專利名稱：：Ⅱ型膠原變構(gòu)肽鼻粘膜給藥治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及n型膠原變構(gòu)肽鼻粘膜給藥治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的應(yīng)用。一、
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以慢性侵襲性關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的全身性自身免疫病。在中國(guó)的患病率為0.34%,全國(guó)有近500萬(wàn)患者，致殘率高達(dá)93%。該病的發(fā)病過(guò)程是一種受抗原驅(qū)動(dòng)的"激發(fā)一連鎖免疫反應(yīng)"的過(guò)程。感染因子及自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的免疫損傷是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病及病情演變的基礎(chǔ)?？乖嚯耐ㄟ^(guò)體內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞表達(dá)，并激活T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞因子的釋放、免疫球蛋白、趨化因子及自由基等炎性介質(zhì)產(chǎn)生增多，進(jìn)而引起血管炎，滑膜增生，軟骨及骨破壞等類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的特征性病理變化。目前，尚無(wú)從根本上控制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物。臨床上主要通過(guò)非甾體抗炎藥如布洛芬及雙氯芬酸等暫時(shí)緩解癥狀。而慢作用抗風(fēng)濕藥如甲氨喋呤及來(lái)氟米特等則是通過(guò)抑制DNA合成廣泛抑制免疫反應(yīng)，進(jìn)而抑制關(guān)節(jié)炎癥。因此，這些藥物在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中并非作用于發(fā)病的最初環(huán)節(jié)，難以針對(duì)性的控制病變，致使全身及關(guān)節(jié)病變不斷進(jìn)展，最終致殘。而且，由于這些藥物的廣泛免疫抑制作用，骨髓抑制，肝功能異常等不良反應(yīng)較多，致使很多患者不能接受這些藥物治療。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)多年研究發(fā)現(xiàn)了可以用以治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的n型膠原(CII)變構(gòu)肽。研究證明，CII變構(gòu)肽能夠抑制HLA-DRJ31分子以及T細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別和由此而致的自身免疫反應(yīng)，從類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的中心環(huán)節(jié)遏止本病的發(fā)生和發(fā)展。本申請(qǐng)中將CII變構(gòu)肽進(jìn)行鼻粘膜給藥治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。二、發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供CII變構(gòu)肽治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的鼻粘膜給藥途徑。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)"CII變構(gòu)肽"指CII263-272多肽中任意一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行修飾后仍能夠與HLA-DR(31結(jié)合的多肽。用于修飾氨基酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。本發(fā)明中所應(yīng)用的Cn變構(gòu)肽主要是以短側(cè)鏈的丙氨酸(A)連續(xù)替換CII263-272多肽中T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別位點(diǎn)及與HLA-DRpi親和力相關(guān)的特定氨基酸，設(shè)計(jì)合成多條CII263-272變構(gòu)肽，變構(gòu)肽與HLA-DRP1分子有親和力，但不被T細(xì)胞受體識(shí)別。HLA-DR(31、抗原多肽及TCR三分子之間的相互識(shí)別和結(jié)合是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎異常免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。CII變構(gòu)肽可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制致病抗原的作用及T細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別，遏止類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的異常免疫反應(yīng)，從而控制發(fā)病及病變的進(jìn)展，達(dá)到從根本上治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的目的。已經(jīng)證明，HLA-DRP1中的第70—74位氨基酸含有一段共同序列QK/RRAA(即Gln-Lys/Arg-Arg-Ala-Ala，谷氨酰胺-賴氨酸/精氨酸-精氨酸-丙氨酸-丙氨酸)(1)，該段共同序列與HLA-DR(31抗原結(jié)合槽的形成有關(guān)，是其結(jié)合抗原的功能氨基酸。