專利名稱：一種脯氨酸異構酶在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于蛋白工程和醫(yī)藥領域，涉及一種脯氨酸異構酶的新用途。
背景技術：
Pinl是一類廣譜表達的，具有脯氨酸異構酶活性的小分子，隸屬于parvulin 亞家族，這個亞家族的成員和cyclophilin， FKBP亞家族的蛋白一起組成了脯氨 酸順反異構酶家族。Pinl通過其氨基末端的WW結構域特異的結合被磷酸化的 Ser/Thr-Pro基序，而通過羧基末端的活性結構域催化磷酸化蛋白構象在這一位點 上發(fā)生順反變化，進而改變蛋白整體構象，弓j發(fā)蛋白功能的轉變[X.Z. Zhou,P丄 Lu, G. Wulf, K.P. Lu， Phosphorylation dependent prolyl isomerization: a novel signaling regulatory mechanism[J], Cell Mol. Life Sci. 1999, 56: 788—806.〗。能夠被 Pinl催化發(fā)生構象變化的蛋白大部分是有絲分裂相關的蛋白，構象上的變化常常 會改變這類蛋白與其他蛋白之間的相互作用關系，引起細胞內定位的變化，以及 促使蛋白在細胞中豐度的改變等，進而影響細胞有絲分裂的進程[K.P. Lu, Y.C. Liou, X.Z. Zhou, Pinning down the proline-directed phosphorylation signaling [J], Trends Cell Biol. 2002, 12: 164-172.]。運用突變，缺失，RNA干擾，構建 dominant-negative突變株等一列方法抑制Pinl功能會引起腫瘤細胞有絲分裂進 程的阻滯以及細胞的凋亡，而過量的表達Pinl使得細胞無法正常的進入有絲分 裂期，表明了 Pinl是一個參與調節(jié)細胞有絲分裂過程的重要因子。
肝癌是世界范圍內，尤其是在亞洲和非洲國家最常見且死亡率較高的惡性 腫瘤之一，我國每年新發(fā)肝癌患者在IO萬以上，死亡率高，生存期短，嚴重威 脅人民健康。肝癌臨床上手術切除率低，對放、化療敏感性差，轉移情況普遍， 預后極差[吳孟超.原發(fā)性肝癌的診斷和治療進展[J].中華外科雜志， 1998,36(9):515 — 516; J丄.Murray, A.D. Lopez, Mortality by cause for eight regions
of the world: globalburden of disease study [J]， Lancet 1997, 349: 1269-1276.]。因此
研究抑制肝癌的藥劑有著非常重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供脯氨酸異構酶pinl (NCBI登錄號為AAX41625)的 一種新用途。
本發(fā)明提供了脯氨酸異構酶pinl在制備抗腫瘤藥物中的應用。 本發(fā)明提供了脯氨酸異構酶Pinl在制備抗肝癌藥物中的應用。 本發(fā)明中，該藥物是片劑或者針劑。 本發(fā)明中，脯氨酸異構酶pinl是藥靶。
本發(fā)明還提供了一種用脯氨酸異構酶Pinl篩選抗腫瘤藥劑的方法，該
方法包括以下步驟
(1 ) 確定脯氨酸異構酶pinl的蛋白模擬結構；
(2 ) 模擬篩選與脯氨酸異構酶pinl活性部位相結合的物質；
(3 ) 在穩(wěn)定表達脯氨酸異構酶pinl的細胞中加入(2 )所得到的
候選物質，并檢測pinl的蛋白活性；
(4 ) 統(tǒng)計分析加入候選物質與pinl蛋白活性變化的對應關系； (5 ) 將使pinl蛋白活性變化顯著的候選物質作為候選抗腫瘤藥劑。
上述方法中，(3)所述的候選物質是核酸、蛋白或者小分子化合物。 上述方法中，(4)所述的蛋白活性變化是指蛋白活性降低。 上述方法中，(5)所指的變化顯著是指加入候選物質后，pinl蛋白活 性變化具備統(tǒng)計學中的P〉0. 1。
