專利名稱：預防和治療仔豬黃痢的受體阻斷劑、制備及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑-受體阻斷劑，特別涉及一種預防和治療仔豬黃痢 的受體阻斷劑以及應用。
背景技術：
在本發(fā)明之前，針對仔豬黃痢的預防和治療是主要采用抗生素或(和)產(chǎn)腸 毒素大腸桿菌(ETEC) K88和K99二價基因工程苗用于預防和臨床治療，在一 定程度上降低了初生仔豬和斷奶仔豬腹瀉率，但長期和大量復合抗生素的使用， 導致多種耐藥性ETEC不斷產(chǎn)生和水平傳播擴散，并造成抗生素低效和在動物體 內(nèi)的畜積，也會導致動物胃腸道正常菌群紊亂，消化不良，引發(fā)胃腸道和機體抵 抗力下降，易繼發(fā)或并發(fā)多種疾病；K88和K99 二價基因工程苗僅局限使用在 免疫懷孕母豬產(chǎn)生母源抗體，仔豬在吃到含4^高母源抗體的初乳后，在一定時間 內(nèi)產(chǎn)生被動免疫力，能抵抗、中和體內(nèi)已侵襲感染的ETEC病原菌，保護仔豬不 發(fā)病，但免疫期較短，且長期使用，免疫壓力選擇下不斷增加產(chǎn)生優(yōu)勢血清型致 病性菌林，而原有的疫苗對這種致病性菌林感染免疫效力不佳。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種受體阻斷劑及制備方法。 本發(fā)明的技術是
預防和治療仔豬黃痢的受體阻斷劑，其主要技術特征在于受體阻斷劑是益生 素重組菌組合系列，該益生素重組菌系列為2種豬源優(yōu)勢益生素菌林，其中1 種為豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌EPl,第2種為豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌 林LP1,豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌內(nèi)含表達987P和K88粘附素的重組 pBR322載體，其中粘附素987P是由987P產(chǎn)腸毒素大腸桿菌染色體基因組和野 生型53kb大質(zhì)粒DNA共同編碼，由FasA、 B、 C、 D、 E、 F、 G基因組成，F(xiàn)asH 則是它的調(diào)節(jié)基因，僅存在于染色體基因組上，粘附素K88是由K88產(chǎn)腸毒素 大腸桿菌野生型大質(zhì)粒DNA編碼，由faeA到faeJ共10個基因參與其菌毛粘附 素的生物合成，其中faeA和faeB為調(diào)節(jié)基因，其余都為粘附素K88操縱子結(jié)構 基因。
本發(fā)明的另一技術方案是
所述的受體阻斷劑的制備方法，其主要技術步驟如下
(1)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹載體菌EP1和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌 LP1分離自仔豬正常小腸粘膜，按常規(guī)細菌法分離、鑒定，符合大腸桿菌 和乳酸桿菌形態(tài)、培養(yǎng)和生物學的一般特性，進一步通過仔豬小腸上皮細 胞體外粘附試驗和體內(nèi)口服后仔豬腸道定植、增殖試驗細菌數(shù)檢測，篩選 出對小腸上皮細胞粘附能力強、易能在仔豬腸道定植、定居和增殖的EP1 和LP1 二種細菌并保存；
(2 )選取豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹栽體菌EP1,按大腸桿菌常規(guī)細菌培養(yǎng)和 增殖，選取豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌LP1,按乳酸桿菌常規(guī)培養(yǎng)和增殖；
(3)鑒定、克隆編碼大腸桿菌987P、 K88完整操縱子結(jié)構基因根據(jù)上述二 種完整操縱子基因已知的發(fā)表序列，采用長距離PCR法擴增粘附素完整 結(jié)構基因，核酸分子雜交檢測，經(jīng)特定的限制性內(nèi)切酶EcoRI或Pstl分 別酶切消化，結(jié)合核苷酸序列分析而最后獲得粘附素完整操縱子結(jié)構基 因，987P粘附素結(jié)構基因含F(xiàn)asA、 B、 C、 D、 E、 F、 G7個亞單位基因， 約9Kb大小，K88粘附素結(jié)構基因含F(xiàn)aeC、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 J 8個 亞單位基因，約8Kb大?。?br>
