專利名稱：：綠原酸在制備治療小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及綠原酸的新用途，具體地來說，是綠原酸在制備治療小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：肺癌的發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅人類生命健康?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肺癌是一種由細(xì)胞突變所致的克隆性疾病，在肺癌組織中，通常有一種惡性細(xì)胞占主要地位。從生物學(xué)行為的角度可將其分為小細(xì)胞肺癌(smallcelllungcancer，SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)兩種主要類型，其中SCLC約占15%20%。SCLC和NSCLC不僅在染色體、基因、細(xì)胞表面標(biāo)記等細(xì)胞分子水平存在顯著差異，在病理特征方面也存在顯著差異。具體差異如下一、細(xì)胞分子水平差異1.染色體變異肺癌中已報道多種染色體畸變，包括整條染色體和部分染色體的丟失等，在SCLC染色體畸變主要發(fā)生在lp、3p、5q、6q、8q、13q和17p。和非小細(xì)胞肺癌NSCLC相比較而言，SCLC常常表現(xiàn)出3p、5q、13q和17p，其中最為常見的的染色體畸變是3p的丟失。2.基因異常表達(dá)或缺失myc原癌基因的表達(dá)產(chǎn)物是一種核DNA結(jié)合蛋白，參與調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和分化。myc基因異常表達(dá)的頻率在NSCLC較低，而在SCLC中則存在差異，其表達(dá)的增高則SCLC的預(yù)后較差。BCL家族蛋白是細(xì)胞程序性死亡或凋亡中重要的調(diào)控子，是細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控子，它通過延長細(xì)胞的生存期來抑制細(xì)胞的凋亡。BCL在SCLC中的表達(dá)遠(yuǎn)比NSCLC高，BCL表達(dá)在抑制細(xì)胞凋亡的同時，也可增加腫瘤細(xì)胞對一些抗癌藥物的耐受性。SCLC易產(chǎn)生耐藥性與該基因的過表達(dá)有關(guān)。Rb基因的缺失或改變，在NSCLC和SCLC中有很大不同，超過卯。/。的SCLC中Rb基因的缺失或改變，而在NSCLC中僅占15。/。，Rb基因的缺失或改變與癌癥預(yù)后不良密切相關(guān)。3.細(xì)胞表面標(biāo)記SCLC細(xì)胞表面表達(dá)的經(jīng)典分子之一是神經(jīng)粘附分子(NCAM)，粘附分子在細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)聯(lián)系中發(fā)揮著重要作用。并且，在異常狀態(tài)下，對于細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移也發(fā)揮作用。一些研究表明100n/。的SCLC呈現(xiàn)NCAM抗體陽性，而僅9n/。的NSCLC與該抗體反應(yīng)陽性。二、病理特征差異SCLC與NSCLC比較,腫瘤倍增時間短,惡性程度高，較早出現(xiàn)淋巴道轉(zhuǎn)移和侵入血管經(jīng)血道廣泛轉(zhuǎn)移到身體遠(yuǎn)處器官組織。對放射治療及/或抗癌藥物治療敏感度高，但易產(chǎn)生耐藥性。且由于常短期內(nèi)復(fù)發(fā),生存率低于NSCLC。正是由于上述SCLC與NSCLC的細(xì)胞分子水平和病理特征差異，因此全身化療為SCLC治療的重點。盡管80G/。90M的局限期與約70。/。的廣泛期患者接受細(xì)胞毒藥物化療后腫瘤得以緩解,但緩解期通常不持久(中位緩解期多為6至8個月),且高達(dá)95%的患者最終將因疾病復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡。目前，無論局限期或廣泛期小細(xì)胞肺癌的主要治療模式均為聯(lián)合化療。根治性化療可以延長患者的生存期,即便對于伴有嚴(yán)重臟器功能損害的患者,姑息性化療也有助于緩解癥狀。因此開發(fā)高效低毒的化療藥物用于SCLC具有非常大的臨床意義。綜上所述，按生物學(xué)行為的角度區(qū)分兩種肺癌是相當(dāng)重要的，因為這兩種類型的肺癌存在明顯差異，發(fā)病機理、治療方案是截然不同的。