專利名稱：采用丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白進行的基因免疫的制作方法
采用丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白進行的基因免疫本申請是1999年1月28日提交的申請?zhí)枮?9802481. 3 (PCT/US 99/01823)， 名為"采用丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白進行的基因免疫"的發(fā)明專利申請的分案 申請。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及重組核酸分子和包含例如與基因免疫方案中抗丙型肝炎病毒 的疫苗組分同樣有用的藥物組合物；涉及誘導抗丙型肝炎病毒感染的免疫應(yīng) 答的方法；并涉及治療患有丙型肝炎感染的病人的方法。發(fā)明背景丙型肝炎病毒(HCV)，由輸血獲得的非甲非乙型肝炎的主要病原體，在 美國每年引起了大約150， OOO起的急性病毒性肝炎的新病例。(Choo，等，科 學，1989， 244， 359-362.)在西方國家，有0. 6%至2.0%的流行率，而在世界的 一些不發(fā)達地區(qū)要高達15%。 (Heintges，等，H印athology, 1997, 26, 521-526.)大約一半的此類感染會演變成和肝硬化以及/或肝癌相關(guān)的慢性感 染。(Alter,等，科學，1992， 258， 135-140;和alter,等，新英格蘭醫(yī)學雜 志，1992,327, 1899-1905).此外，抗丙型肝炎病毒抗體的流行顯示，丙型肝炎 病毒的感染是肝細胞癌發(fā)展的 一 種獨立的危險因素(Colombo, 等，Lancet, 1989， ii, 1006-1008; Saito，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1990, 87， 6547-6549; Simonetti，等，An. Int. Med. , 1992， 116， 97-102 ;和 Tsukuma，等，新英格蘭醫(yī)學雜志，1993， 328, 1797-1801).丙型肝炎病毒是一種具有衣殼的正鏈RNA病毒，長度大約為9， 500核苷 酸，最近被分類為黃病毒屬的一個獨立種。(Heinz， Arch. Virol. (Suppl.)， 1992,4， 163-171.)不同的分離物顯示出相當多的核酸序列多樣性，導致將 HCV的基因組進一步分成八個基因型。(Si隱onds，等，J.Gen.Virol.， 1993,74， 2391-2399.)在所有的基因型中，病毒基因組都包含 一 個大的開放閱讀框 (0RF),編碼一條由3010到3033個氨基酸組成的，大約330Kd的多聚蛋白前 體。(Choo，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991， 88， 2451-2455 ; Inchauspe, 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1991， 88， 10292-10296; Kato,等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1990， 87, 9524-9528 ; Okamoto,等，病毒遺傳學雜 志，1991' 72， 2697 — 704;和Takamizawa ，等，J. Gen. Virol. ， 1991， 65， 1105-1113.)通過該多聚蛋白前體的蛋白水解加工產(chǎn)生了核心蛋白(C)，衣殼蛋白(El， E2)和非結(jié)構(gòu)(NS2 — NS5)蛋白，從而產(chǎn)生出各種HCV多肽。(Bartenschlager， 等，病毒遺傳學雜志，1993， 67， 3835 — 3844; Grakoui，等，病毒遺傳學雜 志雜志，1993， 67, 2832 — 2843;及Selby，等，病毒遺傳學雜志，1993， 74， 1103—1113)。這種蛋白水解是聯(lián)合采用細胞蛋白酶和病毒編碼的蛋白酶進 行催化反應(yīng)的。NS3基因編碼一種絲氨酸蛋白酶，此酶能在幾種功能部位切 斷轉(zhuǎn)錄后的病毒多聚蛋白前體，還可以作為蛋白解旋酶起作用。NS5區(qū)域編 碼此病毒的RNA依賴的RNA聚合酶。除了轉(zhuǎn)錄區(qū)域外，HCV基因組還包含一個5'非翻譯區(qū)域(5'UTR)和一個 3'非翻譯區(qū)域(3'UTR)。該324至341的5'非翻譯區(qū)域核酸序列代表了迄今 為止報道過的所有HCV分離物中最保守的核酸序列。(Han，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1991, 88, 1711-1715;禾口 Bukh,等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992， 89,4942-4946).該5'非翻譯區(qū)域被假定包含了 HCV RNA復制和/ 或翻譯的重要調(diào)控元件。該5'非翻譯區(qū)域還包含了數(shù)個小的開放閱讀框 (0RF)，但現(xiàn)今尚未有證據(jù)提示這些開放閱讀框被真實翻譯。在HCV感染期間涉及肝損傷和病毒清除的細胞免疫機制只是部分的被說 明。