專利名稱：：葡萄球菌腸毒素c在制備腫瘤治療藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物毒素的醫(yī)療用途，具體地說(shuō)涉及葡萄球菌腸毒素治療腫瘤的醫(yī)療用途。
背景技術(shù)：
：1980年國(guó)夕卜Terman等(TermanDS,YoungJB,ShearerWT，etal.PreliminaryobservationsoftheeffectsonbreastadenocarcinomaofplasmaperfiisedoverimmobilizedproteinA.NEnglJMed.Nov12198i;305(20):1195-1200.)偶然發(fā)現(xiàn)5例乳腺癌患者在接受金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)的灌注治療時(shí)，有4例患者腫瘤消失，l例部分消退。進(jìn)一步追蹤發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)腫瘤消退的直接原因不是SPA，而是其中混雜的微量葡萄球菌腸毒素(staphylococcalenterotoxin,SE)。在我國(guó)也有腫瘤患者因金葡菌感染或食物中毒導(dǎo)致腫瘤消退的病例。典型一例是上海一腫瘤患者并發(fā)金葡菌菌血癥后，腫瘤逐漸縮小消失，最終痊愈。..對(duì)葡萄球菌腸毒素早期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用SE具有一定的抗腫瘤效果。Hedlund等用SEA/SEB在體外對(duì)Raji細(xì)胞進(jìn)行殺傷，發(fā)現(xiàn)亂八-011+Raji細(xì)胞在加入l(T12mol/L腸毒素超抗原后幾分鐘即被明顯殺傷(LandoPA,HedundQDohlstenM，KallandT.Bacterialsuperantigensasanti-tumouragents:inductionoftumourcytotoxicityinhumanlymphocytesbystaphylococcalenterotoxinA.CancerImmundImmunother.1991;33(4):231-237.)。Hedlund等(1992)用SEB抑制小鼠B細(xì)胞淋巴瘤生長(zhǎng)試驗(yàn)，結(jié)果抑瘤率(以腫瘤直徑計(jì))達(dá)80%，有75%的動(dòng)物延長(zhǎng)了活存期，且未出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)。近十多年來(lái)，瑞典隆德大學(xué)和法瑪西亞腫瘤中心在腸毒素超抗原抗腫瘤方面作了艱苦卓絕的研究。但在國(guó)外，對(duì)單獨(dú)利用SE作抗癌治療的研究至今仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段，尚未獲得臨床應(yīng)用。我國(guó)在超抗原的臨床應(yīng)用方面起步較早。沈陽(yáng)協(xié)和集團(tuán)研究發(fā)現(xiàn)金葡菌培養(yǎng)物的過(guò)濾液同樣具有抗腫瘤活性，據(jù)此開發(fā)了抗腫瘤生物制品——高聚生.(HAS)..(黨軍,勾宏圖..61例非小細(xì)胞肺癌連續(xù)放療并用高聚生的臨床觀察.CffiN^SlJOURNALOFCLINICALONCOLOGY.2000;27(2)J。對(duì)數(shù)以萬(wàn)計(jì)各類癌癥患者的臨床試驗(yàn)證實(shí)單獨(dú)使用高聚生治療后實(shí)體腫瘤完全消失和部分消失的有效率可達(dá)42.5%。這些臨床效果表明高聚生與同類抗腫瘤制品相比是杰出的。RenS等也發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)品不僅能有效消除非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)胸水，而且對(duì)延長(zhǎng)病人的生存期作用顯著(RenS，TermanDS，BohachQetal.Intrapleuralstaphylococcalsuperantigeninducesresolutionofmalignantpleuraleffiisionsandasurvivalbenefitinnon-smallcelllungcancer.Chest.Nov2004;126(5):1529-1539.)。結(jié)果顯示對(duì)有惡性胸水的病人進(jìn)行高聚生胸腔內(nèi)注射可消除胸水復(fù)發(fā)達(dá)90天，有幾例病人甚至長(zhǎng)達(dá)6、8、12、15個(gè)月之久，惡性胸水消除率達(dá)100%，優(yōu)于目前常規(guī)治療惡性胸水的制劑；接受治療病人的存活期比對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，10例NSCLC病人平均存活期為7.9月，其中有3例超過(guò)350天，而對(duì)照組僅存活2.5月，治療組有20%存活時(shí)間超過(guò)一年，而對(duì)照組則無(wú)一例?