專利名稱：：一種增敏腫瘤細(xì)胞藥劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)，涉及新藥的研發(fā)，具體為一種增敏腫瘤細(xì)胞藥劑即先導(dǎo)化合物ZD緒01(氯化甲氧檗因coralynechloride),以及在抗腫瘤中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：因腫瘤而死亡的患者中90%與腫瘤細(xì)胞的耐藥性有關(guān)，特別是多藥耐藥性(miUtidrugresistance,MDR)，這是指腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，對結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的其他抗腫瘤藥物也都產(chǎn)生交叉耐藥性。導(dǎo)致產(chǎn)生多藥耐藥性的因素中，與細(xì)胞膜有關(guān)的主要因素有P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥性相關(guān)蛋白(MRP)和肺多藥耐藥性相關(guān)蛋白(LRP)等，與細(xì)胞質(zhì)有關(guān)的主要因素有凋亡抑制蛋白(I-APs)。拓?fù)洚悩?gòu)酶II、蛋白激酶C和谷胱苷肽氧化還原系統(tǒng)等。但最重要、最常見的為P-gP，也稱典型MDR，其為一種廣泛存在于多種腫瘤細(xì)胞胞膜上的蛋白，負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外，從而引起腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性，降低腫瘤化療的療效。另一方面可能是因?yàn)橐恍┠退幍鞍椎谋磉_(dá)增加或活力升高導(dǎo)致細(xì)胞自身的生存能力增強(qiáng)所致，從而腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了耐藥性。理論上，克服多藥耐藥性主要有兩種途徑，一種是開發(fā)對MDR、細(xì)胞不具有耐藥性的新抗癌藥物，另一種途徑是尋找MDR的逆轉(zhuǎn)劑與抗癌藥物合用，恢復(fù)MDR細(xì)胞對抗癌藥物的敏感性。在腫瘤化療領(lǐng)域中，克服多藥耐藥性的研究一直方興未艾，也是腫瘤化療領(lǐng)域急需解決的難題。Nrf2/ECH(NF-E2--relatedfactor2或Chickenerythroid-derivedCNC-homologyfactor)是一種66-kDa蛋白，含有一高度保守的堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)，屬于CNC(c鄰--collar)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，最初被Moi等人分離得到。常態(tài)下，胞槳中的Nrf2被胞漿蛋白伴侶分子Keapl(Kelch-likeECH-associatedproteinl)的DGR區(qū)結(jié)合從而處于抑制狀態(tài)，Ke鄰l同吋可促進(jìn)Nrf2的泛素蛋白酶體途徑降解過程?；钚匝跫坝H核劑等氧化應(yīng)激源作用下，Nrf2脫離Ke即l，轉(zhuǎn)移入核，通過bZIP與小分子Maf蛋白異二聚化之后二聚體與抗氧化元件ARE上GCTGAGTCA位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)受ARE調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。基因分析顯示，ARE是一個(gè)特異的DNA-啟動(dòng)子結(jié)合部位，位于谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、NAD(P)H:醌氧化還原酶l(NQ01)、UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)、微粒體環(huán)氧化物水解酶、谷氨酰半胱氨酸連接酶GCL(含GCLC和GSLM兩個(gè)亞基)、谷胱甘肽合成酶、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物岐化酶(SOD)、血紅素氧化酶(H0-1)、醛脫氫酶、醛酮還原酶、AKR1C1(醇醛酮還原酶家族1，成員C1)等II相解毒酶和抗氧化酶基因的5'側(cè)翼區(qū)域，其能被多種抗氧化性和(或)親電性物質(zhì)激活，從而激活I(lǐng)I相解毒酶和抗氧化酶基因的表達(dá),進(jìn)而增加細(xì)胞對氧化應(yīng)激的抗性。Nrf2的激活受多個(gè)水平的調(diào)控，主要涉及Nrf2與Keapl的相互作用。Nrf2從Ke邵l解離是Nrf2激活的重要環(huán)節(jié)，主要通過兩種途徑，其一是親核物質(zhì)或活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)直接攻擊作用；其二是磷酸化的間接作用。