專(zhuān)利名稱(chēng)：：扎考比利作為制備治療心律失常藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，主要涉及治療心律失常的藥物，具體為扎考比利作為制備治療心律失常藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：心律失常是指心跳頻率和節(jié)律的異常，心律失常是臨床上常見(jiàn)的心血管疾病，嚴(yán)重心律失常往往是患者的主要死因之一。心肌缺血、缺氧、酸中毒/堿中毒、電解質(zhì)紊亂、藥物中毒、心肌損傷等均可誘發(fā)心律失.常。心律失常發(fā)生的基本機(jī)制有折返、自律性異常和觸發(fā)性活動(dòng)。亦即所有心律失常均是由于沖動(dòng)傳導(dǎo)障礙及沖動(dòng)形成障礙或二者兼有所引起的。形成嚴(yán)重心律失常的機(jī)制很復(fù)雜，往往不是單一的機(jī)制，但是究其根本，都有離子通道功能活動(dòng)的改變，由此引起離子流的變化會(huì)影響動(dòng)作電位的發(fā)生和形態(tài)，從而具有致心律失?；蛑涡穆墒С５淖饔?。目前所用抗心律失常藥的作用機(jī)制1.降低自律性>增加最大舒張電位(4相)，促進(jìn)4相K+外流。>減慢4相除極速度，抑制Na+、Ca^內(nèi)流。2.消除后除極，觸發(fā)活動(dòng)>早后除極鈣拮抗藥。>遲后除極鈣拮抗藥，阻斷Na+、(^2+交換電流。3.改變膜反應(yīng)性，改變傳導(dǎo)，消除折返>增強(qiáng)膜反應(yīng)性，增加膜電位，膜電位絕對(duì)值越大，反應(yīng)性越高，則可改變傳導(dǎo)，消除單向阻滯(苯妥英鈉)。>降低膜反應(yīng)性，減慢傳導(dǎo)，導(dǎo)致單向阻滯區(qū)變?yōu)殡p向的完全阻滯，消除折返環(huán)路。4.改變動(dòng)作電位時(shí)程和有效不應(yīng)期，消除折返>絕對(duì)延長(zhǎng)有效不應(yīng)期延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程，延長(zhǎng)有效不應(yīng)期，消除折返。>相對(duì)延長(zhǎng)有效不應(yīng)期動(dòng)作電位時(shí)程的縮短大于有效不應(yīng)期的縮短，消除折返。>使相鄰細(xì)胞不均一的有效不應(yīng)期趨向均一化。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直致力于抗心律失常藥物的研究。目前臨床應(yīng)用的抗心律失常藥物主要的作用靶點(diǎn)是電壓門(mén)控鈉通道(INa)、延遲整流鉀通道(IK)和L型鈣通道(ICai)，根據(jù)藥物對(duì)離子通道和受體的作用，將治療快速型心律失常藥物分成四類(lèi)I類(lèi)鈉通道阻滯藥>Ia:中等強(qiáng)度(適度阻滯鈉通道)，如奎尼丁、普魯卡因胺>Ib:輕度阻滯鈉通道，如利多卡因、苯妥英鈉、美西律、妥卡尼>Ie:重度阻滯鈉通道，如普羅帕酮、氟卡尼此類(lèi)藥物可使阻斷鈉通道，改變單向組織區(qū)的傳導(dǎo)，消除折返。II類(lèi)p受體阻斷藥，如普萘洛爾，此類(lèi)藥物可使4相去極化電流減小，自律性降低。III類(lèi)延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程藥(鉀通道阻滯藥)，如胺碘酮，抑制Ik，使復(fù)極化3相鉀離子外流減少，延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程和有效不應(yīng)期延長(zhǎng)，消除折返。W類(lèi)鈣通道阻滯藥，如維拉帕米，阻斷鈣通道，使動(dòng)作電位4相鈣離子內(nèi)流減少，慢反應(yīng)細(xì)胞自律性降低，可用來(lái)治療室上性心律失常?！陨纤念?lèi)主要治療快速型心律失?！獙?duì)緩慢型心律失常，可用阿托品、異丙腎上腺素來(lái)治療——其他藥物如去氧腎上腺素、新斯的明可治療室上性心動(dòng)過(guò)速目前無(wú)論哪種抗心律失常藥物均有一定的致心律失常作用。I類(lèi)藥物可因阻斷鈉通道減慢傳導(dǎo)而誘發(fā)折返；III類(lèi)藥物因延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程而誘發(fā)長(zhǎng)QT綜合癥。這引起了人們的重視，尋找新的更安全的治療方法迫在眉睫。九十年代中期以后，心導(dǎo)管介入技術(shù)治療各類(lèi)心律失常取得了很大進(jìn)展，開(kāi)辟了心律失常治療的新方向。但介入治療有一定的適應(yīng)癥范圍，故對(duì)于多數(shù)心律失?；颊叨?，藥物治療仍是治療的主要方法或必需的組成部分，其中利多卡因是公認(rèn)的治療室性心律失常的藥物。以往研究心律失常藥物時(shí)，內(nèi)向整流鉀通道(lKi通道)是一個(gè)不被重視的耙點(diǎn)。因?yàn)槠袼锌剐穆墒СＫ幬锒际峭ǖ雷钄鄤鴏K,是心肌最主要的背景外向電流，阻斷I^通道雖可延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程，但同時(shí)由于背景外向電流的減小而導(dǎo)致靜息電位減小或自律細(xì)胞的最人舒張期電位減小，從而降低了心肌傳導(dǎo)性，提高了自律性，產(chǎn)生致心律失常的效應(yīng)。因此至今還沒(méi)有一種特異性阻斷IK1的抗心律失常藥物問(wèn)世。1993年Kubo克隆成功IK1通道以來(lái)，對(duì)IK1的結(jié)構(gòu)、功能和電生理特性得到了較深入的研究。