，F(xiàn)已證實(shí)該藥物有效成分是葡萄球菌腸毒素C(SEC)。超抗原的抗腫瘤機(jī)制葡萄球菌腸毒素是重要的超抗原(Superantigen,SAg)。超抗原具有強(qiáng)大的T細(xì)胞激活能力，不需要抗原提呈細(xì)胞(APC)處理而直接與MHcn類分子結(jié)合，導(dǎo)致帶有特異性ve節(jié)段T細(xì)胞大量增殖，其活化T細(xì)胞(CTL)的數(shù)量為普通抗原的2000-50000倍，因此具有高效的免疫激活作用。由于超抗原強(qiáng)大的T細(xì)胞激活能力，目前已成為腫瘤免疫治療的新熱點(diǎn)，并不斷發(fā)展為新型腫瘤免疫治療模式。利用SE作為治療藥物具有其它藥物不可比擬的優(yōu)點(diǎn)①SE的分子結(jié)構(gòu)和氨基酸序列已被闡明；②SE較能抗消化并且耐熱；(D和SAg—樣，只需使用很小的SE劑量就可引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答。目前已經(jīng)研究清楚的超抗原抗腫瘤作用機(jī)制如下-1、超抗原依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(SagDependentCellCytotoxicity,SDCC):超抗原所激活的Tf巴細(xì)胞主要為CD4+和CD8+T細(xì)胞，從而可以汆傷靶細(xì)胞，稱為SDCC作用，細(xì)胞學(xué)水平的實(shí)驗(yàn)證明，l(T12mol/L的超抗原在幾分鐘內(nèi)即可明顯殺傷腫瘤細(xì)胞，可見(jiàn)，SDCC提供了一條快速、敏感、特異消除人腫瘤細(xì)胞的方法。2、活化多種免疫細(xì)胞，使之釋放大量細(xì)胞因子超抗原除能激活殺傷性T細(xì)胞外，還能剌激NK細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子如IL-2、IL-12、IFN-y、TNF-a等，這些細(xì)胞因子可對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行非特異殺傷。3、提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性超抗原還能夠提高腫瘤細(xì)胞膜上ICAM-l、HLA-DR等分子的表達(dá)，打破機(jī)體對(duì)腫瘤的耐受，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)SDCC的易感性。葡萄球菌超抗原純化制品金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的外毒素之一，同時(shí)也是一種重要的細(xì)菌超抗原，具有超抗原的共同特征，即在很低濃度條件(10^mol/L)下激活大量T細(xì)胞，刺、激釋放大量細(xì)胞因子，從而產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤作用。金葡菌除菌濾液高聚生盡管有良好的臨床療效，但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不易建立，難保持續(xù)有效。同時(shí)含有大量雜質(zhì)和雜蛋白，會(huì)導(dǎo)致不期望的副作用，如多次注射，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重局部紅腫反應(yīng)(張金成張京泰.超級(jí)抗原治療腫瘤的最新進(jìn)展.海南醫(yī)學(xué).2000;ll(l).);同時(shí)針對(duì)具體的腫瘤類型，SEC的抗腫瘤作用尚未報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了葡萄球菌腸毒素C(SEC)治療腫瘤的用途，其中的腫瘤為各種實(shí)體瘤，包括胃癌、肝癌或結(jié)腸癌等消化道腫瘤，以及肺癌、宮頸癌、口腔癌或乳腺癌等腫瘤。本發(fā)明的葡萄球菌腸毒素C治療腫瘤的用途是通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證的，首先是制備SEC蛋白(GREGORYA.BOHACHT，PATRICKM.SCHL正VERT.ConservationoftheBiologicallyActivePortionsofStaphylococcalEnterotoxinsCIandC2.INFECTIONANDIMMUNITY,JULY1989，2249-2252)，通過(guò)適當(dāng)培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，將產(chǎn)生的粗毒素通過(guò)液相色譜系統(tǒng)(FPLC)，采用離子交換等方法進(jìn)行純化，用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純度，同時(shí)顯示蛋白分子大小約30kDa左右，無(wú)其它明顯雜帶，純度在90%以上，產(chǎn)量約為15mg/L。用Bradford法測(cè)定蛋白含量。