專利名稱：：一種基于細胞核酸結(jié)合蛋白基因沉默的抑制腫瘤細胞生長新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新型的抑制腫瘤細胞生長的方法，該方法能夠在體外抑制人腫瘤細胞的生長。該方法為腫瘤發(fā)生機理的研究提供了一個方便的途徑，為抗腫瘤的基因治療研究提供了潛在的靶點。
背景技術(shù)：
：在全球范圍內(nèi)，惡性腫瘤的死亡率高居榜首。在細胞生物學(xué)領(lǐng)域，一般認為腫瘤的發(fā)生是細胞增殖失控所致。正常細胞的增殖受到一系列調(diào)控因子的復(fù)雜調(diào)控，如果有一個或多個調(diào)控因子不能正常工作，就可能會引起細胞增殖的紊亂。通過基因治療的方法來治療胂瘤一直是科學(xué)家們努力的方向，基因治療的作用靶點多選擇對細胞增殖具有重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過分子生物學(xué)的手段來糾正腫瘤發(fā)生相關(guān)因子的異常行為達到治療腫瘤的目的。細胞核酸結(jié)合蛋白(cellularnucleicacid-bindingprotein,CNBP)正是一個在細胞增殖中處于樞紐調(diào)控位置的基因，與肺瘤發(fā)生有著密切關(guān)系，是一個潛在的基因治療靶點。細胞核酸結(jié)合蛋白是一個含有7個鋅指結(jié)構(gòu)的19kD蛋白，1989年首次克隆到了人CNBP。隨后的十幾年里研究人員又相繼克隆出了小鼠、大鼠、雞、爪蟾、斑馬魚等脊推動物的CNBP。CNBP在進化過程中具有高度的保守性，脊推動物CNBP的氨基酸序列同源性高達80%以上，高度保守性提示它具有重要的生物學(xué)功能。近十幾年的研究表明，CNBP可以通過調(diào)控c-MYC基因來促進細胞增殖。在常見人腫瘤細胞中，CNBP均有較高表達。CNBP可能是調(diào)節(jié)細胞增殖的樞紐性調(diào)控因子。RM干擾技術(shù)可以方便快捷的實現(xiàn)特定基因表達下調(diào)，是繼基因敲除與反義核酸技術(shù)后又一種有效的基因沉默方法。含有千擾序列的重組質(zhì)?？稍诓溉閯游锛毎麅?nèi)穩(wěn)定表達莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RM,莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA被進一步加工成siRMs,從而干擾目的基因，造成RNA水平上的基因沉默。本發(fā)明構(gòu)建了針對細胞核酸結(jié)合蛋白的RM干擾質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人宮頸癌細胞HeLa細胞系，有效抑制了腫瘤細胞的生長。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明選取細胞核酸結(jié)合蛋白為靶基因，利用RNA干擾技術(shù)使該基因沉默，創(chuàng)建了一個有效的抑制體外胂瘤細胞生長的方法。本發(fā)明在細胞核酸結(jié)合蛋白基因的編碼區(qū)選取翻譯起始位點后的第392-410位作為干擾乾位點，合成了可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸序列，通過分子生物學(xué)方法獲得了含有該莖環(huán)結(jié)構(gòu)的真核干擾質(zhì)粒。將干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人宮頸癌細胞HeLa細胞系中。半定量RT-PCR和蛋白雜交分析技術(shù)顯示，干擾細胞抹中CNBP的mRNA水平和蛋白表達水平有了明顯下降，即CNBP基因被有效的沉默了。通過測定生長曲線，發(fā)現(xiàn)HeLa細胞的生長速度明顯低于對照組。利用流失細胞儀分析了細胞周期，結(jié)果顯示HeLa細胞在CNBP基因沉默后S期細胞減少，G!期細胞增多，表明HeLa細胞的增殖受到抑制。本發(fā)明提出的技術(shù)路線可以進一步應(yīng)用于不同組織來源的腫瘤細胞和不同的腫瘤相關(guān)基因，可以用來研究腫瘤的發(fā)生機制，尋找用于抗肺瘤的基因治療的理想靶點。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細描述。圖1:本發(fā)明中選擇的干擾靶位點。圖2:CNBP基因沉默后HeLa細胞的生長速度明顯低于對照組。圖3:CNBP基因沉默后HeLa細胞中S期細胞減少，G!期細胞增多，表明增殖受到抑制。干擾靶位點的核酸序列GCACCAAAGTGAAGTGCTA具體實施例方式在下面的實施例中進一步說明了本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的范圍。實施例1本發(fā)明中使用的引物序列及用途<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2真核干擾質(zhì)粒的構(gòu)建將引物RMi-F,RNAi-R分別溶于雙蒸水中，調(diào)濃度至l嗎/pl。在50|al體系中加入每個引物各2nL,雙蒸水469(TC放置5min，緩慢降溫至37'C,然后37'C退火1h使之形成雙鏈。將雙鏈與經(jīng)勘/z;HI和A7/7dIII酶切的Ambion/^司pSilencer3.1-H1neo載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a細菌，然后涂布于含氨卞青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37度培養(yǎng)12小時。挑選單克隆進行酶切鑒定(引物-沒計時陽性克隆的勘/rflI和III酶切位點將輛7皮壞，即勘/ziHI和#//dIII切不開的為陽性克隆)。陽性克隆培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒，通過測序確定序列。實施例3質(zhì)粒DM的大量制備(采用北京威格拉斯生物技術(shù)公司質(zhì)粒大量提取純化試劑盒)1)收集過夜培養(yǎng)菌100ml,4°C6000rpm離心10min，棄去上清。2)加入溶液I5ml，充分震蕩菌體沉淀，使其完全分散。將細菌懸液移入50ml離心管中。