專利名稱：使用e09和丙二醇治療膀胱癌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用E09配制品治療膀胱癌及其方法。本發(fā)明利用丙二醇 濃縮液和/或NAD(P)H:醌氧化還原酶-1 (NQOl)、細(xì)胞色素P450氧化還 原酶(P450R)和葡萄糖運(yùn)載體1 (Glut-1)在人體膀胱移行細(xì)胞癌中的蛋 白表達(dá)，從而提供以個(gè)體為耙向的膀胱癌治療。
背景技術(shù)：
膀胱癌是全世界第七大癌癥。2000年，膀胱癌是當(dāng)年英國男性中被診 斷的9,000個(gè)新癌癥病例中的第四大癌癥[l]。估計(jì)2002年歐洲有280,000 例膀胱癌，2004年美國有60,000多的新病例。
膀胱癌的最常見類型(約90%)是移行細(xì)胞癌(TCC)，其由膀胱上 皮衍生，所述膀胱上皮為尿道系統(tǒng)(輸尿管、膀胱和尿道)的細(xì)胞襯里。 移行細(xì)胞癌(TCC)可被分類為淺表性(pTa和PT1)或肌層浸潤性" pT2)。目前淺表性TCC的治療是經(jīng)尿道切除術(shù)(TURBT;即手術(shù)切除所 有可見病灶)，接著佐以化學(xué)療法或免疫療法。這種治療方法的有效性通 過如下證明與單獨(dú)的TURBT相比，觀察到佐以化學(xué)療法后淺表性腫瘤 的復(fù)發(fā)顯著降低了[2]。盡管常規(guī)使用諸如絲裂霉素C (MMC)、表阿霉 素和ECG的試劑，但是人們廣泛認(rèn)識到需要開發(fā)一種更有效和/或毒性更 低的抗TCC試劑，或者對可能受益的個(gè)體(或病理子群)進(jìn)行靶向治療來 說，能更好地使用當(dāng)前療法。
絲裂霉素C (MMC)是一種天然存在的醌基抗腫瘤試劑，其屬于一類被稱為生物還原藥物的化合物[3]。 一般而言，生物還原藥物是前藥(prodrug) ，其需要代謝活化作用從而產(chǎn)生細(xì)胞毒素代謝物，并且原則上都被 設(shè)計(jì)成根除存在于固體腫瘤的不利灌注區(qū)中的缺氧細(xì)胞。然而，這些藥物 也可以以腫瘤中的有氧部分為目標(biāo)。
測定醌基生物還原藥物的細(xì)胞毒素選擇性(即，缺氧腫瘤細(xì)胞與有氧
腫瘤細(xì)胞之間)的關(guān)鍵參數(shù)是還原前藥所需特定還原酶的存在和分子氧
反轉(zhuǎn)活化過程的能力[4,5](盡管在測定細(xì)胞殺傷中還原酶和氧壓的相對作 用依賴于所討論的化合物而發(fā)生變化[4,6])。在TCC治療中常規(guī)使用 MMC的事實(shí)暗示了，這種疾病不僅具有生物還原活化作用所需的適當(dāng)生 物化學(xué)機(jī)能，而且這類化合物中的其它化合物也可用于治療這種疾病。同 樣可用的其它化合物的兩個(gè)實(shí)例包括H引哚醌衍生物E09和氮雜環(huán)丙烷基苯
醌RH1[7，8]。
正如所記載的，醌基生物還原藥物根除有氧細(xì)胞或缺氧細(xì)胞的能力主 要取決于，腫瘤酶學(xué)(包括存在的還原酶)和缺氧之間的復(fù)雜關(guān)系。已暗 示了在生物還原藥活化過程中的數(shù)種還原酶[4,6]，但是注意力主要集中到 了細(xì)胞色素P450氧化還原酶(P450R)禾卩NAD(P)H:醌氧化還原酶-1 (NQOl)。關(guān)于缺氧的測量，已表明諸如葡萄糖運(yùn)載體1 (Glut-1)或碳 酸酐酶IX (CAIX)之類的內(nèi)生標(biāo)記物與諸如哌莫硝唑(pimonidazole)之 類的外生缺氧標(biāo)記物相關(guān)[9，10]。因此，在淺表性和浸潤性膀胱移行細(xì)胞 癌(TCC)中腫瘤缺氧和上述兩種重要還原酶的表達(dá)之間的關(guān)系非常重 要。而且，以淺表性腫瘤或肌層浸潤性腫瘤為目標(biāo)，需要使用具有不同滲 透譜(penetration profile)的膀胱癌治療藥學(xué)制劑。本發(fā)明涉及膀胱癌治 療的上述方面。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)現(xiàn)在淺表性腫瘤和肌層浸潤性腫瘤之間NQOl表達(dá)上具有顯著差 異，觀察到浸潤性腫瘤中表達(dá)水平較低。與此相反，P450R和Glut-l在 TCC的所有階段和等級中表達(dá)，但是表達(dá)隨著腫瘤階段而增強(qiáng)(特別在 Glut-l的情況下)。另外，Glut-1表達(dá)在G3腫瘤中顯著增強(qiáng)，但是存在低
水平的NQOl。這些結(jié)果表明，在淺表性和浸潤性膀胱TCC之間，NQOl 和Glut-l的表達(dá)存在明顯差異。另外，發(fā)現(xiàn)了具有不同滲透譜的醌基生物 還原藥物的藥物制劑。
這些結(jié)果對醌基生物還原藥物的治療意義在于對于淺表性疾病，單
一試劑療法是適當(dāng)?shù)?，而對于肌層浸潤性疾病，需要使用以缺氧部分為?向的醌和根除有氧部分的其它治療方式的組合療法。而且當(dāng)治療淺表性膀 胱癌時(shí)，可以采用具有較低滲透譜的藥學(xué)制劑，而當(dāng)治療浸潤更多肌層的 膀胱癌時(shí)，可以采用具有較高滲透譜的藥學(xué)制劑。將本發(fā)明的這些方面合 起來考慮，通過為個(gè)體疾病的特定特征設(shè)計(jì)癌癥療法，從而為膀胱癌的治 療提供了重要的推動(dòng)作用。
具體地，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括治療膀胱癌的方法，所述方法包
括測定腫瘤中至少一種酶的水平；基于該至少一種酶的水平選擇療法， 其中，所述療法包括單獨(dú)施予醌基生物還原藥物或與其它療法組合施予
醌基生物還原藥物。
在另一實(shí)施方式中，所述酶選自NAD(P)H:醌氧化還原酶-1 (NQOl) 和NADPH細(xì)胞色素P450氧化還原酶(P450R)。在一具體實(shí)施方式
中， 所述酶是NQOl，所述療法包括單獨(dú)施予醌基生物還原藥物。在另一具 體實(shí)施方式中，所述酶是NQOl，所述療法包括與其它療法組合施予醌 基生物還原藥物。在另一具體實(shí)施方式
中，所述酶是P450R，所述療法包 括單獨(dú)施予醌基生物還原藥物。在另一具體實(shí)施方式
中，所述酶是 P450R，所述療法包括與其它療法組合施予醌基生物還原藥物。在本發(fā) 明的另一實(shí)施方式中，所述酶是NQOl和P450R，所述療法包括單獨(dú)施 予醌基生物還原藥物。在另一實(shí)施方式中，所述酶是NQOl和P450R，所 述療法包括與其它療法組合施予醌基生物還原藥物。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式還包括，測定腫瘤中缺氧的水平；基于至少一 種酶的水平和缺氧水平選擇療法。在特定實(shí)施方式中，通過測量葡萄糖運(yùn) 載體l (Glut-1)和/或碳酸酐酶IX (CAIX)來測定缺氧水平。