然后分離人淋巴細(xì)胞，制備靶細(xì)胞，采用MTS法進(jìn)行體外殺傷實(shí)驗(yàn)，將靶細(xì)胞和淋巴細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)孔，將不同濃度藥物分別加入上述細(xì)胞培養(yǎng)孔中，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，同時(shí)設(shè)對(duì)照，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)，用MTS染色后測(cè)定490nm的吸光度值。計(jì)算不同濃度SEC對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制率.(TGI)。TGI計(jì)算公式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中Atest為不同濃度超抗原實(shí)驗(yàn)孔OD值均值，Alym為PBMC對(duì)照孔OD值均值，Am為腫瘤細(xì)胞與PBMC混合孔OD值均值。由以肝癌細(xì)胞為靶細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SEC對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用比高聚生的抑制腫瘤活性強(qiáng)大。半數(shù)有效濃度(IC50)為9.64E-05嗎/mL，而高聚生的抑瘤活性極弱。SEC的抑瘤活性與劑量的依賴性在合適的劑量范圍內(nèi)成正比，在較大及較小劑量時(shí)，有輕微的倒置。超抗原加靶細(xì)胞對(duì)照孔對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用，該結(jié)果表明超抗原的抑瘤活性必需通過(guò)PBMC效應(yīng)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還釆用不同效靶比測(cè)定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)，方法同前述。SEC對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的IC50應(yīng)用ICso計(jì)算軟件計(jì)算。本發(fā)明進(jìn)行了如下SEC體內(nèi)抗腫瘤研究SEC抑制鼠LeWis肺癌實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)中將制備的Lewis肺癌細(xì)胞接種至小鼠的前肢腋皮下，成瘤后制成瘤細(xì)胞懸液，接種于小鼠前肢腋皮下。將小鼠隨機(jī)分為SEC高、中、低劑量組給藥。最后統(tǒng)計(jì)各組動(dòng)物的抑瘤率。抑瘤率氣l一實(shí)驗(yàn)組瘤重均值/對(duì)照組瘤重均值)x100%所得數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件中ANOVA模塊比較各組之間的差異，戶<0.05認(rèn)為有顯著性差異。結(jié)果顯示高劑量組能夠明顯的抑制小鼠Lewis肺癌的生長(zhǎng)，SEC對(duì)腫瘤的抑制作用是呈劑量依賴性的。SEC抑制兔VX-2腫瘤實(shí)驗(yàn)':將制備的兔鱗狀細(xì)胞癌浙胞接種至兔右后肢肌肉，待成瘤后制成瘤細(xì)胞懸液，接種于兔右后肢肌肉內(nèi)。將小鼠隨機(jī)分為SEC高、中、低劑量組給藥。最后統(tǒng)計(jì)各組動(dòng)物的抑瘤率。抑瘤率=(1一實(shí)驗(yàn)組瘤重均值/對(duì)照組瘤重均值)x100%所得數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件中ANOVA模塊比較各組之間的差異，尸<0.05認(rèn)為有顯著性差異。結(jié)果顯示，兔對(duì)超抗原的敏感性明顯高于小鼠，因此在兔腫瘤模型中本發(fā)明采用了較低的超抗原劑量。從結(jié)果可以看出，5昭/kg實(shí)驗(yàn)組的抑制率最高，為53%左右，當(dāng)劑量上升至10ng/kg或下降至2.5pg/kg時(shí)，抑制率均降至纟5%左右，這與體外實(shí)驗(yàn)觀察到的高劑量導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞殺傷率下降較一致。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)還證明了SEC治療組的兔比對(duì)照組的存活率高，而且SEC顯著的延長(zhǎng)了荷瘤兔的存活期；荷瘤兔腫瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增加，而且未出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在效靶比的改變對(duì)SEC腫瘤抑制活性的影響觀察中，結(jié)果表明固定濃度的SEC對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用隨著效靶比的升高而增加。