專利名稱：桑黃菌絲體活性糖蛋白及其用途和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗菌等活性的桑黃深層發(fā)酵菌絲體糖蛋白復(fù)合物、該復(fù) 合物的用途及其分離純化的制備方法。 背彔技術(shù)任何一種生物在自然界都不可能是孤立的存在，各種生物能夠生存，都得益 于其自身防御機制。植物、微生物等能夠合成一些小分子抗生物質(zhì)，如酚類、丹 寧酸等小分子物質(zhì)。同時還能合成多糖、蛋白質(zhì)、糖蛋白復(fù)合物等抗菌大分子。 抗菌蛋白的作用只要是抵抗抗原菌的入侵，提高生物體自身的抗病性，維護生命 活動的延續(xù)和正?；顒??？咕蠓肿游镔|(zhì)研究在最近幾年取得很大進展，隨著分 離純化技術(shù)的深入以及生物質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對抗菌大分子的研究和認(rèn) 識不斷的深入，對自然界各種生物的自身防御體系有了進一步的認(rèn)識。目前已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)了數(shù)以百計的抗菌蛋白、抗菌肽以及抗菌糖蛋白復(fù)合物。大型藥食用真菌是中國傳統(tǒng)中草藥的重要組成部分，由于其富含生物活性物 質(zhì)，因而成為新型藥物開發(fā)的一種重要的天然資源，越來越引起人們的重視。桑黃屬于擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，多孔菌目 (Polyporales)，銹革孔菌科(Hymenochaetacae)，針層孔菌屬(Phellinus)的藥用真 菌，主要分布在中國、日本、韓國、朝鮮、俄羅斯、澳大利亞、北美、中南美等 地，其子實體入藥，有"森林黃金"之美稱?！端幮哉摗酚涊d桑黃味微苦，性寒， 能利五臟、軟堅、排毒；止血、活血；和胃止瀉，民間用以治療淋病、崩漏帶下、 瘡窟積聚、癖軟、脾虛泄瀉等。目前部分研究主要集中馴化菌種和人工栽培技術(shù) 獲取子實體，但由于人工固體栽培技術(shù)存在較多不足，如栽培比較困難、生長周 期長、易受到季節(jié)限制等，進而使得由子實體制得的桑黃活性物質(zhì)價格昂貴，難 以推廣；而采用深層發(fā)酵法制備菌絲體，則可基本克服以上不足之處，并且還能 獲得大量胞外活性物質(zhì)。但目前，只有少數(shù)文獻對桑黃深層發(fā)酵技術(shù)進行系統(tǒng)研 究，中國專利CN1556212介紹了液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖工藝，將發(fā)酵液高溫提取，噴霧干燥得到桑黃水提取物和桑黃多糖。專利CN1908181 介紹了固體發(fā)酵桑黃4.6302獲得菌絲體，并得到具有抗腫瘤活性的多糖。綜合以上不難發(fā)現(xiàn)，多數(shù)桑黃生物活性物質(zhì)的研究主要還集中在對其子實體 中活性小分子化合物或活性多糖的分離純化或者結(jié)構(gòu)鑒定，但其中抗菌活性糖蛋 白分離純化、理化性質(zhì)鑒定以及相關(guān)生物功能并未見有報道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗菌活性的深層發(fā)酵桑黃菌絲體糖蛋白復(fù) 合物及其用途和提取分離制備方法。該方法是利用生物工程發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)桑黃菌 絲體，并從中提取出具有抗菌活性的桑黃菌絲體糖蛋白，并獲得其基本的理化性 質(zhì)，所用方法步驟清晰，方便操作。這種復(fù)合物可用于生產(chǎn)保健產(chǎn)品或進一步開 發(fā)出新的天然抗菌藥物。為實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的(1) 一種桑黃菌絲體糖蛋白復(fù)合物，其特征在于所述糖蛋白復(fù)合物中雜多 糖含量為15 20%，蛋白質(zhì)含量為80 85%,其中雜多糖包括葡萄糖，木糖和甘 露糖3種單糖，蛋白質(zhì)包括天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸在內(nèi)的18種氨基酸；所 述糖蛋白復(fù)合物重均分子量為20~40kD(2) 所述的抗菌糖蛋白用于制備對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用 的抗菌類藥物。(3) —種制備上述具有抗菌活性的桑黃菌絲體糖蛋白復(fù)合物的方法 本發(fā)明采用桑黃AS3.637 (購至中國微生物菌種保藏中心)，PDA培養(yǎng)基斜面保存，使用前將菌種活化，將菌種斜面切割成小塊接種到液體種子培養(yǎng)基中 25°C， 160rpm條件下培養(yǎng)7d后收集種子液，接種于發(fā)酵罐中進行發(fā)酵9~14 天，8000卬m離心后獲得桑黃菌絲體。