專利名稱：一種組織工程化骨及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織工程化骨，具體地說關(guān)于一種Nell-1基因修飾 的bMSCs構(gòu)建組織工程化骨及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Nell-l (Nel樣I型分子)是具有成骨能力的新基因，與顱縫早閉 有關(guān)。Nel卜l蛋白是一個(gè)分泌蛋白，結(jié)構(gòu)上含有分泌信號(hào)肽序列， 一個(gè) 氨基端trombospondin-1-like分子，5個(gè)含半胱氨酸殘基的Von Wi 1 lebrand因子樣重復(fù)，以及6個(gè)表皮生長因子(EGF )樣功能團(tuán)。Nel l-l 編碼90kDa的多肽，在真核細(xì)胞中，N端與50kDa的碳水鏈連接，在胞漿 內(nèi)糖基化成140kDa。Ne11-l最終形成400kDa磷酸化的三聚體分泌到胞夕卜。 種系間基因序列高度保守，比如人與大鼠Nel 1-1蛋白有93 %的同源性。 在研究顱縫早閉時(shí)，發(fā)現(xiàn)該基因在非家族性非系統(tǒng)性患者的早閉顱縫部位 上調(diào)。人的Nell-l主要在顱縫成骨部位的間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。 CMV驅(qū)動(dòng)的Nell-l轉(zhuǎn)基因小鼠，主要表現(xiàn)顱骨增生，發(fā)生顱縫早閉。最 近的研究顯示，Nell-l促進(jìn)成骨的能力非常強(qiáng)。Nell-l it^達(dá)可加速顱 骨成骨細(xì)胞系MC3T3和原代成骨細(xì)胞FRCC的分化，礦化結(jié)節(jié)較對(duì)照組增 加約6倍，而Nel卜l的反義表達(dá)可抑制該細(xì)胞的分化。Nell-l體外誘導(dǎo)FRCC細(xì)胞ALP表達(dá)的能力比BMP-4強(qiáng)。應(yīng)用Nell-1蛋白修復(fù)小鼠顱骨缺 損的在一定的條件下與BMP-2相當(dāng)。有意思的是該基因可以促進(jìn)成骨細(xì)胞 的分化以及成骨分化終末階段所伴隨的凋亡，而對(duì)成纖維細(xì)胞系或原代的 成纖維細(xì)胞卻沒有作用，其作用部位可能是在成骨信號(hào)通路的下游，或者 通過與BMP成骨作用不同的機(jī)制促進(jìn)成骨。由于BMPs對(duì)多種組織和細(xì)胞 有廣泛的生物學(xué)活性，而Nell-1促進(jìn)細(xì)胞的礦化只針對(duì)具有成骨潛能的 細(xì)胞，局限在成骨環(huán)境內(nèi)成骨，所以應(yīng)用該因子在安全性方面較BMP有著 潛在的優(yōu)越性。Nell-1轉(zhuǎn)基因小鼠的出生死亡率和致畸率大大低于BMP 轉(zhuǎn)基因小鼠，也提示Nel卜l具有較低的全身毒性。Nell-l作為新克隆的 成骨基因，在顱頜面部骨組織特異性表達(dá)的特點(diǎn)、潛在的應(yīng)用安全性以及 明顯的成骨能力，使得應(yīng)用Nell-l修復(fù)口腔頜面部骨缺損具有良好的應(yīng) 用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于 (1 )提供一種Nell-1基因〗務(wù)飾的bMSCs構(gòu)建組織工程化骨； (2)提供組織工程化骨用途。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方法來實(shí)現(xiàn)的選擇Nell-1基因腺病 毒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)擴(kuò)增的大鼠bMSCs，Nell-1基因是具有成骨能力的新 基因，目前的研究認(rèn)為在細(xì)胞水平上，NeU-1單獨(dú)誘導(dǎo)一定程度的成骨 分化，它可能操縱了一些成骨相關(guān)基因的下游途徑，并影響了其他信號(hào)通 路，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。作為一種新克隆的成骨相關(guān)基因，Nell-1具有潛在的安全性以及明顯的成骨作用，它的產(chǎn)物蛋白可能成為骨組織工程 中一種新的生長因子。根據(jù)目前研究結(jié)果的總結(jié)，在成骨方面它有如下的
