專利名稱：莫諾苷在預(yù)防或治療腦重大疾病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及莫諾苷的一種新的醫(yī)藥用途，尤其涉及莫諾苷在預(yù)防或治 療腦重大疾病中的應(yīng)用，屬于中藥領(lǐng)域。
莫諾苷(morroniside)是從中藥山茱萸(Cornus officinalis Sicb)提取的化合物，其結(jié)構(gòu)式如下<formula>formula see original document page 3</formula>
山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sicb的干燥 成熟果肉，具有補(bǔ)益肝腎，澀精固脫等功效。山茱萸含揮發(fā)油、有機(jī)酸和 環(huán)烯醚萜苷類等多種化學(xué)成分，藥理學(xué)研究表明，山茱萸具有抑菌抗病毒， 調(diào)節(jié)人體免疫功能，降血糖和抗衰老等作用，其提取物有明顯的免疫抑制 活性，并對腎陽虛動物模型生命質(zhì)量及多個臟器具有保護(hù)作用。
腦重大疾病，指腦卒中、腦缺血/再灌注損傷、癡呆、帕金森疾病， 占腦疾病的85%，它們共同的機(jī)理是在腦卒中、腦缺血/再灌注或者其它 損傷因素誘導(dǎo)下，腦內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，損傷神經(jīng)元，引起神經(jīng)元凋亡或 者死亡，神經(jīng)功能受到破壞，或者神經(jīng)功能逐步損傷、異常，造成死亡或
者中風(fēng)后遺癥、癡呆、帕金森疾病。
tr前認(rèn)為，對于腦重大疾病，針對發(fā)病機(jī)理，治療或者預(yù)防應(yīng)采用抗 氧化、抗凋亡、增加神經(jīng)營養(yǎng)功能，促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)和再生，恢復(fù)神經(jīng)功能， 對于預(yù)防和治療腦卒中、腦缺血/再灌注患者具有重要意義，或者通過延 緩神經(jīng)功能衰減的速度，對于癡呆、帕金森疾病的預(yù)防和治療具有重要意 義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，莫諾苷(morroniside)具有抗氧化、 抗凋亡、增加神經(jīng)營養(yǎng)、促進(jìn)神經(jīng)生長等藥理作用，.對腦重大疾病具有顯 著的治療或者預(yù)防的作用。
其中，所述的腦重大疾病腦指腦卒中、腦缺血/冉灌注損傷、癡呆、 帕金森疾病等，這類疾病共同的發(fā)病機(jī)理是在腦卒中、腦缺血/再灌注 或者其它損傷因素誘導(dǎo)下，腦內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，損傷神經(jīng)元，引起神經(jīng) 元凋亡或者死亡，神經(jīng)功能受到破壞，或者神經(jīng)功能逐步損傷、異常，造 成死亡或者中風(fēng)后遺癥、癡呆、帕金森疾病，由于莫諾苷具有抗氧化、抗 凋亡、增加神經(jīng)營養(yǎng)、促進(jìn)神經(jīng)生長等藥理功效，所以對這類具有共同發(fā) 病機(jī)理的腦重大疾病均具有治療或者預(yù)防的作用。
所述的莫諾苷在用于治療任意一種腦重大疾病時，其使用劑量范圍為 30mg-8000mg/天，優(yōu)選90mg-3000mg/天，更優(yōu)選30mg-1000mg/天。
本發(fā)明還提供了一種治療或者預(yù)防腦重大疾病的藥物組合物，該藥物 組合物含有治療上有效量的莫諾苷和藥學(xué)上可接受的輔料或載體；其中， 所述的腦重大疾病腦是指腦卒中、腦缺血/再灌注損傷、癡呆或帕金森疾 病等。
本發(fā)明提供的以莫諾苷為活性成分的藥物組合物，其含量為 30-1000mg。其可以通過口服、舌下、皮膚、經(jīng)肌肉后者皮下、皮膚粘膜、 靜脈途徑給藥?？梢砸阅z囊、軟膠囊、片劑、口服液、粉針劑、水針劑等
制劑形式存在，這些制劑以藥學(xué)常規(guī)方法制備而成。
本發(fā)明通過高效液相測定含量，YMC U色譜柱(4. 6mmX250mm， 5um); 流動相為甲醇-水(30: 70);檢測波長為240nm;流速1. OmL. min—';柱溫 25°C;進(jìn)樣量10uL。取莫若苷對照品適量，精密稱，置量瓶中，用30% 甲醇制成每lml含0. 3mg溶液，精密汲取此溶液制成不同濃度的對照品溶 液。取莫諾苷提取物樣品5mg，精密稱定，置25ml量瓶中，用30%甲醇溶 解，過0.2um微孔濾膜，制成供試品溶液，精密汲取對照品和供試品溶液， 注入液相色譜儀測定含量，含量為95. 5%。


圖l SY5Y神經(jīng)細(xì)胞正常細(xì)胞形態(tài)。
圖2 SY5Y神經(jīng)細(xì)胞過氧化氫損傷后細(xì)胞形態(tài)。
圖3莫諾苷對SY5Y神經(jīng)細(xì)胞HA損傷LDH的影響；其中，LDH漏出 增多表示細(xì)胞膜損傷嚴(yán)重。
圖4莫諾苷對SY5Y神經(jīng)細(xì)胞HA損傷MTT的影響；其中，MTT比色 光密度降低表示細(xì)胞存活率降低。
