專利名稱：：用于抑制腦血管內(nèi)皮細胞分泌前列腺素E₂的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于抑制腦血管內(nèi)皮細胞分泌前列腺素E2的藥物，是源自中藥經(jīng)典名方桂枝湯苯丙稀類化合物的組合物，能抑制腦血管內(nèi)皮細胞分泌前列腺素E2，可用于防治發(fā)熱以及腦中風(fēng)、缺血性腦損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血、高血壓、腦血管硬化和先天性癡呆等病變。
背景技術(shù)：
：前列腺素E2(PGE2)系公認的中樞發(fā)熱介質(zhì)和重要的炎癥因子,機體許多細胞(包括腦血管內(nèi)皮細胞)在內(nèi)外致病因子刺激下，都能誘生過量的PGE2,造成組織損傷、凋亡或增殖，引起各種病變和疾病。已有的研究表明，腦血管內(nèi)皮細胞誘生的PGE2可擴張局部血管，易化水腫形成，促進血管新生和動脈硬化，與發(fā)熱、疼痛、中風(fēng)、缺血性腦損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血、高血壓、腦血管硬化和先天性癡呆的發(fā)生發(fā)展有關(guān)(SimmonsDL.,BottingRM.,HlaT.:Cyclooxygenaseisozymes:ThebiologyandProstaglandinsynthesisandinhibition.Pharmacol.Rev.2004;56:387-437)。尋找腦血管內(nèi)皮細胞合成分泌前列腺素E2的阻斷劑，是近幾年人們才開始研究防治上述有關(guān)疾病的新的靶標(biāo)。但目前除了對現(xiàn)有的環(huán)氧酶抑制劑作了初步篩選、發(fā)現(xiàn)對乙酰氨基酚等對腦血管內(nèi)皮合成分泌有一定抑制作用外，尚未有選擇性的新藥問世(KisB.,SnipesJA.,SimandleSA.,BusijaDW.:Acetaminophen-sensitiveprostaglandinproductioninratcerebralendothelialcells.Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.2005;288:R897-R902)。同系化合物(Homologuecompounds),是指化學(xué)結(jié)構(gòu)上有相同母核、具有不同官能團的系列化合物。它有狹義和廣義之分，狹義的是指官能團的差異在于《112-的數(shù)目，廣義的則不予局限。關(guān)于藥物的化學(xué)實體，中藥的化學(xué)實體有飲片的粉末、飲片的各類粗提物、活性化學(xué)部位和化學(xué)單體，也包括中西藥物的組合物；西藥化學(xué)藥的化學(xué)實體有單一化學(xué)單體或幾個化學(xué)單體的組合物；生物藥物的化學(xué)實體是以某一生物物質(zhì)為主的產(chǎn)物。迄今尚未見以同系化合物、更未見以若干數(shù)目、明確比值的同系化合物組合作為藥物化學(xué)實體的。經(jīng)查PubMed、CNKI和美英日等國藥典及其相關(guān)藥品監(jiān)管部門網(wǎng)頁，均未見有同系化物作藥品的記載。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于抑制腦血管內(nèi)皮細胞分泌PGE2的藥物，應(yīng)用于臨床。在研究中醫(yī)經(jīng)典方劑桂枝湯的過程中，發(fā)現(xiàn)它的一組苯丙烯類化合物，按一定的配伍比例組合，能協(xié)同地有效抑制腦血管內(nèi)皮細胞分泌前列腺素E2，可作為一種腦血管內(nèi)皮細胞分泌PGE2的阻斷劑，應(yīng)用于臨床。1.