(4) 表達987P和K88粘附素完整操縱子結(jié)構基因的pBR322重組載體系統(tǒng)構 建按常規(guī)DNA重組技術操作，將編碼大腸桿菌987P、 K88粘附素完整 操縱子結(jié)構基因DNA和表達載體pBR322 DM分別經(jīng)特定限制性內(nèi)切酶 BamHI和HindIII酶切消化、連接后，分別轉(zhuǎn)化工程菌DH5a感受態(tài)細菌， 從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的陽性質(zhì)粒DNA,結(jié)合細菌粘附素 凝集反應陽性結(jié)果，篩選到能功能性展呈表達987P和K88粘附素的 pBR322重組栽體；
(5) 鑒定、克隆編碼大腸桿菌染色體上的天門冬氨酸半醛脫氫酶管家基因即 ASD完整編碼基因根據(jù)上述基因已知的發(fā)表序列，以工程菌DH5&染 色體DNA為才莫板，采用長距離PCR法擴增ASD完整基因，核酸分子雜 交;f企測，經(jīng)特定的限制性內(nèi)切酶Pstl酶切消化結(jié)合核苷酸序列分析而最后 獲得ASD完整編碼基因，約2Kb大??；
(6 )表達987P、 K88粘附素完整操縱子結(jié)構基因和ASD編碼基因的pBR322 重組栽體系統(tǒng)構建表達987P和K88粘附素完整操縱子基因的pBR322 重組載體，經(jīng)重組DNA技術操作，插入ASD編碼基因于上述表達987P和 K88粘附素完整操縱子結(jié)構基因的pBR322重組栽體的多克隆位點區(qū)域， 失活了原pBR322載體上的抗性基因活性，篩選出含表達ASD編碼基因， 上述表達987P和K88粘附素完整操縱子結(jié)構基因的pBR322重組載體以 ASD存在為篩選標志替代抗生素抗性基因篩選標志，且祛除了原pBR322 載體上的氨卞青霉素和四環(huán)素抗性基因篩選標志；
(7 )豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP1重組菌構建和篩選:提取含表達987P、 K88 粘附素完整操縱子結(jié)構基因和ASD編碼基因的pBR322重組質(zhì)粒載體 DNA，經(jīng)DNA轉(zhuǎn)化法分別導入豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素ASD缺失突變 林載體菌內(nèi)，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的陽性重組質(zhì)粒DNA， 結(jié)合細菌粘附素凝集反應、仔豬小腸上皮細胞體外粘附試驗和仔豬腸道定 植試驗細菌數(shù)檢測陽性結(jié)果，'拜選出能將987P和K88兩種粘附素有效和 功能性展呈表達在仔豬腸道上皮細胞的豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素ASD缺 失突變抹EPl ASD重組菌；
(8 )受體阻斷劑產(chǎn)品制備挑取步驟(7 )中豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP1重 組菌和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌LP1單個菌落，在37'C過夜培養(yǎng)18小時菌液作 為種子液，再分別擴大培養(yǎng)、增殖16 18小時，經(jīng)常規(guī)細菌菌落計數(shù)， 以菌落形成單位cfo度量，濃度達2 6 x lo9cfu,混合配置而成益生素重組 菌系列。 本發(fā)明的又一技術方案是
所述的受體阻斷劑作為預防和治療仔豬黃痢藥物的應用，其主要技術特征在
于
1)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP1，經(jīng)DNA遺傳修飾，即利用X噬菌 體Red重組酶系統(tǒng)和同源重組技術，缺失其菌林染色體上的天門冬氨酸半醛 脫氫酶管家基因即ASD編碼基因，構建出豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP1 ASD缺失突變抹； 2 )表達987P和K88粘附素完整操縱子基因的pBR322重組載體，經(jīng)重組DM 技術操作，插入ASD編碼基因于上述pBR322重組載體的多克隆位點區(qū)域， 失活了原pBR322栽體上的抗性基因活性，篩選出含表達ASD編碼基因，上 述表達987P和K88粘附素完整操縱子基因的pBR322重組載體以ASD存在 為篩選標志替代抗生素抗性基因篩選標志，且祛除了原pBR322載體上的氨 卞青霉素和四環(huán)素抗性基因篩選標志；