SEC對(duì)人不同類型腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用實(shí)驗(yàn)本發(fā)明為了驗(yàn)證SEC的抗瘤譜，選擇了常見(jiàn)的肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、口腔鱗癌、宮頸癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞系為靶細(xì)胞，通過(guò)共培養(yǎng)的MTS染色方法考察SEC的抑瘤活性。通過(guò)抑制率及IC50的計(jì)算，證明.SEC可以劑量依賴地抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，但不同的腫瘤細(xì)胞對(duì)SEC的敏感性不同，其中人肝癌細(xì)胞系的BEL-7402最高，在對(duì)SEC進(jìn)行109倍稀釋時(shí)其殺傷率仍可達(dá)到約100%，但對(duì)乳腺癌ZR-75-1的殺傷能力則各濃度都沒(méi)有超過(guò)40%。SEC對(duì)兔VX-2腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用實(shí)驗(yàn)證明SEC對(duì)兔腫瘤的抑制非劑量依賴性，中劑量組抑瘤率最高。但所有治療組的腫瘤平均重量均小于對(duì)照組。本發(fā)明使甩丁鄰C對(duì)各種類型的腫瘤進(jìn)行了體內(nèi)體外的抗腫瘤研究。由于SEC是超抗原純品，.注射后不會(huì)出現(xiàn)局部紅腫等多種副作用，而且在體外人腫瘤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)中，在同樣的效靶比下，SEC表現(xiàn)出了比高聚生強(qiáng)的抗腫瘤活性；在小鼠和兔腫瘤體內(nèi)模型中，高聚生則沒(méi)有表現(xiàn)出抗腫瘤活性。因此與其粗制品相比，SEC純品抗腫瘤活性更高。葡萄球菌腸毒素C用于制備腫瘤治療藥物，具有抗腫瘤種類多、劑量低、副作用小、效果好等特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。圖1SEC蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖2純化SEC對(duì)不同人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的劑量效應(yīng)曲線，存活的腫瘤細(xì)胞以MTS還原法計(jì)數(shù)，結(jié)果以三復(fù)孔的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算。(A)SEC和高聚生對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的殺傷活性比較。SEC起始濃度為10ug/mL，而高聚生起始濃度為10IU/mL。10倍系列稀釋。(B)不同效靶比(E:Tratio)下SEC對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的殺傷活性。SEC的濃度為lng/mL。(C)SEC對(duì)不同人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、BEL-7402、Hep-G2生長(zhǎng)抑制的劑量效應(yīng)曲線；(D)SEC對(duì)其它消化道腫瘤細(xì)胞(BGC-823/HT-29)和肺癌細(xì)胞(GLC-82)生長(zhǎng)抑制的劑量效應(yīng)曲線；(E)SEC對(duì)腫瘤細(xì)胞KB、Hela和ZR-75-1生長(zhǎng)抑制的劑量效應(yīng)曲線；(F)SEC對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的IC50值。圖1A和1C-1E，SEC起始濃度為10pg/mL，PBMC細(xì)胞數(shù)8xl()4個(gè)/mL，腫瘤細(xì)胞數(shù)為5xl()S個(gè)/mL。效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的比例為16:1。圖3SEC抑制兔VX-2腫瘤體內(nèi)試驗(yàn)。(A)體內(nèi)SEC治療荷VX-2瘤兔的生存率。荷瘤兔分別肌肉注射SEC8.75ug/kg和PBS。(B)SEC治療兔VX-2腫瘤的病理學(xué)觀察(40x)。腫瘤組織用福爾馬林固定后制切片，行HE染色。(i)8.75ug/kgSEC治療組腫瘤標(biāo)本的HE染色。治療結(jié)束后，腫瘤組織邊緣出現(xiàn)灶狀壞死，腫瘤間質(zhì)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。(ii)對(duì)照組腫瘤組織的HE染色。'壞死僅發(fā)生在腫瘤中心部位。(iii)8.75ug/kgSEC治療組肺組織HE染色。(iv)對(duì)照組肺組織HE染色。與8.75ug/kgSEC治療組相比，對(duì)照組肺組織出現(xiàn)腫瘤侵襲和壞死。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一SEC體內(nèi)外抗腫瘤研究一.