特點(diǎn)(l)生物學(xué)特異性，Nell-l促進(jìn)成骨主要作用于成骨細(xì)胞或具有成 骨潛能的細(xì)胞，尚未見作用于其他細(xì)胞；(2)細(xì)胞周期特異性，Nel卜l基 因只在分化期作用于成骨細(xì)胞。它的機(jī)理可能是操縱成骨相關(guān)基因的下游 途徑，相對(duì)來說，具有成骨特異性；(3)潛在較低的生物學(xué)毒性，Nel卜l 轉(zhuǎn)基因小鼠的出生死亡率和致畸率都大大低于BMP轉(zhuǎn)基因小鼠；采用腺病 毒作為載體，不僅僅是由于轉(zhuǎn)染效率的考慮，更重要的是病毒基因組不會(huì) 將外源基因整合到細(xì)胞染色體。腺病毒載體能夠克服組織特異性的轉(zhuǎn)染屏 障，不會(huì)在不需要的組織中產(chǎn)生轉(zhuǎn)染。腺病毒所介導(dǎo)的基因只能短暫表達(dá)， 較為安全。而組織工程化組織構(gòu)建是一個(gè)相對(duì)短暫的過程，只需要一段時(shí) 間內(nèi)的基因表達(dá)，如BMP-2基因用于骨構(gòu)建需3周左右的時(shí)間。所以采用 短暫表達(dá)的腺病毒更適合組織工程化骨的構(gòu)建。腺病毒基因轉(zhuǎn)染作為骨組 織工程的方法在研究細(xì)胞系已經(jīng)得到較多的應(yīng)用，被證實(shí)有很肯定的轉(zhuǎn)染 效率和活躍的治療性生長因子表達(dá)。骨髄基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells,bMSCs)具有來源豐富，采集方便，容易在體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)、擴(kuò)增的 特點(diǎn)，并具有明確的成骨潛能，是組織工程化骨理想的種子細(xì)胞。該細(xì)胞在 體外培養(yǎng)具有較強(qiáng)的傳代增殖能力，外源目的基因易于導(dǎo)入，因此也是骨
缺損基因治療較為理想的靶細(xì)胞。本發(fā)明利用腺病毒介導(dǎo)的Nell-l基因 體外轉(zhuǎn)染大鼠bMSCs,轉(zhuǎn)染后72小時(shí)基因轉(zhuǎn)染效率達(dá)到峰值，基因表達(dá) 也達(dá)到峰值。利用LacZ基因作為測(cè)定轉(zhuǎn)染效率和陰性對(duì)照的報(bào)告基因。 LacZ為編碼p-半乳糖苷酶(p-galactosidase, |3-gal)的基因。使用LacZ的原理為基因轉(zhuǎn)染之后合成的(3-gal能水解X-gal，產(chǎn)生藍(lán)色的沉 淀能在顯微鏡下直觀地觀察到并計(jì)算。在M01=80pfu/cell時(shí)可獲得54. 8 ±4.6%的轉(zhuǎn)染效率，在MOI蕓160pfu/ce11時(shí)，基因轉(zhuǎn)染效率隨著轉(zhuǎn)染滴 度增加而增高。反轉(zhuǎn)錄PCR顯示，在轉(zhuǎn)染目的基因的泳道中，400bp大小 的條帶明顯。結(jié)果表明有Nell-l基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，而LacZ組和空白 對(duì)照組未見此條帶出現(xiàn)，表明此兩組中無Nell-l基因的表達(dá)。以P-actin 蛋白為內(nèi)參照，進(jìn)行各組間內(nèi)參照蛋白濃度一致的蛋白電泳，可見轉(zhuǎn)染目 的基因泳道有大小約90kDa的蛋白條帶表達(dá),條帶的表達(dá)隨轉(zhuǎn)染滴度的增 加而更加明顯，顯示轉(zhuǎn)染目的基因的泳道有Nell-1基因蛋白水平的表達(dá)， 而LacZ組和空白對(duì)照組未見此條帶出現(xiàn)，顯示對(duì)照組無Nell-1基因蛋白 水平的表達(dá)。
光基團(tuán)的探針來標(biāo)記PCR產(chǎn)物。本發(fā)明在實(shí)時(shí)熒光PCR前用反轉(zhuǎn)錄PCR 進(jìn)行初步驗(yàn)證時(shí)，設(shè)定未見明顯二聚體的引物設(shè)計(jì)及退火溫度為采用標(biāo)
見非特異性PCR產(chǎn)物，說明實(shí)時(shí)熒光PCR的結(jié)果是可信的?；?全測(cè)結(jié)果 顯示利用腺病毒介導(dǎo)的Nel卜l基因體外轉(zhuǎn)染大鼠bMSCs后促進(jìn)ALP、BSP、 OCN、 OPN等成骨分化表型標(biāo)志基因的上調(diào)。