3)加入溶液II5ml，輕輕顛倒離心管6一8次，室溫放置5min,使菌體完全裂解，溶液變透明。4)加入溶液III5ml，立即顛倒離心管6_8次，充分混勻，至白色絮狀物產(chǎn)生，水上放置10一15min。5)4'C13000rpm離心15min,用3層無菌紗布過濾上清于另一離心管中。6)加入10ml異丙醇，充分混勻，冰上^C置15min。7)4°C13000rpm離心10min,棄去上清，倒置輕輕瀝干殘余液體，加入0.5ml溶液I，充分溶解沉淀。移入新的1.5ml離心管，室溫放置20min。8)室溫12000rpm離心2min,上清移入新的L5ml離心管。9)加入100^1雜質(zhì)清除液A,輕輕混勻，12000rpm離心2min,上清移入新的1.5ml離心管。10)再次加入100^1雜質(zhì)清除液A，輕輕混勻，12000rpm離心5min，上清移入新的1.5ml離心管。11)加入70^1雜質(zhì)清除液B，輕輕混勻，12000rpm離心5min,上清移入新的1.5ml離心管。12)加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置10min,12000rpm離心10min,棄去上清，用70°/乙醇輕輕洗涂，棄去液體，室溫倒置晾干5min。3)加入0.5raTE溶解沉淀。14)加入200nl雜質(zhì)清除液C,混勻后水上放置30min,12000rpm離心10min,棄去上清，用70%乙醇輕輕洗滌2次，室溫倒置晾干5min使乙醇完全揮發(fā)。15)加入100—200nlTE溶解沉淀。實施例4脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核細胞轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的細胞以105細胞/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，長到70-80%匯合時，可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2h換入50(^1新鮮的無雙抗的DMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染時，在1.5ml離心管A管中加入50jxl無雙抗、無血清的培養(yǎng)基和0.8-1.2叫質(zhì)粒，在另一B管中加入50nl無雙抗、無血清的培養(yǎng)基和2(UInvitrogen公司Lipofectamine2000試劑，將A和B兩管輕輕混勻，室溫放置30min后，將混合物逐滴緩慢加到培養(yǎng)板中，輕輕混勻，培養(yǎng)12-16h后，換新鮮培養(yǎng)基。細胞轉(zhuǎn)染24-48h后，用含新霉素(600嗎/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，3天一換液，篩選2-4周。實施例5細胞生長曲線的測定取對數(shù)生長期細胞，lxl0"田胞/孔接種于24孔板中，分別于0、2、4、6天計數(shù)，3個復(fù)孔，作生長曲線。實施例6利用流式細胞儀分析細胞周期取對數(shù)生長期細胞，磷酸鹽緩沖液PBS洗2次，1000rpm離心lOtnin,棄上清，留0.2ml左右PBS重懸細胞，加入lml70°/。乙醇于4'C固定8h以上，1500rpm離心10min,棄上清，細胞沉淀用PBS洗兩次，留O.2mlPBS，加入終濃度為50嗎/mlRnaseA,37XM呆溫30-45min,水浴1rain,加入終濃度為65嗎/ml碘化丙錠，4'C避光染色30min,流式細胞儀分析細胞周期。權(quán)利要求1.一種基于細胞核酸結(jié)合蛋白基因(CNBP)沉默的抑制腫瘤細胞生長的方法，該方法包括以下步驟(1)將化學(xué)合成的含有CNBP干擾靶位點的引物退火獲得含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的插入序列；(2)將插入序列構(gòu)建到真核質(zhì)粒pSilencer3.1-H1中；(3)利用脂質(zhì)體將干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人乳腺癌細胞HeLa細胞系，并進行穩(wěn)定篩選；(4)測定細胞生長曲線和細胞周期來判斷細胞生長是否受抑制。2.—種含有權(quán)利要求1所述的CNBP干擾靶位點的真核表達載體，是pSilencer3.1-HI-CNBP。3.—種含有權(quán)利要求2所述表達栽體的原核重組菌。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組菌，其中所述的重組菌是含有重組質(zhì)粒的重組大腸桿菌BL21-CNBP。5.—種含有權(quán)利要求1所述的CNBP干擾靶位點核酸序列(具體序列見說明書)。6.—種含有權(quán)利要求2所述表達栽體的重組HeLa細胞抹。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組HeLa細胞抹，其中所述的重組HeLa細胞抹是含有重組質(zhì)粒pSilencer3.1-H1-CNBP的重組HeLa細胞林HeLa-CNBP。全文摘要本發(fā)明涉及一種新型的抑制腫瘤細胞生長的方法，該方法能夠在體外抑制人腫瘤細胞的生長。本發(fā)明在細胞核酸結(jié)合蛋白基因的編碼區(qū)選取干擾靶位點，構(gòu)建了針對該位點的真核干擾質(zhì)粒，將干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人宮頸癌細胞HeLa細胞系中，沉默了CNBP基因，明顯抑制了HeLa細胞的生長。本發(fā)明提出的技術(shù)路線可以進一步應(yīng)用于不同組織來源的腫瘤細胞和不同的腫瘤相關(guān)基因，該方法為腫瘤發(fā)生機理的研究提供了一個方便的途徑，為抗腫瘤的基因治療研究提供了潛在的靶點。文檔編號A61K48/00GK101422619SQ20071016526公開日2009年5月6日申請日期2007年11月2日優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日發(fā)明者張世馥,鋒楊申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所