目前認(rèn)為促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、蛋白激酶C(PKC)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)等幾條蛋白激酶途徑參與了Nrf2-ARE通路激活和其依賴基因表達(dá)的調(diào)控。Nrf2、Keapl和ARE是Nrf2-ARE信號系統(tǒng)的軸心元件。激活Nrf2-ARE信號通路能上調(diào)很多II相解毒酶和抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而表達(dá)一些抗致癌物、氧化劑和其他有毒化學(xué)物質(zhì)的基因產(chǎn)物，起細(xì)胞保護(hù)作用。Nrf2是調(diào)控細(xì)胞對抗有害環(huán)境因素的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2缺失或激活障礙，會(huì)引起細(xì)胞對應(yīng)激源的敏感性增高，可加重氧化應(yīng)激源的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、凋亡甚至死亡，其與化學(xué)促癌的發(fā)生、炎癥修復(fù)進(jìn)程延長、細(xì)胞凋亡等病變密切相關(guān)。近幾年來，對一些抗癌藥的耐藥性研究表明Nri2調(diào)控的一系列基因與MDR有很大的關(guān)系，這是腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥產(chǎn)生耐藥性的一條重要途徑。某些抗腫瘤藥能在腫瘤細(xì)胞中激活Nrf2轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致第II相解毒酶和抗氧化酶基因表達(dá)量的增加，提高腫瘤細(xì)胞對氧化應(yīng)激的抵抗能力，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對抗癌藥的抗性，引起很多種腫瘤對這些抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是以Nrf2為腫瘤耐藥性的分子靶標(biāo)，篩選Nrf2的拮抗劑，達(dá)到致敏腫瘤細(xì)胞的作用，降低腫瘤耐藥性。本發(fā)明的一種增敏腫瘤細(xì)胞藥劑，是對Nrf2具有效抑制作用的小分子化合物氯化甲氧檗因(coralynechlorideZDAK01)，其結(jié)構(gòu)式如下所述的小分子化合物氯化甲氧檗因(c.oralynechlorideZDAK01)聯(lián)合抗癌藥用于抗腫瘤藥物的開發(fā)和制備。即利用氯化甲氧檗因(coralynechlorideZDAK01)作為增敏腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤藥物。建立在Nrf2與腫瘤耐藥性的關(guān)系的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)室建立了靈敏、穩(wěn)定、以Nrf2為分子耙標(biāo)的細(xì)胞篩藥平臺。本實(shí)驗(yàn)室以叔丁基對苯二酚(tBHQ)為Nrf2誘導(dǎo)劑，Nrf2抑制劑視黃酸Retinoidacid(RA)或X為陽性對照，己經(jīng)篩選出一生物堿類小分子化合物ZDAK01(氯化甲氧檗因coralynechloride)可以抑制tBHQ誘導(dǎo)的II相解毒酶和抗氧化酶基因的表達(dá)，據(jù)此推斷某些生物堿小分子化合物可能使細(xì)胞對化療藥物-烷化劑和氧化還原循環(huán)物更敏感。抗氧化性誘導(dǎo)劑tBHQ能強(qiáng)誘導(dǎo)II相解毒酶，而不會(huì)誘導(dǎo)其它藥物代謝酶，為單功能誘導(dǎo)劑。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)中的熒光素酶活性檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)ZDAK01(coralynechloride)可能為Nrf2抑制劑，能抑制瘤可寧(Chlorambucil)等抗腫瘤藥對Nrf2-ARE信號通路的激活作用，以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株和人結(jié)腸腺癌Caco2細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)來檢測不同加藥組細(xì)胞中AKR1C1、NQOl、H0_1和GCLMmRNA的表達(dá)水平。tBHQ能大幅度誘導(dǎo)細(xì)胞中AKR1C1、NQOl、HO-1和GCLMmRNA的相對拷貝數(shù)，ZDAK01(coralynechloride)能有效抑制該誘導(dǎo)作用；Chlorambucil能誘導(dǎo)AKR1CI、NQOl、H0-1和GCLMmRNA的相對拷貝數(shù)增加，其中AKRICImRNA表達(dá)量顯著高于空白對照組(，粉，而ZDAK01(coralynechloride)能抑制該誘導(dǎo)作用，其中AKRICImRNA表達(dá)量顯著低于10Chlorambucil處理組(/Yft05)。