實(shí)驗(yàn)材料U菌株金黃色葡萄球菌>S.aw綴strainFRI1371.2腫瘤細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞BEL-7402，SMMC-7721，HepG-2;人結(jié)腸癌HT-29;人胃癌細(xì)胞BGC-823;人宮頸癌細(xì)胞株Hela;人口腔鱗癌細(xì)胞株KB;人肺癌細(xì)胞株GLC-82;:人乳腺癌細(xì)胞株ZR-75-l;兔腫瘤細(xì)胞株VX-2鱗狀細(xì)胞癌；鼠肺癌細(xì)胞株Lewis肺癌均購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。1.3試驗(yàn)動(dòng)物小鼠C57BL/6，雌性，體重1822g，SPF級(jí)，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，本院動(dòng)物中心飼養(yǎng)；兔新西蘭大白兔，雄性，體重4.55kg，SPF級(jí)，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，本院動(dòng)物中心詞養(yǎng)。1.4試劑A液5mmol/LPBPH7.0B液40mmol/LPB+0.5mol/LNaClpH7.4產(chǎn)毒培養(yǎng)基(1L):蛋白胨20g，酵母粉40g，K2HP04lg，KH2P04lg，CaClO.lg，調(diào)PH至6.8二.實(shí)驗(yàn)方法2.1SEC蛋白制備37""C振蕩培養(yǎng)S.aweMstrainFRI137菌株48小時(shí)，培養(yǎng)基為產(chǎn)毒培養(yǎng)基，PH7.0，將粗毒素用A液稀釋后作為上樣液，用全自動(dòng)快速液相色譜系統(tǒng)(FPLC)上樣。蛋白純化分兩步進(jìn)行。純化的第一步采用CM離子交換柱，上樣完畢后，以A液沖平，以B液做線性洗脫，收集洗脫的樣品，以A液進(jìn)行透析后進(jìn)行第二步純化。第二步純化采用SP離子交換柱，同樣以A液沖平，以B液做線性洗脫，根據(jù)洗脫曲線，取與洗脫峰相對(duì)應(yīng)的試管中的樣品，用SDS-PAGE檢測(cè)得到的蛋白純度；Bradford法測(cè)定蛋白的含量。2.2體外腫瘤細(xì)胞殺傷2.2.1人淋巴細(xì)胞分離a.抽取健康志愿者外周血10mL，每毫升血加入5單位肝素抗凝，用等量的不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋；b.取滅菌離心管加入3mL的淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Paque，Amersham)，然后在上面小心加入6mL用RPM1640稀釋的外周血，2000rpm離心25min使外周血分層；c.離心后分層的外周血從上至下分別為血漿血小板層、淋巴細(xì)胞層、Ficoll-Paqueplus層、有粒細(xì)胞和紅細(xì)胞層，用毛細(xì)吸管輕輕吸取含淋巴細(xì)胞白色霧狀層，用等量的0.01mol/LPBS洗兩次，5000rpm離心10min。用少量不含血清的培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)。2.2.2靶細(xì)胞制備用0.25%的胰酶消化貼壁生長(zhǎng)的、狀態(tài)良好的各種人腫瘤細(xì)胞，使用前用RPMI1640洗三次，1000rpm離心5min，加完全培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5xl(^個(gè)/mL，臺(tái)盼藍(lán)法測(cè)細(xì)胞活率>95%。2.2.3體外殺傷實(shí)驗(yàn)(MTS法)a.用完全培養(yǎng)基調(diào)整靶細(xì)胞濃度，以100uL/孔加入96孔細(xì)胞板培養(yǎng)孔中；b.根據(jù)靶細(xì)胞數(shù)目和效靶比用完全培養(yǎng)基調(diào)整淋巴細(xì)胞數(shù)，以100uL/孔加入96孔細(xì)胞板培養(yǎng)孔中；c.藥物處理用完全培養(yǎng)基將待試藥物稀釋成終濃度為10"、1(T2、10—3、104、l(T5、0r6、l(T7、l(T8、l(T9、l(T10、l(T11、l(T12ug/mL的12個(gè)梯度，以25nL/孔加入淋巴細(xì)胞培養(yǎng)孔中。在活性比較實(shí)驗(yàn)中，以SEA和高聚生作為對(duì)照，SEA的稀釋同樣是稀釋成與SEC相同的12個(gè)梯度，高聚生以10IU/mL開始稀釋6個(gè)梯度；'d.將靶細(xì)胞培養(yǎng)板和淋巴細(xì)胞、藥物混合培養(yǎng)板分別置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)后，用移液器輕輕混勻淋巴細(xì)胞、藥物培養(yǎng)孔，然后以100uL/孔將淋巴細(xì)胞加入耙細(xì)胞培養(yǎng)孔中，同時(shí)設(shè)置單純靶細(xì)胞孔；單純淋巴細(xì)胞孔；靶細(xì)胞與人淋巴細(xì)胞混合對(duì)照孔(對(duì)照孔應(yīng)用完全培養(yǎng)基將體積補(bǔ)足到200uL/孔)，將細(xì)胞板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育；e.