專利名稱：：合成的抗微生物多肽的制作方法合成的抗微生物多肽本申請是于2004年9月13日提出的、申請?zhí)枮?00480033242.5、發(fā)明創(chuàng)造名稱為"合成的抗微生物多肽"的中國發(fā)明專利申請的分案申請。
背景技術(shù)：
：抗微生物肽(AMP)是相對新近發(fā)現(xiàn)的一組具有新作用模式的抗微生物劑。AMP廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物并且屬于最古老的宿主防御因子。絕大多數(shù)的該種肽在天然情況下是陽離子的和兩親性的；該特性允許與帶負(fù)電荷的細(xì)菌或真菌的膜相互作用。該種肽大小范圍從6-7個(gè)氨基酸至60個(gè)氨基酸。迄今為止已經(jīng)分離出500種以上不同的AMP?；诮Y(jié)構(gòu)或M酸組成可以將它們分為幾類。最簡單的結(jié)構(gòu)是小的"-螺旋肽。其它AMP折疊形成/3-片層結(jié)構(gòu)，而另外的再次形成剛性的二硫橋連接的三級結(jié)構(gòu)。AMP通常是殺微生物的(與靜止相對)并且作用極其快。通常，乾生物在幾分鐘之內(nèi)被殺死。它們通過干擾把生物的膜功能而起作用。已經(jīng)顯示存在幾種不同的作用機(jī)制，但是對于大多數(shù)AMP，總體結(jié)果AM破裂和/或細(xì)胞裂解。對微生物膜的選擇性是由膜組成、膜電荷和跨膜電位介導(dǎo)的。微生物膜比更高等生物的膜具有較高的負(fù)電荷，其包含不同類型的磷脂而不含膽固醇。已經(jīng)證明在耙生物中誘導(dǎo)對AMP的抗性極端困難。這是乾標(biāo)的原因；為了顯著性改變膜組成或電荷，靶標(biāo)將不得不發(fā)生多重基因組改變。發(fā)明概述在本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及具有抗微生物活性的多肽，其包含氨基酸序列XrX2-XrX4-Xs;其中&、X2、X3、X4和X5中的每一個(gè)選自M^f列P-P-R陽F、P-R-F-P、R-F誦P-P、F-P-P畫R、P-R畫P-F、R-P-F-P、P-F-P-R、F-P-R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P誦P-R-L、P-R-L國P、R-L畫P-P、L誦P-P-R、P-R-P-L、R-P-L國P、P誦L-P-R、L-P-R-P、P國P-L-R、P-L-R-P、L-R陽P-P、R-P-P隱L、P-P畫R-V、P-R-V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R-P-V、R誦P-V-P、P-V-P畫R、V-P-R-P、P-P-V-R、P誦V-R-P、V畫R-P-P、R-P-P-V、P畫P-R-I、P曙R-I曙P、R-I-P-P、I-P-P-R、P隱R-P畫I、R-P-I-P、P-I-P-R、I誦P-R-P、P畫P小R、P小R-P、I-R-P畫P和R-P-P-I;并且其中X廣Xs中最多4個(gè)是相同的。在本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及具有編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。在本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及包含編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，該核苷酸序列與指導(dǎo)多肽在適當(dāng)宿主中產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)控制序列有效連接。在本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)栽體。在本發(fā)明的第五個(gè)方面涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的第六個(gè)方面涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，該方法包括(a)在有利于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞；和(b)回收多肽。本發(fā)明的其它方面在以下描述和附加權(quán)利要求中是顯而易見的。定義在更加詳細(xì)地討論本發(fā)明之前，首先定義以下術(shù)語和規(guī)定抗微生物活性:術(shù)語"抗微生物活性"文中定義為能夠殺死或抑制微生物細(xì)胞生長的活性。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"抗微生物的"旨在指具有殺菌和/或抑菌和/或殺真菌和/或抑真菌作用和/或殺病射用，其中術(shù)語"殺菌的"應(yīng)理解為能夠殺死細(xì)菌細(xì)胞。術(shù)語"抑菌的，，應(yīng)理解為能夠抑制細(xì)菌生長，即抑制正在生長的細(xì)菌細(xì)胞。術(shù)語"殺真菌的"應(yīng)理解為能夠殺死真菌細(xì)胞。術(shù)語"抑真菌的"應(yīng)理解為能夠抑制真菌生長，即抑制正在生長的真菌細(xì)胞。術(shù)語"殺病毒的"應(yīng)理解為能夠使病毒失活。術(shù)語"微生物細(xì)胞"指細(xì)菌或真菌細(xì)胞(包括酵母)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"抑制微生物細(xì)胞生長"旨在指細(xì)胞處于非生長狀態(tài)，即它們不能夠繁殖。為了本發(fā)明的目的，按照Lehrer等(JournalofImmunologicalMethods,第137巻，(2)第167-174頁，1991)所描述的方法可以確定抗微生物活性。在具有抗微生物活性多肽的25。/。(w/w)水溶液中；優(yōu)選地在10%(w/w)水溶液中；更加優(yōu)選地在5。/。(w/w)水溶液中；甚至更加優(yōu)選地在l%(w/w)水溶液中；最優(yōu)選地在0.5。/。(w/w)水溶液中；并且具體而言在0.1%(w/w)水溶液中于20。C孵育8小時(shí)后(優(yōu)選地4小時(shí)后，更加優(yōu)選地2小時(shí)后，最優(yōu)選地l小時(shí)后，并且具體而言30分鐘后)，具有抗微生物活性的多肽能夠?qū)⒋竽c桿菌(五sc/^i7Y^iVicv/,')(DSM1576)的活細(xì)胞數(shù)量降低至1/100。當(dāng)加入具有抗微生物活性多肽的濃度為1000ppm時(shí)；優(yōu)選地為500ppm時(shí)；更加優(yōu)選地為250ppm時(shí)；甚至更加優(yōu)選地為100ppm時(shí)；最優(yōu)選地為50ppm時(shí)；并且具體而言為25ppm時(shí)，該多肽還能夠在25。C下抑制大腸桿菌(DSM1576)在微生物生長基質(zhì)中生長達(dá)24小時(shí)。在具有抗微生物活性多肽的25。/。(w/w)水溶液中；優(yōu)選地在10%(w/w)水溶液中；更加優(yōu)選地在5。/。(w/w)水溶液中；甚至更加優(yōu)選地在l%(w/w)水溶液中；最優(yōu)選地在0.5。/。(w/w)水溶液中；并且具體而言在0.1%(w/w)水溶液中于20。C孵育8小時(shí)后(優(yōu)選地4小時(shí)后，更加優(yōu)選地2小時(shí)后，最優(yōu)選地1小時(shí)后，并且具體而言為30分鐘后)，具有抗微生物活性的多肽能夠?qū)⒖莶菅挎邨U菌(5aci7/MSswMto)(ATCC6633)的活細(xì)胞數(shù)量降低至1/100,當(dāng)加入具有抗微生物活性多肽的濃度為1000ppm時(shí)；優(yōu)選地為500卯m時(shí)；更加優(yōu)選地為250ppm時(shí)；甚至更加優(yōu)選地為100ppm時(shí)；最優(yōu)選地為50卯m時(shí)；并且具體而言為25ppm時(shí)，該多肽還能夠在25。C下抑制枯草芽孢桿菌(ATCC6633)在微生物生長基質(zhì)中生長達(dá)24小時(shí)。本發(fā)明多肽將優(yōu)選地具有由SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個(gè)"H&酸序列所組成多肽的抗微生物活性的至少20%。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽將具有由SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個(gè)氨基酸序列所組成多肽的抗微生物活性的至少40%，例如至少50%，優(yōu)選地至少60%,例如至少70%,更加優(yōu)選地至少80%,例如至少90%,最優(yōu)選地至少95%，例如大約或至少100%。片段:當(dāng)文中使用時(shí)，本發(fā)明M,列的"片段"是多肽的亞序列，其中^J^末端和/或g末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸已經(jīng)缺失。優(yōu)選地為從羧基末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，片段由至少20個(gè)氨基酸組成。等位基因變體:在本文中，術(shù)語"等位基因變體"表示占據(jù)同一染色體位點(diǎn)的基因的任意兩種或多種可選擇形式。等位基因變體在天然情況下通過突變產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?沒有改變所編碼多肽)或者可以編碼M酸序列發(fā)生改變的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體所編碼的多肽?；旧霞兊亩嗪塑账?如文中所使用術(shù)語"基本上純的多核苷酸"是指多核苷酸制劑，其中多核苷酸已經(jīng)脫離了其天然遺傳環(huán)境并因此不含其它外來的或不必要的編碼序列，并且是適宜在遺傳工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸包含最多10%(按重量計(jì)算)的例如按重量計(jì)算最多8%、最多6%、最多5%、最多4%、最多3%、最多2%、最多1%以及最多0.5%)。然而，基本上純的多核苷酸可以包含天然存在的5，和3，非翻譯區(qū)，例如啟動(dòng)子或終止子。優(yōu)選地，基本上純的多核苷酸的純度至少為92%(即多核苷酸組成了制劑中存在的總多核普酸物質(zhì)重量的至少92%)，并且優(yōu)選更高的百分比，例如純度至少94%、至少95%、至少96%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%,并且最多99.5%。優(yōu)選地，文中所公開多核苷^A^本上純的形式。具體而言，文中公開的多核苷酸優(yōu)選地是"本質(zhì)上純的形式"，即多核苷酸制劑基本上不含與其天然相關(guān)的其它多核苷酸物質(zhì)。在文中，術(shù)語"基本上純的多核苷酸"與術(shù)語"分離的多核苷酸"和"分離形式的多核苷酸"同義。修飾:在本發(fā)明上下文中，術(shù)語"修飾"旨在指由氨基酸序列X廣X2-X3-X4-Xs組成的多肽或者SEQIDNO:l至SEQIDNO:319的任意一個(gè)M酸序列的任意化學(xué)修飾以及對編碼多肽的DNA的遺傳操作；其中XpX2、X3、X4和Xs中的每一個(gè)選自絲,列P-P-R-F、P-R-F-P、R曙F誦P畫P、F國P國P畫R、P誦R國P-F、R誦P誦F-P、P誦F-P國R、F-P-R-P、P畫P國F-R、P-F-R國P、F-R-P畫P、R-P-P-F、P-P誦R-L、P誦R國L-P、R畫L國P漏P、L-P誦P-R、P國R曙P曙L(fēng)、R曙P-L-P、P誦L國P-R、L-P-R-P、P-P-L曙R、P-L-R-P、L-R-P-P、R一p一p誦L、P國P國R-V、P-R-V-P、R國V-P-P、V-P誦P-R、P畫R陽P誦V、R-P-V-P、P-V-P-R、V曙P-R-P、P-P誦V誦R、P-V國R-P、V-R-P-P、R畫P-P-V、P-P-R-I、P-R誦I-P、R誦I誦P國P、I畫P國P國R、P國R畫P-I、R畫P-I-P、P畫I畫P誦R、I-P國R-P、P誦P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I;并且其中X！-X5中最多4個(gè)是相同的。修飾可以是M酸側(cè)鏈的替換，目的氨基酸中或目的氨基酸處的替代、缺失和/或插入；或者在J^酸序列中使用具有相似特性的非天然氨基酸。具體而言修飾可以是酰胺化，例如C末端的酰胺化。cDNA:當(dāng)用于本文中時(shí)，術(shù)語"cDNA"旨在涵蓋能夠通過逆轉(zhuǎn)^來自真核細(xì)胞的成熟的、剪接的mRNA分子制備得到的DNA分子。cDNA缺^L相應(yīng)基因組DNA中通常存在的內(nèi)含子序列。最初的初級RNA轉(zhuǎn)錄本是mRNA的前體，并且在成為成熟的剪接mRNA之前其將經(jīng)歷一系列加工事件。這些事件包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因此當(dāng)cDNA來自mRNA時(shí)其缺乏內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體:當(dāng)文中使用時(shí)，術(shù)語"核酸構(gòu)建體"意思是指單鏈或雙鏈核酸分子，其從天然存在的基因分離得到或者已經(jīng)進(jìn)行了修飾以包含自然界中不存在的核酸的片段。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含本發(fā)明編碼序列表達(dá)所需的控制序列時(shí)，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語"表達(dá)盒"同義?？刂菩蛄?術(shù)語"控制序列"文中定義為包括本發(fā)明多^達(dá)所必需或者有利于本發(fā)明多M達(dá)的全部元件。相對于編碼多肽的核苷酸序列，每個(gè)控制序列可以是天然的或外來的。每個(gè)控制序列包括但不限于前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。在最低限度時(shí)，控制序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號?？刂菩蛄锌梢跃哂薪宇^，以《更導(dǎo)入便于控制序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)相連接的特異限制性酶切位點(diǎn)。有效連接:術(shù)語"有效連接"文中定義為一種構(gòu)象，其中控制序列適當(dāng)?shù)胤胖糜谂cDNA序列的編碼序列相關(guān)的位置從而使控制序列指導(dǎo)多肽表達(dá)。編碼序列:當(dāng)用于文中時(shí)，術(shù)語"編碼序列"旨在涵蓋核苷酸序列，該序列直接指定其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的^J^酸序列。編碼序列的邊界通常通過開放閱讀框確定，開放閱讀框通常起始于ATG起始密碼子。編碼序列一般包括DNA、cDNA和重組核苷酸序列。表達(dá):在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"表達(dá)"包括參與多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯和翻譯后修飾。優(yōu)選地，表達(dá)還包括多肽的分泌。表達(dá)載體:在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"表達(dá)載體"涵蓋線性或環(huán)狀DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的片段，并且其與用于其轉(zhuǎn)錄的另外片段有效連接。宿主細(xì)胞:如文中所使用，術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括易于用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的任何細(xì)胞類型。在題目為"具有抗微生物活性的多肽"的部分中定義術(shù)語"多核苷酸探針"、"雜交"以及各種嚴(yán)格性條件，發(fā)明詳述具有抗微生物活性的多肽在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的多肽，并且其中多肽包含4^酸序列XrX2-X3-XrX5，優(yōu)選地多肽由^J^酸序列Xi-X2-X3-X4-X5組成；其中X"X2、X3、X4和Xs獨(dú)立地為P-P-R-Z"P-R-Z2-P、R誦Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Zs、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z10-R-P、Zn-R-P誦P或R-P-P-Z12;其中Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z10、Zn和Zu獨(dú)立地為F、L、V或I。本發(fā)明還涉及具有抗微生物活性的多肽，并且其中多肽包含M,列XrX2-X3-X4-Xs，優(yōu)選地多肽由^t^酸序列XrX2-X3-X4-Xs組成；其中X2、X3、X4和Xs中的每一個(gè)選自^J^酸序列P-P-R-F、P-R-F國P、R隱F-P畫P、F國P-P曙R、P-R國P-F、R-P國F腸P、P-F-P-R、F-P誦R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P-R-L、P誦R丄-P、R丄誦P誦P、L國P誦P-R、P-R-P誦L、R-P-L-P、P-L誦P-R、L-P-R-P、P-P-L-R、P-L誦R-P、L誦R-P-P、R-P-P-L、P-P-R-V、P-R-V-P、R誦V誦P-P、V-P隱P-R、P陽R-P-V、R國P國V-P、P-V-P-R、V-P隱R-P、P-P國V國R、P-V-R-P、V國R-P誦P、R-P-P-V、P-P誦R-I、P誦R-I-P、R-I-P-P、I-P-P國R、P-R-P-I、R-P-I-P、P國I國P畫R、I-P畫R誦P、P-P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R誦P-P誦I。在一個(gè)實(shí)施方案中，X2、X3、X4和Xs選自^酸序列P-P-R-Zi、P-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Zs、R-P-Z6-P、P-Z-P-R、Z8-P-R-P、P國P醫(yī)Z9國R、P-Z10-R-P、Zn-R-P國P和R-P-P-Z12;其中除了Z廣Zu^^酸以外Xi-Xs是相同的；其中ZrZu選自氨基酸F、L、V和I。優(yōu)選地，XrXs中最多4個(gè)是相同的；更加優(yōu)選地為XrXs中最多3個(gè)是相同的，甚至更加優(yōu)選地為XrX5中最多2個(gè)是相同的；最優(yōu)選地為&《5不相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，除了Xn、X2、X3、X4和Xs的Z^Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z10、Zu和Z12獨(dú)立地為F、L、V或I以外；X尸X尸X3-X4-Xs為P-P-R-Zi、P-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Z5、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z1(rR-P、Z"-R-P-P或R-P-P-Z12。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的多肽，并且其中多肽包含氨基酸序列XrX2-X3-X4-Xs-X6，優(yōu)選地多肽由氨基酸序列X廣X2-X3-X4-Xs-X6組成；其中X"X2、X3、X4、Xs和&獨(dú)立地為P-P-R-Z"P-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P曙R-P-Zs、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z10-R-P、Zu-R-P-P或R-P-P-Z12;其中Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z1()、Zn和Zu獨(dú)立地為F、L、V或I。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的多肽，并且其中多肽包含氨基酸序列X^X2-X3-X4-Xs-X6，優(yōu)選地多肽由氨基酸序列XrX2-X3-X4-Xs-X6組成；其中X2、X3、&、Xs和X6中的每一個(gè)選自^J^^f歹'J:P-P-R-F、P-R-F-P、R-F曙P-P、F國P誦P-R、P國R-P國F、R-P-F曙P、P-F-P國R、F-P-R-P、P隱P-F-R、P-F陽R-P、F國R-P畫P、R-P國P-F、P-P曙R-L、P醫(yī)R-L-P、R誦L誦P-P、L國P-P-R、P-R-P-L、R-P-L誦P、P-L-P-R、L誦P-R-P、P-P-L誦R、P-L誦R-P、L-R誦P畫P、R-P-P-L、P畫P-R-V、P-R曙V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R-P-V、R誦P-V-P、P畫V-P-R、V-P-R-P、P-P-V-R、P-V畫R誦P、V-R-P漏P、R-P-P-V、P-P誦R畫I、P-R-I誦P、R-I畫P國P、I-P-P-R、P-R-P-I、R曙P-I-P、P小P國R、I曙P畫R誦P、P畫P-I誦R、P-I-R-P、I-R-P誦P和R-P-P-I。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X2、X3、X4、Xs和X6選自M酸序列P誦P-R-ZpP隱R誦Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R畫P-Zs、R-P-Z6-P、P-Z7-P國R、Zs-P誦R-P、P-P-Z9畫R、P-Z10-R-P、Zu-R-P-P和R-P-P-Z12;其中除了&-Z12氨基酸以外X廣X6是相同的；其中ZrZu選自氨基酸F、L、V和I。優(yōu)選地，XrX6中最多4個(gè)是相同的；更加優(yōu)選地為Xr"X6中最多3個(gè)是相同的，甚至更加優(yōu)選地為XrX6中最多2個(gè)是相同的；最優(yōu)選地為X^X6不相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，除了X2、X3、X4、Xs和X6的Z^Z2、Z3、Z4、Zs、Z6、Zr、Z8、Z9、Z10、Zu和Zu獨(dú)立地為F、L、V或I以外；Xi=X2=X3=X4=Xs=X6為P-P-R-Zi、P-R畫Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P誦R醫(yī)P誦Zs、R-P-Z6-P、P誦Z7-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9誦R、P-Z10-R-P、Zu-R-P-P或R-P-P-Z12。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的多肽，并且其中多肽包含SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個(gè)的絲酸序列，優(yōu)選地多肽由SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個(gè)的M酸序列組成。