該抑制作用可能涉及增敏腫瘤細(xì)胞。圖l:TaqMan探針法PT-PCR原理。圖2:氯化甲氧檗岡(coralynechloride)及視黃酸RA(X)對tBHQ誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞中的AKRICImRNA、NQOlmRNA、H0-1mRNA和GCLMm脂A的表達(dá)水平的影響。圖3:氯化甲氧檗因coralynechloride及視黃酸RA(X)對tBHQ誘導(dǎo)Caco2細(xì)胞中的AKR1C1mRNA、NQOlmRNA、HO-1mRNA和GCLMmRNA的表達(dá)水平的影響。圖4:抗腫瘤藥瘤可寧(Chlorambucil)和Cisplatin均能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞中的AKRICI、NQOl、HO-1和GCLMmRNA的表達(dá)，且前者的誘導(dǎo)作用具有顯著性差異(_P<0.05)。X對兩者的誘導(dǎo)效應(yīng)均有抑制作用，Zdak01(氯化甲氧檗因coralynechloride)能顯著抑制Chlorambucil的誘導(dǎo)作用(戶<0.05)。A、B、C和D分別為各樣品細(xì)胞中的AKR1C1、NQOl、HO-1和GCLMmRNA的相對拷貝數(shù)(Foldofcontrol)。*，表示和未加藥處理細(xì)胞相比存在顯著性差異(尸<0.05)。#，表示和10PMChlorambucil處理組細(xì)胞相比存在顯著性差異(尸<0.05)。(n=3，共重復(fù)了三次)。具體實(shí)施方式(一)材料1.儀器生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Ther,Forma)，光學(xué)顯微鏡'-80'C超低溫冷藏柜(FormaScientific),微量低溫臺式離心機(jī)(ThermoElectronCorporation),臺式冷凍高速離心機(jī)(SORVALLHeraeus)，靜音混合器，全波長酶標(biāo)儀(ThermoElectronCorporation),熱循環(huán)儀(BIO-KAD)，7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI)，微機(jī)型精密酸度計(jì)，電子分析天平(Sartorius)，恒溫金屬浴(上海藍(lán)豹實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，EPS-300電泳儀(天能)，電泳槽(天能)，VE-186轉(zhuǎn)移電泳槽(天能)，搖床。2.主要試劑(1)胎牛血清(FBS)(GIBC0)(2)醒EM培養(yǎng)液(GIBCO)(3)MEM培養(yǎng)液(GIBCO)(4)抗生素Antibiotic-Antimycotic(GIBC0)(5〉RNeasyMiniKit(QIAGEN):RLTBuffer,RPEBuffer,RWlBuffer,RNase-freeWater,RNeasyMiniSpinColumn,CollectionTubes(6)腿isoReagent(TaKaRa)(7)無水乙醇(分析純)(8)氯仿(分析純)(9)異丙醇(分析純)(10)cDNA合成i式劑盒5XRTbuffer(GibcoSuperscriptII)，RQ1RNase—freeDNase(Promega)，RQ1Stopbuffer(Promega)，六聚體隨機(jī),引物(Promega)，DTT(Invitrogen)，dNTPs(Promega)，SuperScriptIIITranscriptase(Invitrogen)(11)M-MLVReverseTranscriptase(Promega)(12)二甲基亞砜(DMSO):(Sigma)(13)焦碳酸二乙酯(DEPC)(Sigma)(14)Tris(—h海Sangon公司，AMRESCO分裝)(15)RNase-freeWater(上海Sangon公司)(16)TaqMan2XUniversalPCRMasterMix(AB丄；TaKaRa)(17)PCR引物(委托TaKaRa有限公司合成)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>'(18)胰酶(上海Sangon公司)(19)EDTA(上海Sangon公司)(20)WesternBlot發(fā)光底物3.溶液配方(1)畫EM細(xì)胞培養(yǎng)液將一包(13.4g)DMEM培養(yǎng)基粉劑加入800ml高純水中，充分溶解，依據(jù)包裝袋上的說明加入3.7g碳酸氫納，充分溶解，定容至1000ml，以0.22um孔徑濾膜過濾除菌，分裝后4。C保存。臨用前，加入FBS至終濃度為(v/v)10%，按I:IOO加入IOOX抗生素Antibiotic-Antimycotic，即含鹿FBS的DMEM完全培養(yǎng)液。(2)MEM細(xì)胞培養(yǎng)液將一包(9.6g)MEM培養(yǎng)基粉劑加入800ml高純水中，充分溶解，依據(jù)包裝袋上的說明加入2.2g碳酸氫納，充分溶解，定容至1000ml，以0.22um孔徑濾膜過濾除菌，分裝后4匸保存。