專利名稱：一種構(gòu)建粘膜移植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，更具體地涉及利用口腔粘膜上皮
細(xì)胞(0KC)構(gòu)建組織工程化粘膜及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
膀胱(urinary bladder)疾病臨床上很常見，包括膀胱腫瘤、炎癥、結(jié) 核、先天性畸形、神經(jīng)源性膀胱、醫(yī)源性損傷等多種病因，會(huì)造成膀胱功能障 礙或在治療后產(chǎn)生大面積膀胱缺損。目前臨床上常用胃腸道進(jìn)行全膀胱術(shù)后的 替代或膀胱擴(kuò)大術(shù)，各種術(shù)式的不斷改良也使胃腸道成為至今為止臨床膀胱替 代的首選，但是這種傳統(tǒng)的外科修復(fù)方式存在"拆東墻補(bǔ)西墻"的缺陷，而且 無法避免術(shù)后腸粘連、腸梗阻、腸道粘膜吸收引起的電解質(zhì)紊亂、代膀胱內(nèi)結(jié) 石或腫瘤形成等并發(fā)癥。
從20世紀(jì)90年代初開始，國(guó)外開始嘗試應(yīng)用組織工程(tissue engineering)方法進(jìn)行膀胱再生的研究。組織工程技術(shù)由于只從體內(nèi)獲取數(shù) 量較少的種子細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)和大量擴(kuò)增后，回植修復(fù)體內(nèi)組織和器官的缺 損，解決了傳統(tǒng)外科修復(fù)"拆東墻補(bǔ)西墻"的缺陷，創(chuàng)傷明顯較小，是膀胱缺 損臨床修復(fù)的新方向。
但象大多數(shù)組織工程器官修復(fù)一樣，膀胱構(gòu)建及修復(fù)所利用的種子細(xì)胞主 要來源于自體原位膀胱，包括膀胱平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell, SMC) 和尿路上皮細(xì)胞(urothelium, urothelial cell, UC)。在造成臨床膀胱缺 損最常見的疾病——膀胱癌中，90%以上為尿路上皮腫瘤(urothelial cancers)， 或稱為移行細(xì)胞癌(transitional cell carcinomas)。 其月中瘤 細(xì)胞來源于不同時(shí)間和不同部位的膀胱尿路上皮細(xì)胞。尿路上皮細(xì)胞是一種特 殊類型的上皮細(xì)胞，以前曾被稱為移行上皮細(xì)胞。UC分布于整個(gè)泌尿集合系統(tǒng) 的內(nèi)腔面，包括腎盂、輸尿管、膀胱和后尿道。由于膀胱腫瘤的"多克隆"發(fā) 病機(jī)制，即使膀胱內(nèi)外觀正常的UC也無法作為安全的種子細(xì)胞被利用。也就 是說，在修復(fù)最常見的膀胱腫瘤所造成的缺損時(shí)，由于尿路上皮細(xì)胞癌"多中心起源"的特點(diǎn)及腫瘤細(xì)胞對(duì)周圍組織的浸潤(rùn)，使得自體膀胱原位獲得種子細(xì)
胞的安全性無法得到保證。同樣神經(jīng)源性膀胱的SMC由于收縮性的異常以及間 質(zhì)性膀胱炎的自體細(xì)胞，都不適合作為膀胱組織工程修復(fù)的種子細(xì)胞來源。同 時(shí)由于泌尿系腫瘤多器官發(fā)病的特點(diǎn)，腎盂、輸尿管和尿道粘膜上皮也不是一 種良好的選擇。
近年來國(guó)外已開始利用干細(xì)胞(stem cell)作為替代的種子細(xì)胞實(shí)驗(yàn)嘗 試修復(fù)膀胱壁缺損。包括利用應(yīng)用人類胚體來源的生殖嵴干細(xì)胞(human embryonic germ cell-derived stem cells)修復(fù)大鼠的膀胱部分缺損，利用 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells, BMSC)進(jìn)行大鼠、兔和犬動(dòng) 物模型膀胱缺損的修復(fù)重建。然而這些干細(xì)胞主要都應(yīng)用于膀胱平滑肌細(xì)胞的 替代，未見針對(duì)尿路上皮細(xì)胞缺損的修復(fù)，而且干細(xì)胞的獲得受到來源有限等 多方面的限制。
因此本領(lǐng)域迫切需要提供一種新的適合組織工程膀胱修復(fù)的種子細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種口腔粘膜上皮細(xì)胞的用途。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種移植物的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種口腔粘膜上皮細(xì)胞的用途，所述的用途包 括(1)用于制備器菅—移植中的移植物；或(2)作為種子細(xì)胞制備粘膜移植物。
在另一優(yōu)選例中，所述的用途是用于制備同種同體、同種異體或異種異體間 的粘膜移植物。
在另一優(yōu)選例中，所述的口腔粘膜上皮細(xì)胞在膀胱內(nèi)環(huán)境中具有向尿路上皮 細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的能力。
在另一優(yōu)選例中，所述的粘膜包括膀胱粘膜、尿道粘膜、輸尿管粘膜、和/或 腎盂粘膜；優(yōu)選膀胱粘膜。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種移植物的用途，所述的移植物用于制 備可修復(fù)具有粘膜缺損的器官的組織工程化器官。
