專利名稱：：利用超聲波處理液體介質(zhì)以防止過度增殖或感染細胞生長的設(shè)備與方法利用超聲波處理液體介質(zhì)以防止過度增殖或感染細胞生長的設(shè)備與方法本申請為申請日為2003年11月4曰、申請?zhí)枮?00380102757.1、發(fā)明名稱為"利用超聲波處理液體介質(zhì)以防止過度增殖或感染細胞生長的設(shè)備與方法"的發(fā)明專利申請的分案申請。:仗術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及利用高頻、<氐能超聲；皮來處理'液體介質(zhì).在具體實施方案中，本發(fā)明的設(shè)備和方法能夠顯著"i秀導(dǎo)懸浮在生理液體中的細胞凋亡，
背景技術(shù)：
細刀包在暴露于超聲波中可引起損傷.例如，超聲波能夠引起不可逆的細月包損傷和誘導(dǎo)破壞性的細胞膜的改變。某些凈艮道提出，由產(chǎn)生自聲壓場(acousticpressurefields)的氣;包崩解引4i的空穴作用可能是超聲波-悟4H乍用后引起細胞損傷的原因，同時還提出，通過殘留的過氧化氬作用-造成的空穴作用可誘導(dǎo)DNA單鏈的斷裂、.超聲波在癌癥治療中的應(yīng)用已經(jīng)成為一個重要的方面,.超聲波-通常與高溫、以及光、放射和化療聯(lián)合《吏用。已知惡,f生細胞比其對應(yīng)的正常細胞-于這些聯(lián)合治療更加敏感.對某些分子(例如，經(jīng)典的光敏劑和聲^t劑)的直接輻射作用(例如，超聲波、激光、光照)產(chǎn)生諸如單線態(tài)氣、超氧自由基、過氧化氫和脂肪酸自由基的高活性氧類，其能夠選摔地作用于惡'f生細胞從而在癌癥治療中發(fā)4軍重要作用.才艮據(jù)放射的來源，上述治療稱為PDT(光能治療)，或者如果通過超聲波或聲致發(fā)光則稱為SDT(聲能治療)。這兩種治療都預(yù)先需要光敏劑的力口入.盡管在細月包生存能力方面通過SDT和PDT產(chǎn)生的總的作用不同，<旦SDT(特別是涉及超聲波空穴作用活性)和PDT均產(chǎn)生活性氧化類物質(zhì)并導(dǎo)5丈細月包內(nèi)石充醇水平的降4氐。在4吏用紫外線-A(UVA)的PDT時，單線態(tài)氧的產(chǎn)生能夠誘導(dǎo)T輔助細力包的凋亡，但是該作用必須依賴光敏劑(PS)的起始濃度和局部氧的舍量。對于SDT,因有高能量參與，細胞裂解為主要的現(xiàn)象，這可能會掩蓋對活存細月包的其它作用Umemura等的美國專利笫4,971,991號公開了利用超聲波治療腫瘤細月包，《旦其依賴較髙的超聲；皮功率電平，并沒有4結(jié)述拔i泡的應(yīng)用。i者如D，Arrigo的美國專利第5,215,680號的其它專利描述了超聲波和微泡，其依賴于超聲波的空穴作用和熱作用來治療腫瘤，與治療單獨的癌癥細月包相對比，由治療持續(xù)時間和數(shù)量來確定其治療的范圍。這種類型的治療^f吏用高能量和長時間的輻射，主要產(chǎn)生細胞的裂解和壞死。參見Kondo,CancerLetters178(1),63-70,(2002)。附圖的簡要說明圖1所示為本發(fā)明所述的超聲波處理設(shè)備的一個實施方案。圖2所示為利用超聲波和微泡處理懸浮液中過度增殖細胞的設(shè)備的三種視圖。最左側(cè)圖為所述設(shè)備的俯視圖，中間圖為主視圖，及最右側(cè)圖為所述設(shè)備的側(cè)視圖。圖3所示為超聲波處理對細胞谷胱甘肽水平作用的柱狀圖。數(shù)據(jù)以相對于未處理細胞表現(xiàn)出谷胱甘肽水平的細胞的百分比來表示。數(shù)值是3個獨立實驗的平均值±標準誤。圖4所示為表示高頻超聲波對細胞caspase-3活性作用的柱狀圖。圖5所示為輻射對K562細胞克隆效率作用的柱狀圖。結(jié)杲以3個獨立試'驗的平均值±標準誤表示。圖6所示為經(jīng)1次或3次超聲波處理后5小時K562凋亡細胞的百分率柱狀圖。用Annexin-V標記后由流式細胞計量儀測定凋亡比值，并且結(jié)果以7個獨立實驗的平均值士標準誤表示。圖7所示為磷脂酰絲氨酸分布依據(jù)時間和連續(xù)的超聲波處理而變化的點圖。來自一個^表性實-驗的結(jié)果以凈皮Annexin-V-FITC標記的纟田胞的百分率表示。圖8所示為超聲波處理對正常單核細月包(MNC)和白血病細胞(Nalm-6、KGIa、HL-60細胞和來自5例患者的原代白血病細胞)凋亡作用的柱狀圖。結(jié)果為5個獨立實驗的平均值土標準誤。發(fā)明的詳細描述凋亡或程序性細胞死亡是多細胞器官發(fā)育和健康的正常組成部分。凋亡保證了組織在發(fā)育、宿主防御、衰老和對包括7輻射和紫外暴露的多種信號產(chǎn)生反應(yīng)過程中的自我平衡。細胞響應(yīng)各種刺激而發(fā)生的死亡，特別是在凋亡過程中，這種死亡是以受控方式進行的。這使得凋亡不同于另一種稱為壞死的細胞死亡形式，在壞死中不能控制的細胞死亡導(dǎo)致細胞的裂解、炎癥反應(yīng)以及可能發(fā)生各種健康問題。相反，凋亡是細胞在其自我死亡的中能夠發(fā)揮活性作用的過程，這是為什么凋亡常稱為細胞自殺的原因。當接收到特異信號指示細胞發(fā)生凋亡時，通常在細胞中發(fā)生了一系列特殊的生化和形態(tài)學(xué)變化。