小細(xì)胞肺癌患者主要用放化療方法治療，外科治療對這種類型肺癌患者并不起主要作用。另一方面，外科治療主要適用于非小細(xì)胞肺癌患者。小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，相互之間不存在可推導(dǎo)性。另外，大多數(shù)藥物對不同類別的腫瘤細(xì)胞的作用是有一定的專屬性，如臨床常見的紫杉醇在治療肺癌時是針對非小細(xì)胞癌(勞永聰，紫杉醇治療非小細(xì)胞肺癌毒副作用的觀察與護理，醫(yī)學(xué)文選2006第二期)，但沒有文獻報道公開紫杉醇對小細(xì)胞癌也有功效；吉林柳河方大制藥有限公司生產(chǎn)的"參蟾消解膠囊"中藥抗癌藥的功能主治為肺腺癌[見"參蟾消解膠囊"說明書]，肺腺癌屬于非小細(xì)胞癌類。綠原酸是廣泛存在于各種植物中的重要成分，與日常生活相關(guān)的植物包括葵花籽、水果(蘋果、梨、葡萄)、蔬菜(土豆)、大豆、小麥、可可豆、咖啡豆、沙棘果和傳統(tǒng)中草藥(杜仲、金銀花)均不同程度地含有綠原酸。目前報道的綠原酸用于治療肺癌的報道較多，如文獻CA143:166218:InhibitionofActivatorProtein-l,NF-B，andMAPKsandInductionofPhase2DetoxifyingEnzymeActivitybyChlorogenicAcid)披露了綠原酸體外抑制人癌癥細(xì)胞株A549的增值。所述癌癥細(xì)胞株A549屬于非小細(xì)胞癌中的肺腺癌。文獻CA100:79562:Protectiveeffectsofellagicacidandotherplantphenolsonbenzo[a]pyrene畫inducedneoplasiainmice.披露了綠原酸(5xl00mg/kg，靜脈注射)抗苯并[a]芘(100mg/kg)導(dǎo)致的肺癌。經(jīng)査閱該文獻，認(rèn)為文獻中表現(xiàn)的也是非小細(xì)胞癌中的肺腺癌(pulmonaryadenoma)。文獻CA141:224381:Invitroantioxidativeeffectsandtyrosinaseinhibitoryactivitiesofsevenhydroxycinnamoylderivativesingreencoffeebeans.披露了從叻卩啡豆中提取得至lj的7種羥基苯丙稀衍生物經(jīng)鑒定其中有綠原酸。這些提取物對MCF7和WI38有抗增值作用。其中MCF7為人乳腺癌細(xì)胞株，WI38人胚肺成纖維細(xì)胞也屬非小細(xì)胞癌。文獻TSNAs的形成、影響因素、分析及清除方法綜述，煙草科技/煙草化學(xué)，2004(7):27-30)披露了TSNAs是一種致癌物質(zhì)，與肺癌產(chǎn)生有關(guān)。綠原酸是TSNAs的抑制劑。間接說明綠原酸的抗肺癌作用。但是文獻所闡述的TSNAs為廣義的致癌物質(zhì)，涉及的肺癌也是一個廣義概念，或者說是一個肺癌的上位概念，而且不能說明綠原酸對肺癌的直接作用。綜上所述，現(xiàn)有文獻均披露的綠原酸對肺癌的作用一方面局限于非小細(xì)胞肺癌，沒有綠原酸治療小細(xì)胞肺癌的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了綠原酸的新用途，具體地，是在制備治療小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。本發(fā)明提供了綠原酸Chlorogenicacid在制備治療小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了一種治療肺癌的藥物組合物，它是以有效量的綠原酸為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。其中，所述的藥劑中每制劑單位含有綠原酸1—3000mg。其中，所述的藥劑是口服制劑、注射制劑。雖然文獻報道綠原酸能夠在體外抑制人癌癥細(xì)胞株A549的增值的非小細(xì)胞肺癌屬，但小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌是屬于肺癌中的兩種不同的類型，是不同的適應(yīng)癥。因此，不能推之具有綠原酸具有抑制小細(xì)胞肺癌的功效。小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌在病因?qū)W、種系發(fā)生學(xué)、組織病理學(xué)和臨床方面有著明顯的不同。