研究表明，Andersen-Tawil綜合癥的主要病因是KCNJ基因(心室肌Ik,通道的主要基因)突變，導(dǎo)致Kir2.1通道功能減弱或喪失；計(jì)算機(jī)模擬的研究顯示，降低Kir2.1通道的電導(dǎo)，可致動(dòng)作電位復(fù)極終末延遲，靜息電位減小(去極化)，出現(xiàn)自發(fā)的室性心律失常；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，心肌缺血時(shí)膜電位的減小和心律失常的發(fā)生，內(nèi)皮素、血管緊張素II的致心律失常作用，心衰時(shí)胞內(nèi)C^+濃度升高所致的心律失常等均與Tja電流的抑制有關(guān)。因此可以設(shè)想，激動(dòng)I^通道將具有抗心律失常的效應(yīng)。但是至今國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)有選擇性lKi通道激動(dòng)劑的報(bào)道，更未見(jiàn)通過(guò)特異性激動(dòng)Iiu通道在人或動(dòng)物發(fā)揮抗心律失常效應(yīng)的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明為了解決現(xiàn)有抗心律失常藥物均有一定的致心律失常作用，以及目前為止國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)lK,選擇性激動(dòng)劑的問(wèn)題，提供扎考比利(Zacopride)的新用途，即在制藥中的新應(yīng)用——扎考比利作為制備治療心律失常藥物的應(yīng)用。實(shí)際上，本發(fā)明涉及扎考比利作為制備治療心律失常藥物的應(yīng)用。所述的扎考比利制劑為膠囊、微囊、脂質(zhì)體、顆粒體、注射液、片劑和口服液。扎考比利(Zacopride)，胃動(dòng)力促進(jìn)劑，為呱啶苯酰胺衍生物，屬5-HT3受體阻斷藥和5-HT4受體激動(dòng)劑，目前用于促進(jìn)胃動(dòng)力和腸運(yùn)轉(zhuǎn)，也作為促進(jìn)腦代謝循環(huán)藥治療老年癡呆癥。扎考比利的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為在一項(xiàng)促腸道動(dòng)力藥致心律失常作用的篩查試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)扎考比利(Zacopride)無(wú)致心律失常副作用，且可增強(qiáng)I]U通道電流，但對(duì)Ica-L、INa、Ito、IK、iNa/Ca等主要的心肌離子電流均無(wú)顯著影響。這項(xiàng)結(jié)果提示扎考比利(Zacopride)可作為IK1選擇性激動(dòng)劑，成為一種新的抗心律失常藥物。本發(fā)明采用SD大鼠和豚鼠(只用于觀測(cè)lK通道)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定扎考比利(Zacopride)對(duì)心室肌細(xì)胞離子通道電流的影響及測(cè)定扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠缺血性以及再灌注性心律失常作用的影響，證實(shí)了上述的啟示。具體證實(shí)內(nèi)容如下A.l~30pmol/L范圍內(nèi)，扎考比利(Zacopride)呈濃度依賴(lài)性增強(qiáng)IK1，10nmol/L扎考比利(Zacopride)使IK1電流密度增加29.45%(P<0.01)。130nmol/L范圍內(nèi)扎考比利(Zacopride)對(duì)ICa-L、INa、It。、IK、iNa/ca無(wú)明顯影響，顯示扎考比利(Zacopride)對(duì)通道激動(dòng)作用的特異性。扎考比利(Zacopride)對(duì)靜息膜電位、動(dòng)作電位幅度(ActionpotentialAmplitude,APA)、動(dòng)作電位復(fù)極50%時(shí)程(Actionpotentialdurationat50%repolarization,APD5o)以及動(dòng)作電位復(fù)極900/o時(shí)程(Actionpotentialdurationat卯％repolarization,APD9o)的影響。在3~40|nmol/L范圍內(nèi)，扎考比利(Zacopride)可濃度依賴(lài)性增大靜息電位，增加動(dòng)作電位幅度，縮短動(dòng)作電位復(fù)極50°/。時(shí)程(APD5o)以及動(dòng)作電位復(fù)極90°/。時(shí)程(APD90)。B.扎考比利(Zacopride)對(duì)缺血及再灌注引起的期前收縮數(shù)目、室速持續(xù)時(shí)間、室顫持續(xù)時(shí)間、室顫發(fā)生率均具有顯著抑制作用，呈劑量依賴(lài)性，50mnol/kg為扎考比利(Zacopride)最適給藥濃度；抑制心律失常的效應(yīng)與公認(rèn)的抗心律失常藥利多卡因(lidocaine)相似。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1.扎考比利(Zacopride)是目前首次發(fā)現(xiàn)的選擇性心肌Ija通道激動(dòng)劑，并用于抗心律失常的藥物的研究。2.扎考比利(Zacopride)作為治療缺血再灌注性心律失常的藥物，其效果與利多卡因相似，作用穩(wěn)定，對(duì)心律無(wú)明顯影響，安全范圍大。在缺血再灌注誘發(fā)心律失常的實(shí)驗(yàn)中，利多卡因可使心律減慢，扎考比利(Zacopride)則無(wú)明顯影響；利多卡因在劑量增加1/3時(shí)其抗心律失常作用明顯減弱，扎考比利(Zacopride)則在100倍有效濃度時(shí)才出現(xiàn)此現(xiàn)象。