專利名稱：：一種中藥組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，具體涉及一種抗艾滋病病毒的中藥組合物及其制備方法和在抗艾滋病病毒和/或提高免疫功能方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：艾滋病病毒，又稱人免疫缺陷性病毒(HIV)，該病的病理過程主要是多系統(tǒng)、多器官、多病原體的復(fù)合感染，95%以上的患者最終將死于各種機會性感染或腫瘤。據(jù)聯(lián)合國《2005年度全球艾滋病報告》顯示透露世界艾滋病危機正在加劇，全球艾滋病感染人數(shù)已從2001年的3500萬增加到2005年的6900萬人，其中2300萬人己死亡。2005年度全球新增艾滋病病毒感染者4卯萬，有310萬人死于艾滋病，是自從1981年艾滋病發(fā)現(xiàn)以來，一年中增加最多的。我國艾滋病病毒感染者正以較快的速度上升，感染速度在亞洲僅次于印度、泰國、菲律賓，具不完全統(tǒng)計2004年感染總?cè)藬?shù)已達(dá)84萬人，目前已經(jīng)超過100萬，并仍呈20-30%的速度快速增長。艾滋病的流行形成了龐大的艾滋病藥物市場，目前很多國家主要是用西藥來治療艾滋病，主要有兩大類一類是艾滋病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(RT)的抑制劑；另一類是艾滋病病毒水解酶(protease)的抑制劑。雖然這兩類藥物可明顯抑制艾滋病毒的復(fù)制，延緩病情的發(fā)展和延長艾滋病人的壽命，但這些藥物存在許多問題，如價格昂貴，毒性大和副作用多，以及容易產(chǎn)生耐藥性等。中藥治療艾滋病是一條十分理想的出路，中藥治療艾滋病比西藥具有明顯的優(yōu)勢，如成本低廉，資源廣泛，毒副作用小，并能長期服用而不易產(chǎn)生耐藥性等，這樣的優(yōu)勢是得到醫(yī)藥界肯定的，但目前國內(nèi)市場上治療艾滋病的成藥很少，不能滿足市場需求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是提供一種中藥組合物，該中藥組合物不但具有抗艾滋病病毒的作用，還可顯著提高患者的免疫功能，逐步消除艾滋病患者出現(xiàn)的常見癥狀。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題就是提供一種所述的中藥組合物的制備方法。本發(fā)明人根據(jù)中醫(yī)理論對疫情的認(rèn)識，結(jié)合古代醫(yī)家對"瘟疫"、"瘟病"、"虛勞"等病癥的論述以及相關(guān)的基礎(chǔ)研究文獻(xiàn)報道，從中醫(yī)辨證論治的角度發(fā)現(xiàn)，對艾滋病患者，特別是以氣陰兩虛型為主的早中期艾滋病患者，采用三種治法(清熱解毒、益氣養(yǎng)陰、表里分消)可益氣養(yǎng)陰，補益肺脾。因此，本發(fā)明解決上述第一個技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為，一種中藥組合物，其可以主要是由下述重量份的原料藥制成黃芪1520份、人參712份、當(dāng)歸813份、枸杞子914份、五味子712份、麥冬712份、天花粉813份、茯苓7~12份、甘草712份、柴胡38份和升麻38份。本發(fā)明的上述中藥組合物中還可以含有一種或多種藥學(xué)上可接受的輔助添加劑，即可以加入藥學(xué)上可接受的制備不同劑型所需要的各種常規(guī)輔料，如崩解劑、潤滑劑、粘合劑、矯味劑等，以常規(guī)的制劑方法制備成膠囊、片劑、顆粒劑和口服液等。優(yōu)選的，所述的輔助添加劑可為乳糖、糊精等，劑型可為顆粒劑、膠囊和片劑等。本發(fā)明解決上述第二個技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案則為一種所述的中藥組合物的制備方法，可包括下列步驟a)取所述重量配比的黃芪、枸杞子、天花粉、茯苓和甘草4味藥，加入相當(dāng)生藥重量7~10倍的水煎煮兩次，每次1~2.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為0.9~1.1(30~60°C)的清膏；b)取所述重量配比的人參、當(dāng)歸、五味子、麥冬、柴胡和升麻6味藥，加入相當(dāng)生藥重量5~8倍的50~80%(m/m)乙醇，加熱回流或浸泡二次，每次1~2.5小時，合并乙醇液，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮成相對密度為0.9-1.1(30~60°C)的清膏；c)合并上述兩清膏，濃縮至相對密度為1~1.2G06(TC)的浸膏，較佳地是將浸膏進(jìn)一步噴霧干燥或真空干燥，得干浸膏粉，即為本發(fā)明藥物的活性組分。其中的顆粒劑可由下述方法制得取所述的制得的干浸膏粉1重量份，加入0.36重量份的乳糖和0.14重量份的糊精，混勻，干壓制成顆粒，過30目篩，干燥，即得。本發(fā)明中藥組合物以下稱為"艾寧"，相應(yīng)的其顆粒劑稱為"艾寧顆粒"，其膠囊稱為"艾寧膠囊"，其片劑稱為"艾寧片"，其口服液稱為"艾寧口服液"。本發(fā)明的中藥組合物益氣養(yǎng)陰，補益肺脾，具有抗艾滋病病毒作用，可顯著提高艾滋病患者的免疫功能，特別適用于以氣陰兩虛型為主的早中期艾滋病患者，可明顯改善并逐步消除其乏力，低熱，自汗，盜汗，納差，慢性腹瀉，咳嗽，消瘦等常見癥狀。本發(fā)明艾寧顆粒曾在1991至1997年間，在坦桑尼亞治療126例HIV/AIDS患者，取得了4顯著的臨床有效率。1998-2000年又觀察了29例坦桑尼亞患者和15例中國患者(北京佑安醫(yī)院)，根據(jù)統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，對確診的44例HIV/AIDS患者給予本發(fā)明艾寧顆粒治療并進(jìn)行臨床觀察，時間3個月，從免疫功能、病毒載量和臨床癥狀體征等方面進(jìn)行療效判定，均得到了肯定的結(jié)果。具體實施例方式下面用實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。以下是本發(fā)明中藥組合物的制備實施例。實施例1艾寧顆粒黃芪15g，人參7g，當(dāng)歸8g，枸杞子9g，五味子7g，麥冬7g,天花粉8g，茯苓llg，甘草12g，柴胡8g，升麻8g。制備步驟取上述黃芪、枸杞子、天花粉、茯苓、甘草等五味，加385ml水煎煮二次，每次1小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為0.9G06(TC)的清膏，備用；其余人參、五味子、當(dāng)歸、麥冬、柴胡、升麻等六味加225ml的60%(m/m)乙醇，加熱回流二次，每次2.5小時，合并乙醇液，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為0.9(30~60")的清膏，與上述清膏合并，濃縮至相對密度l.OG06(TC)，噴霧干燥，得干浸膏粉17.5g。取干浸膏粉，加乳糖6.3g、糊精2.4g，混勻，制成顆粒，干燥，即得。實施例2艾寧顆粒黃芪20g，人參12g，當(dāng)歸13g，枸杞子10g,五味子10g，麥冬7g，天花粉8g，茯苓7g，甘草7g，柴胡3g，升麻3g。制備步驟取上述黃芪、枸杞子、天花粉、茯苓、甘草等五味，加610ml水煎煮二次，每次2.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.0(30~60°C)的清膏，備用；其余人參、五味子、當(dāng)歸、麥冬、柴胡、升麻等六味加312ml的60。/。(m/m)乙醇，浸泡二次，每次2小時，合并乙醇液，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為1.0G06(TC)的清膏，與上述清膏合并，濃縮至相對密度1.2(30~60°C)，真空干燥，得干浸膏粉18g。取干浸膏粉，加乳糖6.5g、糊精2.5g，混勻，制成顆粒，干燥，即得。實施例3艾寧顆粒黃芪15g，人參7g，當(dāng)歸8g，枸杞子14g，五味子12g，麥冬12g，天花粉10g，茯苓9g，甘草7g，柴胡3g，升麻3g。制備步驟取上述黃芪、枸杞子、天花粉、茯苓、甘草等五味，加440ml水煎煮二次，每次2小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.0G060'C)的清膏，備用；其余人參、五味子、當(dāng)歸、麥冬、柴胡、升麻等六味加270ml的60%(m/m)乙醇，加熱回流二次，每次2小時，合并乙醇液，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為1.0(3060'C)的清膏，與上述清膏合并，濃縮至相對密度l.l(306CTC)，噴霧干燥，得干浸膏粉17g。