圖5莫諾苷對HA致SY5Y神經(jīng)細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)活性降 低的影響。
圖6莫諾苷對仏02致SY5Y神經(jīng)細(xì)胞谷胱甘肽(GSH)活性降低的影響。
圖7莫諾苷對&02致SY5Y神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2表達(dá)降低的影響。 圖8莫諾苷對HA致SY5Y神經(jīng)細(xì)胞NGF表達(dá)降低的影響。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅
用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例l莫諾苷的制備
山茱萸粉碎，加10倍重量水煎煮3次，每次1小時，合并煎液，濾
過，減壓濃縮，加乙醇沉淀，靜置，濾過，加壓回收乙醇，SP70大孔樹脂 吸附，收取30%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，真空干燥，得到山茱萸環(huán)烯 醚萜苷；用硅膠(60-80目)拌樣，干燥、硅膠(200-300目)柱層析，
用氯仿/甲醇(氯仿甲醇=1: 0-3: 1)洗脫，TLC檢測，相同部分合并，
回收溶劑；將莫諾苷在甲醇溶液中反復(fù)純結(jié)晶，得到莫諾苷純化合物，經(jīng) HPLC檢測含量大于95. 5%。
實(shí)施例2:莫諾苷膠囊的制備
100g莫諾苷(實(shí)施例l所制備)，加100g糊精，加適量54%的乙醇， 攪拌潤濕，制粒，干燥，裝膠囊，即得；每粒含莫諾苷100mg。
試驗(yàn)例1莫諾苷促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)作用
將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤系細(xì)胞系SY5Y細(xì)胞(瑞典卡諾琳娜大學(xué)贈送)(模 擬神經(jīng)元細(xì)胞)以每毫升1.5X104的密度接種，48h后分為對照組與加藥 組，加入過氧化氫(200-500uM)和莫諾苷(實(shí)施例l所制備)，每組8-12 個孔。測定LDH、 MTT、 SOD、 GSH、 Bel-2、 NGF、 BDNF，結(jié)果見圖l-8， i式 驗(yàn)結(jié)果表明，莫諾苷有抑制LDH漏出、MTT代謝、抗細(xì)胞氧化損傷、抑制 細(xì)胞凋亡、增加神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌等藥理作用，對SY5Y細(xì)胞有保護(hù)作用。
通過莫諾苷抑制HA造成SY5Y神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷模型實(shí)驗(yàn)表明，莫諾 苷(liiM， 10uM， 100iiM)具有極顯著降低LDH漏出的作用，可顯著增 加MTT含量。
試驗(yàn)結(jié)果表明莫諾苷具有增加神經(jīng)細(xì)胞活性和神經(jīng)保護(hù)作用。 試驗(yàn)例2莫諾苷抗氧化作用試驗(yàn)
MEM(Gibco BRL， 41500-()34)培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)為0.1的滅活胎 牛血清(Gibco， 16000-044)、 15 mmol/L HEPES(北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中 心)、青霉素lxl05U/L、鏈霉素lxl()5u/L，在體積分?jǐn)?shù)為0.05 C02， 37°C 的孵箱中培養(yǎng)，每周換液2次，傳代1次。細(xì)胞加入不同濃度的藥物孵育 24h后，加入H2O2 (500itmiol/L)損傷18h，用胰蛋白酶裂解，按照試劑盒 的說明測定SOD、 GSH含量。通過莫諾苷對H202造成SY5Y神經(jīng)細(xì)胞氧化 損傷模型抗氧化作用研究，莫諾苷(10uM， 100 uM)具有顯著升高SY5Y 細(xì)胞SOD含量的作用(圖5);同時，莫諾苷(luM， 10uM， 100 uM)也 具有增加GSH含量的作用(圖6)。
試驗(yàn)結(jié)果表明莫諾苷可以提高神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性和小分子 抗氧化物質(zhì)含量，具有抗氧化損傷作用。
試驗(yàn)例3 莫諾苷抗凋亡作用試驗(yàn)
