專利名稱：：莫諾苷的制備方法及其新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種山茱萸提取物在制備預(yù)防或治療急慢性肝損傷和肝纖維化的藥物中的應(yīng)用，具體涉及莫諾苷在制備預(yù)防或治療急慢性肝損傷和肝纖維化方面的藥物中的應(yīng)用。近年來病毒性肝炎，肝纖維化，脂肪肝，酒精肝，藥物性肝損害及肝硬化，肝癌等肝病是當(dāng)今社會威脅人類健康的主要疾病之一。我國是肝病大國，據(jù)最新統(tǒng)計(jì)病毒性肝炎和乙肝病毒攜帶者在我國人群當(dāng)中有14%以上人口感染。病情加重則發(fā)展到肝纖維化，肝腹水，肝腹化和肝癌。每年死于肝硬化，肝癌的患者就是就有一百多萬。肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)，是肝硬化發(fā)生過程的重要階段，常由肝內(nèi)慢性炎癥、膽汁淤積、免疫損傷等原因引起。有資料顯示慢性肝炎肝纖維化的發(fā)病率為85.1%，肝纖維化持續(xù)發(fā)展將有25%-40%發(fā)展為肝硬化。研究證實(shí)肝纖維化是可逆性病變。莫諾苷是從中藥山茱萸中提取得到的水溶性的環(huán)烯醚萜類化合物，文獻(xiàn)報(bào)道山茱萸水提物具有降血糖、免疫抑制、抗炎、抗休克、強(qiáng)心、、抗心律失常、抗疲勞、抗衰老和增強(qiáng)記憶力等作用。但莫諾苷在預(yù)防或治療急慢性肝損傷及肝纖維化的藥理作用未見報(bào)道，本發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)了莫諾苷在預(yù)防或治療急慢性肝損傷及肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。莫諾苷結(jié)構(gòu)式(分子式為d7H260u，分子量:406.38)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了莫諾苷在制備預(yù)防或治療急慢性肝損傷及肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了莫諾苷在制備預(yù)防或治療急性肝損傷的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明提供了莫諾苷在制備預(yù)防或治療慢性肝損傷的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了莫諾苷在制備預(yù)防或治療肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的莫諾苷在用于上述任一用途時(shí)，注射使用劑量范圍為201000mg，優(yōu)選劑量范圍為20500mg;其口服使用劑量范圍為502000mg，優(yōu)選劑量范圍為501000mg。本發(fā)明提供的以莫諾苷為活性成分的藥物組合物，可以以注射劑、片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、糖漿等劑型存在，優(yōu)選為凍干粉針和膠囊。本發(fā)明提供的各種劑型均可以采用藥學(xué)常規(guī)方法制備而成。本發(fā)明提供的莫諾苷按以下方法制備山茱萸藥材粉碎后水洗醇沉；醇沉液濃縮，調(diào)節(jié)PH值至13上非極性弱極性的大孔樹脂，水洗至無色，再用10%30%的乙醇溶液洗脫35倍柱體積，收集洗脫液，濃縮；濃縮液上非極性弱極性的大孔樹脂，水洗，再用10%30%的乙醇溶液洗脫35倍柱體積，收集洗脫液，低溫減壓干燥，結(jié)晶即得。本發(fā)明人通過下列實(shí)驗(yàn)證實(shí)了莫諾苷具有對急慢性肝損傷和肝纖維化的抑制作用，但并不意味著本發(fā)明僅限于此。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1莫諾苷的制備山茱萸藥材50Kg，粉碎，加水500L，浸泡2小時(shí)，加熱煎煮3次，每次2小時(shí)，過濾，合并提取過濾液，減壓濃縮至相對密度為1.02(40'C測定)，加入95%乙醇，攪拌，至乙醇濃度為80%，靜置12小時(shí)，過濾乙醇溶液，少量乙醇洗滌濾渣，棄掉濾渣，濾液濃縮至無醇，調(diào)節(jié)PH值為2，上樣到AB-8大孔樹脂柱，水洗至無色，10%乙醇溶液洗脫3倍柱體積，30%乙醇溶液洗脫3倍柱體積，接收洗脫液，濃縮；濃縮液上樣到HPD300樹脂柱，純化水洗3倍柱體積，10%液乙醇溶液洗3倍柱體積，接收洗脫液，低溫減壓干燥，結(jié)晶。稱重，制得莫諾苷150g，檢測，含量91%。