圖1.扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞Iiu電流的影響.圖1中a:正常對(duì)照b:扎考比利3pmol/Lc:扎考比利lOpmol/Ld:扎考比利30pmol/L圖2.大鼠心室肌細(xì)胞IK1電流的I-V曲線及扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞膜IK1電流的作用圖3.扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞ICa-L電流的影響圖3中a:對(duì)照；b:扎考比利3pmol/Lc:扎考比利lOpmolb:扎考比利30pmol/L;圖4.大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣通道的I_V曲線及扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞ICa-L電流的影響圖5.扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa電流的影響。圖5中a:正常對(duì)照b:扎考比利30nmol/L圖6.大鼠心室肌細(xì)胞lNa電流的I-V曲線及扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞鈉電流的影響圖7.扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞It。電流的影響.圖7中a:正常對(duì)照b:扎考比利3(Hunol/L圖8.大鼠心室肌細(xì)胞It。電流的I-V曲線及扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞膜It。電流的影響圖9.扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa/Ca電流的影響圖9中a:正常對(duì)照b:扎考比利30nmol/Lc:5mmoI/LNiCl2圖10.扎考比利(Zacopride)對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞IK電流的影響圖IO中a:正常對(duì)照b:扎考比利lOpmol/L圖11.豚鼠心室肌細(xì)胞IK電流的I-V曲線及扎考比利(Zacopride)対豚鼠心室肌細(xì)胞膜Ik電流的影響圖12.扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響.圖12中a:正常對(duì)照b:扎考比利3pmol/Lc:扎考比利10pmol/Ld:扎考比利30pmol/Le:扎考比利40nmol/L圖13.不同濃度扎考比利(Zacopride)在15分鐘缺血期內(nèi)的期前收縮數(shù)圖14.不同濃度扎考比利(Zacopride)組在15分鐘缺血期內(nèi)室速、室顫持續(xù)時(shí)間的比較.圖15.大鼠正常及缺血性心律失常時(shí)的心電圖.圖15中A缺血性心律失常心電圖(未給藥)B缺血前2分鐘股靜脈注射扎考比利50nmol/kg，可有效預(yù)防缺血性心律失常C缺血前5分鐘股靜脈注射利多卡因7.5mg/kg，可有效預(yù)防缺血性心律失常D缺血前5分鐘股靜脈注射利多卡因10mg/kg，可促進(jìn)心律失常的發(fā)生。a:缺血前心電圖b:冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎后l分鐘C:室性期前收縮d:室速e:室顫f:缺血前股靜脈注射利多卡因10mg/kg可明顯減慢心率g:利多卡因10mg/kg抗心律失常作用明顯減弱，出現(xiàn)室顫及期前收縮。圖16.不同濃度扎考比利(Zacopride)在15分鐘再灌注期內(nèi)室速、室顫持續(xù)時(shí)間的比較具體實(shí)施例方式下面用扎考比利(Zacopride)進(jìn)行關(guān)于對(duì)IK1通道的激動(dòng)作用的實(shí)驗(yàn)研究及對(duì)抗心律失常作用的探討，說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域的新用途。實(shí)施例l:扎考比利(Zacopride對(duì)心室肌細(xì)胞離子通道電流的影響1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SD大鼠，雄性，體重220—260g，購(gòu)自河南鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2藥品與試劑Zac叩ridehydrochloride購(gòu)自TOCRIS。膠原酶P購(gòu)自德國(guó)BochringerMannhein公司，?；撬?taurine)、四乙胺(tetraethylammoniumchloride,TEA)、4-氨基吡啶(4-aminopyridine,4-AP)、尼卡地平(nicardipine)、三磷酸腺苷二鈉鹽(adenosine5'-triphosphatedisodiumsalt)、三磷酸腺苷二鉀鹽(adenosine5'-triphosphatedipotassiumsalt)、三磷酸腺苷鎂鹽(adenosine5'-triphosphatemagnesiumsalt)、DL-天門(mén)冬氨酸鉀鹽(DL-asparticacidpotassium)、L-谷氮酸(L-glutamicacid)、EthyleneGlycol-bis(beta-aminoethyl-ether)-N,N,N，,N，-TetraAcetate(EGTA)、肌酸磷酸鈉鹽(creatininephosphatesodiumsalt)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；HEPES(N-2-hudroxyethylpiperazine-N'-2-ethane-sulfonicacide)購(gòu)自美國(guó)sigma公司，其余均為國(guó)內(nèi)生產(chǎn)分析純產(chǎn)品。