應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)的Nell-1基因體外轉(zhuǎn)染鼠、兔、羊、豬、狗等bMSCs， 然后將基因修飾的細(xì)胞與生物支架材料復(fù)合(如P-TCP、天然型無機(jī)骨 NNB、珊瑚、藻酸釣、PGA、 PLGA、膠原等)可以構(gòu)建組織工程化骨促進(jìn)頜 骨缺損的修復(fù)。以貝奧路公司研制的微孔結(jié)構(gòu)及降解率可控P -磷酸三鉤(P-tricalcium phosphate, p-TCP)為例，可以起到臨時(shí)支架作用，引導(dǎo) 骨生長，允許周圍的骨向材料中浸潤長入，然后材料被逐漸吸收，無炎癥 或排斥反應(yīng)，不產(chǎn)生局部或全身性毒性反應(yīng)。P-TCP是磷酸三鉤不同相 結(jié)晶物的一種。自二十世紀(jì)70年代以來，P -TCP —直是骨替代材料研究 領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，其分子式為Ca3 (P04) 2，工業(yè)合成P -TCP 4分料的釣/磷比 為1.49-1.51,與正常骨組織的鈣磷比接近。P-TCP的成分與骨基質(zhì)的 無機(jī)成分[Cai。 (P04) 6 (OH) 2 ]相似，故被認(rèn)為具有良好的生物相容性。P -TCP 具有吸收緩慢，低免疫反應(yīng)和低毒性等特點(diǎn)，并具有骨引導(dǎo)性，適合作為 組織工程修復(fù)頜骨的材料。Nell-l基因修飾大鼠bMSCs復(fù)合P -TCP材料 棵鼠皮下植入實(shí)驗(yàn)大體觀察顯示植入物表面皮膚完整光滑，無積液，傷口 無感染，植入物無排出。周圍軟組織包裹材料，未見異物排斥反應(yīng)，也未 見明顯炎癥反應(yīng)。HE染色標(biāo)本病理學(xué)觀察N組可見較多的軟骨樣和板層 骨樣組織自支架區(qū)向空隙區(qū)生長，血管結(jié)構(gòu)和骨陷窩樣結(jié)構(gòu)較C組和L 組明顯。成骨面積N組高于其余兩組。應(yīng)用NeU-1基因修飾的bMSCs還 可以與支架材料復(fù)合，構(gòu)建組織工程化骨促進(jìn)大鼠臨界骨組織缺損(CSD ) 的》務(wù)復(fù)。Micro-CT可以更加直 見的顯示N組^修復(fù)區(qū)i^密度大于L組，骨 質(zhì)生長未超出材料的體積范圍；N組在組織工程化骨與材料結(jié)合處也更加 致密。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下 一種Nell-1基因修飾的bMSCs構(gòu)建組織工 程化骨，它由下列方法制得
(1) Nell-l基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞；
(2 )將步驟(1)得到的產(chǎn)物、生物支架材料構(gòu)建組織工程化骨，所述的Nel 1-1基因以MOI=50 ~ 80pfu/cel 1工作濃度轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的骨髓 基質(zhì)細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞來源鼠、兔、羊、狗、豬骨髓基質(zhì)細(xì)胞，生物支 架材料是磷酸三鉤、多孔羥基磷灰石、珊瑚、藻酸鉤、膠原，生物支架材 料是P-磷酸三鈣，細(xì)胞密度為5xl(T/ml的細(xì)胞懸液與生物支架材料復(fù) 合。
Nell-1基因修飾的bMSCs構(gòu)建組織工程化骨在領(lǐng)骨缺損修復(fù)領(lǐng)域中 應(yīng)用。
本發(fā)明所公開一種組織工程化骨及其應(yīng)用，其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在本發(fā)明利 用腺病毒介導(dǎo)的Nell-l基因有效的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染大鼠bMSCs，并成功獲得 了 Nell-l轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá)，為骨組織工程中Nel卜l基因治療打 下了基礎(chǔ)。本發(fā)明把Nell-l基因治療與組織工程方法結(jié)合起來，以bMSCs 作為基因治療的靶細(xì)胞，同時(shí)應(yīng)用其作為組織工程化骨的種子細(xì)胞，通過 基因修飾bMSCs后的自分泌和旁分泌作用，加速成骨。Nell-l基因修飾 的組織工程化骨植入棵鼠體內(nèi)后，材料網(wǎng)孔內(nèi)新骨成骨多，Micro-CT顯示 Nell-l基因修飾的組織工程化骨修復(fù)大鼠臨界骨組織缺損時(shí)，可以在大 鼠頜骨CSD內(nèi)安全生長，并能更有效的修復(fù)骨缺損。


圖1:轉(zhuǎn)染效率測(cè)定，在工作濃度時(shí)可獲得較高的轉(zhuǎn)染效率(熒光顯 微鏡下觀察，放大倍數(shù)IOO)。
圖2:轉(zhuǎn)染bMSCs后Nell-l基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，反轉(zhuǎn)錄PCR轉(zhuǎn)染 后3天各組內(nèi)參照條帶均較為明顯。N組泳道中出現(xiàn)400bp左右大小的條帶而對(duì)照組和LacZ組無相應(yīng)條帶出現(xiàn)。C:空白對(duì)照組；N: Nell-l組； L: LacZ組。
