專利名稱：：制備轉(zhuǎn)化細胞的方法制備轉(zhuǎn)化細胞的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，一種特殊聚合物在將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的應用，一種將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的試劑盒(kit),所述試劑盒在將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的應用，一種由生物分子和聚合物制備的配合物，一種治療劑組分，由生物分子和聚合物制備的配合物的應用，一種通過基因療法治療疾病的聚合物，以及一種通過基因療法治療疾病的方法。
背景技術：
：已知現(xiàn)有技術中存在多種不同的將外源核酸-尤其是外源DNA-重組入(轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)細胞中的方法。對于活體內(nèi)轉(zhuǎn)化，主要采用兩種方法病毒介導的基因轉(zhuǎn)化和借助于陽離子脂質(zhì)體或陽離子聚合物-如聚乙烯亞胺、聚L-賴氨酸或、聚L-精氨酸-進行的轉(zhuǎn)化。所采用的病毒載體包括腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，這些病毒可將非病毒DNA轉(zhuǎn)染到能夠進行有絲分裂的活性細胞中。陽離子脂質(zhì)體對DNA上帶負電荷的磷酸鹽骨架具有影響?；铙w內(nèi)轉(zhuǎn)化的適當技術是磷酸鈣共沉淀法(calciumphosphateprecipitation),該技術中，在氯化鉤和磷酸鈉的混合物中，將待轉(zhuǎn)化的DNA綁定到起沉淀作用的磷S吏4丐上，沉積的結晶體被添加到細胞培養(yǎng)基中，并通過內(nèi)噬作用被細胞吸收。除了該化學轉(zhuǎn)化技術外，還已知有多種物理的活體內(nèi)轉(zhuǎn)化技術，如顯微注射，該技術采用注射器具直接將DNA注射到細胞核或細l包中，如電穿孔法(electroporation),該技術借助于電脈沖刺激細胞膜，而使得細胞膜對DNA是可滲透的，再如所謂的基因槍法(particleguntechnique)4支術，它是借助于在DNA上包覆細微的金屬球而將外源DNA發(fā)射到細胞中。上述活體內(nèi)轉(zhuǎn)化技術的一個特別不利情況是，這些技術往往是非常細胞特異性的(cell-specific)。在磷酸鈣共沉淀法中，轉(zhuǎn)化過程更多地依賴于選擇恰當?shù)暮}濃度，且對不同類型的細胞需要一定的實驗技巧與經(jīng)驗。甚至，更重要的是，現(xiàn)有技術中所描述的轉(zhuǎn)化技術的不足之處在于，轉(zhuǎn)化效率較高的轉(zhuǎn)化試劑一般具有較強的毒性，而那些毒性較低或是無毒的試劑的轉(zhuǎn)化效率卻又不能令人滿意。作為一種備選，為了克服上述缺陷，陽離子聚合物被用于進行細胞的活體內(nèi)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。例如，眾所周之的，DNA與聚乙烯亞胺(PEI)的配合可#1成功地用在將基因運送到細胞內(nèi)((Boussif等，1995;Boussif等，1996;Abdallah等,1996)。在這種情況下，通過細胞對配合物的隨機綁定和吞噬來實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)。象聚乙烯亞胺一樣，堿性胺基酸的均聚物-如聚L-賴氨酸，樹枝狀陽離子聚合物(dendriticcationicpolymer)—如聚酰胺畫胺(polyamidoamines,簡稱PAMAM)、聚酰胺、聚丙烯胺、陽離子型曱基丙烯酸、殼聚糖或D，L-丙交酯/乙交酯共聚物(poly(D,L-lactide-co-glycolide),簡稱PLGA)都可用作細胞轉(zhuǎn)染的陽離子聚合物。對可用于細胞轉(zhuǎn)染的陽離子的評論由Holtorf和Mikos發(fā)表于"差f~庠^^#凝^^炎合參^差茵脊#，一文，《核酸療法藥學展望》，2002(183)，第367-387頁("Cationicandnon-condensingpolymer-basedgenedelivery"，PharmaceuticalPerspectivesofNucleicAcid-BasedTherapeutics,2002(183)，pages367-387)。這些現(xiàn)有技術中的已知陽離子聚合物的不足之處是要么其轉(zhuǎn)染效率低，要么雖然其具有較好的轉(zhuǎn)染效率，但毒性卻很強。此外，現(xiàn)有技術中已知的一些聚合物，特別是樹枝狀聚合物，其合成成本是相當?shù)馗?，例如，需要花費幾周的時間來合成42kDa的PAMAM樹枝狀聚合物(dendrimer)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是克服現(xiàn)有技術在細胞轉(zhuǎn)化、特別是活體內(nèi)轉(zhuǎn)化中的上述缺陷。本發(fā)明進一步的目的是提供一種制備轉(zhuǎn)化細胞的方法，該方法具有較高的轉(zhuǎn)化效率。另外，該方法盡可能地不使用細胞毒素助劑(cytotoxicauxiliaries)。本發(fā)明的又一目的是提供一種制備轉(zhuǎn)化細胞的方法，該方法中所采用的與低。所采用的該助劑盡可能地易于制備且花費不高。為達到前述目的，本發(fā)明提供了一種將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，包括如下步驟i)由生物分子和聚合物制備出配合物，所述生物分子最好是核酸，所基的環(huán)氧化物單體進行反應而制得的，以及ii)通過細胞與配合物的關聯(lián)反應(contacting)而將所述生物分子轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)。