1.3主要儀器Axopatch200B膜片鉗放大器(AxonInstrument,USA)、Digidate1322A模數(shù)轉(zhuǎn)換器(AxonInstrument,USA)及Pclamp8.0(AxonInstrumen，USA)、微電極拉制儀(Narishige，PP—83，CO.Japan)1.4試劑配制1.4.1溶液配制1.臺(tái)氏液(mmol/L):NaCl140，KC15.4,NaH2P040.33，HEPES5.0，glucose10，MgCl21.0，CaCl21.8，用NaOH調(diào)節(jié)PH至7.38。2.酶液(mmol/L):NaCl125,KC15.4,CaCl275,MgCl21.0,NaH2P040.33,4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazine-ethanesulfonicacid(HEPES)10,glucose10，taurine20，CollagenaseP(BoehringeMannheim,Germary)膠原酶P0.1-0.3mg/ml(3.5—5mg)。3.KB液(mmol/L):KOH85，L隱谷氨酸50，KC130，taurine20，KH2PO430，MgCl21.0，HEPES10，葡萄糖10，EGTA0.5，用KOH調(diào)節(jié)PH至7.4。4.扎考比利(Zacopride)原液用去離子水溶解zacopride濃度為lmmol/L。使用時(shí)按需要稀釋。1.4.2電極內(nèi)液的配制1.L-型鈣電流(Ica-0的電極內(nèi)液成份(mmol/L):KC1150，HEPES5，EGTA5.0,ATP-K23.0，MgCl21.0，4-AP5.0,ATP-Mgl.O，用KOH調(diào)節(jié)PH至7.3。細(xì)胞外灌流液為臺(tái)氏液。2.瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)的電極內(nèi)液成份(mmol/L):KC1150，HEPES5.0，EGTA5.0,ATP-K23.0，MgCl21.0，用KOH調(diào)節(jié)PH至7.3。細(xì)胞外灌流液為臺(tái)氏液中加入CdCl20.1mmol/L，BaCl20.2mml/L，分別阻斷Ic"及內(nèi)向整流鉀通道。3.內(nèi)向整流鉀電流(IK1)電極內(nèi)液成分與Ica-L相同。細(xì)胞外液在臺(tái)氏液中加入CdCl20.5mmol/L阻斷Ica—L電流。4.鈉電流(lNa)的電極內(nèi)液(mmol/L):NaCl5.0,CsCl20,KC1110,MgCl21.0,HEPES5.0，EGTA5.0，Mg—ATP5.0,用CsOH調(diào)節(jié)PH至7.2。細(xì)胞外灌流液成份(mmol/L):NaCl50,CsCl90,MgCl21,glucose10,CaCl20.5,CoCl20.5,HEPES5.0,用CsOH調(diào)節(jié)PH至7.45.鈉鈣交換電流(lNa/ca)的電極內(nèi)液成份(mmol/L):天門(mén)冬氨酸鉀42，MgCl213，EGTA42,CaCl229，ATP-K210，磷酸肌酸鈉鹽5.0，HEPES5.0，4-AP20，用CsOH調(diào)節(jié)PH至7.3。細(xì)胞外液成份(mmol/L):NaCl140，CaCl21.8，MgCl22.0，HEPES5.0，葡萄糖10，用CsOH調(diào)節(jié)PH至7.4，加入尼卡地平lpmol/L，哇巴因20pmol/L，BaCl21.0mmol/L，CsCl2mmol/L,分別阻斷L型鈣通道、鈉鉀泵和鉀通道。2實(shí)驗(yàn)方法2.1單個(gè)心室肌細(xì)胞的分離方法-選用健康成年SD大鼠220-260g，雄性，術(shù)前15分鐘腹腔靜脈注射肝素(1000U/kg)，戊巴比妥鈉(65mg/kg,ip)麻醉后頸動(dòng)脈放血，迅速開(kāi)胸取出心臟，置于4。C用100%氧氣飽和的無(wú)鈣臺(tái)氏液中修剪，然后將心臟懸掛在Langendorff灌流裝置上經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流。先用無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流8~10分鐘，再用酶液循環(huán)灌流1520分鐘。灌流過(guò)程中保持37°C恒溫，灌流壓70cmH2O，，并持續(xù)通以100%氧氣。待心室肌組織變大、變軟后將其剪碎，置于KB液中輕輕吹打得到分散的心室肌細(xì)胞，經(jīng)150jim孔徑的濾網(wǎng)過(guò)濾后保存于KB液中，室溫放置56小時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.2全細(xì)胞膜片鉗記錄方法實(shí)驗(yàn)前先將存放于高鉀KB液中的細(xì)胞逐步復(fù)鈣。然后取幾滴細(xì)胞懸液加入細(xì)胞池(約lml)，平放在連有微操縱儀的倒置顯微鏡上靜置10min，待細(xì)胞充分貼壁后，用臺(tái)氏液灌流，速度約12ml/min。