3 )豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP1重組菌基于ASD非抗生素抗性為選擇壓力的
染色體一一質(zhì)粒致死平衡系統(tǒng)的載體菌林構建；
4 )豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌林能有效促進豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP1重組
菌和其ASD缺失突變4朱EP1 ASD重組菌在仔豬腸道的定植、定居和增殖；
5 )受體阻斷劑產(chǎn)品用于一 日齡仔豬，口服2ml 4小時后能在仔豬腸道定植、定 居、增殖。
本發(fā)明的優(yōu)點和效果在于組合細菌染色體DNA大分子重組技術、病原菌受 體和其粘附素結(jié)合和檢測技術、粘附素受體封閉/阻斷技術、粘附素操縱子體外
表達技術和畜禽益生素多年的研究工作基礎，研制出的一種受體阻斷劑，它是基 于豬源優(yōu)勢通用性益生素抹載體菌重組菌抹組合，仔豬口服后能在腸道很快定 植、定居、增殖，且在腸道上皮細胞表面功能性展呈表達987P和K88粘附素， 該粘附素優(yōu)先和仔豬腸道上皮細胞受體結(jié)合，從而封閉了腸道上皮細胞與987P 和K88粘附素介導的ETEC病原菌的結(jié)合靶位點，即使外界污染有大量病原菌， 由于失去了結(jié)合仔豬腸道上皮細胞的能力，而不能感染易感仔豬。本發(fā)明的最大 優(yōu)點在于該種受體阻斷劑與常Mi元生素藥物和疫苗的功效作用階^:完全不同，后 者是抵抗、抑制、中和體內(nèi)已侵襲感染的ETEC病原菌，保護仔豬不發(fā)病，而前 者則是阻止外界病原菌不能進入動物體內(nèi)，兩者比較，后者能最直接、最有效地 封閉/阻止仔豬腸道上皮細胞表面受體靶位點與987P和K88粘附素介導的產(chǎn)腸 毒素大腸桿菌病原菌的結(jié)合，在臨床上用于抗987P和K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感 染的高效防治，且見效很快。事實上，我們已將此受體阻斷劑用于通常都發(fā)生仔 豬黃痢一些豬場，幾小時(最早4小時)產(chǎn)生明顯保護效果，對987P和K88產(chǎn) 腸毒素大腸桿菌病原菌感染的預防效果很好，使用方法為仔豬口服，非常簡單， 很易于推廣應用。它是一種全新的、廣譜的、非抗生素預防和治療仔豬黃痢高科 技生物制劑。該受體阻斷劑高科技生物制劑本身不帶有任何抗生素抗性基因篩選 標志，因而不會造成任何抗生素耐藥基因在病原菌和動物機體的存在和傳播。
本發(fā)明的其它優(yōu)點和效果將在下面繼續(xù)描述。
圖1 — _體外優(yōu)化表達系統(tǒng)功能性展呈表達987P完整菌毛粘附素x13500。 圖2—一體外優(yōu)化表達系統(tǒng)功能性展呈表達K88完整菌毛粘附素x46000。
圖3—_PCR檢測豬源優(yōu)勢益生素載體菌抹EP1 AASD缺失突變抹。 M: DM分子量DL2000; 1: PCR擴增檢測EP1菌抹染色體ASD基因；
2和3: PCR擴增檢測一次同源重組菌EP1AASD中ASD基因缺失； 4和5: PCR擴增檢測二次同源重組菌EP1AASD中氯霉素基因缺失； 圖4 ——豬源優(yōu)勢益生素抹栽體菌林EP1功能性展呈表達987P(4a)和 K88(4b)和仔豬腸道上皮細胞表面受體的結(jié)合示意圖x1000。
具體實施例方式
如圖1、圖2、圖3、圖4所示
受體阻斷劑是有效和功能性表達987P和K88粘附素的益生素重組菌組合 系列，其制備為
1. 首先，自仔豬正常小腸粘膜材料分離、鑒定豬源大腸桿菌益生素抹載體菌和豬 源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌，進一步通過仔豬小腸上皮細胞體外粘附試驗和體內(nèi) 口服后仔豬腸道定植、增殖試驗細菌數(shù)檢測，篩選出對小腸上皮細胞粘附性能 強、易在仔豬腸道定植、定居和增殖的豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素菌，代號為 EP1，和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌林，代號為LP1，并分別保存；
2. 選取豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素株載體菌EP1,按大腸桿菌常規(guī)細菌培養(yǎng)和增 殖；選取豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌LP1，按乳酸桿菌常規(guī)培養(yǎng)和增殖；