本發(fā)明的具體實(shí)施方式
包括一種治療膀胱癌的方法，所述方法包括 基于如下量度選擇療法，所述量度選自NAD(P)H:醌氧化還原酶-1
(NQOl)的水平、NADPH細(xì)胞色素P450還原酶(P450R)的水平和葡 萄糖運(yùn)載體-1 (Glut-1)的水平，其中所述療法包括單獨(dú)施予醌基生物還 原藥物或與其它療法組合施予醌基生物還原藥物。在這個(gè)具體實(shí)施方式
的 各個(gè)方面中，所述量度可以為NQOl或P450R，所述療法包括單獨(dú)施予 醌基生物還原藥物；所述量度可以為NQOl或P450R，所述療法包括與 其它療法組合施予醌基生物還原藥物；所述量度可以為NQOl和P450R， 所述療法包括單獨(dú)施予醌基生物還原藥物；所述量度可以為NQOl和 P450R，所述療法包括與其它療法組合施予醌基生物還原藥物；或者所 述量度可以為NQOl、 P450R和Glut-l，所述療法包括單獨(dú)施予醌基生 物還原藥物或與其它療法組合施予醌基生物還原藥物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一種治療浸潤性膀胱癌的方 法，所述方法包括測定腫瘤中NQOl和Glut-l的水平；選擇與其它療法 組合的包括醌基生物還原藥物的組合療法，因?yàn)镹QOl水平低于、并且所 述Glut-l水平高于如果所述腫瘤是淺表性的情況下將觀測到的。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一種根據(jù)患者膀胱腫瘤中的 NQOl和Glut-l的表達(dá)水平將用于適當(dāng)療法的患者進(jìn)行分層管理的方法， 所述方法包括確定患者膀胱腫瘤中的NQ01和Glut-l的表達(dá)水平；如果 所述患者患有具有高水平NQOl的淺表性膀胱癌，那么以單一試劑療法施 予生物還原藥物，或者如果所述患者患有具有低NQ01和高Glut-l水平的 浸潤性膀胱癌，那么施予與放射療法或其它化學(xué)療法組合的組合療法，所 述組合療法中，使用生物還原藥物。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，其它療法是放射療法和/或施予至少一種 化學(xué)療法試劑。
在各種實(shí)施方式中，具體可用的醌基生物還原藥物選自絲裂霉素 C、吲哚醌衍生物E09、氮雜環(huán)丙垸基苯醌(RH1)及其組合。
本發(fā)明還包括藥學(xué)制劑。具體地，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括一種在 如下溶液中含有E09的藥學(xué)制劑，所述溶液中丙二醇(PG)的濃度選自 約30% vol/vol PG，約20% vol/vol PG和約10% vol/vol PG?？梢源嬖诘?EO9的濃度在約300 pM至約400 pM的范圍內(nèi)。在一特定實(shí)施方式中，所
述制劑包括E09濃度為約347 |nM的溶液。
本發(fā)明的藥學(xué)制劑可以進(jìn)一步包括NaHC03、 EDTA、甘露醇和水。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述制劑包括約10 mg/mL至約120 mg/mL的 NaHC03。在一特定實(shí)施方式中，所述制劑包括約100 mg/mL或約100.25 mg/mL的NaHC03。在另一特定實(shí)施方式中，所述制劑包括約50 mg/mL 的NaHC03或約50.125 mg/mL的NaHC03。在另一實(shí)施方式中，所述制劑 包括約0.5 mg/mL至約3.0 mg/mL的甘露醇。在一特定實(shí)施方式中，所述 制劑包括約0.625 mg/mL的甘露醇。在另一特定實(shí)施方式中，所述制劑包 括1.25 mg/mL的甘露醇。在另一特定實(shí)施方式中，所述制劑包括約100 mg/mL的NaHC03，約0.625 mg/mL的甘露醇和約0.1 mg/mL的E09的溶 液，所述溶液包括EDTA、 PG和水。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括一種在含有PG、 EDTA和水的溶液中包括 E09、 NaHC03和甘露醇的藥學(xué)制劑，其中，存在于所述溶液中的所述PG 在選自如下的百分率范圍內(nèi)約6%至約14% vol/vol、約16%至約24% vol/vol、約26%至約34% vol/vol。在另一實(shí)施方式中，存在于所述溶液中 的所述PG的百分率選自約10% vol/vol、約20% vol/vol和約30% vol/vol。在另一實(shí)施方式中，所述制劑包括E09濃度為約347 pM并且PG 濃度為約10% vol/vol的溶液。在另一實(shí)施方式中，所述制劑包括E09濃 度為約347 并且PG濃度為約20% vol/vol的溶液。在另一實(shí)施方式 中，所述制劑包括E09濃度為約347 并且PG濃度為約30% vol/vol的 溶液。本發(fā)明的這些所述實(shí)施方式可以包括約10 mg/mL至約120 mg/mL 的NaHC03，在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，可以包括約100、約100.25或約 50.125 mg/mL的NaHC03。本發(fā)明的這些所述實(shí)施方式還可以包括約0.5 mg/mL至約3.0 mg/mL的甘露醇，在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，包括約0.625 或約1.25 mg/mL的甘露醇。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括一種藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括E09 濃度為約347 pM, PG濃度為約10% vol/vo1， NaHC03為約100.25 mg/mL 和甘露醇為約0.625 mg/mL的溶液。另一實(shí)施方式可以包括一種藥學(xué)制 劑，其中，所述制劑包括E09濃度為約347 pM， PG濃度為約30%
vol/vol, NaHC03為約100.25 mg/mL和甘露醇為約0.625 mg/mL的溶液。


圖1示出了三名患有膀胱移行細(xì)胞癌的患者中的NQOl、 P450R和 Glut-1的免疫組織化學(xué)分析。
圖2示出了用于研究藥物滲透穿過多細(xì)胞層的裝置。
圖3示意性地表示藥物溶液制劑。
圖4示出了摻入W V14作為內(nèi)標(biāo)的空白樣品的色譜圖。
圖5示出了 EO9標(biāo)準(zhǔn)物在RPMI1640培養(yǎng)基中的色譜圖。