在另一優(yōu)選例中，所述的器官包括膀胱、尿道、輸尿管、和/或腎盂。本發(fā)明提供的移植物含有
(a) 口腔粘膜上皮細(xì)胞(Oralkeratinocytes， OKC)和
(b) 醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料。
在另一優(yōu)選例中，所述的生物可降解材料為片狀，并且lcm2醫(yī)學(xué)上可接受的 生物可降解材料上有104—108個(gè)細(xì)胞；優(yōu)選104—106個(gè)細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳 酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA) 、 PLGA、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、 聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán) 氧乙烷、聚對(duì)二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、透明質(zhì)酸、糖氨聚糖、殼聚糖、甲 殼素、海藻酸鹽、脫細(xì)胞基質(zhì)，及其共聚物或混合物。
在另一優(yōu)選例中，所述的醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料是膀胱脫細(xì)胞基 質(zhì)(Bladder acelular matrix graft, BAMG)。
據(jù)此，本發(fā)明提供了一種新的適合組織工程膀胱修復(fù)的種子細(xì)胞及移植物。


圖1顯示了 OKC細(xì)胞的連續(xù)傳代情況(40倍放大)；其中 A表示P0細(xì)胞培養(yǎng)的第8天，OKC細(xì)胞呈"克隆樣"生長(zhǎng)的情況； B表示Pl代細(xì)胞培養(yǎng)的第3天的情況； C表示P2代細(xì)胞培養(yǎng)的第5天的情況；
D表示P3代細(xì)胞培養(yǎng)的第7天，OKC細(xì)胞達(dá)90%融合的情況； E表示P4代細(xì)胞培養(yǎng)的第4天的情況；
F表示P5代細(xì)胞培養(yǎng)的第4天，消化去除滋養(yǎng)層3T3細(xì)胞的情況。 圖2顯示了口腔粘膜上皮細(xì)胞的鑒定情況；其中 A表示免疫熒光CK14陽性(X100) ; B表示CK14陽性(X200); C表示免疫組化CK陽性(X100) ; D表示CK陽性(X200)。 圖3顯示了 P2代OKC行BrdU標(biāo)記后免疫組化檢測(cè)的情況；其中 A表示放大100倍；B表示放大400倍(陽性結(jié)果表現(xiàn)為細(xì)胞核棕色)。 圖4顯示了 0KC與BAMG復(fù)合體外構(gòu)建5天的情況；其中 A表示放大100倍；B表示放大200倍；C表示放大100倍；D表示放大200倍。
圖5顯示了0KC+BAMG修復(fù)膀胱粘膜缺損的情況；其中 A表示回植前OKC+BAMG的情況(HE， X200) ; B表示回植前0KC+BAMG的情 況(大體觀)；C表示手術(shù)回植OKC+BAMG的情況；D表示術(shù)后3月取材的情況 (大體觀)。
圖6顯示了 OKC+BAMG及單純BAMG修復(fù)膀胱粘膜缺損(HE染色)的對(duì)比情 況；其中
A表示單純使用BAMG1個(gè)月時(shí)的情況；B表示單純使用BAMG3個(gè)月時(shí)的情況；C表 示使用BAMG+0KC1個(gè)月時(shí)的情況；D表示使用BAMG+0KC3個(gè)月時(shí)的情況。
圖7顯示了植入膀胱的0KC細(xì)胞表型轉(zhuǎn)歸的情況(連續(xù)切片)；其中 A表示植入1個(gè)月的情況(X200) (BrdU染色陽性)；B表示植入1個(gè)月的情況 (X200) (UPII染色陽性);C表示植入3個(gè)月的情況(X100) (BrdU染色陽性);D 表示植入3個(gè)月的情況(X100) (UPII染色陽性)。
具體實(shí)施例方式
發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)口腔粘膜瓣具有較薄的粘膜下層和基底 血液供應(yīng)良好的特點(diǎn)，更容易早期血管化；同時(shí)較厚的上皮層也增強(qiáng)了植入口 腔粘膜瓣的穩(wěn)定性，使其適合于移植修復(fù)尿路上皮層缺損；另外，發(fā)明人還首 次發(fā)現(xiàn)，OKC在膀胱內(nèi)環(huán)境中可以向尿路上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。因此，利用這些 特性，發(fā)明人將口腔粘膜上皮或稱口腔角質(zhì)上皮細(xì)胞(oralkeratinocytes, OKC) 作為種子細(xì)胞修復(fù)膀胱粘膜層缺損，完成了本發(fā)明。
如本文所用，"口腔粘膜上皮細(xì)胞(oral keratinocytes, OKC)"或"口 腔角質(zhì)上皮細(xì)胞(oral keratinocytes， OKC)"可互換使用。
如本文所用，膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)(bladder acellular matrix grafts, BAMG) 為支架材料。
