專利名稱：：一種小分子酸性肽,其提取方法和以其為活性成分的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種酸性肽，具體地說是一種對老年癡呆病有明顯治療作用的小分子酸性肽、其提取方法和以該酸性肽為活性成分的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：隨著人類社會老齡化步伐的加快，老齡人口正逐年增加。衰老和伴隨衰老而發(fā)生的嚴(yán)重危害老年人身心健康的重大疾病老年癡呆病的發(fā)病率也在逐年增加。阿爾茨海默病(Alzheimer'sDisease,AD，早老性癡呆病)便是一種常見的發(fā)生于老年和老年前期的以進行性癡呆為特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性病。其主要臨床表現(xiàn)為進行性學(xué)習(xí)記憶減退，認(rèn)知障礙，個性改變及皮層分離癥，自制力和理解力喪失，晚期則表現(xiàn)為記憶力完全喪失，語言與行為能力喪失。病程一般十年左右，最后發(fā)展成為嚴(yán)重癡呆以至植物人狀態(tài)。早老性癡呆病典型的分子病理學(xué)特征是(1)細(xì)胞外有f3淀粉樣肽沉積而形成老年斑；(2)細(xì)胞內(nèi)有過度磷酸化的tau蛋白沉積形成神經(jīng)纖維纏結(jié)；(3)由于細(xì)胞內(nèi)外tau蛋白和e淀粉樣肽的沉積對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用而引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡而使神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量丟失，造成前腦基底部，海馬和大腦皮質(zhì)的損傷，引起神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。但是，以認(rèn)知障礙為特征的早老性癡呆病是從輕度認(rèn)知障礙(mildcognitiveimpairment,MCI)發(fā)展而來的。實際上，當(dāng)人們超過50歲年齡時，就己經(jīng)開始常常抱怨自己忘事了。這意味著細(xì)胞內(nèi)外tau蛋白和e淀粉樣肽的沉積對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用是一個逐步累積的過程。e淀粉樣肽和tau蛋白不斷對神經(jīng)細(xì)胞作用而引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡就會導(dǎo)致大腦損傷和神經(jīng)系統(tǒng)病變。因此，對大量"輕度認(rèn)知障礙"人群的干預(yù)及預(yù)防和對大量"認(rèn)知障礙"的癡呆病患者的防治已經(jīng)成為全球老齡化社會所面臨的重大醫(yī)學(xué)問題和社會問題。大量的研究均已證明，AD患者的認(rèn)知障礙源于突觸的退化和神經(jīng)元的丟失。而突觸和神經(jīng)元的退化和丟失則源于神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。神經(jīng)分子病理學(xué)和分子醫(yī)學(xué)的研究證明，由3淀粉樣肽在神經(jīng)細(xì)胞外沉積形成的老年斑和由過磷酸化的tau蛋白在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)是引起認(rèn)知障礙和AD的最關(guān)鍵性的分子因素。盡管大量的研究已經(jīng)表明細(xì)胞內(nèi)外tau蛋白和e淀粉樣肽的沉積對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用而引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進而使神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量丟失，造成前腦基底部，海馬和大腦皮質(zhì)損傷，引起神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變是主要的原因。但是迄今為止，人們對阿爾茨海默病的發(fā)病原因和發(fā)病機制尚不完全明了，因而尚缺乏有效的早期診斷方法和治療手段。在發(fā)達國家，AD已經(jīng)成為繼心臟病，癌癥，中風(fēng)之后人類第四位的死因。目前對早老性癡呆病的藥物治療主要包括以下幾類藥物a)膽堿酯酶抑制劑類藥物；(2)促代謝類藥物；(3)激素類藥物；(4)消炎鎮(zhèn)痛類藥物；(5)抗自由基類藥物；(6)鈣離子拮抗劑類藥物；(7)興奮性氨基酸受體的拮抗劑類藥物；(8)神經(jīng)生長因子及其基因治療劑類藥物等。除神經(jīng)生長因子及其基因治療劑類藥物外，上述藥物中均不能抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。因而，它們不能夠阻止早老性癡呆病的發(fā)生和發(fā)展。神經(jīng)生長因子及其基因治療劑類藥物能夠促進神經(jīng)細(xì)胞增殖和生長，具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。但是，由于它們是大分子物質(zhì)，不能夠透過血腦屏障，因而對早老性癡呆病無法發(fā)揮其抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的治療作用。因此，尋找能透過血腦屏障的抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡藥物已經(jīng)成為全球醫(yī)藥學(xué)界研究的熱點和難點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是提供一種能透過血腦屏障的小分子酸性肽，該酸性肽對早老性癡呆病具有良好的治療作用；本發(fā)明的另一個技術(shù)任務(wù)是提供上述酸性肽的提取方法；本發(fā)明進一步的技術(shù)任務(wù)是提供一種用于預(yù)防或治療早老性癡呆病的藥物組合物；本發(fā)明的第四個技術(shù)任務(wù)是提供上述酸性肽在制備預(yù)防和治療早老性癡呆病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了下述氨基酸序列表示的小分子酸性肽Glu-Glu-Glu(谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸)該酸性肽是以動物大腦的腦蛋白干粉為原料，經(jīng)Sephadex-G50柱層析、硅膠柱層析提取得到的。上述的動物大腦可選自牛腦、羊腦、豬腦、雞腦、鴨腦、鵝腦。優(yōu)選該酸性肽的原料是牛腦蛋白干粉。上述小分子酸性肽的提取方法包括以下步驟a、將動物腦蛋白干粉溶解于生理鹽水中，過濾后用Sephadex-G50柱層析，以蒸餾水為洗脫劑，收集含有2種小肽的洗脫液；b、步驟a中所得洗脫液用硅膠柱層析，以氯仿、甲醇、水的混合液為洗脫劑，收集含有1種小肽的洗脫液，其Rf值為0.48，洗脫液冷凍干燥得目標(biāo)產(chǎn)物(提取物)。上述的動物腦蛋白干粉優(yōu)選以下述方法制取將新鮮動物腦中加入生理鹽水，勻漿、離心處理后，收集上清液，上清液經(jīng)冷凍干燥得動物腦蛋白干粉。步驟a中收集的洗脫液的Rf值為0.45—0.52。步驟b中所述洗脫劑各組分的體積比為氯仿甲醇水=60:50:10。提取物結(jié)構(gòu)鑒定分析如下1.提取物為白色粉末。2.提取物用氨基酸分析儀分析酸性肽的氨基酸組成(見附圖)1)，用氨基酸測序儀測定酸性肽的氨基酸排列方式(見附圖2)，用質(zhì)譜儀測定酸性肽的分子量，可證明該提取物是由3個谷氨酸通過a-羧基和a-氨基連接形成肽鍵的小分子酸性肽，其分子離子峰為405.9(見附圖3)，分子量為405。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的小分子酸性肽在治療早老性癡呆病方面具有顯著效果，這在動物試驗中得到了證實。