3. 豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹載體菌EP1染色體ASD缺失突變林構建。經(jīng)DNA 遺傳修飾，即利用X噬菌體Red重組酶系統(tǒng)和同源重組技術，缺失其菌林染色 體上的天hl冬氨酸半醛脫氫酶管家基因即ASD編碼基因，構建出豬源優(yōu)勢大 腸桿菌益生素抹栽體菌ASD缺失突變抹，代號為EP1AASD,經(jīng)體外生長特 性，仔豬腸道定植、定居和增殖試驗細菌數(shù)檢測和比較，EP1和缺失突變林 EP1AASD在體外生長特性，仔豬腸道定植、定居和增殖特性上基本一致；
4. 鑒定、克隆編碼大腸桿菌987P、 K88粘附素完整操縱子結(jié)構基因。根據(jù)上述 基因已知的發(fā)表序列，采用長模板PCR法擴增粘附素完整基因，核酸分子雜 交檢測，經(jīng)特定的限制性內(nèi)切酶EcoRI或Pstl酶切消化結(jié)合核苦酸序列分析 而最后獲得粘附素完整操縱子結(jié)構完整基因，987P粘附素結(jié)構基因含F(xiàn)asA、 B、 C、 D、 E、 F、 G7個亞單位基因，約9Kb大小，K88粘附素結(jié)構基因含 FaeC、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 J8個亞單位基因，約8Kb大??；
5. 表達987P和K88粘附素完整操縱子結(jié)構基因的pBR322重組栽體系統(tǒng)構建。 按常規(guī)DNA重組技術操作，將編碼大腸桿菌987P、 K88粘附素完整操縱子 結(jié)構基因DNA和表達載體pBR322 DNA分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI和 HindIII酶切消化、連接后，分別轉(zhuǎn)化工程菌DH5A感受態(tài)細菌，從篩選的培 養(yǎng)菌液中提取含目的片段的陽性重組質(zhì)粒DNA,結(jié)合細菌粘附素凝集反應陽 性結(jié)果，篩選到能功能性展呈表達987P和K88粘附素的pBR322重組載體；
6. 鑒定、克隆編碼大腸桿菌染色體上的天門冬氨酸半醛脫氫酶管家基因即ASD 完整編碼基因。根據(jù)上述基因已知的發(fā)表序列，以工程菌DH5i染色體DNA 為模板，采用長模板PCR法擴增ASD完整基因，核酸分子雜交檢測，經(jīng)特 定的限制性內(nèi)切酶Pstl酶切消化結(jié)合核普酸序列分析而最后獲得ASD完整編 碼基因，約2Kb大小；
7. 表達987P、 K88粘附素完整操縱子結(jié)構基因和ASD編碼基因的pBR322重 組載體系統(tǒng)構建。上述表達987P和K88粘附素完整操縱子基因的pBR322 重組載體，經(jīng)重組DM技術操作，插入ASD編碼基因于上述pBR322重組載 體的多克隆位點區(qū)域，失活了原pBR322載體上的抗性基因活性，篩選出含 表達ASD編碼基因，上述表達987P、 K88粘附素完整#:縱子結(jié)構基因的 pBR322重組栽體以ASD存在為篩選標志替代抗生素抗性基因篩選標志，且 祛除了 pBR322原載體上的氨卞青霉素和四環(huán)素抗性基因篩選標志；
8. 豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹載體菌ASD缺失突變林構建。經(jīng)DNA遺傳修飾， 即利用X噬菌體Red重組酶系統(tǒng)和同源重組技術，缺失其菌林染色體上的天 門冬氨酸半醛脫氫酶管家基因即ASD編碼基因，構建出豬源優(yōu)勢大腸桿菌益
生素林栽體菌ASD缺失突變林，經(jīng)體外生長特性，仔豬腸道定植、定居和增 殖試驗檢測和比較，ASD缺失突變林EP1 △ ASD和豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生 素林EP1在上述特性上基本一致；
9. 大腸桿菌優(yōu)勢益生素ASD缺失突變林重組菌構建和篩選。提取表達987P、 K88粘附素完整操縱子結(jié)構基因和ASD編碼基因的pBR322重組質(zhì)粒載體 DNA,經(jīng)DNA轉(zhuǎn)化法分別導入豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素ASD缺失突變林載 體菌內(nèi)，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的陽性重組質(zhì)粒DNA,結(jié)合細 菌粘附素凝集反應、仔豬小腸上皮細胞體外粘附試驗和仔豬腸道定植試驗細 菌數(shù)檢測陽性結(jié)果，篩選出能將987P和K88兩種粘附素有效和功能性展呈 表達在仔豬腸道上皮細胞的大腸桿菌優(yōu)勢益生素ASD缺失突變抹EPIAASD 重組菌；