取千浸膏粉，加乳糖6g、糊精2.4g，混勻，干法制成1624目顆粒，干燥，即得。實施例4艾寧膠囊1.艾寧提取物的制備工藝處方黃芪15g，人參9g，當(dāng)歸8g，枸杞子9g，五味子7g，麥冬7g，天花粉13g，茯苓12g，甘草10g，柴胡5g，升麻5g。制備步驟取上述黃芪、枸杞子、天花粉、茯苓、甘草等五味，加472ml水煎煮二次，每次2小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1G06(TC)的清膏，備用；其余人參、五味子、當(dāng)歸、麥冬、柴胡、升麻等六味加287ml的60%(m/m)乙醇，浸泡二次，每次2小時，合并乙醇液，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為1.0G06(TC)的清膏，與上述清膏合并，濃縮至相對密度L2(306(TC)，噴霧干燥，得干浸膏粉17.5g。2.艾寧膠囊的制備工藝處方艾寧提取物17.5g糊精4.4g淀粉4.4g乳糖2.6g硬脂酸鎂0.5g制法按處方比例，取艾寧提取物的干浸膏粉、輔料，混勻，濕法制粒，60。C下通風(fēng)干燥3小時，得到流動性良好的顆粒，使用自動灌裝機灌裝膠囊，鋁箔板機械自動包裝，即得。實施例5艾寧片1.艾寧提取物的制備工藝處方黃芪18g，人參12g，當(dāng)歸12g，枸杞子10g，五味子10g，麥冬9g,天花粉9g，茯苓7g，甘草7g，柴胡3g，升麻3g。制備步驟取上述黃芪、枸杞子、天花粉、茯苓、甘草等五味，加357ml水煎煮二次，每次2小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為0.9(30~60°C)的清膏，備用；其余人參、五味子、當(dāng)歸、麥冬、柴胡、升麻等六味加245ml的60%(m/m)乙醇，加熱回流二次，每次2小時，合并乙醇液，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為U(30~60。C)的清膏，與上述清膏合并，濃縮至相對密度l.lG06(TC)，噴霧干燥，得干浸膏粉17.8g。2.艾寧片的制備工藝處方艾寧提取物17.8g微晶纖維素7.4g淀粉2.9g滑石粉0.5g微粉硅膠0.5g硬脂酸鎂O.lg制法按處方比例，取艾寧提取物的干浸膏粉、微晶纖維素、淀粉、滑石粉和微粉硅膠，分別過80目篩，充分混勻，加乙醇制軟材，以16目篩制粒'于50。C60。C干燥2小時，加入硬脂酸鎂混勻后，壓片，即得。實施例6艾寧口服液1.艾寧提取物的制備工藝處方黃芪15g，人參10g，當(dāng)歸10g，枸杞子12g，五味子12g，麥冬8g，天花粉9g，茯茶9g，甘草7g，柴胡5g，升麻3g。取上述黃芪、枸杞子、天花粉、茯苓、甘草等五味，加416ml水煎煮二次，每次2小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1(30~60°C)的清膏，備用；其余人參、五味子、當(dāng)歸、麥冬、柴胡、升麻等六味加384ml的60%(m/m)乙醇，加熱回流二次，每次2小時，合并乙醇液，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為U(3060°C)的清膏，與上述清膏合并。另取蔗糖50g，葡萄糖8g加水適量，加熱溶解，加入苯甲酸鈉0,2g，溶解后濾過，混勻，加水，攪勻，灌封，即得。以下是本發(fā)明中藥組合物的效果試驗實施例。試驗實施例l質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)實施例1-3艾寧顆粒中黃芪甲苷含量測定。1)對照品溶液的制備精密稱取黃芪甲苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，20mg/支)適量，加甲醇制成每lml含0.5mg的溶液，即得。2)供試品溶液的制備取艾寧顆粒，研細(xì)，取2g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40ml，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流提取4小時，提取液回收甲醇并濃縮至干，殘渣加水10ml微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次20ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水3-5ml使溶解，通過DIOI型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑1.5cm，長12cm)，以水50ml洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30ml洗脫，棄去40。/。乙醇洗脫液，繼用70%乙醇50ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45pm)濾過，取續(xù)濾液即得。3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定分別精密吸取對照品溶液2、4、8^1，注入液相色譜儀中，以對照品進(jìn)樣量的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)，以對照品峰面積的自然對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=1.4828X+12.1376，r=0.9999。4)測定分精密吸取對照品溶液8^1，12nl和供試品溶液10pl，注入液相色譜儀，測定，即得。上述的測定儀器及條件均為美國HP1100高效液相色譜儀，G1311A四元泵，G1313A自動進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1315A二極管矩陣檢測器HPCHEM色譜工作站。色譜柱ZORBAXRX-C18(4.6mmX250mm)，5um，波長195247nm;流速l~3ml/min，柱溫25~60°C。5)結(jié)果艾寧顆粒中黃芪甲苷含量測定結(jié)果為本品每袋(每袋5克艾寧顆粒)含黃芪按黃芪甲苷(C41H68014)計，不少于0.85mg。試驗實施例2藥效(一)實驗材料1、藥物艾寧顆粒(實施例1制備)棕色粉末，0.1715g藥粉相當(dāng)于lg生藥的提取物，水溶,用細(xì)胞培養(yǎng)液配制。齊多夫定(Zidovudine,AZT)[抗HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑]:購自上海迪賽諾化學(xué)制藥有限公司，批號040201b。奈韋拉平(Nevirapine，NVP):購自南京澤眾醫(yī)化信息研究中心，批號0301001。磷甲酸鈉(PFA):常州第一制藥廠生產(chǎn)。沙奎那韋(Saquinavir,SQ):購自美國科羅拉多醫(yī)學(xué)中心。甲基咪唑ACROS公司產(chǎn)品。貞芪扶正顆粒通化神源藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號030411070。環(huán)胞菌素A:瑞典山地明公司產(chǎn)品，批號478886。2、動物動物恒河猴(RhesusMacaques):雄性，體重6+lkg。購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明動物所。經(jīng)血清學(xué)檢查證實無猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV)、猴T淋巴細(xì)胞I型病毒(STLV-I)感染。食蟹猴雄性，體重4+lkg，3-4歲，外觀健康，經(jīng)體檢無淺表淋巴結(jié)腫大，經(jīng)血清學(xué)檢測SIV，猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV)和猴T淋巴細(xì)胞性I型病毒(STLV-I)抗體陰性，結(jié)核菌素陰性，痢疾桿菌陰性。昆明種小鼠雄性，SPF級，體重18-20g，購自中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心。3、細(xì)胞人外周血單個核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)采用常規(guī)技術(shù)從健康新鮮靜脈血中分離獲得，在培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)。MT-4細(xì)胞用含10%胎牛血清、100IU/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素和卡那霉素及含L-谷氨酰胺的RPMIMedium1640培養(yǎng)基，在37。