另外，通過動物實驗可以證實，本發(fā)明酸性肽無毒性作用、無致畸變性和無致癌性。本發(fā)明的用于治療早老性癡呆病的藥物組合物含有治療有效量的上述本發(fā)明小分子酸性肽，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的小分子酸性肽和藥物組合物可用于制備預(yù)防或治療早老性癡呆病的藥物。上述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)載體，例如稀釋劑、賦形劑如水等；填充劑如淀粉等；黏合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮等；濕潤劑如甘油等；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈉等；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六垸醇等；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、聚乙二醇等。另外，還可以在組合物中加入其它輔劑，如香味劑、甜味劑等。本發(fā)明酸性肽可經(jīng)口服給藥，可將其制成常規(guī)的固體制劑，如顆粒劑、膠囊、片劑等；也可制成液體制劑如水或油懸浮劑或其它液體制劑，如糖漿等。非經(jīng)口服給藥時可以注射液或輸液劑等形式給藥。將純的酸性肽制備成上述制劑時可使用常規(guī)的制劑制備技術(shù)制備。本發(fā)明的小分子酸性肽的給藥量因給藥途徑、疾病的嚴(yán)重程度等的不同而各有不同，其日劑量可以是15100mg/kg體重。本發(fā)明的小分子酸性肽不僅具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，而且能夠透過血腦屏障，因而以該酸性肽為活性成分制備的藥物對早老性癡呆病的療效優(yōu)于現(xiàn)有的藥物，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。此外，制備本發(fā)明小分子酸性肽的原料容易獲得，制備工藝簡單。因此，本發(fā)明的預(yù)防或治療早老性癡呆病的藥物具有生產(chǎn)容易、成本低廉、療效好等優(yōu)點。附圖1是本發(fā)明酸性肽的氨基酸組成分析圖譜,其中主峰為谷氨酸。附圖2是本發(fā)明酸性肽的氨基酸序列分析圖譜,其中2-a為空白對照(蒸餾水)；2-b為氨基酸標(biāo)準(zhǔn)；2-C為第1個氨基酸殘基，2-d為第2個氨基酸殘基；2-e為第3個氨基酸殘基；2-f-k無氨基酸殘基。附圖3是本發(fā)明酸性肽的質(zhì)譜分析圖譜(酸性肽在酸性條件下時羧基不解離，而a-氨基可接受l個氫離子，因此其分子離子峰為405.9)。附圖4是本發(fā)明酸性肽透過血腦屏障實驗中谷氨酸(Glu)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；附圖5是本發(fā)明酸性肽透過血腦屏障實驗中酸性肽(酸性肽)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；附圖6是本發(fā)明酸性肽透過血腦屏障實驗中大鼠腦中酸性肽和Glu隨灌胃時間而變化的曲線圖。具體實施方式下面的實施例、試驗實施例、制劑實施例可更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實施例l本發(fā)明小分子酸性肽的提取(l)牛腦蛋白干粉的制備取新鮮牛腦200公斤，加入等體積的生理鹽水，在勻漿器中勻漿10min。然后3000r/min離心20min，收集上清液，冷凍干燥成牛腦蛋白干粉1400克。'置于冰箱保藏備用。(2)Sephadex-G50柱層析取200gSephadex-G50浸泡過夜，之后裝入10cmX50cm層析柱中。取20克上述牛腦蛋白干粉用生理鹽水溶解后加入到柱上然后用蒸溜水洗脫。用部分收集儀分部收集洗脫液(每管5ml)，洗脫液分別進行薄層層析和茚三酮顯色。收集與豬神經(jīng)肽RA5值相近且含有2個牛神經(jīng)肽組份的洗脫液(其中包括Rf值為0.48的本發(fā)明酸性肽，和Rf值為0.42的另一組分)。收集的洗脫液置冰箱保存?zhèn)溆谩?3)硅膠柱層析取200g硅膠，活化后加入到2cmX40cm的層析柱中,加入50ml上述Sephadex-G50柱層析洗脫液。用V(氯仿)V(甲醇)V(水^60:50:10的洗脫劑洗脫。用部分收集儀分部收集洗脫液(每管5ml)，洗脫液經(jīng)薄層層析和茚三酮顯色檢査。收集Rf值為0.48的洗脫液。收集的洗脫液經(jīng)冷凍干燥所制成的0.2克白色干粉末即為純的本發(fā)明小分子酸性肽。經(jīng)多次Sephadex-G50柱層析和硅膠柱層析提取可獲得實驗所需要數(shù)量的提純的本發(fā)明小分子酸性肽的干粉。實施例2提取物干粉的結(jié)構(gòu)分析將實施例1所得的小分子酸性肽干粉進行結(jié)構(gòu)分析。(1)氨基酸組成分析稱取一定量的提取物干粉溶于lml6mol/l的鹽酸溶液中，并密封于水解管中，ll(TC過夜水解后打開水解管，將水解后的樣品溶液洗入坩堝中，揮發(fā)至干。加水再蒸干，反復(fù)多次直到溶液達到中性，定容后備用。取取提取物的水解液10ul注入日立835-50型自動氨基酸分析儀的上樣器中進行分析，獲得提取物的氨基酸分析圖譜(如附圖1所示)。提取物的氨基酸分析圖譜表明它是一種主要含有谷氨酸的的肽。(2)提取物的氨基酸測序用美國產(chǎn)PEABI491A型蛋白測序儀按下述方法進行氨基酸測序。稱取10mg提取物干粉溶于0.1m110。/。(V/V)的三氟乙酸中，經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜純化，取主峰樣品滴到PVDF膜上固定。然后送入蛋白測序儀，依Edman降解法從N末端逐一降解肽鏈上的氨基酸并經(jīng)蛋白測序儀自動分析，獲得測序圖譜(附圖2所示)。結(jié)果經(jīng)PEABI491A型蛋白測序儀分析獲得酸性肽的肽鏈分析圖譜，證明提取物是由3個谷氨酸連接的本發(fā)明的小分子酸性肽。(3)提取物的質(zhì)譜分析用美國熱電Fi皿igan公司Icq-duoESI進行質(zhì)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在405.9處有一個分子離子峰(附圖3所示)，其分子量為405。下面通過試驗實施例說明本發(fā)明酸性肽的活性。試驗實施例中所用的酸性肽為實施例1所得小分子酸性肽。試驗實施例l本發(fā)明酸性肽對血管型癡呆小鼠的治療作用(1)血管型動物模型的建立84只昆明小鼠(河南省實驗動物中心提供)，體重2225g，用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)4d。取12只作為正常組(A組)。其余的小鼠一直用高脂乳劑0.5ml/d灌胃共10d。之后每只小鼠分別用10M水合氯醛(3ml/kg，ip)麻醉，作頸部切開手術(shù)，仔細(xì)分離雙側(cè)頸總動脈，用動脈夾斷血流使腦缺血10min，然后打開10min，重復(fù)三次。最后用絲線結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，縫合切口，局部消毒，術(shù)后分六組飼養(yǎng)。B組為模型組不作任何治療，C組為生理鹽水治療組，D組為腦復(fù)康藥物陽性治療組，E組為高濃度酸性肽治療組，F(xiàn)組為中濃度酸性肽治療組，G組為低濃度酸性肽治療組?？诜o藥治療15天。之后用跳臺試驗進行學(xué)習(xí)記憶功能的變化測試。隨后處死小鼠，分別取腦，稱重，1:9加入生理鹽水，離心。取上清液用于腦中蛋白質(zhì)和NO分析。(2)學(xué)習(xí)記憶功能測試按照高維娟等介紹的跳臺試驗方法進行(見高維娟，黃啟福，王波等。高脂血癥小鼠腦缺血再灌注誘導(dǎo)智能障礙模型研究。中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，1999，5(2):27-29)。第一次測試的結(jié)果為學(xué)習(xí)成績，24h后第二次的測試結(jié)果為記憶成績。(3)腦蛋白和N0分析采用南京建成生物工程研究所2001/6/2生產(chǎn)的試劑盒和隨試劑盒介紹的測定方法進行分析。