小細(xì)胞肺癌(SCLC)在肺癌中所占的比例約2025%，據(jù)近年流行病學(xué)資料顯示該類型已有下降的趨勢。SCLC由肺Kulchitsky細(xì)胞惡變而來，WHO將其又分為燕麥細(xì)胞型、中間細(xì)胞型和混合細(xì)胞型三種。該病男性多發(fā)于女性；發(fā)病部位以大支氣管(中心型)居多。臨床特點為腫瘤細(xì)胞倍增時間短，進展快，常伴內(nèi)分泌異?；蝾惏┚C合征；由于患者早期即發(fā)生血行轉(zhuǎn)移且對放化療敏感，故小細(xì)胞肺癌的治療都采全身化療為主，聯(lián)合放療和手術(shù)為主要治療手段，藥物治療手段不多。本發(fā)明綠原酸對小細(xì)胞肺癌有抑制功效，能替代部分放化療，減輕患者可以因放化療引起的不適反應(yīng)，是治療小細(xì)胞肺癌的新的藥物治療手段和選擇。發(fā)明的具體實施方式實施例1制備氯化鈉0.9%的靜脈注射用注射液處方一純度大于95%的綠原酸l.Og枸櫞酸l.Og枸櫞酸鈉0.5g氯化鈉18g注射用水2000ml按注射劑的常規(guī)操作共制成2ml的注射劑1000支，每支含綠原酸l毫克處方二純度大于95%的綠原酸3000g氯化鈉4500g注射用水_500000ml_按注射劑的常規(guī)操作共制成500ml的注射劑1000瓶，每瓶含綠原酸3克防止綠原酸水解的穩(wěn)定劑如環(huán)糊精包合物、表面活性劑(陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑、非離子表面活性劑)?？寡趸瘎﹣喠蛩徕c、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、抗壞血酸、生理可用的pH值調(diào)節(jié)劑檸檬酸、富馬酸、谷氨酸、L-天冬氨酸、乳酸、乳糖酸、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、抗壞血酸、鹽酸、醋酸。實施例2含氯化鈉的無菌粉針劑處方一純度大于95%的綠原酸無菌粉l.Og氯化鈉無菌粉__按無菌粉針劑的常規(guī)操作共制成2ml粉針劑1000支，每支含綠原酸1毫克處方二純度大于95%的綠原酸無菌粉3000g氯化鈉無菌粉__按無菌粉針劑的常規(guī)操作共制成5ml粉針劑1000支，每支含綠原酸3克將實施例1各配方產(chǎn)品經(jīng)凍干設(shè)備冷凍干燥制得綠原酸氯化鈉的無菌凍干粉針劑。實施例3綠原酸的5%葡萄糖靜脈注射用注射液處方一綠原酸(純度大于95%)2.0g枸櫞酸l.Og枸櫞酸鈉0.5g葡萄糖100g注射用水2000ml按注射劑的常規(guī)操作共制成2ml的注射劑1000支，每支含綠原酸2毫克處方二綠原酸(純度大于95%)葡萄糖注射用水20000ml1500g1000g按注射劑的常規(guī)操作共制成20ml的注射劑1000支，每支含綠原酸1.5克處方三按注射劑的常規(guī)操作共制成500ml的注射劑1000瓶，每瓶含綠原酸3克綠原酸的純度大于95%。防止綠原酸水解的穩(wěn)定劑如環(huán)糊精包合物、表面活性劑(陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑、非離子表面活性劑)抗氧化劑亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、抗壞血酸、半胱氨酸。生理可用的pH值調(diào)節(jié)劑檸檬酸、富馬酸、谷氨酸、L-天冬氨酸、乳酸、乳糖酸、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、抗壞血酸、鹽酸、醋酸。實施例4綠原酸片劑綠原酸(純度大于95%)葡萄糖注射用水3000g25000g500000ml處方--:綠原酸(純度大于95%)l.OOg填充劑180.00g崩解劑10.00g黏合劑6.00g潤滑劑3.00g共計__200.00g按片劑常規(guī)方法制備，共制成1000片，每片含綠原酸lmg。綠原酸(純度大于95%)100.00g填充劑170.00g崩解劑15.00g黏合劑10.00g潤滑劑5.00g共i十_300.00g按片劑常規(guī)方法制備，共制成1000片，每片含綠原酸100mg。處方三綠原酸(純度大于95%)300.00g填充劑155.00g崩解劑20.00g黏合劑15.00g潤滑劑lO.OOg共計__500.00g按片劑常規(guī)方法制備，共制成1000片，每片含綠原酸300mg。綠原酸的純度大于95%。填充劑如淀粉、糊精、糖粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、葡萄糖、微晶纖維素、碳酸鈣、硫酸鈣、碳酸氫鈣。