C,5%(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天傳代一次。HIV-1IIIB慢性感染的H9細(xì)胞，美國Colorado大學(xué)傳染病系。PBMC培養(yǎng)液成分100mlRPMIMedium1640培養(yǎng)液中加入胎牛血清:20ml，(植物血凝素:300)ag,)白介素-2:1000U，抗菌素(青霉素、鏈霉素和卡那霉素各10000U/ml)2ml。4、病毒實驗室傳代HIV-1IIIB病毒株:美國MountSinaiMedicalCenter,在CEM細(xì)胞中擴增。臨床分離AZT敏感株HIV-1018a和AZT耐藥株HIV-1018c:美國Colorado大學(xué)傳染病系。HIV-1整合酶系中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病學(xué)研究所。艾滋病毒1型逆轉(zhuǎn)錄酶P66/P51:中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病學(xué)研究所。艾滋病毒1型蛋白酶中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病學(xué)研究所。病毒及模型建立毒株SIVmac251:美國AaronDiamond艾滋病研究中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所保存。SlVmac251病毒液美國紐約AaronDiamond艾滋病研究中心。5、試劑IMDM(Iscove，sModifiedDulbecco，sMedium,powder):t咅養(yǎng)基禾卩RPMIMedium1640(powder)培養(yǎng)基美國GIBCO公司產(chǎn)品。胎牛血清GIBCOBRL公司產(chǎn)品，批號1025208;青霉素(批號86011)和鏈霉素(批號841121):華北制藥廠產(chǎn)品；四氮唑藍(lán)(Thiazolylblue,MTT),檸檬酸美國Sigma公司產(chǎn)品。TritonX-100:KEBOABSTOCKHOLM公司產(chǎn)品。N，N二甲基甲酰胺(N，N-DimethylFormamide):北京化工廠產(chǎn)品。HIV-1P24抗原檢測試劑盒美國ZeptoMetrix公司產(chǎn)品。COVALINKNH酶標(biāo)板丹麥Nunc公司產(chǎn)品。EDC(l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide):美國Sigma化學(xué)公司產(chǎn)品。PNPP:Roche公司產(chǎn)品。陽性對照化合物SY:中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病學(xué)研究所。poly(A)(dT)15:BoehringerMannheimGmbH公司產(chǎn)品。3H-dTTP:NEN公司產(chǎn)品。DTT，牛血清白蛋白天象人公司產(chǎn)品。地高辛標(biāo)記-N-羥基琥珀酯、阻斷劑和堿性磷酸酶標(biāo)記的抗Dig-NHS抗體Boehringermannheim公司產(chǎn)品。合成肽底物由賽百盛公司合成。10供體底物和靶底物寡核苷酸上海生工生物工程公司合成，用PAGE純化。SIVP27抗原ELISA檢測試劑盒(RETRO-TEKTMSIV-lP27AntigenELISA，CellularProductsInc.產(chǎn)品)，新喋呤ELISA試劑盒(ELItestNeopterin德國產(chǎn))，P2-微球蛋白ELISA法免疫酶聯(lián)試劑盒由ImmunotechCo.提供，一抗為鼠抗人CD4單抗，二抗羊抗鼠IgG-FITC-邦定公司產(chǎn)品?？剐∈驝D3、CD4、CD8和CD45熒光標(biāo)記單克隆抗體購自美國e.B公司生產(chǎn)。6、儀器EmaxTM酶標(biāo)儀為美國MolecuarDevECes公司產(chǎn)品和法國生產(chǎn)的LP400全自動酶標(biāo)儀。流式細(xì)胞儀FACS420Becton-Dickinson產(chǎn)品。負(fù)壓超凈臺BHA48HBIOHAZARD公司產(chǎn)品，英國。低溫高速離心機RS-20IV,TOMYSEIKO產(chǎn)品，日本。C02培養(yǎng)箱CO-ITOKIWA公司產(chǎn)品，日本。PCR儀MODEL50/60,COYTEMPCYCLER公司產(chǎn)品，英國。(二)體外實驗1、對HIV-1復(fù)制酶的體外抑制作用。(1)對艾滋病毒l型整合酶(HIV-1IN)的抑制作用。將供體底物包被試驗板，洗板后加入反應(yīng)緩沖液、不同濃度藥液和標(biāo)定濃度的基因工程HIV整合酶，37。C反應(yīng)l小時。加入耙底物，混合，37。C反應(yīng)。洗板。加入牛血清蛋白，室溫反應(yīng)。洗板。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素，室溫反應(yīng)。洗板。加顯色底物顯色。加0.1NNaOH終止顯色反應(yīng)。酶標(biāo)儀405nm測定OD值。同時設(shè)酶對照和空白對照，計算IC50，試驗操作參見文獻(xiàn)郭志敏，陳鴻珊.HIV-1整合酶聯(lián)免疫吸附試驗及其抑制劑的研究.中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志.2002;16(2)119-123。結(jié)果見表l:表l.艾寧顆粒抑制HIV-1整合酶的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(2)對艾滋病毒1型逆轉(zhuǎn)錄酶(HIV-1RT)的抑制作用。將標(biāo)定濃度的基因工程HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(P66/51)、不同濃度的藥液、反應(yīng)緩沖液和SH-dTTP加入后，混合，37匸反應(yīng)。O'C終止反應(yīng)。反應(yīng)液滴加于濾紙片上，冷三氯乙酸洗3次。乙醇脫水后烤干。液閃儀測定cpm值。同時設(shè)酶對照和空白對照及陽性藥物對照，計算ICso，試驗操作參見文獻(xiàn)彭宗根，陳鴻珊，滕立.艾滋病毒I型逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的小鼠血清活性動態(tài)研究.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志.2003;23(1):514-517。結(jié)果見表2。表2.艾寧顆粒抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)果藥物IC50(>g/ml)第l批第2批平均值陽性對照NVP艾寧顆粒0.253>10000.203>10000.2±0.035M000(3)對艾滋病毒1型蛋白酶(HIV-1PR)的抑制作用。微孔板加入反應(yīng)緩沖液和底物，加入適量基因工程HIV蛋白酶及不同濃度藥液，混勻，37t:反應(yīng)，加DMSO終止反應(yīng)。加入碘乙酸鈉，混勻，37'C反應(yīng)。加入Dig-NHS，混勻，37"C反應(yīng)，加入甘氨酸中斷反應(yīng)。加入鏈霉親和素標(biāo)記的96孔板中，同時加入反應(yīng)緩沖液，混勻，室溫反應(yīng)，將底物結(jié)合到酶標(biāo)板上。洗板。加阻斷劑室溫反應(yīng)。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體Fab片段，室溫反應(yīng)。洗板。加入底物pNPP顯色，酶標(biāo)儀405nm測OD值。同時設(shè)酶對照、空白對照和陽性藥對照，計算IC50，試驗操作參見文獻(xiàn)郭志敏，陳鴻珊.HIV-1整合酶聯(lián)免疫吸附試驗及其抑制劑的研究.中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志.2002;16(2)119-123。結(jié)果見表3。表3.艾寧顆粒抑制HIV-1蛋白酶的結(jié)果藥物IC50第l次第2次平均值陽性對照(SQ)艾寧顆粒組13.586nmol/L>300yg/ml2.658nmol/L>300Pg/ml8.122±7.727nmol/L>300iig/ml2艾寧顆粒在細(xì)胞培養(yǎng)中抗HIV-1作用(1)在MT-4細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對細(xì)胞的毒性和抑制HIV-1作用MTT染色法測定藥物對細(xì)胞的毒性(CC5o和CCo)MT-4細(xì)胞培養(yǎng)和MTT染色檢測細(xì)胞毒性將lxl05細(xì)胞/ml100n1接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，同時分別加3倍稀釋的艾寧顆粒，和陽性藥AZT，或NVP2倍稀釋藥液，每個稀釋度重復(fù)3孔，設(shè)細(xì)胞對照組。