上述方法中，確定蛋白模擬結構、模擬篩選與脯氨酸異構酶Pinl活性 部位相結合的物質都可以通過計算機系統(tǒng)完成。例如，對已有脯氨酸異構酶 家族成員的模擬結構根據(jù)Pinl的氨基酸序列進行修飾，從而得到Pinl的蛋 白模擬結構。確定了 pinl的蛋白模擬結構的模擬結構后，再用類似方法得 到候選物質的模擬結構，然后判斷兩者是否有結合的可能性，尤其是在pinl
的蛋白模擬結構的內部活性部位。也可以直接用pinl的蛋白模擬結構篩選 數(shù)據(jù)庫中候選物質，以便從大批量的物質中搜索可與脯氨酸異構酶Pinl相 互作用的物質。
在獲得了脯氨酸異構酶pinl的基本信息后，就可以確定篩選測試其蛋 白活性的方法，例如，通過抗體結合量、底物的結合數(shù)量等進行測試。還可 以配合各種顯色劑，例如熒光蛋白、辣根過氧化酶等，以便更直接的觀察和 便于檢測。
此時，可以通過計算機進一步模擬篩選抑制脯氨酸異構酶pinl的物質， 也可以通過生化手段篩選。通過生物化學方法篩選候選物質時，可以在適當 的緩沖液中加入脯氨酸異構酶pinl、候選物質和蛋白活性檢測試劑，記錄候 選物質對pinl活性的影響。也可以利用表達pinl的蛋白作為反應載體。蛋 白活性檢測試劑可以是通過蛋白抗體、顯色劑等組合而成。顯色劑可以是液 體、試紙等形式，顯色可以是顏色或者熒光變化等。蛋白活性檢測試劑一方 面不影響脯氨酸異構酶pinl與候選物質的結合，另一方面可以標記脯氨酸異 構酶pinl的數(shù)量或者標記脯氨酸異構酶pinl底物。
通過上述方法獲得的候選抗腫瘤物質還可以在動物實驗水平進行檢驗。 例如，對長有腫瘤的小鼠施用候選抗腫瘤物質，與相同培養(yǎng)條件下生長的小 鼠相比，如果腫瘤生長受到明顯抑制，則所施用的抗腫瘤物質可以作為抗腫 瘤抑制劑。
舉例而言，本發(fā)明的pinl可以與Survivin蛋白結合并增強Survivin蛋白 的激酶活性，如果某物質加入含有適當比例的pinl和Survivin蛋白的體系 中，而且能夠抑制CDK4的激酶活性，那么該物質可以作為抗腫瘤藥劑的候選 物質。
本發(fā)明還提供了一種篩選抗腫瘤藥劑的試劑盒，該試劑盒包括脯氨酸異
構酶pinl和蛋白活性檢測試劑。
本發(fā)明中，試劑盒中脯氨酸異構酶pinl可以固定在芯片上。 本發(fā)明的試劑盒中，除了脯氨酸異構酶pinl和蛋白活性檢測試劑外，
還可以包括常規(guī)緩沖液、反應容器和移液器等。蛋白活性檢測試劑可以是通
過蛋白抗體、顯色劑等組合而成。顯色劑可以是液體、試紙等形式，顯色可 以是顏色或者熒光變化等。蛋白活性檢測試劑一方面不影響脯氨酸異構酶 pinl與候選物質的結合，另一方面可以標記脯氨酸異構酶pinl的數(shù)量或者標 記脯氨酸異構酶pinl底物。
本發(fā)明的試劑盒可以分為兩類 一種是芯片形式，另一種是單個檢測形 式。單個檢測形式試劑盒中，各種試劑分裝于不同容器，使用時按照說明書 順序反應。芯片形式中，若干脯氨酸異構酶pinl被固定于芯片上；使用時只 需在每份蛋白上加入候選物質，收集蛋白活性檢測試劑變化數(shù)據(jù)，分析，加 入后使pinl蛋白活性變化具備統(tǒng)計學中的p>0. 1的物質即可以作為候選抗 腫瘤藥劑。
本發(fā)明提供了脯氨酸異構酶Pinl在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明 的pinl在癌旁組織表達量上調，能促進腫瘤細胞增殖，能促進裸鼠腫瘤生 長，具有促進腫瘤生長的作用，可以作為篩選抑制腫瘤生長物質的靶標。
具體實施例方式
下列實施例中所用材料和試劑有
pMD18-T載體(PROMEGA公司) 大腸桿菌origamiDE3 (Novagen公司) pET32a載體(Novagen公司)
cDNA文庫克隆用的人腦和睪丸的cDNA文庫(GibcoBRL公司) Long PCR擴增試劑盒(大連TaKaRa公司)
DNA測序試劑盒自動測序采用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction。 (PE公司)
PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Roche產(chǎn)品)
質粒抽提試劑盒(Roche產(chǎn)品)
入DNA Hind III/EcoR I雙酶切DNA標準分子量(上海華美生物工程
公司)
DNA連接試劑盒(Promega公司) 凝膠回收純化試劑盒 (Boehringer公司) TRIZ0L RNA抽提試劑 (GIBC0BRL公司) DEPC (AMRESC0公司)
S叩erscriptTMII反轉錄酶 (GIBC0BRL公司) Oligo (dT)(Promega公司) 放射性a-32P-dCTP (AMERSHAM公司) 隨機引物標記試劑盒(Promega公司) 顯影液和定影液(上海冠龍照相器材廠)
異丙基-0-D硫代半乳糖苷(IPTG)(上海華舜生物工程公司) 250bp DNA Ladder標準分子量(上海博彩生物科技有限公司) 4%多聚甲醛(PFA) (Sigma公司) 多聚賴氨酸(華美公司)
山羊血清、羊抗地高辛(Digoxigenin)抗體、NBT/BCIP顯色液，10 XDig腿
Labeling Mix (Roche公司)
cA裸小鼠，日齡35 40天，體重18 22 g,雌性，SPF級飼養(yǎng)，自由飲水，隨 意進食。由中國科學院上海藥物研究所提供，
下列實施例中所用儀器為
PCR擴增儀PTC-150及PTC-200型(美國MJ Research公司)；PE 9600 型(PE公司產(chǎn)品)
TGL-16臺式離心機(上海醫(yī)用儀器廠) M0DEL4001型DNA測序電泳儀(GIBCO BRL公司) MODEL SA型DNA測序電泳槽(GIBCO BRL公司) ABI377型全自動DNA測序儀(PE公司) 紫外檢測儀(上海復生公司)
微量加樣器1000ul 、 200ul 、 20ul規(guī)格各一支(法國Gilson公
凝膠成像裝置UVP (上海復日公司)
HZ-C型臺式恒溫振蕩器(江蘇太倉科教器材廠)
GDS-800型凝膠成像系統(tǒng)及相應配制掃描儀(Bio-Rad公司)
雜交反應箱(HYBAID公司)
S叩rafuge 22型高速冷凍離心機(德國Heraeus公司) 勻漿器(Glas-Col公司) 紫外分光光度計(HITACHI公司)
AKTA explorer 100低壓層析儀(美國Bio-Rad公司) SW-CJ-IFD型凈化工作臺(江蘇太倉科教器材廠) Umi薩eter LB 9507 (Berthold公司)
所用常規(guī)試劑配制
5X甲醛凝膠電泳緩沖液將20. 6gM0PS (3- (N-瑪琳代)丙磺酸)溶 于800ml經(jīng)用DEPC處理的50 mmol/L乙酸鈉溶液，2 mol/L Na0H調PH至 7.0，加10 ml經(jīng)DEPC處理的O. 5 mol/L EDTA(PH 8.0)，加DEPC水定容至l L，經(jīng)0.2 um微孔濾膜過濾滅菌，室溫避光保存。
甲醛凝膠加樣緩沖液含50%甘油，1 m mol/L EDTA 8.0) ， 0.25% 溴酚藍，0.25%二甲苯青(滅菌并經(jīng)DEPC處理)。
Northern(預)雜交液:50%甲酰胺，5XSSPE， 10XDenhardt液，2%SDS, CT DNA(100 ug/ml)。
20XSSC (3 M NaCl， 0. 3 M擰檬酸三鈉，PH7.0)
LB液體培養(yǎng)基
Polypepton 10.0 g
Bacto-Yeast Extract 5.0 g
NaCl 10.0 g
加ddH20定容至1000 ml 滅菌條件為121。C，高壓濕熱滅菌20 min;
實施例一 在肝癌樣本組織(由江蘇啟東肝癌防治研究所提供)中的表達
通過RT-PCR從mRNA水平檢驗pinl在癌癥組織中的表達情況。從mRNA 水平上看Pinl在癌癥組織中與癌旁組織比較起來大部分有不同程度的上調。