術(shù)語"接種"指將細(xì)胞均勻分布于支架材料上的過程?？梢允褂帽绢I(lǐng)域 常規(guī)的方法，包括但不限于，將混勻的細(xì)胞懸液滴加在支架材料上，或?qū)⒒?勻的細(xì)胞懸液涂布在支架材料上。
術(shù)語"自體移植"指將所需生物活體材料(如OKC)從某個(gè)體中取出并再施 用于同一個(gè)體的過程。
60KC
本發(fā)明將0KC作為修復(fù)膀胱粘膜缺損的種子細(xì)胞，其中優(yōu)選來自自體的0KC。 可以利用本領(lǐng)域公認(rèn)的方法分離獲得0KC， 一種優(yōu)選的方法是采用dispase
酶消化口腔上皮組織，用機(jī)械法分離出上皮層，再經(jīng)過胰酶的消化處理為單細(xì)胞。
OKC細(xì)胞培養(yǎng)可以采用3T3細(xì)胞作為滋養(yǎng)層或不用滋養(yǎng)層直接接種在培養(yǎng) 皿上。兩種體系分別采用不同的培養(yǎng)液。
采用3T3細(xì)胞作為滋養(yǎng)層時(shí)，以FAD為培養(yǎng)液，即匿EM培養(yǎng)液和F12培 養(yǎng)液3: l混合，還包含表皮生長(zhǎng)因子，腺嘌呤，氫化可的松，胰島素等成分； 或采用DMEM和KSFM以1: l一l: 3混合，并含有0-10%血清。
不用滋養(yǎng)層時(shí)，采用單純的KSFM培養(yǎng)液，不含血清。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的獲得0KC的方法包括步驟-
a. 用dispase酶消化口腔上皮組織，機(jī)械法分離上皮和皮下組織；
b. 將口腔粘膜上皮剪碎后用胰酶消化，過濾后離心獲得單細(xì)胞懸液；
c. 用3T3細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，F(xiàn)AD或DMEM—KSFM混合液作為培養(yǎng)液， 體外培養(yǎng)和擴(kuò)增0KC。
d. 或不用滋養(yǎng)層細(xì)胞，單純KSFM作為培養(yǎng)液，體外培養(yǎng)和擴(kuò)增OKC。 在另一優(yōu)選例中，步驟(a)前還包括步驟去除口腔粘膜皮下脂肪，將
組織塊剪成0.5X0. 5cm2大小，粘膜面朝下置于培養(yǎng)皿中，dispase酶浸沒口腔 粘膜組織塊。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中所用dispase酶濃度為2. 4u/ml Dispase 酶原液以1: l一l: 5稀釋。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中dispase酶消化時(shí)間為4X:過夜或37'C1 —2h。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中所述的胰酶濃度選自0. 01-5(w/v)%,優(yōu)選 0. 1-0. 3%,更優(yōu)選0. 25%;消化時(shí)間為1一60分鐘，優(yōu)選4-8分鐘，更優(yōu)選5分鐘。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)過濾網(wǎng)孔為25-100陶。 在另一優(yōu)選例中，步驟(c)中貼壁培養(yǎng)時(shí)間為l-72小時(shí)。 在另一優(yōu)選例中，步驟(c)中的FAD培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液和F12培養(yǎng)液3: l混合，還包含表皮生長(zhǎng)因子，腺嘌呤，氫化可的松，胰島素等成分。
在另一優(yōu)選例中，步驟(c)中的培養(yǎng)液DMEM和KSFM以1: l一l: 3混合。 在另一優(yōu)選例中，步驟(c)中含血清0-10%。
在另一優(yōu)選例中，步驟(d)中的培養(yǎng)液為單純KSFM，且不含血清。 在另一優(yōu)選例中，將獲得的OKC體外連續(xù)培養(yǎng)超過6 — 8代。
醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料
可用于本發(fā)明的組織工程化粘膜的材料是醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材 料，包括(但并不限于)
(a) 可降解性合成高分子材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、 PLGA 、聚羥基丁酸(PHB)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮 (polyphosphazenes)、 聚氨基酸(polyamino acid)、 假聚氮基酸 (pesudo-polyamino acid)、 聚原酸酉旨(polyorthoesters)、 聚酯尿烷 (polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、透明質(zhì)酸、 聚對(duì)二氧六環(huán)酮(polydioxanorie)等；
(b) 天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖 (glycosamino glycan， GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸 鹽以及各種脫細(xì)胞基質(zhì)等；
(c) 上述材料的共聚物或復(fù)合型材料，尤其是高分子材料與天然材料的復(fù) 合材料，以及固體材料與可注射性材料的復(fù)合材料。