圖6示出了 E09標(biāo)準(zhǔn)物在0.1% DMSO中(6A);在30%丙二醇中 (PG; 6B);在20。/。PG中(6C)和在10。/。PG (6D)中的色譜圖。
圖7示出了 E09在0.1% DMSO中和在各種濃度PG (30°/。； 20%; 10%)中的校準(zhǔn)曲線。
圖8示出了在各種濃度PG中的E09通過DLD-1多細(xì)胞層的滲透率。
圖9示出了經(jīng)染色DLD-1多細(xì)胞層的典型橫截面。
具體實(shí)施例方式
醌基生物還原藥物是前藥，其在酶活化后產(chǎn)生細(xì)胞毒素物質(zhì)。酶 NAD(P)H:醌氧化還原酶(NQ01;也被稱為DT-心肌黃酶(DTD))是雙 電子還原酶，其在有氧條件下醌基生物還原藥物的活化中起主要作用。醌 基生物還原藥物在缺氧條件(包括具有低NQOl活性的細(xì)胞)下也具有細(xì) 胞毒性。單電子還原酶(諸如細(xì)胞色素P450還原酶)在缺氧條件下活化 醌基生物還原藥物中起更主要的作用?；谇笆鰞?nèi)容，還原酶的水平和缺 氧條件可以表明不同癌癥療法適當(dāng)與否，包括使用不同醌基生物還原藥物 適當(dāng)與否。因此，本發(fā)明評估在各種等級和階段的TCC中的所述還原酶的
水平和缺氧條件。
提供含有醌基生物還原藥物具有各種滲透譜的藥學(xué)制劑也可以改善膀 胱癌的療法。例如，當(dāng)治療淺表性膀胱癌時(shí)，使用具有較低滲透譜的藥學(xué) 制劑是有益的，因?yàn)樵撍幬镌谧钚枰委煹陌螂椎谋砻娓浇鼩埩簟Ｅc此相
反，當(dāng)治療浸潤更多肌層的膀胱癌時(shí)，具有較高滲透譜的藥學(xué)制劑是有益 的，因?yàn)樵谶@些情況下，該藥物會(huì)滲透到最需要治療的膀胱的較深層。將 本發(fā)明的各個(gè)方面合起來考慮，通過為個(gè)體疾病的特定特征設(shè)計(jì)癌癥療 法，從而為膀胱癌的治療提供了重要的進(jìn)步。
Apaziquone ((prop. INN， USAN)，也被稱為E09或NSC-382459 (具 有如下結(jié)構(gòu)式的3-羥甲基-5-氮雜環(huán)丙垸基-l-甲基-2-(lH-吲哚-4,7-二酮)-丙 烯醇)
該化合物是一種完全合成的生物還原烷基化吲哚醌。人們相信活化E09的 基本機(jī)理與其它吲哚醌的基本機(jī)理類似，所述機(jī)理包括通過轉(zhuǎn)移一個(gè)或
兩個(gè)電子的細(xì)胞酶進(jìn)行還原，分別形成半醌和氫醌。在有氧條件下氧化半 醌導(dǎo)致氧化還原循環(huán)，該循環(huán)可以通過形成活性氧物質(zhì)(ROS)導(dǎo)致DNA 鏈斷裂，從導(dǎo)致而細(xì)胞死亡。尤其是在缺氧條件下，半醌/氫醌會(huì)烷基化并 且交聯(lián)DNA和其它大分子，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。E09是適于本發(fā)明使用 的醌基生物還原藥物的非限制性實(shí)例。
實(shí)施例l
I.材料和方法
A.人體組織
根據(jù)醫(yī)藥研究委員會(huì)(Medical Research Council)的規(guī)定，在首先獲 得當(dāng)?shù)匮芯亢蛡惱砦瘑T會(huì)(LREC)的同意后，將福爾馬林固定、石蠟包 埋的人體膀胱移行性細(xì)胞癌的樣本(n = 52)用于此項(xiàng)研究。將所有患者 的詳細(xì)資料匿名從而確保機(jī)密性，并且根據(jù)LREC頒布的規(guī)定進(jìn)行所有實(shí) 驗(yàn)。此項(xiàng)研究所用腫瘤代表了人體膀胱TCC的所有等級(ll個(gè)等級l; 26 個(gè)等級2; 15個(gè)等級3)，包括淺表性階段(19個(gè)pTa; 19個(gè)pTl)和肌
層-浸潤性階段(14個(gè)^)T2) 二者。所有腫瘤塊用于構(gòu)成組織微陣列
(TMA)，并且隨后進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。
B. 組織微陣列的構(gòu)建
組織微陣列結(jié)構(gòu)(TMA)由石蠟包埋塊構(gòu)成，從而表示人體膀胱 TCC的各個(gè)等級(Gl-G3)和各個(gè)階段(pTa， pTl, ^T2)。采用 Bubendorf等的改進(jìn)方法[ll]利用Beecher儀器微陣列儀(Silver Spring, MD， USA)得到組織微陣列結(jié)構(gòu)(TMA)，文獻(xiàn)[ll]通過引用插入本 文。簡而言之，將每塊經(jīng)石蠟包埋的原料塊的切片采用蘇木精和曙紅 (H&E)染色，通過顯微鏡檢查并在石蠟塊上標(biāo)記含有感興趣組織的區(qū) 域。在這些代表區(qū)域上進(jìn)行沖擊活組織檢查(punch-biopsled)得到圓柱形 孔(600pM)，并將其轉(zhuǎn)移到受體塊中。組織取樣使用來自每個(gè)腫瘤塊的 四個(gè)孔，從而為每個(gè)母塊上提供代表數(shù)據(jù)。每個(gè)TMA塊包括總共108個(gè) 孔樣品(代表26名患者)，制成兩塊TMA塊。從受體TMA塊上切下切 片(厚5 iaM)，并利用傳送帶系統(tǒng)(Instrumedics， USA)安裝在載玻片 上。為了驗(yàn)證組織學(xué)和樣品的完整性，對從每塊微陣列塊上切下的第一切 片和每序列第十切片上進(jìn)行H&E染色。然后，對TMA載玻片進(jìn)行免疫組 織化學(xué)分析。
C. 抗體
所用抗體包括針對NQ01的小鼠單克隆抗體(由Drs. Siegel和 Ross， University of Colorado Health Sciences Center, Denver, USA提 供)、對P450R具有特異性的山羊多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, USA)、針對Ki67的小鼠單克隆抗體(BD Biosciences, UK)和對葡萄糖運(yùn)載體-1具有特異性的野兔多克隆抗體(GLUT-1; Dako， UK)。
D. 免疫組織化學(xué)
正如先前所述和本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，通過免疫組織化學(xué)評估
NQOl、 P450R、 GLUT-1和Ki67的免疫定位(Immunolocalisation)。簡 而言之，在抗原修復(fù)并阻塞非特異性免疫球蛋白結(jié)合后，采用合適的初級 抗體培養(yǎng)TMA:采用在TBSTM (1 OmM Tris-HCl， 150mM NaCl， 0.2% Tween20， 5%脫脂干奶粉)中以l: 1稀釋的抗-NQO-l抗體培養(yǎng)約60分 鐘；采用在PBS中1: 100稀釋的P450R培養(yǎng)約90分鐘；采用在PBS中 以l: 25稀釋的抗-Glut-l抗體培養(yǎng)約90分鐘；或采用在PBS中以1: 100 稀釋的抗-Ki67抗體在4'C下培養(yǎng)整夜。使用常規(guī)IgG替代初級抗體進(jìn)行對 照實(shí)驗(yàn)。利用適當(dāng)?shù)纳锼鼗拇渭壙贵w(以1: 200稀釋；Vector Labs.， USA)完成免疫定位，接著采用Vectastain ABC試劑盒(Vector Labs.， USA)進(jìn)行信號放大，并采用3,3'-二氨基對二氨基聯(lián)苯(DAB)