圖3:轉(zhuǎn)染bMSCs后Nell-1基因在蛋白水平的表達(dá)，Western blot 顯示各組的內(nèi)參照條帶灰度較為相近，N組出現(xiàn)90kDa左右大小的條帶， MOI為20、 40、 80pfu/cell的3組條帶灰度依次增加，未對(duì)照組和LacZ 組無相應(yīng)的條帶出現(xiàn)。C:空白對(duì)照組；L: LacZ組；N20/N40/N80: Nell-1 組，MOI依次為20/40/80pfu/cell。
圖4: VonKossa硝酸銀染色，第15日至第28日，各組中的4丐結(jié)節(jié) 數(shù)目逐漸增多，Von Kossa硝酸銀染色后，C組和L組4丐結(jié)節(jié)數(shù)目少于N 組。
圖5: N組棵鼠皮下異位成骨組織切片(HE染色，放大倍數(shù)IOO)可見 較多的軟骨樣和板層骨樣組織自支架區(qū)向空隙區(qū)生長，成骨面積較C組和 L組明顯。
圖6: C組棵鼠皮下異位成骨組織切片(HE染色，放大倍數(shù)IOO)。 圖7: L組棵鼠皮下異位成骨組織切片(HE染色，放大倍數(shù)IOO)。 圖8: Micro-CT顯示N組(右側(cè)頜骨)修復(fù)區(qū)域密度大于L組(左側(cè)
頜骨)，骨質(zhì)生長未超出材料的體積范圍；N組在組織工程化骨與材料結(jié)
合處更加致密。
圖9:頜骨缺損組織切片術(shù)后8周N組(HE染色，放大倍數(shù)200)的成 骨較C組更加明顯。
圖10:頜骨缺損組織切片術(shù)后8周C組(HE染色，放大倍數(shù)200)的 成骨。圖11:術(shù)后4周Nell-l基因轉(zhuǎn)染的bMSCs所形成的新骨(E， G)較 BMP-2組骨組織更致密(F, H0。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果分析和相應(yīng)的說明書附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一 步詳細(xì)說明。 實(shí)施例1
一、Nell-l基因轉(zhuǎn)染大鼠bMSCs及表達(dá)測(cè)定
步驟一、原代bMSCs的獲取及培養(yǎng)無菌狀態(tài)下，取SPF級(jí)6周齡雄 性Fischer 344大鼠脛骨和股骨骨髓，所得細(xì)胞懸液離心，吸去上清液和 漂浮于液面的脂肪，加DMEM培養(yǎng)液，均勻吹散，置于培養(yǎng)條件為37"C恒 溫混合氣體(含95%空氣，5%C02)， 100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 周換液3次，待90%左右的細(xì)胞融合時(shí)予以傳代，培養(yǎng)至第2至3代時(shí)， 更換培養(yǎng)液為DMEM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，用于研究。
步驟二、 Nell-l基因轉(zhuǎn)染bMSCs 細(xì)J包生長至70 - 80%融合時(shí)，予以 傳代，24小時(shí)后細(xì)胞全部附著于底壁，此時(shí)吸去DMEM誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液， 無血清DMEM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液洗滌2次，加入一半量包含一定滴度腺病毒 載體的無血清DMEM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，Nell-1腺病毒載體濃度為3. 5 x 10"pfu/ml，加入稀釋的攜基因的腺病毒載體后，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一小時(shí)， 期間每隔15分鐘均勻輕搖晃，使病毒充分接觸細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)染效率。一 小時(shí)后加入另外半量的含20%血清的培養(yǎng)液。此時(shí)培養(yǎng)液中FBS含量為 10%。置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后，吸去培養(yǎng)液，PBS液洗滌兩次，加入全量成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每3天換液。Nell-l基因從美國0rigen 公司獲得。