在嘗試檢測慢性HCV感染病人中肝浸潤淋巴細胞的潛在致病作用時， Koziel等檢驗了細胞毒T淋巴細胞(CTL)對這些細胞的反應(yīng)，并證明HLA I 類限制性的CD8 +細胞毒T淋巴細胞應(yīng)答針對HCV多肽的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)區(qū)域。 (Koziel，等，病毒學雜志 1993， 67， 7522-7532;和Koziel，等，免疫學雜 志，1992， 149, 3339-3344).其他研究者也注意到在外周血單核細胞群體中存 在細胞毒T淋巴細胞，它能識別慢性HCV感染時的病毒核心上的和其它病毒 相關(guān)蛋白上的表位。(Kita,等，Heatol. , 1993， 18， 1039-1044;和Cerny， 等，Intl. Symp. virol Hepatitis Liver Dis. ， 1993， 83 (abstr. ). ) Botarellf 等，(Botarelli,等，Gastroenterol. ， 1993， 104， 580-587)和Ferrari,等,(Ferrari, H印atol. ， 1994, 19， 286-295)發(fā)現(xiàn)了針對慢性HCV感染病人體內(nèi) 得到的HCV的不同區(qū)域的幾種重組蛋白的HLA II類限制性的CD4+T細胞介導的增殖反應(yīng)。在有效HCV感染中，體液和細胞免疫應(yīng)答已顯示是多克隆、多特異性的。 很可能在持續(xù)HCV感染中產(chǎn)生的宿主免疫應(yīng)答，部分的引了肝細胞損傷。然 而，這些免疫應(yīng)答不足夠廣泛或強大，以在慢性HCV感染的病人體內(nèi)促進病 毒清除和保護性免疫力。(Chisari, J.Clin. Invest. ， 1997， 99， 1472-1477.) 最近顯示，那些從急性HCV感染中恢復的病人能產(chǎn)生很強的對非結(jié)構(gòu)蛋白多 肽CD4 + T細胞增殖反應(yīng)。(Missale，等，J.Clin. Invest. , 1996， 98， 706-714; 和Di印older,等，Lancet, 1995, 346， 1006-1007.)更重要的是，HCV特異性 CTL活性的產(chǎn)生是和慢性肝炎個體體內(nèi)病毒復制的控制相聯(lián)系的。 (Rehermann,等，J. CI in. Invest. ， 996， 98, 1432-1440 ;和 Nelson,等， J. Immunol. ， 1997, 158,1473-1481.)然而，非結(jié)構(gòu)蛋白NS3， NS4和NS5是否有足夠的免疫原性能夠在體內(nèi)產(chǎn) 生廣泛的、強有力的CTL應(yīng)答尚不知道。現(xiàn)今還沒有通用的、高效的對慢性HCV感染的治療方法。HCV疫苗策略 的開發(fā)是復雜的，不僅是由于HCV分離物的顯著的異質(zhì)性，還由于在一個病 毒分離物中混合了異源基因組。(Martell,等，J. Virol. ， 1992， 66， 3225.)此 外，病毒包含了一個高度可變的衣殼區(qū)。有效的治療僅限于干擾素。 (Carithers, et al， H印atology, 1997， 26， 83S-88S.)事實上，用這種制劑治 療的病人大約8—10%有反應(yīng)，并有HCV從肝部的擴散。然而，近來的研究 顯示，和那些獲得持續(xù)性HCV感染的病人比較，從急性HCV感染中恢復的病 人對非結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)生了充分的CD4 + T細胞增殖反應(yīng)。(Missale，等， J . Clin. Invest. ， 1996， 98, 706-714;禾口 Diepolder， 等，Uncet， 1995， 346， 1006-1007)直接將DNA注射入動物體內(nèi)是免疫接種輸送特異免疫抗原的一種有前途 白勺方法。(Barry,等，Bio Techniques, 1994， 16， 616—619 ; Davis,等，Hum. Mol. Genet., 1993， II， 1847-1851; Tang，等，自然科學，1992, 356, 152-154 ; Wang， 等 ，J. Virol. , 1993， 67, 3338-3344; 和 Wolff, 等， 科學 ， 1990， 247, 1465-1468.)該方法已被成功的應(yīng)用于在鼠和雞中產(chǎn)生對流感病 毒、在鼠和小牛中對牛皰疹病毒、在鼠中對狂犬病毒產(chǎn)生保護性免疫。(Cox,
等， J. Virol. ， 1993， 67， 5664-5667; Fynan， 等，DNA 和 Cell Biol. , 1993， 12， 785-789;Ulmer等，科學，1993， 259， 1745-1749;和Xiang等， Virol. ， 1994, 199， 132-140.)在大多數(shù)情況中，強而高度多樣的抗體和細胞毒 T細胞應(yīng)答和感染的控制有關(guān)。事實上，和那些死病毒的疫苗，不僅能引起 抗急性感染的保護力而且能根除持續(xù)性病毒感染的CTL應(yīng)答的方法比較，不 使用肝臟載體而產(chǎn)生長而持續(xù)性的記憶性CTL的可能性，使這種方法特別具 有吸引力。(Wolff,等，科學，1990, 247， 1465-1468;Wolff，等，Hum. Mol, Genet.