(Vector Labs.， USA)進(jìn)行可視化。然后，采用Harris，蘇木精對各切片進(jìn) 行復(fù)染色，脫水、清潔并鑲嵌在DPX包埋劑(Sigma, UK)中。
E.免疫組織化學(xué)染色的半定量分析
由三名獨(dú)立的觀測者對陽性免疫染色進(jìn)行半定量計(jì)數(shù)。將腫瘤中的 NQOl和P450R 二者在細(xì)胞質(zhì)上定位?；谌旧膹?qiáng)度和分布，對每個(gè)腫 瘤核的上皮區(qū)進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果被指定為0 (沒有染色)至4 (最強(qiáng)染色強(qiáng) 度)。由獨(dú)立觀測者的結(jié)果計(jì)算TMA的每個(gè)核和每個(gè)腫瘤的平均得分強(qiáng) 度。為了獲得任何關(guān)系和相關(guān)性，將這些結(jié)果與臨床病理學(xué)參數(shù)進(jìn)行比 較。
對每個(gè)TMA核中的Glut-1陽性率(Glut-1 positivity)的水平進(jìn)行分析 并指定得分為0至4，該得分代表顯示隔膜染色的腫瘤細(xì)胞的近似百分率 (0二未著色;1=0-5%陽性;2二5-15%陽性;3 = 15-30%陽性;4 = >30% 陽性)。由獨(dú)立觀測者的結(jié)果計(jì)算TMA的每個(gè)核和每個(gè)腫瘤的平均得分 強(qiáng)度。為了獲得任何關(guān)系和相關(guān)性，將這些結(jié)果與臨床病理學(xué)參數(shù)進(jìn)行比 較。
正如Santos等所報(bào)道的[13,14]，對于每個(gè)核和腫瘤，采用40倍的放 大率計(jì)算腫瘤細(xì)胞中Ki67陽性核的百分率，這些文獻(xiàn)通過引用插入本 文。對每個(gè)核總共200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，對每個(gè)腫瘤總共800個(gè)細(xì)胞進(jìn)行 計(jì)數(shù)，并且計(jì)算陽性百分率。由兩名觀測者進(jìn)行獨(dú)立評分。為了獲得任何 關(guān)系和相關(guān)性，將這些結(jié)果與臨床病理學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較。
F.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
NQ01和P450R的表達(dá)與如下臨床病理學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較腫瘤階段、 腫瘤等級、腫瘤缺氧(Glut-1表達(dá))和繁殖。利用11.0版SPSS軟件包 (SPSS Inc., Chicago, IL)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在免疫組織化學(xué)研究中，因 為表達(dá)不是正態(tài)分布的，因此每個(gè)范圍的平均表達(dá)數(shù)值被報(bào)道為具有四分 位距(interquartiles)的中值。通過Mann-Whitney U測試確定獨(dú)立變量之 間的差異。在雙尾分析(two-tailed analyses)中，P值小于0.05被認(rèn)為是 顯著的。
II.結(jié)果
A. NQOl蛋白質(zhì)水平與腫瘤階段和等級之間的關(guān)系
在所有病理等級和階段的膀胱腫瘤的上皮細(xì)胞中，NQOl在細(xì)胞質(zhì)上 定位，各個(gè)腫瘤之間NQOl的表達(dá)發(fā)生變化(圖1，表1)。在許多情況 下，在同一腫瘤中觀察到不同的NQ01表達(dá)圖案，其中高NQOl表達(dá)和低 NQOl表達(dá)的區(qū)域在同一樣品中(數(shù)據(jù)未示出)。NQOl在所有病理階段
(pTa， pTl， *T2)的腫瘤中表達(dá)，但是不同階段的NQOl的表達(dá)水平 發(fā)生變化(表1)。在淺表性腫瘤(pTa + pTl)和肌層浸潤性腫瘤
($T2)之間觀察到NQ01表達(dá)的顯著差異，其中，肌層浸潤性腫瘤中的 表達(dá)明顯較小(P = 0.02)。通過在非浸潤性(pTa)和浸潤性(pTl + $T2)腫瘤之間觀察到的表達(dá)中的顯著差異(P二0.03)進(jìn)一步證實(shí)NQOl 表達(dá)與腫瘤浸潤勢的反比關(guān)系。TCC的所有病理等級表達(dá)NQOl (表 1)。與等級1或等級3相比，等級2腫瘤中的NQOl表達(dá)明顯較高(表 1)。觀察到高度分化(等級1)和不利分化(等級3)腫瘤之間沒有顯著 差異(表l)。
B. P450R蛋白質(zhì)表達(dá)與腫瘤階段和等級之間的關(guān)系
所有被檢測腫瘤表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)上定位具有可探測水平的P450R。與 NQ01相反，在腫瘤中的P450R表達(dá)通常是均勻的。圖l中描述了典型的 免疫染色。在TCC的所有階段中P450R表達(dá)(表1)。與淺表性(pTa + pTl)腫瘤相比，肌層浸潤性腫瘤(^T2)中的P450R的水平明顯更高 (PO.01)。與NQOl相反，P450R的表達(dá)與漸增的腫瘤階段呈正比關(guān) 系，但與腫瘤的浸潤勢無關(guān)，由此明顯可見，浸潤性(pTl + ^)T2)和非 浸潤性(pTa)之間沒有可觀測的顯著差異(表1) 。 TCC的所有病理等 級都表達(dá)P450R (表1)。觀察到P450R水平與漸增腫瘤等級之間呈正相 關(guān)(表l)。
C. Ghit-l與腫瘤階段和等級之間的關(guān)系
每個(gè)腫瘤樣本中和每個(gè)患者樣品之間的Glut-l蛋白質(zhì)的表達(dá)都是異質(zhì) 的。典型的免疫染色及其與腫瘤階段和等級之間的關(guān)系分別表示在圖1和 表1中。Glut-l蛋白質(zhì)在所有被檢測的階段和等級中都表達(dá)，但是在^)T2 腫瘤(相對于pTa腫瘤，P = 0.05)和等級3腫瘤(相對于等級l[P = 0.03] 和等級2[P < O.Ol]腫瘤二者)中的Glut-l的水平明顯較高。另外，非浸潤 性(pTa)和浸潤性(pTl + ^T2)腫瘤之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著的差異 (P = 0.02)，這暗示了浸潤性疾病與較高的Glut-l蛋白質(zhì)表達(dá)(因而缺 氧水平較高)相關(guān)。
