專利名稱：體內灌注誘導骨髓基質干細胞構建組織工程骨的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學工程中用組織工程再造，器官的方法，具體涉及一種體內灌注誘導骨髓基質干細胞構建組織工程骨以修復大節(jié)段骨缺損、股骨頭壞死等大塊骨缺損的治療方法。
背景技術：
目前能夠用于臨床的組織工程產品主要局限于幾種皮膚和軟骨的組織工程產品，品種和數(shù)量都非常有限，行使的功能和結構也相對簡單。而臨床最常見的長骨大段骨缺損是長期困擾臨床醫(yī)療的難點和熱點問題，其修復與重建自然成為骨組織工程研究領域最重要的主攻方向之一。但是大塊組織工程骨的體內成骨過程非常復雜，是一個包括應力刺激下的涉及多種生長分化調節(jié)因子作用的骨種子細胞在支架材料內的遷移、增殖、和分化等一系列復雜有序的過程。而這些功能的行使是以血供重建為前提和保障的，迅速和有效的血供能為大塊組織工程骨內部的種子細胞提供及時和充足的營養(yǎng)，包括各種生長分化調節(jié)因子，同時帶走局部代謝所產生的廢物。一般認為細胞在血管周圍150-200um內才能通過彌散來保持存活，如果不能建立內在的血液循環(huán)，組織工程只能限于構建較薄而小的組織。而目前的血管化技術存在不少的問題，利用宿主體內的血管進行血管化，不僅受到局部血管條件的限制，還因為血管的長入需要一定的時間，且會增加機體額外創(chuàng)傷，從而制約了大塊組織工程組織的構建。因此，組織工程骨的血管化問題就成為骨組織工程由基礎向臨床應用過渡的亟待解決的關鍵性技術難題，引起了廣泛的關注。
生長因子對種子細胞增殖、遷移、分泌、分化活性起著至關重要的作用，而目前常用的細胞生長因子載體緩釋系統(tǒng)存在載體的突釋和持續(xù)穩(wěn)定釋放、降解過程中產生的分解物對細胞產生不利影響以及多因子的協(xié)同釋放機制等問題尚未解決。盡管組織工程研究已深入到基因水平，但由于基因治療普遍存在的有效性和/或安全性等問題而難以走向臨床應用。
總之，大塊組織工程骨血管化以及生長因子持續(xù)穩(wěn)定的釋放等關鍵性技術難題至今未找到理想的解決辦法，使其臨床應用受到了嚴重限制。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種為解決臨床長骨大段骨缺損、股骨頭壞死等長期面臨的困難提供一種新的方法。以來源廣泛的天然濱珊瑚或其生物衍生材料珊瑚羥基磷灰石為支架材料，根據(jù)骨缺損情況進行加工塑形，復合自體骨髓基質干細胞后形成具有高滲透性三維孔隙結構的生物活性復合物，應用臨床使用的泵系統(tǒng)進行組裝，通過少量的灌注營養(yǎng)液，微量生長因子的協(xié)同有序的高效作用，采用自體骨髓基質干細胞復合生物相容性良好的支架材料，具有安全高效，操作簡單，成本低廉的優(yōu)點。
本發(fā)明是這樣來實現(xiàn)的(一)骨髓基質干細胞(BMSC)的提取、分離和培養(yǎng)其方法步驟如下(1)骨髓基質干細胞的提取無菌條件下，于髂后上棘處骨穿針穿刺，預肝素化處理的注射器抽出骨髓約10ml。
(2)骨髓基質干細胞的分離和擴增培養(yǎng)將含有1％肝素抗凝劑的骨髓置于離心管中，加入約為骨髓體積1∶1～2∶1的無血清培養(yǎng)基，在1000r/min離心10min，棄去上清液，用PBS緩沖鹽清洗2～3次，去除上層脂肪和組織液，將下面細胞層(含BMSCs的混合物)用完全培養(yǎng)基再懸，吸入培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。培養(yǎng)約2-3w，80％融合后用質量濃度為0.25％胰蛋白酶和質量濃度為0.02％的EDTA混合液消化，終止消化后進行細胞傳代，繼續(xù)培養(yǎng)擴增至第三代細胞。
