專利名稱：缺氧誘導真核基因表達載體及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程，特別涉及一種缺氧誘導真核基因表達載體及其用途。
背景技術：
缺氧可51起一 系列的生理反應，如誘導與紅細胞生成和血管生成相關基
因的表達；同時缺氧與許多疾病的發(fā)生也存在著密切的關系，如糖尿病性視 網(wǎng)膜病、中風、關節(jié)炎、缺血性心臟病等。機體對缺氧能夠產(chǎn)生反應是由于 在哺乳動物體內(nèi)廣泛存在著缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor-l,HIF-1),缺氧情況下HIF-1生成增加，可作用于靶基因的缺氧反應 元件(hypoxia responsive element, HRE ),啟動靶基因的轉錄。利用HIF-1/HRE 基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)節(jié)靶基因的轉錄與表達是近年來的研究熱點，并廣泛用于以 缺氧為特征的疾病的基因治療研究，如缺血性心腦血管疾病、腫瘤等。
在基因治療的載體研究中，近年來較為注重組織特異性和基因表達可調(diào) 性的研究。非可調(diào)的基因表達載體，由于基因表達的不可調(diào)控，持續(xù)基因過 表達可能引起一系列副作用，如血管生成因子不可調(diào)表達載體，當基因過表 達時可引起的副作用有血管瘤、視網(wǎng)膜病、關節(jié)炎等，也有引起腫瘤的可負L 因此可調(diào)控的真核基因表達載體(包括病毒載體和質(zhì)粒載體)的研究越來越 受到重3見。
與病毒載體比較，質(zhì)粒載體結構簡單，容易體外構建和大量擴增，使用 方便，不產(chǎn)生免疫排斥等不良反應，也可反復使用；肌肉組織具有自主攝取 棵DNA的特性，通過肌肉注射的方式可使基因?qū)塍w內(nèi)，方法筒便安全，外 源基因也可進行有效的表達。1998年Losordo等人采用含hVEGF^的質(zhì)粒載 體，直接心肌內(nèi)注射治療慢性心肌缺血病人，成功進行了臨床I期試驗，從 而為應用質(zhì)粒載體進4亍缺血性疾病(月支體動脈栓塞疾病、冠狀動脈閉塞性疾 病，腦栓塞疾病等)的基因治療提供了一條新的治療途徑。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是綜合利用上述技術，構建了 一種缺氧誘導真核基因表達 的質(zhì)粒載體。
本發(fā)明的技術內(nèi)容是本發(fā)明構建了一種缺氧誘導真核基因表達載體。 本實驗對pcDM3. 1進行了改造，將其增強子用缺氧誘導的增強子替代，構建 了缺氧誘導基因表達載體；為了檢測缺氧誘導基因表達載體的功能，將 hVEGF165的cDNA插入到載體中，構建了含hVEGF165的缺氧誘導真核基因表達栽 體P6HRE- hVEGF165,并將該載體轉入BHK細胞中，用免疫組化的方法檢測 hVEGF165，證明將該載體可表達外源基因；表達hVEGF的BHK細胞在缺氧環(huán)境 下培養(yǎng)，用ELISA的方法檢測培養(yǎng)上清液中hVEGF的含量，結果證明缺氧誘 導后hVEGF的表達量增加。將p6HRE- hVEGF^用于家兔肢體缺血性疾病的基 因治療，可有效地促進患肢新生血管和側支循環(huán)的形成，使患肢脛動脈壓恢 復。目前，缺氧誘導基因表達載體可用于缺血性疾病的基因治療和腫瘤的基 因治療。
具有缺氧反應元件HRE的真核基因質(zhì)粒表達載體，可在缺氧條件下使基 因表達增強，實現(xiàn)目的基因的可控性表達。將促進血管生成的血管內(nèi)皮細胞 生長因子(VEGF)重組到缺氧誘導真核基因質(zhì)粒載體中，用于缺血性疾病的 基因治療，不僅使用方便安全，也可實現(xiàn)VEGF基因表達的可調(diào)性，如在心肌、 肢體缺血部位局部注射基因，缺氧誘導VEGF基因高表達，促進血管再生，改 善缺血性病變部位的血液供應，從而達到治療目的；當缺氧情況好轉，對基 因誘導作用下降，可減輕或避免由于基因過度表達所致的副作用。這樣不僅 為探索缺血性疾病的基因治療提供了基礎，還為其他與缺氧有關疾病及腫瘤 的基因治療開辟了新的途徑，具有重要的醫(yī)學研究和臨床應用價值。