， 1992,I, 363-369; Manthorpe, 等 ，Human GeneTherapy,1993,4，419-431; Ulmer 等， 科學 ，1993，259， 1745-1749;Yankauckas，etaal. ，DNA 和 細 胞 生 物 學，1993, 12, 777-783 Montgomery, 等，DNA 和細胞生 物 學，1993， 12， 777-783;Fynan,等，DNA和細胞生物學，1993， 12, 785-789 ; Wang, 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993， 90, 4156-4160; Wang，等，DNA 和 細 胞 生 物 學 ，1993， 12， 799-805;Xiang， 等 ， Virol. ， 1994， 199， 132-140;Davis,等，Hum. Mol. Genet. ， 1993， II， 1847-1851; Donnelly,等，Nat. Med. ， 1995， I， 583-587; Boyer,等，Nat. Med, ， 1997， 3， 526-532;Tascon，等，Nat. Med. , 1996， 2， 888-892;禾口 Huygen，等，Nat. Med. 1996， 2， 893-898.)。和融合重組蛋白或多肽相比較，該方法的優(yōu)點在于能 引起強烈的炎癥性的CD4+T細胞應(yīng)答和細胞毒T細胞活性，推測是病毒蛋白 在細胞內(nèi)加工轉(zhuǎn)變成多肽，然后裝載在轉(zhuǎn)染細胞的MHC I類分子上，與抗原 遞呈細胞相互作用而致。相反的是，用融合蛋白免疫接種主要導致由MHC II 類途徑加工的體液免疫應(yīng)答。由于只有有限數(shù)目的表位能刺激宿主的免疫應(yīng) 答，用合成多肽免疫有幾個缺陷之處。相反的，對于感興趣的DNA構(gòu)建物編 碼的每個蛋白，天然存在的B和T細胞表位都可能是為T細胞受體識別而保 留的，因此可能會產(chǎn)生廣泛的體液和細胞免疫應(yīng)答。(McDonnell,等，N. Engl. J. Med. , 1996， 334， 42-45.)疫苗接種和免疫接種通常指引入某種無毒的物質(zhì)，個體的免疫系統(tǒng)能刺 激針對該物質(zhì)的免疫應(yīng)答，從而能抵抗病原體的攻擊。免疫系統(tǒng)識別入侵的 "外來"組分和物質(zhì)主要靠識別在個體內(nèi)正常不存在的蛋白和其它的大分子。 外來的蛋白是免疫應(yīng)答所針對的目標。PCT專利申請PCT/US90/01348公開了 HCV基因組克隆的序列信息，HCV 病毒蛋白的氨基酸序列以及制造和使用包括抗一HCV疫苗等組分的方法，該疫苗中含有HCV蛋白及其產(chǎn)生多肽。美國專利5， 830， 876， 5， 593， 972， 5， 739， 118和于1994年1月 26日提交的PCT專利申請系列號PCT/US94/00899，其內(nèi)容全部納入本文以供 參考。每專利都包含了基因免疫方案的細節(jié)?？笻CV疫苗也包括在各件專利 之中。用于保護個體抵抗HCV感染的疫苗的需求仍然存在，保護個體抵抗HCV 感染的方法的需求仍然存在。發(fā)明概述本發(fā)明涉及重組核酸序列分子，其包含編碼HCV非結(jié)構(gòu)區(qū)域，如NS3， NS4，或NS5，或它們的組合的核苷酸序列。本發(fā)明涉及包含重組核酸分子的藥物組合物，該重組的核酸分子含有一 段編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列。編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的該核苷酸編碼 序列和人細胞中的功能性調(diào)節(jié)元件可操作性相連。該藥物組合物還包含有藥 學上可接受的運載體或稀釋劑，和任選的促進劑(facilitator)，比如丁哌 卡因。該發(fā)明涉及免疫HCV易感個體的方法，包含向該個體給藥，藥物組合物 含有編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列的重組核酸分子。該編碼HCV非結(jié)構(gòu) 蛋白的核苷酸編碼序列與人類細胞中的功能性調(diào)節(jié)元件可操作性相連。該藥 物組合物還包含一種藥學上可接受的運載體或稀釋劑。對個體施用一定量的 藥物使之有效誘導抗HCV感染的保護性免疫應(yīng)答。本發(fā)明涉及治療患有HCV感染個體的方法，包括相該個體歌謠，藥物成 分含有編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列的重組核酸分子。該編碼HCV非結(jié) 構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列序列與人細胞中的功能性調(diào)節(jié)元件可操作性相連。 該藥物組分還包含藥學上可接受的運載體或稀釋劑。給予個體一定量的藥物 使之有效誘導HCV感染的治療性免疫應(yīng)答。附圖簡述

圖1A是一示意圖，顯示HCV的單一大開放閱讀框，它編碼大約3011 — 3030個氨基酸的多聚蛋白前體。該蛋白前體被宿主信號和病毒蛋白酶切割成