例如，在凋亡早期通常有稱為caspases的蛋白家族被活化。這些蛋白分解或裂解正常細胞功能所必需的關(guān)鍵細胞底物，包括細月包支架中的結(jié)構(gòu)蛋白和諸如DNA修復(fù)酶的核蛋白。Caspases也能活化其它的諸如裂解核中DNA的DNase酶的降解酶。通常，凋亡細胞的死亡以核膜的早期變化、染色質(zhì)凝集以及DNA片斷化為特征。這些生化改變導(dǎo)致細胞的形態(tài)學(xué)變化。本發(fā)明的教導(dǎo)涉及壓制、防止液體介質(zhì)中存在的過度增殖細胞(例如，腫瘤細胞)生長或清除這些細胞的設(shè)備和方法。在更具體的實施方案中，本發(fā)明提供的方法和設(shè)備誘導(dǎo)諸如生理液體的懸浮液中過度增殖細胞的凋亡?？商幚淼纳硪后w包4舌血液、血漿、血清及腦脊液，其能夠從包括哺乳動物、人等等的動物中提取和/或給予該動物。才艮據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)的低能量、高頻率超聲波處理能夠誘導(dǎo)過度增殖細胞的凋亡作用。這些作用包括例如，對線粒體膜的作用(線粒體電位的降低)、磷脂酰絲氨酸不對稱性的喪失、激發(fā)膜脂質(zhì)的氧化作用(細胞GSH水平的降低)、形態(tài)學(xué)改變、DNA片,殳化、漿膜缺失等等。此外，低能量超聲波誘導(dǎo)的凋亡可參與細胞中caspase-3活化、caspase底物PARP的蛋白降解，以及6cZ-2/bax比值的調(diào)節(jié)。特定的實驗(參見實施例)已經(jīng)證實在快速誘導(dǎo)凋亡的同時產(chǎn)生有限的壞死數(shù)量。i殳備與方法能夠用于實現(xiàn)本發(fā)明方法的所述設(shè)備的實施方案能夠在Cordemans等的美國臨時申請第60/423,368號、美國申請第10/358445號以及美國專利第6,540,922號中發(fā)現(xiàn)，其中的每一篇均全部引用作為本文的參考。處理過度增殖細胞方法可利用本發(fā)明公開的設(shè)備來進行。一個能夠用于處理諸如水性介質(zhì)(例如，生理性液體)的液體介質(zhì)設(shè)備的特定實施方案如圖1所示。在某些的實施方案中，所述被處理的液體含有過度增殖細胞。在其它的實施方案中，所述被處理的液體可以是例如i夢斷后懷疑含有過度增殖細胞的生理性液體。也可以處理諸如干細胞的不完全分化細胞以及含有病毒和/或病毒感染的細胞的溶液?？商幚淼牟《镜睦影ɡ鏗IV、HCV、HBV、皰滲病毒、漢他病毒(hantavirus)、流感病毒及埃博拉病毒》參照圖1，本發(fā)明所述的設(shè)備包括隔室2,優(yōu)選呈圓柱形或矩形橫截面。在特定的實施方案中，所述隔室2與裝載待處理的液體介質(zhì)儲存器(未顯示)連接。在其它的實施方案中(例如，當人或動物生理性液體浮皮處理時)，本發(fā)明所提供的設(shè)備不含有直接與人或動物體連接的儲存器。這些實施方案包括那些其中包括在人和其它動物體的離體處理過程中所述生理性液體被提取和/或被給予(例如，再注射)的方案。據(jù)此，諸如人的動物能夠被本發(fā)明所指的任何"儲存器"所取代。在其它實施方案中，如所示圖2的設(shè)備能夠處理過度增殖細胞懸浮液。在此實施方案中，空氣進入管3用作微泡發(fā)射器3來發(fā)射微泡5進入包含在隔室(或poach)20中的所述過度增殖細胞懸浮液22?？蓪⒑兴黾毎麘腋∫?2的所述隔室(或poach)20浸入諸如恒溫箱的水浴24中。在進一步的實施方案中，所述隔室2含有(例如，沿其壁或在其底部附近)一種或多種高頻超聲波發(fā)射器1，其發(fā)射超聲波4進入所述的隔室2(有利地應(yīng)朝向此隔室2的中央)。在其它的實施方案中，所述容器還具有一種或多種^L泡發(fā)射器3來發(fā)射氣體微泡5，其被設(shè)計成發(fā)射所述氣體微泡5進入超聲波4發(fā)射到隔室2中的區(qū)域。本發(fā)明所用術(shù)語"微泡"特指平均直徑小于lmni的氣泡。在一些實施方案中，所述直徑小于或等于50/mi。而在其它的實施方案中，所述微泡直徑小于30jwn。在某些的實施方案中，所述微泡選自空氣、氧和臭氧或其混合微泡。為了降低操作成本，能夠使用諸如空氣微泡的非臭氧微泡是有利的。本發(fā)明有利的實施方案不依賴于產(chǎn)生熱效應(yīng)來處理細胞。盡管在特定的實施方案中使用穩(wěn)定的微泡能夠有效地處理細胞，但在優(yōu)選的實施方案中，使用的穩(wěn)定的^:泡不是必需的。穩(wěn)定微泡的一個例子是月旨質(zhì)邊界(lipidboimdary)微泡。術(shù)語"過度增殖細胞"意指以相對較高水平分化、再生或增殖的細胞，并可包括癌癥細胞(例如，白血病細胞)、前癌細胞、腫瘤細胞、骨髓細胞及全能細胞。在某些實施方案中，術(shù)語"液體介質(zhì)"涉及生理性液體，其可給予人或動物和/或從人或動物中提取。在具體的實施方案中，將生理性液體處理后進行再注射(例如，體外處理再回輸)。在某些實施方案中，所述術(shù)語"生理性、液體"包括《旦不限于血、液、血清、腦脊髓液、腦脊液、血漿等等。Tachibana等發(fā)表的美國專利第5,401,237號描述了提取和再給予生理性液體的步驟，其全部在此引用作為本文的參考。在具體的實施方案中，本發(fā)明所述方法和設(shè)備包括用低能高頻超聲波處理過度增殖細胞。