(二)珊瑚復合人工骨的制備根據(jù)管狀骨缺損的大小和形狀，將天然濱珊瑚(NC)加工成內徑2mm未貫通的圓桶狀，超聲清洗，高壓蒸汽消毒后備用。用含自體血清的完全培養(yǎng)基將第三代BMSC制成10×106/ml細胞懸液。注射器吸取BMSC懸液滴入NC，確保NC完全浸潤且不滲漏，使成BMSC-NC復合物。置于37℃體積分數(shù)為5％的CO2孵育箱中5小時后，加入含自體血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。BMSC-NC復合物體外培養(yǎng)5天，待BMSC與NC貼附牢固后再回植入骨缺損處。
(三)灌注系統(tǒng)的建立將圓桶狀的BMSC-NC復合物直接嵌入骨缺損處采用適當方式固定。在此基礎上安裝雙泵組成的灌注系統(tǒng)，術后閉合創(chuàng)口。整個系統(tǒng)分別由體內和體外使用的雙泵系統(tǒng)聯(lián)合組成，體內使用的泵系統(tǒng)為皮下植入式給藥裝置(如KL-II型，陜西省科聯(lián)新技術開發(fā)中心)；體外使用的泵系統(tǒng)為便攜式微量注射泵(如AJ5805型，上海安潔電子設備有限公司)。皮下植入式給藥裝置由注射座和硅橡膠導管二部分組成，管的一頭插入呈圓桶狀的未貫通的復合有BNSC的NC中央。插入到NC內的導管的插入部分有多個側孔。管道的另一頭為埋植在左側臀部皮下的注射座。灌注藥物時，由有經驗的醫(yī)護人員執(zhí)行，首先找準穿刺窗口，然后消毒皮面，將針頭通過皮膚垂直刺入注射座，直到針頭與泵體底部接觸，再開始注入藥物。針頭與體外的AJ5805便攜式微量注射泵相連通，該注射泵是一種操作方便、便于攜帶的給藥裝置，由于其推注速度可以調控，如使用10ml一次性注射器的流量范圍在0.1ml/h～20ml/h，故可實現(xiàn)持續(xù)、緩慢低劑量地輸入含自體血清的培養(yǎng)液以及rhBMP-2、rhbFGF等細胞因子。
根據(jù)公式總的灌注量＝復合物中完全浸潤的液體量+管道系統(tǒng)中滯留的液體量。根據(jù)低濃度的rhbFGF能促進BMSC的增殖與活力，并能誘導支架材料周圍組織毛細血管向NC-BMSC復合物內長入，因此，灌注rhbFGF的濃度始終維持在2ng/ml；根據(jù)極低劑量的rhbFGF(1-2ng/ml)與小劑量的rhBMP-2(10-25ng/ml)聯(lián)合應用能夠產生相互協(xié)同的最佳成骨效應，采取每天rhBMP-2(10-25ng/ml)和rhbFGF(1-2ng/ml)聯(lián)合給藥。通過體外便攜式微量注射泵調控灌注速度，實現(xiàn)灌注與復合物周圍組織吸收之間的平衡。
本發(fā)明以來源廣泛的天然濱珊瑚或其生物衍生材料珊瑚羥基磷灰石為支架材料，可根據(jù)骨缺損情況進行加工塑形，復合自體骨髓基質干細胞后形成具有高滲透性三維孔隙結構的生物活性復合物，植入長骨大節(jié)段缺損處，應用便攜式微量泵聯(lián)合皮下植入式給藥裝置將含有自體血清、生長因子rhbFGF、RHBMP-2的細胞培養(yǎng)液持續(xù)微量穩(wěn)定地灌注到復合物中央，及時供應早期營養(yǎng)，并通過rhbFGF誘導周圍組織毛細血管向復合物內長入，促進復合物快速血管化。