不同的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白，如箭頭所示。圖IB顯示HuH-7細胞瞬時轉(zhuǎn)染和 SP2/0細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的非結(jié)構(gòu)蛋白表達的示范性放射自顯影圖。1， 3， 5泳 道是模擬DNA轉(zhuǎn)染的細胞，用作陰性對照(Mock); 2， 4和6泳道顯示了特異 條帶，NS3在大約70， NS4在大約30， NS5大約125KD。 7—10泳道顯示了分 別轉(zhuǎn)染了含有NS3， NS4，和NS5基因的核酸構(gòu)建物的SP2/0細胞。7和9泳 道代表由穩(wěn)定表達HCV —核心蛋白，作為陰性對照(SP2—10)的細胞得到的細 胞裂解物，而8和10泳道代表NS3和NS5的特異性表達。圖2A是一 柱狀圖，顯示一代表性的以DNA為基礎(chǔ)免疫接種引起的對NS3， NS4和NS5的體液免疫應(yīng)答；血清抗體水平由一 ELISA法測定(每組n=5). 圖2B是一柱狀圖，顯示一在體外用特異或非特異性重組蛋白刺激3日后測得 的代表性的T細胞增殖。圖2C， 2D，和2E為柱狀圖，顯示在體外刺激48小 時后測得的代表性的細胞因子IFN — y， il一2和il一4分別在上清液中的分 泌水平。圖3A和3B是柱狀圖，顯示在不同的效應(yīng)細胞和耙細胞比例下 (100:1，30:1,10:1，3:1)分別對NS3和NS5作出的代表性的細胞毒T細胞 (CTL)反應(yīng).圖3C是柱狀圖，顯示針對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染靶細胞譜線的代表性鉻釋放實驗。圖4A是一表格，顯示評價ctl活性的腫瘤模型的代表性結(jié)果。圖4B是 -一照片，自左自右顯示接種了 l)模擬麗A，并以SP2/NS5-21細胞攻擊； 2)pApNS5，以SP2/NS5-21細胞攻擊；3) pApNS5，以SP2-19細胞攻擊；(穩(wěn)定 表達HCV核心蛋白)；以及4)用重組NS5蛋白腹膜接種三次，并被SP2/NS5-21 細胞攻擊的動物該發(fā)明的優(yōu)選例描述根據(jù)本發(fā)明，提供了對HCV感染進行預防性/或治療性免疫，或治療個體 的方法。重組核酸分子被接種入個體內(nèi)，該重組核苷酸分子包含編碼HCV非 結(jié)構(gòu)蛋白，如NS3， NS4，或NS5，或它們的組合的核苷酸編碼序列。由該重 組核酸基因構(gòu)建物編碼的蛋白由個體的細胞表達，并作為免疫原性靶子，誘 導針對它的抗HCV的免疫應(yīng)答。引起的免疫應(yīng)答是廣泛的，除體液免疫應(yīng)答 外，細胞免疫的兩個途徑都被激活。該發(fā)明的方法可用來賦予預防性和治療 性免疫力。該發(fā)明的方法除用于人類外，亦可用于哺乳動物以進行生物醫(yī)學 研究。因此，該發(fā)明的方法既可用于個體免疫抵抗HCV攻擊，亦可用于治療HCV感染個體。本文所用的詞組"HCV非結(jié)構(gòu)蛋白"是指HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3， NS4和 NS5，以及它們的等價物。等價蛋白包括保留本文所述的生物活性的NS3， NS4 和NS5肽鏈片段。此外，術(shù)語HCV非結(jié)構(gòu)蛋白意指相應(yīng)的來自其它的HCV分 離物，(序列上可能有變化)的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白。該領(lǐng)域一般技術(shù)人員能容 易的鑒定其它HCV分離物的非結(jié)構(gòu)蛋白。需理解的是，當編碼相同的氨基酸 時，密碼子中的核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代 而產(chǎn)生的保守的氨基酸取代時，核苷酸的變換也是可被接受的。需理解的是， 詞組"HCV非結(jié)構(gòu)蛋白"也包括了融合蛋白，該融合蛋白包括非結(jié)構(gòu)蛋白， 以及它的治療和預防性的活性片段。本文所用的詞組"基因構(gòu)建物"指包含編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編 碼序列的重組核酸分子，以及起始和終止信號，它們和包括啟動子、聚腺苷 酸化信號，能指導在疫苗接種個體細胞中表達的調(diào)控元件可操作性相連。在 某些實施例中，基因構(gòu)建物更包含有增強子，Kozak序列(GCCGCCATG;SEQID N0:1)，和至少一個HCV 5'UTR片段。本文所用的詞組"基因疫苗"指包括有一個基因構(gòu)建物的藥物制劑。基 因疫苗包含有用于刺激對HCV的預防性和/或治療性免疫應(yīng)答的藥物制劑。本文所用的詞組"核酸"指DNA， RNA,或由它們形成的嵌合體。根據(jù)本發(fā)明，將基因構(gòu)建物引入個體細胞中并在其中表達，從而產(chǎn)生至 少一種HCV非結(jié)構(gòu)蛋白。更好的是，本發(fā)明的基因構(gòu)建物的調(diào)控元件能指導 哺乳動物細胞中的表達，尤其是人類細胞中的表達。該調(diào)控元件包括啟動子 和聚腺苷酸信號。此外，其它元件，如增強子和Kozak序列，亦可包含在基 因構(gòu)建物中。當被細胞攝取后，本發(fā)明的基因構(gòu)建物可以在細胞中作為染色體外功能 性分子存在或整合入細胞的染色體麗A中。核酸，例如DNA，可以被引入細 胞，在細胞中以質(zhì)粒的形式作為獨立的基因材料存在。另外，可以整合到染 色體中的線狀核酸分子也可導入細胞。當將核酸引入細胞時，可加入促進核 酸整合到染色體上的試劑。在DNA分子中亦可加入有助于促進整合的DNA序 列。此外，RNA也可以接種入細胞。也可考慮將基因構(gòu)建物以線狀微型染色 體包括著絲粒、端粒和復制起始點的形式提供。