置37'C、5%(202和飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變。加藥后第4天(96小時)后吸棄上清100iU，每孔加10pl5mg/mlMTT染色，37°C、5。/。C02飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4小時，每孔加入100ul50%DMF，17%TritonX-100脫色液，37。C過夜，在酶聯(lián)儀上測定波長為570nrn的OD值，計算藥物半數(shù)有毒濃度(CC50)。MTT染色法測定艾寧顆粒在MT-4細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV的半數(shù)有效濃度。將MT-4細(xì)胞lxl05/ml50p1接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入50pl10-2的HIV-1實驗室病毒株IIIB培養(yǎng)液，同時加最大無毒濃度以下稀釋的不同濃度艾寧顆?；蜿栃詫φ账嶢ZT和NVP藥液100lU，在37°C、5。/。C02和飽和濕度下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，于第7天用MTT法染色，測定ODs7omn，計算藥物半數(shù)有效濃度(EC5Q)，試驗操作參見文獻(xiàn)盧長安，山地香茶菜對HIV-1作用的實驗研究.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志.1998，4(4)25-26。結(jié)果如下以Bliss法求得三批實驗艾寧顆粒對MT-4細(xì)胞50%毒性濃度CC5。=0.4683mg/ml。結(jié)果見表4。表4.艾寧顆粒對MT-4細(xì)胞的50%毒性濃度(三批)藥物濃度(mg/ml)OD均值標(biāo)準(zhǔn)差SD存活細(xì)胞率(％)0.01850細(xì)722.321.250.01450.007820.240.01900.011728.680.03380.015640.720.6250.02830.012839.440.03230.012548.680.05080.021861.240.3130.04150.021157.940.04980.029775.090.05750.017869.380.1560.04700.015665.620.05730掘686.420.08290.0129細(xì)胞對照0.07160.01090.06630.0226對HIV-1感染細(xì)胞的保護作用分別計算出各稀釋度OD均值和標(biāo)準(zhǔn)差，再以下式計算各稀釋度藥物對HIV感染細(xì)胞的保護率感染給藥OD-HIV感染對照OD保護率=-x100%細(xì)胞對照OD-HIV感染對照OD達(dá)到50%保護的劑量，為50M有效濃度(EC5())。關(guān)于ECso的計算，可根據(jù)各稀釋度的保護率，利用正規(guī)機率單位法(Bliss法)計算EC5o的統(tǒng)計程序求出。對病毒感染細(xì)胞避免發(fā)生細(xì)胞病變(CPE)的保護率,就是對病毒感染細(xì)胞發(fā)生CPE的抑制率，即抑制率=保護率。藥物對細(xì)胞毒性CCso的計算同EQo，只是上述保護率公式中的HIV感染對照OD值應(yīng)代入0。三批試驗結(jié)果顯示，艾寧顆粒的抑制率在0.078-0.156mg/ml，保護率(抑制率)大于50%，表明其對HIV-1有一定的抑制作用，抑制率為54.7%76.1%。以Bliss法求得抑制HIV-1的半數(shù)有效濃度EC5o-0.0卯lmg/ml(三批實驗均數(shù))，其選擇指數(shù)SI=CC5G/EC50=0.4683/0.0901=5.1976(三批實驗均數(shù))(見表5、6、"。表5.艾寧顆粒對MT-4細(xì)胞的50%毒性濃度(均值)藥物濃度(mg/ml)OD均值標(biāo)準(zhǔn)差SD存活細(xì)胞率(％)1.250.01730.01023.7470.6250.03150.013642.9470.3130.04740.024264.7570.1560.05390.013373.807細(xì)胞對照0.07360.0155表6.艾寧顆粒HIV-1感染細(xì)胞的保護作用(三批)藥物濃度(mg/ml)OD均值標(biāo)準(zhǔn)差SD保護率(抑制率)(％)0.07150.009965.600.3130.07850馬868.990.05080扁3-10.530.07600.027976.400.1560.08650扁388.710.06750.024163.210細(xì)50.024139.200.0780.08000.015772.690.06500.009652.200細(xì)50.027015.200.0390.06730.005041.270.06480馬351.100.08580.0208細(xì)胞對照0.09110.01910.07590.01410.04420.0165病毒對照0.05050.01100.05310.0060表7.艾寧顆粒對HIV-1感染細(xì)胞的保護作用(均值)藥物濃度(mg/ml)OD均值標(biāo)準(zhǔn)差SD保護率(抑制率)(％)0.3130扁90.015744.8630.1560.07670.027476.1070.0780細(xì)50.016554.7000.0390.06090.012835.86細(xì)胞對照0.10290.017病毒對照0.07470.01272批實驗表明，在HIV-1IIIB慢性感染的H9細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)，艾寧顆粒對細(xì)胞培養(yǎng)的TC50為964.46±581.32ug/ml，EC50為641.42±584.06yg/ml，SI為1.85±0.78。陽性對照藥AZT對細(xì)胞培養(yǎng)的TC5o為156.49±15.58wg/ml，EC50為39.51Pg/ml,SI為3.7。見表8。表8艾寧顆粒在HIV-1IIIB慢性感染H9細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)的細(xì)胞毒性及其抑制HIV-1P24作用TC50(yg/ml)IC50(yg/ml)SI藥物第l批第2批2批平均第l批第2批2批平均第1批第2批2批平均AZT167.51145.47156.49±15.58>10(g/ml抑制率為20.7%)39.51--3.7-艾寧顆粒553'4Q1375.51964.4±581.32228.431054.42641.42±584.062.41.31.85±0.78艾寧顆粒對HIV-1IIIB慢性感染H9細(xì)胞培養(yǎng)的毒性TC5o為964.46±581.32ug/ml，在HIV-1IIIB慢性感染H9細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抑制HIV-1IIIBP24抗原的EC50為641.42±584.06Ug/ml，SI為1.85±0.78。陽性對照藥齊多夫定(AZT)的結(jié)果與有關(guān)文獻(xiàn)報道一致，說明實驗可信。(2)PBMC中抑制HIV-1-P24抗原的作用和對細(xì)胞的毒性艾寧顆粒在HIV-1感染的PBMC細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對HIV-1-P24抗原的抑制作用取健康人新鮮靜脈血，用FiColl分離液分離人外周血單核細(xì)胞(PBMC)，以含PHA的培養(yǎng)液制備1.5x105細(xì)胞/ml懸液接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，37°C5%032培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72小時。用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，用AZT敏感(018a)和AZT耐藥(018c)病毒株10-2的病毒液感染細(xì)胞，吸附2小時。用無血清1640培養(yǎng)基洗去未吸附病毒，用培養(yǎng)液將感染病毒的細(xì)胞配成lxl06/1111。種入96孔培養(yǎng)板，100pl/孔。同時分別加無毒濃度以下3倍稀釋的艾寧顆粒和2倍稀釋的陽性對照藥AZT不同濃藥液100pl。設(shè)細(xì)胞對照和病毒感染細(xì)胞對照組組。