圖1是缺氧誘導基因表達載體的構建去掉pcDNAll ( + )中的啟動子和增強子序列，用6HRE-CMV^取代,構建 成缺氧誘導真核基因表達載體。 圖2是構建載體過程中應用的載體pEGFP-Nl; 圖3是酶切鑒定載體p6HRE-hVEGF165;
EcoRI : EcoRI雙酶切片段為626 bp和5105 bp Kpnl : Kpnl雙酶切片段為733 bp和4998 bpBamHI :單酶切片段為5731 bp
Sail : 酶切片段為470 bp、 733 bp、 2185 bp和2333 bp Ml 入DNA/Hind III， DNA分子量標準
M2 200, 400, 600, 800， 1200, 1600， 1800 (bp); DNA小分子量
標準
圖4是重組載體DNA序列測定結果序列測定引物5' -GGTCCAGG TAGAGCAGCAAG-3'
5' -AAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTC-3' 圖5是體外轉染BHK細胞及免疫組化結果； BHK細胞hVEGF免疫組化染色 a為陰性對照， b為空載體對照，
c為BHK轉染p6HRE-hVEGFus后hVEGF免疫組化染色 圖6是ELISA ^r測轉染的BHK細胞缺氧誘導分泌hVEGF的情況；
EL ISA纟企測轉染BHK細胞分泌hVEGF的情況
1、陰性對照組2、空載體組 3、 p6服E-hVEGFws組 圖7是家兔脛動脈血壓比值變化圖； 圖8是家兔肢體動脈造影圖； a對照組14天下肢動脈造影 b實驗組(p6HRE-VEGFw組)14天下肢動脈造影 圖9是基因序列。
具體實施例方式
下面結合

本發(fā)明的具體實施方式
。
人工合成41bp的VEGF基因的缺氧反應元件(hypoxia responsive element, HRE)片段(見圖9基因序列),兩端分別加入Xhol和Sal I酶切位 點，經(jīng)磷酸化后在DNA連接酶的作用下使HRE片段進行串聯(lián)連接，將串聯(lián)的 HRE重組到載體pEGFP-Nl (附圖2 )中,'歸選出6HRE,再與啟動子CMV幽連接, 經(jīng)酶切、測序證實序列正確后，用6HRE-CMV^取代pCMV3. 1 ( + )中的啟動子 和增強子序列，構建成缺氧誘導真核基因表達載體(附圖1)。為了檢測缺氧 誘導真核基因表達載體的功能，將hVEGF^的cDNA插入到載體中，構建了含hVEGF^缺氧誘導基因表達載體p6HRE- hVEGF165 ，經(jīng)酶切和測序證實序列正 確。
將重組載體p6HRE- hVEGFw轉染BHK細胞，用免疫組化的方法檢測 hVEGF165，證明將該載體可表達外源基因；表達VEGF的BHK細胞在缺氧環(huán)境 下培養(yǎng)，用ELISA的方法檢測培養(yǎng)上清液中VEGF的含量，結果證明缺氧誘導 后VEGF的表達增加。將p6HRE- hVEGF^用于家兔肢體缺血性疾病的基因治療， 可有效地促進患肢新生血管和側支循環(huán)的形成，使患肢脛動脈壓恢復。
以下是具體的實^r過程。 一、缺氧誘導真核基因表達載體p6HRE的構建和鑒定
1、 將人工合成的41bp的人VEGF-HRE寡核苷酸片段5，端磷酸化、串聯(lián)
連接成重復片段。
分別將人工合成的41bp的人VEGF-HRE寡核苷酸互補片段2. 50D溶
60 ul水中，等體積混合后進行磷酸化反應。磷酸化反應系統(tǒng)為 IOX緩沖液 10 ul
HRE 75 ul
lOmM ATP 10 ul
T4 polynucleotide kinase (5u/ul) 5 ul
共100ul，混勻后37。C保溫24h。 78°C滅活終止反應；用DNA片段純化
試劑盒純化DNA并溶于40ul水中，再進行連接反應，
IOX緩沖液 5 ul