D. Ki67、腫瘤階段、腫瘤等級和酶學(xué)之間的關(guān)系
Ki67抗原的表達(dá)水平被用作腫瘤繁殖指數(shù)的指示劑(表1)。正如所 預(yù)期的，觀察到漸增的腫瘤等級(遞減的分化)和繁殖指數(shù)之間明顯相關(guān) (P<0.01)。觀察到腫瘤繁殖和腫瘤浸潤勢(pTa對pTl十^T2)之間沒 有關(guān)系。與此相反，相對于淺表性腫瘤(pTa + pTl [PO.Ol])，肌層浸潤 性腫瘤(^)T2)中的腫瘤繁殖明顯更快，這可能是肌層浸潤和較高腫瘤等 級二者關(guān)系的結(jié)果。有趣的是，觀察到腫瘤繁殖指數(shù)與Glut-l表達(dá)(P =0.01)和P450R表達(dá)(P < 0.01) 二者明顯關(guān)聯(lián)，但與NQOl表達(dá)不相 關(guān)。
這項(xiàng)研究結(jié)果表明，涉及醌基化合物的生物還原活性和由Glut-l蛋白 質(zhì)水平所測定的缺氧的存在的關(guān)鍵酶的蛋白質(zhì)表達(dá)隨著膀胱TCC的階段和 等級改變。最驚人的觀測結(jié)果是NQOl蛋白質(zhì)表達(dá)隨著漸增的腫瘤階段 明顯降低(表l)。關(guān)于腫瘤等級，也有證據(jù)表明，G3腫瘤的NQ01水平 比G2 (而非Gl)腫瘤要低。這些發(fā)現(xiàn)與先前公布的研究相符，其中報(bào)道 了NQOl mRNA表達(dá)與漸增腫瘤階段(15)之間呈反比關(guān)系。類似地，對 于Glut陽l，蛋白質(zhì)表達(dá)隨著腫瘤等級(P = 0.03禾口<0.01，當(dāng)G1和G2分別 與G3腫瘤相比時(shí))和腫瘤階段(P=0.05，當(dāng)pTa腫瘤與^)T2腫瘤相比 時(shí))增加，這與先前的報(bào)道一致[16]。與先前公布的報(bào)道[15](該報(bào)道表示 與肌層浸潤性TCC相比淺表性中的P450R mRNA的水平較高)相反，在 這項(xiàng)研究中，P450R蛋白質(zhì)水平在肌層浸潤性(^)T2，與pTa + pTl相 比)疾病中明顯較高(P<0.01)。另外，P450R蛋白質(zhì)表達(dá)與漸增的腫瘤 等級(遞減的分化)呈正相關(guān)性(表1)。有趣的是，P450R表達(dá)還表示 與繁殖指數(shù)呈較強(qiáng)的正相關(guān)性(PO.01)，這可能是P450R、 Ki67和漸增 的腫瘤等級(遞減的分化)之間的較強(qiáng)關(guān)系的結(jié)果。然而，當(dāng)評估涉及 P450R的生物還原療法時(shí)應(yīng)當(dāng)記住這一點(diǎn)，因?yàn)楦叻敝持笖?shù)表明與膀胱癌 中的不良預(yù)后(prognosis)相關(guān)[17,18]。總的來說，通過免疫組織化學(xué)對 蛋白質(zhì)表達(dá)的分析暗示了，通過Glut-l表達(dá)所表明的缺氧與漸增的腫瘤階 段、等級和腫瘤浸潤性相關(guān)。參考腫瘤酶學(xué)，這項(xiàng)研究暗示了， NQOl作 為腫瘤階段(和浸潤勢)的函數(shù)隨著腫瘤階段(和浸潤勢)漸增而明顯降 低，而P450R水平隨著腫瘤等級和浸潤勢增加。
這些發(fā)現(xiàn)對于在膀胱TCC的治療中采用醌基生物還原藥物的潛在治療 對策具有明顯的意義。前期模型中存在的大量證據(jù)表明了，細(xì)胞對 MMC、 E09和RH1的應(yīng)答不僅依賴于NQOl水平，還依賴于腫瘤缺氧的 水平。關(guān)于MMC， NQOl在有氧條件下測定細(xì)胞應(yīng)答中的作用具有爭 議，但是在缺氧條件下，僅在具有低NQOl活性或不具有NQOl活性的細(xì) 胞中見到活性明顯增強(qiáng)[19]。在E09和RH1的情況下，類似的結(jié)果在缺氧
條件下得到，其中僅在具有低NQOl的細(xì)胞中觀察到活性的明顯增強(qiáng)。然而，在有氧條件下，NQOl活性和化學(xué)敏感性之間具有良好的 相關(guān)性，這暗示了，在氧氣的存在下，NQOl在活化E09和RH1中起主 要作用[22，23]。用于解釋這些觀測結(jié)果的發(fā)生機(jī)制并不清楚[24]，但是在 缺氧條件下，假定諸如P450R的單電子還原酶在生物還原活化過程中起到 了更有影響的作用[25]?；谶@些發(fā)現(xiàn)，諸如E09禾卩RH1的化合物以富 NQOl腫瘤的有氧部分(同樣可以為MMC，但在較低程度上)為目標(biāo)， 或者以貧NQOl腫瘤的缺氧部分為目標(biāo)，這些情況假定存在諸如P450R的 單電子還原酶。因此，在富NQOl腫瘤的情況下，適當(dāng)?shù)氖鞘褂弥T如E09 和RH1的化合物作為以需氧部分作為目標(biāo)的單一試劑。對于具有明顯缺氧 部分的貧NQOl腫瘤，這些試劑應(yīng)當(dāng)與放射線療法或以需氧部分為目標(biāo)的 化學(xué)治療試劑組合使用。這項(xiàng)研究的結(jié)果暗示了，后種對策在更后期的膀 胱TCC (即^)T2)或更嚴(yán)重的疾病(即等級3腫瘤)的情況下是有效的， 因?yàn)檫@些疾病通常具有低NQOl蛋白質(zhì)表達(dá)(并且具有可能較高的P450R 表達(dá))并且包含明顯的缺氧區(qū)域。在這種特定背景下，令人感興趣的是， 在肌層浸潤性膀胱癌中，使用化學(xué)放射療法(絲裂霉素C加上5-氟脲嘧啶 與根治性放射療法組合)得到令人鼓舞的結(jié)果，但是對NQOl和缺氧標(biāo)記 的分析并未結(jié)合到本項(xiàng)研究的設(shè)計(jì)中[26]。在更廣泛的背景下，在這項(xiàng)研 究和其它研究中所表明的淺表性和肌層浸潤性膀胱TCC具有顯著的缺氧區(qū) 域，這暗示了這些腫瘤是用于評估其它生物還原藥物或缺氧介導(dǎo)療法的效 果的有利候選者。
總之，這項(xiàng)研究的結(jié)果表明了，涉及醌基化合物的生物還原活化和缺 氧的存在關(guān)鍵酶的蛋白質(zhì)表達(dá)作為膀胱TCC中的腫瘤階段和等級的函數(shù)發(fā) 生變化。這些結(jié)果暗示了，這些腫瘤(即^)T2和G3腫瘤)對于與放射組 合使用醌(例如MMC、 E09禾n RH1)以缺氧部分作為目標(biāo)的化學(xué)放射療 法方案來說是良好的候選者，或者對于以細(xì)胞的有氧部分作為目標(biāo)的其它 化學(xué)療法來說也是良好的候選者?；谶@些基本原理并參照圖1，案例A (pT2G3)具有低NQOl水平、高P450R水平和高Glut-l水平，因而對于 使用醌的化學(xué)輻射療法來說是良好的候選者。案例B (pTaGl)具有高