本發(fā)明人和Wucherfennig等的大量研究證明該序列中帶正電荷的第71位氨基酸(Lys或Arg)是抗原結(jié)合的關(guān)鍵部位P—7)。通過(guò)X線衍射技術(shù)對(duì)HLA-DRP1—抗原二聚體結(jié)晶結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的HLA-DR(31(DR4/DR1)分子相結(jié)合的多種抗原肽在構(gòu)型上均極其相似，其中包括變性II型膠原(Cn)及熱休克蛋白等^叫。從這些肽的立體結(jié)構(gòu)(圖l)可見(jiàn)，Phe263(Pl)、Ghi266(P4)和Gly271(P9)的側(cè)鏈伸向左側(cè)的HLA-DRpi分子，全部或部分嵌入抗原結(jié)合槽內(nèi)。而其它氨基酸的側(cè)鏈則伸向一側(cè)或與HLA-DR(31相反的(T細(xì)胞受體)方向，刺激T細(xì)胞活化。由圖2可見(jiàn)CII多肽的P1、P4、P9側(cè)鏈嵌入HLA-D鄧1結(jié)合抗原的"口袋"中。帶負(fù)電荷的P4(Glu)與HLA-DRpi上帶正電荷的第71位氨基酸(Lys71)相鄰，形成高親和力的極性結(jié)合。因此，Glu266可能是CII多肽結(jié)合DR|31的關(guān)鍵氨基酸。之后的研究進(jìn)一步證明，CII主要靠Gln267、Gly268、Pro269和Lys270與T細(xì)胞受體結(jié)合，導(dǎo)致T細(xì)胞激活。由此可見(jiàn)，CII多肽中主要與HLA-DRpl結(jié)合的氨基酸為Phe263,Gly265，Glu266及Gly271、Glu272,而主要與T細(xì)胞受體結(jié)合的氨基酸為Gln267,Gly268,Pro269,Lys270(表1)。表1.CII中與T細(xì)胞受體(TCR)和HLA-DRp1結(jié)合的氨基酸<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>*F-Phe(苯丙氨酸),K-Lys(賴氨酸),G-Gly(甘氨酸),E-Glu(谷氨酸),(^Gln(谷氨酰胺),P-Pro(脯氨酸),R-Arg(精氨酸)，A:Ala(丙氨酸)基于以上的研究基礎(chǔ)，本發(fā)明人以丙氨酸(A)或者甘氨酸(G)替換CII多肽中與TCR結(jié)合及與HLA-DRpi親和力相關(guān)的特定氨基酸，合成了多條cn變構(gòu)肽。這些cn變構(gòu)肽可特異性結(jié)合HLA-DRP1，并且親和力增高，競(jìng)爭(zhēng)性抑制自身抗原與HLA-DR(31的結(jié)合。從而抑制由HLA-DRP1介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)及由此引起的炎癥介質(zhì)釋放等病理過(guò)程。我們前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CII變構(gòu)肽皮下注射和靜脈注射均可以抑制實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)炎癥，減輕其放射學(xué)及病理學(xué)損傷。但注射給藥在臨床應(yīng)用中不方便也不經(jīng)濟(jì)。經(jīng)鼻腔給藥具有吸收起效快、生物利用度高、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。因此，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，我們優(yōu)選體外抑制作用最強(qiáng)的多肽序列FKGEAGPAAE。應(yīng)用鼻粘膜給藥途徑治療實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，并且得到很好的治療效果，提示CII變構(gòu)肽可以通過(guò)鼻粘膜給藥，從而使T細(xì)胞的激活受到抑制，達(dá)到治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎目的。圖1.CII多肽與HLA-DR(31結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)。CII多肽的Pl、P4和P9的側(cè)鏈嵌入HLA-DRj31的抗原結(jié)合"口袋"中。P4(Glu，帶負(fù)電荷)與HLA-DRJ31上的Lys71(帶正電荷)形成高親和力的極性結(jié)合點(diǎn)(Immunity7:473-81,1997)。圖2.Cn變構(gòu)肽鼻粘膜給藥對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎的抑制作用。CII變構(gòu)肽治療組關(guān)節(jié)炎評(píng)分明顯低于PBS組(*P<0.05)，而CII原型肽治療組關(guān)節(jié)炎評(píng)分與PBS組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。圖3.CII變構(gòu)肽鼻粘膜給藥對(duì)CIA大鼠體重變化的影響。變構(gòu)肽治療組大鼠體重增加幅度要高于PBS治療組和原型肽治療組(P<0.05)。圖4.CII變構(gòu)肽治療對(duì)CIA病理學(xué)損傷的影響。原型肽治療組(b)和PBS治療組(c)可見(jiàn)明顯的關(guān)節(jié)軟骨和骨侵蝕以及關(guān)節(jié)間隙變窄，而變構(gòu)肽治療組(a)僅見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。圖5.CII變構(gòu)肽對(duì)CIA大鼠抗CII抗體IgG及其亞型的影響。變構(gòu)肽可以降低抗CIIIgG2a型抗體滴度(P0.05)，而對(duì)抗CIIIgG和IgGl型抗體滴度無(wú)顯著影響(PX).05)。以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但下列實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。