實(shí)施例2莫諾苷的制備山茱萸藥材50Kg粉碎，加水500L，浸泡2小時(shí)，加熱煎煮3次，每次2小時(shí)，過濾，合并提取過濾液，減壓濃縮，至相對密度1.03(4(TC測定)，加入95%乙醇，攪拌，至醇濃度為80%，靜置6小時(shí)，過濾乙醇溶液，用少量乙醇洗滌濾渣，棄掉濾渣，濾液濃縮至無乙醇；濃縮液調(diào)節(jié)ra為2，上樣到HZ—818大孔樹脂柱，水洗至無色，10%乙醇洗脫3倍柱體積，20%乙醇洗脫3倍柱體積，30%乙醇洗脫3倍柱體積，接收洗脫液，濃縮;濃縮液上樣到HPD300柱，水洗3個(gè)柱體積，10%乙醇洗3倍柱體積，接收洗脫液，低溫減壓干燥，結(jié)晶。稱重，制得莫諾苷140g，檢測，含量95%。實(shí)施例3莫諾苷注射液的制備按處方量取莫諾苷2g，氯化鈉225g，用注射用水25000ml溶解，攪拌；加入活性炭25g，攪拌20分鐘，溶液經(jīng)過微孔濾膜過濾澄明，分裝于250ml輸液瓶中，滅菌，檢査合格后包裝即可。實(shí)施例4莫諾苷固體制劑的制備按處方量取莫諾苷50g，糊精I(xiàn)OOg，淀粉70g，羧甲基淀粉鈉IOg，硬脂酸鎂適量，混和，加入50%乙醇適量制粒，干燥，整粒，壓片，檢查合格后，包裝。實(shí)施例5莫諾苷凍干粉針的制備取莫諾苷50g，溶解于10000ml含1%甘露醇的注射用水溶液中，加入活性炭10g，攪拌30分鐘，溶液經(jīng)過微孔濾膜過濾，得到無熱原的澄清溶液，分裝于10ml西林瓶中，2ml/支，按凍干粉針工藝凍干，制成每支含10mg的凍干粉針。試驗(yàn)例l:莫諾苷對四氯化碳引起小鼠急性肝損傷的影響1.1材料、儀器及動物四氯化碳(分析純，煙臺三和化學(xué)試劑公司，批號050122);莫諾苷按制備例2制備；聯(lián)苯雙酯(滴丸，北京協(xié)和制藥廠，規(guī)格1.5mg，批號050512);ALT/GPT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號060281);ASP/GOT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號060201);全自動生化分析儀(意大利)。清潔級昆明種小鼠，體重18g22g，雌雄各半，山東綠葉制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SYXK(魯)20030020。1.2方法小鼠130只，隨機(jī)分為13組，即正常對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯灌胃10.0mg/kg組、莫諾苷靜脈注射2.0mg/kg組、5.0mg/kg組、20.0mg/kg組、100.0mg/kg組和200.0mg/kg組；莫諾苷灌胃5.0mg/kg組、10.0mg/kg組、50.0mg/kg組、200.0mg/kg組和400.0mg/kg組，各靜脈給藥組連續(xù)給藥3天，各灌胃給藥組連續(xù)給藥7天，末次給藥前16小時(shí)除正常對照組外各組用0.2%的四氯化碳油溶液腹腔注射，注射體積0.25ml/只，正常對照組給與等體積的生理鹽水，隨即禁食16小時(shí)，末次給藥1小時(shí)后眼睚采血，離心(4000rpm,10min)，收集血清，用藥盒檢測ALT/GPT、ASP/GOT活性。數(shù)據(jù)以數(shù)據(jù)用^ts表示，以組間t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。1.3結(jié)果結(jié)果如表1所示，莫諾苷靜脈注射5.0mg/kg、20.0mg/kg、100.0mg/kg和200.0mg/kg組；莫諾苷灌胃10.0mg/kg、50.0mg/kg、200.0mg/kg和400.0mg/kg組明顯降低GOT、GPT水平(與模型對照組比較，p〈0.05或0.01)。表1莫諾苷對CCL4肝損傷小鼠的GOT、GPT的影響組別劑量ASP/GOT酶活A(yù)LT/GPT酶活(mg/kg)CU/L)CU/L)正常對照組—-170±3968±11模型組NS1420±2611122±201聯(lián)苯雙酯組10.0875±264**683±26廣莫諾苷靜脈注射組2.01214±209967±1825.01140±139'870±122*20.01027±15廣757±159**100.0817±133**556±226**200.0820±158"543±242*'莫諾苷灌胃組5.01327±222975±16310.01135±168'858土135'50.01057±151776±144200.0919±179**618±220**400.0903±18廣606±243**與模型組比較*戶<0.05,P<0.01，試驗(yàn)例2:莫諾苷對D-半乳糖胺致小鼠肝損傷的影響2.1材料、儀器和動物四氯化碳(分析純，煙臺三和化學(xué)試劑公司，批號050122);莫諾苷按制備例2制備；聯(lián)苯雙酯(滴丸，北京協(xié)和制藥廠，規(guī)格1.5mg，批號050512);ALT/GPT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號060281);ASP/GOT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號060201);D-半乳糖胺(SIGMA公司生產(chǎn))；全自動生化分析儀(意大利)。