HRE 40 ul
T4連接酶(3u/ul) 、 5 ul
共50ul ， RT過夜。2"/。瓊脂糖凝膠電泳檢測出現(xiàn)不同串聯(lián)數(shù)的HRE。
2、 將串聯(lián)連接的HRE與載體進行連接
用限制性內(nèi)切酶Xho I和Sal I將pEGFP-Nl切開，酶切反應體系為 10x反應緩沖液 2 W
pEGFP-Nl 6 W
Xhol (10u/W) 1.0 W
Sal I (10u/m) 1.0 W
加ddH20 至20 W混勻后37。C水浴消化7h, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切完全后，加入 1/10體積的3M NaAc和2倍體積的無水乙醇沉淀DNA,溶于10ul水中。 將切開的pEGFP-Nl/Xho I-Sal I進行去磷酸化處理，反應體系為
10x反應緩沖液 2 Hl
pEGFP-Nl 10 W
CIAP 1 ul
加ddH20 至20 W
混勻后37。C反應30min， 78。C滅活，乙醇沉淀DNA，溶于10ul水中。 將去磷酸化的pEGFP-Nl/Xho I-Sal I與混合的串聯(lián)HRE進行連接，連接
反應體系為
10x反應緩沖液 1 m
pEGFP-Nl/Xho I-Sal I 1 m
混合的串聯(lián)HRE 6 W
T4DNA連4妄酶 1 W
500雄 1 W
混勻后室溫過夜。用連接產(chǎn)物進行轉化，轉化過程按轉化試劑盒說明操作， 即將10|4連接產(chǎn)物轉化高效感受態(tài)DH-5a細胞100ul，冰浴20min,室溫放 置10min,加入40(^1 LB培養(yǎng)基，37°C 150rpm氣浴培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)lh;取 100-2(%1鋪于含卡那霉素的LB平板，于37。C溫箱培養(yǎng)12-16h。
次曰從含卡那霉素的LB平板上挑取單菌落，接種至5ml的LB培養(yǎng)液中 擴增后小量提取質(zhì)粒DNA，用PCR方法鑒定含6HRE的陽性克隆。PCR引物序 列分別為
上游引物(AK85421 ) TTTAGTGAACCG TCAGATCCGC 下游引物(AO 5 4 2 2 ) CTCCTCGCCCTTGCTCACCAT PCR反應體系:^下
質(zhì)粒腿 0.4 W
10x反應纟爰沖液 5 W
AK85421(10pmol/ul) 1 ul
AK85422 (10pmol/ul) 1 ul
dNTP 1 ulTaq DNA聚合酶(5u/ul) 0.4 ul
ddH20 至50 W
PCR的條件為94。C 6min; 94。C 30sec, 56。C 30sec， 72°C 30sec， 35個循 環(huán)；72°C 5min。 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物片斷為349bp; 將PCR鑒定正確的質(zhì)粒進行序列測定，并證實序列正確。 3、將CMV啟動子插入到含6HRE的陽性克隆
將pEGFP-6HRE分別用Kpnl和Apal進行酶切，酶切過程及反應為 質(zhì)粒pEGFP-6HRE 6 W
lOx反應H沖液 2 ul
Apal (10u/W ) 2 ul
ddH20 至20W
混勻后37。C水浴消化6h, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切完全后，乙醇沉淀DNA, 溶于10 W水中，再用Kpnl酶切，反應體系為
質(zhì)粒pEGFP-6HRE/Apal 10 W
10x反應緩沖液 2 ul
Kpnl (10u/m ) 2 ul
ddH20 至20W
混勻后37°C水浴消化6h, ly。瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切完全后，乙醇沉淀DNA。 從本室構建的含CMVmin的載體pcDNA3. l-CMVmin中分別用Kpnl和Apal 進行酶切，得到191bp的CMVmin片段，(CMVmin/Kpnl-Apal， 191bp);將 CMV啟動子插入pEGFP-6HRE中與6服E連接，連接反應體系為
