專利名稱：預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病的受體阻斷劑、制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑-受體阻斷劑，特別涉及一種預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和 仔豬水腫病的受體阻斷劑、制備以及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在本發(fā)明之前，在全球范圍內(nèi)沒有任何商品化疫苗用于斷奶仔豬腹瀉和仔豬 水肺病的預(yù)防，而只是在臨床上發(fā)生斷奶仔豬腹渴和仔豬水腫病病例時， 一律被 動采用抗生素臨床治療，在一定程度上降低了初生仔豬和斷奶仔豬腹瀉率，但針 對伃豬水腫病病例的抗生素臨床治療，基本無效，其患水肺病的仔豬病程結(jié)局最 后大多死亡，且長期和大量復(fù)合抗生素的使用，導(dǎo)致多種耐藥性產(chǎn)腸毒素大腸桿 菌(ETEC)F18和K88菌4朱不斷產(chǎn)生和在動物體水平傳播擴散，并造成抗生素低 效和在動物體內(nèi)的畜積，也會導(dǎo)致動物胃腸道正常菌群紊亂，消化不良，引發(fā)胃 腸道和機體抵抗力下降，易繼發(fā)或并發(fā)多種疾病。斷奶仔豬腹瀉的主要病原菌是 F18 ETEC和K88 ETEC大腸桿菌兩種，仔豬水腫病的主要病原菌是F18 ETEC, 鑒于F18 ETEC 4姿粘附素F18分為F18ab和F18ac 2個血清型抗原變種，K88 ETEC 按粘附素K88分為K88ab、 K88ac、 K88ad 3種血清型抗原變種，其臨床流行株的 菌體抗原血清型則更多，因而研制出針對斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病的有效預(yù)防 疫苗至今存在著很大難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫 病的受體阻斷劑及制備方法。 本發(fā)明的技術(shù)是
預(yù)防斷奶仔豬腹竭和仵豬水腫病的受體阻斷劑，其主要技術(shù)特征在于受體阻 斷劑是益生素重組菌組合系列，該益生素重組菌系列為2種豬源優(yōu)勢益生素菌 抹，其中1種為豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌EP2，第2種為豬源優(yōu)勢乳酸桿 菌益生素菌林LP2，豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重組菌內(nèi)含表面分泌表達F18 或Fed粘附素亞單位基因FedF，K88或F4或Fae粘附素亞單位基因FaeG的MisL e重組載體，其中粘附素F18分為F18ab和F18ac 2個血清型抗原變種，是由 F18產(chǎn)腸毒素大腸桿菌野生型大質(zhì)粒DNA編碼，F(xiàn)18ab質(zhì)粒大小在48和98Mu 之間，而F18ac大質(zhì)粒在98Mu左右 粘附素Fed的表達和合成需要大質(zhì)?；?組中一組操縱子5個基因共同參與完成，它們分別是FedA、 B、 C、 E和F,其中 FedF亞單位為F18大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域，F(xiàn)18ab FedF和F18ab FedF結(jié)合 相同的仔豬腸上走細(xì)胞表面大分子受體，為高度保守的共同功能性粘附素；粘附 素K88分為K88ab、 K88ac、 K88ad 3種血清型抗原變種，是由K88產(chǎn)腸毒素大腸 桿菌野生型大質(zhì)粒DNA編碼，由FaeA到FaeJ共10個基因參與其菌毛粘附素的 生物合成，其中FaeG亞單位為為K88大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域，結(jié)合仔豬腸 上皮細(xì)胞表面大分子受體，為高度保守的功能性粘附素。
本發(fā)明的另一技術(shù)方案是
所述的受體阻斷劑的制備方法，其主要技術(shù)步驟如下
(1)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹載體菌EP2和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌LP2 分離自仔豬正常小腸粘膜，按常規(guī)細(xì)菌法分離、鑒定，符合大腸桿菌和乳 酸桿菌形態(tài)、培養(yǎng)和生物學(xué)的一般特性，進一步通過仔豬小腸上皮細(xì)胞體 外粘附試驗和體內(nèi)口服后仔豬腸道定植、增殖試驗細(xì)菌數(shù)檢測，篩選出對 小腸上皮細(xì)胞粘附能力強、易能在仔豬腸道定植、定居和增殖的EP2和 LP2 二種細(xì)菌并保存；
(2 )選取豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP2,按大腸桿菌常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)和 增殖，選取豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌LP2,按乳酸桿菌常規(guī)培養(yǎng)和增殖；
(3 )擴增；鑒定FedF和FaeG亞單位基因，根據(jù)FedF和FaeG基因已知的發(fā)表 序列，以F18ab、 F18ac和K88ac優(yōu)勢血清型大腸桿菌大質(zhì)粒DNA為模板， 采用高保真PCR Kit擴增上述亞單位基因FedF和FaeG,進一步將3，末 端帶有A的PCR片段插入克隆載體pGEM-T,制備轉(zhuǎn)化工程菌DH5 &感受態(tài) 細(xì)菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的重組質(zhì)粒 pGEM-T DNA,序列測定驗證；