37°C5%002培養(yǎng)第4天(96小時)，吸出上清，-20'〇凍存，待測HIV-1-P24抗原滴度。上述HIV-1病毒處理的PBMC細(xì)胞培養(yǎng)在吸取上清液后，加入MTT液染色，測定ODs7onm值，計算CC5Q。試驗操作參見文獻(xiàn)張興權(quán)，范江主編，沈廉.HIV感染的細(xì)胞培養(yǎng)和病毒學(xué)檢測.艾滋病病毒感染與艾滋病.人民衛(wèi)生出版社出版1999，295-304。ELISA方法測定HIV-1P24抗原凍存的PBMC感染后加藥細(xì)胞上清液，溶化后進(jìn)行1:100稀釋。按試HIV-1P24抗原劑盒提供的操作步驟測定HIV-1P24滴度，加藥組與病毒對照組比較，計算艾寧顆粒半數(shù)有效濃度(EC50)。半數(shù)毒性濃度(CC5Q)和半數(shù)有效濃度(EC5Q)及選擇指數(shù)(SI)計算方法藥物在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對細(xì)胞或HIV-1P24抗原抑制百分率計算方法抑制％=(實驗組OD-病毒對照組OD)x100/(正常對照組OD-病毒對照組OD)Reed&Muench法計算藥物在細(xì)胞培養(yǎng)中的CG。和ECs。及SI的方法公式如下50-<50%累積抑制％CC5o或￡<:50=&1^1(^(1(^<50°/()藥物濃度+xlog稀釋倍數(shù))>50%累積抑制％-<50%累積抑制％SI=CC50/EC50A、AZT敏感株HIV-1018a和AZT耐藥株HIV-1018c感染2小時后PBMC細(xì)胞培16養(yǎng)中對細(xì)胞的毒性結(jié)果顯示，兩批實驗半數(shù)有毒濃度CQo對AZT敏感病毒株018a分別為1251.3和1190.8yg/ml，平均(122U±42.78)ug/ml，對AZT耐藥病毒株分別為730.20和1232.2ug/ml，平均(981.20土354.97)ug/ml(見表9)。表9.艾寧顆粒對HIV感染PBMC細(xì)胞培養(yǎng)的毒性CCs。(ug/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>B、AZT敏感株HIV-1018a和AZT耐藥株HIV-1018c感染后2小時的PBMC細(xì)胞培養(yǎng)中對P24抗原的抑制作用結(jié)果艾寧顆粒EC5o分別為181.5和313.23ng/ml，平均(247.37±93.15)ng/ml，SI分別為:5.2禾H6.2，平均為5.7土0.70。陽性對照藥AZT兩批實驗EC5o未做到頭，分別為O.46和O.0lPg/ml，SI分別為〉58.28和〉100.0,平均為>79.14±29.50(見表10)。表10.艾寧顆粒在PBMC細(xì)胞中抗HIV-1018a(AZT敏感株)作用(吸附2h后加藥)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>結(jié)果ECso分別為499.70和134.53Pg/ml，平均(317.12土258.21)Ug/ml，SI分別為3.1禾口10.4，平均為6,8土5.11。對陽性藥AZT第1批實驗ECso未做到頭，<0.46，第1批實驗為0.016ug/ml，平均為<0.24±0.31，SI分別為>58.28和>62.5，平均為>60.39土2.98(見表11)。表11艾寧顆粒在PBMC細(xì)胞中抗HIV-1018c(AZT耐藥株)作用(吸附2h后給藥)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>3體外試驗結(jié)論艾寧顆粒在體外對HIV-1整合酶有一定的抑制作用，其ICso為153.29土0.07ug/ml。對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶1000Ug/ml無抑制作用，對HIV-1蛋白酶300ug/ml無抑制作用。陽性對照藥物HIV-1整合酶用SY，ICso為0.51±0.06ug/ml;HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶用奈韋拉平(NVP)，ICs。為:0.228±0.035ng/ml;HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶用沙奎那韋(SQ)，IC50為8.122±7.727nmol/L。都有效，與文獻(xiàn)一致，說明實驗可信。根據(jù)下文中艾寧顆粒在細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)的毒性結(jié)果，即傳代人T淋巴細(xì)胞、MT-4細(xì)胞和人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的半數(shù)中毒濃度(CC5o)分別為693.1±432.lng/ml，200.9±79.2|xg/ml和1221.1±42.78ng/ml，可知其抑制HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶活性的ICso為153.29±0.07Pg/ml，為實際抑制作用，非細(xì)胞毒性所致。艾寧顆粒對艾滋病病毒I型(HIV-1IIIB)感染的MT-4細(xì)胞作用結(jié)果顯示，艾寧顆粒在0.078-0.156mg/ml劑量范圍內(nèi)，對HIV-1感染的MT-4細(xì)胞有一定的抑制作用。其平均抑制率為65.4%;平均治療指數(shù)為5.2。艾寧顆粒在HIV-111IB慢性感染的H9細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)抗HIV的作用2批實驗表明，在HIV-1IIIB慢性感染的H9細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)，艾寧顆粒對細(xì)胞培養(yǎng)的TQo為964.46±581.32Ug/ml，ECso為641.42±584.06ug/ml，SI為1.85±0.78。陽性對照藥AZT對細(xì)胞培養(yǎng)的TCso為156.49±15.58g/ml，EC50為39.51Ug/ml，SI為3.7。艾寧顆粒在人外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)中對AZT敏感HIV-1病毒株感染的細(xì)胞第4天MTT染色毒性CC50為1221.1±42.78pg/ml，感染后2小時加藥第4天上清液測定P24抗原ECso為247.37±93.15嗎/ml，選擇指數(shù)為5.7±0.7。艾寧顆粒在人外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)中對AZT耐藥HIV-1病毒株感染的細(xì)胞第4天MTT染色毒性CCso為981.2±354.97(_ig/ml，感染后2小時加藥第4天上清液測定P24抗原ECso為317.12土258.21jag/ml，選擇指數(shù)為6.8±5.11。(三)體內(nèi)實驗1、艾寧顆粒對免疫抑制小鼠免疫功能重建作用的影響。(1)建立免疫抑制小鼠動物模型昆明種小鼠在本所二級實驗室喂養(yǎng)三天，然后按每公斤體重15毫克用量給動物注射環(huán)孢菌素A0.5毫升(濃度為lmg/ml)隔日注射l次，共注射3次。第3次注射后次日灌胃給藥。設(shè)正常對照組，模型對照組，陽性對照組(貞芪扶正顆粒)，5倍給藥組，IO倍給藥組和20倍給藥組'(給藥組為艾寧顆粒組)。各組動物20只。每日給藥1次，每次0.5ml(按成人59g生藥量/60公斤體重計算，小鼠用藥的等效劑量為每只0.02g生藥量/只)，連續(xù)給藥12天。給藥直至動物眼眶放血。然后每只鼠用3K-EDTA抗凝，取0.1ml抗凝血，按試劑使用說明進(jìn)行T細(xì)胞亞群檢測[關(guān)崇芬，王健，徐淑玲等.中研II號治療艾滋病的臨床和實驗研究.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志2003;23(7):494-497]。檢測結(jié)果統(tǒng)計分析，采用SPSS.1L0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。(2)結(jié)果見表11'。結(jié)果表明，用環(huán)胞霉素成功建立了免疫抑制小鼠模型。陽性對照組與模型對照組比較，差異尸<0.05。與艾寧顆粒中劑量組結(jié)果近似。三個艾寧顆粒給藥組均顯示出對免疫抑制模型小鼠免疫功能的重建具有促進(jìn)作用，但低劑量、中劑量的作用更為明顯。表ll，.艾寧顆粒對免疫抑制小鼠CD4+T細(xì)胞的實驗結(jié)果(>SE;n=20)組別動物數(shù)(只)CD4+T細(xì)胞。