10x反應緩沖液 1 m
pEGFP-6HRE / Kpnl-Apal 1 W
CMVmin/Kpnl-Apal 3 W
T4 DNA連接酶 1 Ml
50%PEG: 1 W
ddH20 至10 W
混勻后室溫過夜。取10m連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌感受態(tài)DH-5ot細胞，取 100-20(mi鋪平板，于37。C溫箱培養(yǎng)過夜，應用卡那霉素篩選陽性轉化子。 次曰從含卡那霉素的LB平板上挑取單菌落，接種至5ml的LB培養(yǎng)液中擴增后小量提取質(zhì)粒，用PCR鑒定含6HRE-CMV的陽性克隆。引物為AK85421 和AK85422, PCR擴增產(chǎn)物片段長度為532bp; PCR鑒定正確的質(zhì)粒進行測序 鑒定，并證實序列正確，得到pEGFP-6HRE-CMV。 4、用6HRE-CMV替換pcDNA3. 1 (+)中的增強子
將pEGFP-6HRE-CMV先用Xhol進行酶切，再用T4 DNA聚合酶補平末端， 而后用BamH I進行酶切，得到長度為461bp的片段。酶切反應為 pEGFP-6HRE-CMV 5 W
10x反應緩沖液 2 ul
Xhol (10u/W ) 2 ul
ddH20 至20 W
混勻后37。C水浴消化7h, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切完全后，乙醇沉淀 DNA,溶于IO W水中，進行末端補平；
質(zhì)粒pEGFP-6肌E-CMV/Xho1 10 W 10x反應》爰沖液 2 ul
dNTP 0.4 ul
T4 DNA聚合酶 1. 5 ul
ddH20 至20W
混勻后12。C水浴反應20min,乙醇沉淀DNA，溶于10 W水中，用BamH I 進行酶切；
質(zhì)粒pEGFP-6HRE-CMV/Xho1 10 W
10x反應緩沖液 2 ul
BamH I (10u/W ) 2 ul
ddH20 至20W
混勻后37t:水浴消化8h， 1°/ 瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切完全后，玻璃奶法 回收6HRE-CMV片#爻(461bp)。
玻璃奶法回收純化DM片段用玻璃奶回收試劑盒，按操作說明進行回收，
即
(1) DNA酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外燈下切取目的DNA條 帶。
(2) 加入3倍體積的溶膠液，50。C保溫3min，其間輕搖幾次使膠完全溶化。(3) 加入混勻的玻璃奶,顛倒混勻，冰浴10min，每隔2-3min混勻 一次。 12000rpm離心30s，棄上清。
(4) 加漂洗液250W，混勻后12000rpm離心30s，吸棄上清。
(5) 重復步驟(4),盡量吸盡漂洗液。置于37。C溫箱干燥約15-20min。
(6) 加滅菌蒸餾水20W,混勻，60。C水浴5min, 12000rpm離心lmin，回收 含DNA片段的上清液備用。
將pcDNA3. 1先用Mlul進行酶切，再用T4DNA聚合酶補矛末端，而后用 BamH I進行酶切，得到長度為4731bp的載體片段。酶切反應為
pc腿3. 1+ 5 W
10x反應J爰沖液 2 ul
Mlul (10u/Ml ) 2 ul
ddH20 至20 W
混勻后37t:水浴消化6h, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切完全后，乙醇沉淀DNA, 溶于10 W水中，進行末端補平；
質(zhì)粒pc艦3. 1 /Mlul 10x反應緩沖液
dNTP
T4 DNA聚合酶 細20
混勻后12。C水浴反應20min 進行酶切；
質(zhì)粒pcDNA3， 1/Mlul 10x反應緩沖液