技術(shù)方案本發(fā)明源自中藥桂枝湯的2-甲氧基桂皮醛(o-methoxy-3-phenyl-2-propenal)、2-甲氧基桂皮醇(o-methoxy-3-phenyl-2-propeno1)、2-甲氧基桂皮酸(o-methoxy-3-phenyl陽2-propenoicacid)、桂皮醛(3-phenyl-2-propenal)、桂皮醇(3-phenyl-2-propeno1)、桂皮酸(3-phenyl-2-propenoicacid)等6種苯丙烯類化合物對腦血管內(nèi)皮細胞分泌釋放具有不同程度的抑制作用。本發(fā)明的另一個目的是將上述6種苯丙烯類化合物，按下述重量比配置2-甲氧基桂皮醛1份、2-甲氧基桂皮醇0.01-0.1份、2-甲氧基桂皮酸0.05-0.15份、桂皮醛10-20份、桂皮醇4-8份、桂皮酸0.05-0.1份等混合成的組合物，對腦血管內(nèi)皮細胞分泌前列腺素E2的抑制呈協(xié)同作用。2.實施結(jié)果2.1桂枝湯苯丙烯類化合物的獲得從中醫(yī)經(jīng)典方劑桂枝湯(由桂枝、芍藥、生姜、大棗、甘草組成)的水煎提取物中多次分離獲得2-甲氧基桂皮醛、2-甲氧基桂皮醇、2-甲氧基桂皮酸、桂皮醛、桂皮醇、桂皮酸等活性成分，得率如表l所示表1.桂枝湯中苯丙烯類6種化合物的得率活性化合物得率(％)得率范圍相互比值范圍#2-甲氧基桂0.3416，0.8540,0.4270，0.854—0.2131皮醛0.2135,0.64052-甲氧基桂0.0288,0.0194,0.0096，0.038—0.0090.01—0.10皮醇0.0384，0.01532-甲氧基桂0.0388，0.0192，0.0656,0.066—0.0190.05—-0.15皮酸0.0307,0.0576桂皮醛6.5778,5.2606，13.151,13.15—3.2910.0—20.03.2879,9,8637桂皮醇5.3802,2.7026,1.3450,5.380—1.3454—-82.1521,4.0351桂皮酸0.0576,0.0307,0.0388,0.066…0.0190.05—0.100.0656,0.0192#是以2-甲氧基桂皮醛的得率為基準(zhǔn)(比值為l)計算其他化合物得率與之的比值，并以實際比值作調(diào)整所確定的范圍。腦微血管內(nèi)皮細胞的獲取取雄性幼年SD大鼠，麻醉，斷頭，取大腦皮質(zhì)，勻漿，不同孔徑的濾網(wǎng)過濾，收集血管段，洗滌，膠原酶消化，吹打、洗漆、富集，接種于明膠覆蓋的培養(yǎng)瓶，C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，換液傳代，以第八因子相關(guān)抗原作免疫組化和細胞形態(tài)鑒定，確定為血管內(nèi)皮細胞。供實驗用。2.26個苯丙烯類化合物分別對白介素-10(IL-1P)刺激腦血管內(nèi)皮細胞分泌前列腺素E2的抑制作用取培養(yǎng)的腦血管內(nèi)皮細胞，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2xl(^細胞，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)至長成融合狀態(tài)后，分別加入2-甲氧基桂皮醛、2-甲氧基桂皮醇、2-甲氧基桂皮酸、桂皮醛、桂皮醇、桂皮酸等6個化合物，每種化合物的劑量均為12.5yg/ml、25iig/ml、50ug/ml、100iig/ml、200lig/ml;繼而加入致炎因子白介素-1e30ng/ml激惹腦血管內(nèi)皮細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，12小時后，取培養(yǎng)液(細胞外液)，使用PGE2_ELISA測定試劑盒，檢測細胞外液中的前列腺素E2含量(pg/ml)。并以概率單位法計算出每個化合物對腦血管內(nèi)皮細胞分泌釋放前列腺素E2的半數(shù)抑制濃度(IC5。)。結(jié)果如表2所示。從表2結(jié)果可知，6種苯丙烯類化合物對腦血管內(nèi)皮細胞分泌釋放前列腺素E2均有不同程度的抑制作用。其中，2-甲氧基桂皮醛、2-甲氧基桂皮醇、桂皮醛、桂皮醇作用較強。依作用強弱依次為桂皮醛>2-甲氧基桂皮醛>桂皮醇>2-甲氧基桂皮醇>桂皮酸>2-甲氧基桂皮酸。