臨用前，加入FBS至終濃度為(v/v)10%，按1:100加入100X抗生素Antibiotic-Antimycotic，即含10%FBS的MEM完全培養(yǎng)液。(3)磷酸鹽緩沖液(1XPBS)(PH7.4):稱取8.00gNaCl，0.20gKCl，1,44gNa2HP04，0.24gKH2P(X溶于800m]雙蒸水中，攪拌，充分溶解，濃鹽酸調(diào)pH值至7.4，雙蒸水定容為1000ml。高壓滅菌后4'C保存?zhèn)溆谩?4)lmol/LTris-HC1(pH7.5)溶液稱取Tris堿121.lg溶于800ral雙蒸水中，攪拌溶解，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.5，加雙蒸水定容至100(kl，分裝后高壓滅菌，4'C保存?zhèn)溆谩?5)DEPC處理水(0.1%v/v)制備方法加1mlDEPC到1L雙蒸水中，磁力攪拌過夜。121'C高壓滅菌，自然冷卻后過濾，室溫貯存?zhèn)溆谩?6)75%乙醇(DEPC處理水配制)取75ml無水乙醇，加DEPC處理水至100ml,充分混勻后室溫貯存?zhèn)溆?7)胰酶EDTA消化液稱取2.5g胰酶，0.2gEDTA,8g,Nacl,0.2gKC1,3.2gNa2HP04，0.2gKH2P040.2g充分溶解于1000ml1XPBS緩沖液中，胰酶和EDTA終濃度為0.25%和0.02%。用0.22nm孔徑濾膜過濾除菌，分裝后-2(TC貯存?zhèn)溆谩?8)SDS-PAGE凝膠12.5%分離膠(15ml):4.26ral高純水，3.33ral1.5MTris-HC1(PH8.8)，5.5ml30%Acrylam]'de-bis,0.1mlIOMPS，0.13ml10%SDS,0.01mlTEMED濃縮膠(10ml):6.13ml高純水，2.5ml0.5MTris-HCl(PH6.8),1.3m]30%Acrylamide-bis，0.1ml10%APS，0.067ml10%SDS，0.0067mlTEMED。(9)細(xì)胞裂解液含0.1MH印as(ffl7.4)，1mMDTT，0.5MKC1，5mMMgCl2，0.5mMEDTA和20%甘油，用高純水溶解，4'C貯存?zhèn)溆?。使用前取出適量加PMSF至終濃度0.1riiM。(10)10X電泳緩沖液稱取800ml高純水，加入30.275gtrisbase和144.192g甘氨酸，攪拌，充分溶解后定容至1000ml，室溫貯存?zhèn)溆?。用時(shí)稀釋成1X，并加SDS至終濃度0.11(11)IOX轉(zhuǎn)膜緩沖液稱取800ml高純水，加入30.275gtrisbase和144.192g甘氨酸，攪拌，充分溶解后用濃HC1調(diào)PH值至8.3，定容至1000ml,室溫貯存?zhèn)溆?。用時(shí)稀釋成1X，并加甲醇至終濃度O.1%。(12)4X蛋白上樣緩沖液:在高純水中加入2.5MTris-HC1(PH6.8)溶液、SDS、DTT、glycerol至終濃度分別為0.25M、8%、0.2M和30%，再加入少量溴酚蘭，攪拌充分溶解后分裝，置-20。C保存。(13)PBST:取1000ml1XPBS緩沖液，加Tween至終濃度0.1%，充分混勻后室溫貯存?zhèn)溆谩?.細(xì)胞株人結(jié)腸腺癌Caco2細(xì)胞株和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。(二)實(shí)驗(yàn)方法1.細(xì)胞培養(yǎng)1.1MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞株生長于含1(F。(v/v)胎牛血清的固EM培養(yǎng)基中，按1:100體積比加100XAntibiotic-Antimycotic，置于5%(v/v)C02、飽和濕度、3TC培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，采用對數(shù)牛長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用中號培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，23d換液一次。細(xì)胞貼培養(yǎng)瓶底約達(dá)90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌2次。中號培養(yǎng)瓶中加入37'C預(yù)溫的胰酶EDTA消化液5ml，再把培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱孵育，約5min后細(xì)胞收縮、間隙增大，加入5ml含10%(v/v)FBS的DMEM培養(yǎng)基以中和胰蛋白酶的活性。用移液管輕輕吹打細(xì)胞，直至貼壁細(xì)胞懸浮，吸取細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，1000g室溫離心5min,棄上清夜，再加入10%(v/v)FBS的DMEM培養(yǎng)基并吹打細(xì)胞沉淀使之懸浮分散，分23中瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。