具體實(shí)施方式實(shí)施例l:多肽的設(shè)計(jì)及合成前述的研究工作(4—7)己經(jīng)證明，CII多肽中267-270位氨基酸主要與T細(xì)胞受體結(jié)合，并激活T細(xì)胞。本發(fā)明的試驗(yàn)中首先固相法合成了CII263-272原型肽和應(yīng)用丙氨酸替換相應(yīng)氨基酸的CII變構(gòu)肽(表2)。為提高多肽的吸收率、利用度及增強(qiáng)療效，合成中將每條肽的氨基端與十四烷酸基因相連，以利多肽向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究中所用十肽均含有4個(gè)以上親水殘基，如賴氨酸(K)及谷氨酸(E)，易于溶解和吸收。這些肽不含易降解的甲硫氨酸(M)、色氨酸(W)、或易脫氨、脫羧基的天門冬氨酸(N)等。因此，肽的穩(wěn)定性好，并且易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其干擾T細(xì)胞識(shí)別的作用。表2.非T細(xì)胞結(jié)合肽的設(shè)計(jì)_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>F-苯丙氨酸，K-賴氨酸，。=甘氨酸，E二谷氨酸，(^=谷氨酰胺，八=丙氨酸，P-脯氨酸研究表明，上述CII263-272變構(gòu)肽與HLA-DR(31的結(jié)合能力增強(qiáng)，而對(duì)T細(xì)胞的激活能力顯著低于CII263-272原型肽，并可抑制CII263-272刺激的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。實(shí)施例2:本發(fā)明CII變構(gòu)肽鼻粘膜給藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的抑制作用在導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的免疫反應(yīng)中，抗原呈遞細(xì)胞是通過(guò)抗原誘導(dǎo)T細(xì)胞激活，并促使T細(xì)胞的增殖，弓l起動(dòng)物體內(nèi)的CII抗體和細(xì)胞因子(例如IFN-力水平增高，進(jìn)而導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的特征性病理變化。所以，通過(guò)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞因子的水平可了解非T細(xì)胞結(jié)合肽對(duì)關(guān)節(jié)炎的抑制作用。同時(shí)，通過(guò)病理切片也能從組織學(xué)的角度對(duì)藥物療效作出全面的評(píng)判。在本發(fā)明的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案中，以牛CII誘導(dǎo)Lewis大鼠的膠原性關(guān)節(jié)炎(CIA)，然后用CII變構(gòu)肽對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)變構(gòu)肽可明顯抑制大鼠關(guān)節(jié)炎，使關(guān)節(jié)腫脹程度減輕，(見(jiàn)結(jié)果部分)。(1)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的建立本發(fā)明中的實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎模型采用了國(guó)際公認(rèn)的膠原性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為近交系Lewis大鼠。本實(shí)驗(yàn)用大鼠均在北京大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(SPF級(jí))飼養(yǎng)，大鼠被關(guān)閉在墊有木刨花的聚苯乙烯籠中，保持12小時(shí)白天/黑夜循環(huán)，使之可自由飲水和攝取食物。用于試驗(yàn)的大鼠均為6-8周齡的雌性大鼠，體重120士10g。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的全部程序均按我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l理進(jìn)行。從Sigma公司購(gòu)得牛II型膠原(批號(hào):C1188)，用無(wú)水冰醋酸溶解配成4mg/ml的溶液，再用等體積的完全福氏佐劑(Sigma,美國(guó))乳化，在每只Lewis大鼠的尾根部注射150|al乳化物，注射劑量為300iLil/只。本實(shí)驗(yàn)成功建立了Lewis大鼠的關(guān)節(jié)炎模型。(2)對(duì)關(guān)節(jié)炎的評(píng)估-在用CII誘導(dǎo)后12—14天，70%大鼠出現(xiàn)踝關(guān)節(jié)和趾間關(guān)節(jié)腫脹。用0-16的記分等級(jí)評(píng)估關(guān)節(jié)炎，對(duì)四只腳爪的每只按0-4記分，其中0分=關(guān)節(jié)無(wú)紅腫；1分=關(guān)節(jié)輕度紅腫；2分=關(guān)節(jié)中度紅腫；3分=關(guān)節(jié)重度紅腫；4分=關(guān)節(jié)重度腫脹且不能負(fù)重，或出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形。發(fā)病關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)評(píng)分相加，最高分為16分。(3)CII變構(gòu)肽鼻粘膜給藥對(duì)CIA大鼠的治療-Lewis大鼠在初次免疫后12-14天出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，共有21只大鼠發(fā)病。將發(fā)病的大鼠隨機(jī)分為3組，每組7只。于發(fā)病當(dāng)天開(kāi)始分別給予變構(gòu)肽、原型肽和PBS鼻滴入治療。