/0正常對照組2025.58±2.113模型對照組2015.039±0.723*陽性對照組2019.27±1.130***艾寧顆粒低劑量組2020.477士0.597"艾寧顆粒中劑量組2019.285±0.792"艾寧顆粒高劑量組2018.347±0.872"*與正常對照組比較*尸<0.01;與模型對照組比較**尸<0.01;***尸<0.05。2、艾寧顆粒對免疫缺陷猴病毒(Simianimmunodeficiencyvirus,SIV)體內(nèi)感染模型預(yù)防性治療的影響。(1)模型建立、分組及給藥方式。乙醚常規(guī)麻醉動物，病毒株SIVmac251，以每只猴3MID/ml(100%低感染劑量)經(jīng)靜脈注射lml感染動物。艾寧顆粒用前以蒸餾水溶解，濃度為lg/ml(生藥)。從感染當(dāng)日起每日插胃管灌服1次，10ml/次。疊氮胸苷(Zidovudine,AZT)為陽性對照組，100mg/粒，用前溶于生理鹽水10ml中，日灌服1次。生理鹽水為陰性對照組，給藥方法同上。連續(xù)給藥8周，每周停服1次，8周后繼續(xù)觀察4周。治療后2、4、8、12周各采血1次。試驗操作參見文獻(xiàn)AsummaryoftheWHOInformalConsultationonAnimalmodelsforevaluationofdrugsandvaccinesforHIVinfectionandAIDSJ，ESPARZAandS.OSMANOVGlobalprogrammeonAIDS,worldHealthOrganizetionGeneva,SwitzerlandGeneva,14-15September1989;21-22。(2)檢測指標(biāo)。①病毒分離人T淋巴細(xì)胞系CEMX174，生長于RPMI1640培養(yǎng)液中。感染猴采血，肝素抗凝，離心2000轉(zhuǎn)/分，IO分鐘，取血漿200ul，以50倍做系列稀釋，各相當(dāng)于血漿中SlVmac251滴度為5、25、125、625、3125和15625TCID/ml，加入24孔培養(yǎng)板(Lin60產(chǎn)品)，每孔和RBMI1640培養(yǎng)液加至1ml，再加入2X105細(xì)胞/ml的CEMX174細(xì)胞懸液0.5ml，在37'C，5%C02條件下培養(yǎng)4周，定期觀察細(xì)胞病變。②血漿SIVP27抗原水平測定ELISA法。采用SIVP27抗原ELISA檢測試劑盒，操作按產(chǎn)品說明書。③猴外周血CD4細(xì)胞計數(shù)采用流式細(xì)胞儀法，一抗為鼠抗人CD4單抗，二抗羊抗鼠IgG-FITC。分離的猴PBMCs(PeriPheralbloodmononuclearcells)，間接法標(biāo)記后，經(jīng)2%多聚甲醛，4"固定過夜，次曰上機檢測。④血清新喋呤水平測定實驗方法采用酶聯(lián)免疫測定法，使用ELItestNeopterin試劑盒，操作按產(chǎn)品說明書。⑤血清e2-微球蛋白變化的測定采用e2-MGELISA試劑盒，按說明書要求進(jìn)行試驗操作，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。猴血清按不同治療時間采血，常規(guī)分離血清，低溫冰箱-20'C保存。實驗結(jié)果使用法國全自動酶標(biāo)儀對樣品OD值測定，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定相應(yīng)蛋白含量。⑥病理檢查實驗到期麻醉處死，取出臟器，固定于10%福爾馬林，進(jìn)行切片，HE染色，鏡檢。試驗操作參見文獻(xiàn)關(guān)崇芬，王健，徐淑玲等.中研II號治療艾滋病的臨床和實驗研究.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志2003;23(7):494-497。(3)實驗結(jié)果①各組不同階段血漿病毒滴度的檢測結(jié)果見表12。表12.各組各階段血漿病毒滴度的平均值(1ogl0/ml)組別一J-iLArt/■1~I、治療后(周)動物數(shù)(只)24812艾寧顆粒組43.610.80.10.1AZT組42.971.000模型對照組33.021.01.691.0表1顯示，以0.51ogl0/ml標(biāo)準(zhǔn)判定，給藥組在4周時病毒滴度下降，12周時病毒分離與AZT組結(jié)果近似，對照組病毒分離一直為陽性。20②SIVp27抗原水平的檢測結(jié)果見表13。表13.各組SIVp27抗原水平比較(pg/ml)組別動物數(shù)(只)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表14顯示，感染前各組動物之間CD4細(xì)胞百分率差別不大，感染后4周艾寧顆粒<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>AZT組4l:ioi101:3201:3201:3201:12801:12801:12801:6401:2560模型對照組3—一一一一———i:20i:640____i:20i:1280表15顯示，艾寧顆?？贵w反應(yīng)比模型對照組出現(xiàn)早且滴度高。⑤不同時間動物血清新喋呤水平的變化結(jié)果見表16。表16.感染前后不同時間動物血清新喋呤水平變化(nmol/L，x土s)組別動物數(shù)治療后(周)(只)24812艾寧顆粒組431.3土5.03'11.07±1.69**11.7±0.77"12.3±7.14**AZT組430±27.93*11.6土3.39"11.25土6.01"11.25±4.6"模型對照組338土28.35*20.17±12,29*27.33±5.35'41±7.0*注a、感染前新喋呤水平為7.05±3.01，為各組動物合計的均值;b、同感染前比較t檢驗結(jié)果'P<0.01，**P>0.05。⑥動物血清P2-MG含量變化結(jié)果見表17。表17.感染前后各組動物血清P2--MG含量變化(mg/L，X±s)組別動物數(shù)感染前治療后(周)(只)24812艾寧顆粒40.0427±0.0850±0.0623±0.0780±0.035±組0細(xì)0.0250.0070.02120.009AZT組40.0300±0.0120.0541±0.0020.0575±0.0230.0425±0.0110扁0±0麓模型對照30.0573±0.0727±0.470±0.0467±0.0355±組0.0170細(xì)0.0040.0070細(xì)上述結(jié)果說明，艾寧顆粒具有抑制感染猴血漿病毒血癥及保護機體免疫細(xì)胞的作用。3、對艾寧顆粒對免疫缺陷猴病毒慢性感染模型治療的影響。(1)模型建立、分組及給藥方式食蟹猴10只，隨機分為艾寧顆粒組和模型對照組，每組5只，以SIVmac251病毒液，5MIDkk)(5個100%猴感染劑量)lml靜脈注射感染動物。感染SIV后90天，艾寧顆粒組以濃度為0.5g/ml艾寧顆粒插胃管灌服藥物，相當(dāng)于人每日給藥劑量lg^cg(生藥)，每日l次，每次10ml，連續(xù)給藥8周。模型對照組給等劑量水。停藥后觀察2個月，觀測指標(biāo)項目和采樣點。試驗操作參見文獻(xiàn)吳小閑，張奉學(xué)，何伏秋等.猴免疫缺陷病毒(SIV)慢性感染猴模型的建立.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報2000:17(4):355-357。(2)檢査方法CD3、CD4淋巴細(xì)胞亞群操作步驟按說明書進(jìn)行，測定CD3+CD4+淋巴細(xì)胞比例，計算CD4細(xì)胞和CD8細(xì)胞％和CD4/CD8比例。血漿病毒載量動物感染SIV后按采樣點要求采血，EDTA抗凝，離心取血漿凍存后，送法國巴黎第五大學(xué)腫瘤和病毒分子實驗室盧葳教授處測定。測定方法由盧葳教授創(chuàng)建，并發(fā)表于NatureMedicine,引物及探針自行制備，并使用Roche公司LightCycler定量儀進(jìn)行檢測。淋巴結(jié)活檢治療前無菌手術(shù)取l側(cè)腹股溝淋巴結(jié)，治療結(jié)束后觀察8周后又取另1側(cè)腹股溝淋巴結(jié)，固定于10%中性甲醛液，石蠟包埋，H.E染色后光鏡觀察。部分淋巴結(jié)切片作細(xì)胞增殖相關(guān)抗原Ki-67(克隆號B56，BD公司)的免疫組化檢査，采用英國Abcam公司的顯色系統(tǒng)(HRP標(biāo)記的抗兔/小鼠IgG和IgM，ab2891)DAB顯色后，蘇木素輕度復(fù)染，光鏡觀察。試驗操作參見文獻(xiàn)盧耀增，吳小閑，李國橋等.猴免疫缺陷病毒急性及慢性感染淋巴結(jié)的病理變化.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報2003;20(3):191。(3)結(jié)果①一般情況實驗猴采用SlVmac251感染90天的食蟹猴，此時猴體內(nèi)血漿病毒載量均己降至調(diào)定點(setpoint)，即平臺期。