專利名稱：：新型低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽以及使用其的化妝品、醫(yī)藥組合物和食品組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：.明，鹽以及使用其的化妝
背景技術(shù)：
：品'醫(yī)藥組合物和食品組合物,透明質(zhì)酸(平均分子量50萬~200萬)是大量存在于生物體內(nèi)的眾多組織(例如皮下組織、目MU關(guān)節(jié))的粘多糖類，由于其高保濕功能，作為例如化妝品的成分已廣泛利用(例如，特開2000-095660號(hào)7>才艮)。此外，通過經(jīng)口攝取透明質(zhì)酸，發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)償生物體本來具有的透明質(zhì)酸含量的降低，改善皮膚的保濕、彈力性和柔軟性的效果，因此透明質(zhì)酸及其鹽已添加到各種食品中。但是，透明質(zhì)酸為高分子的多糖類，因而一般難以吸收到生物體內(nèi)。例如，通過將透明質(zhì)酸涂布到皮膚上，能夠防止水分從皮膚蒸發(fā)，但由于透明質(zhì)^A高分子，因此難以滲透到皮膚組織，大部分只是停留在皮膚的表面。因此，如果通過洗臉或入浴等沖洗皮膚表面的透明質(zhì)酸，則皮膚的保濕效果難以持續(xù)。
發(fā)明內(nèi)容酸和/或其鹽以及4吏用其的化妝品、醫(yī)藥組合物和食品組合物。本發(fā)明第1方式的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，平均分子量為5000~20000，并且在分子量分布中，分子量1萬以下的成分的比例為40重量％以上且分子量5萬以上的成分的比例為5重量％以下。在上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽中，在上述分子量分布中，分子量l萬以下的成分的比例能夠?yàn)?0重量％以上且分子量5萬以上的成分的比例能夠?yàn)?重量％以下。在這種情況下，在上述分子量分布中，分子量1上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，其能夠通過使透明質(zhì)酸和/或其鹽分!Mt酸性含水介質(zhì)中而得到。上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，其能夠通過在加熱下使透明質(zhì)酸和/或其鹽^t在pH2以下的含水介質(zhì)中后，對(duì)除去上述含7jC介質(zhì)而得到的殘留物進(jìn)行加熱干燥而得到。上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽中，1重量%水溶液的運(yùn)動(dòng)粘度能夠?yàn)?,7s以下。在上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的0.lg/mL水溶液(10mL)中添加0.5g/mL的十六烷基氯化吡啶水溶液(0.05g)而得到的液體的吸光度(A660)能夠?yàn)?.4Abs以上。上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的氯化鈉的含量能夠?yàn)?.5%以下。本發(fā)明第2方式的化妝品，含有上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽。本發(fā)明笫3方式的醫(yī)藥組合物，含有上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽。本發(fā)明第4方式的食品組合物，含有上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽。在本發(fā)明中，所謂"透明質(zhì)酸"，是指具有1個(gè)以上由葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺的二糖形成的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元的多糖類。此外，作為"透明質(zhì)酸的鹽"，并無特別限定，優(yōu)選是藥學(xué)上可容許的鹽，例如，可以列舉鈉鹽、鉀鹽、釣鹽、鋅鹽、鎂鹽、銨鹽等。利用上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，向生物體內(nèi)的吸收性(例如經(jīng)皮吸收性)優(yōu)異。