(4 )表面分泌表達FedF和FaeG亞單位基因的V型分泌系統(tǒng)MisL p重組載體 系統(tǒng)構(gòu)建，按常規(guī)DM重組技術(shù)操作，將編碼FedF、 FaeG亞單位基因和 V型分泌系統(tǒng)的分泌表達載體MisL p分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI酶切消化、 連接后，分別轉(zhuǎn)化工程菌DH5 A感受態(tài)細(xì)菌，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含 目的片段的陽性質(zhì)粒DM, PCR檢測，結(jié)合細(xì)菌粘附素凝集反應(yīng)陽性和序 列測定驗證結(jié)果，篩選到能功能性表面分泌表達FedF和FaeG亞單位的V 型分泌系統(tǒng)Mi sL P重組載體；
(5)鑒定、克隆編碼大腸桿菌染色體上的天門冬氨酸半醛脫氫酶管家基因即 ASD完整編碼基因根據(jù)上述基因已知的發(fā)表序列，以工程菌DH5 &染色 體DNA為模板，采用長距離PCR法擴增ASD完整基因，核酸分子雜交檢測， 經(jīng)特定的限制性內(nèi)切酶Pstl酶切消化結(jié)合核苷酸序列分析而最后獲得 ASD完整編碼基因，約2Kb大??；
(6 )表面分泌表達FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisL P重 組栽體系統(tǒng)構(gòu)建。步驟5中表面分泌表達FedF和FaeG粘附素亞單位基因 的Mi sL P重組載體，經(jīng)重組DNA技術(shù)操作，插入ASD編碼基因于步驟5中 MisLP重組栽體的多克隆位點區(qū)域，失活了原MisLp載休上的抗性基因 活性，在工程菌DH5 SASD缺失突變抹DH5 & △ ASD指示細(xì)胞中篩選出含表 達ASD編碼基因和表面分泌表達FedF、 FaeG粘附素亞單位基因的MisL P 重組載體，以ASD存在為篩選標(biāo)志替代抗生素抗性基因篩選標(biāo)志，且祛除 了 MisL P原載體上的氨卞青霉素抗性基因篩選標(biāo)志；
(7)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重組菌構(gòu)建和篩選，提取含表面分泌表達 FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisLp重組質(zhì)粒栽體 DNA，經(jīng)DNA轉(zhuǎn)化法分別導(dǎo)入豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素載體菌EP2內(nèi)，從 篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的陽性重組質(zhì)粒DNA,結(jié)合細(xì)菌粘附素 凝集反應(yīng)、仔豬小腸上皮細(xì)胞體外粘附試驗和仔豬腸道定植試驗細(xì)菌數(shù)檢 測陽性結(jié)果，篩選出能將FedF和FaeG兩種粘附素亞單位有效和功能性展 呈和分泌表達在仔豬腸道上皮細(xì)胞的EP2重組菌表面；
(8 )受體阻斷劑產(chǎn)品制備挑取步驟(7 )中豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重
組菌和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌LP2單個菌落，在37。C過夜培養(yǎng)18小時菌液作 為種子液，再分別擴大培養(yǎng)、增殖16 18小時，經(jīng)常規(guī)細(xì)菌菌落計數(shù)， 以菌落形成單位cfu度量，濃度達2 6 x 109cfu,重組菌EP2和LP2擴大 培養(yǎng)后混合配置而成益生素重組菌系列。
本發(fā)明的又一技術(shù)方案是
所述的受體阻斷劑作為預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病藥物的應(yīng)用，其主要 技術(shù)特征在于
1)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP2，經(jīng)DNA遺傳修飾，即利用入噬菌體 Red重組酶系統(tǒng)和同源重組技術(shù)，缺失其菌林染色體上的天門冬氨酸半酪脫 氬酶管家基因即ASD編碼基因，構(gòu)建出豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹栽體菌 ASD缺失突變4朱EP2 A ASD;
2 )表面分泌表達FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisL p重組
載體，經(jīng)重組DNA技術(shù)操作，插入ASD編碼基因于表面分泌表達FedF和FaeG 粕附素亞單位基因的Mi sL (3重組載體的多克隆位點區(qū)域，失活了原Mi sL p 栽體上的抗性基因活性，在工程菌DH5 & ASD缺失突變林加5 & △ ASD指示細(xì) 胞中篩選出含表達ASD編碼基因和表面分泌表達FedF、 FaeG粘附素亞單位 基因的MisLP重組載體，以ASD存在為'歸選標(biāo)志替代抗生素抗性基因篩選 標(biāo)志，且祛除了 MisL(3原栽體上的氨卞青霉素抗性基因篩選標(biāo)志；