步驟三、基因轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) 細(xì)胞接種于6孔板。轉(zhuǎn)染LacZ基因 72小時(shí)后，吸去培養(yǎng)液，以PBS輕輕漂洗細(xì)^^兩次，室溫下以4°/。多聚曱 醛固定10分鐘，再次以PBS輕漂洗兩次。每孔加入X-gal染色液lml, 37°C水浴箱中染色1-3小時(shí)，觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞綠色染色即以PBS漂洗中止實(shí) 驗(yàn)，在100x放大倍數(shù)下隨機(jī)選擇6個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)LacZ表達(dá)陽性的細(xì)胞 占細(xì)胞總數(shù)的百分比。
步驟四、反轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定Nell-l基因的轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，提 取總RNA,反應(yīng)的條件為42。C水浴2小時(shí)后，立即》文入95 °C水浴5分 鐘進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成好的cDNA模板立即進(jìn)行PCR反應(yīng)。Nell-l的引物序 列如下正向引物5， -CTGTGTGGCTCCTAACAAGTGTG-3，；反向引物5， -GGATTCTGGCAATCACAAGCTGCT-3',退火溫度60。C,預(yù)計(jì)產(chǎn)物400bp。內(nèi)參 照J(rèn)3-actin的引物序列正向引物5， - GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3，；反 向引物5， - AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3，，退火溫度60°C。循環(huán)參數(shù)為 95。C預(yù)變性5分鐘，95°C 30秒，60°C 30秒，72°C 30秒，30個(gè)循環(huán)，最 后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物采用2%凝膠電泳紫外燈下觀察，與DNA Ladder Marker對(duì)比磁基大小，以出現(xiàn)與預(yù)計(jì)產(chǎn)物石咸基大小相同的片斷為 陽性。
步驟五、Western blot檢測(cè)Nell-l基因的蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染后72小 時(shí)，吸去培養(yǎng)液，漂洗細(xì)胞，裂解，移入EP管；振蕩后置冰盒中，離心， 移上清入另一 EP管；加入等體積2%SDS和1M DTT的混合物(SDS: DTT體積比為4:1),充分振蕩。變性后立即冷卻。配濃度為5%的SDS丙烯酰胺 積層膠，6Y。的SDS丙烯酰胺分離膠，以80V電壓在積層膠中電泳，隨后以 100V電壓在分離膠中電泳。聚偏氟乙烯(PVDF)膜預(yù)濕，》丈入電轉(zhuǎn)緩沖 液浸泡15分鐘，隨后將蛋白電泳分離后的凝膠與PVDF膜置入電轉(zhuǎn)系統(tǒng)電 轉(zhuǎn)。封閉后孵育一抗。 一抗滴度anti-Nell-1為1: 850的兔抗；內(nèi)參 照anti-p-actin為1: 10000的小鼠抗。二抗山羊抗兔抗體，滴度1: 3000;山羊抗鼠抗體，滴度l: 1000。以ECL plus化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。 二、 Nel卜l基因影響大鼠bMSCs成骨分化的體外研究 步驟一、Von Kossa硝酸銀法染色 bMSCs接種在6孔板內(nèi)，每孔接 種2乂105個(gè)?；蜣D(zhuǎn)染方法同前。轉(zhuǎn)染21， 28天后，細(xì)胞以O(shè). 1°/。戊二醛 溶液固定，蒸餾水漂洗，加入5%硝酸銀溶液，紫外燈下反應(yīng)，蒸餾水漂 洗后加入5。/U克代辟u酸鈉溶液反應(yīng)，酒精漂洗?！芬姴熘睆酱笥?. 5 mm的鈣 結(jié)節(jié)lt目。