因此，能夠期待肌膚改善效果。由此，上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，可以用作例如化妝品、醫(yī)藥組合物和食品組合物的成分。圖l表示實(shí)施例2中得到的低分子透明質(zhì)酸的色譜。圖2表示在含有實(shí)施例2中得到的低分子透明質(zhì)酸(樣品C)的液體中添加CPC溶液得到的液體的吸光度的測(cè)定結(jié)果。圖3是表示在分別含有樣品A~C的液體中添加CPC溶液得到的液體的外觀的照片。圖4表示在試驗(yàn)例1中將試料粘貼5小時(shí)的試驗(yàn)組1~3的分析樣品的HPLC分析圖。圖5是表示在試驗(yàn)例1中試驗(yàn)組1的試料的貼附時(shí)間和試驗(yàn)組1的分析樣品中每lg皮膚的透明質(zhì)酸增加量的關(guān)系的圖。圖6是表示試驗(yàn)例1中作為確認(rèn)試驗(yàn)進(jìn)行的低分子色鐠柱分析中試驗(yàn)組1~3的各分析樣品以及實(shí)施例2中得到的低分子透明質(zhì)酸的HPLC分析圖。具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明的一實(shí)施方式所涉及的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽、以及使用其的化妝品、醫(yī)藥組合物和食品組合物進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)予說明，本實(shí)施方式和后述的實(shí)施例中，意味著"質(zhì)量％"。1、低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽本發(fā)明的一實(shí)施方式涉及的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，平均分子量為5000~20000，并且在分子量分布中，分子量1萬以下的成分的比例為40重量％以上且分子量5萬以上的成分的比例為5重量％以下。上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，向生物體內(nèi)的吸收性優(yōu)異。例如，上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的經(jīng)皮吸收性優(yōu)異，將上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽涂布到皮膚上時(shí)，上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽不只停留在皮膚表面，而且滲透到皮膚組織內(nèi)部。即，能夠保持皮膚的7jc分量，因而能夠?qū)⑵つw保持在濕潤(rùn)的狀態(tài)下。上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，可以經(jīng)口攝取，可以經(jīng)皮吸收到生物體內(nèi)，或者可以通過注射等注入生物體內(nèi)。上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的平均分子量，從向生物體內(nèi)的吸收性高的方面出發(fā)，更優(yōu)選為5000~15000，進(jìn)一步優(yōu)選為5000-12000。上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽中，從向生物體內(nèi)的吸收性方面出發(fā)，優(yōu)選分子量1萬以下的成分的比例為40重量％以上且平均分子量5萬以上的成分的比例為1重量％以下，更優(yōu)選分子量1萬以下的成分的比例為50重量％以上且分子量5萬以上的成分的比例為1重量％以下。以下，對(duì)本發(fā)明中規(guī)定的平均分子量和分子量分布的測(cè)定方法進(jìn)行i兌明。1.1.平均分子量的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明中規(guī)定的平均分子量是由試料的特性粘度算出的分子量。本發(fā)明中，采用由運(yùn)動(dòng)粘度求出特性粘度，將該特性粘度換算為分子量的方法，來求出低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的平均分子量。更具體地iJL在該方法中，使用后面說明的烏氏粘度計(jì)測(cè)定運(yùn)動(dòng)粘度，由該運(yùn)動(dòng)粘度的值求出特性粘度，將該特性粘度換算為平均分子量。