專利名稱：：含16型hpv反義e7基因的重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建方案及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種人類5型腺相關(guān)病毒(Humanadeno-associatedvimstype5，AAV5)重組體的構(gòu)建方案，其技術(shù)特征在于Notl酶切位點(diǎn)中反向插入315bp的外源性16型HPVE7基因工程cDNA片段，該片段相當(dāng)于16型HPVE7mRNA的858-544nt，從而獲取對(duì)腫瘤具有治療作用的重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建體rA4K-//i>P76￡Z4S。本
發(fā)明內(nèi)容屬于醫(yī)學(xué)基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。二
背景技術(shù)：
：在導(dǎo)致女性死亡的惡性腫瘤中，宮頸癌居于第二位。由于缺乏合適的篩查方法，在發(fā)展中國(guó)家宮頸癌發(fā)病率位于第一位。流行病學(xué)調(diào)查資料顯示我國(guó)是宮頸癌的高發(fā)國(guó)家之一，每年發(fā)病率為14.6/10萬，新增病例約15萬；全世界每年有50萬新發(fā)病例，中國(guó)就超過了1/4。宮頸癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，且年輕婦女宮頸癌的發(fā)病率明顯上升。女性是社會(huì)經(jīng)濟(jì)建設(shè)的重要部分，婦女的健康和生活質(zhì)量的高低直接影響到家庭生活的完美，是關(guān)系到社會(huì)穩(wěn)定的大事，與我國(guó)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展和建設(shè)和諧社會(huì)的發(fā)展大計(jì)息息相關(guān)。然而目前常規(guī)的腫瘤治療手段無法從根本上清除惡性腫瘤，多數(shù)常見腫瘤治療的現(xiàn)狀仍面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，腫瘤的徹底根治需要治療方法的革新。這種革新在宮頸癌的傳統(tǒng)治療中尤其明顯，早期宮頸癌的治療主要為根治性全子宮切除，晚期宮頸癌則主要為放射治療，這兩種方法都不可避免地部分或完全破壞了女性生殖道，無法生育、性生活喪失或不滿意成為不可忽視的后遺癥，宮頸癌發(fā)病年輕化的特點(diǎn)使得這種矛盾在近年顯得尤為突出。對(duì)新型治療手段的需求迫使人們不得不從分子水平尋找靶點(diǎn)。宮頸癌病因?qū)W研究表明95%宮頸癌的原發(fā)因素是人乳頭瘤病毒(HPV)，HPV感染是多數(shù)宮頸癌變的第一步。HPV屬于乳頭多瘤空泡病毒科乳頭瘤病毒屬，是由DNA核心和蛋白衣殼組成的無包膜DNA病毒，衣殼由主要(Ll)和次要(L2)衣殼蛋白組成，HPV具有明顯的種屬特異性，它們不能在動(dòng)物體內(nèi)感染，也不能作體外細(xì)胞培養(yǎng)。不同型別的HPV基因結(jié)構(gòu)基本相似，是雙股環(huán)狀DNA，由三個(gè)基因區(qū)組成，按其功能可分為早期區(qū)(E區(qū))、晚期區(qū)(L區(qū))和上游調(diào)節(jié)區(qū)(URR)。早期區(qū)含有6個(gè)開放閱讀框(ORF)，其中E6、E7基因主要與病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能及致癌性有關(guān)。E6不僅通過結(jié)合并降解p53從而導(dǎo)致細(xì)胞周期細(xì)胞永生化，E7則通過與控制細(xì)胞周期有關(guān)的腫瘤抑制蛋白R(shí)b的相互作用，使細(xì)胞周期失控而發(fā)生永生化，兩種癌蛋白的表達(dá)是維持腫瘤細(xì)胞處于轉(zhuǎn)化狀態(tài)所必須的。16型是最常見的高危型別，其E6、E7基因的表達(dá)產(chǎn)物是上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變必不可少的條件，與宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展有極密切聯(lián)系，我國(guó)的流行病學(xué)表明宮頸癌患者中HPV16型陽性率達(dá)到50%-87%。在HPV16陽性宮頸癌細(xì)胞中，HPVDNA以整合的形式存在于宿主細(xì)胞基因組中，E7基因均是持續(xù)表達(dá).Howley等證實(shí)了病毒E6、E7基因的持續(xù)表達(dá)可能是腫瘤惡性表型得以維持的必要因素，其中E7癌蛋白是HPV的主要轉(zhuǎn)化蛋白。因此，將癌蛋白E7視為腫瘤特異性抗原，是研究開發(fā)新型治療方法的主要著眼點(diǎn)之一。如何通過抑制E7基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯來達(dá)到逆轉(zhuǎn)宮頸癌細(xì)胞惡性表型，已成為研究的熱點(diǎn)。在腫瘤發(fā)病內(nèi)在分子機(jī)制逐漸明了的新的歷史條件下，腫瘤分子醫(yī)學(xué)理論和方法學(xué)的突破引發(fā)了一系列發(fā)展新型腫瘤治療模式的嘗試，大量分子靶點(diǎn)特異性抗癌化合物進(jìn)入臨床試用，標(biāo)志著腫瘤治療的突破到了一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)折點(diǎn),并已獲得階段性成果,初步凸顯出未來腫瘤問題解決的基本輪廓，其最為核心的解決方法之一就是要從腫瘤繁復(fù)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中分解出最為關(guān)鍵的分子靶標(biāo)，實(shí)施分子靶向治療。