優(yōu)選的醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料是各種脫細(xì)胞基質(zhì)，更優(yōu)選的是 膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)。所述的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)可以是同種異體或異種的。
移植物
本發(fā)明中OKC-生物可降解材料復(fù)合物的細(xì)胞接種濃度通常約為5X104 —5X 107cm2，優(yōu)選5X 104—5X 107cm2，更優(yōu)選接種密度為107cm2。首次接種時(shí)間 為0. 5 — 6小時(shí)，優(yōu)選4小時(shí)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，將OKC接種在脫細(xì)胞的膀胱粘膜下組織材料 (BAMG)上，并進(jìn)行細(xì)胞一材料復(fù)合物體外評(píng)價(jià)。包括以下步驟
a. OKC細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，包括BrdU和熒光標(biāo)記；
b. 取P2-3代的口腔粘膜上皮細(xì)胞，PBS清洗后以0.25%胰酶消化至細(xì)胞收縮變園，以含10%胎牛血清的DMEM中止，細(xì)胞懸液以1500rpm離心5分鐘， 棄去上清，重新加入500微升FAD培養(yǎng)液；
c. 將細(xì)胞懸液充分混勻，以107 cm2密度接種在吸干培養(yǎng)液的B認(rèn)G粘膜 面上，4小時(shí)后添加FAD培養(yǎng)液，后每l一2天更換培養(yǎng)液；
d. 體外構(gòu)建細(xì)胞一材料復(fù)合物的評(píng)價(jià)。
細(xì)胞一材料復(fù)合物經(jīng)體外培養(yǎng)2—14天(優(yōu)選為5天)得到本發(fā)明提供的 可修復(fù)粘膜缺損的移植物?？梢詫⑺玫降囊浦参镉帽绢I(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)行回 植來修復(fù)缺損粘膜。
可以將本發(fā)明獲得的移植物修復(fù)膀胱粘膜、尿道粘膜、輸尿管粘膜、和/ 或腎盂粘膜；其中優(yōu)選修復(fù)膀胱粘膜。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，將0KC-BAMG復(fù)合物修復(fù)膀胱粘膜缺損，并用 HE和免疫組化染色，包括采用BrdU、 uroplakin II、 CK14等抗體研究OKC植 入體內(nèi)后的細(xì)胞表型改變
a. 將OKC-BAMG復(fù)合物體外培養(yǎng)2—14天后，回植修復(fù)膀胱粘膜缺損；
b. 將OKC-BAMG復(fù)合物取材后連續(xù)切片；
c. 進(jìn)行HE和免疫組化染色，包括采用BrdU、 uroplakin II、 CK14等抗體。
本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所 揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個(gè)特征，可以任何 可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特 征僅為均等或相似特征的一般性例子。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
1、 將口腔粘膜上皮細(xì)胞用作構(gòu)建組織工程化膀胱粘膜上皮層的種子細(xì)胞， 安全性高、來源充分；
2、 口腔粘膜上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞可廣泛用于包括膀胱、尿道、輸尿管、 腎盂等部位的移植；
3、 口腔粘膜上皮細(xì)胞在膀胱內(nèi)環(huán)境中具有向尿路上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的能力。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所 有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于 本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例1
口腔粘膜角質(zhì)上皮細(xì)胞(0KC)的分離和體外培養(yǎng) 1.3T3飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備
采用NIH3T3細(xì)胞(購(gòu)自中科院細(xì)胞生物所)作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。
取凍存的3T3細(xì)胞，37。C快速?gòu)?fù)溫。在DMEM液中混勻清洗，1500轉(zhuǎn)/分鐘 離心5分鐘，取細(xì)胞沉淀重復(fù)一次。計(jì)數(shù)后以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液 接種于10cm直徑的培養(yǎng)皿內(nèi)。3T3細(xì)胞達(dá)到70%融合時(shí)，PBS清洗3次后，以 10ug/ml的絲裂霉素C處理細(xì)胞4小時(shí)。PBS清洗中止處理，加入0. 25%胰酶 -0. 02%EDTA消化成單細(xì)胞懸液。
