專利名稱：一種注射用人體皮膚填充劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種組織填充劑及其制備方法，更具體地說，是一種注射用人體皮膚填充劑及其制備方法。
背景技術：
人體軟組織填充是作為修復軟組織在損傷后的主要治療方法。十九世紀就已經開始使用石蠟、硅氧烷進行填充。上個世紀八十年代之后又出現了明膠粉末材料，但其均有療效不確定，毒副作用大等問題。
1997年之后，Isolagen采用自體成纖維細胞作為團組織填充材料，有了一定的療效，但存在顯效慢，療效不顯著等問題。
中國專利03155833.X中公開了一種除皺祛疤的注射劑，應用了自體皮膚，經體外分離、培養(yǎng)和擴增，制成于葡萄糖液中的一種注射劑，治療疤痕和祛除皺紋。由于該技術使用的生物材料取自患者自體，無排斥反應，效果持久，但該技術的不足之處是，注射劑中能立即發(fā)揮人體軟組織的填充和修復功能的膠原蛋白含量較低，導致注射到疤痕和皺紋處后見效較慢，一般要4-6個月；另外，使用動物血清作為培養(yǎng)液的成分也可能存在安全性方面的問題。
我們在2006年發(fā)明了采用自體的成纖維前體細胞和透明質酸構成的新的填充材料，有效的改善了單純成纖維細胞治療出現效果慢的缺陷，但是透明質酸最主要的作用是保水，對細胞的擴增和存活作用較弱。
本專利應用治療者自體富含血小板的血漿作為注射材料的一部分，自體血漿中的血小板能有效的提高自體細胞的成活率，注射后其產生的細胞因子能促進自體細胞的擴增和產生較多的膠原蛋白，同時自體血漿中的血小板成分與凝血因子構成一種網狀結構，能使自體細胞更大量的擴增并擴大了細胞分泌膠原蛋白的空間。因而，自體富含血小板的血漿優(yōu)于透明質酸。

發(fā)明內容
為了克服上述注射用人體軟組織填充劑的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種立即見效、療效持久、受術者滿意度更高的注射用人體軟組織填充劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供這種注射用填充劑的制備方法。
為實現上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案一種注射用人體皮膚填充劑，該填充劑主要由細胞成分與富含血小板血漿、凝血因子和鈣離子組成，每毫升注射用填充劑中細胞成分的含量為1000-5000萬個，血小板的含量為100-700×106個/，凝血因子含量為1-10單位，鈣離子含量為10-40mmol；所述細胞成分是指采用治療者自體的皮膚經過體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴增，收集得到的真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞中的至少一種。
優(yōu)選地，在本發(fā)明所述填充劑中，所述的經培養(yǎng)和擴增后收集到的真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞的數量之比為10-20∶50-70∶20-30。
用于本發(fā)明的血漿是自體的，凝血因子可以是自體血液中提取也可以是從動物材料中提取，為醫(yī)藥級產品。
優(yōu)選地，在本發(fā)明所述填充劑中，血漿中的血小板含量為100-700×106個/ml注射用填充劑，進一步優(yōu)選200-300×106個/ml注射用填充劑。
本發(fā)明所述的填充劑除了細胞成分和富含血小板血漿、凝血因子、鈣離子之外，還可以含有一些輔助成分，所述輔助成分可以是本領域常見的能夠加入到填充劑中的任何一種或多種成分，如自體膠原蛋白、維生素、葡萄糖、等滲生理鹽水等等。
本發(fā)明使用的低血清培養(yǎng)基僅需添加3％～5％胎牛血清，而傳統培養(yǎng)基通常須加入約10％的新生牛血清，低血清培養(yǎng)基對于細胞生長、增殖、形態(tài)、活性和功能沒有不良影響，甚至有所改善。