電極用玻璃毛細(xì)管經(jīng)微電極拉制儀(Narishige，PP—83，CO.Japan)分兩步拉制而成，充灌電極內(nèi)液后，電阻約25MQ。選取橫紋清晰的心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。形成高阻抗封接后，用負(fù)壓破膜，進(jìn)行全細(xì)胞記錄。離子電流信號(hào)經(jīng)Axopatch200B膜片鉗放大器(AxonInstrument,USA)、Digidate1322A模數(shù)轉(zhuǎn)換器(AxonInstrument,USA)及Pclamp8.0(AxonInstrumen，USA)采集、忙存及分析，并保存在電腦硬盤(pán)中，所有實(shí)驗(yàn)均在室溫25°C下進(jìn)行。應(yīng)用電流密度(即單位膜電容的膜電流)表示膜電流的大小。電壓鉗方式下進(jìn)行全細(xì)胞離子流記錄，電流鉗方式下記錄單細(xì)胞動(dòng)作電位。2.3觀測(cè)指標(biāo)觀察扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞L-型Ca^電流(Ica丄)、INa、瞬時(shí)外向鉀電流(It。)以及內(nèi)向整流鉀電流(IK1)和心室肌細(xì)胞lNa/ca的影響；觀察扎考比利(Zacopride)對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞lK電流的影響；觀察扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞跨膜電位、動(dòng)作電位幅度(ActionpotentialAmplitude,APA)動(dòng)作電位復(fù)極50%時(shí)程(Actionpotentialdurationat50%repolarization,APD50)以及動(dòng)作電位復(fù)極90%時(shí)程(Actionpotentialdurationat90%repolarization，APD90)的影響。2.4數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(Mean士SD)表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為具有顯著性差異。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀電流(IK1)的影響維持電位-40mv，給予超極化至-100mv，持續(xù)470ms的階躍式脈沖激活I(lǐng)kl，在細(xì)胞外液中加入CdCl20.5mmol/L以阻斷1^—^電流。扎考比利(Zacopride)呈濃度依賴(lài)性增強(qiáng)IK1，10pmol/L扎考比利(Zacopride)可使IK1電流密度增加29.45%(P<0.01)。30pmol/L扎考比利(Zac叩ride)可使IK1電流密度增加38.53%(P<0.01)。見(jiàn)表1、圖1(圖1中a:正常對(duì)照b:扎考比利3nmol/Lc:扎考比利10pmol/Ld:扎考比利30pmol/L)，圖2。表l.扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞IK1電流的影晌.<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>與對(duì)照組相比*<0.05**P<0.013.2扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞各離子通道的影響3.2.1扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞L-型Ca^電流(Ica.O的影響測(cè)定L-型鈣離子通道電流(L-typecalciumcurrent,Ica-O時(shí)，維持電位-40mv，去極化到+10mv，持續(xù)500ms的階躍脈沖激活I(lǐng)ca-L口為確認(rèn)記錄到的電流為Ica丄,在細(xì)胞外液中加入5|amol/L尼卡地平，可完全阻斷該電流，從而支持所記錄的電流為Ic^口破膜后平衡5分鐘，待Ic"穩(wěn)定后加入藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn).。1-30pmol/L范圍內(nèi)扎考比利(Zacopride)對(duì)Ica丄無(wú)明顯作用，用藥前后電流密度相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，PX).05。見(jiàn)表2，圖3(a:正常對(duì)照b:扎考比利3nmol/Lc:扎考比利10nmol/Ld:扎考比利30nmol/L)，圖4。表2.扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞ICa-L電流的影響.pmol/L細(xì)胞例數(shù)電流密度(PA/PF)變化率(％)0511.13±1.131.0511.16±1.24+0.263.0510.91±1.55-1.9810,0511.87±1.36+1.0730.0512.06±1.41+8.353.2.2扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa的影響測(cè)鈉電流時(shí)，維持電壓-80mV，去極化至0mV，持續(xù)50ms的階躍脈沖激活I(lǐng)Na。1-30nmol/L扎考比利(Zacopride)對(duì)I他無(wú)顯著影響。用藥前后電流密度相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P〉0.05。