NQ01水平、低P450R水平和中等Glut-l水平，因而應(yīng)當(dāng)對醌基化學(xué)療法 應(yīng)答良好。案例C (p^ G2)具有中等NQ01水平、中等P450R水平和中 等Glut-l水平，同樣被預(yù)測對醌基化學(xué)療法應(yīng)答良好。對個(gè)體患者腫瘤采 用這些標(biāo)記繪圖很重要，特別在考慮到患者之間存在顯著不同(具體 NQOl不同)。
正如本文所用，當(dāng)采用酶水平來測定適用于患者的療法時(shí)，可以通過
如下方法來確定酶的高低水平將相關(guān)腫瘤中所感興趣酶的水平與同一患
者的其它腫瘤相比，與其它患者的腫瘤相比和/或與標(biāo)準(zhǔn)腫瘤細(xì)胞系或其它 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它可用參照點(diǎn)相比。因此，可以通過主治醫(yī)師或 對特定患者的腫瘤酶水平進(jìn)行測量和/或定量中所涉及的其它實(shí)驗(yàn)室人員、 研究人員或治療人員來確定高低水平。
實(shí)施例2
I.材料和方法
A. 裝置和通用化驗(yàn)原理
如圖2所示，所述實(shí)驗(yàn)中所用的裝置包括轉(zhuǎn)運(yùn)孔插入物(Transwell insert, Costar)，其被插入24孔培養(yǎng)板的一個(gè)孔中。插入物的底部中具有 經(jīng)膠原質(zhì)涂敷的隔膜，因而在上室和下室之間形成了屏障以及細(xì)胞可以附 著和生長的表面。這項(xiàng)研究中所用的細(xì)胞系是精選的DLD-1人結(jié)腸癌細(xì) 胞，因?yàn)樗軌蛟诩?xì)胞之間形成緊密的連接，從而形成藥物必須闖過的 "屏障"。為了評估藥物滲透性，將藥物加入上室，并在時(shí)間間隔范圍內(nèi) 測定下室中的藥物濃度。
B. 細(xì)胞培養(yǎng)條件
DLD-1細(xì)胞被常規(guī)保持在用10%胎牛血清、丙酮酸鈉(1 mM) 、 L-谷酰胺(2 mM)、青霉素/鏈霉素(50IU/ml， 50 pg/ml)補(bǔ)充、并用 HEPES (25 mM)緩沖的RPMI1640培養(yǎng)基中。將DLD-1細(xì)胞(2.5X 105 個(gè)，在200 pi培養(yǎng)基中)加入上室，靜置，并在富C02 (5%)的氣氛中 37"下附著在隔膜上約3小時(shí)。在細(xì)胞附著上后，將轉(zhuǎn)運(yùn)孔插入24孔板 養(yǎng)基加入下室中。然后，將該裝置在37"C下 培養(yǎng)4天，其中上室和下室中的培養(yǎng)基每天變化?；谏鲜鲅芯?，培養(yǎng)4 天后，多細(xì)胞層的厚度為約50 pm。對于每次化驗(yàn)，取出3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)孔用于 組織學(xué)檢測以及厚度和完整性的精確測定(參見以下細(xì)節(jié))。
C.藥物溶液的制備
如下所述以及圖3所概述制備以下溶液。 1.溶液l:在0.P/oDMSO中的E09 (347pM)
將固體E09溶于100% DMSO中以制成347 mM的原料液。將10 pl 原料液加入10 mL全PRMI培養(yǎng)基中(無酚紅)。為了防止E09的可能沉 淀，將E09原料液加入培養(yǎng)基中時(shí)連續(xù)搖動(dòng)。E09的最終濃度為347 pM，其相當(dāng)于4mg/40mL。 溶液2:在10。/。PG中的EO9 (347jiM)
將200毫克碳酸氫鈉(NaHC03)溶于4 mL EDTA溶液(0.5 mg/mL，由0.5M原料液新制備，Sigma)中。然后，將該溶液與6 mL PG 溶液(2 mL PG+4 mL H20 )混合，從而制成總體積為10 mL含有20% PG的溶液。將該溶液加入含有E09 (2 mg)、碳酸氫鈉(5 mg)和甘露 醇(12.5 mg)的20 mL通用試管中。將該溶液在37'C下培養(yǎng)并連續(xù)搖動(dòng) 直到E09完全溶解(約5-6小時(shí))。然后，該溶液用水以1: 1進(jìn)行稀 釋，從而得到10n/。PG溶液。 溶液3:在20。/。PG中的EO9 (347jiM)
將200毫克碳酸氫鈉(NaHC03)溶于4 mL EDTA溶液(0.5 mg/mL，由0.5M原料液新制備，Sigma)中。然后，將該溶液與6 mL PG 溶液(4 mL PG+2 mL H20 )混合，從而制成總體積為10 mL含有40% PG的溶液。將該溶液加入含有E09 (2 mg)、碳酸氫鈉(5 mg)和甘露 醇(12.5 mg)的20 mL通用試管中。將該溶液在37"下培養(yǎng)并連續(xù)搖動(dòng) 直到E09完全溶解(約3-4小時(shí))。然后，該溶液用水以1: 1進(jìn)行稀 釋，從而得到20n/oPG溶液。 溶液4:在3(T/oPG中的E09 (347 nM)
將200毫克碳酸氫鈉(NaHC03)溶于4 mL EDTA溶液(0.5 mg/mL，由0.5M原料液新制備，Sigma)中。然后，將該溶液與6 mL PG 溶液(6 mL PG+O mL H20 )混合，從而制成總體積為10 mL含有60% PG的溶液。將該溶液加入含有E09 (2 mg)、碳酸氫鈉(5 mg)和甘露 醇(12.5 mg)的20 mL通用試管中。將該溶液在37。C下培養(yǎng)并連續(xù)搖動(dòng) 直到E09完全溶解(約2小時(shí))。然后，該溶液用水以1: 1進(jìn)行稀釋， 從而得到30n/。PG溶液。
D. 藥物施予
在整個(gè)過程中，除了使用無酚紅培養(yǎng)基(在色譜中酚紅洗脫非常接近 E09)以外，所用培養(yǎng)基如上所述。將E09在t=0時(shí)以100 fil的體積加 入上室，下室含有600 )il培養(yǎng)基(恒速攪拌)。將轉(zhuǎn)運(yùn)孔在37'C下培養(yǎng) IO分鐘后取出，并置于含有600 1^1l新鮮培養(yǎng)基的24孔板的一新孔中。將 上室中的藥物溶液取出并用100 )Lll新藥物溶液替換(即上室中的濃度被保 持在恒定濃度)。在總共1小時(shí)的時(shí)間內(nèi)每隔10分鐘重復(fù)上述整個(gè)過 程。
E. 萃取過程
E09立即采用Isolute C18 SPE藥桶萃取。藥桶中填裝1 mL甲醇，然 后在添加樣品(500 pl)前在1 mL去離子水中洗滌。在1 mL去離子水中 進(jìn)一步洗滌后，E09在300 pl甲醇中洗脫。將樣品在真空(在室溫下旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)器中)下干燥，并儲(chǔ)存在-2(TC下直到需要分析，或者在流動(dòng)相(如 下)中復(fù)原立即分析。
F. HPLC分析