重要的是通過便攜式微量泵調控灌注速度，可使灌注營養(yǎng)的速度與周圍組織吸收的速度一致，實現(xiàn)灌注系統(tǒng)——復合物——周圍組織之間的微循環(huán)通路，不僅將代謝廢物排除，還能通過生長因子rhbFGF、RHBMP-2發(fā)揮協(xié)同高效的誘導成骨作用，促進成骨的速度和質量，為種子細胞提供理想的代謝微環(huán)境。由于支架材料可生物降解，最終實現(xiàn)骨缺損形態(tài)和功能的重建。本發(fā)明應用臨床使用的泵系統(tǒng)進行組裝，通過少量的灌注營養(yǎng)液，微量生長因子發(fā)揮協(xié)同高效作用。
本發(fā)明的優(yōu)點是
1、可解決兩個關鍵問題。由于灌注的營養(yǎng)液中含有誘導血管生成的細胞因子，不僅可以保證大塊組織工程骨種子細胞的早期營養(yǎng)，而且通過rhbFGF能夠誘導周圍組織血管向NC移植物內長入，實現(xiàn)大塊組織工程骨的快速血管化，促進后期血供的重建；細胞生長因子以一定的濃度持續(xù)/間斷持續(xù)微量緩慢的灌注，因而可實現(xiàn)細胞生長因子在損傷局部持續(xù)/間斷持續(xù)微量穩(wěn)定的緩釋效果。
2、安全高效。由于采用自體血清，可避免異種或異體血清的副作用。細胞生長因子的成分、配方以及釋放量和速度可以人為地調控，故可實現(xiàn)生長因子rhBMP-2、rhbFGF間的協(xié)同誘導成骨的高效應。既可減少細胞生長因子的用量，節(jié)約經費，又可避免單次給藥劑量過大的副作用。
3、通過NC三維相通的孔道，為BMSC提供營養(yǎng)，同時推動局部代謝產生的廢物向外周溢出，被皮下組織吸收。這樣就建立起一個“三維微循環(huán)通路”，為種子細胞提供類似于生理狀態(tài)的理想的代謝微環(huán)境。
4、符合臨床應用的實際需要，操作可行性強。可根據(jù)情況適時更換微量注射泵上使用的一次性注射器及輸液針管，加之皮下植入式給藥系統(tǒng)全部安裝在體內，該裝置的注射座位于皮下，每次進針給藥前僅需簡單的皮膚消毒即可，因而操作方便，能最大限度地保證無菌操作，避免感染；便攜式微量注射泵可以隨身攜帶，便于患者活動；活動所提供的適量應力刺激加上生物體本身復雜微妙的微環(huán)境更有利于成骨。
具體實施例方式
以該方法修復山羊脛骨干大節(jié)段骨缺損為例1、羊BMSC的培養(yǎng)與擴增分別抽取山羊自體骨髓，采用1％戊巴比妥鈉0.3ml/kg靜脈麻醉，速麻安、阿托品肌肉注射復合麻醉。雙側髂骨處備皮后嚴格無菌條件下用16號骨穿針穿刺抽取紅骨髓10ml，將含有1％肝素抗凝劑的骨髓置于離心管中，加入約為骨髓體積1∶1～2∶1的無血清培養(yǎng)基，在1000r/min離心10min，棄去上清液，用PBS清洗2～3次，去除上層脂肪和組織液，將下面細胞層(含BMSCs的混合物)用完全培養(yǎng)基再懸，吸入培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。培養(yǎng)約2-3w，匯合成單層后用質量濃度為0.25％胰蛋白酶和質量濃度為0.02％的EDTA混合液消化，終止消化后進行細胞傳代，繼續(xù)培養(yǎng)擴增至第三代細胞。