為了對Pinl基因在肝癌組織中的表達差異進行半定量分析，我們對圖 中的電泳條帶做掃描定量分析。每一個病理樣品得到4個掃描值，即Pinl的 肝癌及癌旁掃描值，0-MG的肝癌及癌旁掃描值。最后我們按照(Pinl肝癌 /e-MG肝癌)/ (Pinl癌旁/e-MG癌旁)的計算公式得到一個反映Pinl基因 表達情況的DR值。我們規(guī)定DR值大于l. 5表示該基因上調表達，DR值小于O. 75 表示下調表達，0. 75〈DR<1. 5表示表達無顯著變化。結果顯示30例(7 5%) 的肝癌組織中比癌旁組織上調表達。
實施例二促進肝癌細胞增長
細胞復蘇(1)從液氮罐中取出保存管，直接投入37。 C溫水中，并不時 搖動令其盡快融化。(2)從37° C水浴中取出保存管，用吸管吸出細胞懸液，注 入離心管并加入IO倍以上培養(yǎng)液，混合后低速離心，棄上清，再重復用培養(yǎng)液 洗一次。(3)用培養(yǎng)液適當稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放在37° C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)， 次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)至一定濃度時進行傳代(SK-H印l和H印G2細胞 培養(yǎng)在含10。/。胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中)。
細胞傳代培養(yǎng)每天觀察細胞生長的情況，當細胞在培養(yǎng)瓶中長至90%匯合 時傳代，約每隔2-4天傳代-一次。 一瓶傳代成三瓶，或一個25 cm2傳代于一個 75cm2的培養(yǎng)瓶中。方法(I)用IX磷酸緩沖液洗滌細胞一次。(2)加入2-3ml胰 酶消化液消化，置于37° C培養(yǎng)箱中數(shù)分鐘。用手拍打細胞培養(yǎng)瓶，使細胞分離。 (3)用含10%的小牛血清的合適培養(yǎng)基終止胰酶消化。將細胞分裝于新的培養(yǎng)瓶 中，繼續(xù)培養(yǎng)。
細胞凍存(l)取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細胞，加入胰蛋白酶消化，收集于離 心管中并計數(shù)，離心。(2)棄除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入配置好的凍存培養(yǎng) 液(含10°/。 DMS0或甘油)，凍存液中細胞的最終濃度為O. 5- 1X107/ml。用吸管 輕輕吹打使細胞均勻，然后分裝入無菌保存管中，每管加l -1.5ml。 (3)將保存 管放入凍存盒置-70° C速凍，5小時后移入液氮罐中保存。
細胞瞬時轉染轉染前l(fā)天，細胞以4-8X 104/2X105 cells的密度接種
在24孔/6孔板中，第二天運用LIP0FECTIN轉染方法將O. 5Pg/1^質粒轉染入換
液后的細胞(具體轉染步驟參照轉染試劑盒所附說明)。轉染時使用無血清培養(yǎng) 基，轉染5小時候換成正常含10%小牛/胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時。 在96wel1細胞培養(yǎng)皿內種入l X 103 cells/well的SK-H印1細胞，并且按照 4.9的方法分別用LV-CYPJ-RNAi和LV-non-silencing病毒對細胞進行轉染。對 照細胞中不加入慢病毒，用等量體積的PBS處理。
%小時后，用MTS試劑盒測定細胞存活率，測試方法為將細胞用無血清 培養(yǎng)基洗一遍，按照100W/well的量加入預先配制好的MTS顯色溶液(10ml無 血清培養(yǎng)基中加入2 ml溶液1和100W溶液2，充分混勻)。將一個沒有細胞的 孔設為本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把細胞放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 2 4小時，然后用酶標儀讀取光吸收值(參考波長630-700 nm，測定波長490 nm)， 計算細胞存活率。