10. 豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌林能有效促進豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌 和其ASD缺失突變林重組菌在仔豬腸道的定植、定居和增殖試驗。分別選取 EP1， EP1厶ASD, EPl和LPl, EP1AASD和LP1共四組益生素重組菌組 合，分別用于一日齡仔豬口服，經(jīng)仔豬腸道定植試驗和細菌數(shù)檢測比較，豬 源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌抹LP1能有效促進豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌 EP1和EP1 AASD缺失突變林在仔豬腸道的定植、定居和增殖；
11. 受體阻斷劑終產(chǎn)品制備。挑取豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌EP1 AASD 和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌LP1單個菌落在普通LB肉湯或常規(guī)M17培養(yǎng)基3rC過 夜培養(yǎng)18小時菌液作為種子液，再分別擴大培養(yǎng)、增殖16 18小時，經(jīng)常 規(guī)細菌菌落計數(shù)，以菌落形成單位cfii度量，濃度達2 6 x 109cfU， EP1 △ ASD重組菌和LP1擴大培養(yǎng)菌液混合配置而成益生素ASD缺失突變株重組 菌系列。
得到的受體阻斷劑產(chǎn)品是益生素重組菌組合系列，該益生素重組菌組合系列 為2種豬源優(yōu)勢益生素菌林，包括1種豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌和1種豬 源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌林。豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌內(nèi)含表達987P和 K88粘附素，其中粘附素987P是由987P產(chǎn)腸毒素大腸桿菌染色體基因組和野生 型53kb大質(zhì)粒DNA共同編碼，與FasA、 B、 C、 D、 E、 F、 G基因組成，而FasH 則是它的調(diào)節(jié)基因，4又存在于染色體基因組上；粘附素K88是由K88產(chǎn)腸毒素 大腸桿菌野生型大質(zhì)粒DNA編碼，由faeA到faeJ共10個基因參與其菌毛的生 物合成，其中faeA和faeB為調(diào)節(jié)基因，其余都為粘附素K88操縱子結(jié)構基因。
經(jīng)血清學凝集反應檢測，研制成的受體阻斷劑能分別凝集兔或鼠抗987P和 K88粘附素抗體，玻片凝集反應效價達l: IOO以上，經(jīng)仔豬小腸上皮細胞體外粘 附試驗檢測，受體阻斷劑具有對小腸上皮細胞粘附能力強，動物體內(nèi)粘附試驗檢 觀'J,用于一日齡仔豬，口服后能在腸道最早4小時定植、定居、增殖，繼而在仔豬 腸道上皮細胞表面功能性展呈表達987P和K88粘附素。由于粘附素能特異性結(jié) 合存在于仔豬小腸上皮細胞表面的大分子受體，當受體阻斷劑定植、增殖在仔豬 小腸上皮細胞并進一步在其表面功能性展呈表達987P和K88粘附素后，該二種 功能性表達粘附素其作用首先優(yōu)先和仔豬腸道上皮細胞表面受體結(jié)合，從而封閉 了腸道上皮細胞表面大分子受體與987P和K88粘附素介導的ETEC病原菌結(jié)合 的同樣乾位點，從而失去了 987P和K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病原菌感染機體的第 一步也是最最重要一步的可能性，即失去病原菌其感染性粘附素和宿主細胞表面 相應的特異性受體靶位點結(jié)合。在上述受體阻斷劑封閉了腸道上皮細胞表面大分子受體情況下的仔豬，等同于體內(nèi)不存在或失去987P ETEC和K88 ETEC 二種 病原菌的特異受體，即使外界污染有大量病原菌，由于病原菌失去了感染動物的 作用耙位點，不再會發(fā)生感染，即使仔豬體質(zhì)弱、抵抗力差，也不會感染發(fā)病。 本發(fā)明中，受體阻斷劑的制備方法由于采用了對小腸上皮細胞粘附能力強、 易能在仔豬腸道定植、定居和增殖的豬源優(yōu)勢益生素菌林組合系列，其功能性展 呈表達987P和K88粘附素能長時間逗留在仔豬腸道，優(yōu)先并能長時間和仔豬腸 道上皮細胞表面受體結(jié)合，抗感染作用持久。