3 )豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重組菌基于ASD非抗生素抗性為選擇壓力的染
色體一一質(zhì)粒致死平衡系統(tǒng)的載體菌抹構(gòu)建，其系統(tǒng)本身不帶有任何抗生素 抗性基因篩選標(biāo)志；
4)豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌林LP2能有效促進豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2 重組菌和其ASD缺失突變林EP2 △ ASD重組菌在仔豬腸道的定植、定居和增殖； 5 )受體阻斷劑產(chǎn)品用于一 日齡仔豬，口服2ml 4小時后能在仔豬腸道定植、定 居、增殖。
本發(fā)明的優(yōu)點和效果在于組合細(xì)菌染色體DNA大分子重組技術(shù)、病原菌受體 和其粘附素結(jié)合和檢測技術(shù)、粘附素受體封閉/阻斷技術(shù)、表面分泌表達粘附素 技術(shù)和畜禽益生素多年的研究工作基礎(chǔ)，研制出的一種受體阻斷劑，它是基于豬 源優(yōu)勢益生素載體菌重組菌林組合，仔豬口服后能在腸道很快定植、定居、增殖， 且在腸道上皮細(xì)胞表面功能性展呈分泌表達的高度保守的共同功能性粘附素 FedF和FaeG,即F18和K88粘附素受體結(jié)合域，優(yōu)先和仔豬腸道上皮細(xì)胞表面 受體結(jié)合，從而封閉了腸道上皮細(xì)胞與F18和K88粘附素介導(dǎo)的ETEC病原菌的 結(jié)合靶位點，即使外界污染有大量病原菌，由于失去了結(jié)合仔豬腸道上皮細(xì)胞的 能力，而不能感染易感仔豬。本發(fā)明的最大優(yōu)點在于該種受體阻斷劑與常規(guī)抗生 素藥物和疫苗的功效作用階段完全不同，后者是抵抗、抑制、中和體內(nèi)已侵襲感 染的ETEC病原菌，保護仔豬不發(fā)病，而前者則是阻止外界病原菌不能進入動物 體內(nèi)，兩者比較，后者能最直接、最有效地封閉/阻止仔豬腸道上皮細(xì)胞受體靶 位點與F18和K88粘附素介導(dǎo)的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病原菌的結(jié)合，在臨床上用于 抗F18和K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染的預(yù)防。事實上，我們已將此受體阻斷劑產(chǎn) 品用于通常都發(fā)生斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病病例一些豬場，產(chǎn)生明顯保護效 果，對F18和K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病原菌感染的預(yù)防效果好，使用方法為仔豬 口服，非常筒單，很易于推廣應(yīng)用。它是一種全新的、廣譜的、非抗生素預(yù)防斷 奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病的高科技生物制劑。該受體阻斷劑高科技生物制劑本身 不帶有任何抗生素抗性基因篩選標(biāo)志，因而不會造成任何抗生素耐藥基因在病原 菌和動物機體的存在和傳播。
本發(fā)明的其它優(yōu)點和效果將在下面繼續(xù)描述。


圖1 一_功能性表面分泌表達FedF和FaeG亞單位基因的V型分泌系統(tǒng)Mi sL
P重組載體系統(tǒng)構(gòu)建圖。 圖2—一豬源優(yōu)勢益生素林載體菌EP2表面分泌表達的FedF和FaeG亞單位 系統(tǒng)構(gòu)建及其功能性展呈表達檢測圖。a.重組DNA技術(shù)涉及到ColE ori復(fù)制原點，PnirB啟動子，LTB信號肽，V型分泌系統(tǒng)MisL a linker+ p元件的克隆、鑒定。b.以F18ab/F18ac和K88ac大腸桿菌 大質(zhì)粒DNA為模板，釆用高保真PCR Kit擴增FedF或FaeG,克隆 和序列測定。
圖3——V型分泌系統(tǒng)MisL |3 -FedF和FaeG重組質(zhì)粒MisL P -FedF和FaeG 的構(gòu)建圖。
圖4一_豬源優(yōu)勢益生素抹載體菌EP2菌林功能性展呈表面分泌表達的 F18FedF亞單位(a)和 K88FaeG亞單位(b)和仔豬腸道上皮細(xì)胞 表面受體的結(jié)合圖。
具體實施例方式
如圖1、圖2、圖3、圖4所示
受體阻斷劑是有效和功能性表面分泌表達F18FedF亞單位和K88FaeG亞單 位，即粘附素F18和K88受體結(jié)合域的益生素重組菌組合系歹'j,其制備為
1. 首先，自仔豬正常小腸粘膜材料分離、鑒定豬源大腸桿菌益生素林和豬源優(yōu)勢 乳酸桿菌益生素菌，進一步通過仔豬小腸上皮細(xì)胞體外粘附試lir和體內(nèi)口服后 仔豬腸道定植、增殖試驗細(xì)菌數(shù)檢測，篩選出對小腸上皮細(xì)胞粘附性能強、易 在仔豬腸道定植、定居和增殖的豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素載體菌，代號為EP2, 和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌林，代號為LP2，并分別保存；
2. 選取豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹載體菌EP2,按大腸桿菌常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)和增 殖；選取豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素林即LP2,按乳酸桿菌常規(guī)培養(yǎng)和增殖；