雖然由于存在個體差異，各猴到達(dá)此平臺期的病毒載量水平并不相同，但在此后較長的一段時間，各猴的病毒載量均維持于一個相對穩(wěn)定的水平，其對數(shù)(loglO)的波動范圍一般<0.5。SIV感染后各猴的一般情況尚好。艾寧顆粒組治療后一般情況亦尚佳，體重在治療至8周時有所下降，8周后一般維持較穩(wěn)定。模型對照組兩猴一直間歇腹瀉，可能與體質(zhì)和病毒感染相關(guān)。艾寧顆粒組和模型對照組癥狀體征未見顯著差異。②免疫學(xué)檢查結(jié)果兩組猴治療前和治療后每隔4周檢測1次T細(xì)胞亞群CD4和CD8動態(tài)水平，觀察藥物的效果，分別分析CD4和CD8淋巴細(xì)胞數(shù)量及CD4/CD8比值的變化。結(jié)果顯示，艾寧顆粒組治療4周后的CD4淋巴細(xì)胞數(shù)量均較治療前上升，8和12周與治療前持平，16周則下降。模型對照組相對應(yīng)的點即治療后4、8、12周較治療前上升。16周亦下降，但相對應(yīng)CD4細(xì)胞數(shù)量治療后各點均較治療前上升(見表18、19、20)。表18.<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>17.8415.9524.8727.9517.5319.8119.1721.3139.4228.09幼2請J.Z5/.朋".，"62，5.07，模型對照組21.3624.5525.9710.2217.1328.4339.5436.1626.5526.9022.1635.3029.8013.4121.2035.9436.3730.4312.1519.1338.5149.9537.6622.6523.60潔52"7*扁0艾寧顆粒組和模型對照組兩組治療前后、停藥后比較*^>0.05。表20.CD4/CD8比值的變化(X土SD，n=5)分組治療前治療后(周)481216艾寧顆粒組1.141.251.350.891.171.021.381.460.770.981.261.511.430.851.401.001.501.300.661.221.311.380.490.401.50附g朋厶"0."/.，模型對照組1.590.730.751.051.220.440.620.620.581.070.510.620.850.941.200.420.670.911.001.230.610.500.670.841.41丄070.260.670.240.27膨瞎**0.36艾寧顆粒組與模型對照組兩組治療前后比較*^<0.05，停藥后比較**>0.05。③病毒學(xué)檢査結(jié)果兩組治療前后各點血漿病毒載量的測定結(jié)果波動范圍均O.5l0g10，沒有顯著性差異(見表21)。表21.艾寧顆粒組和模型對照組治療前后血漿病毒載量(bgl0.copies/ml)分組治療前治療后(周)48163.203.153.113.023.583.183.423.36艾寧顆粒組5.135.235.215.375.135.245.585.354.855.135.184.84附e朋"S"9"0"9SD0."丄7/7.""26.336.236.266.405.825.925.325.19模型對照組4.534.644.524.264.594.334.124.275.205.375.245.075."，請丄似緩譜艾寧顆粒組與模型對照組兩組治療前后比較*^>0.05，停藥后比較*^>0.05。(D淋巴結(jié)活檢病理組織學(xué)檢査結(jié)果艾寧顆粒組腹股溝淋巴結(jié)，濾泡，生發(fā)中心增大，增多。生發(fā)中心有少量免疫復(fù)合物沉著，中心細(xì)胞凋亡輕度，副皮質(zhì)層有較多濾泡增生，呈增生型病變。模型對照組腹股溝淋巴結(jié)，淋巴濾泡縮小，濾泡數(shù)量明顯減少，生發(fā)中心縮小，中心細(xì)胞稀疏，有免疫復(fù)合物沉著，呈退變型病理改變。Ki-67(單克隆抗體)免疫組織化學(xué)檢査結(jié)果顯示艾寧顆粒組均顯示淋巴細(xì)胞增生，而模型對照組淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞明顯減少，呈退變狀態(tài)。表明艾寧顆粒有促進(jìn)淋巴組織增生作用，或延緩淋巴組織退變作用。根據(jù)以上鏡下觀察對本試驗前后猴淋巴結(jié)各部分變化的評價見表22和表23。表22.猴艾滋病模型治療后淋巴結(jié)病變變化表(N-5)_淋巴組織增生退變耗竭濾泡細(xì)胞凋亡副皮質(zhì)內(nèi)濾泡增生++++++—++++++—+—+++—+++—艾寧顆粒組3200'0023"05"04廣41O'模型對照組O500014041500032運用SPSSIO.O軟件，進(jìn)行秩和檢驗，與模型對照組比較5^^6/.05^^^。.0/表23.淋巴結(jié)病理變化評價"一"陰性"+"輕度++"中度"+++"重度淋巴結(jié)濾泡生發(fā)中心體積沒擴大，細(xì)胞數(shù)量沒增加，細(xì)胞保持原狀。濾泡和生發(fā)中心體積略較增大比原來的增大1/4，細(xì)胞數(shù)量包括表層淋巴細(xì)胞增加約1/4。濾泡生發(fā)中心擴大比原來擴大1/2。細(xì)胞數(shù)量稠密，套層和帽區(qū)淋巴細(xì)胞受壓。濾泡和生發(fā)中心高度擴大2/3以上，淋巴細(xì)胞數(shù)量劇增，向套層和帽區(qū)擠壓，中心細(xì)胞明暗區(qū)融為一片退變?yōu)V泡、生發(fā)中心不擴大，細(xì)胞數(shù)量無明顯增加，也無中心細(xì)胞稀疏減少現(xiàn)象濾泡、生發(fā)中心細(xì)胞稀疏，生發(fā)中心明區(qū)細(xì)胞減少，暗區(qū)細(xì)胞稀疏。濾泡和生發(fā)中心細(xì)胞減少稀疏，中心明區(qū)細(xì)胞變性死亡。暗區(qū)中心細(xì)胞稀疏減少。在淋巴結(jié)內(nèi)占3/4以上的濾泡和生發(fā)中心逐漸消失代之淋巴細(xì)胞浸潤。耗竭在皮質(zhì)區(qū)內(nèi)沒有淋巴濾泡和生發(fā)中心消失濾泡生發(fā)中心消失只是個別區(qū)域。半數(shù)以上濾泡和生發(fā)中心消失。消失區(qū)內(nèi)被淋巴細(xì)胞或纖維化組織代替。占3/4以上的淋巴濾泡生發(fā)中心消失代之淋巴細(xì)胞浸潤或纖維化。4、艾寧顆粒部分癥狀藥效學(xué)實驗研究。(1)實驗材料動物昆明種小鼠；藥品艾寧顆粒0.1715克藥粉相當(dāng)于l克生藥;在濾泡和生發(fā)中生發(fā)中心和套層濾泡和生發(fā)中心凋殘存濾泡生發(fā)中心心沒有細(xì)胞出現(xiàn)見約有1一5個細(xì)亡細(xì)胞5個以上。尚可見凋亡細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。胞凋亡，并有凋亡_小體的出現(xiàn)_付皮質(zhì)內(nèi)沒有濾付皮質(zhì)內(nèi)見濾泡付皮質(zhì)內(nèi)增生濾泡3付皮質(zhì)淋巴濾泡仍泡和生發(fā)中心l一3個以上。然存在濾泡數(shù)目增個。力口。巴泡生淋濾增泡胞亡慮扭l皮內(nèi)泡生付質(zhì)濾，止咳橘紅口服液，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠；人參健脾丸，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠；生脈飲，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠。(2)實驗方法與結(jié)果①艾寧顆粒對小鼠的鎮(zhèn)咳作用選用昆明種小鼠52只，雌雄各半，體重22土2克，按體重及性別均勻分為5組，分別為給藥大劑量組19.7g生藥/kg體重、中劑量組9.83g生藥/kg體重、小劑量組4.92g生藥/kg體重，實驗時將艾寧顆粒藥粉配置成一定濃度，給藥量為0.201111/108體重。陽性對照組給予止咳橘紅口服液，給藥劑量為0.1ml/10g體重?？瞻讓φ战M給予等量蒸餾水。采用灌胃給藥方式，連續(xù)給藥3天，實驗當(dāng)日給藥30分鐘后，將動物置于1000ml的燒杯內(nèi)，注入0，2ml氨水于燒杯內(nèi)的棉球中，記錄小鼠咳嗽的潛伏期及3分鐘內(nèi)的咳嗽次數(shù)。結(jié)果見表24。表24.艾寧顆粒對小鼠的鎮(zhèn)咳作用<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>與空白對照組比較*戶<0.05，**尸<0.01。由以上結(jié)果可見，艾寧顆粒能較明顯的延長小鼠咳嗽的潛伏期，明顯減少小鼠咳嗽次數(shù)，提示該藥具有明顯的鎮(zhèn)咳作用。②艾寧顆粒對小鼠耐力的影響選用昆明種小鼠，雌雄各半，體重20土2克，按體重及性別均勻分為5組，分別為給藥大劑量組19.7g生藥/kg體重、中劑量組9.83g生藥/kg體重、小劑量組4.92g生藥/kg體重，實驗時將艾寧顆粒藥粉配置成一定濃度，給藥量為0.20ml/10g體重。