所得菌絲體的產(chǎn)率為每升培養(yǎng)基80g。將 此桑黃菌絲體加入1 5倍體積的水后勻漿破碎，4 30'C浸提，離心，棄沉淀，收 集提取液，提取液濃縮后添加硫酸銨至濃度為80 卯％ (m/V)，靜置24 72h, 高速離心取沉淀，加少量水復(fù)溶沉淀，將沉淀復(fù)溶液置入8000 10000道爾頓的 透析袋，去離子水透析，收集透析液后低溫濃縮，上樣于DEAE-Sepharose FastFlow層析柱，依次用蒸餾水和O.l， 0.3， 0.5， 2.0mol/LNaCl溶液為洗脫劑進行 階段式洗脫，結(jié)果見圖l。在紫外光OD280nm處檢測，有A、 B、 C、 D四個吸 收峰，在其中選擇含量最高的B組分冷凍干燥，即得到桑黃菌絲體糖蛋白復(fù)合 物。用紅外、高效液相色譜、氨基酸分析儀、SDS—PAGE等可確定其理化性質(zhì)。 本發(fā)明所述方法制取的桑黃抗菌糖蛋白復(fù)合物各項性能的測定試驗(1) 抑菌活性測定實驗抗菌活性采用平板打孔法，于直徑9cm滅菌培養(yǎng)皿中加入106 cfirmL"經(jīng)培 養(yǎng)18 20小時的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌液，用無菌生理鹽水制成菌懸液 lmL分別涂布于其對應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，每種細菌加入一個培養(yǎng)皿，然后注入 已溶化冷卻至45 5(TC的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20mL，立即旋轉(zhuǎn)混勻，待瓊脂凝固后， 用外徑6mm的滅菌不銹鋼打孔器在培養(yǎng)基上打4個等距離的孔，再用滴管吸取 溶化的瓊脂培養(yǎng)液，每孔滴入1滴，作補孔用，以免底部漏夜。用微量加樣器吸 取樣品各50pL加入孔中，置35'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。經(jīng)測定桑黃抗菌糖蛋白可顯著抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，結(jié)果見圖2、 圖3。(2) 生化特性測定實驗① 熱穩(wěn)定性桑黃抗菌糖蛋白經(jīng)沸水浴處理，抗菌活性損失較少，具有很好的熱穩(wěn)定性；② pH值穩(wěn)定性用不同pH溶液處理時，在pH2 13范圍內(nèi)抗菌活力穩(wěn)定；③ 等電點采用等電聚焦電泳法測得桑黃抗菌糖蛋白的PI值PI值為5.0-7.0的酸性蛋白。④ 分子量采用凝膠過濾層析法和SDS—PAGE垂直板電源法，測得本抗菌糖蛋白的分 子量為3 5kD;結(jié)果見圖4。本發(fā)明所有的桑黃桑黃AS3.637購至中國微生物菌種保藏中心，液體深層發(fā) 酵培養(yǎng)基是以農(nóng)副產(chǎn)品麩皮的提取液為主要原料,其他還包括玉米粉、豆餅粉等。培養(yǎng)基的組成如下(/L):麩皮提取液50g玉米粉30g葡萄糖10g豆餅粉10g酵母膏10g玉米漿10gFeS04lgKH2P04lg其余為水pH白〗與其他已有的糖蛋白復(fù)合物提取方法相比較，本發(fā)明科技含量高，有明顯的 技術(shù)優(yōu)勢，能獲得組分單一的活性組分。這種桑黃菌絲體糖蛋白復(fù)合物可望成為理想的和有開發(fā)前景的抗菌藥物或 藥物前體物質(zhì)。該復(fù)合物的制備方法由于釆用價格低廉的麩皮提取液為主要原 料，利用生物工程發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)桑黃菌絲體，并從中分離純化出具有抗菌活性的 糖蛋白，生產(chǎn)工藝簡單、易行，生產(chǎn)周期較短，生產(chǎn)成本低廉，且糖蛋白產(chǎn)率較 高，因此具有廣闊的應(yīng)用前景和潛在的經(jīng)濟效益。


圖1為本發(fā)明桑黃抗菌糖蛋白的DEAE-Sepharose Fast Flow層析2為桑黃抗菌糖蛋白對金黃色葡萄球菌的抑制結(jié)果圖3為桑黃抗菌糖蛋白大腸桿菌的抑制結(jié)果圖4為本發(fā)明桑黃抗菌糖蛋白的SDS—PAGE電泳圖具體實施方式