讓人非常驚訝地發(fā)現(xiàn)，借助于經(jīng)由二元胺與雙環(huán)氧化物的加聚反應而制得的聚合物，生物分子可以高效地被轉(zhuǎn)移到細胞中，且僅有輕微的細胞毒素應激反應。在本發(fā)明方法的步驟i)中，首先制備生物分子和聚合物的配合物，所述聚合物是由具有至少兩個胺基的胺基單體與具有至少兩個環(huán)氧基的環(huán)氧化物單體進行反應而制得的。優(yōu)選地，在步驟i)中所使用的用于制備所述配合物的生物分子是核酸，這樣根據(jù)本發(fā)明的方法可用于細胞的轉(zhuǎn)化。此處術語"轉(zhuǎn)化"通常是指將生物分子，尤其是核酸，更尤其是脫氧核糖核酸(DNA)，引入細胞的過程。其還特別包括轉(zhuǎn)染這一特例，它是將外源DNA引入細胞培養(yǎng)基細胞。術語"轉(zhuǎn)化，，既包括僅暫時性地將DNA-如基因，引入到細胞(瞬時轉(zhuǎn)化)，也包括永久性地將DNA結合在細胞基因組中(穩(wěn)定轉(zhuǎn)化)。步驟i)中用于制備該配合物的核酸也可采用術語多聚核苷酸作為同義詞，它可以是核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)或是它們的混合形式，其中優(yōu)選是脫氧核糖核酸。通常，可以是任何類型的多聚核苷酸，如嘌呤或嘧啶堿基的N苷或C苷，或者是修飾后的噤呤或嘧咬堿基的N苷或C苷，因此也可包括非天然的堿基。除了堿基本身之外，也可對殘?zhí)腔M行修飾。這包括具有亞基修飾鍵的核酸，例如偶磷-硫醇鹽或-醯胺鍵。所述核酸可以是單鏈、雙鏈或是多鏈的，線性的或環(huán)狀的。它可以是與細胞中存在的分子相對應的，如基因組DNA或信使RNA(mRNA),或可以是在活體內(nèi)生成的，如互補DNA(cDNA)、反義RNA(aRNA),或是人造核酸。所述核酸可包括多個亞基，至少兩個亞基，優(yōu)選8個或更多亞基，如低聚核苷酸，也可以是幾百到幾千個亞基，如特定的表達載體。優(yōu)選地，所述核酸包含有與調(diào)控序列具有功能關系的多肽的編碼信息，該編碼信息使得引入了該核酸的細胞對多肽進行表達。因此，在優(yōu)選的實施例中，核酸就是表達載體。在另一實施例中，所述核酸是pDNA(質(zhì)粒DNA)、siRNA、siRNA雙體(siRNA-duplex)、siRNA-異雙體(siRNA-hetero-duplex)或miRNA,其中術語"siRNA"表示具有長度為22個核苷酸的核糖核酸，這些核糖核酸來自于經(jīng)"Dicer"酶裂解后的雙鏈RNA(dsRNA),并在酶復合體"RISC，，(RNA誘導沉默復合體)中插入。人造siRNA也可用作步驟i)中的生物分子。除了核酸以外，也可考慮采用低聚肽、蛋白或脂質(zhì)作為生物分子。個環(huán)氧基的環(huán)氧化物單體進行反應而得到。根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實施例，所述胺基單體具有至少兩個為結構式I的功能基團l.........陽^"、R1I其中，所述功能基團中的殘基R1可以是相同的或不相同的代表C1到C20的碳氫化合物殘基，特別優(yōu)選C1到C10的碳氫化合物殘基，最佳地是C1到C5的碳氫化合物殘基，尤其是曱基殘基、乙基殘基、正丙基殘基或異丙基殘基，羥基功能化的(hydroxyfunctional)C1到C20。的碳氫化合物殘基，特別優(yōu)選羥基功能化的C1到C10。的碳氫化合物殘基，最佳的是羥基功能化的C1到C5的碳氫化合物殘基，或者是氫原子。此外，同樣優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明所述的具有結構式I的功能基團中，至少有一個殘基R1是氫原子。術語"碳氫化合物殘基"包括僅僅由碳原子和氫原子組成的殘基，以及在碳原子和氫原子中含有雜環(huán)原子、特別是卣素原子(=卣化碳氫化合物)的殘基。功能性胺基I因此可以是伯胺基、叔胺基或仲胺基，并且該胺基具有兩個伯胺基(在這種情況下，兩個殘基W均為氫原子)是最有選的。特別有選的是，殘基r/是乙烷基、曱基、-0120120&基團和氫原子。此外，優(yōu)選地，本發(fā)明的胺基單體具有結構式II:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中，X如果出現(xiàn)x，則其是氧原子或氮原子，特別優(yōu)選氧原子或氮原子，并且其為氧原子時，x原子上的rs基團并不出現(xiàn)，且同一胺基單體上的x^、子可以是不同的；R1W在結構式II中可以是相同的或不相同的代表C,到(:20的碳氫化合物殘基，特別優(yōu)選d到do的碳氫化合物殘基，最佳的是d到c5的碳氫化合物殘基，特別是甲基殘基、乙基殘基、正丙基殘基或異丙基殘基，羥基功能化的d到C加的碳氫化合物殘基，特別優(yōu)選羥基功能化的d到do的碳氫化合物殘基，最佳的是羥基功能化的d到Cs的碳氫化合物殘基，或者是氳原子。R2R"在結構式II中可以是相同或不相同的代表d到C2o的亞烴基，特別優(yōu)選d到d。的亞烴基，并最佳的是d到c6的亞烴基，或d到C2。