BamH I (10u/W ) ddH20
混均后37。C水浴消化6h, 收4731bp的載體片段。
將插入片段6HRE-CMV片段(461bp)與4731bp的載體片段進行連接， 連接反應為
pcDNA3. 1/平端-BamH I 2 ul
10 W 2 ul 0. 4 ul 1.5 ul 至20 W
乙醇沉淀DNA,溶于10 m水中，用BamH I
10 W 2 ul 2 ul
至
1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切完全后，玻璃奶法回6HRE- CMV片段 10x反應緩沖液
DNA連4妄酶 ddH20
4 W 1 ul 1 ul 至10 W
混勻后室溫過夜。取l(mi連接產(chǎn)物轉化高效感受態(tài)DH-5oc細胞。用 100-20(mi鋪板，于37。C溫箱培養(yǎng)12-16h,應用氨爺青霉素篩選陽性轉化子。 用酶切方法鑒定正確后，送公司進行序列測定，并證實序列正確，得到缺氧 誘導真核表達載體p6HRE-CMV。 5、將hVEGF165的cDNA重組到p6HRE-CMV:
為了便于檢測載體功能，將hVEGF^插入p6HRE-CMV中。p6HRE-CMV分別 用EcoRI和Apal進4亍酶切，酶切反應為
質(zhì)4立p6HRE-CMV 6 W
10x反應緩沖液 2 ul
Apal (10u/m ) 2 ul
ddH20 至20W 混勻后37。C水浴消化7h， 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切完全后，乙醇沉淀DNA, 溶于10 W水中，再用Kpnl酶切，酶切反應為
質(zhì)粒p6HRE-CMV/Apal 10 W
10x反應緩沖液 2 ul
EcoRI (10u/m ) 2 ul
ddH20 至20m
混勻后37。C水浴消化7h， 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切完全后，乙醇沉淀DM。
將本室構建的含VEGF的載體pEGFP-V分別用EcoRI和Apal進行酶切， 得到600bp的hVEGF片段,作為插入片段；將VEGF與p6HRE-CMV進行連接， 連接反應體系為
10x反應緩沖液1 W
p6匿-CMV/EcoRI-Apal1 m
VEGF-cDNA插入片段3 W
T4 DNA連接酶1 W
50%PEG:1 WddH20 至10 m
混勻后室溫過夜。取10W連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌感受態(tài)DH-5oc細胞，取. 100-20(H4鋪平板，于37。C溫箱培養(yǎng)過夜，應用氨千青霉素篩選陽性轉化子 p6HRE-hVEGF165。
次曰從含氨芐青霉素的LB平板上挑取單菌落，接種至5ml的LB培養(yǎng)液 中擴增后小量提取質(zhì)粒，用酶切的方法鑒定陽性克隆。
酶切反應為
質(zhì)粒MA 「1 W
10x反應緩沖液 1 ul
限制性內(nèi)切酶 1 ul
ddH20 至10 W
混勻后37。C水浴消化4h, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。
用BamH I單酶切，DNA片段為5732bp,用EcoR I雙酶切為626bp和
5106 bp 、 Kpn I雙酶切為734bp和4998bp、 Sail酶切為470 bp、 733 bp、
2185 bp和2333 bp (圖3 )。
酶切鑒定正確的質(zhì)粒進行測序鑒定，并證實序列正確(圖4),得到重組
載體p6HRE-hVEGF165。測列引物為 5' -GGTCCAGGTAGAGCAGCAAG-3'和5'
-AAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTC-3'
二、 質(zhì)粒DNA的大量提取和純化