術(shù)語"高頻"意指高于100kHz并高達數(shù)MHz的頻率。在某些的實施方案中，所使用的高頻在200kHz與20MHz之間。在不同的實施方案中，所述的超聲波頻率選自200kHz與10MHz之間。在優(yōu)選的實施方案中，所用頻率在200kHz與1.8MHz之間。在本發(fā)明所述設(shè)備的多種實施方案中，將用來發(fā)射氣體微泡5的微泡發(fā)射器3置于隔室2的底部ll(即在隔室2的基底部)，使得所述微泡通過自然上升或通過在所述液體流對氣體的夾帶來移動。在進一步的實施方案中，本發(fā)明所述設(shè)備和方法誘導(dǎo)過度增殖細胞的凋亡。已發(fā)現(xiàn)，健康細胞比白血病細胞對高頻超聲波更加不敏感。這種健康與白血病細胞間的行為差異與內(nèi)源性光敏劑的分布差異無關(guān)，但其可能是由例如p53狀態(tài)、信號途徑以及氧化應(yīng)激的耐受性的基礎(chǔ)細胞機制改變所引起。特別地，能夠請導(dǎo)癌癥細胞(例如，白血病細胞)、前癌細胞、胂瘤細胞、骨髓細胞及全能細胞等等的凋亡。雖然本發(fā)明的教導(dǎo)不能在任何方式上受其準確的作用機制的限制，但在更具體的實施方案中，本發(fā)明所述的設(shè)備和方法能夠產(chǎn)生諸如ROS(活性氧類)、H'、'OH及HOO'的自由基，其還可形成H202,該分子和/或這些自由基對過度增殖細胞具有毒性并因此使其失活和/或破壞。產(chǎn)生自超聲波狀態(tài)下的氧化應(yīng)激作用的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物也可能是此生物機制的潛在參與者。盡管證據(jù)不支持在聲能治療中有單線態(tài)氧的形成，但這些數(shù)據(jù)僅符合長時間和"高能量"超聲波暴露狀況，其可直接由于高溫分解或者由于與水溶劑的高溫分解所形成的H'或'OH自由基反應(yīng)導(dǎo)致敏化劑衍生的自由基的累積。使用所公開的方法和設(shè)備產(chǎn)生的物質(zhì)應(yīng)理解為衍生自高頻超聲波對水分子作用引起的反應(yīng)，最有可能的是如下的反應(yīng)(特別是在氧的存在下)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>有利地，如本發(fā)明所迷，如果此過程有微泡存在，產(chǎn)生這些毒性物質(zhì)所需的能量會降低。在確定的實施方案中，發(fā)生器被設(shè)計成能夠向所述超聲波發(fā)射器提供低于1W/cr^的能量。在優(yōu)選的實施方案中，所提供的能量約為0.5W/cn^或更低，或者在許多更有利的實施方案中，所述能量約為0.25W/cn^或更低。在有利的實施方案中，此應(yīng)用于發(fā)射器的功率電平在所述生理性液體體積中消耗的能量低于30mW/cm3。在一些實施方案中，所述能量消耗約為7mW/cm3。盡管在某些實施方案中可連續(xù)給予所述超聲波，但在其它的實施方案中，所述超聲波以開/關(guān)循環(huán)間斷給予。根據(jù)細胞體積、細胞類型和其它相關(guān)變量，本領(lǐng)域所述技術(shù)人員可確定有效的開/關(guān)循環(huán)時間。本發(fā)明教導(dǎo)的進一步實施方案涉及處理懸浮液中的過度增殖細胞，而不是腫瘤或瘤體。在這些實施方案中，本發(fā)明的教導(dǎo)不依賴微泡在特定的腫瘤位點來濃縮或匯集。這使得能夠處理沒有叢生在一起的不需要的過度增殖細胞。本發(fā)明所提供方法和設(shè)備的另一個優(yōu)點是在較短的時間內(nèi)可有效處理所述的過度增殖細胞。在特定的實施方案中，在1分鐘內(nèi)能夠處理過度增殖細胞。在更特定的實施方案中，所述細胞在30秒內(nèi)被處理，例如包括5-20秒之間。如本領(lǐng)域所公知，超聲波作用的生物物理方式分為具有熱、空穴作用或者具有非熱和非空穴作用。需要指出的是使用上述能量范圍和縮短處理時間可避免顯著的液體和/或細胞受熱，這使得不發(fā)生熱致細胞死亡。作為例子，非熱作用處理包括在低于40°C、35。C及30。C下進行的處理。所述功率電平同樣是不發(fā)生明顯程度的空穴作用的水平，從而基本避免由超聲波引起的細胞膜損失。最近發(fā)現(xiàn)，在較高超聲波能量下微泡注入到超聲波區(qū)域通過微泡在超聲波誘導(dǎo)空穴泡上的疊加作用引起聲致發(fā)光現(xiàn)象的增加，可使激發(fā)和有毒的物質(zhì)的數(shù)量增多。當超聲波處理協(xié)同結(jié)合適合大小的微泡存在下，能夠在宏觀水平觀察到此現(xiàn)象。在另外的實施方案中，因為觀察到該處理系統(tǒng)通過將原位形成的產(chǎn)物(例如形成的自由基和11202)向待處理的水性介質(zhì)的儲存器6的擴散來發(fā)揮功能，所以本發(fā)明提供的所述設(shè)備和方法具有不需將超聲波射入特定區(qū)域的優(yōu)點。在進一步的實施方案中，在本發(fā)明所述設(shè)備中的所述的一種或多種超聲波4發(fā)射器1定向成不產(chǎn)生任何駐波現(xiàn)象。例如，在某些實施方案中，一種或多種超聲波發(fā)射器相對于所述隔室2的軸9并相對于液體流和微泡流5斜向定向(不垂直于此軸9的銳角)(參見圖1)。