3. 豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP2菌抹染色體ASD缺失突變林構(gòu)建。經(jīng) DNA遺傳修飾，即利用入噬菌體Red重組酶系統(tǒng)和同源重組技術(shù)，缺失其菌林 染色體上的天門冬氨酸半醛脫氫酶管家基因即ASD編碼基因，構(gòu)建出豬源優(yōu) 勢大腸桿菌益生素林載體菌ASD缺失突變林，代號為EP2AASD，經(jīng)體外生 長特性，仔豬腸道定植、定居和增殖試驗細(xì)菌數(shù)檢測和比較，EP2AASD缺失 突變林和EP2在體外生長特性，仔豬腸道定植、定居和增殖特性上基本一致；
4. 擴增、鑒定FedF和FaeG亞單位基因。根據(jù)FedF和FaeG基因已知的發(fā)表序 列，以F18ab、 F18ac和K88ac優(yōu)勢血清型大腸桿菌大質(zhì)粒DNA為才莫板，采用 高保真PCR Kit擴增上述亞單位基因FedF和FaeG，進一步將3，末端帶有A 的PCR片殺:插入克隆載體pGEM-T,制備轉(zhuǎn)化工程菌DH5 A感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)藍(lán) 白斑篩選，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的重組質(zhì)粒pGEM-TDNA，序 列測定驗證；
5. 表面分泌表達FedF和FaeG亞單位基因的V型分泌系統(tǒng)MisL p重組載體系統(tǒng)
構(gòu)建。按常規(guī)DNA重組技術(shù)操作，將編碼FedF和FaeG亞單位基因和V型分
泌系統(tǒng)的分泌表達載體Mi sL p分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI酶切消化、連接后， 分別轉(zhuǎn)化工程菌DH5&感受態(tài)細(xì)菌，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的 陽性質(zhì)粒DNA， PCR抬r測，結(jié)合細(xì)菌粘附素凝集反應(yīng)陽性和序列測定驗證結(jié)果， 篩選到能功能性表面分泌表達FedF和FaeG亞單位的V型分泌系統(tǒng)MisL P重 組載體；
6. 鑒定、克隆編碼大腸桿菌染色體上的天門冬氨酸半趁脫氫酶管家基因即ASD 完整編碼基因。根據(jù)ASD基因已知的發(fā)表序列，以工程菌DH5 &染色體DNA 為模板，釆用長模板PCR法擴增ASD完整基因，核酸分子雜交檢測，經(jīng)特定 的限制性內(nèi)切酶PstI酶切消化結(jié)合核苷酸序列分析而最后獲得ASD完整編 碼基因，約2Kb;
7. 表面分泌表達FedF和FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisL p重 組載體系統(tǒng)構(gòu)建。步驟5中表面分泌表達FedF和FaeG粘附素亞單位基因的 MisL P重組載體，經(jīng)重組DNA技術(shù)操作，插入ASD編碼基因于步驟5中MisL P重組栽體的多克隆位點區(qū)域，失活了原MisLP載體上的抗性基因活性，在 工程菌DH5 & ASD缺失突變林DH5 & AASD指示細(xì)胞中篩選出含表達ASD編 碼基因和表面分泌表達FedF、 FaeG粘附素亞單位基因的MisLp重組栽體， 以ASD存在為篩選標(biāo)志替代抗生素抗性基因篩選標(biāo)志，且祛除了 MisL P原 載體上的氨卞青霉素抗性基因篩選標(biāo)志；
8. 豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹載體菌ASD缺失突變林即EP2AASD構(gòu)建。經(jīng) DNA遺傳修飾，即利用人噬菌體Red重組酶系統(tǒng)和同源重組技術(shù)，缺失EP2 菌林染色體上的天門冬氨酸半醛脫氫酶管家基因即ASD編碼基因，構(gòu)建出豬 源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌ASD缺失突變林即EP2厶ASD,經(jīng)體外生長 特性，仔豬腸道定植、定居和增殖試驗檢測和比較，EP2AASD缺失突變林 和豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹EP2菌在體外生長特性，仔豬腸道定植、定居 和增殖特性上基本一致；
9. 大腸桿菌優(yōu)勢益生素EP2 △ ASD重組菌構(gòu)建和篩選。提取步驟7中表面分泌 表達FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisL p重組質(zhì)粒載體 DM,經(jīng)DNA轉(zhuǎn)化法分別導(dǎo)入豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素載體菌ASD缺失突變 林EP2 △ ASD內(nèi)，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的陽性重組質(zhì)粒DM, 結(jié)合細(xì)菌粘附素凝集反應(yīng)、仔豬小腸上皮細(xì)胞體外粘附試驗和仔豬腸道定植 試-瞼細(xì)菌數(shù)才僉測陽性結(jié)果，篩選出能將FedF和FaeG兩種粘附素亞單位有效 和功能性展呈表面分泌表達在仔豬腸道上皮細(xì)胞的EP2AASD重組菌；