由于受體阻斷劑的制備方法中含有 987P和K88粘附素是阻止外界病原菌不能進入動物體內(nèi)，與常規(guī)抗生素藥物和 疫苗的功效作用階段完全不同，后者是抵抗、抑制、中和體內(nèi)已侵襲感染的ETEC 病原菌，保護仔豬不發(fā)病，兩者比較，受體阻斷劑能最直接、最有效地封閉/阻 止仔豬腸道上皮細胞受體與987P和K88粘附素介導的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病原 菌的耙位點結(jié)合，在臨床上用于抗987P和K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染的直接、 高效防治。受體阻斷劑最早可用于一日齡仔豬，口服后能在仔豬腸道最早4小時 定植、定居、增殖和封閉仔豬腸道上皮細胞受體與987P和K88粘附素介導的產(chǎn) 腸毒素大腸桿菌病原菌的結(jié)合，使產(chǎn)下仔豬在很短時間內(nèi)由于口服受體阻斷劑而 成為非易感仔豬，應用在實際生產(chǎn)中，因而能顯著提高預防和治療仔豬黃痢效果。 受體阻斷劑作為預防和治療仔豬黃痢藥物的應用 1)上述優(yōu)勢豬源通用性益生素林栽體菌，經(jīng)DNA遺傳修飾，其菌抹染色體上 的天門冬氨酸半醛脫氳酶管家基因(ASD編碼基因)缺失，構建出豬源優(yōu)勢大 腸桿菌益生素林載體菌ASD缺失突變抹，經(jīng)體外生長特性，仔豬腸道定植、 定居和增殖試驗4企測和比較，ASD缺失突變林和豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素 林在上述特性上基本一致； 2 )上述表達987P和K88粘附素完整操縱子基因的pBR322重組載體，經(jīng)重 組DM技術操作，插入ASD編碼基因于上述pBR322重組載體的多克隆位 點區(qū)域，失活了原pBR322栽體上的抗性基因活性，篩選出含表達ASD編 碼基因，以上述ASD存在為篩選標志替代抗生素抗性基因篩選標志，且祛 除了 pBR322原栽體上的氨卞青霉素和四環(huán)素抗性基因篩選標志； 3)上述益生素重組菌基于非抗生素抗性(ASD編碼基因)為選擇壓力的染色體 一一質(zhì)粒致死平衡系統(tǒng)的載體菌株構建，本身不帶有任何抗生素抗性基因 篩選標志，因而不會造成任何抗生素耐藥基因在病原菌和動物機體的存在 和傳播。
4)豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌抹能有效促進豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素和 ASD缺失突變林重組菌在仔豬腸道的定植、定居和增殖，能在仔豬腸道很 快定植、定居、增殖。
5 )上述受體阻斷劑最早可用于一 日齡仔豬，口服2ml后能在仔豬腸道最早4 小時定植、定居、增殖，有效預防和治療仔豬黃痢。
一日齡仔豬10只口服使用本發(fā)明的2ml受體阻斷劑12小時后，用987P和 K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病原菌人工感染，沒有一只仔豬發(fā)病和出現(xiàn)黃痢癥狀，攻 毒保護率達IOO、選擇原先每窩仔豬通常都發(fā)生仔豬黃痢的3個豬場，使用本 發(fā)明的受體阻斷劑后，不再發(fā)生仔豬黃痢。原患有黃痢疾病仔豬，即使采用常規(guī) 治療方法即口服或注射復合抗生素，療程3 5天， 一般治療效果不佳，大多呈 急性敗血型死亡，耐過治愈的仔豬，引發(fā)胃腸道和機體抵抗力下降，易繼發(fā)或并 發(fā)多種疾病，生長較慢，飼料報酬較高，生產(chǎn)性能也會影響，因而生產(chǎn)效益明顯
降低。將本發(fā)明的受體阻斷劑使用在原先患有黃痢仔豬，在使用過豬場的試驗結(jié) 果表明，能很快終止仔豬黃痢的病程發(fā)展， 一些患病仔豬很快恢復。由于本發(fā)明 的受體阻斷劑是一種全新的、非抗生素治療和預防仔豬黃痢策略和途徑，而使用 本發(fā)明受體阻斷劑后，可望在該病的治療和預防上大大減少或不需要抗生素使 用，也預期著本發(fā)明的受體阻斷劑替代基因工程苗和常規(guī)疫苗使用。
權利要求
