專(zhuān)利名稱(chēng)：豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種白介素-12的應(yīng)用，具體涉及一種豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑及制備 方法。
背景技術(shù)：
迄今為止，許多傳染性疾病尚未得到有效防治，現(xiàn)行的滅活疫苗或弱毒疫苗等傳統(tǒng)疫苗 或免疫效力低下，或存在安全性問(wèn)題，促使人們開(kāi)發(fā)安全有效的新型疫苗。基于重組DNA技 術(shù)的基因工程疫苗安全可靠、易于鑒別診斷，具有很大的應(yīng)用前景，但其抗原性一般較弱， 需要有效的免疫佐劑以增強(qiáng)其保護(hù)效力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)pIL-12在豬各種疾病中的免疫調(diào)節(jié)作用，以及開(kāi)發(fā)治療免疫功能 紊亂的免疫調(diào)節(jié)劑及某些炎性疾病的抗炎防治劑，提供了一種豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑 及制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為 一種豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑，pIL-12包括兩個(gè)亞基的編碼 基因p35和p40， p35編碼基因大小為720bp， p40為1044bp,分別編碼223個(gè)氨基酸和325 個(gè)氨基酸的多肽。
一種豬疫苗使用的PIL-12基因佐劑的制備方法，從LPS活化的豬外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC)提取總RNA，用RT-PCR方法擴(kuò)增出pIL-12兩個(gè)亞基的編碼基因p35和p40，然 后將p35基因和p40基因分別亞克隆到原核表達(dá)載體pET30c、 pET30b中，克隆pIL-12基因。
優(yōu)選的是，所述的RNA的提取過(guò)程為從豬前腔靜脈采血，然后用淋巴細(xì)胞分離液分離 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并加LPS于細(xì)胞培養(yǎng)液，分別 取誘導(dǎo)2小時(shí)和12小時(shí)的細(xì)胞，用Trizol試劑盒提取總RNA。
4優(yōu)選的是，所述的RPMI1640培養(yǎng)基含有10U/ml青霉素、10U/ml鏈霉素和10%胎牛血清。
優(yōu)選的是，所述的RT-PCR方法為分別取誘導(dǎo)2小時(shí)和12小時(shí)的細(xì)胞所提取的總RNA， 加入適量下游引物P2、 P4，然后分別加入dNTP、 10Xbuffer、 RNasin、 AMV反轉(zhuǎn)錄酶，再 加入適量的Ex.Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，組成2個(gè)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增體系，合成p35和p40 的PCR產(chǎn)物p35 cDNA和p40 cDNA。擴(kuò)增結(jié)束后取5mL混合物，利用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行 電泳。將p35和p40的PCR產(chǎn)物分別用BamHI和EcoRI酶切鑒定。
優(yōu)選的是，所述的擴(kuò)增體系包括p35擴(kuò)增體系和p40擴(kuò)增體系，p35擴(kuò)增體系的反應(yīng)條 件為預(yù)加熱95。C5min，然后94°C lmin， 54°C lmin， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)，最后72。C延 伸10min; p40擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件與p35相似，不同之處是退火溫度為56°C。
優(yōu)選的是，所述的克隆pIL-12基因的過(guò)程為取和Sa/I酶切處理的原核表達(dá)載體 pET30c、 pET30b和p35或p40的PCR產(chǎn)物，分別加入T4 DNA連接酶和10Xbuffer,組成兩 個(gè)連接反應(yīng)體系，16'C進(jìn)行12小時(shí)連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡工0// JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑 取陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒。
優(yōu)選的是，所述的克隆的鑒定為將提取的質(zhì)粒用PCR和SacI、 Sa/I雙酶切進(jìn)行鑒定并 篩選陽(yáng)性克隆。
本發(fā)明的有益效果為白細(xì)胞介素-12 (IL-12)又名NK細(xì)胞刺激因子(NKSF)或細(xì)胞 毒淋巴細(xì)胞成熟因子(CLMF),能誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN- Y ，并增強(qiáng)其細(xì)胞毒活性， 它的關(guān)鍵作用是能誘導(dǎo)ThO細(xì)胞分化為T(mén)hl細(xì)胞以激發(fā)細(xì)胞免疫進(jìn)程。IL-12是啟動(dòng)保護(hù)性 細(xì)胞免疫的有效佐劑，在調(diào)節(jié)機(jī)體非特異性和特異性免疫方面具有重要作用，其調(diào)節(jié)方式主 要通過(guò)刺激NK細(xì)胞和細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞來(lái)完成。IL-12能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方向，這為細(xì)胞因子 佐劑應(yīng)用于滅活疫苗提供了理論基礎(chǔ)。按預(yù)期反應(yīng)類(lèi)型來(lái)調(diào)節(jié)保護(hù)性免疫，即調(diào)控疫苗誘導(dǎo) 的免疫反應(yīng)，使之朝細(xì)胞免疫為主的方向發(fā)展而不是體液免疫為主的方向發(fā)展，這在開(kāi)發(fā)以 細(xì)胞免疫為主的感染性疾病的有效疫苗方面很有意義。