每個(gè)中瓶加15ml培養(yǎng)液。1.2Caco2細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸腺癌Caco2細(xì)胞株生長于含10X(v/v)胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，按l:100體積比加100XAntibiotic-Antimycotic,置于5義(v/v)C02、飽和濕度、37°C培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，采用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其他操作同MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)。2.實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)采用TaqMan探針法進(jìn)行RT-PCR分析。進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在PCR反應(yīng)液中加入熒光探針，然后在PCR擴(kuò)增過程中。通過檢測PCR反應(yīng)液中的熒光強(qiáng)度，可以達(dá)到檢測PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。TaqMan探針法是使用5'端帶有熒光物質(zhì)(如FAM等)，3'端帶有淬滅物質(zhì)(如:TAMRA等)的Taq(fen探針進(jìn)行熒光檢測的方法。當(dāng)探針完整時(shí)，5'端的熒光物質(zhì)受到3'端的淬滅物質(zhì)的制約，不能發(fā)出熒光。而當(dāng)TaqMan探針被分解后，5'端的熒光物質(zhì)便會(huì)游離出來，發(fā)出熒光。當(dāng)PCR反應(yīng)液中加入熒光探針后，在PCR反應(yīng)的退火過程中，熒光探針便會(huì)和模板雜交。進(jìn)一步在PCR反應(yīng)的延伸過程中，7^gDNA聚合酶的5'—3'Exonuclease活性可以分解與模板雜交的熒光探針，游離熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。通過檢測反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度，可以達(dá)到檢測PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。具體原理見圖1。2.1準(zhǔn)備細(xì)胞樣品用胰酶EDTA消化液消化細(xì)胞(MCF-7細(xì)胞或Caco2細(xì)胞)，使之分散并懸浮在含10%FBS的培養(yǎng)液(DMEM或MEM)中，按1.5X106細(xì)胞/孔的密度接種于六孔板，在37°C、5%(v/v)C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)24h。用DMSO作為溶媒將tBHQ、x、zdak01、chlorambucil、cisplatin等藥品配成一定濃度的母液。細(xì)胞24h培養(yǎng)結(jié)束后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將藥物加入新鮮培養(yǎng)液中(DMSO終濃度控制在(v/v)l呢之內(nèi))，加入抗生素，但不加FBS。吸棄六孔板孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入lralPBS緩沖液洗滌，吸棄PBS，加入2ml上述配好的加入藥物的培養(yǎng)液，在37°C、5呢(v/v)C02及飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h。以不加藥培養(yǎng)基為空白對照，以X為陽性對照。細(xì)胞加藥分組①M(fèi)CF-7細(xì)胞空白對照(不加藥)，1%函SO，1yMX，20uMzdakol,20nMtBHQ，20iiMtBHQ+;UMX，20tBHQ+20yMzdakol②Caco2細(xì)胞空白對照(不加藥)，1%DMSO，1uMX，20uMzdakol,20yMtBHQ，20yMtBHQ+lixMX，20uMtBHQ+20uMzdakol③MCF-7細(xì)胞:空白對照(不加藥)，1。/。固S0,lyMX，50zdakol,10iiMchlorambucil,10tiMchlorambucil+luMX，10chlorambucil十50uMzdakOl，10cisplatin,10yMcisplatin+1nMX2.2總RNA的提取(研究過程中采用了兩種RNA提取方法，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響)方法A:用RNeasyMiniKit提取RNA(1)收集細(xì)胞細(xì)胞用1XPBS洗滌一遍后，加1XPBS收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，低速離心(1X1000g，5min)，棄上清液，收集細(xì)胞沉淀。