10. 豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌抹能有效促進豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌 和EP2△ ASD重組菌在仔豬腸道的定植、定居和增殖試驗。分別選取EP2， EP2 △ ASD, EP2和LP2， EP2AASD和LP2四組益生素重組菌，用于一日齡仔 豬口服，經(jīng)仔豬腸道定植試驗和細(xì)菌數(shù)檢測比較，豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素 菌林LP2能有效促進豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素載體菌EP2或EP2 △ ASD重組 菌在仔豬腸道的定植、定居和增殖；
11. 受體阻斷劑產(chǎn)品制備。挑取步驟9中豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌EP2A ASD和步驟1中豬源優(yōu)勢乳酸桿菌LP2單個菌落在普通LB肉湯或常規(guī)M17 培養(yǎng)基37。C過夜培養(yǎng)18小時菌液作為種子液，再分別擴大培養(yǎng)、增殖16 18小時，經(jīng)常規(guī)細(xì)菌菌落計數(shù)，以菌落形成單位cfu度量，濃度達2 6x
.109cfu,重組菌EP2AASD, 重組菌EP2AASD和LP2擴大培養(yǎng)菌液混合配 置而成益生素ASD缺失突變抹重組菌系列。
得到的受體阻斷劑產(chǎn)品是益生素重組菌組合系列，該益生素重組菌組合系列 為2種豬源優(yōu)勢益生素菌林，包括豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌和豬源優(yōu)勢乳 酸桿菌益生素菌林。豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌內(nèi)含分泌表達F18或Fed 粘附素亞單位基因FedF, K88或F4或Fae粘附素亞單位基因FaeG的V型分泌系 統(tǒng)MlsL(3重組栽體，其中粘附素F18分為F18ab和F18ac 2個血清型抗原變種， 是由F18產(chǎn)腸毒素大腸桿菌野生型大質(zhì)粒DNA編碼，F(xiàn)18ab質(zhì)粒大小在48和98Mu 之間，而F18ac大質(zhì)粒在98Mu左右。粘附素Fed的表達和合成需要大質(zhì)?；?組中一組操縱子5個基因共同參與完成，它們分別是FedA、 B、 C、 E和F，其中 FedF亞單位為F18大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域，F(xiàn)18ab FedF和F18 ac FedF結(jié) 合相同的仔豬腸上皮細(xì)胞表面大分子受體，為高度保守的共同功能性粘附素；粘 附素K88分為K88ab、 K88ac、 K88ad 3種血清型抗原變種，是由K88產(chǎn)腸毒素大 腸桿菌野生型大質(zhì)粒DNA編碼，由FaeA到FaeJ共10個基因參與其菌毛粘附素 的生物合成，其中FaeG亞單位為為K88大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域，結(jié)合仔豬 腸上皮細(xì)胞表面大分子受體，為高度保守的功能性粘附素。
經(jīng)血清學(xué)凝集反應(yīng)檢測，研制成的受體阻斷劑產(chǎn)品能分別凝集兔或鼠抗 F18ab、 F18 ac和K88粘附素亞單位FedF和FaeG抗體，玻片凝集反應(yīng)效價達 1:10以上，經(jīng)仔豬小腸上皮細(xì)胞體外粘附試驗檢測，受體阻斷劑具有對小腸上 皮細(xì)胞粘附能力強，動物體內(nèi)粘附試驗檢測，最早用于一日齡仔豬,仔豬口服后 能在腸道最早4小時定植、定居、增殖，繼而在仔豬腸道上皮細(xì)胞表面功能性展 呈表達Fed粘附素亞單位FedF和Fae粘附素亞單位基因FaeG。由于粘附素亞單 位FedF和FaeG能特異性結(jié)合存在于仔豬小腸上皮細(xì)胞表面的大分子受體，當(dāng)受 體阻斷劑產(chǎn)品使用在仔豬后，定植、增殖在仔豬小腸上皮細(xì)胞并進一步在其表面 功能性分泌表達FedF和Fae粘附素亞單位，該二種功能性表達的粘附素亞單位 其作用首先優(yōu)先和伃豬腸道上皮細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而封閉了腸道上皮細(xì)胞表 面大分子受體與F18和K88粘附素介導(dǎo)的ETEC病原菌結(jié)合的同樣靼位點，從而 失去了 F18和K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病原菌感染機體的第一步也是最最重要一步 的可能性，即失去病原菌其感染粘附素和宿主細(xì)胞表面相應(yīng)的特異性受體把位點 結(jié)合。在仔豬使用受體阻斷劑產(chǎn)品后，封閉了腸道上皮細(xì)胞表面大分子受體情況 下的仔豬，等同于體內(nèi)不存在上迷二種病原菌的特異受體，即使外界污染有大量 病原菌，由于病原菌失去了感染動物的作用靼位點，不再會發(fā)生感染，即使仔豬 體質(zhì)弱、抵抗力差，也不會感染發(fā)病。