步驟二、 Real-time PCR測(cè)定成骨相關(guān)基因表達(dá) 在基因轉(zhuǎn)染后3 天，7天，14天，21天進(jìn)行總RNA提取純^f匕及cDNA合成。采用PP5軟件 設(shè)計(jì)候選大鼠A^P、 BSP、 0C、 0P和Sox9基因引物，并合成引物序列。采 用梯度PCR擴(kuò)增樣品，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在50°C-68°C的范圍內(nèi)選定最佳 退火溫度，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂凝膠電泳紫外燈下觀察， 與DM Ladder Marker對(duì)比堿基大小，以出現(xiàn)與候選基因石tt大小相同的 片l殳為陽性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的體系加入96孔反應(yīng)^反后在ABI 7300 型熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。65 。C -95 °C繪制熔解曲線。所有標(biāo)本均重 復(fù)3次檢測(cè)。檢測(cè)的臨界點(diǎn)設(shè)定為PCR反應(yīng)過程中，焚光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定的熒光信號(hào)閾值對(duì)應(yīng)的循環(huán)^t (cycle number at threshold, CT值)處。 為了校正標(biāo)本RNA的質(zhì)量和反轉(zhuǎn)錄效率的差異，將標(biāo)本才企測(cè)所得的基因 CT值與相對(duì)應(yīng)的GAPDH基因CT值相減來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
三、 Nell-l基因修飾大鼠bMSCs復(fù)合fi-TCP材料凈果鼠皮下成骨 步驟一、支架材料的處理與細(xì)胞復(fù)合 TCP材料高溫消毒備用。
與細(xì)胞復(fù)合前24小時(shí)與成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中浸泡以充分排出孔隙中的氣 泡。用消毒濾紙吸出孔隙中的培養(yǎng)液后，立即復(fù)合。將基因轉(zhuǎn)染3天的 bMSCs消化，制成細(xì)胞密度為5 x 107ml的細(xì)胞懸液,緩慢滴加到|3-TCP
材料至飽和狀態(tài)，復(fù)合后的細(xì)胞-支架復(fù)合物即刻植入。
步驟二、細(xì)胞-支架復(fù)合物棵鼠皮下植入 經(jīng)吸入少量乙醚后，棵 鼠腹部注射氯胺酮3mg/0. 3ml麻醉，在背部皮下剪開3個(gè)約lcm長的切口 ， 以止血鉗鈍性分離皮下組織，復(fù)合物植入，縫合。
步驟三、取材及組織病理學(xué)觀察 術(shù)后4周注射過量戊巴比妥致死， 分離材料周圍皮下組織，取出移植物，置10y。EDTA液脫鉤2周，脫水，包 埋于石蠟，取圓柱形橫斷面切片，觀察新骨成骨面積。
四、 構(gòu)建組織工程化骨促進(jìn)頜骨缺損修復(fù)
步驟一、大鼠bMSCs培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染 取Fischer 344大鼠脛骨和 股骨骨髓，置于培養(yǎng)條件為37。C恒溫混合氣體，100%飽和濕度的培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)。培養(yǎng)至第2至3代時(shí)，更換培養(yǎng)液為DMEM成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。細(xì) 胞生長至70 - 80%融合時(shí)，予以傳代，24小時(shí)后細(xì)胞全部附著于底壁，進(jìn) 行基因轉(zhuǎn)染。步驟二、組織工程化骨的構(gòu)建 將基因轉(zhuǎn)染3天的bMSCs消化，制 成細(xì)月包密度為5 x 10Vml的細(xì)月包懸液，纟爰i曼滴力口到直徑為5mm的圓柱形P -TCP材料至飽和狀態(tài)，使得材料濕潤，而液體不流出。
步驟三、大鼠下頜骨缺損模型創(chuàng)建及缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)無菌狀態(tài)下將成 年Fisher 344大鼠麻醉、頜下區(qū)備皮、消毒，在大鼠頜下做平行于下頜 下緣的切口，切開皮膚，皮下組織和肌肉-骨膜層并翻瓣，暴露下頜骨的 頰側(cè)和舌側(cè)骨板。用Kavo高速鉆機(jī)帶5mm外徑的鉆頭在下頜升支制造5mm 直徑的圓形缺損，過程中始終緩慢注射生理鹽水冷卻。在鉆孔過程中注意 對(duì)頜骨舌側(cè)軟組織的保護(hù)，防止傷及翼靜脈叢。將bMSCs-P-TCP復(fù)合物 填充于缺損中。隨后以4-0縫線縫合肌肉-骨膜層和皮膚-皮下組織層。