還在另一個(gè)實(shí)施方案中，^J^酸序列與^J^酸序列XrX2-X3-X4-Xs最多5個(gè)氨基酸(例如5個(gè)氨基酸)、例如最多4個(gè)氨基酸(例如4個(gè)JIJl酸)、例如最多3個(gè)氨基酸(例如3個(gè)氨基酸)、特別是最多2個(gè)氨基酸(例如2個(gè)氨基酸)、例如l個(gè)氨基酸不同；其中&、X2、X3、X4和Xs中的每一個(gè)選自P國P-R-F、P國R-F-P、R-F-P誦P、F-P-P-R、P國R-P-F、R-P-F畫P、P-F-P-R、F-P-R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P-R-L、P-R國L-P、R-L-P-P、L-P-P誦R、P-R-P-L、R-P畫L-P、P國L-P畫R、L-P-R-P、P國P-L誦R、P-L-R-P、L-R-P-P、R國P畫P畫L、P-P-R-V、P-R-V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R國P曙V、R畫P-V國P、P-V-P-R、V國P-R-P、P誦P國V誦R、P國V-R-P、V-R-P-P、R隱P誦P隱V、P-P畫R誦I、P-R-I-P、R-I-P國P、I曙P-P-R、P-R-P-I、R誦P-I-P、P國I-P-R、I國P國R-P、P-P國I曙R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I;或者^J^紗列與M酸序列X,-X2-X3-X4-Xs-X6最多5個(gè)氨基酸(例如5個(gè)氨基酸)、例如最多4個(gè)氨基酸(例如4個(gè)氨基酸)、例如最多3個(gè)氨基酸(例如3個(gè)氨基酸)、特別是最多2個(gè)氨基酸(例如2個(gè)氨基酸)、例如1個(gè)M酸不同；其中X"X2、X3、X4、X5和X6中的每一個(gè)選自P-P-R-F、P-R-F-P、R誦F-P-P、F-P-P-R、P謹(jǐn)R-P-F、R國P誦F國P、P-F-P-R、F畫P醫(yī)R-P、P-P-F-R、P-F-R誦P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P誦R-L、P-R-L國P、R曙L(fēng)-P-P、L-P-P-R、P-R-P誦L、R-P-L-P、P-L誦P-R、L-P畫R-P、P-P誦L-R、P-L-R畫P、L-R-P誦P、R-P-P-L、P-P-R-V、P-R畫V-P、R-V國P畫P、V-P-P國R、P-R-P-V、R-P-V-P、P-V國P國R、V-P-R隱P、P畫P誦V-R、P國V-R-P、V-R誦P-P、R-P-P-V、P-P國R-I、P-R隱I-P、R-I-P-P、I-P誦P誦R、P-R-P-I、R-P小P、P-I誦P畫R、I-P畫R-P、P-P-I誦R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I;或者^J^酸序列與SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個(gè)的JL&酸序列最多5個(gè)氨基酸(例如5個(gè)氨基酸)、例如最多4個(gè)氨基酸(例如4個(gè)氨基酸)、例如最多3個(gè)氨基酸(例如3個(gè)氨基酸)、特別是最多2個(gè)氨基酸(例如2個(gè)氨基酸)、例如1個(gè)氨基酸不同。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽包含氨基酸序列XrXrXrXrXs或X廣X2畫X3-X4-Xs-X6或SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個(gè)絲酸序列；或者具有抗微生物活性的其片段。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽由^J^酸序列X廣XrX3-X4-Xs或X廣XrX3-X4-Xs-X6或SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個(gè)M酸序列組成'組成本發(fā)明多肽的氛基酸可以獨(dú)立地選自D型或L型。本發(fā)明的多肽可以由20-500個(gè)氨基酸、優(yōu)選20-400個(gè)氨基酸、更加優(yōu)選20-300個(gè)氨基酸、甚至更加優(yōu)選20-200個(gè)氨基酸(例如20-150個(gè)氨基酸)、最優(yōu)選20-100個(gè)氨基酸并且具體而言20-50個(gè)氨基酸組成。在M酸序列X^X2-X3-X4-Xs或XrX2-X3-X4-Xs-X6之前立即為3-10個(gè)氨基酸(例如3-5個(gè)氨基酸)的M酸序列，其中在所述^酸序列當(dāng)中至少2個(gè)JtJ^酸在中性pH時(shí)帶正電荷(例如精氨酸、賴氨酸或組氨酸)。優(yōu)選地，在M酸序列XrX2-X3-X4-Xs或XrXrX3-X4-Xs-X6之前立即為氨基酸序列R-X7-R;其中X7為R、F、L、V或I。術(shù)語"之前立即為"意思是氨基,列連接于^J^,列XrX2-X3-XrXs或XrX2-X3-X4-X5-X6的N末端.本發(fā)明多肽可以是人工變體，其包含(優(yōu)選地由其組成)這樣一種氨基酸序列，即所述的氨基酸序列與氨基酸序列XrX2-XrX4-X5或XrX2誦X3-X4-Xs-X6或者SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個(gè)^J^酸序列相比具有最多3個(gè)、例如最多2個(gè)、諸如最多1個(gè)M酸替換、缺失和/或插入。此類人工變體可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建，例如通過將包含絲紗列Xi-XrX3-X4陽Xs或X廣X2-X3-X4-Xs-X6或者SEQIDNO:l至SEQIDNO:319任意一個(gè)M酸序列的多肽進(jìn)行定點(diǎn)/隨機(jī)誘變。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸變化在特性上變化較小，即為不顯著影響蛋白質(zhì)折疊和/或活性的保守M酸替換；小的缺失(一般為1個(gè)至大約5個(gè)氨基酸缺失)；小的JL^末端或a末端延伸(例如Jl^末端蛋氨酸戎基)；多至大約10-25個(gè)戎基的小的接頭肽；利于通過改變凈電荷進(jìn)行純化或者利于其它功能的小的延伸(例如多聚組氨酸、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。保守替換的例子是堿性M酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性疏*^酸組(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和蛋氨酸)、芳香族^J^B(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小M酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)中的組內(nèi)替換。通常不改變特異活性的M酸替換在本領(lǐng)域中是已知的并且由例如H.Neurath和R.L.HiH(T7re/VotefVw，AcademicPress,1979,NewYork)描述。最常發(fā)生的互換為Ala/Ser、Val/IIe、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly,以;M目反的那些互換。在本發(fā)明的一個(gè)有趣的實(shí)施方案中，氨基酸變化使多肽的物理-化學(xué)性質(zhì)改變。例如，可以進(jìn)行能夠改善多肽熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最適pH等等的氨基酸變化。N末端延伸本發(fā)明多肽的N末端延伸可以適當(dāng)?shù)赜?-50個(gè)氨基酸、優(yōu)選2-20個(gè)氨基酸、特別是3-15個(gè)tJ^酸組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，N末端肽^/f申不包含Arg(R)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，N末端M伸包含如下面將進(jìn)一步定義的kex2或kex2樣切割位點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，N末端延伸為包含至少2個(gè)Glu(E)和/或Asp(D)氛基酸殘基的肽，例如包含序列EAE、EE、DE和DD之一的N末端延伸。Kex2位點(diǎn)Kex2位點(diǎn)(見例如MethodsinEnzymology185巻，D.Goeddel編，AcademicPressInc.(1990)，SanDiego，CA，"GeneExpression、極性M酸組(谷氨,和天冬酰胺)、Technology")和kex2樣位點(diǎn)為在一些蛋白質(zhì)的前肽編碼區(qū)和成熟區(qū)之間發(fā)現(xiàn)的二威基識別位點(diǎn)(即切割位點(diǎn))。已經(jīng)表明，在某些情況下kex2位點(diǎn)或kex2樣位點(diǎn)的插入改善了在前肽切割位點(diǎn)處的正確的內(nèi)肽酶加工，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分泌水平增加。在本發(fā)明的上下文中，與氨基酸序列XrX2-X3-X4-Xs或XrX2-X3-X4-Xs-X6或者SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個(gè)#^酸序列所示的成熟多JIM目比，kex2或kex2樣位點(diǎn)的插入導(dǎo)致可以在N末端延伸(使抗微生物多肽皿伸)內(nèi)的一定位點(diǎn)進(jìn)行切割。融合多肽本發(fā)明多肽還包括融合多肽或可切割融合多肽，其中另一個(gè)多肽與本發(fā)明多肽或其片段的N末端或C末端融合。通過將編碼另一個(gè)多肽的核苷酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)融合產(chǎn)生融合多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，其包括將編碼多肽的編碼序列如此連接以致于使它們處于同一閱讀框并且使融合多肽在同一啟動(dòng)子和終止子控制下表達(dá)。多核香酸和核香^列本發(fā)明還涉及具有編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的多核苷酸。具體而言，本發(fā)明涉及由編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列組成的多核苷酸。由于遺傳密碼的簡并性，技術(shù)人員將容易地認(rèn)識到可以制備編碼本發(fā)明每一多肽的幾種核苷酸序列。在本領(lǐng)域中眾所周知，編碼本發(fā)明多肽的氨基酸的密碼子由核苷酸組成。本發(fā)明還涉及編碼具有抗微生物活性的tJ^酸序列XrX2-X3-X4-Xs或XrX2-X3誦XrXs-X6或者SEQIDNO:l至SEQIDNO:319中任意一個(gè)^J^酸序列的片段的多核苷酸。多核苷酸的亞序列為其中5，和/或3，末端的一個(gè)或多個(gè)核苷酸已經(jīng)缺失的核苷酸序列。通過在遺傳工程中使用的標(biāo)準(zhǔn)克隆步驟，可以將核苷酸序列從一個(gè)位點(diǎn)?？寺〔襟E包括包含編碼多肽的核苷酸序列的目的片段的切除和分離、將片段插入栽體分子以及重組栽體整合入宿主細(xì)胞，在那里將復(fù)制出核苷酸序列的多重拷貝或克隆。核苷酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成來源、合成來源或其任意組合.編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的修飾對于多肽的合成可能是必需的，其中與列X廣X2-X3-X4曙Xs或X廣X2誦X3-X4-X5隱X6或者SEQIDNO:1至SEQIDNO:319中任意一個(gè)U酸序列相比所述多肽所包含的氨基酸序列具有至少一個(gè)替換、缺失和/或插入。這些人工變體在某些工程化方式上可能不同于從其天然來源分離得到的多肽，例如在特異活性、熱穩(wěn)定性、最適pH等等方面不同的變體?？梢栽诜肿庸δ荜P(guān)鍵區(qū)域外進(jìn)行此類修飾，并且此類修飾仍然能夠產(chǎn)生活性多肽，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法例如位點(diǎn)定向謙變或丙氨酸掃描誘變(見例如Cunningham和Wells,1989，5W朋ce244:1081-1085)可以鑒定出對于本發(fā)明核苷酸序列所編碼多肽的活性所必需的、因此優(yōu)選不進(jìn)行修飾(例如替代)的#^酸殘基。在后一種技術(shù)中，在分子中每一個(gè)帶正電荷的殘基處導(dǎo)入突變，并且測定所基。通過使用諸如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記法(見例如deVos等，1992，S"e/ice255:306-312;Smith等，1992，/做iifl/o/Mo/eci//"!"丑&to^;224:899隱卯4;Wlodaver等，1992，i^AS丄e故ra309:59-64)的技術(shù)所確定的三維結(jié)構(gòu)分析也能夠確定底物-酶相互作用的位點(diǎn).此外，通過導(dǎo)入核苷酸替換可以修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，其中核苷酸替換不產(chǎn)生由核苷酸序列所編碼的多肽的另一種M酸序列但是符合打算產(chǎn)生酶的宿主生物的密碼子選擇。通過使用本領(lǐng)域已知的任意方法的位點(diǎn)定向誘變可以實(shí)現(xiàn)將突變引入核苷酸序列中以便將一個(gè)核苷酸替換為另一個(gè)核苷酸.特別有用的是這樣一種方法，其利用具有目的插入片段的超螺旋、雙鏈DNA栽體和包含所期望突變的兩個(gè)合成引物，在溫度循環(huán)期間通過戶/"DNA聚合S^f吏寡核苷酸引物延伸，其中每條寡核苷酸引物與栽體的相反鏈互補(bǔ).一旦引物摻入，則產(chǎn)生了包含交錯(cuò)缺刻的突變質(zhì)粒。溫度循環(huán)之后，使用對甲基化和半甲基化DNA特異的D/ml處理產(chǎn)物以消化親本DNA模板并選擇出包含突變的合成DNA。還可以使用本領(lǐng)域已知的其它方法。對于核苷酸替換的概述見例如Ford等，1991，jEx/ii*eswVm尸w17yjcflfto"2:95-107。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述核苷酸與能夠指導(dǎo)編碼序列在與控制序列相容條件下在適宜宿主細(xì)胞中表達(dá)的一種或多種控制序列有效連接。為了使多g達(dá)，可以以多種方式操作編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列。在插入栽體之前對多核苷酸進(jìn)行操作可能是期望的或必需的，這取決于表達(dá)載體。利用重組DNA方法修飾核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的?？刂菩蛄锌梢允沁m當(dāng)啟動(dòng)子序列，即在核苷酸序列表達(dá)時(shí)可被宿主細(xì)胞識別的核苷酸序列。啟動(dòng)子序列包含介導(dǎo)多M達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動(dòng)子可以是在所選擇宿主細(xì)胞中表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，其包括突變體啟動(dòng)子、截?cái)鄦?dòng)子和雜合啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外多肽或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得.用于指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的適宜啟動(dòng)子的例子;1從大腸桿菌lac操i^基因、天藍(lán)色鏈霉菌CS^/^挑j;c^coe/iV^/w)瓊脂糖酶基因(&gJ)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sflc丑)、地衣芽孢桿菌(5ad//ws/i'cAewyiw7if&)a-淀粉酶基因(AWfj^)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(5""7/附對^^狄6/70/^//《)麥芽糖淀粉酶基因("挑，|;3^)、解淀粉芽孢桿菌(5ac說iisam，y/o^ne/"dews)a-淀粉酶基因(awyg)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(p朋JP)、枯草芽孢桿菌w"和基因和原核的j8-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，iVia^wifl/爿cfldeiMy5We"ces75:3727-3731)獲得的啟動(dòng)子以及toc啟動(dòng)子(DeBoer等，1983，iVwe^/fVigs幼eiV"ftVwa/y4cflrfe附y(tǒng)o/5We"cesf75！/480:21-25)。另夕卜的啟動(dòng)子描述于"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"(5"dewftycj挑wicflw，1980，242:74-94)和Sambrook等，1989，見上。用于指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的適宜啟動(dòng)子的例子是從米曲霉04s/iwgi7/"swj加e)TAKA淀粉酶基因、米黑根毛霉(及A&o附mc(^mi'e/^/)天冬氨酸蛋白酶基因、黑曲霉04spei^7/wsw(gef)中性a-淀粉酶基因、黑曲霉酸穩(wěn)定性a^淀粉酶基因、黑曲霉或泡盛曲霉(厶/^g欲iwflHWfW/)葡糖淀粉酶(^/flJ)基因、米黑根毛霉脂肪酶基因、米曲霉堿性蛋白酶基因、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因、構(gòu)巢曲霉04s/wg,7/"swW"/fl附)乙酰胺酶基因和尖鐮孢(F附fl/7'w附狄p/wniw)胰蛋白酶樣蛋白酶基因獲得的啟動(dòng)子(WO96/00787)以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子的雜合體)以及其突變啟動(dòng)子、截?cái)鄦?dòng)子和雜合啟動(dòng)子。在酵母宿主中有用的啟動(dòng)子是從釀酒酵母(5Vicc/iflw考cescefevfe^)烯醇化酶(ENO-l)基因、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)基因、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因獲得的啟動(dòng)子。用于酵母宿主細(xì)胞的其它啟動(dòng)子描述于Romanos等，1992,1VflW8:423-488?？刂菩蛄羞€可以是適宜轉(zhuǎn)錄終止序列，即宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列.終止序列與編碼多肽的核苷酸序列的3，末端有效連接。在所選擇宿主細(xì)胞中具有功能的任何終止子可用于本發(fā)明。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、構(gòu)巢曲霉鄰M苯甲酸合酶基因、黑曲霉仏葡糖苷酶基因和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因獲得的終止子。用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從釀酒酵母烯醇化酶基因、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)基因和釀酒酵母甘油搭-3-磷酸脫氫酶基因獲得的終止子。用于酵母宿主細(xì)胞的其它終止子描述于Romanos等，1992，見上?？刂菩蛄羞€可以是適宜前導(dǎo)序列，即對宿主細(xì)胞翻譯而言重要的mRNA非翻譯區(qū)域。前導(dǎo)序列有效連接于編碼多肽的核苷酸序列的5，末端。在所選擇宿主細(xì)胞中具有功能的任何前導(dǎo)序列可用于本發(fā)明。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)序列是從米曲霉TAKA淀粉酶基因和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因獲得的。用于酵母宿主細(xì)胞的適宜前導(dǎo)序列是從釀酒酵母烯醇化酶(ENO-l)基因、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、釀酒酵母a-因子基因和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油搭-3-磷自氫酶(ADH2/GAP)基因獲得的?？刂菩蛄羞€可以是多聚腺苷酸化序列，即有效連接于核苷酸序列3，末端并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)被宿主細(xì)胞識別作為向所轉(zhuǎn)錄mRNA添加多聚腺苷酸殘基的信號的序列。在所選擇宿主細(xì)胞中具有功能的任何多聚腺苷酸化序列可用于本發(fā)明。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選多聚腺苷酸化序列是從米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、構(gòu)巢曲霉鄰^J^苯甲酸合酶基因、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因和黑曲霉a-葡糖苷酶基因獲得的。Guo和Sherman，1995，CW/w/"r5"/o^v15:5983-5990描述了對于酵母宿主細(xì)胞有用的多聚腺苷酸化序列?？刂菩蛄羞€可以另_信號肽編碼區(qū)，其中所述信號肽編碼區(qū)編碼連接于多肽氨基末端的M酸序列并且指導(dǎo)所編碼多肽l細(xì)胞的分泌途徑。核苷^列的編碼序列5，端可內(nèi)在地包含與編碼分泌性多肽的編碼區(qū)片段以翻譯閱讀框天然連接的信號肽編碼區(qū)。備選地，編碼序列的5，端可包含對編碼序列而言為外來的信號肽編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列在天然情況下不包^號肽編碼區(qū)時(shí)，可能需要外來的信號肽編碼區(qū)。備選地，可以將外來的信號肽編碼區(qū)簡單地替換天然的信號肽編碼區(qū)以〗更增強(qiáng)多肽的分泌。然而，能夠指導(dǎo)所表達(dá)多肽進(jìn)入所選擇宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)可用于本發(fā)明。用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼區(qū)是從芽孢桿菌NCIB11837麥芽糖淀粉基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌3-內(nèi)酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(";wT、"/mS、w/wM)和枯草芽孢桿菌/wx4基因獲得的信號肽編碼序列。另一些信號肽描述于Simonen和Palva，1993,Miav6f》/tfg&a/及ev/env57:109-137。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效的信號肽編碼區(qū)是從米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因、孤獨(dú)腐質(zhì)霉(^/附/coto!Vi卯/e附)纖維素酶基因和柔毛腐質(zhì)霉(及"附/C0/fl/朋"gi'"owi)月旨肪酶基因獲得的。用于酵母宿主細(xì)的信號肽編碼區(qū)是從釀酒酵母ce因子基因和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶基因獲得的。其它有用信號肽編碼區(qū)描述于Romanos等，1992，見上?？刂菩蛄羞€可以是編碼位于多肽M端的M酸序列的前肽編碼區(qū)。得到的多肽稱為酶原(proenzyme)或多肽原(或在一些情況下稱為酶原(zymogen))。多肽原通常為非活性的并且可通過將前肽從多肽原中催化性切下或自催化性切下而轉(zhuǎn)換為成熟的活性多肽。前肽編碼區(qū)可從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(印fE)基因、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(/i/w7)基因、釀酒酵母a-因子基因、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因和3^ce/,;pA幼wflAei7if^W/fl漆酶基因(WO95/33836)獲得。當(dāng)信號肽和前肽區(qū)均出現(xiàn)于多肽的^J^末端時(shí)，則前肽區(qū)位于多肽氨基端而信號肽區(qū)位于前肽區(qū)的氨基端。添加使多JK^J^f目對于宿主細(xì)胞生長而受到調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)序列也是適當(dāng)存在)做出反應(yīng)從而引^因表達(dá)開啟或關(guān)閉的系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括/flc、toc和吵操M(fèi)因系統(tǒng).在酵母中可使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，TAKAa淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子可用作調(diào)節(jié)序列.