此外，本發(fā)明還提供了一種所述注射用人體軟組織填充劑的制備方法，該方法包括下列步驟(1)采用治療者自體的皮膚進行體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴增，對所得到的真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞進行收集；(2)將收集到的細胞成分與自體富含血小板的血漿配成注射用人體軟組織填充劑。
(3)配置凝血因子和鈣離子溶液作為輔助成分。
本發(fā)明所采集的皮膚組織可以是從耳后、切眼袋、切眉或者其它部位所得到的皮膚，同時包括表皮和真皮。
在本發(fā)明所提供的填充劑制備方法中，將來源于治療者自體的少量皮膚，例如，1-30平方毫米的皮膚，在加入了生長因子和活性材料的低血清或無血清培養(yǎng)液中進行體外培養(yǎng)和擴增，得到真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞。
所述體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴增中，所述培養(yǎng)液的組成可以是本領域常用的基礎培養(yǎng)液，例如，可以參見《細胞實驗指南》中的有關介紹(2001年，科學出版社出版，主編D.L.斯佩克特，黃培唐翻譯)。優(yōu)選地，在體外全程無血清培養(yǎng)和擴增過程中，使用的培養(yǎng)液中還包括生長因子和活性材料。所述生長因子為選自上皮生長因子、成纖維生長因子中的一種或多種；所述活性材料選自氫化可的松、肝素中的一種或多種。所述上皮生長因子在培養(yǎng)液中的含量可以為1至5納克/毫升，優(yōu)選為3納克/毫升；所述成纖維生長因子在培養(yǎng)液中的含量可以為2至20納克/毫升，優(yōu)選為10納克/毫升；所述氫化可的松在培養(yǎng)液中的含量可以為0.2至2微克/毫升，優(yōu)選為1微克/毫升；所述肝素在培養(yǎng)液中的含量可以為2至20微克/毫升，優(yōu)選為10微克/毫升。上述的培養(yǎng)液和生長因子及活性材料可以是選自一個公司或者多個公司(如美國的Cascade公司、Sigma公司、Hyclne公司等)的市售產品。
在本發(fā)明所提供的填充劑制備方法中，所述體外培養(yǎng)和擴增可采用本領域常見的任何用于為獲得自體細胞的體外培養(yǎng)和擴增方法，如組織消化培養(yǎng)法、組織塊培養(yǎng)法等，優(yōu)選采用組織塊培養(yǎng)法。
下面進一步詳細說明本發(fā)明所提供的填充劑制備方法，但本發(fā)明并不因此而受到任何限制。
1、自體皮膚取材用酒精消毒取材部位，進行局部表面麻醉。用取皮器或手術刀和手術剪刀將1-30平方毫米的表皮和真皮組織取下，放入組織保存液中。將創(chuàng)傷部位做一到三針縫合，創(chuàng)可貼覆蓋。也可以采用面部整形手術時切除的多余皮膚組織塊，如手術切除眼袋或切眉所得到的皮膚。
2、皮膚組織培養(yǎng)前處理將皮膚組織塊放置于培養(yǎng)皿中清洗上皮部位，然后去除皮下組織和脂肪，將皮膚組織剪碎為0.1-0.5平方毫米的皮膚碎片，最后將皮膚碎片平鋪于培養(yǎng)皿的底面。另外，對于通過做切眼袋、切眉手術或者其它部位獲得的大于4平方毫米的皮膚組織，可首先將皮膚組織塊用胰酶液消化一段時間，再將消化后的組織塊剪碎平鋪于培養(yǎng)皿的底面。
3、細胞體外培養(yǎng)包括原代細胞培養(yǎng)和傳代細胞培養(yǎng)兩個步驟。
原代培養(yǎng)在已平鋪皮膚碎片的培養(yǎng)皿中加入DMEM和低血清培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，使細胞擴增到50％-90％的培養(yǎng)皿底面即可進行傳代培養(yǎng)。
傳代培養(yǎng)在原代培養(yǎng)的基礎上加入生長因子(如上皮生長因子、成纖維生長因子等)和活性材料(如氫化可的松、肝素等)，培養(yǎng)2-8周，大約培養(yǎng)擴增至1500萬-2億個細胞。
上皮生長因子在培養(yǎng)液中的含量可以為1至5納克/毫升，優(yōu)選為3納克/毫升；所述成纖維生長因子在培養(yǎng)液中的含量可以為2至20納克/毫升，優(yōu)選為10納克/毫升；所述氫化可的松在培養(yǎng)液中的含量可以為0.2至2微克/毫升，優(yōu)選為1微克/毫升；所述肝素在培養(yǎng)液中的含量可以為2至20微克/毫升，優(yōu)選為10微克/毫升。