o的氧化烯基，特別優(yōu)選Q到C50的氧化烯基，且最佳的是C2到Qo的氧化烯基，殘基f特別優(yōu)選自殘基國CH2CH2-、-CH2CH2CHr—-CHCH3CH2-，最佳的是畫CH2CH2國；n當f是亞烴基時，n為0-6的整數(shù)，特別優(yōu)選1到5，更優(yōu)選1到3，且最優(yōu)選的是1到3;當W是氧化烯基時，n為0-100的整數(shù)，特別優(yōu)選1到50，更優(yōu)選2到25，且最優(yōu)選的是2到10,并且R3在結構式II中可以是相同或不相同的代表(^到C2o的碳氫化合物殘基，特別優(yōu)選d到do的碳氫化合物殘基，更優(yōu)選d到Cs的碳氫化合物殘基，尤其是曱基殘基、乙基殘基、正丙基殘基或是異丙基殘基，羥基功能化的d到C2Q的碳氫化合物殘基，特別優(yōu)選羥基功能化的Ci到do的碳氫化合物殘基，最佳的是幾基功能化的c,到C5的碳氫化合物殘基，氫原子，或具有結構式m的殘基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>III對于殘基-CH2-CHrNI^H,特別是當R1=H及R2=-。112012-之時，其最優(yōu)選的即是殘基R3。本發(fā)明中優(yōu)選的胺基單體是具有上述結構式II,并選自包含下列單體a到n的組合:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>IV其中，結構式IV中的殘基W可以是相同或不相同的代表d到C20的碳氫化合物殘基，特別優(yōu)選d到d。的碳氫化合物殘基，更優(yōu)選C2到C5的碳氫化合物殘基，尤其是曱基殘基、乙基殘基、正丙基殘基或異丙基殘基，羥基功能化的C!到C20的碳氬化合物殘基，特別優(yōu)選羥基功能化的d到do的碳氫化合物殘基，最佳的是羥基功能化的C2到C5的碳氫化合物殘基或氫原子，殘基R"優(yōu)選地是氫原子。本發(fā)明中特別優(yōu)選的環(huán)氧化物單體是具有結構式V:脅R4R4分4/、I5iZ、4R—C一C—R—C—C—C—RT4T4l4T4UURRRRRRV不同于上述具有上述結構式II的胺基單體，根據(jù)本發(fā)明方法的另一實施例，為制備所述聚合物，也可能會采用包括隨機雜原子取代基的芳香環(huán)體系的胺基單體，特別優(yōu)選隨機雜原子取代基的C6或d()芳香環(huán)體系，其中至少綁定有兩個具有結構式I的功能基團1一，R—N、，I式中W的定義如上。"芳香環(huán)體系"優(yōu)選地表示任何滿足休克爾規(guī)則(Hiickel，srule)的sp2-雜化碳原子環(huán)狀體系，在此可選一個或多個卣素原子-如氟或氯(=囟代芳烴)，一個或多個烷基-特別是曱基，或一個或多個可綁定在碳原子上的羥基。用于制備所述聚合物的環(huán)氧化物單體，優(yōu)選地具有至少兩個結構式IV的功能基團4R一分M一4L其中，R4定義如上，并且R5如果出現(xiàn)R5,其代表d到C2o的亞烴基，特別優(yōu)選d到do的亞烴基，更優(yōu)選d到C6的亞烴基，該亞烴基特別優(yōu)選是-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-或-CHCH3CH2-，最佳的是-CH2CH2國，或者是結構式為VI的基團—0-R6-O—VI其中R6:代表d到C2。的亞烴基，特別優(yōu)選d到do的亞烴基，更優(yōu)選d到C6的亞烴基，而其中■CH2CH2-，—CH2CH2CH2-，_CHCH3CH2-，[-CH2CH2-]n，其中n-l-lO,[-CH2CH2CH2-]n,其中n二l國10，[-CHCH3CH2-]n，其中11=1國10,或者包含有乙烯和丙烯單體的聚亞烷基是特別優(yōu)選的亞烴基；或代表d到C2(K)的氧化烯基團，特別優(yōu)選C2到doo的氧化烯基團，最佳的是C2到C5的氧化烯基團，而其中nCH2-，其中11=2國100，[-CH2CH2CH2-0-]nCH2CH2CH2-，其中n=2-100,[-CHCH3CH2-0-]nCHCH3CH2-，其中n=2-100,或者包含有氧乙烯和氧丙烯單體的聚乙二醇是特別優(yōu)選的氧化烯基團。本發(fā)明中特別優(yōu)選的環(huán)氧化物單體是具有上述結構式V,并選自包含下列單體A到F的組合本發(fā)明步驟i)中優(yōu)選的用于制備該配合物的聚合物是那些由下列單體組分進行反應而獲得的aA、aB、aC、aD、aE、aF、bA、bB、bC、bD、bE、bF、cA、cB、cC、cD、cE、cF、dA、dB、dC、dD、dE、dF、eA、eB、eC、eD、eE、eF、fA、ffl、fC、fD、ffi、fF、gA、gB、gC、gD、gE、gF、hA、hB、hC、hD、hE、hF、iA、iB、iC、iD、正、iF、jA、jB、jC、jD、jE、jF、kA、kB、kC、kD、kE、kF、1A、1B、1C、1D、1E、1F、mA、mB、mC、mD、mE、mF、nA、nB、nC、nD、nE、nF、oA、oB、oC、oD、oE、oF、qA、qB、qC、qD、qE、qF、rA、rB、rC、rD、rE、rF、sA、sB、sC、sD、sE、sF、tA、tB、tC、tD、伍、tF、uA、uB、uC、uD、uE、uF、vA、vB、vC、vD、vE、vF、wA、wB、wC、wD、wE和wF。胺基單體和環(huán)氧化物單體之間的反應是加成反應，該反應形成了聚合物，其中如果采用具有伯胺基或叔胺基的胺基單體，該聚合物則具有至少兩個結構式VII的結構單元<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中，W和I^如前所定義。然而，如果使用的胺基單體包括叔胺基，形成的聚合物則具有至少兩個結構式VIII的結構單元<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中，Ri和W同樣如前所定義。通過胺基單體和環(huán)氧化物單體之間的加成聚合反應來合成該聚合物，可采用本領域技術人員已知的聚合反應方法來達成。本領域技術人員可通過簡單的初步試驗來確定該反應的條件，特別是與目標產(chǎn)物所想到達到的性質(zhì)-尤其是希望獲得的分子量-相關的反應條件，如溶劑類型、離析物濃度(胺基單體和環(huán)氧化物單體)、反應溫度和反應時間。