一般地，為了求出試料的特性粘度，首先，制備多個(gè)試料溶液，由烏氏粘度計(jì)的試料溶液的流下秒數(shù)和溶劑的流下秒數(shù)，基于下述式(1)和式(2)，算出比粘度和比濃粘度。(式l)比粘度-^t^^Z^—i.....(1)溶劑的流下秒數(shù)(式2)比濃粘度=--….(2)干燥物換算的試料濃度(g/100mL)其次，對(duì)于各試料溶液，以得到的比濃粘度為縱軸，以干燥物換算的試料濃度為橫軸標(biāo)繪制作校正曲線，通過將上述試料濃度外推到0，得到試料的特性粘度。試料為透明質(zhì)酸和/或其鹽時(shí)，根據(jù)下述式(3)，能夠由試料的特性粘度求出平均分子量M。(式3)特性粘度(dL/g)=k，NT(3)(上述式(3)中，k，-O.036，oc=0.78)。其次，對(duì)于成為求出上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的分子量時(shí)的指標(biāo)的運(yùn)動(dòng)粘度的測(cè)定方法進(jìn)行說明。上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的水溶液的運(yùn)動(dòng)粘度，能夠使用烏氏粘度計(jì)(柴田科學(xué)器械工業(yè)林式會(huì)社制)進(jìn)行測(cè)定。此時(shí)，選擇流下秒數(shù)為200~1000秒的系數(shù)的烏氏粘度計(jì)。此外，測(cè)定在301C的恒溫水槽中進(jìn)行以使溫度不變化。由采用烏氏粘度計(jì)測(cè)定的上述水溶液的流下秒數(shù)和烏氏粘度計(jì)的系數(shù)的乘積，能夠求出運(yùn)動(dòng)粘度(單位咖7s)。上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，優(yōu)選1質(zhì)量％水溶液的運(yùn)動(dòng)粘度為2咖7s以下，更優(yōu)選為1.8mm7s以下，進(jìn)一步優(yōu)選為1.5mm7s以下'在上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽中，如果1質(zhì)量％水溶液的運(yùn)動(dòng)粘度超過2mm7s，則上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的添加量超過規(guī)定值時(shí)，粘度變得過高，難以制備，或者對(duì)得到的化妝品、醫(yī)藥組合物和食品組合物的粘度產(chǎn)生影響，有時(shí)使用感降低，或阻礙食感。1.2.分子量分布分子量分布B定本發(fā)明的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的特性的值。本發(fā)明中規(guī)定的分子量分布，通過使用凝膠過濾柱對(duì)試料進(jìn)行液相色鐠分析而得到。上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽是因重復(fù)結(jié)構(gòu)單元(N-乙-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸)的個(gè)數(shù)而具有不同分子量的多種成分的混合物。因此，通過使用^過濾柱對(duì)試料進(jìn)行^目色鐠分析，能夠利用分子尺寸將構(gòu)成上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的成分分離。對(duì)于上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，如果使用凝膠過濾柱進(jìn)行液相色鐠分析，則M持時(shí)間長(zhǎng)的順序，得到N-乙酰葡糖胺、D-葡糖醛酸、透明質(zhì)酸(二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)單元l個(gè))、透明質(zhì)酸(四糖重復(fù)結(jié)構(gòu)單元2個(gè))、透明質(zhì)酸(六糖重復(fù)結(jié)構(gòu)單元3個(gè))、透明質(zhì)酸(八糖重復(fù)結(jié)構(gòu)單元4個(gè))……的峰。根據(jù)該結(jié)果，求出透明質(zhì)酸的保持時(shí)間對(duì)分子量的校正曲線，由該校正曲線，算出對(duì)應(yīng)于規(guī)定分子量的保持時(shí)間，通過用該保持時(shí)間分割峰，能夠求出處于規(guī)定分子量范圍中的成分的比例。