1.預防和治療仔豬黃痢的受體阻斷劑，其特征在于受體阻斷劑是益生素重組菌組合系列，該益生素重組菌系列為2種豬源優(yōu)勢益生素菌株，其中1種為豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌EP1，第2種為豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌株LP1，豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌內(nèi)含表達987P和K88粘附素的重組pBR322載體，其中粘附素987P是由987P產(chǎn)腸毒素大腸桿菌染色體基因組和野生型53kb大質(zhì)粒DNA共同編碼，由FasA、B、C、D、E、F、G基因組成，F(xiàn)asH則是它的調(diào)節(jié)基因，僅存在于染色體基因組上，粘附素K88是由K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌野生型大質(zhì)粒DNA編碼，由faeA到faeJ共10個基因參與其菌毛粘附素的生物合成，其中faeA和faeB為調(diào)節(jié)基因，其余都為粘附素K88操縱子結(jié)構基因。
2. 根據(jù)權利要求1所述的受體阻斷劑的制備方法，其步驟如下(1)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP1和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌 LP1分離自仔豬正常小腸粘膜，按常規(guī)細菌法分離、鑒定，符合大腸桿菌 和乳酸桿菌形態(tài)、培養(yǎng)和生物學的一般特性，進一步通過仔豬小腸上皮細 胞體外粘附試驗和體內(nèi)口服后仔豬腸道定植、增殖試驗細菌數(shù)檢測，篩選 出對小腸上皮細胞粘附能力強、易能在仔豬腸道定植、定居和增殖的EP1 和LP1 二種細菌并保存；(2 )選取豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹載體菌EP1,按大腸桿菌常規(guī)細菌培養(yǎng)和 增殖，選取豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌LP1，按乳酸桿菌常規(guī)培養(yǎng)和增殖；(3) 鑒定、克隆編碼大腸桿菌987P、 K88完整操縱子結(jié)構基因根據(jù)上述二 種完整操縱子基因已知的發(fā)表序列，采用長距離PCR法擴增粘附素完整 基因，核酸分子雜交檢測，經(jīng)特定的限制性內(nèi)切酶EcoRI或Pstl分別酶 切消化，結(jié)合核苦酸序列分析而最后獲得粘附素完整操縱子結(jié)構基因， 987P粘附素結(jié)構基因含F(xiàn)asA、 B、 C、 D、 E、 F、 G7個亞單位基因，約 9Kb大小，K88粘附素結(jié)構基因含F(xiàn)aeC、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 J 8個亞 單位基因，約8Kb大小；(4) 表達987P和K88粘附素完整操縱子結(jié)構基因的pBR322重組載體系統(tǒng)構 建按常規(guī)DNA重組技術操作，將編碼大腸桿菌987P、 K88粘附素完整 操縱子結(jié)構基因DNA和表達栽體pBR322 DNA分別經(jīng)特定限制性內(nèi)切酶 BamHI和HindIII酶切消化、連接后，分別轉(zhuǎn)化工程菌DH5A感受態(tài)細菌， 從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的陽性質(zhì)粒DNA，結(jié)合細菌粘附素 凝集反應陽性結(jié)果，篩選到能功能性展呈表達987P和K88粘附素的 pBR322重組栽體；(5) 鑒定、克隆編碼大腸桿菌染色體上的天門冬氨酸半醛脫氫酶管家基因即 ASD完整編碼基因根據(jù)上述基因已知的發(fā)表序列，以工程菌DH5&染 色體DNA為模板，采用長距離PCR法擴增ASD完整基因，核酸分子雜 交檢測，經(jīng)特定的限制性內(nèi)切酶Pstl酶切消化結(jié)合核苷酸序列分析而最后 獲得ASD完整編碼基因，約2Kb大??；(6) 表達987P和K88粘附素完整操縱子結(jié)構基因和ASD編碼基因的pBR322 重組栽體系統(tǒng)構建表達987P和K88粘附素完整^:縱子基因的pBR322 重組載體，經(jīng)重組DNA技術操作，插入ASD編碼基因于上述表達987P和 K88粘附素完整操縱子結(jié)構基因的pBR322重組栽體的多克隆位點區(qū)域， 失活了原pBR322栽體上的抗性基因活性，篩選出含表達ASD編碼基因， 上述表達987P和K88粘附素完整操縱子結(jié)構基因的pBR322重組載體以 ASD存在為篩選標志替代抗生素抗性基因篩選標志，且祛除了原pBR322 載體上的氨卞青霉素和四環(huán)素抗性基因篩選標志； (7 )豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP1重組菌構建和篩選,提取含表達987P、 