這種特征使在隔室2中的所有微泡5以統(tǒng)計學(xué)上一致的方式被處理，而不在隔室2中產(chǎn)生靜止帶。本發(fā)明所述的設(shè)備和方法可包括發(fā)射具有平均直徑小于1mm的氣體樣i泡進入被處理液體介質(zhì)的高頻超聲波區(qū)域。在一些實施方案中，所述微泡的直徑小于或等于50/mi。在另外的實施方案中，所述微泡的直徑小于30/mi。在某些的實施方案中，所述微泡選自空氣、氧和臭氧微泡。在其它的實施方案中，所述微泡是非臭氧微泡。根據(jù)其它的實施方案，本發(fā)明所述設(shè)備和方法包括光發(fā)射器12(即電磁輻射發(fā)射器)，其發(fā)射主要為可見范圍頻率的輻射進入隔室2中的所述超聲波4區(qū)域。然而，對于特定的應(yīng)用，為了去除某些特定的過度增殖細胞，發(fā)射主要為非可見頻率的電磁輻射是有利的，如紫外線(例如，UVA、UVB或UVC型)、紅外、激光、微波等等。最近意外地發(fā)現(xiàn)，包括微泡發(fā)射進入所述區(qū)域，結(jié)合有超聲波和可選擇的光輻射對失活和去除諸如生理性液體的液體介質(zhì)中的過度增殖細胞特別有效。發(fā)光現(xiàn)象能夠促進超活化氧化物質(zhì)諸如過氧化自由基或單線態(tài)氧的產(chǎn)生，其能夠?qū)е聦δ承┻^度增殖細胞具有超毒性的一系列生化反應(yīng)。在有利的實施方案中，所迷的輻射以開/關(guān)循環(huán)間斷發(fā)射。在更具體的實施方案中，所述開/關(guān)循環(huán)周期約為5.5ms/3ms。已知在所謂敏化分子(例如，光敏劑和聲^:劑)的存在下能夠產(chǎn)生發(fā)光，使得在某些癌癥細胞中產(chǎn)生抗腫瘤作用。這種分子包括卟啉、氯、四環(huán)素類、亞曱基蘭、熒光素、吖啶、若丹明(rhodamine)等等.可將這些活性試劑注射入有機體或口服給藥并隨后由聲致發(fā)光來活化?；罨?，這些試劑產(chǎn)生單線態(tài)氧，其進而發(fā)揮基礎(chǔ)作用，特別是在由氧化應(yīng)激產(chǎn)生的生化過程中發(fā)揮基礎(chǔ)作用。特別地，單線態(tài)氧能夠氧化各種細胞成分，例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、氨基酸和核酸。在其它的實施方案中，固體微粒和固體表面能夠用來協(xié)同增強輻射的發(fā)光和/或發(fā)射。這些固體包括例如Ti02、陶土和陶瓷。許多實施方案涉及不需要附加化學(xué)產(chǎn)物的i殳備和方法，該化學(xué)產(chǎn)物_清如用來壓制、防止生理性介質(zhì)中過度增殖細胞生長和/或去除該細胞的光4史劑和/或聲敏劑。由于意外地發(fā)現(xiàn)已經(jīng)含有這些光敏分子的生理性液體(例如，血液)中的某些過度增殖細胞(例如白血病細胞)能夠原位產(chǎn)生發(fā)光，因此將光敏劑或聲敏劑加入到所述的液體介質(zhì)中并不總是必要的。盡管本發(fā)明所述的設(shè)備和方法能與其它諸如光敏劑、聲敏劑、化療劑、抗生素、抗病毒藥物的藥物聯(lián)合使用，但需指出的是，本發(fā)明所提供的處理過度增殖細胞的方法和設(shè)備的有效性并不依賴于其它化學(xué)藥品、反應(yīng)試劑或藥物的使用。因此，本發(fā)明所述方法和設(shè)備能夠在沒有其它物質(zhì)條件下使用，該物質(zhì)包括化學(xué)藥品、反應(yīng)試劑、激素、肽、蛋白質(zhì)、核酸、碳氫化合物、DNA疫苗、血管生成剌激劑或藥物。在更多具體地實施方案中，本發(fā)明的教導(dǎo)不依賴于細胞對這些物質(zhì)的吸收。特別地，在不需要典型的光敏劑和聲敏劑的條件下可實現(xiàn)本發(fā)明教導(dǎo)所得到的效果。利用諸如PDT的技術(shù)獲得的生理作用同時依賴于所使用的輻射劑量、使用光敏劑的特性、它們的含量以及它們的分布。盡管進行傳統(tǒng)的處理需要敏化劑，但本發(fā)明提供的教導(dǎo)不需要敏化劑，因此相對簡化所述的方法和設(shè)備。在某些實施方案中，超聲波作用的凈效果與結(jié)構(gòu)中局部含有較高含量的內(nèi)源性光敏劑相關(guān)聯(lián)。例如，內(nèi)源性光敏劑主要分布在諸如溶酶體、線粒體、核膜、高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒體的膜結(jié)構(gòu)中，其相對的表面占細胞膜表面的接近50%。在一些實施方案中，本發(fā)明所述設(shè)備和方法包括循環(huán)所述液體介質(zhì)的泵，以及一種或多種優(yōu)選通過過濾、離心或沉淀(例如旋轉(zhuǎn)等等)用于恢復(fù)所述液體介質(zhì)中存在的過度增殖細胞的裝置。在某些實施方案中，將所述用于恢復(fù)的泵和/或恢復(fù)裝置被置于所述含有所述待處理液體介質(zhì)的儲存器(或動物)與所述隔室2之間。在某些實施方案中，本發(fā)明所述設(shè)備和方法能夠用來從懷疑患有(例如，i會斷的)癌癥(例如，白血病)的個體中提取生理性液體(例如，血液)。在提取后，能夠用高頻低能超聲波和直徑小于1mm的氣體微泡處理該生理性液體。