步驟四、取材、組織病理學(xué)觀察和Micro-CT掃描 將大鼠注射過量 戊巴比妥致死，銳性分離軟硬組織，以骨剪取出移植物，脫4丐、脫水，石 蠟包埋、切片、HE染色觀察。將樣本置于Micro-CT系統(tǒng)的檢測(cè)試管內(nèi)，沿 頜骨的長軸方向掃描，獲取連續(xù)的Micro-CT圖像。圖像高斯濾波后，選 取水平面圖像信息，并選取能夠顯示左右兩側(cè)缺損區(qū)域的3D圖像。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
一、Nell-l基因有效的轉(zhuǎn)染大鼠bMSCs并獲得表達(dá) 轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，基因轉(zhuǎn)染效率達(dá)到峰值。選取此時(shí)間點(diǎn)來測(cè)定基因 轉(zhuǎn)染的效率。直視下即可以直觀地觀察到不同轉(zhuǎn)染滴度下轉(zhuǎn)染效率的差 異。沒有轉(zhuǎn)染LacZ基因的細(xì)胞幾乎無P-半乳糖苷酶活性，即不被X-Gal 染色。在MOI-80pfu/ce11時(shí)可獲得54. 8±4. 6%的轉(zhuǎn)染效率(見圖1)，在 M01^160pfu/ce11時(shí)，基因轉(zhuǎn)染效率隨著轉(zhuǎn)染滴度增加而增高。反轉(zhuǎn)錄PCR顯示，在轉(zhuǎn)染目的基因的泳道中，400bp大小的條帶明顯。結(jié)果表明 有Nell-l基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，而LacZ組和空白對(duì)照組未見此條帶出現(xiàn)， 表明此兩組中無Nell-1基因的表達(dá)(見圖2)。以p-actin蛋白為內(nèi)參照， 進(jìn)行各組間內(nèi)參照蛋白濃度一致的蛋白電泳，可見轉(zhuǎn)染目的基因泳道有大 小約90kDa的蛋白條帶表達(dá)，條帶的表達(dá)隨轉(zhuǎn)染滴度的增加而更加明顯， 顯示轉(zhuǎn)染目的基因的泳道有Nell-1基因蛋白水平的表達(dá)，而LacZ組和空 白對(duì)照組未見此條帶出現(xiàn)，顯示對(duì)照組無Ne 11 -1基因蛋白水平的表達(dá)(見 圖3)。
二、 Nell-l基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)bMSCs的成骨分化
轉(zhuǎn)染后第15日，N組中首先出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)；第15日至第28日，各組 中的鈣結(jié)節(jié)數(shù)目逐漸增多，Von Kossa硝酸4艮染色后，C組和L組4丐結(jié)節(jié) 數(shù)目少于N組(見圖4 )。根據(jù)Rea 1-1 ime PCR數(shù)據(jù)分析，N組相對(duì)于對(duì)照 組各成骨相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)存在一定的差異。0C基因第3天時(shí)下調(diào)， 第7天和第14天時(shí)上調(diào)，但都不明顯，21天時(shí)表達(dá)明顯上調(diào)，達(dá)55. 6 倍。0P基因表達(dá)上調(diào)，7天和14天時(shí)較顯著。BSP基因N組BSP較L組 表達(dá)明顯上調(diào)，至14天時(shí)為26. 2倍，21天時(shí)為16. 0倍。
三、 棵鼠皮下異位成骨
4周后獲取標(biāo)本時(shí)，植入處輪廓清晰可見，植入物表面皮膚完整光滑， 無積液，傷口無感染，植入物無排出。周圍軟組織包裹材料，未見異物排 斥反應(yīng)，也未見明顯炎癥反應(yīng)。HE染色組織切片見N組可見較多的軟骨 樣和板層骨樣組織自支架區(qū)向空隙區(qū)生長，成骨面積較C組和L組明顯， C組和L組支架材料空隙中存在較多的梭形細(xì)胞，顯示纖維組織結(jié)構(gòu)。(見圖5、圖6、圖7)。
四、構(gòu)建組織工程化骨促進(jìn)頜骨缺損的修復(fù)
術(shù)后8周的Micro-CT可以更加直;i見的顯示N組1務(wù)復(fù)區(qū)域密度大于L 組，骨質(zhì)生長未超出材料的體積范圍；N組在組織工程化骨與材料結(jié)合處 也更加致密(見圖8)。 HE染色，成骨面積N組最高。(見圖9，圖IO)。
實(shí)施例2
Nell-l與BMP-2基因修飾bMSCs體內(nèi)成骨的比較