(4)結(jié)果學(xué)習(xí)記憶成績的試驗結(jié)果見表l、表2。表l模型小鼠跳臺試驗的學(xué)習(xí)成績變化(x±s)組別動物數(shù)(只)錯誤次數(shù)(次)累積刺激時間(秒)A正常組122.830.5818.254.05B模型組114.64±0.92a45.09±10.01aC鹽水組124.33±0.98a43.92±8.10aD腦復(fù)康組123.58±0,79abc31.00±7.術(shù)bcE酸性肽組(高)123.50±0.67abc32,83±8.術(shù)bcF酸性肽組(中)123.58±0.79abc32.50±7，24abcG酸性肽組(低)123.67±0.78abc33.58±7.22abca.與A組比PO.05;b.與B組比PO.01;c.與C組比PO.05_表2模型小鼠跳臺試驗的記憶成績變化(x±s)_級別動物數(shù)(只)潛伏期(秒)錯誤次數(shù)(次)累積刺激時間(秒)A正常組12183.1719.661.420.675.42±2.87B模型組1145.45±20.66a4.73±0.90a21.18±3.16aC鹽水組1242.00±20.75a4.67±0.98a23.00±3.64aD腦復(fù)康組12112.08±18.90abc3.67±1.07abc4.83±:3.86abcE酸性肽組(高)12157.33±22.19abcd2.17±0.72abcd8.58i:3.15abcdF酸性肽組(中)12133.58±23.56abce2.92±0.79abcde11.75±3.47abcG酸性肽組(低)12124.83±19.28abce3.17±0.94abce12.83±4.41abcea.與A組比PO.05;b.與B組比PO.01;c.與C組比PO.01;d.與D組比PO.05;e.與E組比P〈0.05。腦蛋白和NO的分析結(jié)果見表3和表4。表3模型小鼠腦內(nèi)蛋白含量的分析結(jié)果(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表4模型小鼠腦中NO含量的分析結(jié)果(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>a.與A組比PO.05;b.與B組比PO.01;c.與C組比PO.01;d.與D組比P<0.05;e.與E組比PO.05。以上結(jié)果說明l.與正常對照組比較，模型組的學(xué)習(xí)記憶能力均顯著下降(P〈0.05);與模型組比較，生理鹽水組無明顯改變(P〉0.05);與模型組比較，腦復(fù)康組及酸性肽各濃度組的學(xué)習(xí)記憶能力均顯著升高(P〈0.01);2.與模型組比，腦復(fù)康和酸性肽各治療組小鼠腦內(nèi)的蛋白水平明顯升高(P〈0.01);3.與模型組比，腦復(fù)康和酸性肽各治療組小鼠腦內(nèi)的NO水平明顯降低(P〈0.01)。試驗實施例2本發(fā)明酸性肽對阿爾茨海默病(AD)模型大鼠的治療作用(l)動物及分組雄性SD大鼠105只，812周齡，體重170210g，由河南省實驗動物中心提供。將動物隨機分7組，飼養(yǎng)l周后造模。除去制作AD動物模型時死亡的動物，每組最后保持12只動物用于實驗。I組為正常對照組，II組為AD模型組，III組為AD模型+生理鹽水組，IV組為AD模型+腦復(fù)康0.3g/kg治療組，V組為AD模型+酸性肽15mg/kg治療組，VI組為AD模型+酸性肽30mg/kg治療組，Vn組AD模型+酸性肽60mg/kg治療組。(2)AD動物模型的建立大鼠用100g/L的水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于立體定位儀上，剪掉手術(shù)區(qū)毛發(fā)，局部消毒，于頭頂正中做一個1.5cm的矢狀切口，鈍性分離骨膜，參照大鼠腦立體定位圖譜，坐標(biāo)前后徑1.4mm，左右徑2.4mm，垂直7.4mm，對雙側(cè)邁奈特基底核(nbM)進行立體定位后，于雙側(cè)顱骨各對應(yīng)點分別鉆一個直徑lmm的孔洞，用玻璃微量進樣器進行垂直注射。nVH組注射溶于0.1mol/LpH7.4pB液的IBOlu1(5ixg)。每針注射時間5min，留針5min，去針后縫合手術(shù)切口，局部消毒，清醒后放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。(3)試驗方法跳臺實驗與迷宮實驗7組均連續(xù)灌胃給藥20d，期滿后分別做跳臺實驗與迷宮實驗以測試大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，顯著性檢驗采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)《=0.05。(4)結(jié)果7組大鼠跳臺實驗及迷宮實驗的學(xué)習(xí)、記憶能力的比較，見表5、6。表57組大鼠學(xué)習(xí)能力比較(n=12)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>a.與I組比PO.01;b.與II組比P〈0.01表67組大鼠記憶能力比較(11=12)組別上臺潛伏期/s正確反應(yīng)次數(shù)/次I組17.25±2,1325.75±1.66II組43.17±4.66a15.67±2.15aIII組42.37±3.71a15.67±2.27aIV組27.20±2.65a，b20.08±2,43a，bv組29.78±4.48a，b,c20.92±2.68a,bVI組26.20±3.28a，b，c20.83±2.29a,bvn組22.09±4.43a,b，c20.25±2.05a,ba.與I組比PO.Ol;b.與II組比PO.01;c.與W組相比P<0.05結(jié)果表明，與正常對照組比較，模型組的學(xué)習(xí)記憶能力均顯著下降(P〈0.01);與模型組比較，生理鹽水組無明顯改變(P〉0.05);與模型組比較，腦復(fù)康組及酸性肽各濃度組的學(xué)習(xí)記憶能力均顯著升高(P〈0.01)。本實施例中所用的鵝膏蕈氨酸(IBO)為分析純，批號LO5308，瑞士Alexis公司生產(chǎn)；腦復(fù)康東北制藥總廠生產(chǎn)，批號001030。試驗實施例3本發(fā)明酸性肽對凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡促進基因Bax表達的影響(1)海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)取新生(24h內(nèi))的SD大鼠，75%乙醇消毒，斷頭，去除頭皮，剝離腦膜，分離出全腦，PBS(生理鹽水)中漂洗去除殘留血塊，分離出雙側(cè)海馬，剪碎海馬組織，0.125X胰酶37。C、5XCO2孵箱30min，用種植液終止胰酶消化，用拋光的巴氏吸管輕輕吹打腦組織，靜置5分鐘，轉(zhuǎn)移上清單細(xì)胞懸液，沉淀再加入3ml種植液，重復(fù)吹打，獲得單細(xì)胞懸液，合并兩次單細(xì)胞懸液，計數(shù)后用種植液調(diào)整細(xì)胞密度為1X1(^細(xì)胞/L，接種于預(yù)先鋪有0.01%多聚賴氨酸的6孔培養(yǎng)板中，每L2ml。37°C、5%<:02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)到第3天，換無血清培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，Neurobasal培養(yǎng)基加B27無血清培養(yǎng)液(B27serumfreesupplementliquid)可抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長使神經(jīng)元生長得以純化。以后每3天換液一次，每次換液一半。培養(yǎng)至第IO天的海馬神經(jīng)元神經(jīng)絲蛋白(neurofilamentprotein,NF)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。