桑黃抗菌蛋白的制取方法及生物活性的步驟以下結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明實施例1桑黃AS3.637購至中國微生物菌種保藏中心。首先在斜靣培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌 種。培養(yǎng)用的試管以及棉塞均需在12rC滅菌30min，再裝入培養(yǎng)基121'C滅菌 30min，斜放冷卻使其凝固成斜面。然后超凈臺接種。斜面培養(yǎng)在恒溫25'C左右 進行，為期7天。將斜面菌種切割成小塊接種到種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)基分裝完畢后， 在錐形瓶上塞上棉塞，以防止外界微生物進入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染,并保證有良 好的通氣性能。種子培養(yǎng)液組成為葡萄糖20g,酵母膏5g,玉米漿10g,麩皮 50g，MgSO4'7H2O0.5g,KH2PO4 lg,其余為水，pH自然；在25。C，160rpm條件 下培養(yǎng)7d后收集種子液，接種于20L發(fā)酵罐中得發(fā)酵培養(yǎng)液中，液體培養(yǎng)基的 組成為麩皮50g,玉米粉30g，葡萄糖10g，豆餅粉10g，酵母膏10g，玉米漿 10g, FeS04lg， KH2P04lg，其余為水，pH自然；25。C發(fā)酵9天。所得菌絲體 呈棕黃色，有濃郁香味。實施例2100g桑黃菌絲體加入l倍體積的水后勻漿破碎,4。C浸提，離心，棄不溶物， 收集提取液，提取液濃縮后添加硫酸銨至濃度為80% (m/V),靜置24h,高速離 心取沉淀，加少量水復(fù)溶上述沉淀，將沉淀復(fù)溶液置入8000道爾頓的透析袋， 去離子水透析，收集透析液，濃縮，上樣于DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱， 依次用蒸餾水和NaCl為洗脫劑進行階段式洗脫，收集NaCl溶液洗脫的糖蛋白 復(fù)合物組分，冷凍干燥各收集液。取各管測280nm的紫外吸收繪圖，得4個峰。經(jīng)抑菌活性檢測，其中B, C 為活性成分，具有抑菌作用。收集B組分，冷凍干燥后即得到桑黃菌絲體糖蛋 白復(fù)合物，樣品呈棕色粉狀，采用紅外、高效液相色譜、氨基酸分析儀、SDS — PAGE等確定了其理化性質(zhì)。該糖蛋白復(fù)合物中多糖為雜多糖，多糖含量為15%， 由葡萄糖，木糖和甘露糖3種單糖組成；蛋白質(zhì)含量為85%,含有包括天冬氨酸、 谷氨酸和精氨酸在內(nèi)的18種氨基酸；該糖蛋白復(fù)合物重均分子量為20kD;實施例3100g桑黃菌絲體加入3倍體積的水后勻漿破碎，15。C浸提，離心，棄不溶物，收集提取液，提取液濃縮后添加硫酸銨至濃度為85% (m/V)，靜置36h,高速離 心取沉淀，加少量水復(fù)溶沉淀，將沉淀復(fù)溶液置入8000道爾頓的透析袋，去離 子水透析，收集透析液，濃縮，上樣于DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱，依次 用蒸餾水和NaCl為洗脫劑進行階段式洗脫，收集NaCl溶液洗脫的糖蛋白復(fù)合 物組分，冷凍千燥各收集液。取各管測280nm的紫外吸收繪圖，得4個峰。經(jīng)抑菌活性檢測，其中B， C 為活性成分，具有抑菌作用。收集B組分，冷凍干燥后即得到桑黃菌絲體糖蛋 白復(fù)合物，樣品呈棕色粉狀，采用紅外、高效液相色譜、氨基酸分析儀、SDS — PAGE等確定了其理化性質(zhì)。該糖蛋白復(fù)合物中多糖為雜多糖，多糖含量為18%， 由葡萄糖，木糖和甘露糖3種單糖組成；蛋白質(zhì)含量為82%，含有包括天冬氨酸、 谷氨酸和精氨酸在內(nèi)的18種氨基酸；該糖蛋白復(fù)合物重均分子量為25kD;實施例4100g桑黃菌絲體加入5倍體積的水后勻漿破碎，15'C浸提，離心，棄不溶物， 收集提取液，提取液濃縮后添加硫酸銨至濃度為90% (m/V)，靜置72h,高速離 心取沉淀，加少量水復(fù)溶沉淀，將沉淀復(fù)溶液置入8000道爾頓的透析袋，去離 子水透析，收集透析液，濃縮，上樣于DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱，依次 用蒸餾水和NaCl為洗脫劑進行階段式洗脫，收集NaCl溶液洗脫的糖蛋白復(fù)合 物組分，冷凍干燥各收集液。取各管測280nrn的紫外吸收繪圖，得4個峰。經(jīng)抑菌活性檢測，其中B， C 為活性成分，具有抑菌作用。收集B組分，冷凍千燥后即得到桑黃菌絲體糖蛋 白復(fù)合物，樣品呈棕色粉狀，采用紅外、高效液相色譜、氨基酸分析儀、SDS — PAGE等確定了其理化性質(zhì)。該糖蛋白復(fù)合物中多糖為雜多糖，多糖含量為20 %， 由單糖葡萄糖，木糖和甘露糖3種單糖組成；蛋白質(zhì)含量為80%，含有包括天冬 氨酸、谷氨酸和精氨酸在內(nèi)的18種氨基酸；該糖蛋白復(fù)合物重均分子量為40 kD;實施例5抗菌糖蛋白抑菌譜測定采用平板打孔法，病原菌分別為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。將上述病原菌培養(yǎng)于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3g;蛋白胨 10 g;NaCl: 5g;瓊脂15 g;水1000mL)。待新鮮菌落長出后，在對角線 放置滅菌不銹鋼打孔器，用微量加樣器吸取分離的抗菌糖蛋白加入孔中。每批次 處理3次，待菌體生長一段時間，觀察抗菌糖蛋白對不同病原菌的抑菌活性，發(fā) 現(xiàn)抗菌糖蛋白對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有較強的抑菌抗菌活性。本發(fā)明以深層發(fā)酵桑黃菌絲體為原料，分離純化菌絲體中的糖蛋白，保持了 糖蛋白的活性，經(jīng)驗證，該蛋白抗菌活性。本發(fā)明能普遍用于各種發(fā)酵菌絲體內(nèi) 糖蛋白的分離純化。