見(jiàn)表3、圖5(圖5中a:正常對(duì)照b:扎考比利30nmol/L)，圖6。表3.扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa電流的影響Hmol/L細(xì)胞例數(shù)電流密度(PA/PF)變化率(％)0.0638.16±1.461.0636.78±1.33-3.623.0639.21±1.18+2.7510.0637.64士1.39-1.3630.0637.92±1.34-0.633.2.3扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀電流(It。)的影響測(cè)定It。時(shí)，維持電壓-40mV，去極化至+50mV，持續(xù)60ms的階躍脈沖激活I(lǐng)t。，在細(xì)胞外液中加入CdCl20.5mmol/L，BaCl20.5mmol/L，分別阻斷Ica-L及內(nèi)向整流鉀通道電流(Ikl)。扎考比利(Zacopride)1-30pmol/L對(duì)It。無(wú)明顯影響。用藥前后電流密度相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05。見(jiàn)表4、圖7(圖7中a:正常對(duì)照b:扎考比利30nmol/L)，圖8。表4.扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞It。電流的影晌.pmol/L細(xì)胞例數(shù)電流密度(PA/PF)變化率(％)0.0624.39±1.231.0623.72±1.34-1.333.0624.41±1.25+0.3110.0623.64±1.12-3.0830.0623.21±1.16-4.843.2.4扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa/Ca的影響iNa/ca測(cè)定，運(yùn)用鋸齒電壓程序記錄電流一電壓關(guān)系，維持電壓為-40mV，斜坡電壓由+60mV降為-120mV，下降速度90mV/s，記錄到電流一電壓關(guān)系，5mmol/L的NiCl2使正向和反向INa/Ca均減小。利用NiCb阻斷前后的電流差，得到Ni2+敏感電流即lNa/Ca。扎考比利(Zacopride)對(duì)iNa/ca無(wú)明顯影響，用藥前后相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05。見(jiàn)表5、圖9(圖9中a:正常對(duì)照b:扎考比利30|imol/Lc:5mmol/LNiCl2)。表5.扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞INa/Ca電流的影響.電流密度(PA/PF)Hmol/L細(xì)胞例數(shù)-+70mv-70mv0,060息0.060.48±0.051.060.88±0.070.47±0.063.060.91±0.110.49±0.0310.060.88±0.090.48±0.0430.060.91±0.030.47±0.033.3扎考比利(Zacopride)對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞IK的影響由于大鼠心室肌細(xì)胞k通道分布密度低，所以另外采用豚鼠觀察扎考比利(Zacopride)對(duì)心室肌細(xì)胞k的影響，豚鼠心室肌細(xì)胞分離方法、電流記錄方法與大鼠實(shí)驗(yàn)相似。結(jié)果顯示，扎考比利(Zacopride)對(duì)ik無(wú)明顯影響。用藥前后Ik密度相比P〉0.05。見(jiàn)表6，圖10(圖10中a:正常對(duì)照b:扎考比利10^imol/L)，圖11。表6.扎考比利(Zacopride)對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞IK電流的影響.__Hmol/L細(xì)胞例數(shù)電流密度(PA/PF)變化率(％)0.0613.20±1.891.0612.78±2.32-3.193.0612.84±2.16-3.7210.0612.67±1.99-4.0230.0613.01±2.05-1.443.4扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞跨膜電位的影響采用全細(xì)胞膜片鉗記錄，以電流鉗制模式記錄靜息電位(Restingpotential,RP)和動(dòng)作電位(Actionpotential,AP)，AP由3ms，0.5Hz，700pA-1000pA的內(nèi)向電流激發(fā)口分別觀察扎考比利(Zacopride)對(duì)跨膜電位口動(dòng)作電位幅度(ActionpotentialAmplitude,APA)動(dòng)作電位復(fù)極50%時(shí)程(Actionpotentialdurationat50%repolarization,APDso)以及動(dòng)作電位復(fù)極90%時(shí)程(Actionpotentialdurationat90%repolarization,APD9。)的影響□扎考比利(Zacopride)對(duì)靜息電位、動(dòng)作電位幅度和動(dòng)作電位時(shí)程的影響見(jiàn)表7，圖12(圖12中a:正常對(duì)照b:扎考比利3pmol/Lc:扎考比利lO^mol/Ld:扎考比利3(Himol/Le:扎考比利40pmol/L)。在34(Himol/L范圍內(nèi)扎考比利(Zacopride)可濃度依賴(lài)性增強(qiáng)靜息電位,增大動(dòng)作電位幅度，并縮短動(dòng)作電位復(fù)極50n/。