根據(jù)本發(fā)明，基因構(gòu)建物包含具有編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列的重組核酸分子。在一些優(yōu)選例中，重組核酸分子包括了編碼NS3的核苷 酸編碼序列。在另一些優(yōu)選例中，重組核酸分子包括了編碼包括NS4在內(nèi)的 HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列。在另一些優(yōu)選例中，重組核酸分子包括 了編碼包括NS5在內(nèi)的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列。在另一些優(yōu)選例 中，重組核酸分子包括了編碼包括NS3， NS4，和NS5在內(nèi)的任一HCV非結(jié)構(gòu) 蛋白組合的核苷酸編碼序列。在一些優(yōu)選例中，該重組核酸分子包括了編碼包括HCV NS3， NS4， NS5 蛋白的片段或它們的組合的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸編碼序列。這些片段包 括，但不限于，含有相應(yīng)非結(jié)構(gòu)蛋白的10， 25， 50， 75， 100， 150， 200， 250， 300， 350， 400， 450， 500， 550， 600， 650， 700， 750， 800， 850， 900， 950，或1000個氨基酸的片段。此外，這些片段可以包含蛋白羧基端一部分、 胺基端一部分、或它們兩者之間的任一部分。該領(lǐng)域技術(shù)熟練的研究人員可 以容易地制備HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的免疫原性片段、或含有任一組合的非結(jié)構(gòu)蛋 白的免疫原性片段的融合蛋白。因此，可以考慮，使含有編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋 白的核苷酸編碼序列的重組核酸分子含有比整個HCV非結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物少的序 列，而基本上不改變疫苗效率。還可考慮，在該核苷酸編碼序列中替換至少 一個或多個核苷酸而不影響該蛋白的氨基酸序列。此外還可考慮可在整段蛋 白中制造至少一個或多個保守性的氨基酸替代，而不實質(zhì)減弱HCV非結(jié)構(gòu)蛋 白的免疫原性的活力。在本發(fā)明的一些優(yōu)選例中，重組核酸分子包含具有HCV 5'UTR最后9 個核苷酸，HCV5'UTR最后25個核苷酸，HCV5'UTR最后50個核苷酸，HCV 5'UTR最后75個核苷酸，HCV 5'UTR最后100個核苷酸，HCV5，UTR最后 150個核苷酸，HCV 5'UTR最后200個核苷酸，HCV 5'UTR最后250個核苷酸， 以及HCV 5'UTR最后300個核苷酸的5'UTR片段。在一些優(yōu)選例中，基因 構(gòu)建物含有整個HCV5'UTR。在一些優(yōu)選例中，基因構(gòu)建物含有HCV 5'UTR 的最3'端的9個核苷酸。 一個優(yōu)選例中的整個HCV 5' UTR是GCCAGCCCCC GATTGGGGGC GACACTCCAC CATAGATCAC TCCCCTGTGA GGAACTACTG TCTTCACGCA GAAAGCGTCT AGCCATGGCG TTAGTATGAG TGTCGTGCAG CCTCCAGGAC CCCCCCTCCC GGGAGAGCCA TAGTGGTCTG CGGAACCGGT GAGTACACCG GAATTGCCAG GACGACCGGG TCCTTTCTTG GATCAACCCG CTCAATGCCT GGAGATTTGG GCGTGCCCCC GCGAGACTGCTAGCCGAGTA GTGTTGGGTC GCGAAAGGCC TTGTGGTACT GCCTGATAGG GTGCTTGCGA GTGCCCCGGG AGGTCTCGTA GACCGTGCAC C (SEQ ID NO: 2)DNA分子的基因表達所需的調(diào)控元件包括啟動子，初始密碼子，終止 密碼子，聚腺苷酸信號。此外，基因表達常需增強子。這些元件需和編碼HCV 非結(jié)構(gòu)蛋白的的序列可操作性連接，還需要在接種的個體中具操作性。起始 密碼子和終止密碼子通常被視為編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列的一部 分。使用的啟動子和聚腺苷酸信號必須在個體細胞中具有功能性。為使蛋白 的生產(chǎn)達到最大，可選擇給予該構(gòu)建物的細胞中非常適合基因表達的調(diào)控元 件。此外，可選擇能在細胞中最有效轉(zhuǎn)錄的密碼子。在本領(lǐng)域具有一般技能 的研究人員能構(gòu)建在哺乳動物，尤其是人類細胞中具有功能性的DNA構(gòu)建物。