(2)海馬神經(jīng)元的鑒定將細(xì)胞以1.0X1(^/L密度接種于加有0.01X多聚賴氨酸預(yù)處理的蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔2mL。37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第10天，棄去培養(yǎng)基，取出細(xì)胞涂片，用多聚甲醛固定，對內(nèi)源性過氧化物酶的活性使用山羊血清封閉，再分別用神經(jīng)絲蛋白(neurofilamentprotein,NF)、二抗和三抗標(biāo)記，DAB顯色后用蘇木素復(fù)染并觀察和照相。確定神經(jīng)元的純化率在95%以上。細(xì)胞培養(yǎng)至第11-12天生物學(xué)性狀穩(wěn)定時，才可用于后續(xù)實驗。(3)實驗分組及藥物處理取培養(yǎng)至第11天的神經(jīng)細(xì)胞，用不同劑量的由實施例1所獲得的酸性肽預(yù)處理6h，再加入終濃度為50ummol/L的硝普鈉(SNP)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞進行實驗。每次實驗均分為以下五組I組為正常對照組；II組為SNP處理組；m組為SNP+0.0375mg/ml酸性肽組；IV組為SNP+0.075mg/ml酸性肽組；V組為SNP+0.15mg/ml酸性肽組。每組至少重復(fù)3次。SNP用PBS溶解，每次臨用前配置，錫紙避光，過濾除菌。(4)MTT比色法檢測細(xì)胞存活率將細(xì)胞以0.4X109/L密度接種于預(yù)先鋪有0.01%多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板中，每孔100yL。37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第11天，加藥干預(yù)，每組設(shè)8個平行樣本。繼續(xù)培養(yǎng)20h于收獲細(xì)胞前4h，每孔加入5mg/ml噻唑藍(thiazoleblue,MTT)20uL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。收獲細(xì)胞后棄培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗1次，加入150uL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩8min，待紫色結(jié)晶充分溶解后，置酶標(biāo)儀上測各孔吸光度值(OD)，以空白孔調(diào)零，濾過波長592nm。所有的實驗均重復(fù)三次，取其均值，然后用OD值求細(xì)胞存活率，以對照組存活率為100%，其余各組按細(xì)胞存活率=(各濃度組吸光度值/對照組吸光度值)X100%，與對照組比較(5)細(xì)胞凋亡的核型觀察將細(xì)胞以1.0X109/L密度接種于預(yù)先鋪有0.01%多聚賴氨酸的6孔培養(yǎng)板中，每孔2mL。37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第11天，加藥干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后95X乙醇固定，吖啶橙染色，熒光顯微鏡下觀察并拍照。(6)細(xì)胞凋亡的DNA電泳分析將細(xì)胞以1.0X109/L密度接種于預(yù)先鋪有0.01%多聚賴氨酸的6孔培養(yǎng)板中，每孔2mL。37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第11天，加藥干預(yù)后繼續(xù)培養(yǎng)24h。提取細(xì)胞DNA，瓊脂糖凝膠電泳后在紫外透射儀下觀察、拍照。(7)Bcl-2和Bax蛋白的WesternBlot分析將細(xì)胞以1.0X109/L密度接種于預(yù)先鋪有0.01%多聚賴氨酸的6孔培養(yǎng)板中，每孔2mL。37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第11天，按實驗分組及藥物處理中介紹的方法加測試的藥物進行干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24h。棄去培養(yǎng)基，以冷PBS(pH7.2)洗滌細(xì)胞，棄去PBS，并吸干液體。每孔加入50uL裂解液，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，將粘稠的裂解液收集于1.5mL的EP管中，-20"放置20min，冰上超聲破碎細(xì)胞(10s/次X3次，間隔15s)，4'C，12000Xg離心5min，收集上清液并用考馬斯亮藍法(Bradford法)測定蛋白質(zhì)濃度。每個電泳泳道的加樣池中均加入50ug的破碎細(xì)胞的蛋白樣品。在破碎細(xì)胞的蛋白樣品中加入上樣緩沖液，煮沸5min，立即上樣做12.5X濃度的SDS-PAGE電泳。之后，用電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜并將NC膜放入塑料袋中，加入封閉液4'C過夜封閉。將NC膜放入另一塑料袋中，分別加入小鼠抗大鼠Bcl-2單克隆抗體、兔抗大鼠Bax多克隆抗體和小鼠抗大鼠的e-Actin單克隆抗體，37'C2h雜交。之后，再將膜轉(zhuǎn)入另一塑料袋中，分別加入二抗即辣根過氧化酶標(biāo)記兔抗鼠IgG和辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，37'C雜交20min。DAB顯色后用蒸餾水洗膜終止反應(yīng)，拍照并用光密度掃描儀測定Bcl-2、Bax條帶的光密度。(8)統(tǒng)計學(xué)分析運用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。試驗數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差^士s)表示，多個樣本均數(shù)間比較采單因素用方差分析，以^=0.05作為有顯著性的檢驗水準(zhǔn)。(9)結(jié)果神經(jīng)元培養(yǎng)和鑒定的結(jié)果培養(yǎng)12d后，神經(jīng)元成熟，胞體飽滿，呈錐形，周圍有光暈，折光感強，軸突、樹突粗大明顯，網(wǎng)絡(luò)更加稠密。神經(jīng)元經(jīng)免疫組化染色和DAB顯色后，陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞漿呈褐色。MTT比色法檢測細(xì)胞存活率的實驗結(jié)果，見表7。表7酸性肽對SNP處理的海馬神經(jīng)元凋亡存活率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注與空白對照組比較弁P〈0.01;與SNP處理組比較*P<0.05，**P<0.01細(xì)胞凋亡的核型觀察結(jié)果吖啶橙熒光染色(AO染色)結(jié)果顯示，正常對照組海馬神經(jīng)元在熒光顯微鏡下細(xì)胞輪廓清晰，呈彌散均勻綠色熒光。SNP處理組可見有大量的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核固縮、凝集、裂解，染色可見致密濃染的黃色熒光及顆粒狀碎片，呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)特征。而酸性肽各濃度組海馬神經(jīng)元細(xì)胞核與正常對照組的細(xì)胞核形態(tài)接近。細(xì)胞凋亡的DNA電泳分析結(jié)果細(xì)胞凋亡的DNA電泳分析顯示，SNP處理組的細(xì)胞DNA在瓊脂糖凝膠電泳上顯示清晰的階梯狀DNA條帶，而正常對照組和酸性肽各濃度組的海馬神經(jīng)元的DNA沒有階梯狀DNA條帶的出現(xiàn)。Bcl-2和Bax蛋白的WesternBlot分析結(jié)果Bcl-2和Bax蛋白的WesternBlot分析和光密度掃描結(jié)果顯示，酸性肽各濃度組的Bcl-2蛋白條帶隨加入的酸性肽的濃度的增加而逐漸增粗，光密度掃描結(jié)果顯示酸性肽各濃度組的Bcl-2蛋白的表達量也隨加入的酸性肽濃度的增逐漸增加。