黏合劑如羥丙甲纖維素、聚維酮、淀粉漿、糊精漿、糖漿、膠槳、海藻酸鈉、聚乙二醇、桃膠、阿拉伯膠。崩解劑如交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)聚維酮、羧甲淀粉鈉、羥丙基淀粉、低取代羥丙基纖維素、梓檬酸、酒石酸、酸酐、碳酸氫鈉、碳酸鈉。潤滑劑如硬脂酸鎂、滑石粉、微粉硅膠、液體石蠟、聚乙二醇。實施例5綠原酸膠囊劑處方一綠原酸(純度大于95%)1.00g填充劑184.00g黏合劑5.00g潤滑劑lO.OOg共計200.00g按膠囊劑常規(guī)方法制備，共制成1000粒膠囊，每粒膠囊含綠原酸lmg。處方二綠原酸(純度大于95%)100.00g填充劑85.00g黏合劑5.00g潤滑劑lO.OOg共計200.00g按膠囊劑常規(guī)方法制備，共制成1000粒膠囊，每粒膠囊含綠原酸lOOmg。處方綠原酸(純度大于95%)300.00g填充劑85.00g黏合劑5.00g潤滑劑lO.OOg共計400.00g按膠囊劑常規(guī)方法制備，共制成1000粒囊，每粒膠囊含綠原酸300mg。綠原酸的純度大于95%。填充劑如淀粉、糊精、糖粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、葡萄糖、微晶纖維素、碳酸鈣、硫酸朽、碳酸氫鈣。黏合劑如羥丙甲纖維素、聚維酮、淀粉漿、糊精漿、糖漿、膠漿、海藻酸鈉、聚乙二醇、桃膠、阿拉伯膠。潤滑劑如硬脂酸鎂、滑石粉、微粉硅膠、液體石蠟、聚乙二醇。以下通過藥效學(xué)試驗證明本發(fā)明的有益效果。試驗例l綠原酸體外抗腫瘤細(xì)胞作用的實驗下述試驗從小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩個類別方面進行了體外實驗證明了綠原酸具有的治療肺癌的作用，更全面和完整地說明了綠原酸能治療小細(xì)胞肺癌。一、藥物及主要試劑耗材1、綠原酸粉劑，純度99.6%，由四川大學(xué)藥學(xué)院提供，分子量354。2、培養(yǎng)基及試劑培養(yǎng)基RPML1640(Gibco公司)，小牛血清(蘭州民海)，青霉素(華北制藥股份有限公司，批號E0509104)、硫酸鏈霉素(華北制藥股份有限公司，批號No細(xì)302)，MTT(Sigma公司)。3、培養(yǎng)器皿96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶(BD公司)。4、儀器日本SANYO二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，Olympus1X70倒置相差熒光顯微鏡，美國NUAIRE生物安全柜，p-Quant微孔板測定儀(BioTek公司)。5、細(xì)胞株人肺腺癌(SP-CA-1);人小細(xì)胞肺癌(NCIH446)。從中科院上海細(xì)胞庫和ATCC引進，實驗室保存。二、實驗歩驟(一)藥物及試劑配制1、綠原酸的配制綠原酸粉劑用超純水(18.2MQ/cm水質(zhì)，Millipore-Q制備)溶解配成6.4mg/ml的儲存濃度，經(jīng)0.22pmMillipore無菌過濾頭無菌過濾除菌。2、培養(yǎng)液配置RPML1640粉劑溶解于超純水中，攪拌溶解，力n2.2gNaHC03、10mMHEPES攪拌溶解，加青霉素100U/ml、鏈霉素100|ug/ml，充分混合后0.22pm濾膜無菌過濾，分裝-20'C凍存，此為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。臨用前37'C水浴解凍，加10%的小牛血清，調(diào)整培養(yǎng)液pH為7.27.4，此為完全培養(yǎng)基。3、CellProliferationReagent(WST-1)(Roche11644807001)按要求冷藏。(二)細(xì)胞復(fù)蘇及接種1、細(xì)胞復(fù)蘇將凍存細(xì)胞株從-152"C超低溫冰柜中取出，4(TC水浴解凍，離心用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌后用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，靜置于37"C、5%C02的飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每23天換液。細(xì)胞生長鋪滿細(xì)胞瓶后用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)直實驗所需細(xì)胞數(shù)量。