用于實現(xiàn)本發(fā)明的啟動子的實例，尤其是生產(chǎn)人類用的基因疫苗的啟動 子的實例，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)的啟動子，鼠乳房瘤病毒(MMTV) 的啟動子，人類免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV的長最后重復序列(LTR) 的啟動子，白血病(moloney)病毒，ALV (禽白血病(moloney)病毒)，巨 細胞病毒(CMV)，如CMV的立即早期啟動子，EB病毒(EBV) ， Rous肉瘤病 毒(RSV)，以及來自人類基因的啟動子，如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血 色素、人肌酸素以及人金屬硫蛋白的啟動子。用于實現(xiàn)本發(fā)明的聚腺苷酸信號的實例，尤其是生產(chǎn)人類用的基因疫苗 的聚腺苷酸信號的實例，包括但不限于猿猴病毒40 (SV40)和LTR的聚腺 苷酸信號。具體使用的SV40聚腺苷酸信號是在pCEP,質(zhì)粒(Invitrogen, San Diego CA)中的SV40聚腺苷酸信號。除基因表達所需的調(diào)控元件外，在基因 構(gòu)建物中還可含有其它的元件。這些其它的元件包括增強子。增強子可從下 列組中選擇但不限于人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血色素、人肌酸素以及 病毒增強子如CMV， RSV和EBV的增強子?？上蚧驑?gòu)建物提供哺乳動物復制起始點，以使之保持染色體外的狀態(tài)， 從而在細胞中產(chǎn)生此構(gòu)建物的多個拷貝。質(zhì)粒pCEP4, pREP4 (San Diego， CA) 包含有EB病毒的復制起始點和無需整合，能產(chǎn)生高拷貝游離型復制的核酸抗 原EBNA—1編碼區(qū)。接種途徑包括，但不限于肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，真皮內(nèi)，皮下，靜脈注射， 動脈內(nèi)，眼內(nèi)和口服，以及透皮或釆用吸入法或栓劑。優(yōu)選給藥途徑包括肌
內(nèi)，腹膜內(nèi)，真皮內(nèi)和皮下注射。在采用和粘膜免疫力相關(guān)組織中存在的物 質(zhì)免疫接種后，編碼HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的基因構(gòu)建物的輸送能賦予粘膜免疫力。 因此，在一些實施例中，此基因構(gòu)建物通過在個體口腔中的口腔前庭接種來 輸送。基因構(gòu)建物可通過包括，但不限于傳統(tǒng)注射，無針注射設(shè)備，或"顯 微粒子轟擊基因槍,，(microprojectile bombardment gene guns)給予。此 外，基因疫苗亦可用多種方法導入從個體上取出的細胞中。這些方法包括 比如，體外轉(zhuǎn)染，電穿孔法，顯微注射以及顯微粒子轟擊。在基因構(gòu)建物被 細胞攝取后，可將細胞重新植回個體?？煽紤]，本來無免疫原性的細胞摻入 了基因構(gòu)建物后可以植入個體，即使被接種的細胞原來來自另一個個體。根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選例，基因構(gòu)建物采用無針注射器接種入個體。根 據(jù)另一些優(yōu)選例，基因構(gòu)建物同時用無針注射器通過真皮內(nèi)，皮下注射和肌 肉注射來接種入個體。無針注射器是廣為人知并廣泛可得的。該領(lǐng)域的一般 技術(shù)人員能夠按照本文的指導，用無針注射器來將基因物質(zhì)傳遞給個體的細 胞。無針注射器非常適合向所有的組織傳遞基因物質(zhì)。它們尤其對相皮膚和 肌肉細胞傳遞遺傳物質(zhì)有效。在一些優(yōu)選例中，無針注射器可以用來將含有 DNA分子的液體推至個體的皮膚表面。該液體以足夠的速度推動，由于對皮 膚的沖擊力，液體穿透皮膚表面，滲入到下面的皮膚和肌肉組織。因此，基 因構(gòu)建物同時被接種入真皮，皮下和肌肉。在一些優(yōu)選例中，為了向器官細 胞引入核酸分子，無針注射器可用來將基因物質(zhì)傳遞給其它器官的組織。根據(jù)本發(fā)明，基因疫苗含有1納克至1000毫克的核酸，宜選是DNA。在 一些優(yōu)選例中，該疫苗含有10納克至大約800毫克的核酸。在一些優(yōu)選例中， 該疫苗含有0. 1至大約500毫克的核酸。在一些優(yōu)選例中，該疫苗含有1至 大約350毫克的核酸。在一些優(yōu)選例中，該疫苗含有25至大約250毫克的核 酸。在一些優(yōu)選例中，該疫苗含有大約IOO毫克的核酸。該領(lǐng)域熟練技術(shù)人 員能容易地配制所需量核酸的疫苗。按照接種模式來配置本發(fā)明的基因疫苗。該領(lǐng)域中一般技術(shù)人員可以容 易地配制含有基因構(gòu)建物的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物包含有的編碼 NS3， NS4，或NS5，或它們的組合的單一基因構(gòu)建物。另外，本發(fā)明的藥物 組合物包含有編碼NS3， NS4，或NS5，或它們的組合的多個基因構(gòu)建物。另 外，本發(fā)明的藥物組合物包含有編碼NS3， NS4，或NS5的片段，或它們的組