采用本領域常用的細胞培養(yǎng)條件即可，如可將從組織塊培養(yǎng)出的真皮細胞(含成纖維干細胞、成纖維前體細胞和成纖維細胞)用上述的低血清或無血清培養(yǎng)液在溫度為37℃，5％的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3-4天換上述培養(yǎng)液一次，直至得到所需的細胞成分的含量。
在醫(yī)院或診所由醫(yī)護人員抽取治療者5-30毫升血液。在潔凈的實驗室或化驗室條件下將此血液置入裝有細胞分離液的離心管中，以500-2500轉/分的轉速離心25分鐘，優(yōu)選轉速1500轉/分鐘，優(yōu)選離心時間為15分鐘，提取上部的富含血小板的血漿作為自體注射用的血漿。
4、填充劑配制將培養(yǎng)數量達到要求的細胞首先使用胰蛋白酶進行消化處理，使其脫離培養(yǎng)皿底面，在使用無外源性蛋白的DMEM清洗數次，去除外源性生長因子和活性物質。再將收集到的細胞與少量膠原蛋白直接加入富含血小板的血漿中，混勻，配成注射填充劑，每毫升注射用填充劑中細胞成分的總個數為1000-5000萬個，血小板的含量為100-700×106個。
凝血因子是從治療者自己的血液中經過熱冷交換處理得到的凝血因子，或者是醫(yī)療試劑公司購得的人源性或動物源性的醫(yī)用的凝血因子，將其配制成濃度為1-10單位/ml的溶液。氯化鈣或檸檬酸鈣配制成濃度為10-40mmo/ml的溶液。
治療步驟先將含有細胞和血漿的溶液注射到治療部位，使填充部位出現發(fā)白和輕微的隆起為止，再將凝血因子與鈣離子溶液的混合溶液從同一針孔進入注射，注射到稍感硬度，發(fā)白度更加明顯，注射過程完成。
與現有技術相比，本發(fā)明的注射用人體軟組織填充劑包含了大量的血漿和凝血因子構成支架結構，在注射部位能快速產生填充除皺和修復效果；隨后，在大量的血小板中產生的自體生長因子的作用下，注射填充劑中含有的細胞成分能不斷地分泌出膠原蛋白，保持填充和修復的效果。該注射用人體軟組織填充劑在注射后可快速出現明顯的填充和修復效果，且療效持久。此外，本發(fā)明的注射用人體軟組織填充劑在制備過程中使用了低血清或無血清培養(yǎng)，基本不含有外源性免疫原性物質，大大降低了注射后感染動物源性疾病和發(fā)生過敏的危險。且由于血小板和自體血漿對細胞起到促進作用，可誘導細胞生成膠原蛋白纖維并使組織再生，使除皺和修復效果更加自然。
因此，本發(fā)明的注射用人體軟組織填充劑可廣泛用于美容、改善皮膚彈性和光澤以及其它部位和類型的填充和修復中，包括處理由于真皮缺損而導致的各種癥狀，例如面部皺紋、凹陷性疤痕、妊娠紋、手背皺紋等，還可用于豐唇、增強真皮厚度和改善皮膚基質等。


圖1是培養(yǎng)成功的真皮細胞在100倍光學顯微鏡下形態(tài)學照片；圖2是本發(fā)明的一個具體實施例的注射用人體軟組織填充劑在包裝瓶中照片。其中左瓶為細胞與富含血小板血漿注射填充劑，右瓶為凝血因子和鈣離子注射填充劑；圖3和圖4是本發(fā)明的一個具體實施例治療紋前后的對比照片，其中圖3為受術者頸紋治療前照片，圖4為受術者頸紋治療后照片；具體實施方式
下面進一步詳細說明本發(fā)明所提供的注射用人體軟組織填充劑及其制備方法，但本發(fā)明并不因此而受到任何限制。
實施例人體軟組織填充劑的制備一.自體健康皮膚樣品的提取用70％的酒精消毒耳后，然后用10％的利多卡因和十萬分之一的腎上腺素進行局部表面麻醉。用取皮器或手術刀和手術剪刀將接受治療者耳后4平方毫米的表皮和真皮組織取下，放入組織保存液(DMEM細胞保存液，購自美國Hyclone公司)中，將創(chuàng)傷部位做一針縫合，創(chuàng)可貼覆蓋。
二.細胞懸液的制備1.皮膚組織培養(yǎng)前處理將皮膚組織塊放置于培養(yǎng)皿中清洗上皮部位，然后去除皮下組織和脂肪，將皮膚組織剪碎為0.1-0.5平方毫米的皮膚碎片，最后將皮膚碎片平鋪于培養(yǎng)皿的底面。