如Philips等所述對E09實(shí)施色譜分析(British Journal of Cancer. 65(3): 359-64， 1992)，該文獻(xiàn)通過引用插入本文。簡而言之，使用 HichromRPB柱(25cmX4.6mm id, Hichrom Ltd, UK)用于分離。使用 具有Masslynx 3.4軟件(Micromass Ltd)的Waters 996光電二極管陣列檢 測器(、=280nm)對感興趣的波峰進(jìn)行光譜分析。移動(dòng)相由1 M磷酸鹽
緩沖液(1%)、甲醇(42%)和HPLC級水(47%)組成。流速利用 Waters Alliance 2690 (Milford， MA， USA)四元梯度泵色譜系統(tǒng)設(shè)定為
I. 2ml分鐘—1，該色譜系統(tǒng)還結(jié)合有自動(dòng)取樣器。檢測極限為10ng/ml (34.7 nM)。
G.組織學(xué)
對于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，選擇3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)孔插入物l個(gè)對照，2個(gè)在實(shí)驗(yàn)?zāi)┒恕?br> 將每個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)孔固定在10%福爾馬林中1小時(shí)，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到70%乙醇中并儲(chǔ) 存整夜。使用清潔的解剖刀，將隔膜與塑料插入物仔細(xì)地分離，并利用本 領(lǐng)域技術(shù)人員己知的標(biāo)準(zhǔn)過程進(jìn)行處理以包埋在石蠟中。利用Leitz Rotary Microtone分割樣本，并固定在經(jīng)蛋白質(zhì)涂敷的載玻片上，并采用本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)過程利用蘇木素和曙紅染色。利用目鏡分化板 (eyepiece graticule)測量多細(xì)胞層的厚度，該目鏡分化板已采用分級測微 器(stage micrometer)校正過。對于每個(gè)部分得到5次測量結(jié)果，測量每 個(gè)樣品的三個(gè)部分。
II. 結(jié)果
A. 典型色譜圖
圖4表示摻入WV14作為內(nèi)標(biāo)的空白樣品的色譜圖(保留時(shí)間= 11.059分鐘)。6.870分鐘處的峰為污染峰。圖5表示E09標(biāo)準(zhǔn)物(1 嗎/ml (圖5A)禾卩20ng/ml (圖5B))在RPMI1640培養(yǎng)基中的色譜圖。 如圖5A所示，E09禾B WV14峰分別在8.029分鐘和13.023分鐘洗脫 (7.292分鐘處的波峰為上述污染峰)。應(yīng)當(dāng)注意到，由于實(shí)驗(yàn)室中溫度 波動(dòng)保留時(shí)間會(huì)移動(dòng)，但是相對保留時(shí)間應(yīng)當(dāng)保持恒定。圖5B指出檢測 極限。圖6表示E09標(biāo)準(zhǔn)物在0.1% DMSO中(6A);在30%PG中(圖 6B);在20。/。PG中(圖6C)和在10。/。PG中(圖6D)的色譜圖。
B. 校正曲線
為每種E09制劑制訂校正曲線，結(jié)果在圖7中表示。校正曲線是可重 復(fù)的，并且如7中所示觀察到每條校正曲線的斜率間的微小差異。上述差
異的原因不清楚，但可以反映不同制劑之間的萃取效率的微小差異。E09
在0.P/。DMSO中、10n/。PG中、20n/。PG中和30。/。PG中的萃取效率分別為 92.3%、 81.7%、 79.9%和81.1%。因?yàn)檫@種變化，所以對每個(gè)所進(jìn)行的實(shí) 驗(yàn)制訂校正曲線。在任意色譜圖上沒有見到明顯分解的產(chǎn)物。
C.藥物滲透
如圖8可見，隨著PG濃度的增加，E09的多細(xì)胞層滲透速率降低。 當(dāng)上室中的濃度被保持在或多或少的恒定數(shù)值時(shí)，如所預(yù)料的，在0.1% DMSO中的E09的動(dòng)力學(xué)是線性的。在所測試PG的兩個(gè)最高濃度下，應(yīng) 當(dāng)注意到，動(dòng)力學(xué)并未是完全線性的——隨著時(shí)間的增加速率急劇增加。 這個(gè)結(jié)果可能反映了 PG誘導(dǎo)多細(xì)胞層的厚度發(fā)生變化(見圖9)。在任 意評估時(shí)間點(diǎn)沒有觀察到明顯的代謝物或分解產(chǎn)物。
圖9表示用于檢測E09滲透穿過DLD-1多細(xì)胞層所進(jìn)行的組織學(xué)分 析結(jié)果。未經(jīng)藥物處理切片的厚度為56.01 ± 3.63 iam。采用在0.1。/。DMSO 中的E09處理1小時(shí)后，多細(xì)胞層的厚度(58.80 ± 2.50 pm)與未經(jīng)藥物 處理的樣本相比沒有顯著差異。然而，采用在30% PG中的E09處理后， 多細(xì)胞層的厚度顯著降至29.01 ± 1.78 nm。該層的外觀中也存在明顯的形 態(tài)變化，最明顯的是該層外觀本身出現(xiàn)"破裂"或"通道"。在整個(gè)實(shí) 驗(yàn)中采用PG中的E09得到的觀測結(jié)果是上室含有比預(yù)期更多的流體。 例如，采用在30%、 20%和10。/。PG中的E09培養(yǎng)10分鐘后，從上室回收 的體積分別為106 ± 3、 107 ± 3禾卩105 ± 2 pl (暴露于在0.1% DMSO中的 E09 1小時(shí)后，回收的體積為98 ± 2 pl)。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是，這些體積僅是 近似值(可以利用Gilson洗液管回收的體積)，但是這些體積的確表明 了，當(dāng)使用溶于PG配制品(尤其在30。/。PG中)中的E09時(shí)，上室中培 養(yǎng)基的體積發(fā)生變化。還值得注意的是，組織學(xué)圖片表明，在對照和經(jīng) EO (0.1%DMSO)處理的樣本中，細(xì)胞與基質(zhì)隔膜緊密接觸，而對于采 用在30%PG中的E09處理的多細(xì)胞層，多細(xì)胞層與隔膜本身之間存在小 但卻明顯的間隙。
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表達(dá)。NQOl、 P450R和GLUT-1的數(shù)據(jù)被表示為兩名觀測者的中值評分 (士四分位距)。繁殖指數(shù)的數(shù)據(jù)被表示為兩名觀測者的平均值士S.E。正 如"材料和方法"中所述，樣本的NQOl、 P450R和GLUT-1被評為0至
4，繁殖指數(shù)被計(jì)算為Ki67陽性率e/。。_
繁殖％
中值NQ01 中值GLUT-1
中值P450R表達(dá) (Ki67陽性率)
樣品數(shù)表達(dá)(士四分 表達(dá)
(±四分位距) (± S.E.)