時(shí)程(APD5(3)以及動(dòng)作電位復(fù)極90n/。時(shí)程(APD90)。表7扎考比利(Zacopride)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞靜息電位、動(dòng)作電位幅度和動(dòng)作電位時(shí)程的影響<table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例2:扎考比利(Zacopride)抗大鼠缺血性、再灌注性心律失常作用的研究1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SD大鼠，雄性，體重220—260g,購(gòu)自河南鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2藥品與試劑Zacopridehydrochloride購(gòu)自TOCRIS。鹽酸Lidocaine注射液購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限公司。1.3主要儀器Rm6240多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)；HX-200動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)1.4試劑配制1.4.1溶液配制1.扎考比利(Zacopride)原液用去離子水溶解zacopride濃度為lmmol/L。使用時(shí)按需要稀釋。.2.利多卡因原液(0.1g/5ml):使用時(shí)按7.5mg/kg取用2實(shí)驗(yàn)方法2.1缺血性心律失常模型制備方法2丄1實(shí)驗(yàn)分組健康SD大鼠48只，隨機(jī)分為6組，即生理鹽水對(duì)照組、扎考比利(Zac叩ride)5nmol/kg組、15nmol/kg組、50nmol/kg組和利多卡因(7.5mg/kg)陽(yáng)性對(duì)照組。2丄2實(shí)驗(yàn)方法將大鼠用戊巴比妥鈉(65mg/kg，ip)麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，然后頸部正中切口，氣管插管，接人工呼吸機(jī)(DH—1型)；頸總動(dòng)脈插管后，Rm6240多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)連續(xù)記錄n導(dǎo)聯(lián)心電圖和血壓。于胸骨左側(cè)鎖中線第4、5肋間切口開(kāi)胸，在冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)發(fā)出后的2mm處，用6-0醫(yī)用無(wú)損傷縫合針于左心耳下緣進(jìn)針，肺動(dòng)脈圓錐處出針，將線穿入一短PE50管。穩(wěn)定5min后，股靜脈給藥。2min后拉緊絲線，以塑料管末端壓迫冠狀動(dòng)脈造成心肌缺血，持續(xù)15min，在此期間連續(xù)記錄心電圖(ECG)動(dòng)脈血壓(BP)。由于利多卡因有減慢心率的作用，所以在缺血前5分鐘給藥，其余方法同上。2丄3實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)缺血后心律失常最早出現(xiàn)的時(shí)間(潛伏期)；心律失常類(lèi)型；PVB:連續(xù)出現(xiàn)5個(gè)以下的室性異位搏動(dòng)；VT:連續(xù)出現(xiàn)5個(gè)以上的室性早搏；VF:室顫，為QRS波及T波消失，代之一系列大小、形狀不同的不規(guī)則波動(dòng)。記錄缺血15min內(nèi)的PVB數(shù)目，VT、VF持續(xù)時(shí)間(為每次出現(xiàn)VT、VF持續(xù)時(shí)間的累加)。2.2再灌注性心律失常模型制備方法2丄1實(shí)驗(yàn)分組健康SD大鼠48只，隨機(jī)分為6組，即生理鹽水對(duì)照組、扎考比利(Zac叩ride)1.5nmol/kg組、5nmol/kg組、15nmol/kg組和利多卡因(7.5mg/kg)陽(yáng)性對(duì)照組。2.2.2實(shí)驗(yàn)方法將大鼠用戊巴比妥鈉(65mg/kg，ip)麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，然后頸部正中切口，氣管插管，接人工呼吸機(jī)(DH—1型)；頸總動(dòng)脈插管后，Rm6240多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)連續(xù)記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖和血壓。于胸骨左側(cè)鎖中線第4、5肋間切口開(kāi)胸，在冠狀動(dòng)脈左前降支，(LAD)發(fā)出后的2mm處，用6-0醫(yī)用無(wú)損傷縫合針于左心耳下緣進(jìn)針，肺動(dòng)脈圓錐處出針，將線穿入一短PE50管。穩(wěn)定5min后，股靜脈給藥。2min后拉緊絲線，以塑料管末端壓迫冠狀動(dòng)脈造成心肌缺血，持續(xù)15分鐘后松開(kāi)絲線，再灌注15分鐘，在此期間連續(xù)記錄心電圖(ECG)和動(dòng)脈血壓(BP)。于再灌注前2分鐘由股靜脈分別給予生理鹽水，扎考比利(Zacopride)各劑量。由于利多卡因有減慢心率的作用，所以在再灌注前5分鐘給藥，其余方法同上。2.2.3觀測(cè)指標(biāo)再灌注后心律失常類(lèi)型PVB:連續(xù)出現(xiàn)5個(gè)以下的室性異位搏動(dòng)；VT:連續(xù)出現(xiàn)5個(gè)以上的室性早搏；VF:室顫，為QRS波及T波消失，代之一系列大小、形狀不同的不規(guī)則波動(dòng)。