截止至2001年底，獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段的分子治療品種已超過三千種，包括細(xì)胞傳導(dǎo)阻斷劑、血管生成抑制劑、腫瘤疫苗和單克隆抗體，為腫瘤問題的最終解決帶來了新的希望，可以說，未來人類腫瘤的有效控制在根本上依賴分子治療的發(fā)展完善。分子治療的主要手段主要分為三類單克隆抗體、小分子化合物和基因治療，其中，基因治療作為近年醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展中最具有生命活力的部分之一，已廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的臨床試驗(yàn)性治療，顯示出良好的應(yīng)用前景。截至目前，在全世界260多家以基因治療為核心業(yè)務(wù)的公司中，有128家在進(jìn)行腫瘤的基因治療研究和開發(fā)，全世界已經(jīng)批準(zhǔn)的基因治療臨床試驗(yàn)方案共有1145個(gè)，其中腫瘤基因治療方案有762個(gè)，占66.6%。我國(guó)近年來也逐漸加大對(duì)這方面的研究和開發(fā)力度，我國(guó)自行研制生產(chǎn)了世界上第一個(gè)上市銷售的腫瘤基因治療藥物-重組人p53腺病毒注射液。在巨大的醫(yī)療需求的推動(dòng)下，基因治療制劑將有可能成為腫瘤現(xiàn)有治療體系中不可或缺的組成部分。反義基因技術(shù)是基因治療的重要手段之一，為保證反義技術(shù)的特異性，我們選擇了針對(duì)包括E7基因閱讀框在內(nèi)的全長(zhǎng)片段，片段經(jīng)測(cè)序?yàn)?00%吻合。而腺相關(guān)病毒是目前發(fā)現(xiàn)的唯一無病原性的人DNA病毒，也是已知的唯一能與人基因組特異染色體(19q13.3—19qter)定點(diǎn)整合的真核細(xì)胞缺陷病毒。因此，基于以上特點(diǎn)而開發(fā)的腺相關(guān)病毒載體是繼腺病毒和4逆轉(zhuǎn)錄病毒載體后出現(xiàn)的新型基因治療工具，具有低免疫原性、低毒性、可長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)攜帶的外源基因以及可感染分裂期和非分裂期的宿主細(xì)胞等特點(diǎn)，同時(shí)在理論上，能夠減少由于轉(zhuǎn)基因的隨機(jī)整合而導(dǎo)致的插入突變機(jī)率，為分子治療手段的開發(fā)提供了一種可能的理想載體。
發(fā)明內(nèi)容基于以上技術(shù)背景和重大的醫(yī)療需求，本發(fā)明將公開一種含16型HPV反義E7基因的重組人類5型腺相關(guān)病毒(AAV5)重組體的構(gòu)建方案，通過該方案獲得的構(gòu)建體具有明顯的治療和預(yù)防作用，可以解決目前腫瘤治療的困難與不足。HPV16是感染宮頸的最常見高危型別，與各級(jí)上皮瘤及侵襲性鱗狀細(xì)胞癌均有關(guān)。研究表明HPVE7基因在大多數(shù)宮頸癌及癌前期病變中均持續(xù)表達(dá),而在正常組織中不表達(dá)。大多數(shù)腫瘤特異性抗原起源于正?；蛲蛔兊牡鞍?，E7完全是外來的病毒蛋白，并因此可能包含比細(xì)胞蛋白更多的抗原性表位。另外E6和E7對(duì)誘導(dǎo)和維持癌細(xì)胞的惡性表型是必需的，因此癌細(xì)胞在抗原丟失中不太可能逃過免疫反應(yīng)。在E6和E7基因中，E7基因表達(dá)量更多且具有更好的免疫學(xué)特征，而且序列比E6基因更保守，因而得到更多研究者的關(guān)注。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證明，以乳頭瘤病毒的早期蛋白為靶抗原的疫苗即能產(chǎn)生預(yù)防作用；與己上市的HPV疫苗相比，以E7蛋白為靶點(diǎn)的宮頸癌抗原特異性免疫治療或疫苗因兼具治療作用和預(yù)防作用將成為更有前景的基因治療方向。重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)源于非致病的野生型腺相關(guān)病毒，由于其安全性好、宿主細(xì)胞范圍廣(分裂和非分裂細(xì)胞)、免疫源性低，在體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長(zhǎng)以及可感染分裂期和非分裂期的宿主細(xì)胞等特點(diǎn)，被視為繼腺病毒、逆^t錄病毒之后最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一，在世界范圍內(nèi)的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應(yīng)用。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已經(jīng)有27項(xiàng)AAV載體基因治療方案進(jìn)入臨床試驗(yàn)。經(jīng)過10余年的研究，重組腺相關(guān)病毒的生物學(xué)特性已被深入了解，尤其是其在各種細(xì)胞、組織和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用效果方面巳經(jīng)積累了許多資料。