通常在該反應時，首先將所述胺基單體和環(huán)氧化物單體同時溶解或分散-優(yōu)選溶解-在適當?shù)娜軇┲?，?yōu)選那些至少可同時部分溶解所述胺基單體和環(huán)氧化物單體的溶劑。舉例來說，該適當?shù)娜軇┦撬痛碱?，如曱醇、乙醇、l-丙醇、2-丙醇、n-丁醇、叔-丁醇或異丁醇，醚，酮，碳氫化合物，卣代烴，烷氧基烷醇-優(yōu)選烷氧基丙醇，烷基吡咯烷酮-如曱基吡咯烷酮，二烴基亞砜-如二曱亞砜，或至少兩種上述溶劑的混合物。在加合物成形的初期，溶劑中各種單體的濃度范圍通常為l-10000mmol/L，優(yōu)選范圍為l-5000mmol/L，更優(yōu)選的范圍是50-1000mmol/L,最佳范圍是100國500mmol/L。此外，如果所述聚合物是由具有相同結構的胺基單體和相同結構的環(huán)氧化物單體來制備的話，較佳的是將胺基單體和環(huán)氧化物單體的摩爾比設置為2:1到l:2，更佳的是將胺基單體和環(huán)氧化物單體的摩爾比設置為1.5:l到l:1.5,最佳的摩爾比為l:1。該加成反應一般在10到200。C的溫度范圍中進行，較佳的溫度范圍為20到150°C，最佳溫度范圍為50到100。C,反應的持續(xù)時間和所需的反應溫度主要取決于單體的反應活性。通常加成反應的反應時間為0.5到10小時，較佳的反應時間為1到5小時。當采用具有伯胺基的胺基單體時，反應一般持續(xù)到不再檢測出伯胺基為止，而當采用具有仲胺基或叔胺基的胺基單體時，反應一般持續(xù)到檢測不出仲胺基或是叔胺基為止。根據(jù)本發(fā)明方法的一個特定實施例，在步驟i)中所用到的用于制備所述配合物的聚合物可經(jīng)由將兩種不同結構的胺基單體與環(huán)氧化物單體進行反應而獲得。例如，在根據(jù)本發(fā)明方法的一個特定實施例中，可使用親水性的和疏水性的胺基單體。當使用兩種不同結構的胺基單體時，有兩種工藝程序可用于制備所述聚合物。在一方面，兩種胺基單體與環(huán)氧化物單體一同被溶解或懸浮在適當?shù)娜軇┲校谶@種情況下，如果兩種胺基單體與環(huán)氧化物單體的反應活性大致相同的話，所得到的聚合物中這兩種單體是隨機分布的。然而，在另一方面，可以先將一種胺基單體與過量的環(huán)氧化物單體反應，所述胺基單體與環(huán)氧化物的摩爾比至多為0.5:1，特別優(yōu)選地至多為0.25:1,最佳地至多為0.1:1。以這種方式獲得的聚合物，在其碳鏈的尾部具有活性的環(huán)氧化物基團。在將第一種胺基單體與環(huán)氧化物單體反應后，將制得的聚合物從反應混合物中與其它組分相分離，特別是在仍然存在環(huán)氧化物單體的情況下；所述分離可采用本領域技術人員所公知的分離方法來完成，如萃取法、蒸餾法、結晶法或透析法，特別優(yōu)選透析法。接著，倘若所述聚合物在清除了未反應的單體后成為了純凈物，將該聚合物再次溶解到適當?shù)娜軇┲?，并與第二胺基單體反應，這樣第二胺基單體就被加成到聚合物尾部的環(huán)氧化物基團上。當然可以以相同的方式將具有兩種不同結構的環(huán)氧化物單體與一種胺基單體制備成所述聚合物。此外，同樣也可以采用具有至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種不同結構的胺基單體，和/或采用具有至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種結構不同的環(huán)氧化物單體。在加聚反應完成后，可獲得溶解或分散在所使用的溶劑中的聚合物、以及未反應的胺基和/或環(huán)氧化物單體。當根據(jù)本發(fā)明的方法，在步驟i)中使用該聚合物來制備所述配合物之前，最好是對所述反應混合物進行處理，特別是將所述聚合物與所述反應混合物中的其他組分分離。對于分離方法，可再次考慮萃取法、蒸餾法、結晶法或透析法，優(yōu)選透析法，這是因為采用透析法可獲得可直接溶解或分散在溶劑中的聚合物。另外，通過選擇不同的透析膜，透析法提供了對特定大小的聚合物的選擇性離析。除了將聚合物從反應混合物中分離以外，優(yōu)選對該聚合物進行殺菌處理或在透析時對聚合物和溶劑的混合物進行殺菌處理?？刹捎帽绢I域技術人員公知的任何殺菌方法對所述聚合物或是聚合物和溶劑的混合物進行殺菌處理，如無菌過濾、，照射、uv光照射或高壓滅菌，其中最佳的是無菌過濾。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，將單體從反應混合物中與其它組分相分離并對所述聚合物進行殺菌處理之后，首先用水將反應混合物稀釋，反應混合物與水的體積比范圍為5:l到l:5，優(yōu)選2:l到l:2,且最佳為l:1，并且將稀釋后所得的反應混合物進行透析，透析時所采用的透析膜的截留分子量最大為10kDa，特別優(yōu)選5kDa，最佳的是lkDa,尤其是從水性溶劑透析時，如從去礦物質(zhì)水、生理鹽水溶液或營養(yǎng)培養(yǎng)基透析。從這種方式所獲得的水性聚合物溶液-如果該聚合物是從水中離析的話)，隨后優(yōu)選冷凍干燥的方式去除水分，這樣的話即可獲得純凈的聚合物。接著，將聚合物進行再懸浮，優(yōu)選在水介質(zhì)中進行，如去礦物質(zhì)水、生理鹽水溶液-如PBS-或營養(yǎng)培養(yǎng)基，緊接著進行無菌過濾。以這種方式獲得的無菌水性聚合物溶液中含有的聚合物的濃度范圍為0.1到500mg/ml，特別優(yōu)選0.5到100mg/ml、最佳的是I到IOmg/ml。還可以想象得到的是，最好是直接對離析后的無菌水性聚合物溶液進行快速的殺菌處理。非常重要的是對于活體外的應用，該試劑必須為無菌的。步驟i)中所使用的聚合物的分子量-采用質(zhì)譜法測定-優(yōu)選的范圍是0.1到500kDa,特別優(yōu)選l到100kDa,最佳的是10到50kDa。