專利名稱：豬流感dna疫苗plga微球的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬流感DNA疫苗PLGA微球的制備工藝，屬于藥物緩釋 劑型方面的研究。
技術(shù)背景.-
豬流感是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一種豬的急性、傳染性呼吸道 疾病，傳播迅速，常引起急性呼吸道疾病暴發(fā)。因為豬流感病毒亞型較多、抗 原易發(fā)生變異和可在種間傳播，給流感疾病的預防乃至人類的健康帶來很多挑 戰(zhàn)。所以豬流感在人流感和禽流感之間發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，具有重大的公共衛(wèi)
DNA疫苗是將含有編碼抗原基因的真核表達質(zhì)粒直接接種體內(nèi)，在體內(nèi)表 達相應抗原刺激機體產(chǎn)生針對該抗原的免疫應答，產(chǎn)生保護性免疫。目前，DNA 疫苗大動物實驗、人體臨床實驗結(jié)果表明DNA疫苗存在著給藥劑量較大，生 物利用度低，免疫效果個體差異大，不夠理想的缺點，極大地阻礙了DNA疫苗 的研究進展。因此如何增強DNA疫苗的免疫效果、誘導產(chǎn)生粘膜免疫等課題是 當前DNA疫苗研究的國際熱點。如何在保證DNA疫苗的穩(wěn)定性、微球粒徑適 宜的前提下，提高載藥量和包封率是DNA疫苗PLGA微球制備中需要解決 的難題。目前，國外DNA疫苗微球給藥系統(tǒng)的研究發(fā)展十分迅速，取得了不少 階段性成果，有的已進入臨床實驗。國內(nèi)DNA疫苗在給藥系統(tǒng)方面的研究工作 開展較少，DNA疫苗可控緩釋微球給藥系統(tǒng)的研究則更少。DNA疫苗可控緩 釋微球給藥系統(tǒng)的研究結(jié)果已經(jīng)顯示出了巨大的應用潛力，微球給藥系統(tǒng)具有 靶向作用，對DNA疫苗具有保護作用，提高細胞轉(zhuǎn)運效率，提高免疫效果并可 口服和鼻腔給藥，誘導粘膜免疫等特點。因此，DNA疫苗可控緩釋微球給藥系 統(tǒng)是一個很好的給藥系統(tǒng)，經(jīng)過進一步的深入研究，必將產(chǎn)業(yè)化，促進DNA疾 苗在畜牧業(yè)和臨床的實際應用，屆時用于預防、治療、診斷動物和人的疾患， 將拯救諸多病畜或病者的生命或延長其壽命，其經(jīng)濟效益和社會效益無疑是巨 大的。普通DNA疫苗的作用特點是持續(xù)時間短，在體內(nèi)易被降解，不能夠?qū)崿F(xiàn)
3緩釋的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬流感DNA疫苗PLGA微球的制備工藝，及該 制備工藝的影響因素。
上述的目的通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)
豬流感DNA疫苗PLGA微球的制備工藝，其組成包括取初乳制成復乳， 將復乳轉(zhuǎn)移至燒杯中，磁力攪拌5小時，室溫條件下?lián)]干有機溶劑，離心10分 鐘，收集微球，用滅菌水洗滌，真空冷凍干燥即得豬流感DNA疫苗PLGA微 球。
所述的豬流感DNA疫苗PLGA微球的制備工藝，所述的取初乳制成復乳 為吸取含DNA的豬流感DNA疫苗水溶液作為內(nèi)水相，經(jīng)二氯甲烷溶解的PLGA 為油相，將所述的內(nèi)水相加至所述的油相中，超聲乳化后加入到聚乙烯醇中， 攪拌后得復乳。
所述的豬流感DNA疫苗PLGA微球的制備工藝，所述的復乳制作為吸取 含DNA重量份數(shù)為2的豬流感DNA疫苗水溶液作為內(nèi)水相，取重量份數(shù)為200 的PLGA，加入體積份數(shù)為5的二氯甲烷溶解完全，作為油相，將所述的內(nèi)水 相加至所述的油相中，冰浴條件下超聲乳化10秒，得初乳，在7000rpm轉(zhuǎn)速 下，將所得初乳加至體積份數(shù)為20的2%聚乙烯醇中，乳化器攪拌35秒后停止， 得復乳。