在某些實施方案中，所述方法誘導(dǎo)所述癌性細胞(例如，白血防止生長或被去除后，所述液體隨后、能夠給予戶^述的個體。這些方法以與其它的體外處理再回輸?shù)姆椒ㄏ嗨频姆绞竭M行，例如血液透析?？蓪⑦M行血液處理個體與本發(fā)明所述的設(shè)備中的一種相連接。根據(jù)某些實施方案，可通過所述個體手臂內(nèi)部的瘺管將其血流連接到本發(fā)明所述的超聲波設(shè)備上。這包含了動脈與靜脈間的手術(shù)性連接。當它們連接后，從動脈而來的較強的血流會引起靜脈變粗?？蓪⑨槻迦朐龃值撵o脈中來將所述個體與所述超聲波設(shè)備連接起來。提供進入血流的另一種方式是插入內(nèi)在的移植物。在此步驟中，用;改置在皮下的一)殳特殊的短管將動脈與靜脈手術(shù)連接，針能夠插入該短管。在其它的實施方案中，當有必要快速到達所述的血流時，或者例如當所述手臂中的所述靜脈太小不能提供足夠的用于超聲波處理的血液時，可使用某些靜脈導(dǎo)管。在此步驟中，軟管被手術(shù)插入頸部或近鎖骨處的大靜脈中。在一些實施方案中，在持久的進入位點就緒之前該方法是臨時的。能夠根據(jù)本發(fā)明所述的方法處理的個體包括任何動物，例如包括人小鼠、猴子、狗、豬等等的哺乳動物。在進一步的實施方案中，本發(fā)明所述設(shè)備和方法利用低能、高頻超聲波通過誘導(dǎo)細胞(例如白血病細胞)的凋亡來預(yù)防、治療或壓制過度增殖細胞。誘導(dǎo)過度增殖細胞的凋亡能夠引起一系列特征后果，包括線粒體電位的降低、磷脂酰絲氨酸不對稱性的喪失、形態(tài)學(xué)改變、DNA片段化、漿膜缺失等等。此外，低能超聲波誘導(dǎo)的凋亡能夠包含細胞中的caspase-3活化、caspase底物PARP的蛋白降解以及bcl-2/bax比值的調(diào)整。附加的方法包括利用超聲波誘導(dǎo)的聲化學(xué)發(fā)光，通過直接的光輻射激發(fā)光敏性單線態(tài)氧產(chǎn)物來啟動凋亡。在典型的超聲波輻射條件下，所述直接的破壞性空穴作用在該聲致發(fā)光中起主導(dǎo)作用，其在所迷介質(zhì)中沒有介入空氣/液體界面時相當弱。據(jù)此，為增強空穴作用中的發(fā)光，聯(lián)合使用微泡與超聲波是有利的。以下的實施例描述了利用高頻低能超聲波處理，以及顯示所述細胞凋亡存在的各種分析。實施例1細胞的制備與高頻超聲波處理將從美國典型培養(yǎng)物貯藏中心(ATCC,Rockville,MD,美國)獲得的人白血病細胞抹(K562、Nalm-6、KGla及HL-60)培育在含有10%胎牛血清(Gibco,GrandIsland,NY，美國)和1%L-谷酰胺(Gibco)的RPMI-1640(BioWhittaker,Walkersville,MD,美國)中。收集白血病細胞，以磷酸鹽緩沖液(PBS,pH-7.2,Gibco)重懸，并立即用于實驗。從健康志愿者和白血病患者中獲得肝素化的靜脈血液。通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心(InternationalMedicalProducts,Brussels,Belgium)來分離單核細胞。以下描述了對所述細胞的超聲處理。通過頻率為1.8MHz的超聲波、7mW/mL的聲能、以5.5ms/3ms的輻射周期(開/關(guān))在不同暴露時間下處理人白血病細胞抹(K562、HL-60、KGla及Nalm-6)、原代白血病細胞以及正常單核細胞。在培養(yǎng)箱(37°0和5%C02)中培養(yǎng)18小時后，通過臺盼藍排除分析可成功地檢測所述細胞的存活。在以下的實施例中將詳細描述對所述處理的細胞進行的其它實-驗。通過細胞形態(tài)學(xué)、磷脂酰絲氨酸暴露及DNA片段化來評價細胞凋亡。通過流式細胞計量儀來檢測線粒體電位、谷酰胺含量、caspase-3活化作用、PARP降解以及bcl-2/bax比值。在甲基纖維素中評價克隆效率。實施例2高頻超聲波對DNA片段化的作用DNA片段化與凋亡相關(guān)。根據(jù)Nicoletti,I.etal./7m,"畫/Me〃w^139(2):271(1991)所述的方法及ApotargetQuickDNALadder檢測試劑盒(Biosource)對含有降解DNA的細胞進行定量。將細胞團(106細胞)重懸浮在20L的裂解緩沖液中并根據(jù)廠商說明書來抽提DNA。通過凝膠電泳(P/0瓊脂糖)分離DNA后進行分析。作為陽性對照，將平板直接放置在UV發(fā)光器下IO分鐘(強度為5mW/cm"利用UV光照射細胞。隨后，在評價凋亡之前，將細胞培養(yǎng)在37。C、5和18小時。在通透化后，將細胞在含有PI和RNAse(CoulterDNA-prep反應(yīng)劑)溶液中孵育。在進行流式細胞計量4義鑒定與凋亡對應(yīng)的亞G0峰之前，將該小管在4。C放置在黑暗中過夜。在經(jīng)紫外光(陽性對照)和超聲波處理細胞的DNA樣品中觀察到典型的核小體DNA梯狀帶形式。超聲波處理5小時后幾乎沒有可見的內(nèi)部核小體DNA降解但在18小時以后變得清晰可見(結(jié)果未顯示)。此外，處理5小時后用PI染色可觀察到具有片段化DNA的核的數(shù)量的增加。