離心后計(jì)數(shù)，以0. 5Xl07ml的密度接種于10cm直徑的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入 FAD條件培養(yǎng)液，37°C、 5W:02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜備用。
2. 口腔粘膜角質(zhì)上皮細(xì)胞的分離和原代獲取
切取成年長(zhǎng)楓雜交豬(購(gòu)自上海南匯養(yǎng)殖場(chǎng))口腔頰粘膜瓣約2X2cm2大 小，盡量切除皮下組織。
PBS漂洗干凈血跡，置入含10%胎牛血清的DMEM中。
以PBS和氯霉素反復(fù)清洗，將口腔頰粘膜瓣剪成1X0.5cm2大小，真皮面 朝下鋪在培養(yǎng)皿內(nèi)，以2. 4u/ml Dispase (1:1稀釋)，4'C冷消化16小時(shí)。
PBS洗去dispase溶液，以手術(shù)器械分離撕下口腔粘膜表皮層。
以眼科剪刀將表皮層剪碎，以O(shè). 125%胰酶37〔震蕩消化10—15分鐘，并 用含10%胎牛血清的DMEM中止消化。
細(xì)胞懸液以100目金屬濾網(wǎng)過濾，1500rpm離心5分鐘，棄去上清。
FAD培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以4X107ml的密度接種在生長(zhǎng)抑制后的3T3 飼養(yǎng)層細(xì)胞上。3. 口腔粘膜角質(zhì)上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增
口腔粘膜角質(zhì)上皮細(xì)胞接種后7—10天首次換液，然后每2 — 3天更換FAD 液一次。
觀察0KC細(xì)胞生長(zhǎng)到多個(gè)克隆匯合，3T3細(xì)胞被推向細(xì)胞的邊緣，0KC細(xì) 胞約達(dá)到80 — 90%融合時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。
洗盡培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)液，PBS清洗一次后，加入1: 5稀釋的中性蛋白酶2. 5ml ， 37'C下作用10分鐘，使飼養(yǎng)層細(xì)胞先脫落培養(yǎng)皿底。然后加入0. 25%胰酶 -O. 02y。EDTA消化0KC細(xì)胞約2分鐘，觀察細(xì)胞回縮變圓，含血清條件培養(yǎng)液中 止反應(yīng)。
輕輕吹打后吸取細(xì)胞懸液于離心管中，1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去上 清，加入條件培養(yǎng)液，以l: 3比例傳代，接種于新培養(yǎng)皿中。
OKC細(xì)胞貼壁后更換FAD培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況。相同方法OKC 細(xì)胞連續(xù)傳代至P4 — P5代。
4. 結(jié)果 見圖1。
結(jié)果表明，原代口腔粘膜角質(zhì)上皮細(xì)胞約5 — 7天后貼附于3T3滋養(yǎng)層上， 細(xì)胞呈典型"克隆樣"生長(zhǎng)。隨著OKC細(xì)胞的不斷分裂和增殖，細(xì)胞逐漸由內(nèi) 向外擴(kuò)展，并把作為滋養(yǎng)層細(xì)胞的3T3細(xì)胞向周圍擠壓。
原代培養(yǎng)的OKC細(xì)胞生長(zhǎng)良好，克隆團(tuán)相互聯(lián)匯，至OKC原代細(xì)胞獲取后 12—14天達(dá)到80 — 90%融合。傳代后3 — 4天細(xì)胞達(dá)80 — 90%融合，并可以再 次傳代。細(xì)胞在3T3滋養(yǎng)層上擴(kuò)增5 — 6代生長(zhǎng)良好，未見明顯細(xì)胞衰老跡象。
實(shí)施例2
口腔粘膜角質(zhì)上皮細(xì)胞的鑒定 1. OKC細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)
將實(shí)施例1中培養(yǎng)的p2代口腔粘膜上皮細(xì)胞接種于放置滅菌蓋玻片的培
養(yǎng)皿中，檢測(cè)時(shí)細(xì)胞爬片從培養(yǎng)皿中取出行細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)。具體過程如下
細(xì)胞爬片PBS漂洗，2分鐘X5次；
4%多聚甲醛固定10—15分鐘，PBS漂洗2分鐘X5次；
滴加0. 25%TritonX-100， 5%DMS0-PBS室溫10分鐘；PBS漂洗5分鐘X3次；
滴加10%羊血清，置于濕盒內(nèi)37'C30分鐘；
吸去羊血清后擦干；
滴加鼠抗人單克隆抗體細(xì)胞角蛋白14 (cytokeratin14 ， Abcam)，工作 濃度為1: 100，置濕盒內(nèi)4'C過夜；
人成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)照，空白對(duì)照僅滴加PBS液；
第二天PBS振洗3分鐘X3次；
滴加二抗為羊抗鼠IgG羅達(dá)明(Rodamine， Santa cruz),置于濕盒內(nèi)37 。C30分鐘；