所述的豬流感DNA疫苗PLGA微球的制備工藝，將所得復乳轉(zhuǎn)移至燒杯 中，在200rpm轉(zhuǎn)速下磁力攪拌5小時，室溫條件下?lián)]干有機溶劑，在4000rpm 轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，收集微球，用滅菌水洗漆3次，真空冷凍干燥即得豬流感 DNA疫苗PLGA微球，所述的重量份數(shù)與體積份數(shù)對應單位為mg:ml。
本發(fā)明的有益效果
1.使用本方法制備的DNA疫苗微球在保證DNA疫苗穩(wěn)定性的條件下具有 較高的包封率，可以保持體內(nèi)最佳的藥物濃度，并且延長藥物作用的時間。因 此，可實現(xiàn)藥物的緩釋、靶向給藥，具有重要的理論價值和實際應用前景，用 于動物體或人體一些流行性疾病的預防、治療和診斷，市場規(guī)模巨大，必將創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟效益。
2.該制備方法具有工藝簡便、制備成本低、工藝重現(xiàn)性好、樣品需要量少, 較好保持了 DNA疫苗的活性等優(yōu)點，試驗篩選的處方和工藝也可放大到生產(chǎn)應 用，因而對產(chǎn)業(yè)化的應用具有指導意義。
本發(fā)明的
具體實施例方式
實施例l:
豬流感DNA疫苗PLGA微球的制備工藝，其組成包括初乳、復乳的制 作，所述的初乳制作為吸取含DNA重量份數(shù)為2的豬流感DNA疫苗水溶液作 為內(nèi)水相，取重量份數(shù)為200的PLGA,加入體積份數(shù)為5的二氯甲烷溶解完 全，作為油相，將所述的內(nèi)水相加至所述的油相中，冰浴條件下超聲乳化10秒， 得初乳，在7000rpm轉(zhuǎn)速下，將所得初乳加至體積份數(shù)為20的2%聚乙烯醇中， 乳化器攪拌35秒后停止，得復乳，將所得復乳轉(zhuǎn)移至燒杯中，在200rpm轉(zhuǎn)速 下磁力攪拌5小時，室溫條件下?lián)]干有機溶劑，在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心10分 鐘，收集微球，用滅菌水洗滌3次，真空冷凍干燥即得豬流感DNA疫苗PLGA 微球，所述的重量份數(shù)與體積份數(shù)對應單位為mg:inl。
采用復乳(wl/o/w2)-溶劑揮發(fā)法制備豬流感DNA疫苗PLGA (聚乳酸/ 羥基乙酸共聚物)微球，吸取DNA疫苗水溶液(含DNA2mg)，作為內(nèi)水相(wl); 稱取PLGA200mg，加入5mL 二氯甲烷溶解完全，作為油相(o);將內(nèi)水相加 至油相中，冰浴條件下超聲乳化10s，得初乳(wl/o);在7000rpm轉(zhuǎn)速下，將 初乳加至20mL2y。聚乙烯醇(PVA)中，乳化器攪拌35s后立即停止，得復乳 (wl/o/w2);復乳轉(zhuǎn)移至燒杯中，200rpm磁力攪拌5h，室溫條件下?lián)]干有機 溶劑，4000rpm離心10min，收集微球，用滅菌水冼滌3次，真空冷凍干燥即 得微球。由此方法制備的豬流感DNA疫苗PLGA微球在電鏡下觀察結(jié)果為大 小均勻，外形圓整，表面光滑，測得的微球粒徑在6-l(Him之間，微球的包封率 達到60%，載藥量達到5.5%。
微球制備工藝的影響因素
考察的影響囟素包括①超聲乳化的時間；②乳化器攪拌速度；③PVA的 濃度；④油相中PLGA的濃度(m/v);⑤DNA疫苗與PLGA的比例(mg/mg)。從DNA疫苗的穩(wěn)定性考察影響因素①
稱取PLGA25mg溶于0.75mL 二氯甲垸中，待完全溶解后，加入40ulDNA疫 苗水溶液，冰浴條件下超聲乳化時間分別為5s、 8s、 10s、 12s、 14s得初乳，加入 lmLTE， 2000rpm渦旋振蕩15min， 4000rpm離心lOmin，取上清10pL，瓊脂
糖電泳分析，結(jié)果表明，冰浴條件下超聲乳化時間為10s，初乳乳化效果較好且 DNA疫苗的降解不明顯。
從DNA疫苗的穩(wěn)定性考察影響因素②
稱取PLGA25mg溶于0.75mL 二氯甲烷中，待完全溶解后，加入40ulDNA疫 苗水溶液，冰浴條件下超聲乳化時間10s得初乳，分別在5000rpm， 6000rpm, 7000rpm, 8000rpm轉(zhuǎn)速下，將初乳加至20mL2。/o聚乙烯醇(PVA)中，得復 乳，200r/min磁力攪拌5h， 4000r/min離心10min，收集微球，用滅菌水洗滌 3次制備出在四種攪拌速度下的微球，向收集的微球中加入2mL 二氯甲烷使微 球完全溶解，溶解后加入5mLPBS，渦旋振蕩30min， 4000rpm離心10min，取 上清10pL，瓊脂糖電泳分析，結(jié)果表明，攪拌速度在7000rpm乳化效果較好 且DNA疫苗的降解不明顯。