說明隨著酸性肽濃度的增加，Bcl-2基因表達也增強，而且Bcl-2基因表達Bcl-2蛋白的水平是可劑量依賴性地依賴酸性肽加入的劑量。相反，酸性肽各實驗濃度組中Bax基因表達Bax蛋白的電泳條帶則隨著酸性肽加入量的增加而逐漸變淡，光密度掃描結(jié)果顯示酸性肽各濃度組的Bax基因表達Bax蛋白的量也逐漸下降，這說明隨著酸性肽濃度的逐漸增加使Bax基因表達Bax蛋白的量也逐漸下降，它們具有劑量依賴性關(guān)系(表8)。表8Bcl-2和Bax蛋白的WesternBlot顯色條帶的輝度掃描結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注與空白對照組比較#<0.01;與SNP處理組比較515〈0.01試驗實施例4本發(fā)明酸性肽對腦內(nèi)e淀粉樣肽和N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體產(chǎn)生水平的影響和對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響選取出生后10周齡的健康且經(jīng)Y-迷宮測定無癡呆癥狀的雄性SD大鼠70只，體重170210克，由河南省實驗動物中心提供。動物合格證號為410117，動物級別為普通級。鼠料合格證號為4104041。(1)實驗分組取雄性SD大鼠70只，812周齡，體重170210克，由河南省實驗動物中心提供。隨機分為7組，每組10只。I組為正常對照組；II組為AD模型組；m組為AD模型+生理鹽水組(陰性對照組)；IV組為AD模型+谷氨酸0.3g/kg治療組；V組為AD模型+酸性肽-15mg/kg治療組；VI組為AD模型+酸性肽-30mg/kg治療組；VD組為AD模型+酸性肽-60mg/kg治療組。(2)動物模型的制作大鼠用10a/。水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于立體定位儀上，剪掉手術(shù)區(qū)毛發(fā)，局部消毒，于頭頂正中做一個1.5cm的矢狀切口，鈍性分離骨膜，參照大鼠腦立體定位圖譜，坐標(biāo)前后徑土1.4mm，左右徑土2.4mm，垂直7.4mm，對雙側(cè)nbM進行立體定位后，于雙側(cè)顱骨各對應(yīng)點分別鉆一個直徑lmm的孔洞，用玻璃微量進樣器進行垂直注射。IIVn組注射溶于0.1MpH7.4PB液的IBOly1(5"g)。每針注射時間5min，留針5min，去針后縫合手術(shù)切口，局部消毒，清醒后放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。手術(shù)后連續(xù)灌胃20天。(3)Y-迷宮實驗灌胃期滿后即做迷宮實驗以檢測大鼠的學(xué)習(xí)能力，24h后再做迷宮實驗以檢測大鼠的記憶能力。將大鼠放入Y型迷宮器中，適應(yīng)環(huán)境3min，以大鼠所在的Y型臂為起步區(qū)(安全區(qū))，通入電流70V，0.50.7A，同時所在臂燈亮。如果大鼠跑向左臂，則定右臂為安全區(qū)；如果大鼠跑向右臂，則定左臂為安全區(qū)。每次均以安全區(qū)為起跑區(qū)，并使大鼠在安全區(qū)停留30秒以鞏固記憶。依次改變安全區(qū)位置，以大鼠直接跑入安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯誤反應(yīng)。連續(xù)測試30次，記錄正確反應(yīng)次數(shù)作為成績。實驗時間固定在上午9U點之間，保持周圍環(huán)境安靜，避免強光刺激。(4)腦組織石蠟切片的制備學(xué)習(xí)記憶測試結(jié)束后，各組大鼠用10%水合氯醛腹腔深度麻醉，迅速開胸暴露心臟，經(jīng)左心室行主動脈插管，剪開右心耳作為灌注液流出口，在10-20min內(nèi)經(jīng)左心室灌注4'C生理鹽水200-300ml快速沖洗血液，迅速斷頭取腦,4%多聚甲醛/0.01M磷酸鹽緩沖液固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，石蠟切片機連續(xù)冠狀切片，片厚4um，每切5張取1張切片，備用。(5)NMDAR1、NGF和AP的免疫組化測定(a)切片在二甲苯中脫蠟，乙醇脫水，蒸餾水洗。(b)3%H202室溫20分鐘以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗2分鐘X3次。(c)熱修復(fù)抗原將切片浸入O.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)，微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5-10分鐘后再沸騰，冷卻后PBS(pH7.2-7.6)洗2分鐘X3次。(d)滴加5%血清封閉液，室溫20分鐘.甩去多余液體，不洗。(e)滴加稀釋的一抗(NGF抗體1:100、NMDAR1抗體1:50、Ae抗體1:100),冰箱過夜，PBS洗2分鐘X3次。(f)滴加生物素化IgG(二抗)工作液，37。C孵育30分鐘。PBS洗2分鐘X3次。(g)滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫下孵育30分鐘，PBS洗3分鐘X3次。(h)DAB顯色使用DAB顯色試劑盒(AR1022)，lml蒸餾水滴加1滴A，1滴B，1滴C，混勻，呈色5min，自來水洗3次。(i)蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明、封片。(j)顯微鏡觀察并用BiosensDigitalImagingSystem進行灰度掃描以檢測大鼠腦內(nèi)NMDAR1、NGF、AP的含量。(6)統(tǒng)計學(xué)分析運用SPSSll.O軟件采用單因素方差分析和兩樣本均數(shù)t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗數(shù)據(jù)均以；士s表示，以『0.05作為差異有顯著性意義。(7)結(jié)果Y-迷宮實驗的檢測結(jié)果見表9。表9Y-迷宮試驗的的檢測結(jié)果(；士s，次)組別例數(shù)正確反應(yīng)次數(shù)(次)24小時后檢測的正確反應(yīng)次數(shù)(次)正常對照組1020.20±1.6924.89±1.90模型組1012.30±1.42a14.90±1.60a生理鹽水組1013.50±1.18a'b15.20±1.03ab谷氨酸組1013.80±1.2315.30±1.06a'b60mg/kg酸性肽組1017.30±150a'c'e'"21.10±2.04a'c30mg/kg酸性肽組1015.80±19919.90±1.10a'c15mg/kg酸性肽組1013.20±169a,M15.00±0.94a'b注a，與I組比PO.01;b，與II組比P〉0.05;c，與II組比PO.01;d，與IV組比PX).05;e，與IV組比PO.01;f，與V組比PO.01;g，與VI組比PX).05大鼠大腦皮層中NMDAR1含量的檢測結(jié)果見表10。表IO大鼠大腦皮層中NMDAR1含量的檢測結(jié)果(x士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注a，與I組比PO.01;b，與I組比P〉0.05;c,與II組比P〉0.05;d，與II組比PO.01;e，與IV組比PX).05;f，與IV組比PO.01;g，與V組比PO.01;h，與VI組比PX).05大鼠基底前腦中NGF含量的檢測結(jié)果見表ll。表ll大鼠基底前腦中NGF含量的檢測結(jié)果(^土s)組別例數(shù)NGF的灰度掃描值正常對照組1080.77±2.72模型組1069.60±2.41a生理鹽水組1069.59±1.73"谷氨酸組1069.62±1.46a'e60mg/kg酸性肽組1080.20±1.75b'd'f'g'h30mg/kg酸性肽組1079.39±2.23bd'f'g15mg/kg酸性肽組1069.73±1.87a'注:a,與I組比PO.01;b，與I組比P>0.05;c，與II組比P〉0.05;d,與II組比P〈0.01;e，與IV組比P〉0.05;f，與IV組比P〈0.01;g，與V組比P〈0.01;h，與VI組比PX).05大鼠大腦皮層中Ae含量的檢測結(jié)果見表12。