(2)裂解細(xì)胞及勻漿每管細(xì)胞沉淀中加350ulRLTBuffer,用一次性使用無菌注射器抽吸5次以上。(3)每管加入350nl70%乙醇(用RNase—FreeWater配制)，充分混勻。(4)樣品上柱至RNeasyMiniSpinColumn,10000g室溫離心15s，棄去收集管中濾過液。(5)加入700iURW1Buffer,10000g室溫離心15s，棄去收集管中濾過液。(6)加入500ylRPEBuffer,10000g室溫離心15s，棄去收集管中濾過液。(7)加入500ylRPEBuffer,10000g室溫離心2min，棄去收集管中濾過液。(8)將RNeasyMiniSpinColumn放入新的收集管中(配置)，加入30ii1RNase—FreeWater,難Og室溫離心lmin，濾過液即為RNA樣品。方法B:用RNAisoReagent提取RNA(1)收集并勻漿細(xì)胞樣品用1ml1XPBS洗滌細(xì)胞后，加1mlRNAisoReagent收集并裂解細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，用一次性針筒抽吸5次以上。室溫靜置5min。(2)總RNA的提取。①向上述的勻漿裂解液中加入200Pl氯仿，蓋緊離心管蓋，用漩渦儀充分振蕩。待溶液充分乳化(無分相現(xiàn)象)后，再室溫靜置5min。②12，000g4。C離心15min。③取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層，即無色的上清夜、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相。吸取上清夜轉(zhuǎn)移至另一新的1.5ml離心管中(切忌吸出白色中間層)。向上清夜中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在室溫下靜置10rain。12,000g4'C離心10inin。離心后，試管底部會(huì)出現(xiàn)少量白色沉淀。(3)RNA沉淀的清洗。小心棄去上清夜，緩慢地沿離心管壁加入75°/。的乙醇1ml(切勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒洗滌離心管壁，12，000g4'C離心5min后棄去乙醇。(4)訓(xùn)A的溶解室溫干燥25min，加入30ulKNA-free水溶解沉淀。2.3RNA定量及稀釋(1)用Tris。Cl溶液(10mM，PH7.5)按1:25稀釋RNA樣品(2)向比色杯中加入100ul上述稀釋液，避免產(chǎn)生氣泡。(3)打開全波長酶標(biāo)儀系統(tǒng)，測各個(gè)RNA樣品的0D26。/0D娜值及RNAUgAa)濃度，質(zhì)量較好的RNA的OD腳/OD2s。值應(yīng)在1.82.0之間。(4)根據(jù)所測RNA濃度，用RNase—FreeWater將各RNA樣品均稀釋成100ng/y1。2.4逆轉(zhuǎn)錄(1)準(zhǔn)備0.5ml小離心管，按下述配方加入各樣品及試劑:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(2)放入熱循環(huán)儀37°C，10min(3)每管加入1u1Stopbuffer(4)放入熱循環(huán)儀65°C，5min2.5cDNA合成(1)每管加入lwl六聚體隨機(jī)引物(150ng/ul)(2)放入熱循環(huán)儀70°C，10min，冰浴(3)每管再加入<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(4)放入熱循環(huán)儀25'C，5min(5)用DEPC水按1:1稀釋逆轉(zhuǎn)錄酶(原濃度200u/u1)，每管加入1ix1逆轉(zhuǎn)錄酶稀釋液(6)放入熱循環(huán)儀，設(shè)置程序25°C10min—42°C50min—70°C10min2.6RT-PCR(Taqman12.5y1反應(yīng)體系)(1)從各cDNA樣品中取出適量分別按1:10、1:100及1:1000稀釋。(2)配master-mix(以下均為一個(gè)反應(yīng)體系的mix量)①AKR1C1、,、H0-1、GCLM基因的master-mix:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(3)向PCR板中加入上述master-mix(10u1/孔)(4)向PCR板加入cDNA樣品(2.5u1/孔)，其中18srRNA基因?qū)?yīng)所加的為1:1000稀釋的cDNA樣品，AKR1C1基因?qū)?yīng)所加的為未稀釋的cDNA樣品，NQOl、HO-1、GCSM基因?qū)?yīng)的均為1:10稀釋的cDNA樣品。(5)用PCR板封閉膜封閉PCR板反應(yīng)孔。小心將膜對準(zhǔn)覆蓋在PCR板上，用刮板將膜粘貼固定于板上。(6)振蕩己上樣的PCR反應(yīng)板5min(7)1253g(儀器限定)4°C離心PCR反應(yīng)板10min(8)打丌7500RealTimePCRSystem,將PCR反應(yīng)板放入反應(yīng)槽，設(shè)置相關(guān)條件及系數(shù)。