權(quán)利要求
1.一種桑黃菌絲體糖蛋白復(fù)合物，其特征在于所述糖蛋白復(fù)合物中雜多糖含量為15～20％，蛋白質(zhì)含量為80～85％，其中雜多糖包括葡萄糖，木糖和甘露糖3種單糖，蛋白質(zhì)包括天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸在內(nèi)的18種氨基酸；所述糖蛋白復(fù)合物重均分子量為20～40 kD。
2. 權(quán)利要求l所述的桑黃菌絲體糖蛋白復(fù)合物的用途，其特征在于所述的抗菌糖蛋白用于制備對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用的抗菌類藥物。
3. 權(quán)利要求l所述的桑黃菌絲體糖蛋白復(fù)合物的制備方法，其特征在于以下步驟(1 )采用桑黃菌種經(jīng)常規(guī)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)后得到桑黃菌絲體；(2) 將此桑黃菌絲體加入1 5倍體積的水后勻漿破碎，4-30。C浸提，離心，棄 不溶物，收集提取液；低溫濃縮提取液后添加硫酸銨至濃度為80 90%m/V，靜 置24 72h，高速離心取沉淀；(3) 加入少量水復(fù)溶上述沉淀，將沉淀復(fù)溶液置入8000 10000道爾頓的透析袋， 去離子水透析；(4) 收集上述透析液，低溫濃縮后，上樣于DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱， 依次用蒸餾水和0.1 mol/L， 0.3mol/L， 0.5 mol/L， 2mol/LNaCl為洗脫劑進行階 段式洗脫；(5) 在紫外光OD280nm處檢測，在A、 B、 C、 D四個吸收峰中選擇含量最高 的B組分冷凍干燥，即得到桑黃菌絲體糖蛋白復(fù)合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的菌絲體制備方法，其特征在于所述的每升種子培 養(yǎng)基中葡萄糖20g,酵母膏5g,玉米漿10g,麩皮50g, MgS04.7H20 0.5g, KH2P04 lg,其余為水，pH自然；每升發(fā)酵液體培養(yǎng)基的組成為麩皮50g，玉 米粉30g，葡萄糖10g，豆餅粉10g，酵母膏10g，玉米漿10g， FeS04 lg， KH2P04 lg，其余為水，pH自然。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種深層發(fā)酵桑黃菌絲體糖蛋白及其用途和分離提取制備方法，該復(fù)合物為雜多糖和蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中雜多糖含量為15～20％，由單糖葡萄糖，木糖和甘露糖3種單糖組成；蛋白質(zhì)含量為80～85％，由天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸等18種氨基酸組成；其重均分子量為20～40KD。該糖蛋白復(fù)合物是用麩皮的提取液為主要成分配制成培養(yǎng)基，由桑黃菌種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃菌絲體，并采用勻漿破碎、冷水浸提、離心、收集上清液、硫酸銨沉淀、透析、DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析進行系統(tǒng)分離純化出的糖蛋白復(fù)合物。所述的抗菌糖蛋白用于制備對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用的抗菌類藥物。同時本發(fā)明能用于各種藥食用真菌深層發(fā)酵所得菌絲體中糖蛋白的分離純化。
文檔編號A61K36/06GK101297821SQ20071013267
公開日2008年11月5日 申請日期2007年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月18日
發(fā)明者崔鳳杰, 張志才, 杰 羅, 香 肖, 英 董, 娜 邵, 錢靜亞, 黃達明 申請人:江蘇大學(xué)