表12大鼠大腦皮層中Ae含量的檢測結(jié)果(x土s)組別例數(shù)AP的灰度掃描值正常對照組1067.40±3.06模型組1074.26±1.39'生理鹽水組1074.89±8.66a'c谷氨酸組1074.88±1.46"60mg/kg酸性肽組1067.58±2.21"'"'h.30mg/kg酸性肽組1067.66±2.25b'd'f's15mg/kg酸性肽組1074.16±2.48a'c'e注a，與I組比P〈0.01;b，與I組比P〉0.05;c，與II組比P〉0.05;d，與II組比P〈0.01;e，與IV組比PX).05;f，與IV組比PO.01;g，與V組比PO.01;h，與VI組比PX).05本實驗在建立了癡呆動物模型和對各組動物用不同藥物進行治療后，用Y-迷宮實驗和免疫組化的方法測定了各組動物的學(xué)習(xí)記憶能力和NMDR1、NGF和AP的含量，并對各組的實驗結(jié)果進行了比較。結(jié)果表明1.與正常組比較①模型組、生理鹽水組、谷氨酸治療組及酸性肽各濃度治療組的學(xué)習(xí)記憶能力均顯著下降(PO.Ol)。②模型組、生理鹽水組、谷氨酸治療組及酸性肽低濃度治療組基底前腦NGF的含量顯著下降(PO.05);酸性肽中、高濃度治療組基底前腦NGF的含量雖有降低但并無顯著差異(P>0.05)。(D模型組、生理鹽水組、谷氨酸組及酸性肽低濃度治療組大腦皮層NMDAR1、AP顯著升高(PO.01);酸性肽中、高濃度治療組大腦皮層NMDAR1、Ae雖有升高但并無顯著差異(P>0.05)。2.與模型組比較①生理鹽水組、谷氨酸組及酸性肽低濃度治療組的學(xué)習(xí)記憶能力無明顯改變(P>0.05);酸性肽中、高濃度治療組的學(xué)習(xí)記憶能力均顯著升高(PO.01)。②生理鹽水組、谷氨酸組及酸性肽低濃度治療組基底前腦NGF的含量均無明顯改變(P>0.05);酸性肽中、高濃度治療組基底前腦NGF的含量均顯著升高(PO.Ol)。③生理鹽水組、谷氨酸組及酸性肽低濃度治療組大腦皮層NMDAR1、AP無明顯改變(P>0.05);酸性肽中、高濃度治療組大腦皮層的NMDAR1、Ae顯著降低(PO.Ol)。3.與谷氨酸治療組比較①酸性肽低濃度治療組的學(xué)習(xí)記憶能力無明顯改變(P>0.05);酸性肽中、高濃度治療組的學(xué)習(xí)記憶能力均顯著升高(PO.Ol)。②酸性肽低濃度治療組基底前腦NGF的含量無明顯改變(P>0.05);酸性肽中、高濃度治療組基底前腦NGF的含量均顯著升高(PO.Ol)。③酸性肽低濃度治療組大腦皮層NMDAR1、Ae無明顯改變(P>0.05);酸性肽中、高濃度治療組大腦皮層NMDAR1、AP顯著降低(PO.Ol)。上述結(jié)果充分說明本發(fā)明酸性肽能明顯改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，對AD模型大鼠有良好的治療作用。而其治療作用則主要是通過促進基底前腦中NGF的產(chǎn)生和分泌以及抑制大腦皮質(zhì)中NMDAR1和AP產(chǎn)生而實現(xiàn)的。這表明酸性肽是作為神經(jīng)生長因子的誘生劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體及e淀粉樣蛋白的抑制劑或拮抗劑而發(fā)揮作用的。試驗實施例5本發(fā)明酸性肽對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌神經(jīng)生長因子(NGF)和腦源性生長因子(BDNF)的影響(1)大鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的純化培養(yǎng)取出生后2天內(nèi)的SD大乳鼠，在無菌條件下斷頭取出大腦皮質(zhì)部分，投入PBS中，仔細(xì)剔除中腦、嗅球、海馬、腦膜、毛細(xì)血管等結(jié)構(gòu)，將皮層剪碎成l-2mm3小塊，用吸管吹打l分鐘左右，加入0.25%的胰酶放入<:02培養(yǎng)箱中消化10分鐘，1000r/min離心10min，收集沉淀，DMEM培養(yǎng)基重懸。用200目的篩網(wǎng)過濾，調(diào)整細(xì)胞密度至1.0X106/ml，錐蟲藍實驗證明細(xì)胞存活率大于95%。接種于瓶底為25cn^的培養(yǎng)瓶中，每瓶5ml。一天后換液棄掉非貼壁細(xì)胞，而后每三天換液一次，待細(xì)胞長滿瓶底70%時，傳代，傳兩代后免疫組化染色證明星形膠質(zhì)細(xì)胞純度大于95%。(2)大鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定將傳兩代的星形膠質(zhì)細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，接種于預(yù)先鋪有多聚賴氨酸的蓋玻片上，三天后，先用0.01mol/LPBS漂洗，再用PBS配制的4%多聚甲醛固定，經(jīng)含3%&02禾口10。/o甲醇的0.01mol/LPBS處理，按照ABC免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色方法進行膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GF酸性肽)抗血清(1:500，Sigma)反應(yīng)，顯示陽性反應(yīng)的是星形膠質(zhì)細(xì)胞。(3)實驗分組及樣品的制備將培養(yǎng)的細(xì)胞分四組即含20%血清對照組、無血清對照組、陽性對照組、實驗組。含20%血清組和無血清對照組均不施加實驗因素，陽性對照組為1000U/ml干擾素，實驗組中則分別加入150ug/ml、75ug/ml、37.5ug/ml的酸性肽。對照組和實驗組均取24、48及72小時三種不同的作用時間。將長滿瓶底的第二代星形膠質(zhì)細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液以5X105/ml的濃度等量接種于三塊12孔培養(yǎng)板中，每孔lml，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后吸出板內(nèi)培養(yǎng)液。無血清對照組內(nèi)均加入不同濃度的酸性肽。每組均取24、48及72小時三種培養(yǎng)時間進行培養(yǎng)。實驗時間終止后，分別將上清液移入無菌的EP管中，離心(1000r/min，5分鐘)，再將上清夜分別移入另一無菌EP管，-201:冷藏待測。(4)細(xì)胞計數(shù)和存活率的檢測藥物作用時間結(jié)束后吸出培養(yǎng)上清液放入無菌的EP管中，培養(yǎng)板中加入同等少量體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶，置C02培養(yǎng)箱中消化充分吹打制成細(xì)胞懸液，用完全培養(yǎng)基終止消化并補充體積至lml，混勻立即細(xì)胞計數(shù)。用玻棒蘸一滴細(xì)胞懸液，滴于血球計數(shù)板上，計數(shù)四角四個大方格中的細(xì)胞數(shù)為N個。則總細(xì)胞數(shù):N/4Xl(^個/ml，細(xì)胞用PBS緩沖液輕洗兩次，每孔滴PBS配制的0.4。/。的苔盼藍溶液200ul，立即混勻，滴在血球計數(shù)板上，上鏡觀察，3min左右在倒置顯微鏡下觀察，隨機計數(shù)400個相鄰細(xì)胞中藍染(死亡細(xì)胞)和未藍染(存活細(xì)胞)的細(xì)胞個數(shù)，計算細(xì)胞死亡百分比。細(xì)胞存活率(％)=[(總細(xì)胞數(shù)-藍染細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)]X100%。(5)噻唑藍(thiazoleblue,MTT)實驗用0.25%胰蛋白酶消化傳二代的單層培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成單個細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為0.5X1()S個/ml，每孔200ul接種于預(yù)先鋪有多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞傳代于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24小時后，換液按實驗分組加入不同濃度的酸性肽，酸性肽組和陽性對照干擾素均用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋，同等條件下再培養(yǎng)72小時，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞生長情況。