當測定Pinl對各種肝癌細胞生長的作用時，在96孔細胞培養(yǎng)皿內種入l X 103 cells/well的各種肝癌細胞株，包括H1299細胞，L02， H1299， Hep3B， HepG2 (均來源于ATCC) 。 37°C C02培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的CsA，對照 孔加入等體積的PBS。 72小時后測定各個孔的光吸收，以測定孔光吸收值/對照 孔光吸收值作為細胞存活率的數(shù)值。
結果顯示，Pinl能明顯促進上述腫瘤細胞生長。
實施例三裸鼠致瘤實驗
按前述方法大量培養(yǎng)檢測過的穩(wěn)定表達細胞株細胞，胰酶消化，離心收獲所 培養(yǎng)的細胞，用PBS洗滌后計數(shù),重懸于PBS,將兩種細胞用一次性注射器對裸鼠 進行皮下注射，與對照分別注射于裸鼠左右兩側，每組注射^5只，(雌性，30-40 天)，每只裸鼠的細胞注射量為200W,約含2X106，一周后腫瘤長出，40天后處死 裸鼠剝離其皮下腫瘤,稱量腫瘤并攝影。
結果顯示，穩(wěn)定表達Pinl的細胞株和對照細胞株都能使裸鼠長瘤，但 是，穩(wěn)定表達Pinl的細胞株注射的裸鼠所得到的腫瘤平均瘤體體積大于對 照組。
權利要求
1.脯氨酸異構酶pin1在制備抗腫瘤藥物中的應用。
2. 脯氨酸異構酶pinl在制備抗肝癌藥物中的應用。
3. 如權利要求1或者2所述的應用，其特征在于，該藥物是片劑或者 針劑。
4. 如權利要求1或者2所述的應用，其特征在于，脯氨酸異構酶pinl 是藥靶。
5. —種用脯氨酸異構酶pinl篩選抗腫瘤藥劑的方法，其特征在于，該方 法包括以下步驟-(1 )確定脯氨酸異構酶pinl的蛋白模擬結構；(2 )模擬篩選與脯氨酸異構酶pinl活性部位相結合的物質；(3 )在穩(wěn)定表達脯氨酸異構酶pinl的細胞中加入(2 )中得到的候選物質，并檢測pinl的蛋白活性； (4 )統(tǒng)計分析加入候選物質與pinl蛋白活性變化的對應關系； (5 )將使pinl蛋白活性變化顯著的候選物質作為候選抗腫瘤藥劑。
6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，(3)中所述的候選物質是核酸、蛋白或者小分子化合物。
7. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，(4)中所述的蛋白活性變化 是蛋白活性降低。
8. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，(5)中所指的變化顯著是加 入候選物質后，pinl蛋白活性變化具備統(tǒng)計學中的p〉0. 1。
9. 一種篩選抗腫瘤藥劑的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括脯氨酸異 構酶pinl和蛋白活性檢測試劑。
10. 如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒中脯氨酸異構酶 pinl固定在芯片上或者固定在硝酸纖維膜上。
全文摘要
本發(fā)明屬于蛋白工程和醫(yī)藥領域，涉及一種脯氨酸異構酶的新用途。Pin1是一類廣譜表達的，具有脯氨酸異構酶活性的小分子，隸屬于parvulin亞家族。本發(fā)明提供了脯氨酸異構酶pin1在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明的pin1在癌旁組織表達量上調，能促進腫瘤細胞增殖，能促進裸鼠腫瘤生長，具有促進腫瘤生長的作用，可以作為篩選抑制腫瘤生長物質的靶標。
文檔編號A61K38/43GK101181634SQ200710171269
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月29日 優(yōu)先權日2007年11月29日
發(fā)明者龍 余, 琳 張 申請人:復旦大學