調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的調(diào)節(jié)序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括能夠在氨甲蝶呤存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因和在重金屬存在下擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因，在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列有效連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。上面所述的各種核苷酸和控制序列可以連接在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)栽體，該重ia^達(dá)載體可以包含一個(gè)或多個(gè)適宜的限制性酶切位點(diǎn)以允許編碼多肽的核苷^f列在此位點(diǎn)處插入或替換。備選地，通過將包含該序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體中可以表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列。在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，編碼序列位于載體內(nèi)從而使編碼序列與用于表達(dá)的適當(dāng)控制序列有效連接。重組表達(dá)載體可以是能夠方便進(jìn)行重組dna步驟并且能夠引起核苷酸序列表達(dá)的任意栽體(例如質(zhì)?；虿《?。對載體的選擇一般取決于載體與載體將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線性的或閉合環(huán)狀的質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制型栽體，即載體作為染色體外的實(shí)體而存在，它的復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。栽體可以以任意方式保證自我復(fù)制。備選地，當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)載體可以整^^入基因組并與其已經(jīng)整合入的染色體一起復(fù)制。而且，可以使用單一栽體或質(zhì)粒或者兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒(共同包含待導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的總dna)或者轉(zhuǎn)座子。本發(fā)明載體優(yōu)選包含允許對轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行容易篩選的一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記是其基因產(chǎn)物可提供對殺生物劑或病毒抗性、對重金屬抗性、針對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等等的基因。細(xì)菌選擇標(biāo)記的例子是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的rffl/基因，或者賦予抗生素抗性如氨節(jié)青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記。用于酵母宿主細(xì)胞的適當(dāng)標(biāo)記為ADE2、fflS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記包括但不限于fl/iK^(乙酰胺酶)、flrg5(鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶)、6flr(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、A膽5(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、/MViZ)(辨酸還原酶)、/^K(乳清酸核苷-5，4^羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)、吵c(鄰絲苯甲酸合酶)，以及其等效物。優(yōu)選地用于曲霉屬(Js/w^7/"s)細(xì)胞的標(biāo)記是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的a挑fltS和/yr(基因以及吸7jc鏈霉菌(5&印to挑y"s/y絮r仍co/i/c附)的6flr基因。本發(fā)明栽體優(yōu)選地包含允許栽體穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞基因組或者載體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于基因組之外自主復(fù)制的元件。對于整合入宿主細(xì)胞基因組，載體依賴于編碼多肽的核苷酸序列或者用于通過同源或非同源重組將載體穩(wěn)定整合入基因組的載體的任意其它元件。備選地，載體可以包含用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組的附加核苷酸序列。附加核苷酸序列能夠使栽體在染色體內(nèi)的精確位置整合入宿主細(xì)胞基因組。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件將優(yōu)選地包含足夠數(shù)量的核苷酸，例如100-1,500個(gè)^^對、優(yōu)選400-1,500個(gè)4^對并且最優(yōu)選800-1,500個(gè)>^對，其與相應(yīng)把序列高度同源以增加同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中的乾序列同源的任意序列。此外，整合元件可以是非編碼核苷酸序列或編碼核苷酸序列。另一方面，栽體可以通過非同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組。對于自主復(fù)制，栽體可以進(jìn)一步包含使栽體在所述宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的例子是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)和允許在芽孢桿菌中復(fù)制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMIJl的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)的例子是2micron復(fù)制起點(diǎn)、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合以及ARS4和CEN6的組合，復(fù)制起點(diǎn)可以具有突變，該突變使其在宿主細(xì)胞中以溫度敏感方式起作用(見例如Ehrlich，1978，/Vwee必wgsd/說eiVaftV)"a"airfe附y(tǒng)o/iSWewces75:1433)。可以將一個(gè)以上拷貝的本發(fā)明核苷酸序列插入到宿主細(xì)胞中以增加基因產(chǎn)物的生產(chǎn)。核苷^列拷貝數(shù)的增加可以通過將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組獲得或者通過包含與核苷酸序列在一起的可擴(kuò)增選擇標(biāo)記基因獲得，在第二種情況下通it^適當(dāng)選擇劑存在下培養(yǎng)細(xì)胞雜細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的(見例如Sambrook等，1989，見上)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞，其方便地用于多肽的重組生產(chǎn)。如先前所描述，將包含本發(fā)明核苷酸序列的載體導(dǎo)入宿持。宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物例如原核生物，或者是非單細(xì)胞微生物例如真核生物。有用的單細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞例如革蘭氏陽性細(xì)菌(包括但不限于芽孢桿菌屬(5fld//"s)細(xì)胞，例如嗜堿芽孢桿菌(J5fld//Msa/^/<i/^//"s)、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌CBa"7/MS6rev,'s)、環(huán)狀芽孢桿菌(5""7/|dmi/aws)、克勞氏芽^&^f菌(^ic飾sdaus")、凝結(jié)芽孢桿菌(5鎖7Zmscoflgw/fl"s)、丑a"7/"s/a"加s、遲緩芽孢桿菌(丑aa7/附/e"似s)、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(5flCl7Z"S/W"fltefl'MW)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌(5flci7/ws^im'wgf*e"'s);或者鏈霉菌屬(S"印似附j(luò);cm)細(xì)胞例如變鉛青鏈霉菌cs，fir印towy;ces/iV!v/"ws)或鼠灰鏈霉菌(5yrep似n^cmw"r/"iw))或者革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌和假單胞菌(i^"rf(Wi卵flwsp)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是i^芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，桿菌細(xì)胞是嗜堿性芽孢桿菌。通過例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(見例如Chang和Cohen,1979，MtfZ"M/w(^"^yi/G^"幼cs168:111-115)、4吏用感受態(tài)細(xì)胞(見例如Young和Spizizin，1961，/oMi7ia/5fl"e^/ogv81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，/卯wfl/o/Mo/"M/w及Vto^56:209-221)、電穿孑L(見例如Shigekawa和Dower，1988，5,》tecAf々《es6:742-751)或者#^作用(見例如Koehler和Thorne，1987，/(ww7ifl"/5flrfm'o/o^v169:5771-5278)可以實(shí)現(xiàn)載體向細(xì)菌宿主細(xì)胞的導(dǎo)入，宿主細(xì)胞可以是真核生物例如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。如文中所使用"真菌"包括子嚢菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等在j/wsmw狄朋</5/勿，sD/cftV"flijFmw'，第8版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如在Hawksworth等，1995，同上，第171頁中所引用)和全部有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，同上)。在更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。如此處所使用的"酵母"包括產(chǎn)子嚢酵母(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)孢子目酵母(basidiosporogenous)和屬于半知菌類的酵母(芽酵母屬(Blastomycetes)).由于酵母的分類將來可能發(fā)生變化，為了本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)當(dāng)如5iV/ogyJcft'v旭esd/ye"s《(Skinner，F(xiàn).A.,Passmore，S.M.和Davenport,R.R.，編者，5^c.丑acten》ASen'esNo.9，1980)所描述進(jìn)行定義。在甚至更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬(Cflfi必rfa)、漢遜酵母屬(^mse"w/")、克魯維酵母屬(JS7ionwwi^"s)、畢赤酵母屬(P,V^Vi)、酵母屬(5ViccA"/w/yY鄉(xiāng))、裂殖酵母屬(iScAi'zasflcc/uwwi^ces)或亞羅酵母屬(；Fii/7wv/fl)細(xì)胞。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母(Sfla^fliwiy;cesaw7s^ge附i's)、酉良酒酵母、糖化酵母(iSacc/rfliwiij^sWas她'cws)、5Vicc/w/Ywi^cesrfowg/flsi7、克魯弗酵母(5Vicc/rfliwiy;cesA:/w"m')、諾地酵母(5ViccAfl/wiy;ceswo由wsis)或5"flcc/iflr細(xì)j;cesov(/iw附ij細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(iS7"jw/ww，yces/ac治)細(xì)胞。在另一個(gè)最選的實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞是解脂耶氏酵母(PiamM7'a/—)細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。"絲狀真菌"包括真菌門(Eumycota)和卵菌門(Oomycota)亞門的所有絲狀真菌(如Hawksworth等，1995，見上，所定義)。絲狀真菌的特征為具有由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖構(gòu)成的菌絲壁。營養(yǎng)生長通過菌絲延長進(jìn)行并且碳代謝是專性需氧。與此不同，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長是通過單細(xì)胞菌體的出芽進(jìn)行并且碳代謝可以狄酵。在甚至更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是如頂孢霉屬(Jcre挑wi/"附)、曲霉屬(』s/ierg///iis)、鐮孢霉屬(F"ww/w挑)、腐質(zhì)霉屬(好"加/c0/fl)、毛霉屬(Mmcw)、毀絲霉屬(Mj;ce/&/^^Wfl)、脈孢菌屬(A^iiiw/wa)、青霉屬(尸e"iW股Mw)、梭孢殼屬(rWe/aviVi)、彎頸霉屬(ro/，octo必"附)或木霉屬(7WcAtwfer挑tf)各種的細(xì)胞，但不限于此。在最優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、臭曲霉(^4s/^g///"s/i^iV/"s)、日本曲霉()、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是軒抱狀嫌抱(jpMSflri'W/M)、FMSflr/m挑CgfCfl/l'S、尸ns"r/"附crooAwc//we、大刀嫌抱(尸wsflr/w/ncm/挑wm附)、禾本^t^抱(F"scw7'"加gfa附fVicflrM附)、禾赤錄抱(尸wsan'M附grawiVi挑)、異抱嫌抱(^F"sfln'w挑/te拈/YM/Wf"挑)、合歡木鐮孢(Fmswi7i挑wegw/i必)、尖鐮孢、多沖支鐮孢(i^wsflnVi戰(zhàn)i*gft'cw/afti/)、粉紅嫌抱(尸"sar/w附rosewiif)、接骨木嫌抱(i^iisan'ii附sa附6fidwMiM)、狹色嫌抱(JP"sa"'m附s<HToc&r<wiw)、者以分枝孢鐮孢(尸"sfl"/"挑s/ww加'cA/dVfes)、石克色鐮孢菌(/Ymw/w挑幼(p/iwr^/附)、JFwsfln'M附tofiifosw附、i^san'Miii,ri'c/i<^/tcc/o/flfes或,wsflr/wwfvcwe/fa^/附細(xì)胞。在甚至最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌母細(xì)胞是ve"e/ifl似附(Nirenbergsp.nov.)細(xì)胞，在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的絲狀真菌宿主細(xì)胞是孤獨(dú)腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米黑毛霉(^Z^"cw附,'e/^)、iW^ce/^/i緣w"/tmMflp緒fl、粗較脈孢菌(iVeMms/iwflcmssfl)、產(chǎn)紫青審(/wir/;wng6/iM附)、T7j/CflviVite/Tgsfr&、哈茨木審(7>/cA<w/mwaAa/z/aw謂)、康寧木霉(7>/c/wfe/7MaA;o"/wg//)、長柄木霉(TWc/wz/mnfl/tfwg幼iYicAtoi挑)、李氏木霉(JWc/w(itei7fifl)或綠色木霉(7WcAofifer鵬v'Wflfe)細(xì)胞。真菌細(xì)胞可通過包括原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的方法以本身已知的方式轉(zhuǎn)化。適用于轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細(xì)胞的方法描述于EP238023和Yelton等，1984，^ftwe^Z/"gs幼eiViarf卵fl/y4cflrf棚yiSWe""sfAS^81:1470-1474。適用于轉(zhuǎn)化鐮孢霉屬各種的方法描述于Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787。對酵母的轉(zhuǎn)化可使用Becker和Guarente(在Abelson，J.N.和Simon,M.I.,編者，GuiV/etoPiwirfG^weftcs"m/Mo/ecw/ar丑fWiigy，五""鵬o/o狄，第194巻，第182-187頁，AcademicPress,Inc.,NewYork中)；Ito等，1983，J做r/m/</丑《"抓'。/柳153:163以及Hinnen等，1978，幼eA^ftVwifl/^4cflrfe考<>/5We"ces1/5^475:1920中描述的方法進(jìn)行。生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有利于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收多肽。在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，使用本領(lǐng)域已知的方法將細(xì)胞培養(yǎng)于適宜多肽產(chǎn)生的營M養(yǎng)基中。例如，可以通過在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐內(nèi)于適宜培養(yǎng)基中并站允許多錄達(dá)和/或分離的糾下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)、小雄或大，發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在包含碳和氮源和無機(jī)鹽的適宜營^^養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。適宜培養(yǎng)基可從商品供應(yīng)商獲得或者按照已公布的組成制備(例如在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的產(chǎn)品目錄中公布的組成)，如果多肽分泌入營M養(yǎng)基，則可以直接從培養(yǎng)基回收多肽。如果多肽不分泌，則可以從細(xì)胞裂解物回收多肽.使用本領(lǐng)域已知的對多肽特異的方法檢測多肽。這些檢測方法包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或者酶底物的消失。例如，如文中所描述酶測定法可以用于測定多肽活性。通過本領(lǐng)域已知的方法可以回收所得到的多肽。例如，通過包括但不限于離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀的常規(guī)方法可以從營M養(yǎng)基中回收多肽?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的各種方法純化本發(fā)明多肽，所述方法包括但不限于層析法(例如離子交換層析、親和層析、疏7]C層析、色《普聚焦層析和大小排阻層析)、電泳方法(例如制備型等電聚焦電泳)、差異溶解度(例如石危酸銨沉淀)、SDS-PAGE或抽提(見例如iVote/"尸Mf訴c她Vm，J.國C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，它們已經(jīng)用編碼具有本發(fā)明抗微生物活性的多肽的核苷酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)化以便以可回收量表達(dá)并產(chǎn)生多肽?？梢詮闹参锘蛑参锊糠只厥斩嚯?。備選地，包含重組多肽的植物或植物部分可以用于提高食品或飼料的質(zhì)量(例如提高營養(yǎng)價(jià)值、適口性和流變學(xué)特性)或者為了破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子?；厥盏亩嚯摹⒅参锘蛑参锊糠诌€可以用于改善或改變動(dòng)物和家畜中的消化菌群。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實(shí)例為草例如牧草(藍(lán)草，禾本科)、飼料草如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)、溫帶草如Agrostis和谷類如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高梁和玉蜀黍(玉米)。雙子葉植物的實(shí)例為煙草、馬鈴薯、甜菜、豆類如羽扇豆、豌豆、扁豆和大豆、十字花fl"植物(十字花科(5m柳Vtfc^^))如花椰菜、油菜，以及關(guān)系密切的模式生物擬南芥菜(^"fl6/rf印si's汰fl&Vwia)。植物部分的實(shí)例為莖、愈傷組織、葉、根、果實(shí)、種子和塊莖。特殊植物組織如葉綠體、質(zhì)外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體和細(xì)胞質(zhì)也認(rèn)為是植物部分。此夕卜，任何植物細(xì)胞無論組織來源如何也認(rèn)為是植物部分。此類植物、植物部分和植物細(xì)胞的后代也包括于本發(fā)明范圍之內(nèi)。按照本領(lǐng)域已知的方法可以構(gòu)建表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。簡言之，通過將編碼本發(fā)明多肽的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體整合入植植物細(xì)胞而構(gòu)建植物或植物細(xì)胞。方便地，表ii^J建體是包含編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的核酸構(gòu)建的適當(dāng)調(diào)控序列有效i接。此外，表i^建體包含用于鑒定表i^I建體已經(jīng)整合入其中的宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記和將構(gòu)建體導(dǎo)入所述植物所必需的DNA序列(后者取決于所使用的DNA導(dǎo)入方法).對調(diào)控序列如啟動(dòng)子和終止子序列以及任選地信號或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇要基于例如期望多肽在何時(shí)、何處和如何表達(dá)來確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達(dá)可以是組成型的或可誘導(dǎo)的，或者可以;UL育、時(shí)期或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向于特異組織或植物部分如種子或葉。