位距) (土四分位距)
pTa
pT2
19
19
14
2.50(7."-
3, 1.88
i卿 0.17 ,0-
/刷
3.20 (25《-3.< " 2.00 (7.J0-3.朋) 16.75 ±2.8
2.96 (2.33-3.67) 3.38 (275-3.S》 13.88 ±2.2
.89 (!75-3.9力 3.88 f2.67-4力0) 24.59 ±4.43
Gl
G2
G3
11
26
15
1.00 f"謹(jǐn)-
/.， 2.72 (7恭
丄郡 0.33 r,陽
,S5」
2.79 (2./7-2.9" 2.38 (2.00-3.25) 9.72 ±2.64
3.35 P.7U.S" 2.83 (7.75-3.7》 14.59 ±1.72
3.83(3.37-3.92; 4.00 fl63-4卵) 30.47 ±3.71
非浸潤性' 浸潤性b
19
33
2.50
3， 1.67 P力-
2.5"
3.20 P.5S-3,S" 2.00 (7.37-3.67) 17.51 ±2.83 3.67 (2H卯」 3.50 f2.77-楊) 19.41±2.86
2.00 (7箭
淺表性￡ 38 3.10卩.1M7》 2.83 (7.SHS" 15.69±1.79
i巧
0.17卩謹(jǐn)-
肌層浸潤性d 14 3.89卩.75-3.9" 3.88 r2.67-4力^ 24.59 ±4.43
/刷
后綴a、 b、 c和d分別表示pTa、 (pT!+pT2)、 (pTa + pT0禾B pTj中瘤 階段。
權(quán)利要求
1. 一種在溶液中含有EO9的藥學(xué)制劑，所述溶液的丙二醇(PG)濃度選自約30％vol/vol PG，約20％vol/vol PG和約10％vol/vol PG。
2. 如權(quán)利要求1所述的藥學(xué)制劑，其中所述制劑包括E09濃度為約 300 )UM至約400 /zM的溶液。
3. 如權(quán)利要求1所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括E09濃度為約 347 /xM的溶液。
4. 如權(quán)利要求1所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑進(jìn)一步包括 NaHC03、 EDTA、甘露醇和水。
5. 如權(quán)利要求4所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括約10mg/mL 至約120 mg/mL的NaHC03。
6. 如權(quán)利要求5所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括約100 mg/mL 的NaHC03。
7. 如權(quán)利要求5所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括約50 mg/mL 的NaHCO; 。
8. 如權(quán)利要求4所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括約0.5 mg/mL 至約3.0mg/mL的甘露醇。
9. 如權(quán)利要求8所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括約0.625 mg/mL的甘露醇。
10. 如權(quán)利要求8所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括約1.25 mg/mL的甘露醇。
11. 如權(quán)利要求1所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括在含有 EDTA、丙二醇和水的溶液中約100 mg/mL的NaHC03、約0.625 mg/mL 的甘露醇和約0.1 mg/mL的E09。
12. —種在含有丙二醇、EDTA和水的溶液中含有E09、 NaHC03和甘 露醇的藥學(xué)制劑，其中，存在于所述溶液中的所述丙二醇在選自如下的百 分率范圍約6%至約14% vol/vo1，約16%至約24% vol/vo1，約26%至約 34% vol/vol 。
13. 如權(quán)利要求12所述的藥學(xué)制劑，其中，存在于所述溶液中的所述 丙二醇具有選自如下的百分率約10% vol/vo1，約20% vol/vol和約30% vol/vol o
14. 如權(quán)利要求12所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括E09濃度為 約347 )LtM，且丙二醇濃度為約10% vol/vol的溶液。
15. 如權(quán)利要求12所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括E09濃度為 約347 /iM，且丙二醇濃度為約20% vol/vol的溶液。
16. 如權(quán)利要求12所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括E09濃度為 約347 /xM，且丙二醇濃度為約30% vol/vol的溶液。
17. 如權(quán)利要求12所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括約10 mg/mL至約120 mg/mL的NaHC03。
18. 如權(quán)利要求17所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括約100 mg/mL的NaHC03。
19. 如權(quán)利要求17所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括約50 mg/mL的NaHC。3。
20. 如權(quán)利要求12所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括約0.5 mg/mL至約3.0 mg/mL的甘露醇。
21. 如權(quán)利要求20所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括約0.625 mg/mL的甘露醇。
22. 如權(quán)利要求20所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括約1.25 mg/mL的甘露醇。
23. 如權(quán)利要求12所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括E09濃度為 約347 juM，丙二醇濃度為約10% vol/vo1， NaHC03為約100.25 mg/mL并 且甘露醇為約0.625 mg/mL的溶液。
24. 如權(quán)利要求12所述的藥學(xué)制劑，其中，所述制劑包括E09濃度為 約347 piM，丙二醇濃度為約30% vol/vol ， NaHC03為約100.25 mg/mL并 且甘露醇為約0.625 mg/mL的溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了各種膀胱癌的治療及其方法。本發(fā)明公開的內(nèi)容利用丙二醇濃縮液和/或NAD(P)H醌氧化還原酶-1(NQO1)、細(xì)胞色素P450氧化還原酶(P450R)和葡萄糖運(yùn)載體1(Glut-1)在人體膀胱移行細(xì)胞癌中的蛋白質(zhì)表達(dá)，從而提供以個(gè)體為靶向的膀胱癌治療。
文檔編號A61K47/10GK101384255SQ200780005059
公開日2009年3月11日 申請日期2007年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月9日
發(fā)明者古魯·雷迪, 路吉·萊納茲, 道爾拉·米勒約夫斯基 申請人:癌癥治療公司