在醫(yī)學(xué)研究中，i:AAV被用于多種疾病的基因治療的研究(包括體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn))；同時(shí)作為一種有特點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)移載體，還廣泛用于基因功能研究、構(gòu)建疾病模型，制備基因敲除鼠等方面。為此，本發(fā)明以AVV5重組腺相關(guān)病毒為載體，在NotI酶切位點(diǎn)中反向插入315bp的外源性16型HPVE7基因工程cDNA片段，該片段相當(dāng)于16型HPVE7mRNA的858-544nt，從而獲取對(duì)腫瘤具有治療作用的重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建體rA47-/^F76￡Z4S。本發(fā)明達(dá)到了以下效果1、腫瘤細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建體可特異性滅活HPV16型E7基因的表達(dá)，達(dá)到抑制HPV16型陽性的腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡，阻遏腫瘤細(xì)胞的成瘤、侵襲能力，而且可以使己形成的腫瘤縮小，以及預(yù)防腫瘤的形成。2、對(duì)腫瘤動(dòng)物模型的體內(nèi)研究證實(shí),通過腫瘤局部注射的給藥途徑,該重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建體對(duì)受試的腫瘤動(dòng)物模型有顯著的治療和預(yù)防作用，且對(duì)動(dòng)物無明顯治療相關(guān)毒性。四附圖l:pUFl-HPV16E7AS測(cè)序報(bào)告。附圖2:重組腺相關(guān)病毒制備及滴度檢測(cè)圖。附圖3:重組腺相關(guān)病毒抑制CaSki細(xì)胞生長(zhǎng)率。附圖4:重組腺相關(guān)病毒促進(jìn)CaSki細(xì)胞凋亡率。附圖5:重組腺相關(guān)病毒阻礙細(xì)胞侵襲的體外驗(yàn)證及抑制CaSki細(xì)胞HPV16E7的表達(dá)。附圖6:重組腺相關(guān)病毒抑制CaSki細(xì)胞成瘤力。附圖7:重組腺相關(guān)病毒治療和預(yù)防CaSki細(xì)胞成瘤。五具體實(shí)施例方式除特別注明外，在下面的實(shí)施例中，技術(shù)流程所用的酶和PCR引物均購自美國(guó)Gibco公司。例l、含目的基因骨架質(zhì)粒pUFl-HPV16E7AS的構(gòu)建與鑒定在兩個(gè)NotI位點(diǎn)之間區(qū)域反向插入315bp的外源性HPV16E7cDNA片段，該片段相當(dāng)于HPV16E7mRNA的858-544nt?！?—〈1〉RT-PCR法擴(kuò)增目的基因(DTRIZOLTM試劑一步法提取SiHa細(xì)胞總RNA;將25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基棄盡，用無RNase的PBS洗滌一遍，吸盡PBS;加入TRIZOLTM試劑1ml，使之均勻覆蓋瓶底，室溫放置5~15min，將瓶?jī)?nèi)液體轉(zhuǎn)入EP管內(nèi)；加入氯仿0.2ml，劇烈振勻15秒，室溫放置10~15min;4'C，12000rpmxl5min離心；將上層水相轉(zhuǎn)移至另一EP管內(nèi)，加入0.5ml冰異丙醇，混勻，室溫放置10min;4°C，12000rpmxl5min離心；去掉異丙醇，加入75%乙醇重懸RNA;4°C，7500rpmxl5min離心；用真空泵抽吸上清，使沉淀干燥，加入適量DEPC水溶解沉淀，取部分樣品測(cè)純度及濃度。②RNA的逆轉(zhuǎn)錄；A反應(yīng)體系RNA2jig01igo(dT)15(0.5一1)1piRNasin(40u/|il)1(al70°C加熱5min，冰浴5min;B依次加入5xbuffer5juldNTP5|alMMLV逆轉(zhuǎn)錄酶1|nlDEPC水補(bǔ)至25piC混勻，短暫離心，42°C水浴60min;D95°C水浴5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶終止反應(yīng)，4°C冰浴5min冷卻反應(yīng)液，一20°C保存?zhèn)溆谩＂跴CR擴(kuò)增；反應(yīng)體系10xBuffer5^1MgCl2(25mM)3(ildNTP(10mM)Primer1(10pmol/|al)0.5Primer2(1Opmol/ul)0.5piCDNA5~10piTaq酶1^去離子水補(bǔ)至50[il擴(kuò)增程序?yàn)?4°C5min，94°C30sec，54°C30sec，72°C45sec，35個(gè)循環(huán)，最后72°C10min。目的擴(kuò)增片段大小為315bp，GAPDH擴(kuò)增片段大小為230bp。HPV16型E7基因引物上游引物5，-GCGGCCGCAGAAACCCAGCTGTAATCAT-3'下游引物5，-GCGGCCGCTTATCCTTTCTGAGAACAGA3'GAPDH引物上游引物5'-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3,下游引物5，-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3'④回收目的片段；取10plPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，切取目的片段的凝膠，放入EP管中，加入3倍體積的碘化鈉，避光55"C水浴10min，加入玻璃奶5^1/0.3ml，充分搖勻，室溫靜置5min，室溫離心12000rpmx5sec，棄上清并加入0.5ml欲冷的washbuffer重懸沉淀，室溫離心12000rpmx5sec，棄上清并重復(fù)兩次，棄上清后室溫靜置5~10min，取適量去離子水重懸沉淀，再次離心取上清備用。