本發(fā)明中，受體阻斷劑的制備方法由于采用了對小腸上皮細(xì)胞粘附能力強、 易能在仔豬腸道定植、定居和增殖的豬源優(yōu)勢益生素菌林組合系列，其功能性分 泌表達FedF和Fae粘附素亞單位能長時間逗留在仔豬腸道，優(yōu)先并能長時間和 仔豬腸道上皮細(xì)胞表面受體結(jié)合，抗感染作用持久。由于受體阻斷劑的制備方法 中含有FedF亞單位和FaeG亞單位，分別為F18大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域和 K88大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域，結(jié)合仔豬腸上皮細(xì)胞表面大分子受體，從而阻 止外界病原菌不能侵襲感染腸道并進一步進入動物體內(nèi)，與常規(guī)抗生素藥物和疫 苗的功效作用階段完全不同，后者是抵抗、抑制、中和體內(nèi)已侵襲感染的ETEC 病原菌，保護仔豬不發(fā)病，兩者比較，受體阻斷劑能最直接、最有效地封閉/阻 止仔豬腸道上皮細(xì)胞表面受體與F18和K88粘附素介導(dǎo)的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病原 菌的靼位點結(jié)合,在臨床上用于抗F18和K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染的直接、高 效防治。受體阻斷劑最早可用于一 日齡仔豬，口服后能在仔豬腸道最早4小時定
植、定居、增殖和封閉仔豬腸道上皮細(xì)胞受體與F18和K88粘附素介導(dǎo)的產(chǎn)腸 毒素大腸桿菌病原菌的結(jié)合，使產(chǎn)下仔豬在很短時間內(nèi)由于口服受體阻斷劑而成 為非#感仔豬，應(yīng)用在實際生產(chǎn)中，因而能顯著提高預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水 腫病效果。
受體阻斷劑作為預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水肺病藥物的應(yīng)用 1)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP2，經(jīng)DNA遺傳修飾，其菌林染色體上 的天門冬氨酸半醛脫氳酶管家基因(ASD編碼基因)缺失，構(gòu)建出豬源優(yōu)勢大 腸桿菌益生素林載體菌ASD缺失突變林，經(jīng)體外生長特性，仔豬腸道定植、 定居和增殖試驗檢測和比較，EP2 AASD缺失突變抹和豬源優(yōu)勢大腸桿菌益 生素;f朱EP2在上述特性上基本一致； 2 )表面分泌表達FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisL P重 組載體，經(jīng)重組DNA技術(shù)操作，插入ASD編碼基因于表面分泌表達FedF 和FaeG粘附素亞單位基因的MisL P重組載體的多克隆位點區(qū)域，失活了 原MisL P載體上的抗性基因活性，在工程菌DH5 & ASD缺失突變抹DH5 & △ ASD指示細(xì)胞中篩選出含表達ASD編碼基因和表面分泌表達FedF、 FaeG 粘附素亞單位基因的MisL p重組載體，以ASD存在為篩選標(biāo)志替代抗生 素抗性基因篩選標(biāo)志，且祛除了 MisLP原載體上的氨卞青霉素抗性基因篩 選標(biāo)志；
3)上述益生素重組菌基于非抗生素抗性(ASD編碼基因)為選擇壓力的染色體 一一質(zhì)粒致死平衡系統(tǒng)的載體菌林構(gòu)建，本身不帶有任何抗生素抗性基因 篩選標(biāo)志，因而不會造成任何抗生素耐藥基因在病原菌和動物機體的存在 和傳播。
4 )豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素LP2菌抹能有效促進豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素 EP2和ASD缺失突變林EP2 A ASD重組菌在仔豬腸道的定植、定居和增殖， 能在仔豬腸道很快定植、定居、增殖。
5 )上述受體阻斷劑最早可用于一 日齡仔豬，口服2ml后能在仔豬腸道最早4
小時定植、定居、增殖，因而能顯箸提高預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病 發(fā)生效果。
一日齡仔豬10只口服使用本發(fā)明的2ml受體阻斷劑產(chǎn)品，十五日齡再次口 服2ml ，至三十五日齡時，用F18和K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病原菌人工感染， 沒有一只仔豬發(fā)生仔豬水腫病和出現(xiàn)腹瀉癥狀，攻毒保護率達100%。選擇原先 每窩仔豬通常都發(fā)生斷奶仔豬腹瀉的3個豬場和仔豬水腫病的3個豬場，使用本 發(fā)明的受體阻斷劑產(chǎn)品后，不再發(fā)生斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病。原患有斷奶仔 豬腹瀉仔豬，即使采用常規(guī)治療方法即口服或注射復(fù)合抗生素，療程5 7天， 一般治療效果不佳，大多耐過治愈的仔豬，引發(fā)胃腸道和機體抵抗力下降，易繼 發(fā)或并發(fā)多種疾病，生長較慢，飼料報酬較高，生產(chǎn)性能也會影響，因而生產(chǎn)效 益明顯降低。由于本發(fā)明的受體阻斷劑是一種全新的、非抗生素預(yù)防斷奶仔豬腹 渴和仔豬水腫病策略和途徑，而使用本發(fā)明受體阻斷劑產(chǎn)品后，可望在斷奶仔豬 腹瀉和仔豬水腫病的治療和預(yù)防上大大減少或沒有抗生素使用，也預(yù)期著本發(fā)明 的受體阻斷劑替代基因工程苗和常規(guī)疫苗使用。
權(quán)利要求