變構(gòu)肽和原型肽劑量為100jug/次(多肽溶于PBS，濃度為2.5mg/ml),每天1次，連續(xù)給藥5天后改為隔日給藥，共給藥12次。對(duì)照組每次給予鼻滴入PBS40(il。每天觀察大鼠體重的變化，并用前述的關(guān)節(jié)炎評(píng)估方法對(duì)發(fā)生關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)數(shù)目作關(guān)節(jié)炎評(píng)分。初次免疫38天后處死動(dòng)物，留取外周血，ELISA方法檢測(cè)抗CII-IgG抗體及其亞型的變化，用IFN-y和IL-IOELISA試劑盒(Bender公司，奧地利)檢測(cè)其血清中的相應(yīng)細(xì)胞因子的濃度；同時(shí)，取后足關(guān)節(jié)，固定，脫鈣，切片做HE染色。(4)應(yīng)用SPSS軟件包做統(tǒng)計(jì)分析。(5)結(jié)果本發(fā)明CII變構(gòu)肽鼻粘膜給藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的抑制作用用CII對(duì)30只雌性Lewis大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)，結(jié)果21只大鼠于第12天至第14天時(shí)出現(xiàn)不同程度的關(guān)節(jié)腫脹。在出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎的當(dāng)天，將大鼠隨機(jī)的分為3組，分別給予變構(gòu)肽、原型肽和PBS鼻滴入治療，并用前述的關(guān)節(jié)炎評(píng)估方法對(duì)發(fā)生關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)數(shù)目評(píng)分。結(jié)果顯示，治療前各組間關(guān)節(jié)炎評(píng)分無(wú)顯著差異。變構(gòu)肽治療組于治療后的2周內(nèi)大鼠關(guān)節(jié)腫脹逐漸減輕，而原型肽治療組和PBS對(duì)照組的關(guān)節(jié)腫脹逐漸加重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后行后踝關(guān)節(jié)病理學(xué)檢查，結(jié)果顯示，原型肽和PBS治療組大鼠踝關(guān)節(jié)存在明顯的滑膜增生和血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨質(zhì)破壞明顯，嚴(yán)重者關(guān)節(jié)腔消失，出現(xiàn)關(guān)節(jié)強(qiáng)直。而變構(gòu)肽治療組大鼠踝關(guān)節(jié)只見(jiàn)輕度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜增生，關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨質(zhì)破壞不明顯。變構(gòu)肽顯著降低CIA大鼠體內(nèi)抗CII抗體IgG2a亞型的滴度，并降低血清中Y-干擾素(IFN-y)水平。這些結(jié)果證明，CII變構(gòu)肽鼻粘膜給藥治療可減輕CIA大鼠的自身免疫性炎癥，抑制關(guān)節(jié)炎的程度及病程，該多肽鼻粘膜給藥可能對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有治療作用。表3.各組大鼠治療后血清中細(xì)胞因子的變化<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*與對(duì)照組相比，CII變構(gòu)肽可以降低CIA大鼠血清中IFN-Y水平(PO.05)，而對(duì)IL-10水平?jīng)]有明顯影響(P>0.05)。序列表<110>北京大學(xué)人民醫(yī)院<120>II型膠原變構(gòu)肽鼻粘膜給藥治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的應(yīng)用<140><141>2007-11-14<160>2<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>10(氨基酸)<212>肽<213〉人工序列<223>合成<400>1PheLysGlyGluGinGlyProLysGlyGlu<210>2<211〉10(氨基酸)<212>肽<213>人工序列<223>合成<400>2PheLysGlyGluAlaGlyProAlaAlaGlu權(quán)利要求1.以丙氨酸(A)或者甘氨酸(G)替換CII263-272多肽序列中與TCR結(jié)合及與HLA-DRβ1親和力相關(guān)的特定氨基酸而合成的CII變構(gòu)肽。2、權(quán)利要求1的CII變構(gòu)肽在制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的鼻粘膜給藥劑型中的應(yīng)用。3、權(quán)利要求1的CII變構(gòu)肽鼻粘膜給藥在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供II型膠原變構(gòu)肽治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的鼻粘膜給藥方式。這種II型膠原變構(gòu)肽鼻粘膜給藥可特異性抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的異常免疫反應(yīng)，針對(duì)發(fā)病的起始環(huán)節(jié)，從根本上控制本病的發(fā)展。文檔編號(hào)A61K38/16GK101244257SQ20071017983公開(kāi)日2008年8月20日申請(qǐng)日期2007年12月19日優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日發(fā)明者栗占國(guó)申請(qǐng)人:北京大學(xué)人民醫(yī)院