藥物作用時間結(jié)束后取出96孔板，加入20ul/孔MTT(濃度為5mg/ml)，然后再放入C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時，小心吸去培養(yǎng)液，加入DMSO150ul/孔，振蕩10min，使顆粒完全溶解，以不加細(xì)胞的培養(yǎng)液空白對照孔調(diào)零，酶標(biāo)儀檢測492nm的光密度值。用單因素方差分析對數(shù)據(jù)做統(tǒng)計學(xué)處理，并計算細(xì)胞增殖率。增殖率=(實驗組OD值一對照組OD值)/對照組OD值X100%(6)ELISA-ABC法測定細(xì)胞上清液中NGF和BDNF含量每種樣品為一組，每組8孔，用碳酸鹽緩沖液0.05mol/LpH9.6，包被培養(yǎng)上清液于96孔板，上清液10ul,包被液90ul，總量100ul/孔，4°C過液；PBS國T液漂洗5分鐘三次；用150ul封閉液37t:溫育l小時；漂洗五分鐘三次后；加入稀釋的NGF抗體(美國santcruze公司1:500),37'C溫育1小時；漂洗；力卩ABC復(fù)合物l:1:200(A:B:PBS，用前30分鐘配置)，37。C溫育l小時；漂洗；加底物顯色液100ul/孔，溫育30分鐘；加入2mol/LH2SO450ul/孔，終止反應(yīng)；其中空白組不加NGF抗體，僅加入PBS作對照，其余步驟各孔各組均相同。在芬蘭WellscanMK2and3型號ELISA檢測儀上，于450nm處以空白組調(diào)零后測各孔OD值。所得OD值的大小與包被液中NGF的含量成正比，即OD值可間接反映NGF的含量。(7)細(xì)胞內(nèi)NGF的測定藥物作用時間結(jié)束后吸出培養(yǎng)上清液放入無菌的EP管中，培養(yǎng)板中加入同等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶，置C02培養(yǎng)箱中消化15分鐘。充分吹打制成細(xì)胞懸液，用PBS補充體積至lml。吸入無菌的EP管中，放入-8(TC冰箱中。反復(fù)凍融，至細(xì)胞全部溶解。其余步驟同上(6)。(8)數(shù)據(jù)處理運用SPSS10.0統(tǒng)計軟件采用單因素方差分析和兩樣本均數(shù)t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(；±s)表示，以a=0.05作為有顯著性的檢驗標(biāo)準(zhǔn)。(9)結(jié)果細(xì)胞計數(shù)和存活率的檢測結(jié)果見表13和表14。表13細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果分組24小時48小時72小時無血清對照組0.7x107ml0.4x107ral0.27x105/ml20%血清組0.8xioVml1.1x105/ml'1.37x105/ml'酸性肽0.15mg/ml1.25x107ml'2.02x107ml*2.26x107ml'酸性肽0.075mg/ml1.Oxl05/ml'1.73x107ml'1.83x107ml'酸性肽0.0375mg/ml0.5x107ml'0.84x107ml'1.0x107ml'注該細(xì)胞計數(shù)為三組的平均值，與空白對照組比較*P<0.01表14細(xì)胞存活率的檢測結(jié)果分組24小時48小時72小時無血清對照組83.9%79.8%69.7%2tW血清組82.1%84.9191.6f酸性肽0.15mg/ml97.9f95.9f94.If酸性肽0.075mg/ml90.81.86.0%'83.9%"酸性肽0.0375mg/ml86.3%81.2%79.7%注該數(shù)據(jù)為三組的平均值，與無血清對照組比較***P《0.001，**P《0.01，*P<0.05。噻唑藍(thiazoleblue,MTT)實驗的結(jié)果見表15。表15酸性肽對大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響(；±s，n=8)_<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>注*與對照組比較ELISA-ABC法測定細(xì)胞上清液中NGF的含量變化結(jié)果見表16和表17。表16酸性肽對培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞上清中NGF的OD值(x±s，n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>與無血清對照組比較*P<0.001表17酸性肽對培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NGF的OD值(^土s，n=8)分組24小時48小時72小時無血清對照組1.1880.0480.8130.0610.5650.09220°/血清組1.035±0.0791.3020.1081.3470.093干擾素(1000U/ml)組1.177±0.0711.0330.0661.0160.046酸性肽(37.5ug/ml)組1.412±0.165'1.072±0.1920.9550.195酸性肽(75ug/ml)組1.3710.066'0.990±0.1580.888±0.112酸性肽(150ug/ml)組1.792±0.116'0.721±0.0910.636±0.085*P<0.01細(xì)胞分泌BDNF的測定結(jié)果見表18。表18酸性肽對培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液中分泌BDNF的OD值(^±s，n=8)分組24小時48小時72小時無血清對照組1.2710.0230.348±0.0070.225±0.Oil20%血清組1.5780.02"0.489±0.018"0.341±0.008"酸性肽(37.5ug/ml組)1.297±0.0.365±0.or0.234±0.008'酸性肽(75ug/ml)組1.366±0.018"0.398±0.007"0.298±0.008"酸性肽(150ug/ml)組1.536±0.018"0.475±0.006"0.328±0,007"與無血清對照組比較*P<0.05，**P<0.001試驗實施例6酸性肽透過血腦屏障實驗(1)實驗動物SD大鼠，60只，購于河南省實驗動物中心；雞、鴨、兔、牛和羊等動物購于市場。(2)Glu和酸性肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作分別配制0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml的Glu和酸性肽溶液。用微量進樣器分別精確吸取4^1濃度為0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml的溶液點在5個泳道上。300V電泳lh，取出后立即放在電熱鼓風(fēng)干燥箱中，65'C下烘干lOmin。用剪刀剪下斑點，95%的乙醇洗脫下斑點并用分光光度儀測定各個斑點洗脫液的OD值。以濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，分別繪制Glu、酸性肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)大鼠口服酸性肽對腦內(nèi)酸性肽含量的影響分析60只SD大鼠(購于河南省實驗動物中心)隨機分為6組，每組10只?？瞻讓φ战M每只大鼠灌2ml生理鹽水。其余5組大鼠用酸性肽灌胃2ml(100mg/kg)。各組分別在灌胃后lh、2h、3h、4h、5h采用斷頭處死。