按QIAGEN質(zhì)粒純化試劑盒說明，將鑒定正確的重組質(zhì)粒進行提取純 化，得到純化的質(zhì)粒p6HRE-hVEGF,65和空載體；經(jīng)酶切鑒定正確；用紫外 分光光度計測定A26。/A訓為1. 8-2. 0。
三、 基因轉染和穩(wěn)定轉染細胞的篩選及鑒定
1、 BHK細胞的培養(yǎng)
倉鼠腎細胞系BHK-21為本室保存。用含10%胎牛血清的高糖DMEM (Invitrogen)在37°C、 5%0)2的條件于細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，至對數(shù)生 長期時備用。
2、 脂質(zhì)體介導的DNA轉染及穩(wěn)定轉染BHK細胞抹的篩選
將細胞分為三組對照組(BHK細胞)
空載體組(轉入空載體的BHK細胞)實驗組(轉入p6HRE-hVEGF165的BHK細胞) 轉染前一天將BHK細胞用0. 25°/。胰酶(0. 02%EDTA)消化，細胞計數(shù)后按 5X107ml傳代至6孔培養(yǎng)板，細胞長滿至80-90%時轉染相應的質(zhì)粒DNA， 轉染方法按細胞轉染試劑LipofectaMine2000的i兌明書操作。 轉染后將細胞;^文入37°C、 5WX)2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24h后胰酶消化 傳代并用含G^ ( 800u/ml )的高糖DMEM完全培養(yǎng)液進行壓力篩選，每3 天換液1次，約10-14天得到相應的穩(wěn)定表達外源基因的抗性細胞克隆， 繼續(xù)用含G418的培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)，得到穩(wěn)定表達外源基因的抗性細胞林， 即分別含p6HRE-VEGF和空栽體的陽性細胞才朱。 3、穩(wěn)定轉染BHK細胞抹的鑒定
將細胞培養(yǎng)于蓋玻片上，用1. 5%多聚曱醛固定，采用ABC免疫組化 的方法4企測VEGF的表達，具體操作按ABC試劑盒說明書操作， 一抗為抗 hVEGF抗體。免疫組化具體梯:作為
(1) 室溫下固定30min，用PBS洗片5 min X ,3;
(2) 加PBST 室溫30min,用PBS洗片5 min X 3
(3) 3訓202去離子水，室溫10min，消除內(nèi)源性過氧化物酶。 蒸餾水沖洗5min， PBS洗2min x 3。
(4) 5%正常山羊血清室溫封閉30min。
(5) 去除封閉液，加鼠抗人VEGF單克隆抗體(1:400 )，于濕盒中4。C孵育 過夜。
(6) PBS洗5minx3。
(7) 滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG ( 1:200 )，于濕盒中室溫粹 育30min, PBS洗5min x 3。
(8) 滴加DAB顯色液，鏡下觀察顯色情況。
(9) 蘇木精輕度復染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。 免疫組化結果證明重組載體p6HRE-hVEGF"5可表達目的基因VEGF (圖5)。
四、ELISA (雙抗體夾心法)檢測缺氧誘導后VEGF的表達
接種相同數(shù)目(5X105/ml )的、并轉染了 p6HRE hVEGF^和空載體的BHK 細胞于35mm培養(yǎng)亞內(nèi)，細胞貼壁后將培養(yǎng)基中的胎牛血清降至2%,將細胞分為兩組分別置于常氧和低氧(用封口膜將平皿密封)培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng) 上清液，用人VEGF定量ELISA檢測試劑盒分別測定標準品及培養(yǎng)上清液中 VEGF的含量，具體操作按ELISA試劑盒說明書操作。
實驗結果表明正常BHK和轉染空載體的細胞內(nèi)hVEGF^表達不受缺氧所誘 導，所測得的VEGF含量基本一致，可能為血清中所含VEGF的量；缺氧狀態(tài) 下，p6HRE-hVEGFw表達增高(圖6 )。 五、家兔肢體缺血性疾病的基因治療實驗
1、 動物模型制作