圖l為本發(fā)明具體實(shí)施例p35/pET30c的構(gòu)建示意圖；圖2為本發(fā)明具體實(shí)施例p40/pET30b的構(gòu)建示意圖3為本發(fā)明具體實(shí)施例P35亞基的基因序列及預(yù)測(cè)蛋白的氨基酸序列圖4為本發(fā)明具體實(shí)施例P40亞基的基因序列及預(yù)測(cè)蛋白的氨基酸序列圖。
具體實(shí)施例方式
如圖1至4所示，本發(fā)明的具體實(shí)施例， 一種豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑，pIL-12 包括兩個(gè)亞基的編碼基因p35和p40, p35編碼基因大小為720bp， p40為1044bp，分別編碼 223個(gè)氨基酸和325個(gè)氨基酸的多肽，序列分析顯示，pIL-12的p35亞基基因序列與GenBank 發(fā)表的完全一致，而p40亞基基因與GenBank發(fā)表的只有微小差異，提示p40基因可能存在 多態(tài)性。然后將p35基因和p40基因分別亞克隆到原核表達(dá)載體pET30c、 pET30b中，用IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別表達(dá)出了預(yù)期分子量大小的重組蛋白。
一種豬疫苗使用的PIL-12基因佐劑的制備方法，從LPS活化的豬外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC)提取總RNA，用RT-PCR方法擴(kuò)增出pIL-12兩個(gè)亞基的編碼基因p35和p40，然 后將p35基因和p40基因分別亞克隆到原核表達(dá)載體pET30c、 pET30b中，克隆pIL-12基因。
RNA的提取過(guò)程為從豬前腔靜脈采血，然后用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC)，用RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并加LPS于細(xì)胞培養(yǎng)液，分別取誘導(dǎo)2小時(shí)和 12小時(shí)的細(xì)胞，用Trizol試劑盒提取總RNA。所述的RPMI1640培養(yǎng)基含有10U/ml青霉素、 10U/ml鏈霉素和10%胎牛血清。
RT-PCR方法為分別取誘導(dǎo)2小時(shí)和12小時(shí)的細(xì)胞所提取的總RNA，加入適量下游 引物P2、 P4，然后分別加入dNTP、 10Xbuffer、 RNasin、 AMV反轉(zhuǎn)錄酶，再加入適量的Ex.Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，組成2個(gè)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增體系，合成p35和p40的PCR產(chǎn)物p35 cDNA 和p40cDNA。擴(kuò)增體系包括p35擴(kuò)增體系和p40擴(kuò)增體系，p35擴(kuò)增體系的反應(yīng)條件為預(yù) 加熱95。C5min，然后94。C lmin， 54°C lmin， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸10min; p40擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件與p35相似，不同之處是退火溫度為56°C。擴(kuò)增結(jié)束后取5pL混合 物，利用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。將p35和p40的PCR產(chǎn)物分別用BawHI和EcoRI酶切 鑒定。
克隆pIL-12基因的過(guò)程為取和酶切處理的原核表達(dá)載體pET30c、 pET30b 和p35或p40的PCR產(chǎn)物，分別加入T4 DNA連接酶和lOXbuffer，組成兩個(gè)連接反應(yīng)體系，16'C進(jìn)行12小時(shí)連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.0^ JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌落，提取 質(zhì)粒。
克隆的鑒定為將提取的質(zhì)粒用PCR和SacI、 Sfl/I雙酶切進(jìn)行鑒定并篩選陽(yáng)性克隆。
權(quán)利要求
1. 一種豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑，其特征在于pIL-12包括兩個(gè)亞基的編碼基因p35和p40，p35編碼基因大小為720bp，p40為1044bp，分別編碼223個(gè)氨基酸和325個(gè)氨基酸的多肽。