〈2〉將目的基因裝入pGEM-Teasy載體系統(tǒng)并測(cè)序己純化的PCR產(chǎn)物l3|al2xBuffer5T4連接酶1|al去離子水補(bǔ)至10pi反應(yīng)條件室溫反應(yīng)至少lh。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入新鮮制備的DH5cx感受態(tài)細(xì)胞，常規(guī)LB瓊脂平板藍(lán)白斑篩選法，挑取白色菌落，常規(guī)擴(kuò)增后質(zhì)?？焖傩×刻崛?，酶切鑒定。選取克隆送測(cè)序，保存結(jié)果正確的菌種(圖l)。〈3〉質(zhì)粒的基因重組及酶切鑒定A將pGEM-Teasy-E7和pUFl質(zhì)粒分別酶切線性化；pGEM-Teasy-E7,'pUF11010xBuffer2jalNotI1pi去離子水補(bǔ)至20^反應(yīng)條件37°C水浴過夜。B回收所需片段回收所需片段A:-NotI-pUFl-NotI-和B:-NotI-E7-NotI-，具體方法同上。C將兩片段進(jìn)行連接反應(yīng)反應(yīng)前取線性化片段A進(jìn)行去磷酸化，反應(yīng)條件如下:A10^10xBufferCIAP去離子水補(bǔ)至5^11pi50(il去磷酸化反應(yīng)條件37°C水浴反應(yīng)30min，加入5mmol/LEDTA(PH8.0)，65°C水浴反應(yīng)lh滅活酶，酚/氯仿抽提，乙酸鈉沉淀，回收去磷酸化片段A，并測(cè)定其濃度。B片段A片段5xBufferT4連接酶去離子水補(bǔ)至連接反應(yīng)條件16°C反應(yīng)20hr。D雙酶切鑒定；pUFl-E7AS10xBufferAccIKpnl去離子水補(bǔ)至4pi1pi20|il10(il2^11pi1pi20|il反應(yīng)條件37°C水浴過夜。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察結(jié)果(圖2)。例2、重組腺相關(guān)病毒的包裝、純化將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293細(xì)胞接種至75cm2的培養(yǎng)瓶中，近70%融合時(shí)，用磷酸鈣沉淀法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將pUFl陽E7AS、pXX2、pXX6或pdxll-lacZ、pXX2、pXX6按摩爾比l:1:1共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，12h后換液，72h吸出培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮匙收集細(xì)胞，兩組各收集細(xì)胞60瓶，將細(xì)胞置于-80。C冰箱，反復(fù)凍融3次，12000rpm4°C離心20min，取上清備用。使用氯化銫梯度離心法純化并濃縮病毒。例3、重組腺相關(guān)病毒滴度及活力測(cè)定〈1〉斑點(diǎn)雜交法測(cè)定rAAV-E7AS和rAAV-Laz病毒滴度。(D樣品的稀釋取含重組腺相關(guān)病毒的上清液40nl，在200^1含Dnasel和RNase及相應(yīng)緩沖液的體積中37'Clh，后加入400ul含10ng/ml蛋白酶K體系，37°C2-3h等體積酚、氯仿、異成醇抽提，12000rpm4。C離心15min,取上清400^1與等體積的0.4MNaOH/10mmEDTA混合。將對(duì)照質(zhì)粒pdxll-lacZ、pUF廣E7AS和經(jīng)上述方法處理后的rAAV-E7AS、rAAV-lacZ100。C加熱5min，置冰上冷卻2min，用0.4MNaOH/10mMEDTA按1011、5xl010、2.5><1010、lx1010、5xl09、2.5x109、lx109、5xl08、2.5x108、108、107、1(^個(gè)分子數(shù)/ml比例稀釋。②常規(guī)裝置點(diǎn)樣，8(TC烤膜2小時(shí)，按試劑說明進(jìn)行雜交。③化學(xué)發(fā)光法顯色，選擇適宜時(shí)間曝光洗片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2?！?〉重組腺相關(guān)病毒的活力測(cè)定將處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293細(xì)胞接種至6孔板，分兩組，分別加入含rAAV-Laz/rAAV-E7AS的完全培養(yǎng)基，24小時(shí)后，吸干培養(yǎng)基，用PBS洗1次，1%戊二醛固定15min，用x-gal染色液300nl/well避光染色24h,光鏡下觀察30個(gè)400倍視野，以含藍(lán)綠色顆粒細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比評(píng)價(jià)其轉(zhuǎn)染效率。例4、重組腺相關(guān)病毒抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的體外驗(yàn)證在96孔板上接種細(xì)胞lxl(^個(gè)/L，37°C、5。