1.預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病的受體阻斷劑，其特征在于受體阻斷劑是益生素重組菌組合系列，該益生素重組菌系列為2種豬源優(yōu)勢益生素菌株，其中1種為豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌EP2，第2種為豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌株LP2，豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重組菌內(nèi)含表面分泌表達F18或Fed粘附素亞單位基因FedF，K88或F4或Fae粘附素亞單位基因FaeG的MisL β重組載體，其中粘附素F18分為F18ab和F18ac 2個血清型抗原變種，是由F18產(chǎn)腸毒素大腸桿菌野生型大質(zhì)粒DNA編碼，F(xiàn)18ab質(zhì)粒大小在48和98Mu之間，而F18ac大質(zhì)粒在98Mu左右。粘附素Fed的表達和合成需要大質(zhì)?；蚪M中一組操縱子5個基因共同參與完成，它們分別是FedA、B、C、E和F，其中FedF亞單位為F18大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域，F(xiàn)18ab FedF和F18ab FedF結(jié)合相同的仔豬腸上皮細(xì)胞表面大分子受體，為高度保守的共同功能性粘附素；粘附素K88分為K88ab、K88ac、K88ad 3種血清型抗原變種，是由K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌野生型大質(zhì)粒DNA編碼，由FaeA到FaeJ共10個基因參與其菌毛粘附素的生物合成，其中FaeG亞單位為為K88大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域，結(jié)合仔豬腸上皮細(xì)胞表面大分子受體，為高度保守的功能性粘附素。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的受體阻斷劑的制備方法，其步驟如下(1) 豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP2和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌LP2 分離自仔豬正常小腸粘膜，按常規(guī)細(xì)菌法分離、鑒定，符合大腸桿菌和乳 酸桿菌形態(tài)、培養(yǎng)和生物學(xué)的一般特性，進一步通過仔豬小腸上皮細(xì)胞體 外粘附試驗和體內(nèi)口服后仔豬腸道定植、增殖試驗細(xì)菌數(shù)檢測，篩選出對 小腸上皮細(xì)胞粘附能力強、易能在仔豬腸道定植、定居和增殖的EP2和 LP2 二種細(xì)菌并保存；(2) 選取豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP2，按大腸桿菌常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)和 增殖，選取豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌LP2，按乳酸桿菌常規(guī)培養(yǎng)和增殖；(3 )擴增、鑒定FedF和FaeG亞單位基因，根據(jù)FedF和FaeG基因已知的發(fā)表 序列，以F18ab、 F18ac和K88ac優(yōu)勢血清型大腸桿菌大質(zhì)粒DNA為模板， 采用高保真PCR Kit擴增上述亞單位基因FedF和FaeG,進一步將3，末 端帶有A的PCR片段插入克隆載體pGEM-T,制備轉(zhuǎn)化工程菌DH5 a感受態(tài) 細(xì)菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的重組質(zhì)粒 pGEM-T DNA,序列測定驗證；(4 )表面分泌表達FedF和FaeG亞單位基因的V型分泌系統(tǒng)MisL β重組載體 系統(tǒng)構(gòu)建，按常規(guī)DNA重組技術(shù)操作，將編碼FedF、 FaeG亞單位基因和 V型分泌系統(tǒng)的分泌表達載體MisL β分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI酶切消化、 連接后，分別轉(zhuǎn)化工程菌DH5 a感受態(tài)細(xì)菌，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含 目的片段的陽性質(zhì)粒DNA， PCR檢測，結(jié)合細(xì)菌粘附素凝集反應(yīng)陽性和序 列測定驗證結(jié)果，篩選到能功能性表面分泌表達FedF和FaeG亞單位的V 型分泌系統(tǒng)MisLβ 重組載體；(5)鑒定、克隆編碼大腸桿菌染色體上的天門冬氨酸半醛脫氫酶管家基因即 ASD完整編碼基因根據(jù)上述基因已知的發(fā)表序列，以工程菌DH5a敘染色 體DNA為模板，采用長距離PCR法擴增ASD完整基因，核酸分子雜交檢測，經(jīng)特定的限制性內(nèi)切酶Pstl酶切消化結(jié)合核苷酸序列分析而最后獲得 ASD完整編碼基因，約2Kb大??；(6 )表面分泌表達FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisL p重 組載體系統(tǒng)構(gòu)建。