合的單一或多個基因構(gòu)建物。此外，本發(fā)明的藥物組合物包含編碼所有或任一NS3， NS4，或NS5蛋白片段的融合蛋白的單一基因構(gòu)建物。在某些例子中， 等滲的配方被采用。通常，等滲添加劑可包括氯化鈉，葡聚糖，甘露糖醇， 山梨醇和乳糖。在某些例子中，可采用等滲溶液例如磷酸緩沖液。穩(wěn)定劑包 括凝膠和白蛋白。在一些優(yōu)選例中，在配方中添加血管收縮劑。本發(fā)明的藥 物制備需是無菌無熱源質(zhì)提供的。本發(fā)明的基因構(gòu)建物可以用能提高基因構(gòu)建物的吸收和/或表達的藥劑 配制或聯(lián)合接種，該藥劑本文稱為促進劑(facilitator)，它與基因構(gòu)建物 的攝取和表達有關(guān)的細胞，以及當在缺少這些藥劑時接種相同的基因疫苗時 出現(xiàn)的細胞有關(guān)。這些藥劑和將它們與基因構(gòu)建物聯(lián)合接種的方案在美國專 利5， 830， 876， 5， 593， 972， 5， 739， 118和與1994年1月26日PCT專 利申請系列號PCT/US94/00899中有描述。這類藥劑的例子包括CaPO,， DEAE， 葡聚糖，脂質(zhì)，胞外基質(zhì)活性酶；皂角苷；凝集素；雌激素化合物和類固醇 激素；羰化低級垸，二甲基亞砜(DMS0);尿素；苯甲酸酯酰替苯胺；脒；氨基甲酸乙酯和局部麻醉藥家族的鹽酸鹽。此外，基因構(gòu)建物可包裹在脂質(zhì)/ 聚陽離子復合物中或與該復合物聯(lián)合接種。一種優(yōu)選的促進劑(facilitator)是丁哌卡因。這些組分可以方便的以單位劑量給予，并可用藥學領(lǐng)域中熟知 的任何方法制備。例如 Remington' s Phamaceutical Sciences (Mack Pub.Co. ，Easton，PA， 1980)，所描述的方法。該文公開的內(nèi)容全部納入本文作參考。在實施例中，提供了以下的用編碼HCV三種不同非結(jié)構(gòu)蛋白的質(zhì)粒作面A 疫苗接種，顯示能刺激免疫系統(tǒng)二部分能強烈抗原特異性免疫應(yīng)答。三次免 疫接種后，所有動物都產(chǎn)生了可檢測的抗體反應(yīng)。在這點上，這些非結(jié)構(gòu)蛋 白和以前用結(jié)構(gòu)性HCV核心結(jié)構(gòu)蛋白的研究相比，是好得多的刺激體液免疫 應(yīng)答的抗原。(Tokushige，等，Hepatology， 1996， 24, 14-20;和Geissler， 等，J.Immunol.， 1997,158, 1231-1237.)在優(yōu)選例中，對非結(jié)構(gòu)蛋白的體 液免疫可以用加入能活化抗原遞呈細胞的化合物來增強，比如，表達細胞因 子的質(zhì)粒，如 IL — 2禾t] GM — CSF 。 ( Geissler，等，J. Immunol.， 1997,158,1231- 1237;和Xiang, Immunity, 1995， 2,129-135.)所有的三 種編碼NS3， NS4， NS5的質(zhì)粒都證明了產(chǎn)生了具有優(yōu)勢THI表型的炎癥性CD4 + 丁細胞。此外，產(chǎn)生強而特異的
ug) 免疫三次。最后一組動物接受了聯(lián)合DNA免疫和重組蛋白。用SP2NS5 — 21或 SP2—10細胞進行腫瘤攻擊15日后，長出腫瘤的小鼠的數(shù)量以及腫瘤的重量 被測定。圖4B，自左至右，顯示了用模擬DNA免疫，并用SP2/NS5 —21細胞 攻擊的動物；用pApNS5免疫，并用SP2/NS5 — 21攻擊的動物；用pApNS5免 疫，并用SP2—19 (穩(wěn)定表達HCV核心)攻擊的動物；以及用重組NS5蛋白 腹膜內(nèi)注射三次，并用SP2/NS5 — 21細胞攻擊的動物。在第一、三和第四組 動物的右體側(cè)上有大腫瘤形成，而第二組沒有，它是用pApNS5免疫，并用穩(wěn) 定表達NS5的小鼠骨髓瘤細胞系攻擊的。
序列表<110>總醫(yī)院有限公司(THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION)<i2o〉采用丙型肝炎病滯非結(jié)構(gòu)蛋ri進行的基閑免疫<130〉 003095F2<150〉 US 60/073,156 <151〉 1998-0卜30<160> 8<170〉 Patentln version 2.0<210〉 1<211〉 9〈212> DNA<213> 人.T.序列<220〉<223>人丁序列的描述合成序列〈400〉 1 gccgccatg<210> 2<211> 341<212〉 DNA <213> 人工序列<220〉〈223〉人丁.序列的描述合成序列 <400〉 2gccagccccc ga"gggggc gacactccac catagatcac tcccctgtga ggaactactg tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggac cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag gacgaccggg tcctttc"g gatcaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc gcgagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac c<210〉 3 <211〉 28 <212> DNA <213> 人工序列〈220〉<223〉人T.序列的描述合成序列 〈400〉 360120180240300341