陽性對照組給予生脈飲口服液，給藥劑量為0.1ml/10g體重?？瞻讓φ战M給予等量蒸餾水。采用灌胃給藥方式，連續(xù)給藥3天，實驗當(dāng)日給藥30分鐘后，將動物放入25'C的水中，記錄小鼠的游泳持續(xù)時間，結(jié)果見表25。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>(四)臨床試驗1.臨床資料U診斷標(biāo)準(zhǔn)主要根據(jù)病史、癥狀體征及實驗室血清學(xué)檢査進(jìn)行診斷。1.2入選標(biāo)準(zhǔn)所有病人均根據(jù)1995年我國艾滋病診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確診，并符合入選標(biāo)準(zhǔn)。1.2.1年齡18-55歲。1.2.2HIV抗體確證陽性。1.2.3CD4陽性計數(shù)100-500/mm3。1.2.4合并下列機會性感染者(腸道感染、皮膚感染、呼吸系統(tǒng)感染)。1.2.5簽署知情同意書者。2.臨床觀察2.1觀察藥物艾寧顆粒，每天3次，每次1袋，每袋5克，3個月為一療程。2.2觀察方法在療前，1月末，3月末分別進(jìn)行病毒載量，免疫功能指標(biāo)(CD4，CD8，CD4/CD8比值，CD45RA細(xì)胞數(shù)量檢測)，并填寫臨床觀察表。2.3臨床觀察及隨訪內(nèi)容在治療前0月及治療后第1、3月末分別觀察乏力、低熱、消瘦、咳嗽、納呆、腹瀉、脫發(fā)、癢疹等癥狀體征，采用等級積分的方法表示。2.4病毒載量采用的是RT-PCR法測定；免疫功能指標(biāo)用來檢測T細(xì)胞亞群，以CD4細(xì)胞絕對值和CD45RA細(xì)胞絕對值作為病人免疫功能的主要指標(biāo)；臨床癥狀體征以來表示，重記3分，中記2分，輕記1分，正常記O分。3.觀察結(jié)果3.1療效判定標(biāo)準(zhǔn)從病毒學(xué)，免疫學(xué)和臨床表現(xiàn)來判斷。免疫功能上升CD4細(xì)胞數(shù)上升>30%;穩(wěn)定:CD4細(xì)胞數(shù)變化范圍在±30%;下降CD4細(xì)胞數(shù)下降>30%。病毒載量下降病毒載量降至檢測不出的水平(〈500拷貝/ml);或降低0.51og拷貝/ml以上的水平；穩(wěn)定病毒載量降低〈0.51og拷貝；上升病毒載量上升者。3.2治療結(jié)果一般資料14例HIV感染者，男性9例，女性5例，年齡在26-53之間，平均40歲，均為有償采供血感染。艾寧顆粒對14例HIV感染者進(jìn)行三個月的治療觀察，其結(jié)果見表2731。其結(jié)果顯示病毒載量，治療前4.554士0.9751og,治療后4.379土1.0821og，平均下降0.1751og，其中病毒載量下降9例，明顯下降的5例(大于0.51Log)，3例穩(wěn)定，有效率為64.28%;免疫功能上升3例，穩(wěn)定5例，有效率為57.14%;臨床癥狀有所改善。未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用。表27.14例HIV感染者免疫功能變化情況(例數(shù))例數(shù)療后一月末療后三l月末指標(biāo)上升穩(wěn)定下降上升穩(wěn)定下降CD4517356CD81000644CD45RA1400743表28.14例HIV感染者免疫功能檢測變化情況(；±5J指標(biāo)測定值，)療前o月療后一月末療后三月末CD4305.5±69.293U.6土72.79287.57±75.86CD8802.4±314.5783.3±333.1808.4±385.6CD45RA28.22±26.5054.85±34.4163.93±42.93表29.14例HIV感染者主要癥狀改善情況癥狀積分乏力低熱咳嗽納呆腹瀉治療前/治療后5/103/54/102/56/10_表30.14例HIV感染者血常規(guī)、肝腎功能變化情況(；is)_項目丙氨酸氨基尿素氮肌酐紅細(xì)胞計數(shù)血紅蛋白血小板計數(shù)轉(zhuǎn)移酶BUNCrRBCHbPLT_GPT(u/1)(mmol/L)(umol/L)(X1012個/L)(g/L)(xl09個/L)正常值0-402.9-8.244-1063.50-5.50110-160100-350療前O月4I.17±5,241±69.48±4.179±129.2U118.6±36.951.23212.090.49817.4148.11療后三37.10±4.931±68.00±4.4±136.78±157.2±月末28.831.3559.4760.37715.8656.78表31.14例HIV感染者CD4細(xì)胞數(shù)和病毒載量的變化情況病例CD4(IU/L)號療前o月療后一月末療后三末13132522372299413354337836528042942513053103823116210270208488楊391833836542093343042851022635031311262260270122651982121330827831114253239129月病毒(拷貝/ml)療前o月(log)療后三月末(log)log差值l譜04.261350005.130.876200005.82420005.390.415002.7540004.732.032080005.321880005.270.0554403.7223004.350.651250005.12070005.320.226350005.81760005.250.5547303.675002.70.97122004.09117004.070.0299200068720005.940.06196004.295002.71.5910100021603.331.67200004.311903.081.2252703.72109004.040.323權(quán)利要求1、一種中藥組合物，其特征在于，其主要是由下述重量份的原料藥制成黃芪15～20份、人參7～12份、當(dāng)歸8～13份、枸杞子9～14份、五味子7～12份、麥冬7～12份、天花粉8～13份、茯苓7～12份、甘草7～12份、柴胡3～8份和升麻3～8份。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的中藥組合物，其還包括一種或多種藥學(xué)上可接受的輔助添加劑。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的中藥組合物，其特征在于，所述的輔助添加劑為乳糖和糊精。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的中藥組合物，其特征在于，所述的中藥組合物為顆粒劑。5、一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于，其包括下列步驟a)取所述重量配比的黃芪、枸杞子、天花粉、茯苓和甘草5味藥，加入相當(dāng)生藥量7-10倍的水煎煮兩次，每次1~2.5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成3060'C時相對密度為1~1.2的清膏；b)取所述重量配比的人參、當(dāng)歸、五味子、麥冬、柴胡和升麻6味藥，加入相當(dāng)生藥量5~8倍的重量百分比50~80%乙醇，加熱回流或浸泡二次，每次12.5小時，合并乙醇液，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮成306(TC時相對密度為1~1.2的清膏；c)合并上述兩清膏，306(TC濃縮至相對密度為1-1.2的浸膏，即為本發(fā)明藥物的活性組分。6、如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于其還將步驟c)得到的浸膏噴霧干燥或真空干燥，得干浸膏粉。7、如權(quán)利要求1~4任一項所述的中藥組合物在制備抗艾滋病病毒和/或提高免疫功能的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種防治艾滋病的中藥組合物及其制備方法。該藥物組合物主要是由下述重量份的原料藥制成黃芪15～20份、人參7～12份、當(dāng)歸8～13份、枸杞子9～14份、五味子7～12份、麥冬7～12份、天花粉8～13份、茯苓7～12份、甘草7～12份、柴胡3～8份及升麻3～8份。本發(fā)明中藥組合物補中益氣，養(yǎng)血滋陰，不但具有抗艾滋病病毒的作用，還可顯著提高患者的免疫功能，逐步消除艾滋病患者出現(xiàn)的常見癥狀。文檔編號A61K36/8968GK101450173SQ200710171908公開日2009年6月10日申請日期2007年12月7日優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日發(fā)明者輝黃申請人:上海炎帝生物科技有限公司