靶細(xì)胞和淋巴細(xì)胞共孵育72h后取出細(xì)胞板在顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)，單純的靶細(xì)胞對(duì)照孔細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)是否良好，細(xì)胞覆蓋實(shí)驗(yàn)孔的面積是否在70%以上；f.棄96孔板中原培養(yǎng)液，用不含血清的1640洗三遍，每孔加不含小牛血清1640100uL/孔，染色劑MTS20uL，5%<:02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h后測(cè)490nm的吸光度值。計(jì)算不同濃度SEC對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制率(TGI)。TGI計(jì)算公式如下(Ara-Alym)-(Atest-Alym)tci=-XI。0%(Am-Alym)其中Atea為不同濃度超抗原實(shí)驗(yàn)孔OD值均值，A一為PBMC對(duì)照孔OD值均值，Am為腫瘤細(xì)胞與PBMC混合孔OD值均值。采用不同效靶比測(cè)定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)方法同前述，將7721細(xì)胞鋪96孔板，固定腫瘤細(xì)胞濃度為5xl(^個(gè)/mL，100uL/孔，將相應(yīng)濃度的淋巴細(xì)胞加入對(duì)應(yīng)的孔中，使效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例分別為32:1、16:1、8:1、4:1、2:1。SEC的濃度為lng/mL。共培養(yǎng)三天，而后MTS染色，490nm測(cè)定OD值。本實(shí)驗(yàn)中采用的效靶比從2:1至lj32:1倍比增加。SEC對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的IC50應(yīng)用IC5o計(jì)算軟件計(jì)算。2.3體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)2.3.1SEC抑制鼠Lewis肺癌實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)瓶中的Lewis肺癌細(xì)胞胰酶消化、離心收集細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定活細(xì)胞率〉95%后，將細(xì)胞接種至C57BL/6小鼠的前肢腋皮下，待第8天成瘤后，取出瘤節(jié)，、'用生理鹽水以1:4配制成瘤細(xì)胞懸液，于實(shí)驗(yàn)的第0天接種于小鼠前肢腋皮下。接種量為每只小鼠0.2mL。第1天將小鼠隨機(jī)分為SEC高、中、低3個(gè)劑量組，和PBS對(duì)照組，每組10只小鼠。分別于實(shí)驗(yàn)的l、4、7天給藥。SEC高、中、低3個(gè)組的給藥劑量分別為500，250，125jig/Kg。每只小鼠給藥體積0.2mL，肌肉注射。每次給藥前稱重。所用藥液均在給藥前配制。至第11天，處死各組小鼠，稱體重；解剖剝離瘤塊，稱瘤重。最后統(tǒng)計(jì)各組動(dòng)物的抑瘤率。抑瘤率-(l一實(shí)驗(yàn)組瘤重均值/對(duì)照組瘤重均值)x100%所得數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件中ANOVA比較各組之間的差異，認(rèn)為有顯著性差異。2.3.2SEC抑制兔VX-2腫瘤實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)瓶中的VX-2兔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞胰酶消化、離心收集細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定活細(xì)胞率>95%后，將細(xì)胞接種至兔右后肢肌肉，待成瘤后，取出瘤節(jié)，用生理鹽水以l:IO配制成瘤細(xì)胞懸液，于實(shí)驗(yàn)的第O天接種于兔右后肢肌肉內(nèi)。接種量為lmL/只。至第12天腫瘤形成后，隨機(jī)分為SEC高、中、低3個(gè)劑量組和PBS對(duì)照組，每組6只進(jìn)行給藥。SEC高、中、低3個(gè)組的給藥劑量分別為2.5，5.0，10.0pg/kg，肌肉注射。每次給藥前稱重。所用藥液均在給藥前配制。至給藥后第22天，處死，稱體重；解剖剝離瘤塊，.稱瘤重V最后統(tǒng)計(jì)各組動(dòng)物的抑瘤率。抑瘤率-(l一實(shí)驗(yàn)組瘤重均值/對(duì)照組瘤重均值)x100%所得數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件中ANOVA模塊比較各組之間的差異，戶<0.05認(rèn)為有顯著性差異。