調(diào)控序列描述于例如Tague等，1988，戶to"/尸—86:506。對于組成型表達(dá)，可以使用35S-CaMV啟動(dòng)子(Franck等，1980，CW/21:285-294)。器官特異性啟動(dòng)子可以是例如來自貯存庫組織如種子、馬鈴薯塊莖和果實(shí)(Edwards和Coruzzi，1990，j/m.及w.(ewd24:275-303)或來自代謝庫組織如分生組織(Ito等，1994，P/朋rMo/.歷W24:863-878)的啟動(dòng)子，種子特異性啟動(dòng)子如來自水稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白啟動(dòng)子(Wu等，1998，尸/朋ffl"rfCW//^ysto/05J39:885-889)、來自蠶豆(Wdfl/fl6")豆球蛋白B4和未知種子蛋白質(zhì)基因的蠶豆啟動(dòng)子(Conrad等，1998，/做i7w/o/i)/flw《i^);w'o/ogy152:708-711)、來自種子油體蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935-941)、來自歐洲油菜(5rassi'cami/H)的貯存蛋白質(zhì)impA啟動(dòng)子或者本領(lǐng)域巳知的任意其它種子特異性啟動(dòng)子例如WO91/14772中描述的啟動(dòng)子。此外，啟動(dòng)子可以是葉特異性啟動(dòng)子例如來自水稻和番茄的^cs啟動(dòng)子(Kyozuka等，1993，iVa"fJPAysiV/tfgy102:991-1000)、小球藻病毒腺噪呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子(Mitra和Higgins，1994，iV"WMo/ecw/flr歷o/^y26:85-93)或來自水稻的fl/rf尸基因啟動(dòng)子(Kagaya等，1995，Af</"w/fl#"<71幼"248:668-674)，或者創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(Xu等，1993，外flWMo/ecM/flr5油gy22-573-588)。啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件也可以用于實(shí)現(xiàn)酶在植物中較高表達(dá)。例如，啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件可以是位于啟動(dòng)子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間的內(nèi)含子。例如，Xu等(1993，同上)公開了水稻肌動(dòng)蛋白l基因的第一個(gè)內(nèi)含子用于增強(qiáng)表達(dá)的用途。選擇標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任意其它部分可以從本領(lǐng)域可利用的那些進(jìn)行選擇。按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)將核酸構(gòu)建體整合入植物基因組，所述技術(shù)包括土壤桿菌Ugn^fl"m'"加)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，19卯，5We""244:1293;Potrykus，1990，5iV/rec/t/ioto^8:535;Shimamoto等,1989，iVfl似fe338:274)。目前，根癌土壤桿菌(^giY^cten'Mwf"附e/flde附)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是選擇用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的方法(對于綜述見Hooykas和Schilperoort,1992，戶/aWMo/eai/flr19:15-38)。然而該方法也能夠用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，盡管其它轉(zhuǎn)化方法對于這些植物通常是優(yōu)選的。目前，選擇用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的方法是胚胎愈傷組織或發(fā)育胚胎的粒子轟擊(用轉(zhuǎn)化DNA包被的顯微金或鎢顆粒)(Christou，1992，戶/"W/卯i7ifl/2:275-281jShimamoto，1994，C"wre"f6^!7f/卵歷她cA朋/05[V5:158-162;Vasil等，1992，說VTecA朋/o幻710:667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的備選方法是Omirulleh等(iVfl"/A^/ecii/af歷oto^，1993,21:415-428)所描述的基于原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化之后，按照本領(lǐng)域眾所周知的方法選擇出其中整合有表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并將轉(zhuǎn)化體再生成為完整植物。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在易于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含編碼多肽(具有本發(fā)明抗微生物活性)的核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；和(b)回收多肽。組合物在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明抗微生物多肽的組合物，例如藥物組合物。組合物可以包含作為主要多肽成分的本發(fā)明多肽，例如單一成分組合物。備選地，組合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、p-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、p-葡糖苷酶、卣素過氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。組合物可以進(jìn)一步包含另一種藥物活性試劑，例如另外的殺生物劑，例如表現(xiàn)為如上所述抗孩i生物活性的另一種抗孩i生物多肽。如本領(lǐng)域已知，殺生物劑可以是抗生素。抗生素種類包括青霉素類例如青霉素G、青霉素V、二甲氧基苯青霉素、苯唑青霉素、羧芐青霉素、乙氧萘青霉素、氨芐青霉素等等；與p-內(nèi)酰胺酶抑制劑頭孢菌素類相組合的青霉素例如氯頭孢菌素、頭孢唑啉、頭孢呋辛、拉氧頭孢等等；碳青霉烯類；單菌霉素類；氨基糖苷類；四環(huán)素類；大環(huán)內(nèi)酯類；林可霉素類；多粘菌素類；磺胺類；喹啉類；氯霉素；甲硝唑；大觀霉素；曱氧節(jié)啶；萬古霉素等等。殺生物劑還可以是抗真菌劑，包括多烯類如兩性霉素B、制霉菌素；5-flucosyn;和唑類如咪康峻、酮康唑、依曲康唑和氟康唑。在一個(gè)實(shí)施方案中，殺生物劑是非酶化學(xué)試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，殺生物劑是非多肽化學(xué)試劑。在殺生物劑的25。/。(w/w)水溶液中；優(yōu)選地在10。/。(w/w)水溶液中；更加優(yōu)選地在5。/。(w/w)水溶液中；甚至更加優(yōu)選地在1。/)(w/w)水溶液中；最優(yōu)選地在0.5。/。(w/w)水溶液中；并且具體而言在0.P/。(w/w)水溶液中于20'C孵育8小時(shí)后(優(yōu)選地4小時(shí)后，更加優(yōu)選地2小時(shí)后，最優(yōu)選地1小時(shí)后，并且具體而言30分鐘后)能夠?qū)⒋竽c桿菌(DSM1576)或枯草芽孢桿菌(ATCC6633)的活細(xì)胞數(shù)量降低至1/100。當(dāng)加入1000ppm濃度的殺生物劑時(shí)；優(yōu)選地當(dāng)加入500ppm濃度的殺生物劑時(shí)；更加優(yōu)選地當(dāng)加入250卯m濃度的殺生物劑時(shí)；甚至更加優(yōu)選地當(dāng)加入IOOppm濃度的殺生物劑時(shí)；最優(yōu)選地當(dāng)加入50ppm濃度的殺生物劑時(shí)；并且具體而言當(dāng)加入25ppm濃度的殺生物劑時(shí)，殺生物劑能夠在25'C抑制大腸桿菌(DSM1576)或枯草芽孢桿菌(ATCC6633)的生長達(dá)24小時(shí)。生物作用。組合物可以包含適當(dāng)載體物質(zhì)。組合物還可以包含適宜遞送媒介物，當(dāng)組合物用作藥物時(shí)所述媒介物能夠?qū)⒈景l(fā)明的抗微生物多肽遞送至預(yù)期位點(diǎn)。組合物可以按照本領(lǐng)域已知的方法制備并且組合物可以是液體或干燥形式的組合物。例如多肽組合物可以是顆?；蛭㈩w粒形式。按照本領(lǐng)域已知的方法可以使組合物所包含的多肽穩(wěn)定。下面給出了本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選用途的例子.基于本領(lǐng)域已知的方法可以確定本發(fā)明多肽組合物的劑量和使用該組合物時(shí)的其它條件。方法和用途本發(fā)明還包含本發(fā)明抗微生物多肽的多種用途。抗微生物多肽一般用于遭受細(xì)菌、真菌、酵母或藻類污染的任何場所。一般地，場所是水系統(tǒng)例如冷卻水系統(tǒng)、洗衣房漂洗水，油系統(tǒng)例如切削油、潤滑油、油田等等，在這些地方需要?dú)⑺牢⑸锘蛘咝枰刂莆⑸锷L。然而，本發(fā)明還用于已知抗微生物組合物有用的全部應(yīng)用中，例如木材、乳膠、粘合劑、膠、紙張、硬紙板、織物、皮革、塑料、膩?zhàn)幽z和飼料的保護(hù)。其它用途包括食品、飲料、化妝品如洗劑、乳骨、■、軟骨、肥皂、'先t劑、調(diào)節(jié)劑、止汗劑、除臭劑、漱口劑、隱形眼鏡產(chǎn)品、酶制劑或食品成分的保藏。因此，在例如痤瘡、眼睛或口腔感染、皮膚感染的治療中；在止汗劑或除臭劑中；在浴足鹽中；在對隱形眼鏡、堅(jiān)硬表面、牙齒(口腔護(hù)理)、創(chuàng)傷、挫傷等等的清洗和消毒中，本發(fā)明抗微生物多肽可以用作消毒劑。通常，可以預(yù)期本發(fā)明抗微生物多肽能夠用于任何堅(jiān)M面的清洗、消毒或抑制微生物生長?？梢苑奖愕嘏c本發(fā)明抗微生物多^目接觸的表面的實(shí)例是在例如牛奶場、化學(xué)或藥物加工廠、水衛(wèi)生系統(tǒng)、油加工廠、紙漿加工廠、水處理廠和冷卻J^使用的加工^:備的表面。本發(fā)明抗微生物多肽應(yīng)以一定量使用，該量可有效地對所i^面進(jìn)行清洗、消毒或抑制微生物生長。另外，可以預(yù)期本發(fā)明抗微生物多肽能夠方便地用于就地清洗(C丄P.)系統(tǒng)以便清洗任何種類加工設(shè)備。本發(fā)明抗微生物多肽還可以用于食品加工廠和任何準(zhǔn)備食物或^J良務(wù)區(qū)域(如醫(yī)院、療養(yǎng)院、餐館特別是快餐館、熟食店等等)的表面清洗和烹調(diào)器具清洗。本發(fā)明抗微生物多肽還可以在食品制品中用作抗孩t生物劑，并且其作為乳酪、水果和蔬菜以及沙拉條食品中的表面抗微生物劑是特別有用的。本發(fā)明抗微生物多肽還可以用作水性^H"中的防腐劑或消毒劑。本發(fā)明抗微生物多肽還可以用于水系的微生物控制以及用于水的消毒，具體而言用于工業(yè)水的消毒。本發(fā)明還涉及本發(fā)明抗微生物多肽或組合物用作藥物的用途。此外，本發(fā)明抗微生物多肽或組合物還可以用于制造控制或防止微生物(如真菌生物或細(xì)菌，優(yōu)選革蘭氏陽性細(xì)菌)的藥物。或預(yù)防劑。因此，本發(fā)明組合物和抗微生物多肽可以用于制備治療微生物感染(如細(xì)菌或真菌感染，優(yōu)選革蘭氏陽性細(xì)菌感染)的獸用或人用治療劑或預(yù)防劑。具體而言，微生物感染與肺病(包括但不限于結(jié)核病、肺炎和嚢性纖維化)和性傳播疾病(包括但不限于淋病和衣原體)相關(guān)。本發(fā)明組合物包含有效量的本發(fā)明抗微生物多肽。當(dāng)文中使用時(shí)，術(shù)語"有效量"旨在指足以抑制所述微生物生長的本發(fā)明微生物多肽的量。本發(fā)明還涉及創(chuàng)傷愈合組合物或產(chǎn)品如繃帶、醫(yī)療用具如導(dǎo)管，并且進(jìn)一步涉及抗皮屑頭發(fā)產(chǎn)品如洗發(fā)劑。本發(fā)明抗微生物多肽的制劑可施用于患有或者易患微生物感染的宿主。施用可以是局部的、局限的或全身的，這取決于特定微生物，優(yōu)i^限施用。通常，本發(fā)明抗微生物多肽劑量足以使微生物菌群減少至少大約50%,通常減少至少1個(gè)殺死對數(shù)級(logofkilling)并且可以降低2個(gè)或更多個(gè)殺死對數(shù)級。可以以降低微生物種群同時(shí)使任何副作用最小化的劑量施用本發(fā)明化合物。可以預(yù)期，對于體內(nèi)使用可以在醫(yī)師指導(dǎo)下獲得并使用組合物。本發(fā)明抗微生物多肽特別地用于殺死革蘭氏陰性細(xì)菌包括銅綠假單孢菌(i^M&卿"flwflm^'"仍fl)和砂目艮衣原體(CMfl考必"^flC^/Mfl泡)和革蘭氏陽性細(xì)菌包括各種葡萄球菌和鏈球菌。本發(fā)明抗微生物多肽對于殺死微生物的體外制劑也是有用的，特別是當(dāng)人們不希望引入大量常規(guī)抗生素時(shí)。例如，本發(fā)明抗微生物多肽可以加入動(dòng)物和/或人類食物制劑中；或者它們作為添加劑用于細(xì)胞體外培養(yǎng)以便防止微生物在組織培養(yǎng)中過度生長。如實(shí)驗(yàn)部分所詳細(xì)描述，通過體外測試可以確定特定微生物對本發(fā)明抗微生物多肽致死的敏感性。一般地，將各種濃度抗微生物多肽與微生物一起培養(yǎng)一段時(shí)間使蛋白質(zhì)充^作用，通常在大約i小時(shí)和i天之間。然后計(jì)數(shù)活的微生物并確定殺傷水平。目的微生物包括但不限于革蘭氏陰性細(xì)菌例如檸檬酸細(xì)菌(C7加6flcter);腸桿菌(JE""te^flctei");埃希氏菌(EscAm'cA/"印.)，例如大腸桿菌；克雷伯氏菌(JSr/Wsi'e/tos/;.);摩根氏菌(^/^^"恥//"sp.);變形菌(iVote"sw.);普羅威登斯菌(PfoviVfewaVis/7.);沙門氏菌(Sa/wMwe/Zas/i.)例如傷寒沙門氏菌(51.印/i似)，鼠傷寒沙門氏菌(51.《v/^/挑nn'M附)；沙雷氏菌(torarifls/7.);志賀氏菌();假單胞菌(戶se油卿/uis)例如銅綠假單孢菌；耶爾森氏菌(yera,Vi/fl，)例如鼠疫耶爾森氏菌(K;e幼's),假結(jié)核耶爾森氏菌(K/wewrf^"6efcn/仍,'s)，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Kewtewo/故cfl);弗朗西絲氏菌(F/wids"http://");巴斯德氏菌(戶"s似re/tow.);弧菌(K幼/7'"s/;.)例如霍亂弧菌(K.c/w/^Yze)，副溶血弧菌(K.;wwfl/^/iwfyria/s);彎曲桿菌(CVz挑/7j;/Mflctefs/.)例如空腸彎曲菌(C.附')；嗜血菌(好^10>/^^印.)例如流感嗜血菌(丑i'"y"g"^j^),4土氏嗜血菌i/mci*^";博德特氏菌(5<mfete//fls/i.)例如百日咳博德特氏菌(及/7eWs's)，支氣管炎博德特氏菌(及AiwicA&印ft'cfl)，副百日咳博德特氏菌(5./wwfl/erti/ssfe);布魯氏菌(丑/7/"/tosp.)，奈瑟氏球菌(iV"'swWfl印.)例如淋病奈瑟氏球菌(iV.go"wrAoeflg)，腦膜炎奈瑟氏球菌(A^we"/"g&iVft's)等等。其它目的細(xì)菌包括軍團(tuán)菌(Leg!Vwe//fls/O例如嗜肺軍團(tuán)菌"./meM挑fl;p似/fl);利斯特氏菌("s^7'"s/1.)例如單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(丄.);枝y^、體(Afyco;p/as附fl)爾J如人型^L^體(A/.AomiVi/s)，肺炎枝>^、體(Af,);分枝桿菌(Mj;a^flcteW"挑印.)例如鳥結(jié)核分枝桿菌(M-似6eirw/osi's)，麻瘋分枝軒菌(Af./e/wYie);密^f、旋體(7Ve/wwe挑fls/;.)例如蒼白密螺旋體(7:/wi肌rf"挑)；包柔螺旋體(Ao/reWfl)例如伯氏包柔螺旋體(及6wg^r/ei7');鉤端螺旋體(丄印tos/w'raesp.);立克次氏體(及i'c紐toiViw.)例如立氏立克次氏體(及.Wc&加//)，斑滲傷寒立克次氏體(及.W/^');衣原體(CA/a附^/fl取)例如砂眼衣原體，肺炎衣原體(C.pweu卿/f)，鷚鷸熱衣原體(C/w/加ci');螺桿菌(份/i'c幽c^印.)例如幽門螺桿菌(E/y;/oW)等等。非細(xì)菌性的目的病原體包括真菌和原生動(dòng)物病原體，例如痗原蟲(/Vflwwo必asp.)侈!]如惡'ti癡原蟲(P./ii/ci^flffMw)，錐蟲(7Yj/ww仍tf附as/.)例如布氏錐蟲(r.6r"c");shistosomes;阿米巴(J"toe附oe6a印.)，隱球酵母(Cij/^coccwss/i.)，假絲酵母(OwirfWfl)例如白假絲酵母(C.a幼/caws)等等?？梢圆捎枚喾N方法施用。多肽制劑可以口月良給藥，或者通itik管內(nèi)、皮下、皿注射給藥、通過氣溶膠、眼(opthalmically)、膀胱內(nèi)、局部給藥等等。例如通過吸入施用的方法是本領(lǐng)域述眾所周知的。取決于待施用特異性抗微生物多肽、疾病性質(zhì)、施用頻率、施用方式、試劑從宿主的清除等等，治療制劑的劑量將可以在很大范圍內(nèi)變動(dòng)。起始劑量可以較大，1^是較小的維持劑量。劑量可以每周或每兩周不頻繁施用，或者分成較小劑量且每日、每半周施用一次或幾次等等以便維持有效劑量水平。在許多情況下，口服施用比靜脈內(nèi)施用需要更高劑量?？梢孕揎楑０锋I以及氨基和羧基末端以便在口月艮施用時(shí)具有更大穩(wěn)定性。例如，絲末端被酰胺化。制劑本發(fā)明化合物能夠摻入到用于治療性施用的各種制劑中。更加具體而言，本發(fā)明化合物能夠通過與適當(dāng)藥用載體或稀釋劑組合按配方配制成藥物組合物，并且可以按配方制成固體、半固體、液體或氣體形式的制劑例如片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、軟骨劑、乳骨劑、泡沫劑、溶液劑、栓劑、注射劑、pilA劑、剿歐劑、劑、洗劑和氣霧劑。照此，化合物的施用能夠以多種方式進(jìn)行，包括口服、頰部、直腸、胃腸外、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)、經(jīng)皮、氣管內(nèi)等等施用。本發(fā)明抗微生物多M施用后可以全身分布，或者可以通過使用能將活性劑量維持于^位點(diǎn)的a^物或其它制劑使本發(fā)明抗微生物多肽在施用后局限分布。在一個(gè)實(shí)施方案中，局部使用的制劑包含降低二價(jià)陽離子(具體而言是釣和鎂)有效濃度的螯合劑.例如可以包括諸如檸檬酸鹽、EGTA或EDTA的試劑，其中優(yōu)選檸檬酸鹽。檸檬酸鹽濃度通常大約l-10mM。本發(fā)明化合物能夠單獨(dú)施用、彼此組合施用或者能夠與其它已知化合物(例如穿孔素、抗炎劑、抗生素等等)組合^f吏用。在藥物劑型中，化合物可以以其可藥用鹽的形式施用。以下方法和賦形劑僅作為實(shí)例而不是限制本發(fā)明。對于口服制劑，化合物能夠單獨(dú)使用或者與適當(dāng)添加劑組合以制成片劑、散劑、顆粒劑或膠嚢劑，例如與常規(guī)添加劑如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉組合；與粘合劑如微晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯樹膠、玉米淀粉或明膠組合；與崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉組合；與潤滑劑如滑石粉或硬脂酸鎂組合；以及如果期望的話還可以與稀釋劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑和調(diào)味劑組合。通過將化合物以及(如果期望)常規(guī)添加劑如助溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑在7jc或非水溶劑(如植物油或其它類似油、合成脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸酯或丙二醇)中溶解、懸浮或乳化而配制成用于注射的制劑?；衔锟梢灾瞥蓺忪F劑制劑以便通過^A施用。本發(fā)明化合物能夠配制成可增壓拋射劑如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等等?；衔锟梢耘c常規(guī)添加劑如助溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑配制成洗劑以防止例如燒傷感染.而且，可以將化合物與多種基質(zhì)如乳化基質(zhì)或水溶性基質(zhì)相混合制成栓劑。本發(fā)明化合物能夠通過栓劑經(jīng)直腸施用。栓劑包括諸如可可豆脂、碳蠟和聚乙二醇的媒介物，其在體溫下熔化而在室溫下固化?？梢蕴峁┯糜诳诜蛑蹦c施用的單位劑型如糖漿劑、酏劑和混懸劑，其中每種劑量單位如一茶匙、一大湯匙、片劑或栓劑包含預(yù)定量的含有一種或多種本發(fā)明化合物的組合物。同樣，用于注射或靜脈施用的單位劑型可以包含本發(fā)明化合物(作為無菌水溶液中的組合物)、生理鹽7]C或另一種可藥用載體。用于緩釋制劑的埋植劑是本領(lǐng)域眾所周知的。埋植劑可按配方與生物可降解聚合物或非生物可降解聚合物配制成微球劑、板等等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成宿主可良好耐受的易蝕聚合物。將包含本發(fā)明抗微生物多肽的埋植劑放置于感染位點(diǎn)附近，以致于活性成分的局部濃度高于身體其它部位。如文中所使用，術(shù)語"單位劑型"指適宜作為用于人或動(dòng)物受試者的單一劑量的物理不連續(xù)單位，每一單位包含預(yù)定量的本發(fā)明化合物以及可藥用稀釋劑、載體或媒介物，預(yù)定量為所計(jì)算出的足以產(chǎn)生預(yù)期效果的量。本發(fā)明單位劑量的規(guī)格取決于所使用特定化合物和打算獲得的效果，以及與宿主中的化合物相關(guān)的藥效學(xué)。可藥用賦形劑如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑^L公眾可以得到的。而且，可藥用輔助物質(zhì)如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑等等是公眾可以得到的。全身施用的一般劑量范圍為每次每公斤受試者體重0.1pg-100毫克。一般劑量為每次一個(gè)片劑，每日2-6次，或者每次一個(gè)按比例增加活性成分含量的定時(shí)釋放膠嚢或片劑，每日一次。使用在不同pH值下溶解的膠嚢材料，通過由滲透壓緩慢釋放的膠嚢或者通過任何其它已知的控制釋放方法獲得定時(shí)釋放效果。技術(shù)人員將容易意識到，劑量水平可以隨特異化合物的功能、癥狀的嚴(yán)重性和受試者對副作用的易感性而改變。一些特異化合物比其它化合物更有效。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過多種方法可以容易地確定給定化合物的優(yōu)選劑量。優(yōu)選方法是測量給定化合物的生理效能.脂質(zhì)體用作遞送工具是目的方法之一。脂質(zhì)體與把位點(diǎn)的細(xì)胞融合并將腔內(nèi)內(nèi)容物遞iliX細(xì)胞內(nèi)。使用多種保持接觸的方法(如分離、粘合劑等等)，可以將脂質(zhì)體與細(xì)胞保持接觸足夠的時(shí)間以便融合。在本發(fā)明的一方面，將脂質(zhì)體設(shè)計(jì)成氣霧化經(jīng)肺施用。使用介導(dǎo)膜融合的純化蛋白質(zhì)或肽如仙臺病毒或流感病毒等等制備脂質(zhì)體。脂類可以是已知形成脂質(zhì)體的脂類的任意有用的組合，其中形成脂質(zhì)體的脂類包括陽離子或兩性離子脂類如磷酯酰膽堿。剩余的脂類通常是中性或酸性脂類，如膽固醇、磷脂酰絲氨酸、礴脂酰甘油等等。為了制備月旨質(zhì)體，可以使用Kato等(/.C7^附.1991，266:3361)所描述的方法。簡言之，將脂類和包含肽的腔內(nèi)組合物組合于適宜水介質(zhì)中，方便地為總固體量為重量的大約1-10%的鹽介質(zhì)。大約5-60秒的短時(shí)間劇烈振蕩后，將管置于大約25-40。C的溫水浴中，并且重復(fù)該循環(huán)大約5-10次。然后將組合物超聲達(dá)適宜時(shí)間，通常大約1-10秒，并且通過渦旋振蕩進(jìn)一步攪動(dòng)。