2.36個苯丙烯類化合物按不同配比聯(lián)合應(yīng)用，對白介素-1P(IL-1P)刺激腦血管內(nèi)皮細胞分泌前列腺素E2的抑制作用2.3.1按1:0.04:0.09:15.4:6.3:0.08配比的組合物以上述6個苯丙烯類化合物在桂枝湯中所測含量(得率)比值，取其中位數(shù)，將2-甲氧基桂皮酸、2-甲氧基桂皮醇、2-甲氧基桂皮酸、桂皮醛、桂皮醇、桂皮酸等6種化合物依次按1:0.04:0.09:15.4:6.3:0.08進行混合，將此混合的組合物按本文(2.2)的方法，觀察它對白介素-ie(il-ie)剌激腦血管內(nèi)皮細胞分泌前列腺素E2的抑制作用。結(jié)果如表3所示，按6種苯丙烯類化合物在桂枝湯中含量比例混合的組合物,處理IL-2e激惹的腦血管內(nèi)皮細胞，對其分泌釋放PGE2的半數(shù)抑制濃度(IC50)為48.79ug/ml，比其組合的各個單一化合物的IC50為低，說明組合物的作用強度高于任何一個單一化合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3.不同比例的苯丙烯類組合物對IL-1P刺激的腦血管內(nèi)皮細胞釋放<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>應(yīng)用擴展的等效線法(isobolerquation)，計算比較了2-甲氧基桂皮醛、2-甲氧基桂皮醇、2-甲氧基桂皮酸、桂皮醛、桂皮醇、桂皮酸及其組合物的IC50的相互關(guān)系，Q值為0.92(Q值〈為協(xié)同作用、Q值-l為相加作用、Q值〉l為拮抗作用)，表明聯(lián)合應(yīng)用后的組合物抑制PGE2釋放的效應(yīng)，是6個成分間的協(xié)同作用的結(jié)果。2.3.2按1:0.01:0.05:10.0:4.0:0.05配比的組合物將2-甲氧基桂皮醛、2-甲氧基桂皮醇、2-甲氧基桂皮酸、桂皮醛、桂皮醇、桂皮酸等6種化合物依次按相互的最小比例范圍(1:0.01:0.05:10.0:4.0:0.05進行混合，制成組合物，按(2.3.1)方法，觀察它對白介素-ie剌激腦血管內(nèi)皮細胞分泌前列腺素E2的抑制作用。結(jié)果如表4所示，其分泌釋放PGE2的半數(shù)抑制濃度(IC50)為66.49ug/ml。應(yīng)用擴展的等效線法，計算比較了2-甲氧基桂皮醛、2-甲氧基桂皮醇、2-甲氧基桂皮酸、桂皮醛、桂皮醇、桂皮酸及其組合物的IC50的相互關(guān)系，Q值為表4.不同比例的苯丙烯類組合物對IL-1P剌激的腦血管內(nèi)皮細胞釋放PGE2的影響-2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>苯丙烯類組合物(1:0.01:0.05:10.0:4.0:0.05)的IC5066.49ug/ml2.3.3按1:0.10:0.15:20.0:8.0:0.10配比的組合物0.999，表明聯(lián)合應(yīng)用后的組合物抑制PGE2釋放的效應(yīng)，是6個成分間的協(xié)同作用的結(jié)果，但己接近相加的作用。將2-甲氧基桂皮醛、2-甲氧基桂皮醇、2-甲氧基桂皮酸、桂皮醛、桂皮醇、桂皮酸等6種化合物依次按相互的最大比例范圍(1:0.10:0.15:20.0:8.0:0.10)進行混合，制成組合物，按(2.3.1)方法，觀察它對白介素-1P剌激腦血管內(nèi)皮細胞分泌前列腺素E2的抑制作用。結(jié)果如表5所示，其分泌釋放PGE2的半數(shù)抑制濃度(IC50)為52.62ng/ml。應(yīng)用擴展的等效線法，計算比較了2-甲氧基桂皮醛、2-甲氧基桂皮醇、2-甲氧基桂皮酸、桂皮醛、桂皮醇、桂皮酸及其組合物的IC50的相互關(guān)系，Q值為0.997，表明聯(lián)合應(yīng)用后的組合物抑制PGE2釋放的效應(yīng)，是6個成分間的協(xié)同作用的結(jié)果，但也己接近相加的作用。表5.