清潔級昆明種小鼠，體重18g22g，雌雄各半，山東綠葉制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SYXK(魯)20030020。2.2方法小鼠130只，隨機(jī)分為13組，即正常對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯灌胃10.0mg/kg組、莫諾苷靜脈注射2.0mg/kg組、5.0mg/kg組、20.0mg/kg組、100.0mg/kg組和200.0mg/kg組；莫諾苷灌胃5.0mg/kg組、10.0mg/kg組、50.0mg/kg組、200.0mg/kg組和400.0mg/kg組，各靜脈給藥組連續(xù)給藥3天，各灌胃給藥組連續(xù)給藥7天，末次給藥lh后除正常對照組外各組用150mg/kg的D-半乳糖胺造模，正常對照組給與等體積的生理鹽水，禁食16h后眼眶采血，離心(4000rpm,10min)，收集血清，用藥盒檢測ALT/GPT、ASP/GOT活性。數(shù)據(jù)以數(shù)據(jù)用5±3表示，以組間t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2.3結(jié)果如表2所示，莫諾苷靜脈注射5.0mg/kg組、20.0mg/kg組、100.0mg/kg組和200.0mg/kg組；莫諾苷灌胃10.0mg/kg組、50.0mg/kg組、200.0mg/kg組和400.0mg/kg組明顯降低GOT、GPT水平(與模型對照組比較，pO.05或0.01)。表2莫諾苷對D-半乳糖胺致肝損傷小鼠的GOT、GPT的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>試驗(yàn)例3:莫諾苷對大鼠慢性肝損傷的影響3.1材料與動物莫諾苷按制備例2制備；聯(lián)苯雙酯(滴丸，北京協(xié)和制藥廠，規(guī)格1.5mg，批號050512);ALT/GPT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號060281);ASP/GOT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號060201);四氯化碳(分析純，煙臺三和化學(xué)試劑公司，批號050325);實(shí)驗(yàn)動物清潔級SD大鼠，雄性，體重150-200g，山東綠葉天然藥物研究開發(fā)公司實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格號SYXK(魯)20030020。3.2實(shí)驗(yàn)方法大鼠130只，隨機(jī)分為13組，即正常對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組灌胃5.0mg/kg組、莫諾苷靜脈注射1.0mg/kg組、2.0mg/kg組、10.0mg/kg組、50.0mg/kg組和100.0mg/kg組；莫諾苷灌胃2.0mg/kg組、5.0mg/kg組、20.0mg/kg組、100.0mg/kg組和200.0mg/kg組，每組10只。除正常對照組外，各組首次給予四氯化碳原液5ml/kg體重，以后每周2次25%四氯化碳溶液(橄欖油稀釋)2ml/kg體重，連續(xù)20周。正常對照組給與同體積生理鹽水，按上述方法制備慢性肝損傷模型,于實(shí)驗(yàn)第8周時(shí),開始給藥，連續(xù)給藥12周，給藥結(jié)束后用20%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉，解剖，腹主動脈采血，留取肝組織，部分用10%中性福爾馬林溶液固定，24—48h內(nèi)制石蠟塊。肝組織病理學(xué)檢查采用HE染色，對慢性肝損傷大鼠病理組織學(xué)改變進(jìn)行評分，肝細(xì)胞漿疏松化分為0-3級，肝細(xì)胞脂肪變分為0-3級，肝細(xì)胞壞死分為0-3級，肝間質(zhì)纖維增生分為0-3級，對大鼠病理組織學(xué)改變分?jǐn)?shù)進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。血樣離心(4000rpm，10min),收集血清，用藥盒檢測ALT/GPT、ASP/GOT活性。