然后加入水介質(zhì)以擴(kuò)大體積，通常增加大約1-2倍的體積，隨后搖動(dòng)并冷卻。該方法允許將高分子量分子摻入腔內(nèi)。具有其它活性劑的制劑為了用于本發(fā)明方法，本發(fā)明抗微生物多肽可以與其它藥物活性劑、具體而言為其它抗微生物劑一起進(jìn)行配制。如本領(lǐng)域已知，其它目的試劑包括廣泛多種的抗生素?？股氐念悇e包括青霉素例如青霉素G、青霉素V、二甲氧基苯青霉素、苯唑青霉素、羧爺青霉素、乙氧萘青霉素、氨芐青霉素等等；與^內(nèi),酶抑制劑頭孢菌素類組合的青霉素例如氯頭孢菌素、頭孢唑啉、頭孢呋辛、拉氧頭孢等等；碳青霉烯類；單菌霉素類；氨基糖苷類抗生素；四環(huán)素類；大環(huán)內(nèi)酯類；林可霉素類；多粘菌素類；磺胺類；會啉類；氯霉素；甲硝唑；大觀霉素；甲氧千啶；萬古霉素等等?？姑咕鷦┮彩怯杏玫?，其包括多烯類如兩性霉素B、制霉菌素；5-flucosyn;和哇類如咪康哇、酮康唑、依曲康唑和氟康唑。抗結(jié)核藥包括異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素和利福平。本發(fā)明抗微生物多肽制劑也可以包括細(xì)胞因子，例如干擾素Y、腫瘤壞死因子a、白介素12等等。體外合成本發(fā)明抗微生物肽可以使用如本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法體外合成制備?？梢垣@得多種商業(yè)化的合成裝置例如AppliedBiosystemsInc.、Beckman等的自動(dòng)化合成儀。通過使用合成儀可以將天然存在M酸替換為非天然氨基酸，特別是D-異構(gòu)體(或D-型)如D-丙氨酸和D-異亮氨酸、非對映異構(gòu)體、具有不同長度或功能性的側(cè)鏈等等，特定序列和制備方式將根據(jù)方4更性、經(jīng)濟(jì)狀況、所需純度等等確定?？梢韵虬m宜功能性的多種肽或蛋白質(zhì)提供化學(xué)交聯(lián)以便結(jié)合，例如氨基用于形成酰胺或取代酰胺如還原性胺化作用、巰基用于形成石克醚或二硫化物、氛基用于形成酰胺等等。如果期望，在合成或表達(dá)過程中可以將多種基團(tuán)引入肽內(nèi)，這允許與其它分子或表面連接。因此半胱氨酸能夠用于產(chǎn)生硫醚、組氨酸用于與金屬離子#物連接、氣基用于形成酰胺或酯、氣基用于形成酰胺等等。按照重組合成的常規(guī)方法還可以分離并純化多肽。裂解物可以是M達(dá)宿主制備的并且可以使用HPLC、大小排阻層析、^電泳、親和層析或其它純化技術(shù)純化裂解物。對于絕大部分，相對于產(chǎn)物制備方法及其純化相關(guān)的污染物，所使用的組合物以重量計(jì)將包含至少20%的目的產(chǎn)物，更加通常至少大約75%，優(yōu)選地至少大約95%，并且為了治療目的通常至少大約99.5%。通常，百分比以總蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)。動(dòng)物飼料本發(fā)明還涉及將具有抗微生物活性的多肽用于動(dòng)物飼料的方法，以及包含本發(fā)明抗微生物多肽的飼料組合物和飼料添加劑。術(shù)語動(dòng)物包括全部動(dòng)物，包括人類。動(dòng)物的例子為非反芻動(dòng)物和反芻動(dòng)物如奶牛、綿羊和馬。在特定實(shí)施方案中，動(dòng)物是非反芻動(dòng)物。非反芻動(dòng)物包括單胃動(dòng)物例如豬或豬類(包括但不限于小豬、生長豬和母豬)；家禽例如火雞和小雞(包括但不限于燒烤雞、母雞)；年幼小牛；和魚(包括但不限于鮭魚)。術(shù)語飼料或飼料組合物意思是指適宜或旨在由動(dòng)物攝入的任何化合物、制劑、混合物或者組合物。在根據(jù)本發(fā)明的用途中，抗微生物多肽可以在喂食之前、之后或同時(shí)投喂于動(dòng)物。優(yōu)選同時(shí)投喂。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，對加入到飼料中或飼料添加劑中的形式的抗微生物多肽進(jìn)行了充分限定。充分限定意思是指如通過大小排阻層析所確定抗微生物多肽制劑純度至少為50%(見WO01/58275的實(shí)施例12)。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，如通過該方法所確定抗孩吏生物多肽制劑純度至少為60%、70%、80%、85%、88%、卯％、92%、94%或者至少95%.充分限定的抗微生物多肽制劑是有利的。例如，正確地確定投喂基本上沒有其它抗微生物多肽干擾或污染的抗微生物多肽的劑量更加容易。術(shù)語正確地確定劑量具體而言是指獲得一致和恒定結(jié)果的目標(biāo)以及基于預(yù)期效果優(yōu)^f匕劑量的能力。然而，對于在動(dòng)物飼料中的用途，抗微生物多肽不需要那種純度；它可以包含例如其它酶，在這種情況下其可以稱為抗微生物多肽制劑?？刮⑸锒嚯闹苿┠軌?a)直接加入飼料(或者直接用于植物性蛋白的處理過程中)，或者(b)用于一種或多種中間組合物如隨后加入到飼料中的飼料添加劑或綜合微量添加劑(premix)的生產(chǎn)中(或者用于處理過程中)。上面所描述的純度的程度是指最初抗微生物多肽制劑的純度，而不管是否按照上面(a)或(b)使用。使用重組生產(chǎn)方法尤其可以獲得該數(shù)量級純度的抗微生物多肽制劑，然而當(dāng)抗微生物多肽是通過傳統(tǒng)發(fā)酵方法生產(chǎn)時(shí)，該數(shù)量級純度的抗孩t生物多肽制劑不易得到并且還存在批次間差異。當(dāng)然此種抗微生物多肽制劑可以與其它酶混合。如文中所使用，術(shù)語植物蛋白是指包含至少一種衍生于或來源于植物的蛋白質(zhì)(包括修飾蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)衍生物)的任何化合物、組合物、制劑或混合物。在特定實(shí)施方案中，植物蛋白的蛋白質(zhì)含量為至少10%、20%、30%、40%、50。/?；?0。/o(w/w)。植物蛋白可以從植物性蛋白質(zhì)來源如豆類和谷類得到，例如來自豆科(F"6flce"e(Z^ww/"osae))、十字花科(0""y^iYiceae)、蓁科(C%ewo/w(ftVicie)和禾本科(i^flceae)植物的材料，如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。在特定實(shí)施方案中，植物性蛋白質(zhì)來源是來自一種或多種豆科植物如大豆、羽扇豆、豌豆或扁豆的材料。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，植物性蛋白質(zhì)來源是來自一種或多種藜科植物如甜菜、糖甜菜、菠菜或昆諾阿藜的材料。植物性蛋白質(zhì)來源的其它例子是油菜籽和甘藍(lán)。大豆是優(yōu)選的植物性蛋白質(zhì)來源。植物性蛋白質(zhì)來源的其它例子是谷類例如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉蜀黍(玉米)、水稻和高梁。料，或者與其它旨在添加到動(dòng)物飼料中的其它成分相混合，即以動(dòng)物飼料添加劑(例如所謂的動(dòng)物飼料綜合微量添加劑)的形式。在本發(fā)明的另一方面涉及用于動(dòng)物飼料的組合物，例如動(dòng)物飼料和動(dòng)物祠料添加劑如綜^^微量添加劑。除了包含本發(fā)明抗微生物多肽之外，本發(fā)明動(dòng)物飼料添加劑還包含至少一種脂溶性維生素和/或至少一種水溶性維生素和/或至少一種微量礦物質(zhì)(tracemineral)和/或至少一種巨量礦物質(zhì)(macromineral)。此外，任選地，飼料添加成分是著色劑、芳香化合物、穩(wěn)定劑和/或至少一種選自肌醇六磷酸酶EC3.1.3.8或3.1.3.26;木聚糖酶EC3.2.1.8;半乳聚糖酶EC3.2.1.89和/或j8-葡聚糖酶EC3.2.1.4的其它酶。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，這些其它酶是充分限定的(如上對抗微生物多肽制劑所限定)。其它抗微生物肽(AMP)的例子是CAP18、LeucocinA、Tritrpticin、Protegrin-l、Thanatin、Defensin、Ovispirin如Novispirin(RobertLehrer，2000)或者保留抗微生物活性的其變體或片段。其它抗真菌多肽(AFP)的例子是巨大曲霉(厶/iei^7/附g^mfews)和黑曲霉肽，以及保留抗真菌活性的其變體或片段，如在WO94/01459和PCT/DK02/00289一旦公布則替換成WO編號中所描述。通常脂溶性和水溶性微生素以及微量礦物質(zhì)形成了旨在添加到飼料中的所謂綜合微量添加劑的部分，而巨量礦物質(zhì)通常分開加入到飼料中。當(dāng)組合物中富含本發(fā)明抗微生物多肽時(shí)，任一種類型的這些組合物是本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑。在特定實(shí)施方案中，在動(dòng)物飾料或飼料中旨在包含(或規(guī)定必須包含)0.01-10.0%、更加具體而言0.05-5.0%或者0.2-1.0%(%意思是每100g飼料中添加劑的克數(shù))水平的本發(fā)明動(dòng)物飼料添加劑。特別是對于綜合孩先量添加劑情況如此。以下是這些組分的非排外性實(shí)例清單脂溶性維生素的例子是維生素A、維生素D3、維生素E和維生素K如維生素K3。水溶性維生素的例子是維生素B12、生物素和膽喊、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸和泛酸如D-泛酸鈞。微量礦物質(zhì)的例子是錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。巨量礦物質(zhì)是鉀、磷和鈉。這些組分的營養(yǎng)需求(以家禽和小豬/豬為例)列于WO01/58275的表A中。營養(yǎng)需求意思是指這些組分將以所指定濃度提供于斜料中。在另一方面，本發(fā)明動(dòng)物飼料添加劑包含至少一種在WO01/58275表A中所指定的個(gè)別組分。至少一種意思是指l種、或2種、或3種、或4種等等直到全部13種、或者直到全部15種個(gè)別組分中的任一種、一種或多種。更加明確地說，本發(fā)明添加劑中所包含的該至少一種個(gè)別組分的量能夠提供在表A第4列、或第5列、或第6列所指定范圍內(nèi)的飼料內(nèi)濃度。本發(fā)明還涉及動(dòng)物飼料組合物。動(dòng)物飼料組合物或飾料具有相對高含量的蛋白質(zhì)。如在WO01/58275中表B第2-3列所指出，對家禽和豬的飼料進(jìn)行特征描述。如在表B第4列所指出，對魚類飾料進(jìn)行特征描述。此外，此類魚類飾料通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。根據(jù)本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物具有50-800g/kg的粗蛋白質(zhì)含量，并且此外還包含至少一種如文中所要求權(quán)利保護(hù)的抗微生物多肽。此外，或者作為(對于上面所指出的粗蛋白質(zhì)含量的)選擇，本發(fā)明動(dòng)物祠料組合物具有10-30MJ/kg的可代謝能量含量；和/或0.1-200g/kg的鈣含量；和/或0.1-200g/kg的可利用的磷含量；和/或0.1-100g/kg的蛋氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的蛋氨^&a半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸含量。在特定實(shí)施方案中，可代謝能量、粗蛋白質(zhì)、鈣、磷、蛋氨酸、蛋氨酸加半胱氨酸和/或賴氨酸的含量處于WO01/58275表B中第2、3、4或5列(R.2-5)的任意一個(gè)的范圍內(nèi)。粗蛋白質(zhì)計(jì)算為氮(N)乘以系數(shù)6.25,即粗蛋白質(zhì)(g/kg)-N(g/kg)x6.25。通過Kjeldahl方法確定氮含量(A.O.A.C.，1984，OfficialMethodsofAnalysis第14版，AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)?；贜RC出版物豬的營養(yǎng)需求(Nutrientrequirementsinswine)(第9次修訂版，1988，國家研究委員會，農(nóng)業(yè)委員會，動(dòng)物營M員會，豬營養(yǎng)小組委員會，NationalAcademyPress,Washington,D.C.，第2國6頁)和歐洲家禽飼料能量值表(theEuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs)(Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension,7361DABeekbergen，荷蘭GrafischbedrijfPonsen&looijenbv，Wageningen.ISBN90-71463-12-5)計(jì)算可代謝能量。對完全動(dòng)物飾料中鈣、可利用磷和氨基酸的飾料內(nèi)含量的計(jì)算基于飼料表例如Veevoedertabel1997，gegevensoverchemischesamenstelling，verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen，、CentralVeevoederbureau,Runderweg6，8219pkLelystad.ISBN卯-72839-13國7。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明動(dòng)物飼料組合物包含至少一種如上所定義的植物性蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來源。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明動(dòng)物飼料組合物包含0-80%玉蜀黍；和/或0-80%高梁；和/或0-70%小麥；和/或0-70%大麥；和/或0-30%燕麥；和/或0-40°/。大豆粉；和/或0-10°/。魚粉；和/或0-20%乳清。動(dòng)物辨料能夠加工成例如搗^fN料(非顆粒)或顆粒飼料，一般地，磨碎的飼料是混合的，并且根據(jù)對所述物種的規(guī)范添加足夠量的必需維生素和礦物質(zhì)。酶可以作為固體或液體酶制劑加入。例如固體酶制劑一般在混合步驟之前或混合步驟過程中加入；而液體酶制劑一般在粒化步驟之后加入。酶還可以摻入到飼料添加劑或綜合微量添加劑中。飾料中最終酶濃度在0.01-200mg酶蛋白質(zhì)/kg伴料的范圍內(nèi)，例如在5-30mg酶蛋白質(zhì)/kg動(dòng)物辨料的范圍內(nèi)?？刮⑸锒嚯目梢砸韵铝辛?劑量范圍)的一種或多種施用0.01-200;或0.01-100;或0.05-100;或0.05-50;或0.10-10—全部這些范圍為每千克飼料中的抗微生物多肽蛋白質(zhì)毫克數(shù)(ppm)。為了確定每千克飼料中抗微生物多肽蛋白質(zhì)的毫克數(shù)，從飼料組合物純化抗微生物多肽，并且使用相關(guān)測定法(見下面抗孩t生物活性、底物和測定法)確定所純化抗孩i:生物多肽的特異活性。照此^_用相同測定法還可確定飼料組合物的抗微生物活性，并且基于這兩次測定可計(jì)算出每千克飼料中抗微生物多肽蛋白質(zhì)毫克數(shù)的劑量。也可使用相同原理確定飼料添加劑中的抗微生物多肽蛋白質(zhì)的毫克數(shù)。當(dāng)然，如果用于制備飼料添加劑或飼料的抗微生物多肽樣品是可以得到的，則可以從該樣品中測定特異活性(不需要從飼料組合物或添加劑純化抗微生物多肽)。清潔劑組合物本發(fā)明的抗微生物多肽可添加至洗滌劑組合物中并且因此成為它們的一種組分，'柔軟劑組合物)，或者配制成用于一般家居;i^表面清潔操作的洗滌劑組合物，或者配制成用于手工用或機(jī)器用洗碟操作的洗滌劑組合物。在一個(gè)特定方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明抗微生物多肽和表面活性劑的洗滌劑添加劑。洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包含一種或多種其它酶，如另一種蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如漆酶)和/或過氧化物酶(例如卣素過氧化物酶).通常，所選則酶的特征應(yīng)當(dāng)與所選擇洗滌劑相容(例如最佳pH、與其它酶或非酶成份的相容性等等)，并且酶應(yīng)當(dāng)以有效量存在。蛋白酶適宜蛋白酶包括那些動(dòng)物來源、植物來源或微生物來源的蛋白酶。優(yōu)選微生物來源的蛋白酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體包括在內(nèi)。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例是枯草蛋白酶，尤其是源自芽孢桿菌屬的那些枯草蛋白酶，如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實(shí)例M蛋白酶(如豬或牛來源)和在WO89/06270和WO94/25583中描述的鐮孢霉屬蛋白酶。有用蛋白酶的實(shí)例是在WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中描述的變體，尤其在如下位置存在一個(gè)或多個(gè)替代的變體第27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274位。脂肪酶適宜脂肪酶包括那些細(xì)菌來源或真菌來源的脂肪酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體包括在內(nèi)。有用脂肪酶的實(shí)例包括來自腐質(zhì)霉屬(同義詞嗜熱真菌屬)如在EP258068和EP305216中描述的柔毛腐質(zhì)霉或者在WO96/13580中描述的孤獨(dú)腐質(zhì)霉的脂肪酶；假單胞菌脂肪酶如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)或類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272)、洋蔥假單胞菌(P,c印acia)(EP331376)、施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB1，372，034)、焚光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌種SD705菌林(Pseudomonassp.strainSD705)(WO95/06720和WO96/27002)、P.wisconsinensis(WO96/12012)的脂肪酶；芽孢桿菌脂肪酶如來自枯草芽胞桿菌(Dartois等，(1993)，BiochemicaetBi叩hysicaActa,1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64〃44992)或短小芽孢桿菌(WO91/16422)的脂肪酶。另一些實(shí)例是如在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中描述的那些脂肪酶變體。淀粉酶適宜淀粉酶(a和/或/S)包括那些細(xì)菌來源或真菌來源的淀粉酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體包括在內(nèi)。淀粉酶包括例如自芽孢桿菌如更加詳細(xì)描述于GB1,296,839中的地衣芽孢桿菌特定抹獲得的a誦淀粉酶。有用淀粉酶的實(shí)例是在WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的變體，尤其在如下位置存在一個(gè)或多個(gè)替代的變體第15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、湧、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444位，纖維素酶適宜纖維素酶包括那些細(xì)菌來源或真菌來源的纖維素酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體包括在內(nèi)。適宜纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢霉屬、梭孢殼屬、頂孢霉屬的纖維素酶，例如公開于US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757和WO89/09259中的由孤獨(dú)腐質(zhì)霉、Myceliphthorathermophila和尖鐮孢產(chǎn)生的真菌纖維素酶，尤其適合的纖維素酶是助于護(hù)色的堿性或中性纖維素酶.此類纖維素酶的實(shí)例是在EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纖維素酶。另一些實(shí)例是在WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些纖維素酶變體.過氧化物酶/氧化酶適宜過氧化物酶/氧化酶包括那些植物、細(xì)菌或真菌來源的過氧化物酶/氧化酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體包括在內(nèi)。有用過氧化物酶的實(shí)例包括來自鬼傘屬(Cc;pnVi"s)如灰蓋鬼傘(C:.d"emw)的過氧化物酶以及在WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中描述的它們的變體。通過添加包含一種或多種酶的單獨(dú)添加劑或通過添加包含所有這些酶的組合添加劑，使洗滌劑組合物中包含洗滌劑酶。本發(fā)明的洗滌劑添加劑(即單獨(dú)添加劑或組合添加劑)可配制成顆粒、液體、漿夜等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑制劑是顆粒(尤其為非塵狀顆粒)、液體(尤其是穩(wěn)定液體)或漿液。非塵狀的顆粒可例如按照US4，106，991和4,661,452中所公開那樣產(chǎn)生并且可任選地通過本領(lǐng)域已知的方法包衣。蠟質(zhì)包衣材料的實(shí)例是平均分子量為1000-20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG);具有16-50個(gè)環(huán)氧乙烷單元的乙H^化壬基酚；在醇中包含12-20個(gè)碳原子并且存在15-18個(gè)環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸以及脂肪酸的單甘油酯、二甘油酯和三甘油酯。適用于通過流化床技術(shù)形成膜的包衣材料的實(shí)例在GB143591中給出。液體酶制劑可以根據(jù)已建立方法通過加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸進(jìn)行穩(wěn)定處理。經(jīng)保護(hù)的酶可根據(jù)在EP238,216中公開的方法制備。本發(fā)明的洗滌劑組合物可為任何方便形式，如棒狀、片狀、粉末、顆粒狀、糊狀或液體。液體洗滌劑可以是含水液體，一般>^有高達(dá)70%的水和0-30%的有機(jī)溶劑，或者是非水液體。洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑，所W面活性劑可以是包括半極性在內(nèi)的非離子表面活性劑和/或陰離子表面活性劑和/或陽離子表面活性劑和/或兩性離子表面活性劑。表面活性劑水平一般為重量的0.1%-60%。當(dāng)在洗滌組合物中包含陰離子表面活性劑時(shí)，所述洗滌劑一般包含大約1%至大約4%的陰離子表面活性劑，例如直鏈烷基^酸鈉、a烯烴磺酸酯、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)、醇乙氧基琉酸鹽、仲烷基磺酸鹽、a硫代脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂。當(dāng)在洗滌組合物中包含非離子表面活性劑時(shí)，所述洗滌劑一般包含大約0.2%至大約40%的非離子表面活性劑，例如醇乙fl^化物、壬基苯酚乙lL^化物、烷基多葡糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙ll^化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酰胺或葡糖胺的N-阮基N-烷基衍生物("葡糖酰胺(glucamides)")。洗滌劑可以包含0-65%的助洗劑或絡(luò)合劑，如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基或鏈烯基琥珀酸、可溶性珪酸鹽或?qū)訝罟杷猁}(例如來自Hoechst的SKS誦6)。洗滌劑可以包含一種或多種聚合物。