三.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1SEC表達(dá)、純化結(jié)果將粗毒素用bufferA(5mmol/LPB，pH7.2)充分稀釋后，分別經(jīng)CM-弱陽(yáng)離子交換柱，SP-強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱在AKTAFPLC蛋白純化儀上純化后，對(duì)收集到的蛋白經(jīng)過(guò)SDS-PAGE鑒定顯示，蛋白分子大小約30kDa左右，無(wú)其它明顯雜帶，純度在90%以上，產(chǎn)量約為15mg/L。(如圖l)。3.2SEC、高聚生的腫瘤抑制活性比較超抗原可以刺激T淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)T細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子，從而具備了抗腫瘤活性。為了比較SEC與上市藥物高聚生抑瘤活性差異。本發(fā)明以SMMC-7721肝癌細(xì)胞為靶細(xì)胞在體外通過(guò)共培養(yǎng)的MTS染色方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。由以SMMC-7721肝癌細(xì)胞為靶細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SEC對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用比高聚生的抑制腫瘤活性強(qiáng)大。半數(shù)有效濃度(IC50)為9.64E-05昭/mL，而高聚生的抑瘤活性極弱。SEC的抑瘤活性與劑量的依賴性在合適的劑量范圍內(nèi)成正比，在較大及較小劑量時(shí)，有輕微的倒置(圖2A)。超抗原加靶細(xì)胞對(duì)照孔對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用，該結(jié)果表明超抗原的抑瘤活性必需通過(guò)PBMC效應(yīng)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，具體數(shù)據(jù)沒(méi)有給出。3.2效耙比的改變對(duì)SEC腫瘤抑制活性的影響為研究效靶比的改變與SEC的細(xì)胞毒作用之間的關(guān)系，本發(fā)明選擇SMMC-7721為祀細(xì)胞，固定SEC濃度，通過(guò)改變PBMC的濃度，使E:T從2:l逐步增大到32:1，采用共培養(yǎng)的方法，考察效靶比與抑制率的關(guān)系。結(jié)果表明，lng/mL固定濃度的SEC對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用隨著效靶比的升高而增加(圖2B)。3.3SEC對(duì)人不同類型腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用為了驗(yàn)證SEC的抗瘤譜，本發(fā)明選擇了常見(jiàn)的肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、口腔鱗癌、宮頸癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞系為靶細(xì)胞，通過(guò)共培養(yǎng)的MTS染色方法考察SEC的抑瘤活性。通過(guò)抑制率及IC50的計(jì)算，可知SEC可以劑量依賴地抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，但不同的腫瘤細(xì)胞對(duì)SEC的敏感性不同，其中BEL-7402最高，在對(duì)SEC進(jìn)行109倍稀釋時(shí)其殺傷率仍可達(dá)到約100%，但對(duì)乳腺癌ZR-75-l的殺傷能力則各濃度都沒(méi)有超過(guò)40%(圖2C-E)。受試超抗原對(duì)敏感腫瘤細(xì)胞的IC50在2.04E-13|Hg/mL到4.04E-05嗎/mL的范圍內(nèi)(圖2F)。3.4SEC對(duì)小鼠Lewis肺癌生長(zhǎng)的抑制作用為了研究SEC在體內(nèi)能否激起T細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答，本發(fā)明采用了C57BL/6小鼠的Lewis肺癌模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肌肉給予500、250、125(ig/kg劑量的SEC，高劑量組能夠明顯的抑制小鼠B16黑色素瘤的生長(zhǎng)，與生理鹽水對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果同時(shí)表明，SEC對(duì)腫瘤的抑制作用是呈劑量依賴性的。生理鹽水組腫瘤在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到了1.86g，表明腫瘤生長(zhǎng)良好。具體結(jié)果見(jiàn)表l-l。