具體地，15%的所述處理細胞具有片段化DNA,而2%未處理的細胞具有片段化DNA(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例3高頻超聲波對線粒體跨膜電位的作用在細胞凋亡的一些類型中，觀察到了早于發(fā)展的DNA片段化的線粒體跨膜電位(AYm)的早期中斷。通過以下的分析來測定高頻超聲波處理對△Yw的作用。根據(jù)A.Macho,etal.，別ood.86(7):2481(1995)發(fā)表的步驟在細胞處理后即刻利用與陽離子熒光染料DiOC6的結(jié)合來估計線粒體電位。簡而言之，將K562細胞(l()6/mL)與2.5nmol/L的3，3'-二己基氧羰花青(DiOC6;分子探4十，Eugene,OR)在37。C孵育15分鐘，隨后用流式細胞計量儀來分析。超聲波處理伴隨著顯示較低的AY,"的細胞群的增加(結(jié)果未提供)。在處理后30分鐘發(fā)現(xiàn)顯示與DiOC6結(jié)合減少的細胞群，并且在超聲波處理后5小時線粒體電位的降低非常清楚，超過50°/。的細胞具有較低的厶Yw。這些結(jié)果提供了細胞凋亡的證據(jù)。實施例4高頻超聲波對細胞谷胱甘肽水平的作用已表明在凋亡過程中有谷胱甘肽的丟失。在超聲波處理后進行了測定細胞谷胱甘肽含量的分析。如D.W.Hedleyetal.C)^w^715:349(1994)所述，使用細胞示蹤綠CMFDA(5-氯甲基熒光素二乙酸酯；分子探4十)來測定細胞內(nèi)谷胱甘肽水平。如圖3所示，與未處理細胞相比，在超聲波處理后直接出現(xiàn)顯示出較低GSH水平的亞群(〉50。/。的細胞顯示低水平GSH)。連續(xù)處理的結(jié)果顯示，5小時后較多的GSH丟失。這些結(jié)果與未處理細胞比較，以顯示GSH水平的細胞百分比來表示，清楚地表明高頻超聲波處理與GSH丟失相關(guān)。實施例5高頻超聲波對細胞caspase-3活性的作用已表明Caspase-3在化療誘導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮重要作用。具體地，caspases的活化作用通過諸如肌動蛋白、凝溶膠蛋白或PARP的細胞底物的降解可導(dǎo)致細胞死亡。為直接證實caspase-3在超聲波誘導(dǎo)凋亡中的參與作用，利用流式細胞計量儀和比色分析測定了caspase的活性。具體地，利用具有抗caspase-3單克隆抗體活性的與藻紅蛋白(PE)結(jié)合的多克隆兔抗體(BD-Pharmingen，SanDiego，CA，美國)，通過流式細月包計量儀來測定caspase-3。室溫下利用固定與通透試劑盒(Caltag,Burlingame,CA)固定和通透化細胞15分鐘。隨后用抗caspase-3抗體標記細月包并孵育15分鐘。洗滌細胞并通過流式細胞計量儀來分析。根據(jù)廠商建;義，利用Apotarget的caspase-3/cpp32/比色蛋白酶分4斤試劑盒(Biosource)測定caspase-3酶活性。也可以通過PARP降解，利用兔抗PARP降解位點AB與FITC結(jié)合(Biosource)來間接評價Caspase-3活性。如圖4所示，高頻超聲波處理導(dǎo)致caspase-3的活化。此外，在處理后1小時此蛋白酶的活性達最高。而且，在處理后2小時PARP的降解明顯，有40。/。的細胞被兔抗-PARPFITC標記，與之相比只有5%的未處理細月包纟皮標記(結(jié)果未顯示)。實施例6高頻超聲波^t"細胞BCL-2/BAX比值的作用已表明bcl-2家族的不同蛋白在啟動和防止凋亡中有作用。進行以下的分析來測定bcl-2家族的兩個主要成員bc卜2與bax是否參與了超聲波對凋亡的誘導(dǎo)作用。通透化后，細胞與同型匹配陰性對照、FITC標記小鼠4元人bcl-2(Dako，Glostrup，Denmark)、以及抗bax的多克隆兔抗體一同孵育。隨后將FITC標記的第二抗體(Dako)加入到bax。為確定bc-2與bax的表達量，通過用已知4、量的熒光染料標記的顆粒混合物(Dako)來標準化所述的細胞計量儀。隨后利用標準曲線將熒光強度平均值(MFI)轉(zhuǎn)化為等價的可溶性熒光染料的摩爾數(shù)(MESF)。結(jié)果(數(shù)據(jù)未提供)顯示，未處理的細胞表達高氷平的抗凋亡蛋白bcl-2蛋白((47士4)xl(^MESF),并且此表達以熒光單峰的形式出現(xiàn)。超聲波處理1小時后，bcl-2蛋白的表達已被下調(diào)(用超聲波進行1或3次處理的K562細胞中分別為(40士0.9)x103MESF和(32士0.9)x103MESF)。處理后兩小時，bcl-2表達出現(xiàn)明顯的雙峰，所述細胞表現(xiàn)出或者高bcl-2(與未處理細胞比較)表型或者低bcl-2((ll士2)xi03MESF)表型。與bcl-2相反，與未處理細胞比較，在超聲波處理的細胞中促凋亡蛋白bax的水平明顯增力口(處理和未處理的K562分別為(85土0.5)x103MESF和(48士5xl03MESF).因此，高頻超聲波處理過程中bcl-2/bax比值顯著降低，以此提供了細胞凋亡的證據(jù)(對照細胞為0.98而超聲波處理細胞為0.38)。實施例7高頻超聲波對細胞磷脂酰絲氨酸水平的作用在凋亡中，磷脂酰絲氨酸殘基從質(zhì)膜的內(nèi)面翻轉(zhuǎn)到外面，且此變化能夠利用結(jié)合PS殘基的Annexin-FITC來測定。