聚合物的實(shí)例是羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡啶N-氧化物、聚乙烯咪唑、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、馬來^/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可以包含含有過氧化氫源如過硼酸鹽或過碳酸鹽的漂白系統(tǒng)，其中所述過氧化氫源可與形成過酸的漂白激活物如四乙?；叶坊蛉甚Ａu苯磺酸鹽混合。備選地，漂白系統(tǒng)可包含例如酰胺型、二酰亞胺型或砜型的過氧酸。本發(fā)明洗滌劑組合物中的酶(類)可使用常規(guī)穩(wěn)定劑進(jìn)行穩(wěn)定，穩(wěn)定劑如多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物如芳香硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲酰苯基硼酸，并且組合物可以按照如WO92/19709和WO92/19708中所述配制。洗滌劑還可以包含其它常規(guī)洗滌劑成份例如織物調(diào)節(jié)劑，包括粘土、泡沫促進(jìn)劑、抑泡劑、防腐劑、污垢懸浮劑、防塵污再沾著劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑、水溶助長劑、晦暗抑制劑或香料。目前考慮按照相當(dāng)于每升洗滌液體0.01-100毫克酶蛋白、優(yōu)選每升洗滌液體0.05-10毫克酶蛋白、更加優(yōu)選每升洗滌液體0.1-5毫克酶蛋白并且最優(yōu)選每升洗滌液體0.1-1毫克酶蛋白的量向洗滌劑組合物中加入任意酶和本發(fā)明的抗微生物多肽。本發(fā)明的抗微生物多肽可以額外加入到WO97/07202中所公開的洗滌劑配方中，該專利文中引用作為參考。通過以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例將不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例用作緩沖液和底物的化學(xué)試劑是至少試劑級的商業(yè)化產(chǎn)品。實(shí)施例l:合成的抗微生物肽的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和評價(jià)為了研究和設(shè)計(jì)具有有效抗微生物活性的新的AMP，構(gòu)建了一系列假定的AMP。選擇3個(gè)相鄰精氨酸置于6個(gè)連續(xù)的四氣基酸重復(fù)之前?；谄淠は嗷プ饔媚芰驮谔烊坏腜R富含肽中的豐度，選擇苯丙氨酸作為系列最初的疏水殘基(ZrZu)。這導(dǎo)致形成12種不同的衍生物，將衍生物指定為SEQIDNO:l至SEQIDNO:12(見表1)。從12條特異寡核苷酸(引物1至引物12)合成了編碼SEQIDNO:l至SEQIDNO:12的12個(gè)基因，每一個(gè)編碼一條肽。通過互補(bǔ)引物(引物鏈DNA。iVoIDNA限制性酶切位點(diǎn)(加下劃線)位于引物近端部分而A&fll限制性酶切位點(diǎn)(加下劃線)位于引物遠(yuǎn)端部分一這些位點(diǎn)用于克隆入相應(yīng)表達(dá)栽體pBAD/glIIA(Invitrogen，美國)。引物l-SEQIDNO:l正向(SEQIDNO:320):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCGCCACGTTTTCCACCTCGTTTTCCACCTCGTTTCCCTCCACGTTTCCCTCCACGCTTCCCACCTCGTTTCTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物2-SEQIDNO:2正向(SEQIDNO:321):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCACGTTTTCCACCTCGTTTTCCACCTCGTTTCCCTCCACGTTTCCCTCCACGCTTCCCACCTCGTTTCCCGTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物3-SEQIDNO:3正向(SEQIDNO:322):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCGTTTTCCACCTCGTTTTCCACCTCGTTTCCCTCCACGTTTCCCTCCACGCTTCCCACCTCGTTTCCCGCCATAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物4誦SEQIDNO:4正向(SEQIDNO:323):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTTTTCCACCTCGTTTTCCACCTCGTTTCCCTCCACGTTTCCCTCCACGCTTCCCACCTCGTTTCCCGCCACGTTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物5-SEQIDNO:5正向(SEQIDNO:324):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCACGTCCTTTTCCGCGCCCTTTTCCACGTCCATTCCCTCGTCCTTTCCCACGCCCTTTTCCACGCCCATTCTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物6-SEQIDNO:6正向(SEQIDNO:325):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCGTCCTTTTCCGCGCCCTTTTCCACGTCCATTCCCTCGTCCTTTCCCACGCCCTTTTCCACGCCCATTCCCATAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物7-SEQIDNO:7正向(SEQIDNO:326):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCTTTTCCGCGCCCTTTTCCACGTCCATTCCCTCGTCCTTTCCCACGCCCTTTTCCACGCCCATTCCCACGTTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物8國SEQIDNO:8正向(SEQIDNO:327):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTTTTCCGCGCCCTTTTCCACGTCCATTCCCTCGTCCTTTCCCACGCCCTTTTCCACGCCCATTCCCACGTCCTTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物9國SEQIDNO:9正向(SEQIDNO:328):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCACCATTTCGTCCACCTTTCCGTCCTCCATTTCGCCCGCCGTTTCGGCCACCGTTTCGACCTCCTTTCCGTTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物10-SEQIDNO:IO正向(SEQIDNO:329):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCATTTCGTCCACCTTTCCGTCCTCCATTTCGCCCGCCGTTTCGGCCACCGTTTCGACCTCCTTTCCGTCCATAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物ll-SEQIDNO:ll正向(SEQIDNO:330):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTTTTCGTCCACCTTTCCGTCCTCCATTTCGCCCGCCGTTTCGGCCACCGTTTCGACCTCCTTTCCGTCCACCATAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物12-SEQIDNO:12正向(SEQIDNO:331):CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCGTCCACCTTTCCGTCCTCCATTTCGCCCGCCGTTTCGGCCACCGTTTCGACCTCCTTTCCGTCCACCATTTTAATTGCTCTAGAACAAAAACTC引物13-反向(SEQIDNO:332):GAGTTTTTGTTCTAGAGCAATTA如國際專利申請WO00/73433的實(shí)施例1中所公開，在自殺表達(dá)系統(tǒng)(SES)中測試了AMP的抗生素活性。該系統(tǒng)應(yīng)用敏感宿主(這里為;U^桿菌)和具有可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的質(zhì)粒(pBAD/glIIA)。如果肽具有抗菌活性，肽合成的誘導(dǎo)將導(dǎo)致生產(chǎn)細(xì)胞的生長抑制和/或細(xì)胞死亡一因此為自殺表達(dá)系統(tǒng)。通常，抗微生物活性越強(qiáng)，所觀察到的抑制作用越強(qiáng)。將12個(gè)雙鏈PCR片段進(jìn)行純化，用和iVcoI進(jìn)行限制性酶切并將其克隆入pBAD/glIIA，將它們轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TOP10(Invitrogen)，并在含有100jig/ml氨千青霉素的LB瓊脂平板上重新劃線接種.SEQIDNO:l至SEQIDNO:12的各個(gè)克隆在37'C下生長于100微孔板(Honeycomb板)的150jil腿+0.2%葡萄糖+100ng/ml氨千青霉素中，培養(yǎng)基在BioscreenC(Thermosystems，芬蘭)中振蕩。將過夜培養(yǎng)物在100孔honeycomb板中的150jilRM+0.2o/o甘油+100將/ml氨千青霉素(不含有或含有0.1%的誘導(dǎo)物(阿拉伯糖))中稀釋50倍。通過在37'C測量BioscreenC中的OD450，每30分鐘監(jiān)測一次細(xì)胞密度。生長抑制作用的百分比計(jì)算為每個(gè)樣品的終點(diǎn)OD測量值除以從包含對照載體的細(xì)胞中獲得的終點(diǎn)OD測量值并乘以100。方程式如下生長抑制(％)=卜-^樣品OD-空白00)x100工>T";L對照栽體OD—空白ODJ其中"空白OD，，對應(yīng)于只有生長培養(yǎng)基的OD值。合成AMP的JL&酸序列和相應(yīng)生長抑制作用示于表1。表lSEQIDNO狄軿列生長抑制(％)對照TMELEICSWYHMGIRSFLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH01RRRPPRFPPRFPPRFPPRFPPRFPPRF48RRRPRFPPRFPPRFPPRFPPRFPPRFP453RRRRFPPRFPPRFPPRFPPRFPPRFPP434RRRFPPRFPPRFPPRFPPRFPPRFPPR465RRRPRPFPRPFPRPFPRPFPRPFPRPF576RRRRPFPRPFPRPFPRPFPRPFPRPFP577RRRPFPRPFPRPFPRPFPRPFPRPFPR398RRRFPRPFPRPFPRPFPRPFPRPFPRP389RRRPPFRPPFRPPFRPPFRPPFRPPFR6710RRRPFRPPFRPPFRPPFRPPFRPPFRP7811RRRFRPPFRPPFRPPFRPPFRPPFRPP7312RRRRPPFRPPFRPPFRPPFRPPFRPPF76如所預(yù)期，當(dāng)缺乏誘導(dǎo)物時(shí)沒有觀察到抑制作用或者抑制作用非常小(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)存在0.1%的誘導(dǎo)物時(shí)，全部合成AMP導(dǎo)致生長抑制。實(shí)施例2:合成AMP在酵母中的表達(dá)將指定為SEQIDNO:l、SEQIDNO:5和SEQIDNO:IO的AMP克隆入酵母表達(dá)栽體pHH3885.簡言之，pHH3885是基于pYES(Invitrogen)的酵母/大腸桿菌穿梭載體。該質(zhì)粒包含2p酵母復(fù)制起點(diǎn)和用于在酵母中篩選的Ura3基因。為了在;U^桿菌中繁殖使用了pUC起始和W"基因。表達(dá)由Gal啟動(dòng)子控制，并且使用釀酒酵母a-前導(dǎo)序列介導(dǎo)肽分泌。由于有效AMP的表達(dá)將殺死生產(chǎn)微生物，所以抗微生物活性必須,皮掩蓋。這可以使用能夠掩蓋對抗微生物活性至關(guān)重要的鄰近電荷的一段陰離子M酸實(shí)現(xiàn)。因此，所有3個(gè)AMP前面是一段天冬氨酸和谷氨酸(DDDDE)。由于一些蛋白酶特異地在谷氨酸殘基(E)之后切割，所以陰離子延伸段(stretch)能夠從AMP釋放出來以允許監(jiān)測AMP的抗微生物活性。在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中使用特異性正向引物和通用反向引物可以擴(kuò)增指定為SEQIDNO:l、SEQIDNO:5和SEQIDNO:IO的PR富含AMP.由于正向寡核苷酸含有全部編碼信息所以不需要模板。引物14-SEQIDNO:l正向(SEQIDNO:333):GTATCGATGGCCAAGAGAGAAGCCGACGATGACGATGAACGTCGCCGTCCGCCACGTTTTCCACCTCGTTTTCCACCTCGTTTCCCTCCACGTTTCCCTCCACGCTTCCCACCTCGTTTCTAGATGGCTCTAGAGGGCCG引物15-SEQIDNO:5正向(SEQIDNO:334):GTATCGATGGCCAAGAGAGAAGCCGACGATGACGATGAACGTCGCCGTCCACGTCCTTTTCCGCGCCCTTTTCCACGTCCATTCCCTCGTCCTTTCCCACGCCCTTTTCCACGCCCATTCTAGATGGCTCTAGAGGGCCG引物16-SEQIDNO:10正向(SEQIDNO:335):GTATCGATGGCCAAGAGAGAAGCCGACGATGACGATGAACGTCGCCGTCCATTTCGTCCACCTTTCCGTCCTCCATTTCGCCCGCCGTTTCGGCCACCGTTTCGACCTCCTTTCCGTCCATAGATGGCTCTAGAGGGCCG引物17-反向(SEQIDNO:336):CGGCCCTCTAGAGCCATCTA別小兩種酶限制性酶切的pHH3885。將相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌并測序。證實(shí)序列之后，將穿梭載體電轉(zhuǎn)化入釀酒酵母(JG169)并鋪在SC+2。/o葡萄糖+100嗎/ml氨節(jié)青霉素瓊脂平板上。將酵母菌落重新劃線接種并在30。C下生長于5ml液體SC基礎(chǔ)培養(yǎng)基(添加2%葡萄糖)中3天。通過以3500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘沉淀細(xì)胞。取500fil轉(zhuǎn)移至microconYM-3離心過濾器(MilliporeCorp.，美國)并通過離心將體積減少至大約20jil。將濃縮的樣品與Tricine加樣緩沖液混合并在16%Tricine凝膠(Novex，Invitrogen，美國)中分析。在三份培養(yǎng)物的每一份中都觀察到清楚的具有預(yù)期分子量的條帶，表明表達(dá)了三種肽。在包含對照質(zhì)粒的酵母細(xì)胞的上清液中沒有觀察到條帶。實(shí)例例3:SEQIDNO:l、SEQIDNO:5和SEQIDNO:IO變體的評價(jià)SEQIDNO:l、SEQIDNO:5和SEQIDNO:IO在突變高通量篩選中用作起始點(diǎn)以便獲得具有提高活性的AMP。為了簡單起見，SEQIDNO:l、SEQIDNO:5和SEQIDNO:104^P含有作為疏水殘基的苯丙氨酸。僅應(yīng)用一種類型疏^J^酸可能對抗微生物活性不是最適的；通過天然肽也說明了這一點(diǎn)，在天然肽中4^P含有疏水殘基的混合。設(shè)計(jì)了簡并DNA寡聚體，其編碼4種疏:^基酸的每一種而不是限制于苯丙氨酸。原則上，由于SEQIDNO:l、SEQIDNO:5和SEQIDNO:10的每一個(gè)包含6個(gè)苯丙氨酸殘基，在理論上該庫能夠編碼46或4096種不同的變體。如上使用一條編碼完整肽的長的正向引物(SEQIDNO:l簡并引物，SEQIDNO:5簡并引物和SEQIDNO:10簡并引物)和一條較小的用于合成反向鏈的反向引物(引物13)構(gòu)建了該庫。N代表25。A可能性的4種核苷酸(G、A、T和C)之一，以允許在指定位置摻入4種疏水氨基酸。SEQIDNO:l簡并引物(SEQIDNO:337)CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCGCCACGTNTTCCACCTCGTNTTCCACCTCGTNTCCCTCCACGTNTCCCTCCACGCNTCCCACCTCGTNTCTAATTGCTCTAGAACAAAAACTCSEQIDNO:5簡并引物(SEQIDNO:338)CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCACGTCCTNTTCCGCGCCCTNTTCCACGTCCANTCCCTCGTCCTNTCCCACGCCCTNTTCCACGCCCANTCTAATTGCTCTAGAACAAAAACTCSEQIDNO:IO簡并引物(SEQIDNO:339)CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCANTTCGTCCACCTNTCCGTCCTCCANTTCGCCCGCCGNTTCGGCCACCGNTTCGACCTCCTNTCCGTCCATAATTGCTCTAGAACAAAAACTC將DNA片段克隆入SES載體pBAD/glIIA并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌以產(chǎn)生三個(gè)獨(dú)立的庫，每個(gè)庫大約一百萬個(gè)菌落。將該庫涂在平板上并使用菌^lLlMm每個(gè)庫中湘沐大約10,000個(gè)單獨(dú)菌落放入包含20x稀釋RM+200ng/ml氨節(jié)青霉素的96孔微:jl4l中。將這些主板(masterplate)復(fù)制接種于一套新的96(包含20x稀釋RM培養(yǎng)基和0.1%或0%誘導(dǎo)物)中，并且于371C培養(yǎng)過夜。從每個(gè)庫中分離^泮多最大生長抑制的克隆，將其測序并在BioscreenC中重新測試其生長抑制作用。SEQIDNO:l變體的M酸序列和相應(yīng)生長抑制作用示于表2;SEQIDNO:5變體的M酸序列和相應(yīng)生長抑制作用示于表3;并且SEQIDNO:10變體的M酸序列和相應(yīng)生長抑制作用示于表4。表2.SEQIDNO:l的變體和相應(yīng)生長抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>表4.SEQIDNO:IO的變體和相應(yīng)生長抑制作用SEQIDNO絲斷列生長抑制(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>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<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table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實(shí)施例4:來自混合基序庫的合成的PR富含AMP的評價(jià)在實(shí)施例3中測試的AMP由簡并性的但在其它方面相同的重復(fù)組成。為了測試當(dāng)將12種不同的"4^J-酸序列基序"混合成為一個(gè)序列時(shí)是否會產(chǎn)生有效AMP，構(gòu)建了一個(gè)新的庫。在該系列中親本主鏈由以下序列基序組成PPRX、PRPX、PXRP、PPRX、PRPX和PXRP;其中X表示疏7jC氨基酸纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸或亮氨酸的任意一個(gè)。再次使用等比率的疏水氨基酸。如上面實(shí)施例3，使用一條長的編碼完整肽的正向引物(混合基序簡并引物)和較小的用于合成反向鏈的反向引物(引物13)構(gòu)建了該庫。N代表25。/?？赡苄缘?種核苷酸(G、A、T和C)之一。混合基序簡并引物(SEQIDNO:340)CCATAGCACCATGGCGCGTCGCCGTCCGCCACGTNTTCCACGTCCTNTTCCANTTCGTCCACCGCCACGTNTTCCACGTCCTNTTCCANTTCGTCCATAATTGCTCTAGAACAAAAACTC將PCR合成的DNA片段克隆入SES載體pBAD/glIIA并轉(zhuǎn)化1大腸桿菌，產(chǎn)生了每個(gè)庫包含大約一百萬個(gè)菌落的庫。將該庫涂在平板上并使用菌^l沐儀杏沐大約10,000個(gè)單獨(dú)菌落iix包含20x稀釋RM+200pg/ml氨千青霉素的96孔微《USL中。將這些主板復(fù)制接種于一套新的96孑L板(包含20x稀釋RM培養(yǎng)基和0.1%或0%誘導(dǎo)物)中，并且于37匸培養(yǎng)過夜。分離許多最大生長抑制的克隆，將其測序并在BioscreenC中重新測試其生長抑制作用。來自混合基序庫的變體的M酸序列和相應(yīng)生長抑制作用示于表5。表5.具有混合基序的合成的PR富含AMP<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>實(shí)施例5:所選擇肽的MIC、MBC和MEC的測定為了^^在實(shí)施例1-4中所鑒定和描述肽的抗微生物潛能，測定了3種結(jié)構(gòu)不同肽對一定范圍微生物的最低抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)和最低效應(yīng)濃度(MEC)。選擇以下3種肽進(jìn)行化學(xué)合成并測定其抗微生物潛能PR曙1(RRR-PRPV-PRPF曙PRPV-PRPL-PRPF-PRPF)(SEQIDNO:61)PR曙2(RRR-PFRP-PFRP-PFRP-PVRP-PVRP-PFRP)(SEQIDNO:79)PR-3(RRR-PPRL國PRPF-PVRP-PPRF-PRPF-PLRP)(SEQIDNO:239)測試微生物包括:^桿菌(ATCC10536)、肉葡萄球菌cflm仍附)、模仿葡萄球菌s/挑"/fl"s)、藤黃微球菌(M/"te"s(ATCC9341))、枯草芽孢桿菌(ATCC6633)和釀酒酵母(ATCC9763)。按照稍加修改NCCLS方案進(jìn)行MIC和MBC測定，其中所作的修改為將肽溶于0.01%醋酸和0.1%BSA中以避免在高濃度時(shí)肽沉淀并且使肽與塑料容器的結(jié)合最小化。按照Steinberg和Lehrer(MethodsinMolecularBiology,第78巻AntibacterialPeptideProtocols)的方法在瓊脂糖彌散抗菌實(shí)驗(yàn)(radialdiffusionassay)裝置中測定MEC。MEC方案避免了與用NCCLS方案測試抗微生物lbf目關(guān)的一些問題并且能夠提供非常靈敏的測試裝置。結(jié)果示于表6-8。表6.MIC測定(全部數(shù)值為pg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>表7.MBC測定(全部數(shù)值為ng/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>菌球菌菌桿菌PR-11286464>12864>128PR-2>128>128>1286464>128PR-31286432>12864>128表8.MEC測定(全部數(shù)值jig/ml)肽大腸桿菌肉葡萄球菌模仿葡萄球菌藤黃微球菌枯草芽孢桿菌酉良酒酵母PR-13.01.70.80.42.432PR國23.02.01.10.53.632PR畫33.01.80.90.82.0>1284艮明顯，三種PR富含肽在限定條件下對革蘭氏陽性微生物和革蘭氏陰性微生物具有廣鐠活性。實(shí)施例6:PR-1、PR-2和PR-3的溶血活性分析了抗微生物肽溶解人紅細(xì)胞(hRBC)的能力。紅細(xì),驗(yàn)測定法提供了評價(jià)測試材料的膜溶解活性的簡單測試系統(tǒng)。它適宜作為溶血特性的篩選測定。血紅蛋白釋放是一種有用的細(xì)胞膜完整性終點(diǎn)。通過測量540nm處的吸光度測定釋放的血紅蛋白。通常，計(jì)算出導(dǎo)致總?cè)芙鈽悠?0%溶血的濃度(HL50);然而由于測試肽的低溶血活性，所以在本實(shí)施例中未計(jì)算該值。在本測試裝置中使用了8%的RBC懸浮液(12日齡)。在表9中顯示了相對100%溶解樣品的各個(gè)溶血作用值。