/。C02培養(yǎng)箱中孵育過夜，加入適宜濃度的病毒轉(zhuǎn)染，完全培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液分別作為空白對(duì)照和陰性對(duì)照，另設(shè)一組在轉(zhuǎn)染前固定，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后棄去培養(yǎng)基，10。/。TCA液4i:固定lh，倒掉固定液，去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥，每孔加入100^1SRB液，在室溫放置10min,1%醋酸液洗5遍，空氣干燥，1Ommol/L非緩沖Tris堿液(PH10.5)溶解，用自化分光度平板讀數(shù)計(jì)在515mn波長(zhǎng)處測(cè)定每個(gè)小孔OD值。按公式計(jì)算生長(zhǎng)率。實(shí)驗(yàn)證實(shí)處理72h后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)率達(dá)到最低，以術(shù)處理組和AXV^iacZ作用組作為對(duì)照組，對(duì)照組則沒有變化(圖3)。例5、重組腺相關(guān)病毒促進(jìn)細(xì)胞凋亡的體外驗(yàn)證收集細(xì)胞，用預(yù)冷的75。/。乙醇固定，PBS洗滌、離心，加入含有10嗎/mlPI和0.1。/。RNaseA的PBS室溫處理至少20min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)處理72h后腫瘤細(xì)胞凋亡率達(dá)到最高，以未處理組和AAV-lacZ作用組作為對(duì)照組，對(duì)照組則沒有變化(圖4)。例6、重組腺相關(guān)病毒阻礙細(xì)胞侵襲的體外驗(yàn)證在^m孔徑的聚碳酸酯微孔濾膜(SPI公司)上均勻平鋪按l:5稀釋的DMEM基底膜基質(zhì)膠Growthfactor-reducedMatrigel，約120嗎/cm2，37°C放置3小時(shí)，后轉(zhuǎn)入室溫下過夜干燥。將Boyden小室按常規(guī)裝置，下室各孔加入25ul含一定濃度的LGMCSF的DMEM，10上室加入3T3和CaSki細(xì)胞，細(xì)胞濃度為2x105/ml，每孔25nl，細(xì)胞數(shù)5000個(gè)/小室，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孑L，37'C、5。/。C02培養(yǎng)10小時(shí)，取出膜拭去上層剩余細(xì)胞，90%甲醇室溫固定45min，蘇木素染色10min，流水沖洗，風(fēng)干，在光學(xué)顯微鏡下每孔計(jì)數(shù)5個(gè)視野中的全部細(xì)胞。以不涂Matrigel的膜作為對(duì)照，瘤細(xì)胞穿過數(shù)作為100%，實(shí)驗(yàn)組與之比較的相對(duì)百分率表示趨化活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)處理72h后腫瘤細(xì)胞侵襲力達(dá)到最低，以未處理組和AAV-lacZ作用組作為對(duì)照組，對(duì)照組則沒有變化(圖5)。例7、重組腺相關(guān)病毒抑制HPV16E7表達(dá)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NorthernBlot法檢測(cè)HPV16E7基因的表達(dá)水平提取細(xì)胞總RNA并測(cè)純度及濃度，進(jìn)行RNA甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，參照試劑說明書標(biāo)記探針(全長(zhǎng)DNA探針)、雜交、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色、曝光，重復(fù)三次。以GAPDH作為內(nèi)參照。WesternBlot法檢測(cè)HPV16E7基因的表達(dá)水平三去污法提取細(xì)胞胞漿蛋白，取50嗎蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2h后，用TBST漂洗3次，加入相應(yīng)的抗HPV16E7抗體(1:500)，4°C孵育過夜；TBST漂洗3次后加入相應(yīng)的堿磷酶標(biāo)記的二抗(1:500)，37。C搖床孵育2h，NBT/BCIP顯色系統(tǒng)顯色,重復(fù)三次。以p-actin作為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。例8、重組腺相關(guān)病毒抑制腫瘤細(xì)胞成瘤能力的驗(yàn)證選取適宜濃度病毒轉(zhuǎn)染CaSki細(xì)胞，作用72小時(shí)后收獲細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，濃度為106個(gè)/100^1,對(duì)照組為未經(jīng)轉(zhuǎn)染的CaSki細(xì)胞，取低齡組裸小鼠，每組5只，于小鼠肩胛區(qū)皮下注射細(xì)胞，接種100nl/只，觀察腫瘤的形成，計(jì)算成瘤率。實(shí)驗(yàn)證實(shí)處理72h后腫瘤細(xì)胞侵襲力達(dá)到最低，以未處理組和AAV-lacZ作用組作為對(duì)照組，對(duì)照組則沒有變化(圖6)。