2、消化細(xì)胞接種孔板取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化、用基礎(chǔ)培養(yǎng)基離心洗滌1000rpm5min兩次，用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為6xl0Vml，接種細(xì)胞于%孔板內(nèi)，每孔50pl(細(xì)胞數(shù)量3><103/孔)。接種孔數(shù)以每個藥物濃度3個復(fù)孔接種，并設(shè)正常對照組(腫瘤細(xì)胞+完全培養(yǎng)基)，接種培養(yǎng)后次日細(xì)胞貼壁后加藥。設(shè)定空白對照組(完全培養(yǎng)基+實驗終止前同步加等量WST-l)(三)加藥按以下分組加藥，靜置培養(yǎng)48小時，加藥48小時后終止前4小時加WST-1，H-Quant微孔板測定儀(BioTek公司)測定440nm波長的光吸收值。1、綠原酸組加藥前用完全培養(yǎng)基將6.4mg/ml儲存濃度的綠原酸配制成256pg/ml的藥物濃度，然后按兩倍稀釋法逐步稀釋；每個濃度取50pl2倍終濃度的綠原酸到己接種細(xì)胞的有50pl培養(yǎng)基的相應(yīng)孔板中，綠原酸終濃度即為128、64、32、16、8、4、2禾卩l(xiāng)pg/ml。2、正常對照組設(shè)腫瘤細(xì)胞正常對照組孔與上述同步實驗。3、空白對照組每孔加等量完全培養(yǎng)基，3個復(fù)孔。實驗終止前同歩加等量WST-1并同步測定。4、37°C、5%(:02飽和濕度靜置培養(yǎng)48小時。比色測定實驗結(jié)束前4小時，在上述3個實驗組和正常對照組孔板內(nèi)每孔加10)^1WST-1溶液，置37"C細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，于加樣后2、4hr在)i-Quant微孔板測定儀(BioTek公司)上測定不同藥物組和正常對照孔的440nm波長光吸收值。96孔對應(yīng)濃度及數(shù)據(jù)見表1:表1綠原酸體外作用肺癌細(xì)胞的測定值<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>三實驗結(jié)果根據(jù)表一測定結(jié)果，按公式(1)計算不同濃度綠原酸對人肺腺癌(SP-CA-1);人小細(xì)胞肺癌(NCIH446)的抑制率。抑制率％=a-ODg,—0/)基質(zhì))xioo......i0^正常值_。"基質(zhì)計算結(jié)果見表2。表2不同濃度綠原酸對肺癌NCIH446和SP-CA-1的抑制結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)論綠原酸體外抑瘤實驗證明，綠原酸高濃度時對人患肺腺癌(SP-CA-1)和小細(xì)胞肺癌(NCIH446)有抑制作用。上述試驗證明，本發(fā)明綠原酸對小細(xì)胞肺癌有抑制功效，能替代部分放化療，減輕患者可以因放化療引起的不適反應(yīng)，是治療小細(xì)胞肺癌的新手段。權(quán)利要求1、綠原酸Chlorogenicacid在制備治療小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。2、一種治療肺癌的藥物組合物，它是以有效量的綠原酸為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的藥劑。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥劑中每制劑單位含有綠原酸1—3000mg。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥劑是口服制劑、注射制劑。全文摘要本發(fā)明提供了綠原酸Chlorogenicacid在制備治療小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。本發(fā)明綠原酸對小細(xì)胞肺癌有抑制功效，能替代部分放化療，減輕患者可以因放化療引起的不適反應(yīng)，是治療小細(xì)胞肺癌的新的藥物治療手段和選擇。文檔編號A61P35/00GK101120938SQ20071014060公開日2008年2月13日申請日期2007年8月9日優(yōu)先權(quán)日2006年8月9日發(fā)明者旭包,潔張,徐小平,易大朝申請人:四川九章生物化工科技發(fā)展有限公司