特別是，通過改變反應時間、單體濃度、溶劑、反應溫度、胺基單體與環(huán)氧化物單體的摩爾比以及透析膜的截留值，聚合物的平均分子量可以以簡單的方式得以控制，同樣，也可針對所需的特定轉(zhuǎn)換而優(yōu)化轉(zhuǎn)換效率。此外，根據(jù)本發(fā)明方法的特定實施例，同樣有利的是，在將所述聚合物從反應混合物中與其它組分分離之前或之后，可對所述聚合物進行化學修飾。修飾優(yōu)選地發(fā)生在聚合物的胺基或羥基上。根據(jù)本發(fā)明，所述修飾優(yōu)選的是促進細胞對所述聚合物的攝取的修飾。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的修飾包括生物素基團的附著，如DE-A-IOO16811中所描述。該文獻中公開了關于通過在陽離子聚合物上附著效應物基團的方式而將核酸分子靶標引入(targetedintroduction)到細胞的可能性，本發(fā)明在此結合引用，以作參考，并成為本發(fā)明公開的一部分。除了生物素基團，還可采用其他效應物基團修飾所述胺基或羥基，例如采用抗生素蛋白或鏈霉親和素(streptavidin)。這些基團具有可與特定細胞受體相互綁定的配合體，如鐵轉(zhuǎn)移蛋白或與碳水化合物。此外，可采用環(huán)氧丙醇處理以在所述聚合物中形成末端二醇基團，或是可通過醋酸或醋酸鹽處理以在所述聚合物中生成負電荷基團。此外，還可采用烷基化試劑-如硫酸二甲酯、溴化曱基、對甲苯磺酸曱酯或甲磺酸曱酯-將所述聚合物中的胺基至少部分地季胺化?？梢韵胂蟮玫?，所述胺基至少部分地被轉(zhuǎn)化成了精氨酸基團。物分子進行關聯(lián)而得到的，該配合物的構造是靜電相互作用的結果。可選擇地，該生物分子-如果是核酸的話-在與所述聚合物關聯(lián)之前，可先將其與適當?shù)膹娀蜃?enhancer)-特別是與多肽，如來自鮭魚精子的魚精蛋白硫酸鹽或其類似物--賻化濃縮,。也可以想象得到的是，可將該生物分子與縮氨酸關聯(lián)以便于細胞的攝取。此外也可以想象得到可將聚合物與另一轉(zhuǎn)化試劑-如卵磷脂或是非卵磷脂脂質(zhì)或是在化學上不同的聚合物的混合物-相結合，以將生物分子-特別是核酸-引入到細胞中。優(yōu)選地，該生物分子與該聚合物相關聯(lián)時，生物分子和聚合物的重量比范圍是10:l到l:50,特別優(yōu)選l:l到l:30，最佳的是l:2到1:20。本領域技術人員可通過常規(guī)實驗來確定混合物的最優(yōu)比例。優(yōu)選地，當生物分子為核酸時，在負電荷過剩的情況中，通過設定聚合物與生物分子的比例而使得zeta電位大約在+20到+50mV之間。生物分子和聚合物的關聯(lián)優(yōu)選在水性溶劑中進行，例如生理鹽水溶液、緩沖溶液或營養(yǎng)培養(yǎng)基，該關聯(lián)反應優(yōu)選在pH范圍為5到8，特別優(yōu)選5.5到7.4的情況下進行，且溫度范圍在4到40。C,優(yōu)選10到37。C，最佳地為15到25。C。優(yōu)選地，該關聯(lián)反應的進行是將組分的水溶液相混合，并且這些溶液中的一種或兩種都可以是緩沖液，且可選擇性地包含其他添加劑。特別優(yōu)選地，配合物的生成可以是在生物分子--如當生物分子是核酸時-不在生理鹽濃縮液中分離的情況下發(fā)生關聯(lián)反應，這可筒單地通過采用溴化乙錠置換試驗(ethidiumbromidedisplacementassay)來測定(Plank等,1999)。本發(fā)明方法的步驟ii)中，將上述生物分子和聚合物形成的配合物與細胞進行關聯(lián)，以獲得引入了該生物分子的細胞，并且所述關聯(lián)可以發(fā)生在活體內(nèi)或活體外，盡管對細胞進行活體外處理是特別優(yōu)選的。緊接著在該細胞存在的情況下制備生物分子和聚合物的配合物是基本可能的(因此步驟i)和步驟ii)是同時進行地)?？梢韵胂蟮玫角覂?yōu)選地是，可以在待處理的細胞不存在的情況下制備該配合物，這樣的話步驟ii)就在步驟i)之后進行。在活體外處理的情況下，細胞或組織可與配合物一起在適當?shù)沫h(huán)境中進行孵化，原核生物與真核生物都可被看作是細胞。如果要對培養(yǎng)細胞進行處理，可向營養(yǎng)培養(yǎng)基中添加該配合物或含有該配合物的無菌水性溶液。本發(fā)明的方法既適宜于在細胞培養(yǎng)基上生長的細胞(懸浮細胞)，也適宜于黏附在在培養(yǎng)基而表面生長的細胞(貼壁細胞)。對于活體內(nèi)處理，所述配合物或含有配合物的無菌水性溶液可應用于包括人類的動物或植物有機體內(nèi)。該應用可以是系統(tǒng)的或是局部的，并且對于動物有機體，特別適用于非腸道施用，例如靜脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、肌肉注射、皮層或皮下注射、靜脈輸液、肺部、口腔、鼻部、真皮或透皮給藥。在適當?shù)臈l件和相應的劑型下，其它施用途徑，如口服/腸道給藥，也是可以的。所述配合物或含有配合物的無菌水性溶液也可局部直接地應用于把組織，例如器官或腫瘤。對于活體內(nèi)施用，該配合物需要制成藥劑兼容的形式，為此，可將其與藥劑容許的賦形劑相結合。而其劑型取決于給藥方式。例如，對于注射劑或是輸液劑，該配合物可以制成等滲壓鹽溶液或等滲亞緩沖液-如PBS或林嘉氏溶液(Ringer'ssolution)，對于肺部給藥，可以制成藥劑兼容的氣霧劑(arosol)。也可選擇固體劑型，取決于使用意圖，如凍干劑這，在給藥前可將該固體制劑在水中再生。適當?shù)乃巹┵x形劑和劑型對本領域技術人員來說是公知的，例如可參見Gennaro(Publ.),雷明頓"藥劑科學與實踐"，第19版，1995，美國賓州阿斯頓，麥克出版有限7>司[Ge皿aro(Publ.)，Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thedition,1995，MackPublishingCo"Eastern,PA,USA]。