例如，分子量1萬以下的成分的比例，能夠由上述校正曲線算出對(duì)應(yīng)于分子量1萬的保持時(shí)間，用該保持時(shí)間以下的成分的吸收面積除以總吸收面積而求出。同樣地，分子量5萬以上的成分的比例，通過由上述校正曲線算出對(duì)應(yīng)于分子量5萬的保持時(shí)間，用該保持時(shí)間以上的成分的吸收面積除以總吸收面積而求出。1.3.用CPC沉淀法求得的液體的吸光度的測(cè)定CPC沉淀法是用作粘多糖類的確認(rèn)試驗(yàn)的試驗(yàn)方法。以透明質(zhì)酸為代表的粘多糖類，已知與CPC(十六烷基氯化吡啶)等季銨鹽結(jié)合而產(chǎn)生沉淀。本發(fā)明中，能夠?qū)⑨娪肅PC沉淀法得到的液體的吸光度的值用作判定本發(fā)明的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的存在用的指標(biāo)之一。本實(shí)施方式涉及的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，優(yōu)選在上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的0.lg/mL水溶液(10mL)中添加0.5g/mL的十六烷基氯化魂咬水溶液(CPC7jc溶液X()■05g)而得到的液體的吸光度(A66。)為0.4Abs以上。即，吸光度(A66。)為對(duì)于波長(zhǎng)660nm的光的吸光度，廣泛用作鑒定液體"渾濁"用的指標(biāo)。在此，本實(shí)施方式涉及的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，由于其分子量和分子量分布的特性，制備上述混合液時(shí)，具有難以形成沉淀、液體白濁的傾向。即，上述吸光度的值成為表示本實(shí)施方式涉及的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽存在的指標(biāo)。1.4.制造在酸性含7jc介質(zhì)中而制造。采用該方法，與公知的方法(例如使用酶等將透明質(zhì)酸低分子化的方法、在堿條件下低分子化的方法)相比，得到的上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的分離精制容易，因此能夠以低成本、高收率制造上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽。1.4丄原料作為上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的原料的透明質(zhì)酸及其鹽(以下也稱為"原料透明質(zhì)酸及其鹽")，通常以對(duì)雞冠、臍帶、眼球、皮膚、軟骨等生物組織或者鏈球菌屬的微生物等生產(chǎn)透明質(zhì)酸的微生物進(jìn)行培養(yǎng)而得到的培養(yǎng)液等作為原料，由這些原料提取(進(jìn)而根據(jù)需要進(jìn)行精制)而得到。例如，由雞冠提取的透明質(zhì)酸和/或其鹽的分子量通常為200萬~800萬。作為原料透明質(zhì)酸和其鹽，可以使用該粗4I:取物和精制物的任一種，優(yōu)選精制物，具體地說，優(yōu)選透明質(zhì)酸和/或其鹽的純度為90%(質(zhì)量比)以上的精制物。使用純度90%以上的原料透明質(zhì)酸及其鹽作為原料時(shí)，保存中難以引起色調(diào)、風(fēng)味的變化，因此得到穩(wěn)定的化妝品、醫(yī)藥組合物和食品組合物。再有，由低分子透明質(zhì)酸轉(zhuǎn)化為低分子透明質(zhì)酸的鹽的方法以及由低分子透明質(zhì)酸的鹽轉(zhuǎn)化為低分子透明質(zhì)酸的方法，并無特別限定，能夠使用^i^p的方法進(jìn)行。作為由低分子透明質(zhì)酸轉(zhuǎn)化為低分子透明質(zhì)酸的鹽的方法，可以列舉例如使用堿水溶液(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化銨等的水溶液)進(jìn)行處理的方法。此外，作為由低分子透明質(zhì)酸的鹽轉(zhuǎn)化為低分子透明質(zhì)酸的方法，可以列舉例如^f吏用酸7jc溶液(例如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸等的水溶液)進(jìn)行處理的方法、使用酸性陽離子交換樹脂的方法。1.4.2.制造方法1.4.2-1.