例9、重組腺相關(guān)病毒治療和預(yù)防宮頸癌的裸鼠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為空白對(duì)照組(A組)，rAAV-lacZ治療組(B組)，rAAV-E7AS治療組(C組)，rAAV-lacZ預(yù)防組(D組)，rAAV-E7AS預(yù)防組(E組)。每組6只，預(yù)防組于3周時(shí)即給予相應(yīng)處理因素即rAAV-lacZ、rAAV-E7AS在預(yù)接種部位肌肉注射，其他組注射生理鹽水，6組裸鼠在相同條件下詞養(yǎng)，1周后即同時(shí)皮下接種腫瘤細(xì)胞。當(dāng)皮下瘤形成0.5x0.5x0.5ci^大小時(shí)，治療組即給予相應(yīng)的處理因素，預(yù)防組則注射生理鹽水。評(píng)價(jià)指標(biāo)含腫瘤直徑、成瘤時(shí)間、生存時(shí)間。腫瘤直徑以三相的平均數(shù)值為評(píng)定指標(biāo)，其中含最大直徑，其余兩相與之成90'角度(長(zhǎng)、寬、高)。成瘤時(shí)間為自接種日起至形成0.5x0.5x0.5cmS大小瘤體時(shí)的時(shí)間。生存時(shí)間即為自接種日起至死亡的時(shí)間。A、B、C、D四組的成瘤時(shí)間相近，差異無顯著性意義(P>0.05)，僅在E組則出現(xiàn)成瘤時(shí)間明顯后延，差異有極其顯著性意義(PO.01)(圖7)表lA、B、C、D四組成瘤時(shí)間、腫瘤直徑、生存時(shí)間比較<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注眾E組與A、B、C、D組比較PO.Ol▲C、E組與A、B、D組比較PO.OlAE組和C組比較P=0.038★C、E組與A、B、D組比較PO.OlA、B、C、D、E組腫瘤直徑分別為2.23士0.21、2.29士0.14、0.92士0.10、2.28士0.12、0.66士0.33cm，C組腫瘤直徑明顯小于對(duì)照A、B組，E組腫瘤直徑明顯小于對(duì)照A、D組，PO.01;而C、E兩組比較，E組小于C組，P=0.038，五組中生存時(shí)間最短96天，最長(zhǎng)130天，A、B、D三組生存時(shí)間相近，分別為102.83±4.75、102.17±4.36、103.67±3.67，C、E兩組生存時(shí)間亦相近，分別為124.00±4.20、124.67±3.50，差異均無顯著性意義(P>0.05);而后兩組與前三組相比，生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有極其顯著性意義(PO,Ol)，結(jié)果顯示rAAV-lacZ無論是用于治療還是預(yù)防，生存時(shí)間與空白對(duì)照組相比差異無顯著性，一定程度上驗(yàn)證了重組腺相關(guān)病毒用于基因治療的安全性。在rAAV-E7AS治療組中，腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，腫瘤直徑明顯小于對(duì)照組，生存時(shí)間亦明顯延長(zhǎng)；在rAAV-E7AS預(yù)防組中，成瘤時(shí)間較其他組明顯推后，形成的腫瘤直徑明顯小于對(duì)照組，亦小于rAAV-E7AS治療組。附件DNA序列表<110>深圳市奧尼克斯基因技術(shù)有限公司<110>馬丁王世宣周劍峰盧運(yùn)萍鄔素芳<120>含16型HPV反義E7基因的重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建方案及用途<140〉<141><160>1<170><210>1<211><212>DNA<213>人工序列<220><223><400>HPV16全基因組序列E7開放閱讀框?yàn)?44bp—858bp。1ttcatgtat已a(bǔ)aact^gggcgt已3ccgaaatcggttgaaccgaaaccgg61ttagtat犯aagcagacattttatgcaccagcaatgtttcaggscccaca121ggagcgacccag已a(bǔ)agttaccacagtt已tgcac3gagctgtacatgatat181tgtgtgtactgcaagcaacagttactgcgacgtgaggtatatgactttgc241ttttcgggatt3tat3gagatggg已a(bǔ)tccatatgctgtatgtgataaatg301tttaaagttttattctaaaattagtgagtatagacattattgttatagtttgtatggaac361aacattag已a(bǔ)cagcaa/tac已a(bǔ)caaaccgttgtgtgatttgttaattaggtgtattaactg421ctgtgtcctgaagac3tctggacaaaaagcaaagattcca481ggtcggtggaccggtcgatgtatgtxttgttgcagatcatcaagaacacg541tagagaaacccagctgtastcatgcatgg已g已t3C3cctaLatatatgtta601gatttgcaacC3g￡Lga<C3￡LCtgatctctactgttatgagccagctcagag661鵬gaggatgaaatagatggtccagctggacaagcagaaccggac卿gcccattacaat721attgt犯ccttttgttgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtaca781gtagscattcgtactttggasgacctgttaatgggcsceLCtaggaattgtgtgccccatc841tgttctcagaaaccataatctaccatggctgatcctgcsggtacc已3tgggga卿gggt901acgggatgtaatggatggtttt已tgtagaggctgtaigtgg郷,tgct961atatcsgatgacgagascgagatacaggtgaagatttggt1021gtaaatgataaacacaggcagaaacagagacagcacatgcgttgtttact腿gcacagg鄉(xiāng)caaaacaacatsgagatgcagtacsggttcta3aacgaaagtatttggta1141gtccacttagtgstattagtggatgtgtagacaataatattagtcctagattaaaagcta1201tatgtatagaagagctgcaaatttgaaagcga卿cagcg1261ggtatggcaatactgasgtgga_￡L￡LCtC￡LgCagatgttacaggt卿鄉(xiāng)gcgccatgaga1321ctgaascaccatgt已gtcagt由gtggtgg卿tgggggtggttgcagtcagtacagta1381gtggaagtgggttagtgsaagacacactatatgccaaacaCC3CttaC犯1441atat111aaaact3gtaatgcaaaggcagcaatgttagca1501agttatacggggtgagtttttxag3attagtaagaccatt￡L￡L￡LtCa_￡LCgt1561gttgcgattggtgtattgctgcatttggacttacacccagtatagctgac3gtataaaaa1621cactattacattatatttacacattcaaagtttagcatgttcatggggaa1681tggttgtgttactattagtagtgga犯aaatagsgaaacaattgaaaaat1741tgctgtctaagtgtctccaatgtgtatgatgatagagcctccaaaattgc1801gtagt已cagc3gcagc3t"ta3犯caggtatatcaaatattsgtg鄉(xiāng)tgt18613tgg3gac已cgcc卿atgg3ca^ca^agttttaatgatt1921gtacatttgagggcctacgataatgacata1981gtgaaattgcatataaatatgcacaattggtagtaatgcaagtgcctttx2041ttcacaggca郷sttgtgc犯CEL3tgtgtsgacattata2101atgagtatgagtC犯tgg3taaaatatagstgtgataggg2161t卿tgatggaggtg已Uggttatgtttttaaggtatc犯ggtgt卿gt2221ttatgtcatttttaactgcattttgcaaggcatacctaaaaaa3attgca2281tggtgcagctaatcEtttatttggtatgagtttaatgaaat2341ttctgcaagggtctgtaatatgttttgtaa3ttcta已a(bǔ)己gccatttttggttacaaccat2401t已gcagatgcatgttagatgatgCt3C8gtgccctgttgg2461atgacaatttttggatgg犯atttagtttctatggatgtaaagcatagac142521cattggtacacctccattattaattac已tcgctggtacag2581attctaggtggccttatttacataatagattggtggtgtttacatttcctaatgagtttc2641catttgacgaaaacggaaatccagtgtatgagcttaatgataagaactggaaatcctttt2701tctcaaggacgtggtcc卿ttaagtttgcacg已ggacgaggacaaggaaaacgatggag2761actctttgcctgtgtgtxaggacaaaatac2821agtacagacct已cgtg3ccatgcgcctagaatgtgctatt2881tattacaaggccagagaaatggg3ttt犯3accaagtggtgccaacactg2941gctgtatcaaagaMaaagcattgaactgcaactaacgtt3001tataactcactga^￡L￡Lgtggaceittacaagacgttagccttgaagtgtat3061ttaactgcaccaac3gga_tgtataaaaaaacatggat已tacagtggaagtgcagtttg￡Lt3121ggagacatatgcaat已caataactggacacatatatatatttgtgaagaa3181gcatcagtaactgtggt卿gggtc犯gttgtttatattatgttCELtg犯3241ggaatacgaacatattttgtgcagtttaa^gatgatgcag3301gtatgggaagttcatgcgggtggtc郷taa^tattatgtcctacatctgtgtttagcagc3361aacgaagtatcctctcctga33tt￡Ltt￡LggcagcacttggCC犯CC3CCCcgccgcgacc3421cataccaaagccgtcgccttgggcaccg朋gaaacacagaicgactatccagcgaccaaga3481tcagagccagacaccggaaacccctgccacaccactaagttgttgcacagagactcagtg3541gacagtgctccaatcctcactgcatttaacagctcacacat已a(bǔ)ctgtaat3601agtaacactacacccatagtggtgatgctaatactttaaaatgtttaaga3661tatagatttaaaaagcattgtacattgtatactgcagtgtcgtct已catggcattggaca3721ggeicataatg犯gtgcaMtgttacacttacatatgatsgtgaatggcaa3781cgtgaccaatttttgtctcattacagtgtctactggattt3841atgtctatatgacaaatcttgatactgcatccacaacattactggcgtgctttttgctU3901gctttgtgtgcttttgtgtgtxtgcctattagLtacgtccgctgcttttgtctgtgtctac3961atacaca*tcatggtattactattgtggataacagcagcctctgcgtt"tag德gtgttttatttatttgtttatata_cc3tt8tttttaatacatscacatgc4081acgctttttagtatatgtactgtt3CElt3taattgttgta4141taccataacttactattttttcttttttataatttttttttUgtttgtt4201tgtttgttttgttattacttaacaatgcgacscaaacgttctgcaaaacg<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula><image>imageseeoriginaldocumentpage17</image>7741ttggcataaggtttaaacttctaaggccaactaaatgtcaccctagttcatacatgaact7801gtgtaaaggttagtcatacattgttcatttgtaaaactgcacatgggtgtgtgcaaaccg7861attttgggttac已catttacaagcaacttatataataatactaa權(quán)利要求1、一種重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建體，該構(gòu)建體命名為rAAV-HPV16E7AS，其技術(shù)特征在于在野生型AAV5NotI酶切位點(diǎn)中反向插入315bp的外源性16型HPVE7cDNA片段，相當(dāng)于HPV16E7mRNA的858-544nt，其他基因組結(jié)構(gòu)與野生型AAV5完全相同。2、制備權(quán)利要求1所述的重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建體的方法，其特征在于用PCR法擴(kuò)增全長(zhǎng)序列片段，并將獲得的片段裝入載體，經(jīng)測(cè)序并與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)證實(shí)為100%吻合，而后與腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pf/FJ進(jìn)行基因重組，構(gòu)建成功含HPV16型反義E7基因的新載體p"^7-/ffP76￡7AS<，；^W-//PW6E7A5質(zhì)粒與包裝載體和；^OT(5共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，篩選出表達(dá)反義16型HPVE7mRNA的重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建體rAAV-HPV16E7AS。3、權(quán)利要求1所述的重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建體在制備用于基因治療載體中的用途。4、權(quán)利要求1所述的重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建體在制備用于宮頸癌及其他與HPV16型感染有關(guān)疾病預(yù)防藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了一種含人乳頭瘤病毒(HPV)16型反義E7基因的腺相關(guān)病毒構(gòu)建方案，以及用該方案獲取的一種重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建體在腫瘤治療中的具體用途。用PCR法擴(kuò)增全長(zhǎng)、酶切、連接、同源重組、轉(zhuǎn)染、腺相關(guān)病毒純化等技術(shù)，獲得一種重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建體，其技術(shù)特征在于在NotI酶切位點(diǎn)中反向插入全長(zhǎng)外源性HPV16型E7基因cDNA片段。該種重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建體具有以下突出的技術(shù)優(yōu)勢(shì)能定點(diǎn)整合入染色體；插入的反向外源性基因?yàn)槿L(zhǎng)片段，特異性好；對(duì)感染16型HPV的細(xì)胞具有強(qiáng)效應(yīng)，具備預(yù)防效能。該重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建體為腫瘤基因治療和預(yù)防提供了一種理想的基因靶點(diǎn)特異性治療和預(yù)防應(yīng)用途徑。文檔編號(hào)A61K48/00GK101440378SQ20071018784公開日2009年5月27日申請(qǐng)日期2007年11月20日優(yōu)先權(quán)日2007年11月20日發(fā)明者盧運(yùn)萍,周劍峰,王世宣,鄔素芳,丁馬申請(qǐng)人:深圳市奧尼克斯基因技術(shù)有限公司