處死的大鼠立即剝顱取腦，加4倍重量的生理鹽水制成腦勻槳，3000r/min離心10min，取上清液，封閉后在沸水中煮5min，冷卻后，取lml，5000r/min離心10min。取上清液4pl點樣做紙電泳。300V電泳lh后取出電泳濾紙，放在烘箱中，65'C烘干10min。分別把對應(yīng)于Glu、酸性肽的斑點剪下，95%的乙醇洗脫，用UV-2000型分光光度計(A570nm)測出洗脫液的OD值。分別測出每組(10只)大鼠的Glu、酸性肽OD值，取其平均OD值，在Glu、酸性肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對應(yīng)的含量，然后換算出大鼠腦中的Glu、酸性肽含量。(4)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析實驗結(jié)果以^is表示，顯著性檢驗用方差分析及q檢驗，采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。(5)實驗結(jié)果Glu和酸性肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作結(jié)果見表19、20、附圖4、5。表19谷氨酸的OD值<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>谷氨酸(Glu)的標(biāo)準(zhǔn)曲線見附圖4。表20酸性肽的AP值<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>酸性肽(AP)的標(biāo)準(zhǔn)曲線見附圖5。大鼠口服酸性肽對腦內(nèi)酸性肽含量的影響分析結(jié)果見表21、22和附圖6。表21谷氨酸(Glu)在各組大鼠腦中的含量(mg/g腦組織)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>方差分析F=197.693PO.Ol表22酸性肽(AP)在各組大鼠腦中的含量(mg/g腦組織)組別例數(shù)x士sP對照組灌胃lh灌胃2h灌胃3h灌胃4h灌胃5h合計101010101010601.7789±0.20781.4662±0.15113.8377±0.27783.2253±0.27331.8701±0.18221.7398±0.18222.3197±0.9150<0.01<0.01<0.01>0.05>0.05方差分析F=32.757PO.Ol大鼠腦中酸性肽和Glu隨灌胃時間而變化的曲線圖如附圖6所示。通過上述實驗例(對早老型癡呆模型大鼠和血管型癡呆模型小鼠)可證明本發(fā)明小分子酸性肽干粉對早老性癡呆病具有療效。通過藥理學(xué)研究(包括①酸性肽對腦內(nèi)蛋白質(zhì)合成的影響；②酸性肽對凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡促進基因Bax基因表達的影響；③酸性肽對腦內(nèi)一氧化氮(NO),e淀粉樣肽和N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體產(chǎn)生水平的影響和對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響；酸性肽對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌神經(jīng)生長因子(NGF)和腦源性生長因子(BDNF)的影響；⑤酸性肽能否透過血腦屏障等)以證明其作用機理——1、酸性肽能增加腦內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，促進大腦損傷的修復(fù)；2、酸性肽能促進凋亡抑制基因Bcl-2基因的表達和抑制凋亡促進基因Bax基因的表達；3、酸性肽抑制一氧化氮(NO),e淀粉樣肽和N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體的產(chǎn)生，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。4、酸性肽能夠促進星形膠質(zhì)細(xì)胞合成和釋放神經(jīng)生長因子(NGF)和腦源性生長因子(BDNF)，從而促進星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，存活率增加，對神經(jīng)細(xì)胞的生長存活具有營養(yǎng)和保護作用。5、酸性肽為小分子3肽，無抗原性，能夠通過血腦屏障。另外，發(fā)明人已經(jīng)對本發(fā)明的小分子酸性肽干粉進行過毒理學(xué)研究(14天急性毒性實驗，90天慢性毒性實驗和35周誘癌實驗)，可以證實本發(fā)明小分子酸性肽的安全性。下面的制劑實施例說明包含由本發(fā)明提供的小分子酸性肽的藥用制劑。制劑實施例l片劑。按照本領(lǐng)域巳知的方法制備片劑，每片含有下述成份小分子酸性肽100mg乳糖30mg硬脂酸鎂O.lmg聚乙烯吡咯烷酮O.lmg制劑實施例2膠囊按照本領(lǐng)域已知的方法制備膠囊，每個膠囊中含有下述成份小分子酸性肽80mg乳糖20mg玉米淀粉10mg硬脂酸鎂0.03mg聚乙烯吡咯垸酮0.03mg制劑實施例3口服液按照本領(lǐng)域已知的方法制備口服液，每IO毫升口服液中含有下述成份:小分子酸性肽3.0g果糖l.Og水10mL苯甲酸(防腐劑)O.Olg權(quán)利要求1.一種小分子酸性肽，如以下氨基酸序列表示Glu-Glu-Glu。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酸性肽，其特征在于該酸性肽是以動物大腦的腦蛋白干粉為原料，經(jīng)Sephadex-G50柱層析、硅膠柱層析提取得到的。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的酸性肽，其中所述的動物大腦選自牛腦、羊腦、豬腦、雞腦、鴨腦、鵝腦。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的酸性肽，其中所述的動物大腦是牛腦。5、權(quán)利要求1所述酸性肽的提取方法，該方法包括以下步驟a、將動物腦蛋白干粉溶解于生理鹽水中，過濾后用Sephadex-G50柱層析，以蒸餾水為洗脫劑，收集含有2種小肽的洗脫液；b、步驟a中所得洗脫液用硅膠柱層析，以氯仿、甲醇、水的混合液為洗脫劑，收集Rf值為0.48的洗脫液，洗脫液冷凍干燥得目標(biāo)產(chǎn)物。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于所述動物腦蛋白干粉由下述方法制得將新鮮動物腦加入生理鹽水中，勻漿、離心處理后，收集上清液，上清液冷凍干燥得動物腦蛋白干粉。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于步驟a中收集的洗脫液的Rf值為0.45—0.52。8、根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于步驟b中所述洗脫劑各組分的體積比為氯仿甲醇水=60:50:10。9、用于預(yù)防或治療早老性癡呆病的藥物組合物，其特征在于含有治療有效量的權(quán)利要求1所述酸性肽活性成分和藥學(xué)上可接受的載體。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酸性肽在制備預(yù)防或治療早老性癡呆病藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種小分子酸性肽，其氨基酸序列如以下所示Glu-Glu-Glu。本發(fā)明還涉及該酸性肽的提取方法，它以動物大腦的腦蛋白干粉為原料，經(jīng)Sephadex-G50柱層析、硅膠柱層析提取而得。本發(fā)明還進一步涉及以該酸性肽為活性成分的藥物組合物，以及所述的酸性肽和藥物組合物在制備預(yù)防或治療早老性癡呆病藥物中的應(yīng)用。該產(chǎn)品具有生產(chǎn)容易、成本低廉、療效好等優(yōu)點。文檔編號A61K38/06GK101121745SQ200710118699公開日2008年2月13日申請日期2007年7月12日優(yōu)先權(quán)日2007年7月12日發(fā)明者安玉會申請人:安玉會