2.原代細胞培養(yǎng)在已平鋪皮膚碎片的培養(yǎng)皿中加入DMEM和3％的胎牛血清，放入Forma CO23131型培養(yǎng)箱中，在37℃，5％CO2的條件下進行培養(yǎng)，每隔2～3天換上述培養(yǎng)液一次，當原代細胞達到80％匯集后傳代。
3.傳代細胞培養(yǎng)在原代培養(yǎng)的基礎上加入上皮生長因子為3納克/毫升、成纖維生長因子10納克/毫升、氫化可的松1微克/毫升、肝素10微克/毫升，每3-4天換上述培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)4周，大約培養(yǎng)擴增至1500萬個細胞。
4.配制注射劑將培養(yǎng)數量達到要求的細胞首先使用胰蛋白酶進行消化處理，使其脫離培養(yǎng)皿底面，再使用無外源性蛋白的DMEM清洗3次。將收集到的細胞與少量膠原蛋白直接加入富含血小板的血漿中，混勻，配成注射填充劑，每毫升注射用填充劑中細胞成分的總個數為1000-5000萬個，血小板的含量為100-700×106個。
凝血因子是從治療者自己的血液中經過熱冷交換處理得到的凝血因子，或者是醫(yī)療試劑公司購得的人源性或動物源性的醫(yī)用的凝血因子，將其配制成濃度為1-10單位/ml的溶液。氯化鈣配制成濃度為10-40mmmol/ml的溶液。
病毒檢測皮膚組織培養(yǎng)4周后，取1ml含有細胞的培養(yǎng)液進行HIV和肝炎病毒的檢驗，確定此為無病毒細胞。
免疫反應測試第4周將0.1ml細胞與血小板注射液對受術者進行皮試(同青霉素皮試方法)，無免疫反應。
成品檢測1)外觀細胞與血小板注射液為黃色混懸液，凝血因子和氯化鈣溶液為白色半透明液體。
2)本品中細胞分類檢定成纖維干細胞采用Brdu抗體測定(黃暉，賴西南，王正國，王麗麗，“創(chuàng)傷愈合中物質對表皮干細胞遷移及受體表達的作用”；《中華創(chuàng)傷雜志》2004年；20(3)142-145。利用核標記物)，產品中有10％的成纖維干細胞。
成纖維前體細胞采用細胞形態(tài)學方法觀察(在100倍光學顯微鏡下做形態(tài)學觀察，其標準形態(tài)為細小長索狀)，產品中有70％的成纖維前體細胞。
成纖維細胞采用細胞形態(tài)學方法觀察(在100倍光學顯微鏡下做形態(tài)學觀察，其標準形態(tài)為呈多觸突的長索形細胞)，產品中有20％的成纖維細胞。
3)無菌試驗按《中國生物制品規(guī)程》(2000版)通則《生物制品無菌試驗規(guī)程》A/B項進行，結果符合無菌要求。
三.治療用于額頭皺紋，眼角魚尾紋，脖頸皺紋，妊娠紋等所有面部及其它身體部位的皺紋和細小皺紋；治療5例。
1.治療者術前檢查，各項指標均正常，包括血尿便常規(guī)、心電圖、肝腎功能、HIV、HbsAg。
2.將注射部位用70％的酒精消毒，局部注射1％的利多卡因麻醉。
3.將1ml填充劑吸入1ml的注射器中備用。
4.取2.2cm長的4.5號針頭，采用多點斜面(針頭與皮膚的角度20°～45°)，在注射部位注射時，將注射部位表皮拉緊注射細胞，使其發(fā)白，注射時使注射部位留有彌散空間。先將含有細胞和血漿的溶液注射到治療部位，使填充部位出現發(fā)白和輕微的隆起為止，再將凝血因子和氯化鈣的溶液從同一針孔進入注射，注射到稍感硬度，發(fā)白度更加明顯，注射過程完成。
療程注射部位共注射1次。
四、術后觀察、調護1.手術后，用冰袋敷注射處2小時。
2.觀察局部及全身的情況一切正常。
3.每天二次口服維生素C(每次2.00mg，每天共400mg)，服用6個月。
4.術后3天內防曝曬及慎用刺激性化妝品。
五、效果描述皺紋在注射后基本消失或明顯變淺，效果良好。注射前后的效果對比見圖3至圖4。
權利要求
1.一種注射用人體皮膚填充劑，該填充劑主要由細胞成分與富含血小板血漿、凝血因子和鈣離子組成，每毫升注射用填充劑中細胞成分的含量為1000-5000萬個，血小板的含量為100-700×106個，凝血因子含量為1-10單位；所述細胞成分是指治療者自體的皮膚經體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴增后收集到的真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞中的至少一種。