2、珊瑚復合人工骨的制備根據(jù)山羊脛骨解剖資料數(shù)據(jù)，將天然濱珊瑚(NC)加工成長25mm，外徑12mm，內徑2mm未貫通的圓桶狀，超聲清洗，高壓蒸汽消毒后備用。用含自體血清的完全培養(yǎng)基將第三代BMSC制成10×106/ml細胞懸液。注射器吸取BMSC懸液滴入NC，確保NC完全浸潤且不滲漏，使成BMSC-NC復合物。置于37℃體積分數(shù)為5％的CO2孵育箱中5小時后，加入含自體血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。BMSC-NC復合物體外培養(yǎng)5天，待BMSC與NC貼附牢固后再回植入骨缺損處。
3、羊脛骨干骨缺損模型的建立健康中國青山羊，12個月齡，體重14.5-15.5kg的成年山羊。左后肢前外側弧形切開皮膚，沿脛前肌與脛骨間隙分開進入。于脛骨外側8孔重建鋼板內固定，除第4、5孔外，骨折遠近段各三枚螺釘固定。環(huán)行剝離并切除脛骨中段骨膜，于鋼板第3、4及5、6孔之間分別以線鋸鋸斷脛骨，移除游離骨段，大段骨缺損動物模型構建完成(骨與骨膜缺損長度2.5cm)。術后肌肉注射普魯卡因青霉素80萬u/d，高蛋白青飼料圈養(yǎng)，術后14d拆線。
4、單純材料組(對照組)將健康中國青山羊脛骨干骨缺損模型9只，分別將NC直接嵌入骨缺損處。
5、灌注系統(tǒng)的建立準備健康中國青山羊9只，建羊脛骨干骨缺損模型，將圓桶狀的未貫通的復合有BNSC的NC直接嵌入骨缺損處，在此基礎上安裝雙泵組成的灌注系統(tǒng)，整個系統(tǒng)分別由體內和體外使用的雙泵系統(tǒng)聯(lián)合組成，體內使用的泵系統(tǒng)為皮下植入式給藥裝置；體外使用的泵系統(tǒng)為便攜式微量注射泵。皮下植入式給藥裝置由注射座和硅橡膠導管二部分組成，管的一頭插入呈圓桶狀的未貫通的復合有BNSC的NC中央。插入到NC內的導管長20mm，管道的插入部分有多個側孔。管道的另一頭為埋植在左側臀部皮下的注射座。灌注藥物時，由有經驗的醫(yī)護人員執(zhí)行，首先找準穿刺窗口，然后消毒皮面，將針頭通過皮膚垂直刺入注射座，直到針頭與泵體底部接觸，再開始注入藥物。針頭與體外的便攜式微量注射泵相連通，該注射泵是一種操作方便、便于攜帶的給藥裝置，由于其推注速度可以調控，如使用10ml一次性注射器的流量范圍在0.1ml/h～20ml/h，故可實現(xiàn)持續(xù)、緩慢低劑量地輸入含自體血清的培養(yǎng)液以及rhBMP-2、rhbFGF等細胞生長因子。
結果1一般情況采用每天rhBMP-2(25ng/ml)t rhbFGF(2ng/ml)聯(lián)合給藥。通過體外便攜式微量注射泵調控灌注速度，實現(xiàn)灌注與復合物周圍組織吸收之間的平衡。動物術后1W完全站立，2W可自由活動。其中有一只山羊因放養(yǎng)不當，針頭滑落一次，經及時消毒，并更換一次性無菌針管和灌注液后繼續(xù)灌注。連續(xù)觀察各實驗動物手術切口周圍組織均無紅腫、滲出等炎性表現(xiàn)。
2灌注情況2.1體外灌注情況在體內灌注給藥前，經體外灌注含或不含有細胞因子的含自體血清的完全培養(yǎng)基，觀察到灌注的液體能均勻滲透整個復合物支架，當灌注量超過2.6ml整個支架被完全浸潤，并逐漸溢出。
2.2體內灌注情況每天每次5ml的灌注液體量持續(xù)20小時給完，持續(xù)微量緩慢灌注的超過2.6ml的部分液體逐漸被皮下組織吸收，因而，未觀察到復合物支架周圍液體潴留而出現(xiàn)的腫脹、滲出等現(xiàn)象，傷口愈合良好。