將SY5Y細(xì)胞以密度為1X107L—^妾種于75cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生 長至90%密度時，更換為無血清培養(yǎng)基，分組。24h后棄去原培養(yǎng)液，用 預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗兩遍，加入1.0mL細(xì)胞裂解液，冰浴中提取細(xì)胞蛋 白質(zhì)。20min后，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞裂解物刮下收集到1.5 mLEpendorff 管中，15000r/min， 4'C離心30min，取上清。應(yīng)用BioRad蛋白質(zhì)測定試 劑盒檢測蛋白質(zhì)含量，以控制樣品的加樣量。80-120V電壓下SDS-聚丙稀 酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%奶粉封閉，加一抗Bcl-2稀釋(l:500)， 二抗，堿 性磷酸酶顯色系統(tǒng)顯色。掃描儀掃描電泳條帶，用軟件分析數(shù)值。Bcl-2 對正常細(xì)胞功能和代謝沒有影響，對病理性細(xì)胞凋亡具有抑制作用，研究 和觀察莫諾苷對HA造成株SY5Y神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷模型Bcl-2表達(dá)的影 響，試驗(yàn)結(jié)果表明莫諾苷(luM， 100uM)具有顯著增加Bcl-2表達(dá)的
作用(圖7)，說明莫諾苷具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。
試驗(yàn)例4莫諾苷神經(jīng)營養(yǎng)作用試驗(yàn)
將SY5Y細(xì)胞以密度為1X107L—'接種f75cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生 長至90%密度時，更換為無血清培養(yǎng)基，分組。24h后棄去原培養(yǎng)液，用 預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗兩遍，加入l.OmL細(xì)胞裂解液，冰浴中提取細(xì)胞蛋 白質(zhì)。20min后，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞裂解物刮下收集到1.5 mLEpendorff 管中，15000r/min， 4r離心30min，取上清。應(yīng)用BioRad蛋白質(zhì)測定試 劑盒檢測蛋白質(zhì)含量，以控制樣品的加樣量。80-120V電壓下SDS-聚丙稀 酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%奶粉封閉，加一抗NGF稀釋(1:500)， 二抗，堿 性磷酸酶顯色系統(tǒng)顯色。掃描儀掃描電泳條帶，用軟件分析數(shù)值。通過莫 諾苷對H202造成SY5Y神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷模型對神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)影響作用 研究，結(jié)果表明莫諾苷(10uM， lOOtxM)具有增加SY5Y細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)生 長因子(NGF)表達(dá)的作用(圖8)，試驗(yàn)說明莫諾苷具有增加神經(jīng)營養(yǎng)因 子的作用，能夠增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)發(fā)生的作用。
權(quán)利要求
1、莫諾苷(morroniside)在制備治療或者預(yù)防腦重大疾病藥物中的用途；其中，所述莫諾苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
2、 按照權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述腦重大疾病是指腦卒 中、腦缺血/再灌注損傷、癡呆或帕金森疾病。
3、 一種治療或者預(yù)防腦重大疾病的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物含有治療上有效量的莫諾苷和藥學(xué)上可接受的輔料或載體。
4、 按照權(quán)利要求3的藥物組合物，其特征在于所述腦重大疾病是指腦卒中、腦缺血/再灌注損傷、癡呆或帕金森疾病。
全文摘要
本發(fā)明公開了莫諾苷(morroniside)在制備治療或者預(yù)防腦重大疾病藥物中的用途。通過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)莫諾苷具有抗氧化、抗凋亡、增加神經(jīng)營養(yǎng)作用、促進(jìn)神經(jīng)生長的藥理作用，對腦卒中、腦缺血/再灌注損傷、癡呆、帕金森病等腦重大疾病具有顯著的治療或者預(yù)防作用。
文檔編號A61P9/10GK101336927SQ20071011851
公開日2009年1月7日 申請日期2007年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月6日
發(fā)明者林 李, 文 王, 艾厚喜 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院