2.根據權利要求1所述的注射用人體軟組織填充劑，其特征在于所述富含血小板的血漿是從治療者血液中提取，且所述血小板的含量范圍為100-700×106個/ml注射用填充劑。
3.根據權利要求1所述的注射用人體軟組織填充劑，其特征在于所述凝血因子的含量為1-10單位/ml注射用填充劑，可以從自體血液中提取，也可以使用動物來源的凝血因子。
4.根據權利要求1所述的注射用人體軟組織填充劑，其特征在于所述的鈣離子為Cacl2或檸檬酸鈣，其含量為10-40mmol/ml。
5.根據權利要求1或3所述的注射用人體軟組織填充劑，其特征在于所述的經培養(yǎng)和擴增后收集到的真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞的數量之比為10-20∶50-70∶20-30。
6.一種制備權利要求1至4中任意一項所述的注射用人體軟組織填充劑的方法，包括以下步驟(1)采用治療者自體的皮膚進行體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴增，收集所得到的真皮成纖維干細胞、成纖維前體細胞、成纖維細胞；(2)從治療者臂部抽全血5-30毫升，在體外分離所得富含血小板的血漿。(3)將收集到的細胞成分與富含血小板的血漿構成成注射用人體軟組織填充劑；每毫升該填充劑中細胞成分的含量為1000-5000萬個，血小板的含量為100-700×106個。
7.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述低血清或無血清體外培養(yǎng)和擴增采用組織塊培養(yǎng)法。
8.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于所述體外低血清或無血清培養(yǎng)和擴增中加入了生長因子和活性材料；所述生長因子選自上皮生長因子、成纖維生長因子中的一種或多種，所述活性材料選自氫化可的松、肝素中的一種或多種。
9.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于所述上皮生長因子在培養(yǎng)液中的含量為1至5納克/毫升；所述成纖維生長因子在培養(yǎng)液中的含量為2至20納克/毫升；所述氫化可的松在培養(yǎng)液中的含量為0.2至2微克/毫升；所述肝素在培養(yǎng)液中的含量為2至20微克/毫升。
10.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于所述上皮生長因子在培養(yǎng)液中為3納克/毫升；所述成纖維生長因子在培養(yǎng)液中的含量為10納克/毫升；所述氫化可的松在培養(yǎng)液中的含量為1微克/毫升；所述肝素在培養(yǎng)液中的含量為為10微克/毫升。
11.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于從治療者抽取5-30毫升全血，進行500-2000轉/分，15分鐘離心得到富含血小板的治療者自體的血漿，其含量為100-700×106個/ml。
12.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于從受術者自體血漿中用熱冷交換法獲得凝血因子或者是從市場購得的動物源性凝血因子，濃度為1-10單位/ml。
13.用富含自體血小板的血漿與自體細胞制備成注射液。注射過程分為2步先將培養(yǎng)好的治療者自體的細胞和富含血小板的血漿制備的注射液注射到需要填充的部位后，用第二支注射器在同樣部位注射凝血因子和鈣離子的混合溶液，使之在注射部位混合。
全文摘要
一種注射用人體皮膚填充劑，主要由細胞成分與富含血小板血漿、凝血因子和鈣離子組成，每毫升注射用填充劑中細胞成分的含量為1000－5000萬個，血小板的含量為100－700×10
文檔編號A61L27/60GK101088569SQ20071013077
公開日2007年12月19日 申請日期2007年7月24日 優(yōu)先權日2007年7月24日
發(fā)明者韓斌 申請人:北京賽爾泰和生物醫(yī)藥科技有限公司