步驟5中表面分泌表達FedF和FaeG祐附素亞單位基因 的MisL p重組載體，經(jīng)重組DM技術(shù)操作，插入ASD編碼基因于步驟5中 MisLp重組載體的多克隆位點區(qū)域，失活了原MisLP載體上的抗性基因 活性，在工程菌DH5 & ASD缺失突變株DH5 & △ ASD指示細(xì)胞中篩選出含表 達ASD編碼基因和表面分泌表達FedF、 FaeG粘附素亞單位基因的MisL P 重組載體，以ASD存在為篩選標(biāo)志替代抗生素抗性基因篩選標(biāo)志，且祛除 了 MisL P原載體上的氨卞青霉素抗性基因歸選標(biāo)志；(7)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重組菌構(gòu)建和篩選，提取含表面分泌表達 FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisLp重組質(zhì)粒載體 DNA，經(jīng)DNA轉(zhuǎn)化法分別導(dǎo)入豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素載體菌EP2內(nèi)，從 篩選的培養(yǎng)菌液中提取舍目的片段的陽性重組質(zhì)粒DNA，結(jié)合細(xì)菌粘附素 凝集反應(yīng)、仔豬小腸上皮細(xì)胞體外粘附試驗和仔豬腸道定植試驗細(xì)菌數(shù)檢 測陽性結(jié)果，篩選出能將FedF和FaeG兩種粘附素亞單位有效和功能性展 呈和分泌表達在仔豬腸道上皮細(xì)胞的EP2重組菌表面；(8 )受體阻斷劑產(chǎn)品制備糸沐步驟(7 )中豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重 組菌和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌LP2單個菌落，在37。C過夜培養(yǎng)18小時菌液作 為種子液，再分別擴大培養(yǎng)、增殖16 18小時，經(jīng)常規(guī)細(xì)菌菌落計數(shù)， 以菌落形成單位cfu度量，濃度達2 6 x 109cfu，重組菌EP2和LP2擴大 培養(yǎng)菌液混合配置而成益生素重組菌系列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的受體阻斷劑作為預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病藥物 的應(yīng)用，其特征在于1)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP2,經(jīng)DM遺傳修飾，即利用A噬菌體 Red重組酶系統(tǒng)和同源重組技術(shù)，缺失其菌林染色體上的天門冬氨酸半醛脫 氫酶管家基因即ASD編碼基因，構(gòu)建出豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌 ASD缺失突變沖朱EP2 △ ASD;2 )表面分泌表達FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisL p重組載體，經(jīng)重組DM技術(shù)操作，插入ASD編碼基因于表面分泌表達FedF和FaeG 粘附素亞單位基因的MisL 3重組載體的多克隆位點區(qū)域，失活了原MisL P 載體上的抗性基因活性，在工程菌DH5 & ASD缺失突變林DH5 & AASD指示細(xì) 胞中篩選出含表達ASD編碼基因和表面分泌表達FedF、 FaeG粘附素亞單位 基因的MisLP重組載體，以ASD存在為篩選標(biāo)志替代抗生素抗性基因篩選 標(biāo)志，且祛除了 MisL p原載體上的氨卞青霉素抗性基因篩選標(biāo)志；3 )豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重組菌基于ASD非抗生素抗性為選擇壓力的染色體_一質(zhì)粒致死平衡系統(tǒng)的載體菌抹構(gòu)建，其系統(tǒng)本身不帶有任何抗生素 抗性基因篩選標(biāo)志；4) 豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌林LP2能有效促進豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2 重組菌和其ASD缺失突變林EP2 △ ASD重組菌在仔豬腸道的定植、定居和增殖；5) 受體阻斷劑產(chǎn)品用于一日齡仔豬，口服2ml 4小時后能在仔豬腸道定植、定 居、增殖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病的受體阻斷劑、制備以及應(yīng)用。本發(fā)明受體阻斷劑是益生素重組菌組合系列，豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌EP2和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌株LP2，表達F18或Fed粘附素亞單位基因FedF，K88或F4或Fae粘附素亞單位基因FaeG的MisLβ重組載體，菌體表面良好展呈表達抗原技術(shù)，仔豬口服后能在腸道很快定植、定居、增殖，且在腸道上皮細(xì)胞表面功能性展呈分泌表達的高度保守的共同功能性粘附素FedF和FaeG，即F18和K88粘附素受體結(jié)合域，優(yōu)先和仔豬腸道上皮細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而控制斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病。解決了現(xiàn)有抗生素臨床治療存在的基本無效，其患水腫病的仔豬病程結(jié)局大多死亡和導(dǎo)致多種耐藥性的缺陷。
文檔編號A61K35/66GK101199556SQ20071019146
公開日2008年6月18日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者原志偉, 張建軍, 朱國強, 朱曉芳, 王建業(yè), 董國雄 申請人:揚州大學(xué)