錄工序如上所述，上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，能夠通過使透明質(zhì)酸和/或其鹽a在酸性含水介質(zhì)中而制造。在M工序中，例如，能夠通過將粉末狀的原料透明質(zhì)酸和/或其鹽添加到酸性含水介質(zhì)中進(jìn)行攪拌而進(jìn)行。在此，粉末狀的透明質(zhì)酸和/或其鹽在幾乎不溶解地^bfr含7JC介質(zhì)中。因此，在這種情況下，通過停止攪拌，該粉末沉淀。在此，通過調(diào)節(jié)攪拌速度、攪拌時(shí)間，能夠調(diào)節(jié)低分子化的程度。此外，使透明質(zhì)酸和/或其鹽分散在含水介質(zhì)中的時(shí)間，可以根據(jù)含7jC介質(zhì)的pH或溫度進(jìn)行適當(dāng)確定。通過使原料透明質(zhì)酸和/或其鹽^4含水^h質(zhì)中，能夠在幾乎無褐變的狀態(tài)下得到上述透明質(zhì)酸和/或其鹽。由此，不需要用于脫色的新的精制工序，因此能夠?qū)崿F(xiàn)生產(chǎn)工序的省力化。此外，能夠在加熱下進(jìn)行上述的分歉工序。更具體地說，能夠?qū)⑦厰?介質(zhì)加熱?；蛘呖梢灶A(yù)先將酸性含7jC介質(zhì)加熱，向其添加原料透明質(zhì)酸和/或其鹽，保持溫度。在此，酸性含7jc介質(zhì)的加熱溫度優(yōu)選為30~701C。通過將酸性含水介質(zhì)加熱到該溫度范圍內(nèi)，能夠通過l小時(shí)以內(nèi)的加熱，穩(wěn)定地低分子化到目標(biāo)分子量。如果不在加熱下進(jìn)行上述^t工序，而是在常溫(小于301C)下進(jìn)行，也可以將原料透明質(zhì)酸和/或其鹽低分子化。但是，在這種情況下，與在加熱下進(jìn)行時(shí)相比需要非常長(zhǎng)的時(shí)間。另一方面，也可以4吏上述*工序中的加熱溫度高于70匸。但是，在這種情況下，如果長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行加熱則低分子化過度進(jìn)行，有時(shí)難以穩(wěn)定地調(diào)節(jié)到目標(biāo)分子量。1.4.2-2.加熱干燥工序在上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的制造方法中，在上述的使透明質(zhì)酸和/或其鹽^在酸性含水介質(zhì)中的工序后，能夠包含將除去上述含水介質(zhì)而得到的殘留物加熱干燥的工序。在此，在加熱干燥工序中，例如，將從通過上述^t工序低分子化的透明質(zhì)酸和/或其鹽中除去含水介質(zhì)而得到的殘留物加熱干燥。含水介質(zhì)的除去，可以列舉例如用過濾器的過濾或離心分離等物理手段、使用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器等的蒸餾餾去。此外，在加熱干燥工序中，優(yōu)選使用例如保溫箱、熱風(fēng)干燥機(jī)等從得到的殘留物中除去殘留的含水介質(zhì)和水分。加熱干燥工序中的溫度和時(shí)間并無特別限定，溫度優(yōu)選60951C，更優(yōu)選70~90匸，進(jìn)一步優(yōu)選7080X:。加熱干燥工序中的溫度小于60X3時(shí)，有時(shí)干燥效率降低，另一方面，加熱干燥工序中的溫度超過951C時(shí)，有時(shí)產(chǎn)生褐變。此夕卜，加熱干燥工序中的時(shí)間優(yōu)選6~48小時(shí)，更優(yōu)選12~36小時(shí)。如果加熱干燥工序中的時(shí)間小于6小時(shí)，有時(shí)干燥效率降低，另一方面，如果加熱干燥工序中的時(shí)間超過48小時(shí)，有時(shí)產(chǎn)生褐變。通過加熱干燥工序，能夠進(jìn)一步將通過上述^:工序低分子化的透明質(zhì)酸和/或其鹽低分子化，因此能夠有助于低分子化工序的效率提高。此外，通過加熱干燥工序，能夠容易地得到上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽。1.4.2-3.含水介質(zhì)在上述制造方法中，含水介質(zhì)是指包含水的透明質(zhì)酸和/或其鹽的分散介質(zhì)。含水介質(zhì)中能夠使用的介質(zhì)，優(yōu)選透明質(zhì)酸和/或其鹽的溶解性低。含水介質(zhì)中能夠使用的介質(zhì)并無特別限定，例如優(yōu)選是液體、具有溶解于水的性質(zhì)并且在化妝品或食品的制造工序中能夠使用的介質(zhì)。