在這種方式下，采用適當?shù)暮怂嶙鳛樯锓肿?，該配合物可被用于基因療法的醫(yī)藥品。本領域技術人員可根據(jù)病癥、病人狀況、治療方法和其他因素來選擇劑量。通常，當生物分子是核酸時，對于使用，DNA給藥的數(shù)值范圍是0.1ng/kg體重到100pg/kg體重，優(yōu)選2.5jig/kg體重到10pg/kg體重。對為達到一開始所提出的目標所做出的貢獻是，提供了一種采用前述方法被引入了生物分子的細胞。使用上述聚合物將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中，尤其是細胞的轉(zhuǎn)化，對于為達到一開始所提出的也做出了貢獻。所述聚合物是通過具有至少兩個胺基的胺基單體與具有至少兩個環(huán)氧基的環(huán)氧化物單體之間的反應而得到的。對為達到一開始所提出的目標所做出的進一步貢獻是，同時提供了一套將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中-特別是用于細胞轉(zhuǎn)化-的試劑盒，其包括(Bl)所述聚合物，該聚合物可通過具有至少兩個胺基的胺基單體與具有至少兩個環(huán)氧基的環(huán)氧化物單體之間的反應而制得，以及，(B2)其他試劑盒組分，特別是促進劑(用于核酸的濃縮或是改善攝取)，例如，來自鮭魚精子的魚精蛋白硫酸鹽，附加緩沖液-如PBS或生理鹽水，控制轉(zhuǎn)化效率的試劑以及附加轉(zhuǎn)化試劑-如卵磷脂或非卵磷脂脂質(zhì)或附加聚合物。基于將要被轉(zhuǎn)染的細胞的特定類型，聚合物與類脂物或脂質(zhì)體的結合物、或各種聚合物的混合物都可能是有用的。因此，也基于本專利申請制成的混合物但在化學性質(zhì)上不同的聚合物也可以被采用。對為達到一開始所提出的目標所做出的進一步貢獻是，同時提供了一種生物分子—優(yōu)選核酸—與前述聚合物的配合物，該聚合物可通過具有至少兩個胺基的胺基單體與具有至少兩個環(huán)氧基的環(huán)氧化物單體之間的反應而制得。例如，該配合物可通過將生物分子和聚合物在適當?shù)乃泽w系中相關聯(lián)而制得，這已經(jīng)在前面本發(fā)明的方法中進行了描述。對為達到一開始所提出的目標所做出的貢獻是，同時提供了一種治療組合物，包含上述生物分子-優(yōu)選核酸-與前述聚合物的配合物，該聚合物可通過具有至少兩個胺基的胺基單體與具有至少兩個環(huán)氧基的環(huán)氧化物單體之間的反應而制得。除了所述配合物，該治療組合物也可特別包括藥劑容許的賦形劑，如生理鹽水。類似地，采用上述配合物制備這樣的藥物組合物同樣對為達到一開始所提出的目標做出了貢獻。對為達到一開始所提出的目標所做出的貢獻是，同時提供了與根據(jù)本發(fā)明的方法相關的聚合物，該聚合物可通過具有至少兩個胺基的胺基單體與具有至少兩個環(huán)氧基的環(huán)氧化物單體之間的反應而制得，該聚合物可用于人體或動物體的治療，特別是采用基因療法治療疾病。最后，本發(fā)明也涉及一種通過基因療法治療疾病的方法，包含以下步驟I)從生物體中切取細胞；II)將生物分子轉(zhuǎn)移到所切取的細胞中，優(yōu)選地，采用本發(fā)明中將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法將切取的細胞進行轉(zhuǎn)化，以及III)將所述細胞復原到生物體。由于細胞可能開始被考慮用于所說的基因治療，特別是，所有的細胞都可得到應用，只要細胞對抵抗切取具有足夠的抗性、被引入-特別是轉(zhuǎn)化-了生物分子、以及從生物體或是向生物體進行了再培植。同樣，這些細胞也需要盡可能長時間地存活，這樣生物體才可從所述處理后的細胞-如從轉(zhuǎn)化后的細胞分泌的蛋白質(zhì)-中足夠地受益。特別是，皮膚細胞-如纖維原細胞、肝細胞、T-細胞—如T-淋巴細胞、或骨髓細胞特別適合作為本發(fā)明的細胞。下面將在非限制性實施例的基礎上，對本發(fā)明進行更加詳細的描述。圖1所示是分別炎用太勞明的古法鳥梧纟右的Huh-7進行轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率比較圖。"MK-7-ll"是對從下面實施例中的烯四胺和乙二醇二縮水甘油醚中而獲得的聚合物的稱謂。三乙具體實施方式(細胞的轉(zhuǎn)化)聚合物的制備將三乙烯四胺(lOmmol)和乙二醇二縮水甘油醚(lOmmol)溶解在50ml的二曱亞砜中，并將該溶液置于60。C溫度下的圓底瓶中3小時。接著，采用相同體積的去離子水將所述反應混合物稀釋到兩倍體積，并采用去離子水透析18小時，并換水3次(透析膜的截留分子量為lkDa)。在透析后，將樣品冷凍干燥，獲得水色透明、粘性的物質(zhì)，然后將其溶解在無內(nèi)毒素的去鹽水中，獲得的聚合物濃度為3mg/ml。采用無菌過濾對由此獲得的水性聚合物溶液進行殺菌處理。細胞的培養(yǎng)將肝細胞瘤細胞系Huh-7種植在每孔100plDMEM培養(yǎng)基、密度為2乂104個細胞/孔的96-孔板上。細胞播種24小時后，進行轉(zhuǎn)染。配合物的制備為了將核酸和聚合物制備成配合物，表l中列出了溶解于DMEMS培養(yǎng)基(O.Ol^ig/^il*)中的DNA的總量(pCMV卩質(zhì)體，克隆技術實驗室(ClontechLaboratories)),并且按表格l中的量將從三乙烯四胺和乙二醇二縮水甘油醚("MK-7-ll")中獲得聚合物的水性無菌溶液吸入96-孔板的孔中，然后在室溫下孵化10分鐘。采用現(xiàn)有技術中已知的來自德國希爾登的QiagenGmbH公司的轉(zhuǎn)染試劑SuperFect(SuperFectfromthecompanyQiagenGmbH，Hilden，Germany)進行轉(zhuǎn)染，并作為對照實驗。