步驟一、細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)基因轉(zhuǎn)染3天的bMSCs用于 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，制備細(xì)胞密度5xl0Vml的細(xì)胞懸液，在5-6周大小BALB/c 棵鼠大腿肌肉內(nèi)注射細(xì)胞懸液100ja 1。
步驟二、取材、組織病理學(xué)觀察、X線) 見察和Micro-CT掃描 術(shù) 后4周處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并將標(biāo)本置10%福爾馬林固定，高分辨率Micro-CT 掃描，juCT Ray T3. 3和juCT Evaluation Program V5. 0三維重建，最后 將標(biāo)本脫釣，石蠟包埋，切片，HE染色。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
術(shù)后4周Nel卜l基因轉(zhuǎn)染的bMSCs所形成的新骨(E， G)較BMP-2 組骨組織更致密(F， H ),(見圖11 )。
權(quán)利要求
1、一種組織工程化骨，它由下列方法制得(1)Nell-1基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的bMSCs；(2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物、生物支架材料復(fù)合構(gòu)建組織工程化骨。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化骨，其特征在于所述的Nell-l 基因以MOI=50 ~ 80pfu/cel 1的工作濃度轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的骨髄基質(zhì)細(xì)胞。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化骨，其特征在于骨髓基質(zhì)細(xì)胞來 源鼠、兔、羊、狗、豬骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化骨，其特征在于骨髄基質(zhì)細(xì)胞來 源鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化骨，其特征在于生物支架材料是 磷酸三鈣、多孔羥基磷灰石、珊瑚、藻酸4丐、膠原。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的組織工程化骨，其特征在于生物支架材料是
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程化骨，其特征在于細(xì)胞密度為5x 107ml的細(xì)胞懸液與生物支架材料復(fù)合。
8、 權(quán)利要求1-7任一所述的組織工程化骨在頜骨缺損修復(fù)領(lǐng)域中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組織工程化骨，具體地說關(guān)于一種Nell-1基因修飾的bMSCs構(gòu)建組織工程化骨及其應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種Nell-1基因修飾的bMSCs構(gòu)建組織工程化骨，它由下列方法制得(1)Nell-1基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞；(2)將步驟(1)得到的產(chǎn)物、生物支架材料構(gòu)建組織工程化骨，促進(jìn)了裸鼠皮下異位成骨和大鼠頜骨臨界骨缺損(CDS)修復(fù)的效果。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在Nell-1基因修飾的組織工程化骨植入裸鼠體內(nèi)后，材料網(wǎng)孔內(nèi)新骨較對(duì)照組成骨多，Micro-CT顯示Nell-1基因修飾的組織工程化骨修復(fù)大鼠臨界骨組織缺損時(shí)，可以在大鼠頜骨CSD內(nèi)安全生長，并能更有效的修復(fù)骨缺損。
文檔編號(hào)A61L27/00GK101444644SQ20071017105
公開日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2007年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月27日
發(fā)明者劉根桃, 孫小娟, 張志愿, 張秀麗, 王紹義, 胡鏡宙, 蔣欣泉, 君 趙, 陳建國 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院