以下描述了所進行的AnnexinV結(jié)合分才斤。依照廠商建i義，4吏用購買自BiosourceInternational(Camarillo,CA，美國)的試劑盒，對用Annexin-V-焚光素異硫氰酸酯(FITC)-和碘代吡咬(PI)-標記的細胞進行流式細胞計量儀分析，數(shù)據(jù)以顯示Annexin-V-FITC/碘代吡吱的平均焚光強度變化的點圖表示(未顯示)。結(jié)果表明，依據(jù)時間，磷脂酰絲氨酸分布隨時間的變化而不同。具體地，結(jié)果顯示細胞中經(jīng)超聲波處理引發(fā)的質(zhì)膜損傷呈現(xiàn)低百分比，這表明測試的超聲波處理的壞死作用是非常弱的。有意思的是，在處理兩小時后，，見察到了凋亡細^^的增加。處理五小時后，35%的細胞為Annexin-V-陽性，表明了超聲波誘導(dǎo)K562細胞凋亡的作用。實施例8高頻超聲波對克隆形成的作用對細胞存活力起作用的重要證據(jù)是細胞增殖和形成克隆的不能。以下描述了克隆形成分析，其針對K562細胞抹進行來測定高頻超聲波輻射對克隆形成效率的作用。簡而言之，培養(yǎng)基由含有20%FCS和終濃度為4%的甲基纖維素的IMDM構(gòu)成。在37。C、含5%C02的空氣中進行培養(yǎng)，且5天后計數(shù)克隆(>20個細胞)。K562細胞抹的克隆形成效率為16%。如圖5所示，在1和3次處理后，觀察到K562細胞的克隆形成效率顯著降低(分別抑制25%和42%)，證明了白血病細胞對高頻超聲波的敏感性。實施例9去氣劑對凋亡的作用進行以下步驟來測定由高頻超聲波產(chǎn)生的活性去氧劑對凋亡的誘導(dǎo)作用。用L-組氨酸(10mM)和/或甘露醇(100mM)孵育K562細胞.一些細胞用高頻超聲波處理而另一些不用。通過Annexin-V/PI分析測定細胞凋亡。結(jié)果見表l，表明在組氨酸和甘露醇存在下超聲波誘導(dǎo)的細胞凋亡明顯減少(通過3次連續(xù)處理i秀導(dǎo)的凋亡分別抑制43%和47%)。表1活性去氧劑對超聲波誘導(dǎo)的細^g包凋亡的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>(來自4個獨立實驗的平均值士標準誤)。甘露醇與組氨酸聯(lián)合可導(dǎo)致超過60%的凋亡抑制。這些試劑在降低由超聲波處理誘導(dǎo)的凋亡方面的有效性為超聲波誘導(dǎo)的單線態(tài)氧自由基和氫氧自由基是誘導(dǎo)凋亡的重要介導(dǎo)劑提供了證據(jù)。實施例10連續(xù)高頻超聲波處理對細胞的作用對超聲波處理后培養(yǎng)0.5、2和5小時的K562細胞重復(fù)進行了流式細胞計量儀的分析。一次處理后，觀察到凋亡細胞的水平是對照的三倍(處理和未處理細胞培養(yǎng)5小時后分別為26%和8%)。還觀察到有5-10%的壞死作用，其顯著低于利用藥物處理和光能處理(PDT)時所觀察到的。通過連續(xù)的輻射，在相同的條件(7mW/mL,20秒)以及在不同的間隔下，在l和3次連續(xù)的處理后，K562細胞的凋亡分別增加至37士3%(p〈0.02)和49±5%(p<0.02)(圖6)。連續(xù)處理后還觀察了形態(tài)學(xué)的變化(例如，細胞皺縮、膜出泡、染色質(zhì)凝集)(結(jié)果未顯示)。圖7顯示，在連續(xù)高頻超聲波處理后通過Annexin-V分析檢測的細胞磷脂酰絲氨酸含量增加。一實施例11高頻超聲波對不同細胞株的作用除K562之外，檢測了超聲波處理對其它正常和惡性細胞林的作用，包括KGla(最小分化幼稚急性髓性白血病母細胞)、HL-60(前髓白血病細胞)和Nalm-6(ALL細胞抹)。結(jié)果如圖8所示，表明對超聲波的敏感性依賴于細胞類型，但連續(xù)的處理導(dǎo)致所評價的所有細胞抹的凋亡細胞數(shù)量的顯著增加。還用超聲波處理了來自5例患者的單核細胞(l例有過量母細胞的難治貧血[RAEB]、1例繼發(fā)性急性髓性白血病[AML]、以及3例分類為M3、M4和M4Eo的AML法國-美國-英國[FAB])，并參照以往F.Lacombe，F(xiàn).etal.11:1878(1997)的描述，根據(jù)其CD45的表達可從污染了正常的細胞中區(qū)分母細胞。也可以通過FITC-Annexin對這些細胞中暴露的磷脂酰絲氨酸的識別對其進行標記。此方法使得經(jīng)超聲波處理的白血病母細胞和正常細胞的各自凋亡行為的比較成為可能。如圖8所示的結(jié)果表明，原代白血病細胞對超聲波處理敏感，3次處理后5小時觀察到的凋亡細胞超過37士18%。以上描述詳細闡述了本發(fā)明教導(dǎo)的某些實施方案。然而應(yīng)理解，雖然無論上文出現(xiàn)的描述有多詳細，本發(fā)明所迷的設(shè)備和方法能夠以多種方式來實施。同樣如上所述，應(yīng)指出的是，在描述本發(fā)明教導(dǎo)的某些特與該術(shù)語相關(guān)的包含本發(fā)明教導(dǎo)的特征和方面的任何特定的特性。因此本發(fā)明教導(dǎo)的范圍應(yīng)根據(jù)附具的權(quán)利要求及其任何等價物來解釋。權(quán)利要求1.