記錄再灌注15min內(nèi)的PVB數(shù)目，VT、VF持續(xù)時(shí)間(為每次出現(xiàn)VT、VF持續(xù)時(shí)間的累加)。2.4數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(Mean士SD)表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，PO.05為具有顯著性差異。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1缺血性心律失常生理鹽水對(duì)照組8只動(dòng)物，缺血后均出現(xiàn)期前收縮、室速，有6只發(fā)生室顫。扎考比利(Zacopride)對(duì)缺血及再灌注引起的期前收縮數(shù)目、室速持續(xù)時(shí)間、室顫持續(xù)時(shí)間、室顫發(fā)生率均具有顯著抑制作用，呈劑量依賴(lài)性。本研究顯示利多卡因7.5mg/kg為最適給藥濃度，當(dāng)劑量加大(10tng/kg)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其可明顯減慢心律，抗心律失常作用明顯減弱。結(jié)果表明，50nmol/kg扎考比利與7.5mg/kg利多卡因相比，其抗心律失常作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見(jiàn)表8，圖13、圖14、圖15(圖15中A缺血性心律失常心電圖(未給藥)B缺血前2分鐘股靜脈注射扎考比利50nmol/kg,可有效預(yù)防缺血性心律失常C缺血前5分鐘股靜脈注射利多卡因7.5mg/kg，可有效預(yù)防缺血性心律失常D缺血前5分鐘股靜脈注射利多卡因10mg/kg，可促進(jìn)心律失常的發(fā)生。a:缺血前心電圖b:冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎后l分鐘C:室性期前收縮d:室速e:室顫f:缺血前股靜脈注射利多卡因10mg^g可明顯減慢心率)g:利多卡因10mg/kg抗心律失常作用明顯減弱，出現(xiàn)室顫及期前收縮。)表8.扎考比利(zac叩ride)對(duì)麻醉大鼠缺血性心律失常的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*與對(duì)照組相比P<0.01，A與利多卡因組相比PX).053.2再灌注性心律失常生理鹽水對(duì)照組8只動(dòng)物，缺血再灌注后均出現(xiàn)期前收縮、室速，有7只發(fā)生室顫。扎考比利對(duì)缺血再灌注后出現(xiàn)的期前收縮數(shù)目、室速持續(xù)時(shí)間、室顫持續(xù)時(shí)間及室顫發(fā)生率都有劑量依賴(lài)性抑制作用。5nmol/kg組為扎考比利最適給藥劑量，5nmol/kg扎考比利與7.5mg/kg利多卡因相比，其抑制再灌注性心律失常作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見(jiàn)表9、圖16。表9.扎考比利(zacopride)對(duì)麻醉大鼠再灌注性心律失常的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*與對(duì)照組相比P<0.05，A與利多卡因組相比PX).05本實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照組利多卡因給藥量為7.5mg/kg，當(dāng)劑量加大(10mg/kg)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其可明顯減慢心律，抗心律失常作用明顯減弱，用藥安全范圍小。結(jié)果見(jiàn)圖15(D:f、g)。權(quán)利要求1、扎考比利作為制備治療心律失常藥物的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的扎考比利作為制備治療心律失常藥物的應(yīng)用，其特征是所述的扎考比利制劑為膠囊、微囊、脂質(zhì)體、顆粒體、注射液、片劑和口服液。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及治療心律失常的藥物，具體為扎考比利作為制備治療心律失常藥物的應(yīng)用。解決現(xiàn)有抗心律失常藥物均有一定的致心律失常作用，以及目前為止國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)I_K1選擇性激動(dòng)劑的問(wèn)題。扎考比利(Zacopride)是目前首次發(fā)現(xiàn)的選擇性的I_K1激動(dòng)劑，并用于抗心律失常的藥物。扎考比利(Zacopride)作為治療缺血再灌注性心律失常的藥物，其效果與利多卡因相似，作用穩(wěn)定，對(duì)心律無(wú)明顯影響，安全范圍大。在缺血再灌注誘發(fā)心律失常的實(shí)驗(yàn)中，利多卡因可使心律減慢，扎考比利(Zacopride)則無(wú)明顯影響；利多卡因在劑量增加1/3時(shí)其抗心律失常作用明顯減弱，扎考比利(Zacopride)則在100倍有效濃度時(shí)才出現(xiàn)此現(xiàn)象。文檔編號(hào)A61K31/439GK101199521SQ20071018532公開(kāi)日2008年6月18日申請(qǐng)日期2007年11月28日優(yōu)先權(quán)日2007年11月28日發(fā)明者劉清華,吳博威,封啟龍,媛李,李曉麗,楊彩紅,白曉潔申請(qǐng)人:山西醫(yī)科大學(xué)