2.3 X線觀察術后8W x線觀察顯示8只羊近同構模型組織工程骨周圍形成骨痂，并與脛骨缺損部分融合；對照組術后8W所有羊都觀察到支架材料大部分降解、吸收。HE染色進行組織學分析，實驗組大量骨組織形成，對照組織見纖維組織生長分別于術后1d，2W，8W，進一步通過骨缺損植入物OD(光密度)值的測定，觀測實驗組骨形成，實驗組與對照組植入材料OD指數(shù)組間比較，1d時統(tǒng)計結果無顯著性差異(P＞0.05)；2W時統(tǒng)計結果差異具有顯著意義(P＜0.05)；8W時統(tǒng)計結果差異非常顯著(P＜0.01)。
權利要求
1.體內灌注誘導骨髓基質干細胞構建組織工程骨的方法，其特征在于方法步聚如下(一)骨髓基質干細胞的提取、分離和培養(yǎng)(1)骨髓基質干細胞的提取無菌條件下，于髂后上棘處骨穿針穿刺，預肝素化處理的注射器抽出骨髓；(2)骨髓基質干細胞的分離和擴增培養(yǎng)將含有1％肝素抗凝劑的骨髓置于離心管中，加入約為骨髓體積1∶1～2∶1的無血清培養(yǎng)基，在1000r/min離心10min，棄去上清液，清洗2～3次，去除上層脂肪和組織液，將下面細胞層用完全培養(yǎng)基再懸，吸入培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3w，匯合成單層后用質量濃度為0.25％胰蛋白酶和質量濃度為0.02％的EDTA混合液消化，終止消化后進行細胞傳代，繼續(xù)培養(yǎng)擴增至第三代細胞；(二)珊瑚復合人工骨的制備根據(jù)管狀骨缺損的大小和形狀，將天然濱珊瑚加工成內徑2mm未貫通的圓桶狀，超聲清洗，高壓蒸汽消毒后備用，用含自體血清的完全培養(yǎng)基將第三代BMSC制成10×106/ml細胞懸液，注射器吸取BMSC懸液滴入NC，確保NC完全浸潤且不滲漏，使成BMSC-NC復合物，置于37℃體積分數(shù)為5％的CO2孵育箱中5小時后，加入含自體血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，BMSC-NC復合物體外培養(yǎng)5天，待BMSC與NC貼附牢固后再回植入骨缺損處；(三)灌注系統(tǒng)的建立將圓桶狀的BMSC-NC復合物直接嵌入骨缺損處采用適當方式固定，在此基礎上安裝雙泵組成的灌注系統(tǒng)，術后閉合創(chuàng)口，整個系統(tǒng)分別由體內和體外使用的雙泵系統(tǒng)聯(lián)合組成，體內使用的泵系統(tǒng)為皮下植入式給藥裝置；體外使用的泵系統(tǒng)為便攜式微量注射泵，皮下植入式給藥裝置由注射座和硅橡膠導管二部分組成，管的一頭插入呈圓桶狀的未貫通的復合有BNSC的NC中央，插入到NC內的導管的插入部分有多個側孔，管道的另一頭為埋植在左側臀部皮下的注射座，針頭與體外的便攜式微量注射泵相連通，實現(xiàn)持續(xù)、緩慢低劑量地輸入含自體血清的培養(yǎng)液以及rhBMP-2、rhbFGF細胞因子。
全文摘要
一種體內灌注誘導骨髓基質干細胞構建組織工程骨的方法，其特征在于方法步聚如下1.骨髓基質干細胞的提取、分離和培養(yǎng)；2.珊瑚復合人工骨的制備；3.灌注系統(tǒng)的建立。本發(fā)明的優(yōu)點是1.不僅解決大塊組織工程骨快速血管代的難題，還可實現(xiàn)生長因子在損傷局部持續(xù)或間斷持續(xù)微量穩(wěn)定的緩釋；2.具有安全高效、操作簡單、成本低廉的優(yōu)點。
文檔編號A61L27/02GK101091804SQ20071013750
公開日2007年12月26日 申請日期2007年7月18日 優(yōu)先權日2007年7月18日
發(fā)明者戴江華, 羅軍, 戴閩 申請人:戴江華