18sRNA的熒光染料為VIC，AKRICI等其他基因的熒光染料為FAM，反應(yīng)體積為12u1，以master-mix為陰性對照。釆用標(biāo)準(zhǔn)TaqraanPCR反應(yīng)條件第一步50°C2min第二步95°C10min第三步95°C15s第四步60°C1min40個(gè)循環(huán)所有反應(yīng)均做三個(gè)重復(fù)，總反應(yīng)時(shí)間約為1個(gè)小時(shí)40分鐘(9)從7500RealTimePCRSystem直接得到的是各所測樣品的CT值，處理數(shù)據(jù)，求出各組樣品18srRNA的CT值的平均數(shù)、各組其他基因的CT值的平均數(shù)及相對拷貝數(shù)，分析結(jié)果。相對拷貝數(shù)的求法如下以18SrRNA為內(nèi)參照，空白組為對照，求加藥組的目標(biāo)基因的相對拷貝數(shù)。加藥組目標(biāo)基因相對拷貝數(shù)=2—SCTffiSCT值=(加藥組目標(biāo)基因CT值-加藥組18SrRNA的CT值)-(空白組目標(biāo)基因CT值-空白組的18SrRNA的CT值)3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.0forWindows統(tǒng)計(jì)處理軟件分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(*±s)表示。兩組樣品數(shù)據(jù)之間的比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05或P〈0.01為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果(一).PT-PCR分析1.ZdakOl(氯化甲氧檗因coralynechloride)及視黃酸RA(X)對tBHQ誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞中的AKRlClmRNA、NQOlmRNA、HO-1raRNA和GCLMmRNA的表達(dá)水平的影響(見圖2)。2.ZdakOl(氯化甲氧檗因coralynechloride)及視黃酸RA(X)對tBHQ誘導(dǎo)Caco2細(xì)胞中的AKRlClmRNA、NQOlmRNA、HO-1raRNA和GCLMmRNA的表達(dá)水平的影響(見圖3)。3.ZdakOl(氯化甲氧檗因coralynechloride)及視黃酸RA(X)對抗腫瘤藥Chlorambucil、Cisplatin誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞巾的AKRlClmRNA、NQ01mRNA、HO-1mRNA和GCLMmRNA的表達(dá)水平的影響。ZdakOl(氯化甲氧檗因coralynechloride)及RA(X)能有效抑制該誘導(dǎo)作用。A、B、C和D分別為各樣品細(xì)胞中的AKR1C1、NQOl、H0-1禾卩GCLMmRNA的相對拷貝數(shù)(Foldofcontrol)。圖4.抗腫瘤藥瘤可寧(Chlorambucil)和Cisplatin均能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞中的AKR1C1、NQOl、HO-l和GCLMmRNA的表達(dá)，且前者的誘導(dǎo)作用具有顯著性差異(尸<0.05)。視黃酸RA(X)對兩者的誘導(dǎo)效應(yīng)均有抑制作用，ZdakOl能顯著抑制Chlorambucil的誘導(dǎo)作用(尸<0.05)。A、B、C和D分別為各樣品細(xì)胞中的AKR1C1、NQ01、H0-1和GCLMmRNA的相對拷貝數(shù)(Foldofcontrol)。*，表示和未加藥處理細(xì)胞相比存在顯著性差異(P<0.05)。表示和10yMChlorambucil處理組細(xì)胞相比存在顯著性差異(尸<0.05)。(n=3，共重復(fù)了三次)。綜上所述,Chlorambucil和Cisplatin是臨床上常用的兩種烷化劑和氧化-還原循環(huán)物類抗癌藥，對這類抗癌藥的耐藥性研究表明它們在腫瘤細(xì)胞中激活Nrf2轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致II相解毒酶和抗氧化酶基因表達(dá)量的增加，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對抗癌藥的抗性，引起多種腫瘤對這些抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性。Nrf2現(xiàn)己成為腫瘤化療增敏解毒藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)蛋白，以Nrf2-ARE通路為分子靶點(diǎn)的抑制劑的研發(fā)和使用，一方面將有可能增敏腫瘤細(xì)胞，即減少抗癌藥物的用量從而減輕毒副作用；另一方面也會(huì)逆轉(zhuǎn)耐藥性。因此，以Nrf2-ARE為分子靶點(diǎn)的抑制劑的開發(fā)利用將有可能改善化療藥物的治療效果，為癌癥的協(xié)同治療提供一條新途徑。