不同比例的苯丙烯類組合物對IL-ie刺激的腦血管內(nèi)皮細胞釋放PGE2的影響-3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>苯丙烯類組合物(1:0.10:0.15:20.0:8.0:0.10)的IC5052.62iig/ml3有益效果以上結(jié)果表明，2-甲氧基桂皮醛、2-甲氧基桂皮醇、2-甲氧基桂皮酸、桂皮醛、桂皮醇、桂皮酸等6種化合物按一定比例聯(lián)合應(yīng)用，具有協(xié)同效果，而其相互配伍比值應(yīng)在l:0.01-0.10:0.05-0.15:10.0-20.0:4.0-8.0:0.05-0.10之內(nèi)。本發(fā)明的特點與優(yōu)點①本發(fā)明是由6個苯丙烯類同系化合物混和而成的組合物，以同系化合物作為活性物質(zhì)，是中藥新藥一類新的化學(xué)實體。②本發(fā)明針對的是引起腦和腦血管組織損傷、凋亡或增殖等基本病理過程中、由腦血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的一種重要細胞因子-PGE2，故對多種相關(guān)疾病具有多效性。③本發(fā)明的化學(xué)成分明確，配伍比例清楚，質(zhì)量可控性強，又體現(xiàn)了中藥系活性成分群組成的特點。④本發(fā)明可制成口服和注射劑型，供急、慢性患者使用。具體實施例方式取2-甲氧基桂皮醛100克、2-甲氧基桂皮醇5(110)克、2-甲氧基桂皮酸9(515)克、桂皮醛1525(10002000)克、桂皮醇627(400800)克、桂皮酸6.8(510)克，在膠體磨中研磨均勻，得原料藥，制成(1)加入聚乙二醇400適量，制成軟膠囊9090粒，每粒膠囊含6種苯丙烯類的組合物250毫克，供口服使用；或(2)加入36倍的碳酸鈣、磷酸鈣或e-環(huán)糊精等，制粒，壓片，包衣，制成片劑18180片，每片含6種苯丙烯類的組合物125毫克，供口服使用；或(3)加入聚氧乙烯氫化蓖麻油，制成注射劑9090瓶，每瓶含6種苯丙烯類的組合物125毫克，供注射使用。以上制劑可作為腦血管內(nèi)皮細胞分泌釋放PGE2的抑制劑，也可用于前列腺素E2局部過度分泌誘致的發(fā)熱、疼痛、中風(fēng)、缺血性腦損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血、高血壓、腦血管硬化和先天性癡呆等疾患。實施例之一將源自中藥桂枝湯的各成分按下述重量比配置2-甲氧基桂皮醛1份2-甲氧基桂皮醇0.05份2-甲氧基桂皮酸0.1份桂皮醛15.5份桂皮醇6.5份桂皮酸為0.1份。權(quán)利要求1.一種用于抑制腦血管內(nèi)皮細胞分泌前列腺素E2的藥物，其特征是由6種苯丙烯類化合物組成2-甲氧基桂皮醛(o-methoxy-3-phenyl-2-propenal)、2-甲氧基桂皮醇(o-methoxy-3-phenyl-2-propenol)、2-甲氧基桂皮酸(o-methoxy-3-phenyl-2-propenoicacid)、桂皮醛(3-phenyl-2-propenal)、桂皮醇(3-phenyl-2-propenol)、桂皮酸(3-phenyl-2-propenoicacid)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于抑制腦血管內(nèi)皮細胞合成分泌前列腺素E2的藥物，其特征在于6種苯丙烯類化合物的重量比為2-甲氧基桂皮醛l份2-甲氧基桂皮醇0.010.1份2-甲氧基桂皮酸0.050.15份桂皮醛1020份桂皮醇48份桂皮酸為0.050.1份。全文摘要一種用于抑制腦血管內(nèi)皮細胞分泌前列腺素E₂的藥物，它是由2-甲氧基桂皮醛、2-甲氧基桂皮醇、2-甲氧基桂皮酸、桂皮醛、桂皮醇、桂皮酸等6種苯丙烯類化合物組合構(gòu)成，能抑制腦血管內(nèi)皮細胞分泌釋放前列腺素E2，可用于防治由前列腺素E2過度表達引起的腦及腦血管性疾病。文檔編號A61P9/00GK101371830SQ20071012065公開日2009年2月25日申請日期2007年8月23日優(yōu)先權(quán)日2007年8月23日發(fā)明者姜廷良,李蘭芳,郭淑英,霍海如申請人:中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所