處理液體介質(zhì)的設(shè)備，包括裝載液體介質(zhì)的隔室，所述液體介質(zhì)含有過度增殖、未分化或病毒感染的細胞的懸浮液；設(shè)計成將所述液體介質(zhì)暴露于高頻聲波的超聲波發(fā)射器，所述高頻聲波的頻率大于100kHz，能量小于30mW/cm3；及設(shè)計成將氣體發(fā)射到所述隔室中并發(fā)射到由所述超聲波發(fā)射器產(chǎn)生的超聲區(qū)域中的氣體發(fā)射器；其中所述隔室、所述超聲波發(fā)射器和所述氣體發(fā)射器設(shè)計成在所述細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡。2.如^L利要求1所述的設(shè)備，其中所述氣體選自空氣和氧氣。3.如權(quán)利要求l所述的設(shè)備，其中所述隔室含有從哺乳動物提取的生理性液4本。4.如權(quán)利要求l所述的設(shè)備，其中所述超聲波發(fā)射器位于所述隔室的底部。5.如權(quán)利要求l所述的設(shè)備，其中所述氣體發(fā)射器位于所述隔室的底部。6.如權(quán)利要求l所述的設(shè)備，其中所述超聲波發(fā)射器設(shè)計成將所述液體介質(zhì)暴露于頻率大于200kHz的高頻聲波。7.如權(quán)利要求6所述的設(shè)備，其中所述超聲波發(fā)射器設(shè)計成將所述液體介質(zhì)暴露于頻率大于300kHz的高頻聲波。8.如權(quán)利要求l所述的設(shè)備，其中所述隔室、超聲波發(fā)射器和氣體發(fā)射器進一步設(shè)計成不顯著地加熱所述液體即在所述細胞中誘導(dǎo)細月包凋亡。9.如權(quán)利要求l所述的設(shè)備，其中所述隔室、超聲波發(fā)射器和氣體發(fā)射器進一步設(shè)計成不引起顯著的空穴作用即在所述細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡。10.如權(quán)利要求l所述的設(shè)備，其進一步包括回收所述液體介質(zhì)中存在的過度增殖、未分化或病毒感染的細胞的裝置。11.如權(quán)利要求10所述的設(shè)備，其中所述回收過度增殖、未分化或病毒感染的細胞的裝置選自過濾器和旋力分離器。12.如權(quán)利要求〗所述的設(shè)備，其進一步包括設(shè)計成向所述超聲波發(fā)射器供給低于lW/C1T^的能量。13.如權(quán)利要求所述的設(shè)備，其中所述超聲波發(fā)射器設(shè)計成連續(xù)地或間斷地發(fā)射超聲波。14.如權(quán)利要求l所述的設(shè)備，其進一步包括電磁輻射發(fā)射器。15.如權(quán)利要求14所述的設(shè)備，其中所述電^f茲輻射發(fā)射器設(shè)計成在可見光范圍內(nèi)發(fā)光。16.如權(quán)利要求14所述的設(shè)備，其中所述電^f茲輻射發(fā)射器設(shè)計成在不可見光范圍內(nèi)發(fā)光。17.體外處理包含過度增殖、未分化或病毒感染的細胞的液體介質(zhì)的方法，該方法包4舌向所述液體介質(zhì)中注入高頻聲波，所述高頻聲波的頻率大于100kHz，能量小于30mW/cm3;及將氣體注入隔室中并注入通過所述超聲波發(fā)射器產(chǎn)生的超聲區(qū)域；其中暴露于所述氣體和超聲波在所述細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中暴露于所述氣體和超聲波不引起顯著的空穴作用即在所述細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡。19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中暴露于所述氣體和超聲波不顯著加熱所述液體介質(zhì)即在所述細胞中誘導(dǎo)細^^凋亡。20.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述氣體選自空氣和氣氣。21.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述液體介質(zhì)包括選自血液、血漿、血清和腦脊液的生理性液體。22.如權(quán)利要求17所述的方法，其進一步包括向所述超聲區(qū)域中發(fā)射電磁輻射。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述電磁輻射包括可見光范圍內(nèi)的光。24.如權(quán)利要求17所述的方法，其進一步包括向所述超聲波發(fā)射器供給低于lW/cit^的能量。25.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述過度增殖細胞選自癌細胞、骨髓細胞和全能細胞。全文摘要本發(fā)明公開了利用高頻、低能超聲波處理、防止生長及壓制液體介質(zhì)中過度增殖、未分化或病毒感染的細胞的設(shè)備和方法。文檔編號A61K41/00GK101125209SQ200710141028公開日2008年2月20日申請日期2003年11月4日優(yōu)先權(quán)日2002年11月4日發(fā)明者伊夫·卡尼韋,埃里克·D·科爾迪曼斯·德莫伊勒內(nèi)爾,鮑德溫·阿內(nèi)卡爾申請人:亞什蘭許可和知識產(chǎn)權(quán)有限公司