作為含水介質(zhì)中能夠使用的介質(zhì),可以列舉例如醇系介質(zhì)(例如甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇等)、酮系介質(zhì)(例如丙酮、甲乙酮等)、四氫呋喃、乙腈等，它們可以單獨(dú)使用或者組合使用。其中，從沸點(diǎn)低和價(jià)格方面出發(fā)，優(yōu)選是選自乙醇、甲醇和丙酮中的至少l種。含7K介質(zhì)中的含水量并無特別規(guī)定，含水量多則透明質(zhì)酸和/或其鹽不能維持^t狀態(tài)，溶解于含7]c介質(zhì)中，因此有可能導(dǎo)致收率降低。因此，相對(duì)于含水介質(zhì)的總量的水的比例優(yōu)選40容量％以下，更優(yōu)選30容量％以下。此外，上述制造方法中，作為用于使含水^h質(zhì)為酸性的物質(zhì)，可以列舉例如酸、酸性陽離子交換樹脂。作為酸，并無特別限定，優(yōu)選在化妝品、醫(yī)藥品或食品的制造中能夠使用的酸。作為酸，可以列舉例如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機(jī)酸，檸檬酸、抗壞血酸、醋酸、冰醋酸等有機(jī)酸。酸的添加量并無特別限定，酸的添加量少則透明質(zhì)酸和/或其鹽的低分子化不進(jìn)行，制造效率降低。另一方面，酸的添加量過多，則由于促進(jìn)透明質(zhì)酸和/或其鹽的低分子化，而難以穩(wěn)定地調(diào)節(jié)到目標(biāo)分子量。例如，^使用鹽酸作為酸時(shí)，優(yōu)選為0.2容量％~4容量％,使用硫酸作為酸時(shí)，優(yōu)選為0.1容量％~3容量％。作為酸性陽離子交換樹脂，并無特別限定，可以列舉例如強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂、弱酸性陽離子交換樹脂等，優(yōu)選強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。上述制造方法中，含水介質(zhì)的pH優(yōu)選為2以下，更優(yōu)選為1以下。含7K介質(zhì)的pH如果超過2，則使原料透明質(zhì)酸和/或其鹽低分子化需要長(zhǎng)時(shí)間，因而效率降低。1.5.關(guān)于制造方法的不同和氯化鈉含量的不同本發(fā)明中，能夠使用透明質(zhì)酸的氯化鈉含量的值作為用于判定本發(fā)明的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽存在的指標(biāo)之一。本實(shí)施方式所涉及的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，優(yōu)選氯化鈉的含量為0.5%以下。更優(yōu)選為0.3%以下。一般流通的透明質(zhì)酸，因其工業(yè)制造方法而含有某種程度的氯化鈉。其比例通常為1%以上。作為一般的透明質(zhì)酸的工業(yè)制造方法，可以列舉乙醇沉淀、采用季銨鹽的精制方法(FRAGRANCEJOURNAL臨時(shí)增刊號(hào)No.151996再次印刷)。采用乙醇沉淀的精制方法通常按以下順序進(jìn)行。向透明質(zhì)酸的提取液中加入氯化鈉，添加提取液的2~3倍量的乙醇。如果添加乙醇，則透明質(zhì)酸沉淀，雜質(zhì)以溶解的狀態(tài)與透明質(zhì)酸分離。反復(fù)該工序數(shù)次，提高透明質(zhì)酸的純度。最后用含水乙醇洗滌數(shù)次，進(jìn)行氯化鈉的除去。另一方面，采用季銨鹽的精制按以下的順序進(jìn)行。透明質(zhì)酸具有與季銨鹽形成復(fù)合體、沉淀的性質(zhì)。因此，向透明質(zhì)酸的提取液中添加季銨鹽，生成沉淀。用含有氯化鈉的醇將得到的沉淀洗滌。反復(fù)數(shù)次以提高透明質(zhì)酸的純度后，為了進(jìn)行氯化鈉的除去，反復(fù)數(shù)次用含水乙醇進(jìn)行洗滌。在任一方法中，在精制的下游中使用大量的氯化鈉，因此即使實(shí)施氯化鈉的除去，某種程度的量的氯化鈉殘存。另一方面，將詳細(xì)敘述本實(shí)施方式涉及的制造方法，在沒有在含有鹽酸的含水乙醇中溶解而以粉末的狀態(tài)將透明質(zhì)酸粉末加熱處理，然后，用含水乙醇洗滌數(shù)次，將鹽酸除去。根據(jù)本實(shí)施方式涉及的制造方法，由于不需要粉末化，也不需要添加氯化鈉，使用的鹽酸不用中和能夠通過洗滌、干燥而被除去，因此可以將氯化鈉、氯離子的含量控制在極低的水平。由此，得到的透明質(zhì)酸和/或其鹽的氯化鈉含量能夠達(dá)到0.5°乂以下，進(jìn)而能夠達(dá)到0.3%以下。