表9.溶血作用值肽濃度Oig/ml)溶血作用(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>由于肽溶解于0.01%醋酸中，所以還包括了0.01%醋酸的媒介物對照。在兩個(gè)板中都包括了含有25%、10%、5%的0.01%醋酸的PBS。在任一測試濃度都沒有觀察到與背景不同的溶血反應(yīng)。為了證實(shí)劑量/反應(yīng)效應(yīng)的存在，還測試了SDS的溶血活性。表IO.SDS劑量/反應(yīng)值<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>三種測試肽變體PR-1、PR-2和PR-3在測定濃度下沒有顯示出與背景水平顯著不同的溶血特性。在本測定中自發(fā);^jfc作用水平高，可能是由于紅細(xì)胞年齡(12天)的原因。相對高水平的自發(fā)溶血作用不會影響產(chǎn)生這樣的結(jié)論，即三種肽在測試濃度是非溶血性的。序列表〈110〉諾和酶股份有限公司(NovozymesA/S)〈120〉合成的抗微生物多肽〈130〉10275.204-WO〈160〉340〈170〉Patentln版本3.2〈210〉1〈211〉27<212>PRT〈213〉人工的〈220〉〈223>合成的抗微生物多肽〈400〉1ArgArgArgProProArgPheProProArgPheProProArgPhePro151015ProArgPheProProArgPheProProArgPhe2025〈210>2〈211>27〈212〉PRT〈213>人工的〈220><223>合成的抗微生物多肽<400>2ArgArgArgProArgPheProProArgPheProProArgPheProPro151015ArgPheProProArgPheProProArg■PhePro2025<210>3〈211〉27<212>PRT<213>人工的<220>〈223〉合成的抗微生物多肽<400>3ArgArgArgArgPheProProArgPheProProArgPheProProArg151015PheProProArgPheProProArgPheProPro2025〈210〉〈211〉〈212>〈213>〈220〉〈223〉〈400〉427PRT人工的合成的抗微生物多肽4ArgArgArgPheProProArgPheProProArgPheProProArgPhe151015ProProArgPheProProArgPheProProArg2025<210>〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉〈400>527PRT人工的合成的抗微生物多肽5ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProPhePro151015ArgProPheProArgProPheProArgProPhe2025〈210〉<211>〈212〉〈213>〈220〉<223>〈400〉627PRT人工的合成的抗微生物多肽6ArgArgArgArgProPheProArgProPheProArgProPheProArg151015ProPheProArgProPheProArgProPhePro2025<210>〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉〈400〉727PRT人工的合成的抗微生物多肽7ArgArgArgProPheProArgProPheProArgProPheProArgPro151015PheProArgProPheProArgProPheProArg2025〈210〉<211〉〈212><213>〈220〉〈223〉〈400>827PRT人工的合成的抗微生物多肽8ArgArgArgPheProArgProPheProArgProPheProArgProPhe151015ProArgProPheProArgProPheProArgPro2025<210>〈211>〈212><213>927PRT人工的〈220〉〈223〉合成的抗微生物多肽〈400〉9ArgArgArgProProPheArgProProPheArgProProPheArgPro151015ProPheArgProProPheArgProProPheArg2025〈210><211>〈212><213>〈220>〈223>〈400>1027PRT人工的合成的抗微生物多肽10ArgArgArgProPheArgProProPheArgProProPheArgProPro151015PheArgProProPheArgProProPheArgPro2025<210>〈211>〈212>〈213><220>〈223>〈400〉1127PRT人工的合成的抗微生物多肽11ArgArgArgPheArgProProPheArgProProPheArgProProPhe151015ArgProProPheArgProProPheArgProPro2025<210><211〉<212>〈213><220〉〈223><400>1227PRT人工的合成的抗微生物多肽12ArgArgArgArgProProPheArgProProPheArgProProPheArg151015ProProPheArgProProPheArgProProPhe2025〈210>13<211>27<212>PRT〈213〉人工的〈220〉〈223〉合成的抗微生物多肽〈400〉13ArgArgArgProProArgPheProProArgPheProProArgPhePro151015ProArgPheProProArgPheProProArgPhe2025<210>〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉〈400>1427PRT人工的合成的抗微生物多肽14ArgArgArgProProArgPheProProArglieProProArgPhePro151015ProArgLeuProProArglieProProArgLeu2025〈210〉〈211><212><213>〈220〉〈223〉〈400〉1527PRT人工的合成的抗微生物多肽15ArgArgArgProProArgPheProProArglieProProArgLeuPro151015ProArgValProProArgValProProArgLeu2025<210>16〈211>27<212>PRT〈213〉人工的〈220〉〈223>合成的抗微生物多肽<400〉16ArgArgArgProProArglieProProArgPheProProArgValPro151015ProArgPheProProArgValProProArgVal2025〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉<400>1727PRT人工的合成的抗微生物多肽17ArgArgArgProProArglieProProArgLeuProProArgliePro151015ProArgPheProProArgPheProProArgLeu2025<210〉〈211〉〈212>〈213〉〈220><223><400>1827PRT人工的合成的抗微生物多肽18ArgArgArgProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro151015ProArglieProProArgPheProProArglie2025〈210〉〈211〉<212>〈213>〈220〉〈223>〈400〉1927PRT人工的合成的抗微生物多肽19ArgArgArgProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro151015ProArglieProProArgPheProProArglie2025〈210〉〈211〉〈212>〈213〉〈220>〈223〉<400>2027PRT人工的合成的抗微生物多肽20ArgArgArgProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro151015ProArgValProProArgPheProProArgVal2025〈210><211><212><213><220><223><400>2127PRT人工的合成的抗微生物多肽21ArgArgArgProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro151015ProArgValProProArgPheProProArgVal2025<210>〈211〉<212>〈213><220>〈223〉<400>2227PRT人工的合成的抗微生物多肽22ArgArgArgProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro151015ProArgValProProArgLeuProProArgPhe2025〈211〉27〈212〉PRT〈213〉人工的〈220〉〈223〉合成的抗微生物多肽〈400〉23ArgArgArgProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro151015ProArgValProProArgValProProArgPhe2025〈210〉〈211>〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉<400>2427PRT人工的合成的抗微生物多肽24ArgArgArgProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro151015ProArgValProProArgValProProArgPhe2025〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉〈400〉2527PRT人工的合成的抗微生物多肽25ArgArgArg1ProProArgLeuProProArgPheProProArgPhePro51015ProArgValProProArgValProProArglie2025<210>26<211>27<212>PRT<213〉人工的<220〉〈223〉合成的抗微生物多肽〈400>26ArgArgArgProProArgValProProArgPheProProArgValPro151015ProArgPheProProArgValProLeuArgLeu2025<210〉〈211〉<212〉<213><220〉〈223〉<400〉2741PRT人工的合成的抗微生物多肽27ArgArgArgProProArgLeuProProArgLeuProProArgLeuPro151015ProArgValProProArgValProLeuValSerAsnCysSerArgThr2025LysThrHisLeuArgArgGlySerGlu354030〈210〉〈211><212><213><220><223><400>2827PRT人工的合成的抗微生物多肽28ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProPhePro151015ArgProPheProArgProPheProArgProPhe2025〈210>29〈211〉26〈212〉PRT<213〉人工的〈220〉〈223〉合成的抗微生物多肽<400>29ArgArgArgProArgLeuProArgProPheProArgProValProArg151015ProLeuProArgProValProArgProlie2025〈210〉〈211〉〈212〉<213〉〈220〉<223>〈400〉3027PRT人工的合成的抗微生物多肽30ArgArgArgProArgProPheProProProPheProArgProliePro151015ArgProPheProArgProPheProArgProLeu2025<210><211>〈212〉〈213〉〈220><223〉<400>3127PRT人工的合成的抗微生物多肽31ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProHisProPhePro151015ArgProPheProArgProlieProArgProlie2025<210>32<2U>27〈212>PRT〈213〉人工的〈220><223〉合成的抗微生物多肽〈400〉32ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProHisProliePro151015ArgProLeuProArgProPheProArgProlie2025<210>〈211>〈212〉<213><220>〈223〉<400〉3327PRT人工的合成的抗微生物多肽33ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProPhePro151015ArgProPheProArgProPheProArgProPhe2025〈210〉<211〉<212〉<213〉<220>〈223〉<400>3427PRT人工的合成的抗微生物多肽34ArgArgArgProArgProPheProArgProPheProArgProPhePro151015ArgProPhePr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肽236ArgArgArgProProArgLeuProArgProPheProLeuArgProPro151015ProArgValProArgProValProPheArgPro2025〈210〉<211〉〈212〉〈213〉〈220〉<223〉<400>23727PRT人工的合成的抗微生物多肽237ArgArgArgProProArgLeuProArgProPheProLeuArgProPro151015ProArgValProArgProValProValArgPro2025〈210〉238<211>27<212>PRT〈213〉人工的〈220><223〉合成的抗微生物多肽<400>238ArgArgArgProProArgLeuProArgProPheProValArgProPro151015ProArgPheProArgProPheProlieArgPro2025〈210><211>〈212〉<213>〈220>〈223〉<400〉23927PRT人工的合成的抗微生物多肽239ArgArgArgProProArgLeuProArgProPheProValArgProPro151015ProArgPheProArgProPheProLeuArgPro2025〈210〉<211〉<212>〈213〉〈220〉〈223〉〈400〉24027PRT人工的合成的抗微生物多肽240ArgArgArgProProArgLeuProArgProPheProValArgProPro151015ProArgPheProArgProValProPheArgPro2025<210〉241<211>27<212>PRT<213>人工的〈220>〈223〉合成的抗微生物多肽<400>241ArgArgArgProProArgLeuProArgProPheProValArgProPro151015ProArglieProArgProlieProPheArgPro2025〈210〉242〈211>27〈212〉PRT〈213〉人工的〈220〉〈223〉合成的抗微生物多肽〈400〉242ArgArgArgProProArgLeuProArgProPheProValArgProPro151015ProArgLeuProArgProValProPheArgPro2025〈210〉<211〉〈212〉<213〉〈220〉〈223>〈400〉24327PRT人工的合成的抗微生物多肽243ArgArgArgProProArgLeuProArgProPheProValArgProPro151015ProArgLeuProArgProValProPheArgPro2025<210><211><212><213><220><223>〈400〉24427PRT人工的合成的抗微生物多肽244ArgArgArgProProArgLeuProArgProPheProValArgProPro151015ProArgLeuProArgProValProPheArgPro2025〈210〉〈211><212>〈213〉〈220〉〈223〉〈400>24527PRT人工的合成的抗微生物多肽245ArgArgArgProProArgLeuProArgProPheProValArgProPro151015ProArgValProArgProPheProValArgPro2025〈210〉〈211〉〈212〉〈213>〈220><223>〈400〉24627PRT人工的合成的抗微生物多肽246ArgArgArgProProArgLeuProArgProPheProValArgProPro151015ProArgValProArgProPheProValArgPro2025〈210〉<211><212>〈213>〈220><223〉〈400〉24727PRT人工的合成的抗微生物多肽247ArgArgArgProProArgLeuProArgProPheProValArgProPro151015ProArgValProArgProLeuProPheArgPro2025〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉<223〉〈400〉24827PRT人工的合成的抗微生物多肽248ArgArgArgProProArgLeuProArgProPheProValArgProPro151015ProArgValProArgProValProlieArgPro2025〈210〉<211〉<212><213>〈220〉<223>〈400〉24927PRT人工的合成的抗微生物多肽249ArgArgArgProProArgLeuProArgProPheProValArgProPro151015ProArgValProArgProValProlieArgPro2025<210><211〉〈212>〈213>〈220><223><德25027PRT人工的合成的抗微生物多肽250ArgArgArgProProArgLeuProArgProlieProPheArgProPro151015ProArglieProArgProlieProValArgPro2025〈210〉〈211〉〈212>〈213〉〈220〉〈223><400〉25127PRT人工的合成的抗微生物多肽251ArgArgArgProProArgLeuProArgProlieProPheArgProPro151015ProArglieProArgProLeuProPheArgPro2025〈210〉<211>〈212〉〈213〉<220>〈223〉〈400〉25227PRT人工的合成的抗微生物多肽252ArgArgArgProProArgLeuProArgProlieProPheArgProPro151015ProArglieProArgProValProValArgPro2025<210〉<211>〈212〉〈213>25327PRT人工的<220>〈223〉合成的抗微生物多肽<400>253ArgArgArgProProArgLeuProArgProlieProPheArgProPro151015ProArgLeuProArgProlieProlieArgPro2025<210>254<211>27<212〉PRT〈213〉人工的〈220〉〈223>合成的抗微生物多肽〈400〉254ArgArgArgProProArgLeuProArgProlieProPheArgProPro151015ProArgValProArgProPheProlieArgPro2025〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉〈400〉25527PRT人工的合成的抗微生物多肽255ArgArgArgProProArgLeuProArgProlieProlieArgProPro151015ProArgPheProArgProValProPheArgPro2025<210>〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉〈400〉25627PRT人工的合成的抗微生物多肽256ArgArgArgProProArgLeuProArgProlieProLeuArgProPro151015ProArgValProArgProlieProlieArgPro2025〈210〉257<211>27<212>PRT<213>人工的<220〉〈223〉合成的抗微生物多肽<400〉257ArgArgArgProProArgLeuProArgProlieProValArgProPro151015ProArgPheProArgProlieProPheArgPro2025<210>〈211〉〈212〉<213〉〈220〉〈223〉〈400〉25827PRT人工的合成的抗微生物多肽258ArgArgArgProProArgLeuProArgProlieProValArgProPro151015ProArgPhePro'ArgProlieProPheArgPro2025<210>〈211〉〈212><213><220〉<223><400>25927PRT人工的合成的抗微生物多肽259ArgArgArgProProArgLeuProArgProlieProValArgProPro151015ProArgPheProArgProlieProValArgPro2025<210><211><212><213〉<220><223〉<400>26027PRT人工的合成的抗微生物多肽260ArgArgArgProProArgLeuProArgProlieProValArgProPro151015ProArglieProArgProlieProValArgPro2025<210>〈211〉〈212><213>〈220>〈223>〈400>26127PRT人工的合成的抗微生物多肽261ArgArgArgProProArgLeuProArgProlieProValArgProPro151015ProArglieProArgProValProPheArgPro2025〈210〉〈211><212>〈213〉〈220><223〉〈400>26227PRT人工的合成的抗微生物多肽262ArgArgArgProProArgLeuProArgProlieProValArgProPro151015ProArgLeuProArgProValProLeuArgPro2025〈210〉<211>〈212〉〈213>〈220〉<223>〈400〉26327PRT人工的合成的抗微生物多肽263ArgArgArgProProArgLeuProArgProlieProV3IArgProPro151015ProArgValProArgProlieProLeuArgPro2025<210〉〈211〉<212>〈213〉<220〉〈223〉〈400〉26427PRT人工的合成的抗微生物多肽264ArgArgArgProProArgLeuProArgProLeuProPheArgProPro151015ProArgPheProArgProVaJProValArgPro2025<210>〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉<400〉26527PRT人工的合成的抗微生物多肽265ArgArgArgProProArgLeuProArgProLeuProPheArgProPro151015ProArgLeuProArgProPheProValArgPro2025〈210〉<211〉<212>〈213>〈220〉<223>〈400〉26627PRT人工的合成的抗微生物多肽266ArgArgArgProProArgLeuProArgProLeuProPheArgProPro151015ProArgLeuProArgProValProValArgPro2025<210>267〈211>27〈212〉PRT〈213>人工的〈220〉〈223>合成的抗微生物多肽<400>267ArgArgArgProProArgLeuProArgProLeuProPheArgProPro151015ProArgValProArgProPheProlieArgPro2025〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉<220>〈223〉〈400〉26827PRT人工的合成的抗微生物多肽268ArgArgArgProProArgLeuProArgProLeuProPheArgProPro151015ProArgValProArgProValProLeuArgPro2025<210><211><212><213>〈220〉〈223〉<400>26927PRT人工的合成的抗微生物多肽269ArgArgArgProProArgLeuProArgProLeuProPheArgProPro151015ProArgValProArgProValProVal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roArgProVaJProLeuArgProPro151015ProArgValProArgProLeuProlieArgPro2025〈210〉<211>〈212〉〈213〉<220><223><400>30427PRT人工的合成的抗微生物多肽304ArgArgArgProProArgLeuProArgProValProValArgProPro151015ProArgPheProArgProValProlieArgPro2025〈210><211><212〉