數(shù)據(jù)以數(shù)據(jù)用^士s表示，以組間t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，莫諾苷靜脈注射2.0mg/kg組、10.0mg/kg組、50.0mg/kg組和100.0mg/kg組；莫諾苷灌胃5.0mg/kg組、20.0mg/kg組、100.0mg/kg組和200.0mg/kg組明顯降低GOT、GPT水平及肝指數(shù)(與模型對照組比較，pO.05或0.01)。肝組織病理變化..結(jié)果顯示，CC14慢性肝損組大鼠,正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,有廣泛的脂肪變性，肝細(xì)胞壞死及不同程度的間質(zhì)纖維增生，而經(jīng)莫諾苷治療的大鼠，損傷性病理變化明顯減輕。如表4所示，莫諾苷靜脈注射2.0mg/kg組、10.0mg/kg組、50.0mg/kg組和100.0mg/kg組；莫諾苷灌胃5.0mg/kg組、20.0mg/kg組、100.0mg/kg組和200.0mg/kg組明顯降低肝細(xì)胞漿疏松化、肝細(xì)胞脂肪變、肝細(xì)胞壞死及肝間質(zhì)纖維增生(與模型對照組比較，P<0.05或0.01)。表3莫諾苷對慢性肝損傷的大鼠GOT、GPT水平及肝指數(shù)影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>與模型組比較'P<0.05，戶<0.01表4莫諾苷對慢性肝損傷的大鼠病理組織學(xué)改變的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>與模型組比較'P<0.05，戶<0.01試驗(yàn)例4:莫諾苷對肝纖維化的影響4.1材料與動物莫諾苷按制備例2制備；文迪雅(馬來酸羅格列酮片，GlaxoSmithKline公司，批號051023);HA(透明質(zhì)酸)、LN(層粘連蛋白)及PcIII(ni型膠原)放免試劑盒購買于上海海研醫(yī)學(xué)中心；羥脯氨酸檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；實(shí)驗(yàn)動物清潔級SD大鼠，雄性，體重150-200g，山東綠葉天然藥物研究開發(fā)公司實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格號SYXK(魯)20030020。4.2實(shí)驗(yàn)方法大鼠130只，隨機(jī)分為13組，即正常對照組、模型組、羅格列酮組灌胃8mg/kg組、莫諾苷靜脈注射1.0mg/kg組、2.0mg/kg組、10.0mg/kg組、50.0mg/kg組和100.0mg/kg組；莫諾苷灌胃2.0mg/kg組、5.0mg/kg組、20.0mg/kg組、100.0mg/kg組和200.0mg/kg組，每組10只。大鼠肝纖維化模型復(fù)制及各組處置方法參考吳孟超等復(fù)制大鼠肝纖維化模型的方法吳孟超，楊廣順.大鼠肝硬變模型復(fù)制的研究.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，1984，1(4):145—147，除正常對照組外，各組每3d每100g體重皮下注射40%四氯化碳油溶液0.3ml,首劑量加倍，正常對照組大鼠每3d皮下注射油溶液0.3ml/100g體重，6周后,各組開始給藥，連續(xù)給藥6周，給藥結(jié)束后用20%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉，解剖，腹主動脈采血，留取肝組織，部分用10%中性福爾馬林溶液固定，24—48h內(nèi)制石蠟塊。肝組織病理學(xué)檢查采用HE染色，纖維增生程度分為0-4級栗坤，趙玉珍，朱秋霜等.川芎嗪對老齡小鼠心、肝超氧化物歧化酶活力的影響.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，1998;21:4_5，對血清中HA(透明質(zhì)酸)、LN(層粘連蛋白)及PcIII(m型膠原)、及肝中HYP(羥脯氨酸)進(jìn)行測定，HA、LN、PcIII、HYP按檢測試劑盒測定方法測定。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果病理學(xué)檢査正常對照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠肝臟12周均出現(xiàn)明顯的纖維化；莫諾苷各組中纖維化程度均較模型組輕。光鏡觀察HE常規(guī)染色和VG膠原染色肝組織切片顯示，肝纖維化模型對照組大鼠肝組織中可見肝細(xì)胞脂肪變性，壞死，炎細(xì)胞浸潤；匯管區(qū)內(nèi)膠原纖維沉積，Henny管增生；纖維結(jié)締組織增生明顯，纖維間隔增粗，并有典型假小葉形成。莫諾苷治療組大鼠肝組織纖維結(jié)締組織增生程度減輕，纖維間隔變細(xì)，假小葉形成不明顯。