K88 粘附素完整操縱子結(jié)構基因和ASD編碼基因的pBR322重組質(zhì)粒載體 DNA，經(jīng)DNA轉(zhuǎn)化法分別導入豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素ASD缺失突變 林載體菌內(nèi)，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的陽性重組質(zhì)粒DNA, 結(jié)合細菌粘附素凝集反應、仔豬小腸上皮細胞體外粘附試驗和仔豬腸道定 植試驗細菌數(shù)檢測陽性結(jié)果，篩選出能將987P和K88兩種粘附素有效和 功能性展呈表達在仔豬腸道上皮細胞的豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素ASD缺 失突變林重組菌；(8 )受體阻斷劑產(chǎn)品制備挑取步驟(7 )中豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP1重 組菌和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌LP1單個菌落，在37'C過夜培養(yǎng)18小時菌液作 為種子液，再分別擴大培養(yǎng)、增殖16 18小時，經(jīng)常MJB菌菌落計數(shù)， 以菌落形成單位cfu度量，濃度達2 6 x 109cfo，混合配置而成益生素重 組菌系列。
3.根據(jù)權利要求1所述的受體阻斷劑作為預防和治療仔豬黃痢藥物的應用，其 特征在于1)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP1,經(jīng)DNA遺傳修飾，即利用？i噬菌 體Red重組酶系統(tǒng)和同源重組技術，缺失其菌林染色體上的天門冬氨酸半醛 脫氫酶管家基因即ASD編碼基因，構建出豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹載體 菌EP1 ASD缺失突變林； 2 )表達987P和K88粘附素完整操縱子基因的pBR322重組栽體，經(jīng)重組DNA 技術操作，插入ASD編碼基因于上述pBR322重組栽體的多克隆位點區(qū)域， 失活了原pBR322載體上的抗性基因活性，篩選出含表達ASD編碼基因，上 述表達987P和K88粘附素完整操縱子基因的pBR322重組載體以ASD存在 為篩選標志替代抗生素抗性基因篩選標志，且祛除了原pBR322栽體上的氨 卞青霉素和四環(huán)素抗性基因篩選標志；3) 豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP1重組菌基于ASD非抗生素抗性為選擇壓力的 染色體一一質(zhì)粒致死平衡系統(tǒng)的栽體菌抹構建；4) 豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌林能有效促進豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌和 其ASD缺失突變林重組菌在仔豬腸道的定植、定居和增殖；5) 受體阻斷劑產(chǎn)品用于一日齡仔豬，口服2ml4小時后能在仔豬腸道定植、定 居、增殖。
全文摘要
本發(fā)明涉及預防和治療仔豬黃痢的受體阻斷劑、制備及應用。本發(fā)明組合細菌染色體DNA大分子重組技術、病原菌受體和其粘附素結(jié)合和檢測技術、粘附素受體封閉/阻斷技術、粘附素操縱子體外表達技術的一種受體阻斷劑，仔豬口服后能在腸道很快定植、定居、增殖，在腸道上皮細胞表面功能性展呈表達987P和K88粘附素，與仔豬腸道上皮細胞受體結(jié)合，從而封閉了腸道上皮細胞與987P和K88粘附素介導的ETEC病原菌的結(jié)合靶位點。解決了使用復合抗生素導致耐藥性，導致動物胃腸道正常菌群紊亂，消化不良，機體抵抗力下降等缺陷。本發(fā)明優(yōu)點在于阻止外界病原菌進入動物體內(nèi)，直接封閉仔豬腸道上皮細胞表面受體靶位點與987P和K88粘附素介導的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病原菌的結(jié)合。
文檔編號A61K35/66GK101204404SQ20071019146
公開日2008年6月25日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權日2007年12月19日
發(fā)明者何素芬, 劉俊斌, 劉振華, 原志偉, 朱國強, 朱春紅, 朱曉芳, 王建業(yè), 董國雄 申請人:揚州大學