表1-1SEC抑制小鼠Lewis肺癌體內(nèi)實(shí)驗(yàn).TestedDoseTumorweight(g)Inhibitionsample(ug/kg)(mean±SD)rate1251.86±0.3140.48SEC2501.49±0.47419.885001.05±0.38943.6承**N.S.-1.86士0.328—*p<0.05，**p<0.01，娟pO細(xì).小鼠接種腫瘤后，按方法部分，分別注射不同劑量的SEC和生理鹽水，設(shè)SEC高、中、低劑量組和生理鹽水對(duì)照組。治療結(jié)束后，小鼠在第11天引頸處死。腫瘤結(jié)節(jié).判離并稱重。結(jié)果以每組IO只小鼠腫瘤瘤重的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。腫瘤抑制率以與生理鹽水對(duì)照組相比計(jì)算。給藥方式于第l、4、7天肌肉注射。3.5SEC對(duì)兔VX-2腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用研究表明，兔對(duì)超抗原的敏感性明顯高于小鼠，因此在對(duì)兔腫瘤模型進(jìn)行研究時(shí)，本發(fā)明采用了較低的超抗原劑量。從結(jié)果可以看出，5pg/kg實(shí)驗(yàn)組的抑制率最高，為53%左右，當(dāng)劑量上升至10jig/kg或下降至2.5pg/kg時(shí)，抑制率均降至35%左右，這與體外實(shí)驗(yàn)觀察到的高劑量導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞殺傷率下降較一致。本發(fā)明同時(shí)觀察了兔的存活期，發(fā)現(xiàn)SEC治療組的兔比對(duì)照組的存活率高(圖3A)。同時(shí)SEC顯著的延長(zhǎng)了荷瘤兔的存活期，在第40天時(shí)，SEC組還有70%的存活率，而此時(shí)對(duì)照組的兔全部死亡。對(duì)荷瘤兔的腫瘤進(jìn)行組織切片，發(fā)現(xiàn)SEC組的腫瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增加，壞死區(qū)域不僅僅局限于中心區(qū)域，而陰性對(duì)照組，浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞偏少，壞死灶僅存在于腫瘤的中心地帶(圖3i，3ii);對(duì)荷瘤兔肺組織進(jìn)行組織切片發(fā)現(xiàn)，生理鹽水對(duì)照組出現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而實(shí)驗(yàn)組則無(wú)此現(xiàn)象(圖3iii,3iv)。表1-2SEC抑制兔VX-2腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>按方法部分給兔接種腫瘤且腫瘤形成后，分SEC高、中、低三個(gè)劑量組進(jìn)行治療，同時(shí)設(shè)置PBS對(duì)照組。至給藥后第22天，處死兔，剝離腫瘤，稱重。SEC對(duì)兔腫瘤的抑制率以腫瘤瘤重的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。SEC對(duì)兔腫瘤的抑制非劑量依賴性，中劑量組抑瘤率最高。但所有治療組的腫瘤平均重量均小于對(duì)照組。給藥方式每7天1次，肌肉注射。權(quán)利要求1.葡萄球菌腸毒素C在制備腫瘤治療藥物中的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述用途，其中的腫瘤為實(shí)體瘤。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述用途，其中腫瘤為消化系統(tǒng)腫瘤。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述用途，其中消化系統(tǒng)腫瘤為胃癌、肝癌或結(jié)腸癌《5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述用途，其中腫瘤為肺癌、宮頸癌、口腔癌或乳腺癌。全文摘要本發(fā)明公開了葡萄球菌腸毒素C在制備腫瘤治療藥物中的用途。通過(guò)實(shí)驗(yàn)本發(fā)明證明了對(duì)多種腫瘤，葡萄球菌腸毒素C具有抗腫瘤作用。這些腫瘤可以是實(shí)體瘤，包括消化系統(tǒng)腫瘤，例如胃癌、肝癌或結(jié)腸癌等，還包括肺癌、宮頸癌、口腔癌或乳腺癌。葡萄球菌腸毒素C用于制備抗腫瘤藥物，具有劑量低、副作用小、效果好的特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A61K38/16GK101391096SQ20071015220公開日2009年3月25日申請(qǐng)日期2007年9月19日優(yōu)先權(quán)日2007年9月19日發(fā)明者姜永強(qiáng),華江,王海榮,節(jié)可歌,鄭玉玲申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所