2. —種豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑的制備方法，其特征在于從LPS活化的豬外周血 單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)提取總RNA，用RT-PCR方法擴(kuò)增出pIL-12兩個(gè)亞基的編碼基 因p35和p40,然后將p35基因和p40基因分別亞克隆到原核表達(dá)載體pET30c、 pET30b 中，克隆pIL-12基因。
3. 如權(quán)利要求2所述的豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑的制備方法，其特征在于所述的 RNA的提取過(guò)程為從豬前腔靜脈采血，然后用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并加LPS于細(xì)胞培養(yǎng)液，分別取誘導(dǎo)2小 時(shí)和12小時(shí)的細(xì)胞，用Trizol試劑盒提取總RNA。
4. 如權(quán)利要求2所述的豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑的制備方法，其特征在于所述的 RPMI1640培養(yǎng)基含有10U/ml青霉素、10U/ml鏈霉素和10%胎牛血清。
5. 如權(quán)利要求2所述的豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑的制備方法，其特征在于所述的 RT-PCR方法為分別取誘導(dǎo)2小時(shí)和12小時(shí)的細(xì)胞所提取的總RNA，加入適量下游引 物P2、 P4，然后分別加入dNTP、 lOXbuffer、 KNasin、 AMV反轉(zhuǎn)錄酶，再加入適量的 Ex.TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，組成2個(gè)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增體系，合成p35和p40的PCR 產(chǎn)物p35 cDNA和p40 cDNA。擴(kuò)增結(jié)束后取5pL混合物，利用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電 泳。將p35和p40的PCR產(chǎn)物分別用Ba/wHI和EcoRI酶切鑒定。
6. 如權(quán)利要求5所述的豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑的制備方法，其特征在于所述的 擴(kuò)增體系包括p35擴(kuò)增體系和p40擴(kuò)增體系，p35擴(kuò)增體系的反應(yīng)條件為預(yù)加熱95t: 5min，然后94°C lmin， 54°C lmin, 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min; p40 擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件與p35相似，不同之處是退火溫度為56°C。
7. 如權(quán)利要求2所述的豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑的制備方法，其特征在于所述的 克隆pIL-12基因的過(guò)程為取和Safl酶切處理的原核表達(dá)載體pET30c、 pET30b 和p35或p40的PCR產(chǎn)物，分別加入T4 DNA連接酶和10Xbuffer，組成兩個(gè)連接反應(yīng) 體系，16'C進(jìn)行12小時(shí)連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E,co// JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性 菌落，提取質(zhì)粒。
8. 如權(quán)利要求2所述的豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑的制備方法，其特征在于所述的 克隆的鑒定為將提取的質(zhì)粒用PCR和S"cI、 S"/I雙酶切進(jìn)行鑒定并篩選陽(yáng)性克隆。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬疫苗使用的pIL-12基因佐劑及制備方法，pIL-12包括兩個(gè)亞基的編碼基因p35和p40；從LPS活化的豬外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)提取總RNA，用RT-PCR方法擴(kuò)增出pIL-12兩個(gè)亞基的編碼基因p35和p40，然后將p35基因和p40基因分別亞克隆到原核表達(dá)載體pET30c、pET30b中，克隆pIL-12基因。IL-12是啟動(dòng)保護(hù)性細(xì)胞免疫的有效佐劑，在調(diào)節(jié)機(jī)體非特異性和特異性免疫方面具有重要作用，其調(diào)節(jié)方式主要通過(guò)刺激NK細(xì)胞和細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞來(lái)完成。IL-12能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的方向，這為細(xì)胞因子佐劑應(yīng)用于滅活疫苗提供了理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K39/39GK101468202SQ200710306038
公開(kāi)日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2007年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日
發(fā)明者溫建新, 峰 邵 申請(qǐng)人:邵 峰;溫建新