ggtctagatt gatggcgccc atcacggc 28〈210> 4<211〉 29<212〉 DNA<213> 人T.序列<220〉<223〉人工序列的描述合成序列 <400〉 4cacacgcgtt cacgtgacga cctccaggt 29〈210〉 5<211〉 25<212〉 DNA <213> 人T.序列〈220><223〉人T.序列的描述合成序列 <400〉 5ggtctagatg agcacctggg tgctc 25<210〉 6<211> 27 <212>陽<213> 人丁.序列<220〉<223〉人T.序列的描述合成序列 〈400〉 6ccaggatcct cagcatggag tggtaca 27<210> 7 <211〉 39 <212> DNA <213〉 人T.序列<220><223〉人T.序列的描述合成序列 <400〉 7tcagtctaga atgtccggct ccggctcctg gctaaggga 39<210〉 8 <211〉 30 <212〉 DNA <213〉 人丁序列<220〉<223〉人工序列的描述合成序列 <400〉 8agctacgcgt tcaccggttg gggaggaggt
權(quán)利要求
1.一種重組核酸分子，其特征在于，它包含編碼丙型肝炎非結(jié)構(gòu)蛋白NS5的核苷酸序列，其中所述重組核酸不編碼NS2蛋白。
2. 如權(quán)利要求1所述的重組核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列和 人類細胞中有功能性的調(diào)控元件可操作性相連，所述有功能性的調(diào)控元件選 自啟動子、增強子、聚腺苷酸序列以及任選的丙型肝炎病毒5'UTR。
3. 如權(quán)利要求2所述的重組核酸分子，其特征在于，所述啟動子是巨細 胞病毒啟動子，所述增強子是Rous肉瘤病毒增強子。
4. 一種包含權(quán)利要求1中所述核酸分子的重組宿主細胞。
5. —種藥物組合物，其特征在于，包含a) 如權(quán)利要求1所述的重組核酸分子，其中所述核苷酸序列 和人類細胞中功能性的調(diào)控元件可操作性相連，所述有功能性的調(diào)控元件選 自啟動子、增強子、聚腺苷酸序列以及任選的丙型肝炎病毒5'UTR;以及b) 藥物接受載體或稀釋劑。
6. 如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述啟動子是巨細胞 病毒啟動子，所述增強子是Rous肉瘤病毒增強子。
7. 如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，它還包含促進劑。
8. 如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述促進劑是丁哌卡因。
9. 權(quán)利要求1所述的重組核酸分子的用途，用于制備在未感染丙型肝炎 病毒的人體中誘導對丙型肝炎病毒的免疫應(yīng)答的藥物。
10. 如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括細胞應(yīng)效口 。
11. 如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述免疫應(yīng)答包括體液應(yīng)答°
12. 如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述重組核酸分子存在于 包含有藥物接受載體或稀釋劑的藥物組合物里。
13. 如權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于，所述藥物組合物還包含僻 進劑。
14. 如權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于，所述促進劑是丁哌卡因。
15. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物的用途，其特征在于，用于制備對丙 型肝炎病毒易感的人免疫的藥物。
16. 如權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于，在給予所述藥物組合物的 部位給予丁哌卡因。
17. 權(quán)利要求1所述的重組核酸分子的用途，其特征在于，用于制備對丙 型肝炎病毒易感的人免疫的藥物。
18. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物的用途，其特征在于，用于制備治療 丙型肝炎病毒感染的藥物。
19. 如權(quán)利要求18所述用途，其特征在于，在給予所述藥物組合物的 部位給予所述人丁哌卡因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種編碼丙型肝炎非結(jié)構(gòu)蛋白的核酸分子(包括具體公開的DNA序列)。還公開了藥物組合物，它包含編碼NS3、NS4和NS5，或它們組合的核苷酸序列的丙型肝炎非結(jié)構(gòu)蛋白的核酸分子，該核酸分子和人體細胞內(nèi)功能性的調(diào)控元件可操作性相連。還公開了對丙型肝炎病毒易感或被感染的個體進行免疫的方法，該方法包括施用這些藥物組合物。
文檔編號A61K48/00GK101126094SQ20071013846
公開日2008年2月20日 申請日期1999年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月30日
發(fā)明者J·萬德斯, J·恩克 申請人:總醫(yī)院有限公司