PBS漂洗3分鐘X3次后，以Hoechst 33258 (Santa cruz)襯染細(xì)胞核。 直接在熒光顯微鏡下觀察OKC細(xì)胞并拍照。
2. 0KC細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè)
將實(shí)施例1中培養(yǎng)的P2代0KC消化成單細(xì)胞懸液，接種在清潔消毒的蓋 玻片上。至細(xì)胞達(dá)60% —70%融合時(shí)以4%多聚甲醛固定細(xì)胞10分鐘。PBS漂 洗5分鐘X3次后，以0. 25%TritonX-100 (含5%DMS0-PBS)室溫下細(xì)胞膜通透 處理10分鐘。
PBS漂洗后滴加3WHA置于濕盒內(nèi)37'C下孵育15分鐘，去除內(nèi)源性過氧 化物酶。
PBS漂洗后以羊血清37。C封閉內(nèi)源性非特異抗原30分鐘。 棄去羊血清后滴加一抗鼠抗人潘角蛋白抗體(pan cytokeratin, Sigma) (1: 100)并4。C過夜。
第二天PBS漂洗后加入二抗羊抗小鼠鏈霉卵白素一辣根過氧化物酶IgG (Str印toavidin-服P IgG, Santa Cruz)工作液37。C下孵育45分鐘，PBS漂洗 后以l: 50濃度的二氨基聯(lián)苯胺(DAB,華美生物工程公司)顯色。
光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。正常皮膚表皮組織作為陽性對(duì)照，豬軟骨作為 陰性對(duì)照，未加一抗的作為空白對(duì)照。
3. 結(jié)果
見圖2。 P2代的口腔粘膜角質(zhì)上皮細(xì)胞Pan cytokeratin (CK)和 cytokeratin 14 (CK14)都表達(dá)陽性，而少量混雜的3T3細(xì)胞為陰性表達(dá)。
結(jié)果表明，通過酶消化法可以獲得純度較高的OKC細(xì)胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)2 一3代0KC細(xì)胞表型維持正常?？谇徽衬そ琴|(zhì)上皮細(xì)胞的BrdU標(biāo)記及鑒定
1. 口腔粘膜角質(zhì)上皮細(xì)胞的BrdU標(biāo)記
取實(shí)施例1得到的接近50呢融合的P2代0KC細(xì)胞，培養(yǎng)液中加入l: 1000 5-溴2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo 2-deoxyuridine， BrdU， Sigma)液，在37。C、 5%C02培養(yǎng)箱中放置48小時(shí)，至0KC細(xì)胞達(dá)80 — 90%細(xì)胞融合。
棄去含BrdU的培養(yǎng)液，PBS反復(fù)沖洗，加入O. 25胰酶-0. 02y。EDTA消化成 單細(xì)胞懸液。
接種于干凈消毒后的玻璃爬片上進(jìn)行鑒定。
2. 細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定(BrdU)
細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛固定10分鐘，PBS漂洗3次。
滴加0. 25%TritonX-100， 5飄S0-PBS室溫10分鐘；PBS漂洗5分鐘X3 次；滴加0. 75/1. 5%- PBS H20237°C15分鐘；PBS漂洗3分鐘X2次；滴加2M 的HCL37。C孵育60分鐘；PBS漂洗3分鐘X3次；滴加10%羊血清，置于濕盒內(nèi) 37°C30分鐘；吸去羊血清并擦干；滴加一抗為鼠抗Brdu抗體(Sigma) (1:100)， 置濕盒內(nèi)4'C過夜。
第二天PBS漂洗5分鐘X3次，滴加二抗生物素化羊抗鼠IgG(Santa cruz); PBS漂洗3分鐘X3次；DAB(1:50)顯色10分鐘；流水沖洗5分鐘，細(xì)胞核襯染， 蘇木素染色2分鐘，自來水洗，迅速過鹽酸酒精分化；自來水沖洗，梯度酒精 脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。
3. 結(jié)果
見圖3。 P2代0KC經(jīng)過48小時(shí)BrdU標(biāo)記后，約60 —70%BrdU表達(dá)陽性， 表現(xiàn)為細(xì)胞核染色為棕色
結(jié)果表明，BrdU適合作為0KC的細(xì)胞示蹤標(biāo)記。
實(shí)施例4
組織工程化口腔粘膜上皮結(jié)構(gòu)的體外構(gòu)建 l.脫細(xì)胞支架材料制備膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)移植物(BAMG)的制備
取成年豬的膀胱組織全層(購(gòu)自上海南匯養(yǎng)殖場(chǎng))，PBS液中漂洗去血跡，
將其剪成需要的合適大小。
用玻璃片刮去膀胱粘膜面的尿路上皮層，再用解剖剪去處膀胱漿膜層和絕 大部分肌層組織，僅保留膀胱粘膜下層組織。注意保持膀胱粘膜下層的完整性。
再次以PBS漂洗后，加入0.5。/。SDS振蕩24小時(shí)，至材料轉(zhuǎn)變?yōu)榘胪该鳡睢?再用0. 2%Trixon-100和三蒸水4'C下反復(fù)振蕩漂洗l周以完全去除支架內(nèi)原有 的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
切取BAMG材料中央及周邊各數(shù)塊，常規(guī)行HE、 Masson和免疫組化鑒定。
2. 細(xì)胞一支架體外接種和培養(yǎng)
切取3X2cn^大小的B扁G， 70%酒精浸泡過夜消毒。PBS反復(fù)沖洗后改用 FAD培養(yǎng)液浸泡預(yù)培養(yǎng)過夜。