本實(shí)驗(yàn)室建立了靈敏、穩(wěn)定、以Nrf2為分子靶標(biāo)的熒光素酶報(bào)告蛋白細(xì)胞株ARExw篩藥平臺，預(yù)實(shí)驗(yàn)中，通過檢測細(xì)胞熒光素酶發(fā)現(xiàn)tBHQ能強(qiáng)有力地誘導(dǎo)Nrf2-ARE信號通路調(diào)控的某些基因的蛋白表達(dá)水平。因此，選擇tBHQ作為Nrf2誘導(dǎo)劑來篩選Nrf2抑制劑。研究報(bào)道，用tBHQ處理細(xì)胞能激活Nrf2，tBHQ能強(qiáng)有力誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞及結(jié)腸腺癌Caco2細(xì)胞中AKR1C1、NQOl、H0-l及GCLM這四種II相解毒酶和抗氧化酶的raRNA的表達(dá)水平，這從mRNA水平進(jìn)一步驗(yàn)證了tBHQ為Nrf2的高效誘導(dǎo)劑。本實(shí)驗(yàn)室以tBHQ為Nrf2誘導(dǎo)劑，Nrf2抑制劑RA為陽性對照，通過熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，Zdak01(氯化甲氧檗因coralynechloride)能抑制tBHQ的誘導(dǎo)作用，作用類似于視黃酸RA。研究中通過RT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，tBHQ能強(qiáng)有力誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞及Caco2細(xì)胞中AKK1C1、NQOl、H0-1及GCLM這四種II相解毒酶和抗氧化酶的mRNA的表達(dá)水平，視黃酸RA和ZdakOl(氯化甲氧檗因coralynechloride)均能有效抑制該誘導(dǎo)作用，表明tBHQ能通過激活Nrf2誘導(dǎo)II相解毒酶和抗氧化酶的表達(dá)，視黃酸RA和Zdak01(氯化甲氧檗因coralynechloride)能通過抑制Nrf2來抑制tBHQ對II相解毒酶和抗氧化酶的誘導(dǎo)作用，兩者均為Nrf2的有效抑制劑，但具體抑制機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明順鉑Cisplatin及瘤可寧Chlorambucil能誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞及結(jié)腸腺癌Caco2細(xì)胞中AKR1C1、NQOl、HO-l及GCLM這四種II相解毒酶和抗氧化酶的raRNA表達(dá)，RA對兩者的誘導(dǎo)效應(yīng)均起抑制作用，生物堿小分子化合物ZDAKOl(氯化甲氧檗因coralynechloride)能抑制Chlorambucil的誘導(dǎo)作用，這與熒光素酶活性檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。從而推測ZMK01(氯化甲氧檗因coralynechloride)能抑制垸化劑Chlorambucil抗癌藥對腫瘤細(xì)胞II相解毒酶和抗氧化蛋白的表達(dá)量的誘導(dǎo)作用，ZDAKOl(氯化甲氧檗因coralynechloride)可能減輕甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤對垸化劑抗癌藥Chlorambucil的耐藥性，聯(lián)合ZDAKOl(氯化甲氧檗因coralynechloride)能改善瘤可寧Chlorambucil抗癌藥的治療效果，ZDAK01(氯化甲氧檗因coralynechloride)具有聯(lián)合治療的開發(fā)前景。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>權(quán)利要求1、一種增敏腫瘤細(xì)胞藥劑，其特征在于對Nrf2具有效抑制作用的小分子化合物氯化甲氧檗因(coralynechlorideZDAK01)，具有如下結(jié)構(gòu)式id="icf0001"file="S2007101645225C00011.gif"wi="91"he="55"top="5"left="5"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2、如權(quán)利要求l所述一種增敏腫瘤細(xì)胞藥劑的應(yīng)用，其特征在于所述小分子化合物氯化甲氧檗因(coralynechlorideZDAK01)聯(lián)合抗癌藥用于抗腫瘤藥物的開發(fā)和制備。全文摘要一種增敏腫瘤細(xì)胞藥劑及其應(yīng)用，該增敏腫瘤細(xì)胞藥劑是對Nrf2具有效抑制作用的小分子化合物氯化甲氧檗因(coralynechlorideZDAK01)，可以聯(lián)合抗癌藥用于抗腫瘤藥物的開發(fā)和制備。該小分子化合物氯化甲氧檗因具有如下結(jié)構(gòu)式。文檔編號A61K31/4375GK101181268SQ20071016452公開日2008年5月21日申請日期2007年12月10日優(yōu)先權(quán)日2007年12月10日發(fā)明者唐修文申請人:浙江大學(xué)