對各組纖維增生程度分值進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。結(jié)果見表5，莫諾苷靜脈注射2.0mg/kg組、10.0mg/kg組、50.0mg/kg組禾卩100.0mg/kg組；莫諾苷灌胃5.0mg/kg組、20.0mg/kg組、100.0mg/kg組和200.0mg/kg組明顯降低纖維增生程度(與模型對照組比較，pO.05或0.01)。電鏡觀察正常對照組大鼠肝細(xì)胞間緊密相連，細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器分布規(guī)整，結(jié)構(gòu)典型。血竇排列整齊，Disse腔內(nèi)可見肝貯脂細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有脂滴。模型對照組大鼠肝組織中則出現(xiàn)典型的肝細(xì)胞損傷結(jié)構(gòu)，相鄰肝細(xì)胞間隙增寬，肝細(xì)胞變性壞死，核固縮，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等、分布不規(guī)則的脂滴。肝組織中存在輕重不等的纖維化病變。肝竇毛細(xì)血管化，Disse間隙內(nèi)可見較多成纖維細(xì)胞(活化的肝貯脂細(xì)胞)，且周圍有大量膠原纖維沉積。匯管區(qū)內(nèi)可出現(xiàn)大量的膠原纖維。莫諾苷治療組中，肝細(xì)胞損傷有不同程度的減輕，肝細(xì)胞間隙較緊密，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂肪小滴減少，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)趨向正常。肝纖維化病變不明顯，肝血竇和Disse間隙內(nèi)膠原纖維沉積及成纖維樣細(xì)胞數(shù)量減少。對各組HA、LN、PcIII、HYP進(jìn)行T檢驗(yàn)。結(jié)果見表6，莫諾苷靜脈注射2.0mg/kg組、10.0mg/kg組、50.0mg/kg組和100.0mg/kg組；莫諾苷灌胃5.0mg/kg組、20.0mg/kg組、100.0mg/kg組和200.0mg/kg組明顯降低HA、LN、PcIII、HYP水平(與模型對照組比較，p<0.05或O.Ol)。表5莫諾苷對大鼠肝纖維化病理形態(tài)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>與模型組比較，<0.05;"P<0.01。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1.莫諾苷在制備預(yù)防或治療急慢性肝損傷及肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。2.莫諾苷在制備預(yù)防或治療急性肝損傷的藥物中的應(yīng)用。3.莫諾苷在制備預(yù)防或治療慢性肝損傷的藥物中的應(yīng)用。4.莫諾苷在制備預(yù)防或治療肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。5.權(quán)利要求l一4任一所述的莫諾苷的制備方法為山茱萸藥材粉碎后水洗醇沉；醇沉液濃縮，調(diào)節(jié)PH值至13上非極性弱極性的大孔樹脂，水洗至無色，再用10%30%的乙醇溶液洗脫35倍柱體積，收集洗脫液，濃縮；濃縮液上非極性弱極性的大孔樹脂，水洗，再用10%30%的乙醇溶液洗脫35倍柱體積，收集洗脫液，低溫減壓干燥，結(jié)晶即得。6.權(quán)利要求5所述的制備方法為山茱萸藥材50Kg粉碎，加水500L，浸泡2小時(shí)，加熱煎煮3次，每次2小時(shí)，過濾，合并提取過濾液，減壓濃縮，至相對密度1.03(40'C測定)，加入95%乙醇，攪拌，至醇濃度為80%，靜置6小時(shí)，過濾乙醇溶液，用少量乙醇洗滌濾渣，棄掉濾渣，濾液濃縮至無乙醇；濃縮液調(diào)節(jié)PH為2，上樣到HZ—818大孔樹脂柱，水洗至無色，10%乙醇洗脫3倍柱體積，20%乙醇洗脫3倍柱體積，30%乙醇洗脫3倍柱體積，接收洗脫液，濃縮；濃縮液上樣到HPD300柱，水洗3個(gè)柱體積，10%乙醇洗3倍柱體積，接收洗脫液，低溫減壓干燥，結(jié)晶。全文摘要本發(fā)明涉及莫諾苷的制備方法及其新用途，具體涉及莫諾苷在制備預(yù)防或治療急慢性肝損傷和肝纖維化方面的藥物中的應(yīng)用，以及莫諾苷的制備方法。文檔編號A61K31/7048GK101385735SQ20071011382公開日2009年3月18日申請日期2007年9月13日優(yōu)先權(quán)日2007年9月13日發(fā)明者廣劉,王春明,田京偉,耿桂華,蔣王林申請人:山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司