*注意在該方法中DNA與聚合物之間的配合物制備是在50inl不含血清的培養(yǎng)基中進行的。所列出的濃度與其體積有關。在10分鐘的孵化時間之后，通過吸管添力口100nl含血清的培養(yǎng)基，隨后將全體溶液(150^1)加入到細胞中，當中的培養(yǎng)基已被事先去除。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>細胞的轉(zhuǎn)染對于轉(zhuǎn)染，將該配合物添加到細胞中，并在37。C下孵化4小時，已提前快速更換培養(yǎng)基。在孵化4小時后，更換培養(yǎng)基，采用新鮮的細胞培養(yǎng)基替換含有配合物的溶液。在將細胞采用本發(fā)明的配合物孵化或采用核酸和轉(zhuǎn)染劑SuperFect孵化后，在細胞轉(zhuǎn)染的2天后，采用裂解緩沖液(5mMMgCl2、l%NP-40、100mMNaCl、10MmTris/HCl，pH7.4)對細胞進行裂解。轉(zhuǎn)染效率采用P-半乳糖苷酶篩選法測定，以ONPG(2-硝基苯-P-D-半乳糖苦，MerckKGaA,Darmstadt,Germany)作為基質(zhì)。轉(zhuǎn)染效率(在每毫升的單位P-半乳糖苷酶中)見圖1所示。由圖1可見，采用本發(fā)明的方法，可獲得比現(xiàn)有技術中已知的轉(zhuǎn)化試劑更好的轉(zhuǎn)染效率。權利要求1.一種將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，包含以下步驟:i)由生物分子和聚合物制備出配合物，所述生物分子優(yōu)選核酸，所述聚合物是由具有至少兩個胺基的胺基單體與具有至少兩個環(huán)氧基的環(huán)氧化物單體進行反應而制得的；ii)通過細胞與配合物的關聯(lián)反應而將所述生物分子轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)。2.根據(jù)權利要求1所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，步驟i)中配合物的制備是在pH值為6到8的條件下將聚合物與生物分子進^f亍關聯(lián)反應。3.根據(jù)前述任意一項權利要求所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，所述生物分子是脫氧核糖核酸。4.根據(jù)前述任意一項權利要求所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，所述胺基單體具有至少兩個結構式為I的功能基團<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中，所述功能基團中的殘基W是相同的或不相同的代表d到C2o的碳氫化合物殘基、羥基功能化的d到C20的碳氫化合物殘基，或者氫原子。5.根據(jù)前述任意一項權利要求所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，所述胺基單體具有結構式為II的功能基團<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中，n是1-100中的整數(shù)，X如果出現(xiàn)X，則是氧原子或氮原子，并且當X為氧原子時，X原子上的R3基團并不出現(xiàn)，R1Ri在結構式II中是相同的或不相同的代表d到C2o的碳氫化合物殘基、羥基功能化的C,到C2C的碳氫化合物殘基，或者氫原子；r2je在結構式n中是相同或不相同的代表d到C2()的亞烴基、或d到C2o的亞烴基、或d到C2o的氧化烯基；R3RS在結構式II中是相同或不相同的代表d到C2o的碳氫化合物殘基、羥基功能化的d到C2o的碳氫化合物殘基、氫原子或結構式為III的殘基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>III6.根據(jù)前述任意一項權利要求所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，所述胺基單體包括芳香環(huán)體系，其中綁定了至少兩個結構式為I的功能基團<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>I其中，R^代表d到C2。的碳氫化合物殘基、羥基功能化的d到C2Q的碳氫化合物殘基，或者氫原子。7.根據(jù)前述任意一項權利要求所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，所述芳香環(huán)體系是苯環(huán)、嘧啶環(huán)、吡啶環(huán)或是三氧烯環(huán)。8.根據(jù)權利要求4-7所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，其中至少一個W殘基是氫原子。9.根據(jù)前述任意一項權利要求所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，所述環(huán)氧化物單體具有至少兩個結構式為IV的功能基團<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>IV其中，R4殘基W在結構式IV中是相同或不相同的代表d到C2o的碳氫化合物殘基、羥基功能化的Q到C20碳氫化合物殘基，或者氫原子。10.