取實(shí)施例1中培養(yǎng)的P2-3代口腔粘膜上皮細(xì)胞，PBS清洗后以0.25%胰 酶消化至細(xì)胞收縮變圓，以含10X胎牛血清的DMEM中止。
細(xì)胞懸液以1500rpm離心5分鐘，棄去上清，重新加入500微升FAD培養(yǎng)液。
將細(xì)胞懸液充分混勻，以10Vcm2密度接種在吸干培養(yǎng)液的BAMG粘膜面上。 4小時(shí)后添加FAD培養(yǎng)液，然后每l一2天更換培養(yǎng)液。
3. 細(xì)胞一材料復(fù)合物檢測(cè)
HE檢測(cè)
切取以上體外培養(yǎng)2天、5天、8天、和14天的OKC-BAMG復(fù)合物1Xlcm2 大小，PBS漂洗干凈后，在10%福爾馬林中固定24小時(shí)，石蠟包埋。脫蠟后 常規(guī)HE染色。
免疫組化檢測(cè)
取已包埋OKC和BAMG體外構(gòu)建組織的蠟塊連續(xù)切片，二甲苯及梯度酒精 脫蠟至水；PBS漂洗3次，加3%過氧化氫，室溫下孵育10分鐘，PBS漂洗3次； 0. 1%胰蛋白酶37。C消化30分鐘，PBS漂洗3次。
正常滅活羊血清37。C孵育30分鐘后傾去液體，滴加鼠抗人Pan cytokeratin (1:100)，置濕盒內(nèi)4'C冰箱孵育過夜；棄去一抗后PBS漂洗3 次，滴加ENVISION 二抗(DAKO) ; PBS漂洗3次，1:50 DAB顯色。
切片顯色完畢后蘇木精襯染細(xì)胞核5分鐘，鹽酸酒精分化，水洗30分鐘，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹酯封片。 4.結(jié)果
見圖4。 0KC接種BAMG材料后2天即可以看到細(xì)胞與材料緊密復(fù)合，接種 后5天0KC細(xì)胞呈多層排列。接種后的0KC在BAMG支架上表達(dá)Pan cytokeratin 陽性
結(jié)果表明，組織工程化的口腔粘膜上皮仍能維持正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)和表型。體 外培養(yǎng)5天即能夠達(dá)到細(xì)胞一材料復(fù)合物回植體內(nèi)的需要。
實(shí)施例5
自體組織工程OKC修復(fù)膀胱粘膜層缺損
1. 手術(shù)方法
取長(zhǎng)楓雜交豬12頭(購(gòu)自上海南匯養(yǎng)殖場(chǎng))，其中8頭為實(shí)驗(yàn)組(縫合 0KC + BAMG復(fù)合物)，4頭為對(duì)照組(縫合單純BAMG)。
取豬的下腹部正中切口，切開皮膚、皮下組織、腹直肌及肌鞘，打開腹腔 暴露膀胱。
在膀胱前壁正中切開，放盡尿液。
以眼科剪切除3X3cra2大小的膀胱粘膜層。
局部止血后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別植入實(shí)施例4中得到的組織工程化OKC粘
膜支架復(fù)合物及單純支架材料。
將組織工程OKC復(fù)合物覆蓋于膀胱創(chuàng)面上，細(xì)胞面朝上，四個(gè)邊角以3 — 0 絲線固定標(biāo)記后，以5 — 0可吸收縫線連續(xù)鎖邊縫合材料。
膀胱內(nèi)留置F8號(hào)造瘺管，固定后以5 — 0可吸收縫線連續(xù)鎖邊縫合關(guān)閉膀 胱。逐層關(guān)閉切口。
2. 術(shù)后檢測(cè)
手術(shù)后分別于1月和3月取材檢測(cè)，行大體觀察、HE和免疫組化染色。具 體實(shí)驗(yàn)步驟同前。
3. 結(jié)果
見圖5。手術(shù)后1個(gè)月和3個(gè)月觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12例膀胱容量基本正常， 未見膀胱內(nèi)新生物和結(jié)石形成。
實(shí)驗(yàn)組中組織工程OKC修復(fù)處局部粘膜較周圍膀胱粘膜略蒼白，對(duì)照組局部粘膜充血明顯。
兩組膀胱壁收縮和舒張性皆基本正常。
實(shí)施例6
組織工程0KC體內(nèi)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)歸研究 HE染色
對(duì)照組(實(shí)施例4中得到的單純BAMG)植入術(shù)后1月僅見支架材料膠原成 分，未見其上有明顯細(xì)胞存在，粘膜下層有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。術(shù)后3個(gè)月 支架材料明顯變薄，支架上仍未見明顯細(xì)胞存在，粘膜下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所 減少。
實(shí)驗(yàn)組(實(shí)施例4中得到的0KC+BAMG)術(shù)后1個(gè)月移植區(qū)域見上皮細(xì)胞多 層排列，粘膜下層局部較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。術(shù)后3個(gè)月上皮細(xì)胞層次略增厚， 膀胱粘膜形態(tài)良好，局部粘膜呈乳頭狀，己類似正常膀胱粘膜上皮層，粘膜下 層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，粘膜下層見較多新生血管(見圖6)。
BrdU染色
術(shù)后1個(gè)月見膀胱粘膜層的上皮細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色染色，大多數(shù)陽性細(xì)胞 沿基底層分布，部分細(xì)胞位于粘膜上皮的中間層和頂層。