用1 %戊巴比妥鈉按30 mg/ kg靜脈麻醉動物后暴露股動脈，自腹股溝韌 帶至膝部內(nèi)側，行左下肢股動脈及其分支切斷剔除術，制作下肢閉塞性血管 病模型。所有動物在術后即出現(xiàn)左下肢的跛行，皮膚蒼白，皮溫低。
2、 基因轉移
40只新西蘭兔進行血管切斷剔除術后立即注射質(zhì)粒DNA或生理鹽水。將 動物隨機分成3組，分別給與生理鹽水(生理鹽水組22只)、質(zhì)粒p6HRE -hVEGF165(轉基因組或VEGF組10只)或pcDNA3. 1空載體(空載體組8只)， DNA量為400ug/ kg多點注射于股動脈供血區(qū)的大腿^L肉群。
3、 臨床纟企測
每只動物術后進行臨床檢測，包括患肢狀況(肢體活動狀況、肢體有無 潰瘍、足趾壞疽、脫落等)、小腿脛動脈血壓測量和動脈造影。
術后生理鹽水組出現(xiàn)5例感染和6例不同程度的組織壞死；空載體組出 現(xiàn)2例感染，l例肢端缺血性壞死；VEGF組未出現(xiàn)傷口感染和肢端缺血性壞 死，且術后恢復較對照組快。
所有動物脛動脈血壓率(L/R)均顯著降低，VEGF組在術后14d可檢測 到患肢脛動脈血壓，血壓率隨后逐漸增加，到術后8周患肢脛動脈血壓恢復 到正常。生理鹽水組和空載體組合稱對照組，于術后21d才可探測到患肢脛 動脈的搏動，術后3月脛動脈壓恢復正常(圖7)。 動脈造影可見實驗組新 生血管和側支循環(huán)的形成均較對照組明顯(圖8)。
結果表明，缺氧誘導基因表達載體p6HRE - hVEGF165在體外可被缺氧所 誘導，使目的基因表達增強；在家兔肢體缺血性疾病的基因治療實驗中，可 有效地促進患肢的新生血管和側支循環(huán)的形成，使患肢脛動脈壓恢復。
權利要求
1、一種缺氧誘導真核基因表達載體，其特征在于所述發(fā)明對pcDNA3.1進行了改造，將其增強子用缺氧誘導的增強子替代，構建了缺氧誘導基因表達載體；為了檢測缺氧誘導基因表達載體的功能，將hVEGF165的cDNA插入到載體中，構建了含hVEGF165的缺氧誘導真核基因表達載體p6HRE-hVEGF165，并將該載體轉入BHK細胞中，用免疫組化的方法檢測hVEGF165，證明將該載體可表達外源基因；表達VEGF的BHK細胞在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)，用ELISA的方法檢測培養(yǎng)上清液中VEGF的含量，結果證明缺氧誘導后VEGF的表達量增加。
2、 一種缺氧誘導真核基因表達載體的用途，其特征在于所述發(fā)明可以用 于缺血性疾病的基因治療和腫瘤的基因治療。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種缺氧誘導真核基因表達載體及其用途。所述發(fā)明對pcDNA3.1進行了改造，將其增強子用缺氧誘導的增強子替代，構建了缺氧誘導基因表達載體；為了檢測缺氧誘導基因表達載體的功能，將hVEGF₁₆₅的cDNA插入到載體中，構建了含hVEGF₁₆₅的缺氧誘導真核基因表達載體p6HRE-hVEGF₁₆₅，并將該載體轉入BHK細胞中，用免疫組化的方法檢測hVEGF₁₆₅，證明將該載體可表達外源基因；表達hVEGF的BHK細胞在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)，用ELISA的方法檢測培養(yǎng)上清液中hVEGF的含量，結果證明缺氧誘導后hVEGF的表達量增加；將p6HRE-hVEGF₁₆₅用于家兔肢體缺血性疾病的基因治療，可有效地促進患肢新生血管和側支循環(huán)的形成，使患肢脛動脈壓恢復。本發(fā)明可用于缺血性疾病的基因治療和腫瘤的基因治療，它不僅為探索缺血性疾病的基因治療提供了基礎，還為其他與缺氧有關疾病及腫瘤的基因治療開辟了新的途徑。
文檔編號A61K48/00GK101532027SQ20071019576
公開日2009年9月16日 申請日期2007年12月14日 優(yōu)先權日2007年12月14日
發(fā)明者武文琦, 殷愛紅, 鄭少鵬 申請人:首都醫(yī)科大學