根據(jù)前述任意一項權利要求所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，所述環(huán)氧化物單體具有結構式V:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>V其中，R4代表d到C20的碳氫化合物殘基、羥基功能化的d到C20的碳氫化合物殘基、或者氫原子；以及R5如果出現(xiàn)R5,則其代表Q到C2o的亞烴基，或者結構式為VI的基團<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>VI其中f^代表d到C2Q的亞烴基或者d到C2QQ的氧化烯基。11.根據(jù)前述任意一項權利要求所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，所述聚合物具有至少兩個結構式為VII的結構式單元<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中，R1代表d到C20的碳氫化合物殘基、羥基功能化的d到C2。的碳氫化合物殘基、或者氫原子；R4代表為d到C20的碳氫化合物殘基、羥基功能化的d到C20的碳氫化合物殘基、或者氫原子。12.根據(jù)前述任意一項權利要求所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，所述聚合物的平均分子量為O.lkDa。13.根據(jù)前述任意一項權利要求所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，所述聚合物是通過將兩種結構不同的胺基單體與一種環(huán)氧基單體反應而制得的。14.根據(jù)權利要求13所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，其中一種胺基單體是親水性的單體，另一種胺基單體是疏水性的單體。15.根據(jù)權利要求13或14所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，首先將一種胺基單體與所述環(huán)氧化物單體反應，該胺基單體與環(huán)氧化物單體反應的摩爾比至多為0.5:1，在將所述單體間的反應產(chǎn)物分離之后，再將反應產(chǎn)物與另一胺基單體反應。16.根據(jù)前述任意一項權利要求所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，所述聚合物是通過將兩種結構不同的環(huán)氧基單體與一種胺基單體反應而制得的。17.根據(jù)前述任意一項權利要求所述的將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的方法，其特征在于，對所述聚合物中的胺基或羥基進行化學修飾。18.聚合物在將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的應用，所述聚合物是由具有至少兩個胺基的胺基單體與具有至少兩個環(huán)氧基的環(huán)氧化物單體進行反應而制得的。19.一種將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的試劑盒，其特征在于，包括(卩l(xiāng))權利要求4-17定義的聚合物，所述聚合物是由具有至少兩個胺基的胺基單體與具有至少兩個環(huán)氧基的環(huán)氧化物單體進行反應而制得的；以及，(卩2)其他試劑盒組分。20.權利要求19所述的試劑盒在權利要求l-17所定義的方法中的應用。21.—種由生物分子和聚合物制備的配合物，所述生物分子優(yōu)選核酸，所述聚合物是由具有至少兩個胺基的胺基單體與具有至少兩個環(huán)氧基的環(huán)氧化物單體進行反應而制得的。22.—種治療組合物，包含由生物分子和聚合物制備的配合物，其特征在于，所述生物分子優(yōu)選核酸，所述聚合物是由具有至少兩個胺基的胺基單體與具有至少兩個環(huán)氧基的環(huán)氧化物單體進行反應而制得的。23.由生物分子和聚合物制備的配合物在制備治療組合物中的應用，其特征在于，所述生物分子優(yōu)選核酸，所述聚合物是由具有至少兩個胺基的胺基單體與具有至少兩個環(huán)氧基的環(huán)氧化物單體進行反應而制得的。24.—種用于人體或動物體治療用藥的聚合物，其特征在于，所述聚合物是由具有至少兩個胺基的胺基單體與具有至少兩個環(huán)氧基的環(huán)氧化物單體進行反應而制得的。25.—種通過基因療法治療疾病的方法，其特征在于，包含以下步驟I)從生物體中切取細胞；II)將生物分子采用權利要求1-17所定義的方法轉(zhuǎn)移到所述切取的細胞中；以及III)將所述細胞復原到生物體。全文摘要本發(fā)明涉及一種將生物分子結合到細胞中的方法，所述方法包括下列步驟i)由生物分子和聚合物制備出配合物，所述生物分子優(yōu)選核酸，所述聚合物是由具有至少兩個胺基的胺基單體與具有至少兩個環(huán)氧基的環(huán)氧化物單體進行反應而制得的；ii)通過細胞與配合物的關聯(lián)反應而將所述生物分子轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)。本發(fā)明進一步涉及采用所述方法獲得的轉(zhuǎn)化細胞，一種特殊聚合物在將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的應用，一種將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的試劑盒(kit)、所述試劑盒在將生物分子轉(zhuǎn)移到細胞中的應用，一種生物分子和聚合物制備的配合物，一種治療劑組分，一種由生物分子和聚合物制備的配合物的應用，采用基因療法治療疾病的聚合物以及疾病的基因療法。文檔編號A61K47/34GK101384282SQ200780005929公開日2009年3月11日申請日期2007年2月21日優(yōu)先權日2006年2月23日發(fā)明者烏特·克魯格,克里斯多福·埃爾巴赫申請人:奇亞根有限責任公司