術(shù)后3個(gè)月可見BrdU染色陽性細(xì)胞主要位于粘膜上皮的中間層和頂層。 提示植入0KC在膀胱內(nèi)至少存活3個(gè)月(見圖7)。
結(jié)構(gòu)的管腔細(xì)胞膜蛋白II (uroplakin II)染色
術(shù)后l個(gè)月BrdU染色陽性區(qū)域見uroplakin II在粘膜上皮頂端陽性表達(dá)， 在連續(xù)切片上比較發(fā)現(xiàn)BrdU和uroplakin II染色陽性部分重疊。術(shù)后3個(gè)月 在連續(xù)切片上，BrdU和uroplakin II染色陽性基本重疊(見圖7)。
結(jié)果表明，植入膀胱內(nèi)環(huán)境中的OKC部分出現(xiàn)向尿路上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。 說明OKC可以作為尿路上皮細(xì)胞的替代種子細(xì)胞，并采用組織工程方法修復(fù)膀 胱粘膜缺損。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù) 內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍中，任 何他人完成的技術(shù)實(shí)體或方法，若是與申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍所定義的完全相 同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。
權(quán)利要求
1. 一種口腔粘膜上皮細(xì)胞的用途，其特征在于，所述的用途包括(1)用于制備器官移植中的移植物；或(2)作為種子細(xì)胞制備粘膜移植物。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的用途是用于制備同種同體、 同種異體或異種異體間的粘膜移植物。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的口腔粘膜上皮細(xì)胞在膀胱 內(nèi)環(huán)境中具有向尿路上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的能力。
4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的粘膜包括膀胱粘膜、尿道 粘膜、輸尿管粘膜、和/或腎盂粘膜；優(yōu)選膀胱粘膜。
5. —種移植物的用途，其特征在于，所述的移植物用于制備可修復(fù)具有粘膜缺損的器官的組織工程化器官。
6. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的器官包括膀胱、尿道、 輸尿管、和/或腎盂。
7. 如權(quán)利要求1或5任一所述的用途，其特征在于，所述的移植物含有(a) 口腔粘膜上皮細(xì)胞和(b) 醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料。
8. 如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的生物可降解材料為片狀， 并且lcm2醫(yī)學(xué)上可接受的生物可降解材料上有104— 108個(gè)細(xì)胞；優(yōu)選104—106個(gè)細(xì) 胞。
9. 如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的醫(yī)學(xué)上可接受的生物 可降解材料選自下組聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA) 、 PLGA、聚羥基 丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿垸、 聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對(duì)二氧六環(huán)酮、膠原、明膠、透明質(zhì) 酸、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、脫細(xì)胞基質(zhì)，及其共聚物或混 合物。
10. 如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的醫(yī)學(xué)上可接受的生物可 降解材料是膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了了一種口腔粘膜上皮細(xì)胞的用途，所述的用途包括(1)用于制備器官移植中的移植物；或(2)作為種子細(xì)胞制備粘膜移植物。本發(fā)明還公開了一種移植物的用途，所述的移植物可用于制備修復(fù)粘膜缺損的器官移植物。
文檔編號(hào)A61L27/00GK101444645SQ200710171119
公開日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2007年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月28日
發(fā)明者斌 俞, 偉 劉, 盧慕峻, 周廣東, 張文杰, 曹誼林, 忠 王 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院