包封率和載藥量的測定
將制備好的豬流感DNA疫苗PLGA微球中加入2mL 二氯甲垸使微球完全 溶解，溶解后加入5mLPBS，渦旋振蕩30min， 4000rpm離心10min，取上清 用紫外分光光度儀測定萃取出的DNA的濃度，即可計算出DNA的含量。再根
據(jù)公式計算出包封率和載藥量。
包封率(％) =PLGA微球中DNA疫苗的測得含量/制備時PLGA微球中疫
苗的理論載藥量xlOO"/。 載藥量(％) =PLGA微球中DNA疫苗的測得含量/微球的重量xlOO%
考察影響因素③④⑤對粒徑大小、包封率和載藥量的影響 PVA的濃度分別為1。/。、 2%、 3%;油相中PLGA的濃度(m/v)分別為2.5%、 4%、 5。/。；DNA疫苗與PLGA的比例(mg/mg)分別為0.5%、 1%、 .5%，通過
單因素試驗設(shè)計，由前面所述的方法制備出各種微球，分別測定粒徑大小、包 封率和載藥量。從而優(yōu)化出的最佳條件為PVA的濃度為2。/。；油相中PLGA的 濃度(m/v)為4%; DNA疫苗與PLGA的比例(mg/mg)為0.5%。
權(quán)利要求
1. 一種豬流感DNA疫苗PLGA微球的制備工藝，其組成包括取初乳制成復乳，其特征是將復乳轉(zhuǎn)移至燒杯中，磁力攪拌5小時，室溫條件下?lián)]干有機溶劑，離心10分鐘，收集微球，用滅菌水洗滌，真空冷凍干燥即得豬流感DNA疫苗PLGA微球。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流感DNA疫苗PLGA微球的制備工藝，其特 征是所述的取初乳制成復乳為吸取含DNA的豬流感DNA疫苗水溶液作為內(nèi) 水相，經(jīng)二氯甲垸溶解的PLGA為油相，將所述的內(nèi)水相加至所述的油相中， 超聲乳化后加入到聚乙烯醇中，攪拌后得復乳。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流感DNA疫苗PLGA微球的制備工藝，其特 征是所述的復乳制作為吸取含DNA重量份數(shù)為2的豬流感DNA疫苗水溶液 作為內(nèi)水相，取重量份數(shù)為200的PLGA，加入體積份數(shù)為5的二氯甲垸溶解 完全，作為油相，將所述的內(nèi)水相加至所述的油相中，冰浴條件下超聲乳化IO 秒，得初乳，在7000rpm轉(zhuǎn)速下，將所得初乳加至體積份數(shù)為20的2%聚乙烯 醇中，乳化器攪拌35秒后停止，得復乳。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的豬流感DNA疫苗PLGA微球的制備工 藝，其特征是將所得復乳轉(zhuǎn)移至燒杯中，在200rpm轉(zhuǎn)速下磁力攪拌5小時， 室溫條件下?lián)]干有機溶劑，在4000rpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，收集微球，用滅 菌水洗滌3次，真空冷凍干燥即得豬流感DNA疫苗PLGA微球，所述的重量 份數(shù)與體積份數(shù)對應單位為mg:ml。
全文摘要
豬流感DNA疫苗PLGA微球的制備工藝，普通DNA疫苗的作用持續(xù)時間短，在體內(nèi)易被降解，不能實現(xiàn)緩釋的目的。豬流感DNA疫苗PLGA微球的制備工藝，取初乳制成復乳，將復乳轉(zhuǎn)移至燒杯中，磁力攪拌5小時，室溫條件下?lián)]干有機溶劑，離心10分鐘，收集微球，用滅菌水洗滌，真空冷凍干燥即得豬流感DNA疫苗PLGA微球。本工藝用于豬流感DNA疫苗PLGA微球的制備。
文檔編號A61P31/16GK101422618SQ20071014454
公開日2009年5月6日 申請日期2007年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者周東坡, 孫慶申, 凱 趙, 金媛媛, 魏海霞 申請人:黑龍江大學