<213>〈220〉<223><400>30527PRT人工的合成的抗微生物多肽305ArgArgArgProProArgLeuProArgProValProValArgProPro151015ProArgPheProArgProValProValArgPro2025〈210〉<211>〈212>〈213>〈220>〈223〉〈400〉30627PRT人工的合成的抗微生物多肽306ArgArgArgProProArgLeuProArgProValProValArgProPro151015ProArgPheProArgProValProValArgPro2025〈210〉〈211><212>〈213〉〈220〉<223〉〈400〉30727PRT人工的合成的抗微生物多肽307ArgArgArgProProArgLeuProArgProValProValArgProPro151015ProArgValProArgProValProPheArgPro2025<210>〈211><212〉〈213〉〈220><223><400〉30827PRT人工的合成的抗微生物多肽308ArgArgArgProProArgLeuProArgProValProValArgProPro151015ProArgValProArgProValProValArgPro2025<210〉<211〉<212〉〈213〉〈220〉〈223〉〈400〉30927PRT人工的合成的抗微生物多肽309ArgArgArgProProArgValProArgProPheProlieArgProPro151015ProArgValProArgProlieProPheArgPro2025〈210〉〈211><212><213>〈220〉〈223〉〈400>31027PRT人工的合成的抗微生物多肽310ArgArgArgProProArgValProArgProPheProlieArgProPro151015ProArgValProArgProValProValArgPro2025<210><211>〈212〉〈213>〈220>〈223>〈400>31127PRT人工的合成的抗微生物多月太311ArgArgArgPro1ProArgValProArgProPheProValArgProPro51015ProArgPheProArgProValProPheArgPro2025<210>312〈211>27<212〉PRT<213>人工的<220〉<223>合成的抗微生物多肽〈400>312ArgArgArgProProArgValProArgProlieProlieArgProPro151015ProArgValProArgProValProPheArgPro2025〈210〉<211>〈212〉〈213〉〈220><223>〈400〉31327PRT人工的合成的抗微生物多肽313ArgArgArgProProArgValProArgProlieProlieArgProPro151015ProArgValProArgProValProValArgPro2025〈210〉<211〉〈212〉〈213〉<220><223>〈400〉31427PRT人工的合成的抗微生物多肽314ArgArgArgProProArgValProArgProLeuProPheArgProPro151015ProArgPheProArgProlieProPheArgPro2025<210>〈211>〈212〉〈213〉31527PRT人工的〈220〉〈223〉合成的抗微生物多肽<400>315ArgArgArgProProArgValProArgProValProValArgProPro151015ProArglieProArgProPheProValArgPro2025〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉<400>31628PRT人工的合成的抗微生物多肽316ArgArgArgThrArgHisValPheAlaArgProPheProPheArgPro151015ProProArglieProArgProPheProLeuArgPro2025〈210〉〈211〉<212><213>〈220><223>〈400〉31728PRT人工的合成的抗微生物多肽317ArgArgArgThrArgHisValPheAlaArgProValProValArgPro151015ProProArgValProArgProPheProValArgPro2025〈210〉<211>〈212〉<213>〈220〉〈223〉<400>31828PRT人工的合成的抗微生物多肽318ArgArgArgThrArgHisValValProArgProLeuProValArgPro151015ProProArgValProArgProPheProLeuArgPro2025<210>〈211〉〈212〉〈213〉〈220〉〈223〉<400>31941PRT人工的合成的抗微生物多肽319ArgArgArgProProArgValProArgProPheProValArgProPro151015ProArgValProArgProlieProPheValHisAsnCysSerArgThr202530LysThrHisLeuArgArgGlySerGlu3540〈210〉〈211〉〈212>〈213〉〈220〉<223〉320120墜人工的引物l<400>320ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccgccacgttttccacctcgttttccacctcgttt60ccctccacgtttccctccacgcttcccacctcgtttctaattgctctagaacaaaaactc120〈210〉321〈211>120〈212>DNA〈213>人工的<220〉〈223>引物2〈400〉321ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccacgttttccacctcgttttccacctcgtttccc60tccacgtttccctccacgcttcccacctcgtttcccgtaattgctctagaacaaaaactc120〈210>322〈211〉120〈212〉廳〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物3〈400〉322ccatagcaccatggcgcgtcgccgtcgttttccacctcgttttccacctcgtttccctcc60acgtttccctccacgcttxccacctcgtttcccgccataattgctctagaacaaaaactc120〈210〉323〈211〉120〈212〉■〈213>人工的〈220〉〈223〉引物4〈400〉323ccatagcaccatggcgcgtcgccgttttccacctcgttttccacctcgtttccctccacg60tttccctccacgcttcccacctcgtttcccgccacgttaattgctctagaacaaaaactc120<210>324<211>120〈212〉腿<213>人工的〈220〉<223〉引物5〈400〉324ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccacgtccttttccgcgcccttttccacgtccatt60ccctcgtcctttcccacgcccttttccacgcccattctaattgctctagaacaaaaactc120〈210〉325<211>120<212〉DNA<213>人工的〈220〉<223>引物6<400>325ccatagcaccatggcgcgtcgccgtcgtccttttccgcgcccttttccacgtccattccc60tcgtcctttcccacgcccttttccacgcccattcccataattgctctagaacaaaaactc120<210>326<211>120〈212〉腿<213〉人工的<220><223>引物7〈400>326ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccttttccgcgcccttttccacgtccattccctcg60tcctttcccacgcccttttccacgcccattcccacgttaattgctctagaacaaaaactc120<210>327〈211>120〈212>飄〈213>人工的〈220>〈223〉引物8〈400〉327ccatagcaccatggcgcgtcgccgttttccgcgcccttttccacgtccattccctcgtcc60tttcccacgcccttttccacgcccattcccacgtccttaa"ttgctctagaacaaaaactc120〈210〉328〈211〉120〈212〉DNA〈213〉人工的〈220〉〈223>引物9〈400〉328ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccaccatttcgtccacctttccgtcctccatttcg60cccgccgtttcggccaccgtttcgacctcctttccgttaattgctctagaacaaaaactc120<210>329〈211〉120<212〉薩〈213〉人工的<220><223>引物IO〈400>329ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccatttcgtccacctttccgtcctccatttcgccc60gccgtttcggccaccgtttcgacctcctttccgtccataattgctctagaacaaaaactc120〈210>330<211>120〈212>DNA<213>人工的<220><223>引物ll<400>330ccatagcaccatggcgcgtcgccgttttcgtccacctttccgtcctccatttcgcccgcc60gtttcggccaccgtttcgacctcctttccgtccaccataattgctctagaacaaaaactc120<210〉331<211〉120〈212〉DNA〈213〉人工的〈220〉<223>引物12<400>331ccatagcaccatggcgcgtcgccgtcgtccacctttccgtcctccatttcgcccgccgtt60tcggccaccgtttcgacctcctttccgtccaccattttaattgctctagaacaaaaactc120<210>332<211>23〈212>DNA<213>人工的〈220>〈223>引物13〈400〉332gagtttttgttctagagcaatta23〈210>333〈211〉140<212>DNA〈213>人工的<220>〈223〉引物14〈400〉333gtatcgatggccaagagagaagccgacgatgacgatgaacgtcgccgtccgccacgUtt60ccacctcgttttccacctcgtttccctccacgtttccctccacgcttcccacctcgtttc120tagatggctctagagggccg140〈210>334〈211〉140〈212〉DNA〈213〉人工的<220>〈223〉引物15<400>334gtatcgatggccaagagagaagccgacgatgacgatgaacgtcgccgtccacgtcctttt60ccgcgcccttttccacgtccattccctcgtcctttcccacgcccttttccacgcccattc120tagatggctctagagggccg140〈210>335〈211〉140〈212〉DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物16〈400〉335gtatcgatggccaagagagaagccgacgatgacgatgaacgtcgccgtccatttcgtcca60cctttccgtcctccatttcgcccgccgtttcggccaccgtttcgacctcctttccgtcca120t卿tggctctagagggccg140<210>336<211>20〈212〉DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物17〈400〉336cggccctctagagccatcta20<210>337〈211>120<212>DNA〈213>人工的<220>〈223>SEQIDN0:1—簡并引物<220><221〉misc—feature<222>(35)..(35)〈223〉n為a，c,g或t〈220〉〈221>misc—feature<222>(47)..(47)〈223〉n為a，c,g或t〈220>〈221〉misc—feature<222>(59)..(59)〈223〉n為a,c，g或t<220〉<221>misc一feature<222〉(71)..(71)<223>n為a，c,g或t<220〉<221〉misc—feature〈222〉(83)..(83)<223〉n為a,c，g或t<220><221>misc一feature<222>(95)..(95)<223>n為a，c,g或t<400>337ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccgccacgtnttccacctcgtnttccacctcgtnt60ccctccacgtntccctccacgcntcccacctcgtntctaattgctctagaacaaaaactc120<210>338<211〉120<212>DNA<213>人工的〈220>〈223〉SEQIDN0:5-簡并引物〈220〉〈221〉misc一feature〈222〉(35)..(35)〈223〉n為a，c,g或t〈220〉〈221〉misc—feature〈222〉(47)..(47)〈223〉n為a，c,g或t<220><221〉misc—feature〈222〉(59)..(59)〈223〉n為a,c，g或t〈220〉〈221〉misc一feature<222>(71)..(71)〈223〉n為a,c，g或t<220><221>misc一feature<222〉卿..(83)〈223〉n為a，c，g或t<220<221〉misc—feature〈222>(95)7.(95)<223〉n為a'c，g或t<400>338ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccacgtcctnttccgcgccctnttccacgtccant60ccctcgtcctntcccacgccctnttccacgcccantctaaUgctctagaacaaaaactc120<210>339<211>120<212>DNA<213>人工的<220〉<223〉SEQIDNO:IO-簡并引物〈220〉<221>misc—feature<222>(29)..(29)<223>n為a，c,g或t<220〉<221〉misc—feature<222〉(41)..(41)<223〉n為a,c，g或t〈220〉<221〉raise—feature<222>(53):.(53)<223〉n為a,c,g或t<220〉<221>misc—feature<222>(65)..(65)<223>n為a,c,g或t<220><221>misc一feature<222>(77)..(77)<223〉n為a'c，g或t<220><221>misc—feature<222>(89)..(89)<223>n為a,c，g或t〈400>339ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccanttcgtccacctntccgtcctccanttcgccc60gccgnttcggccaccgnttcgacctcctntccgtccataaUgctctagaacaaaaactc120〈210〉340〈211〉120〈212〉腿〈213〉人工的〈220〉〈223〉混合基序-簡并引物<220><221〉〈222〉<223>misc(35):n為a,feature二(35)c，g或t<220><221><222>〈223〉misc(47):n為a，feature-.(47)c，g或t〈220〉<221>〈222><223>misc(53):n為a'feature(53)c,g或t<220><221>〈222>〈223〉miscm):n為a,feature(71)c,g或t〈220〉<221>〈222〉<223>misc卿:n為a,feature匿.(83)c,g或t<220〉<221>〈222〉〈223〉misc(89):n為a，feature一.(89)c,g或t<400>340ccatagcaccatggcgcgtcgccgtccgccacgtnttccacgtcctnttccarvttcgtcc60accgccacgtnttccacgtcctnttccanttcgtccataattgctctagaacaaaaactc120權(quán)利要求1.具有抗微生物活性的多肽，其包含氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5；其中X1、X2、X3、X4和X5中的每一個(gè)選自氨基酸序列P-P-R-F、P-R-F-P、R-F-P-P、F-P-P-R、P-R-P-F、R-P-F-P、P-F-P-R、F-P-R-P、P-P-F-R、P-F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P-P-R-L、P-R-L-P、R-L-P-P、L-P-P-R、P-R-P-L、R-P-L-P、P-L-P-R、L-P-R-P、P-P-L-R、P-L-R-P、L-R-P-P、R-P-P-L、P-P-R-V、P-R-V-P、R-V-P-P、V-P-P-R、P-R-P-V、R-P-V-P、P-V-P-R、V-P-R-P、P-P-V-R、P-V-R-P、V-R-P-P、R-P-P-V、P-P-R-I、P-R-I-P、R-I-P-P、I-P-P-R、P-R-P-I、R-P-I-P、P-I-P-R、I-P-R-P、P-P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I；并且其中X1-X5中最多4個(gè)是相同的。2.權(quán)利要求l的多舦，其中XpX2、X3、X4和Xs選自^J^酸序列P-P-R-ZpP-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Z5、R-P-Z6-P、P-Zy-P-R、Z8-P-R-P、P-P-Z9-R、P-Z10-R-P、Zu-R-P-P和R-P-P-Z12;其中除了ZrZ12氨基酸以外X廣Xs是相同的；并且其中ZrZu選自氨基酸F、L、V和I。3.權(quán)利要求1的多肽，其包含M酸序列:XrX2-X3-XrXs-X6;其中&、X2、X3、X4、Xs和X6中的每一個(gè)選自絲酸序列:P-P-R-F、P-R-F-P、R-F-P-P、F-P-P國R、P-R曙P-F、R-P畫F-P、P-F-P誦R、F-P國R畫P、P誦P誦F國R、P畫F-R-P、F-R-P-P、R-P-P-F、P陽P-R-L、P-R-L醫(yī)P、R-L-P-P、L畫P-P畫R、P國R-P畫L、R畫P畫L-P、P-L國P畫R、L國P-R-P、P-P-L-R、P誦L醫(yī)R-P、L國R-P誦P、R-P-P-L、P-P-R畫V、P-R-V腸P、R-V-P-P、V-P漏P-R、P-R誦P-V、R-P-V-P、P誦V-P誦R、V國P誦R-P、P陽P-V-R、P誦V-R畫P、V誦R-P-P、R誦P誦P-V、P-P-R-I、P-R-I-P、R-I-P-P、I誦P-P-R、P國R-P-I、R-P-I-P、P陽I畫P-R、I誦P-R-P、P-P-I-R、P-I-R-P、I-R-P-P和R-P-P-I;并且其中X^Xfi中最多4個(gè)是相同的。4.權(quán)利要求3的多肽，其中Xi、X2、X3、X4、Xs和X6選自M紗列P-P-R-ZpP-R-Z2-P、R-Z3-P-P、Z4-P-P-R、P-R-P-Z5、R-P-Z6-P、P-Z7-P-R、Zs-P誦R曙P、P-P-Z9-R、P誦Zk)-R-P、Zu-R誦P-P和R-P-P-Z12;其中除了Z廣Zu^J^酸以外X廣X6是相同的；并且其中Z廣Zu選自^酸F、L、V和I'5.權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的多肽，其中XrXs中最多3個(gè)是相同的。6.權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的多肽，其中XrX5中最多2個(gè)是相同的。7.權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的多肽，其中XrX2-X3-X4-X5或XrX;rX3-X4-X5-X6之前立即為3-10個(gè)氨基酸的M酸序列，其中在所述氨基^列當(dāng)中至少2個(gè)氨基酸在中性pH時(shí)帶正電荷。8.權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的多肽，其由氨基酸序列X廣XrX3-X4-Xs或XrX2-X3-X4-X5-X6組成。9.一種多核苷酸，其具有編碼權(quán)利要求l-8中任意一項(xiàng)所定義多肽的核苷酸序列，10.包含權(quán)利要求9中所定義核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列與指導(dǎo)多肽在適宜宿主中產(chǎn)生的一種或多種控制序列有效連接。11.一種重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求10中所定義的核酸構(gòu)建體。12.—種重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求10中所定義的核酸構(gòu)建體。13.生產(chǎn)如權(quán)利要求l-8中任意一項(xiàng)所定義多肽的方法，該方法包括(a)在有利于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求12所定義的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收多肽。14.一種組合物，其包含如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所定義的抗微生物多肽。15.權(quán)利要求14的組合物，其還包含另外的殺生物劑。16.殺死微生物細(xì)胞或抑制孩i生物細(xì)胞生長的方法，其包括將孩1生物細(xì)胞與如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所定義的抗微生物多肽接觸。17.—種洗滌劑組合物，其包含表面活性劑和如權(quán)利要求l-8中任意一項(xiàng)所定義的抗微生物多肽。18.用作藥物的如權(quán)利要求l-8中任意一項(xiàng)所定義的抗微生物多肽。19.用作抗微生物的獸用或人用治療劑或預(yù)防劑的如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所定義的抗微生物多肽。20.如權(quán)利要求l-8中任意一項(xiàng)所定義的抗微生物多肽的用途,其用于制備用于微生物感染治療或用于預(yù)防用途的獸用或人用治療劑。21.如權(quán)利要求l-8中任意一項(xiàng)所定義的抗微生物多肽的用途，其用于殺死微生物細(xì)胞或抑制微生物細(xì)胞生長。22.轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其已經(jīng)用核苷酸序列轉(zhuǎn)化，其中所述核苷酸序列編碼如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所定義的具有抗微生物活性的多肽。23.至少一種如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所定義抗微生物多肽在動(dòng)物飼料中的用途.24.至少一種如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所定義抗微生物多肽在制備用于動(dòng)物祠料的組合物中的用途。25.—種動(dòng)物飼料添加劑，其包含(a)至少一種如權(quán)利要求l-8中任意一項(xiàng)所定義的抗微生物多肽；和(b)至少一種脂溶性維生素，和/或(c)至少一種水i^性維生素，和/或(d)至少一種微量礦物質(zhì)，和/或(e)至少一種巨量礦物質(zhì)。26.權(quán)利要求25的動(dòng)物飼料添加劑，其還包含肌醇六磷酸酶、木l^t酶、半乳聚糖酶和/或)8-葡聚糖酶。27.—種動(dòng)物飼料組合物，其具有50-800g/kg的粗蛋白質(zhì)含量并且包含至少一種如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所定義的抗微生物多肽.全文摘要本發(fā)明涉及具有抗微生物活性的多肽和具有編碼多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體、載體和包含核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞以及生產(chǎn)和使用該多肽的方法。文檔編號A61K38/17GK101113173SQ20071013624公開日2008年1月30日申請日期2004年9月13日優(yōu)先權(quán)日2003年9月12日發(fā)明者H-H·K·赫根豪格申請人:諾和酶股份有限公司