如后面實(shí)施例所示，根據(jù)本實(shí)施方式涉及的制造方法，能夠?qū)⒙然c含量的下限降低到0.05%左右，為了進(jìn)一步降低，也可以引入脫鹽或離子交換處理工序等。這樣，本實(shí)施方式涉及的透明質(zhì)酸和/或其鹽的氯化鈉含量與一般的透明質(zhì)酸的氯化鈉含量相比，可以降低到1/100以下。本實(shí)施方式涉及的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，如后面試驗(yàn)例中所示，可用于化妝品，以及醫(yī)藥組合物、食品組合物。此時(shí)，以氯化鈉為代表的鹽類存在損害體系的穩(wěn)定性的可能性。特別在乳化體系中，能夠成為解乳化的主要原因。此外，由于將它們直接涂布到皮膚或毛&，或者將它們攝食，因此出于任一種理由，希望將氯化鈉等的殘留鹽類極度降低。2.化妝品本發(fā)明的一實(shí)施方式涉及的化妝品含有上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽。上述化妝品的形態(tài)并無特別限定，可以列舉例如用于皮膚的洗滌品、化妝水(例如美白化妝水)、乳骨(例如雪花骨、冷霜)、乳液、美容液、面膜、粉底、口紅、唇骨、唇彩、唇線、腮紅、指甲油、睫毛骨、眼線、眼影、清潔劑、洗面奶、香波、沖洗液、頭發(fā)護(hù)理劑、護(hù)發(fā)素、頭發(fā)定型劑、護(hù)發(fā)乳、頭發(fā)滋養(yǎng)劑、生發(fā)劑、剃須劑、剃須后用護(hù)膚液、曬后用護(hù)膚液、袪臭液、身體護(hù)膚液(包括護(hù)手液、護(hù)腳液)、護(hù)體油、持久液、著色液、皂、身體清洗劑、入浴劑等。利用本實(shí)施方式涉及的化妝品，通過含有上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，由于上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽浸透到皮膚組織內(nèi)部而發(fā)揮保水性，因此皮膚的7jC分量得到保持，能夠?qū)⑵つw保持濕潤(rùn)狀態(tài)。3.醫(yī)藥組合物本發(fā)明的一實(shí)施方式涉及的醫(yī)藥組合物含有上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽。上述醫(yī)藥組合物的形態(tài)并無特別限定，可以列舉外用劑和內(nèi)服劑。作為外用劑，可以列舉例如軟骨劑、外用液劑(例如滴眼劑、含漱用液劑)、點(diǎn)鼻藥、點(diǎn)耳劑、貼附劑(例如糊劑、石骨劑)、坐劑、洗劑、擦劑、氣霧劑等。此外，作為內(nèi)服劑，可以列舉例如錠劑、內(nèi)服液劑、咀嚼劑等。根據(jù)本實(shí)施方式涉及的醫(yī)藥組合物，通過含有上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，向生物體內(nèi)的吸收性優(yōu)異。例如，上述醫(yī)藥組合物為外用劑的情況下，通過含有上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽浸透到皮膚組織內(nèi)部而發(fā)揮保水性，因此皮膚的水分量得到保持，能夠使皮膚保持在濕潤(rùn)的狀態(tài)。此外，例如，上述醫(yī)藥組合物為內(nèi)服劑的情況下，通過含有上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽浸透到口腔組織而發(fā)揮保水性，因此能夠發(fā)揮口腔保濕效果。4.食品組合物本發(fā)明的一實(shí)施方式涉及的食品組合物含有上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽.上述食品組合物的形態(tài)并無特別限定，例如口香糖、糖果、粘糖果、錠樣食品、果凍飲料等能夠期待口腔保濕效果的食品組合物，此外，可以列舉作為主食的米飯加工食品、制面包類等、作為副食的蒸煮罐頭、冷凍食品、干菜、干燥食品等、蛋黃醬等調(diào)味料、飲料、糕點(diǎn)、甜點(diǎn)類、液體、皿狀或皿嚢狀等補(bǔ)充營養(yǎng)類等的全部一般食品、容許表現(xiàn)生理功能的全部特定保健用食品。根據(jù)本實(shí)施方式涉及的食品組合物，通過含有上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，上述低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽浸透到口腔組織而發(fā)揮保水性，因此能夠發(fā)揮口腔保濕效果。5.實(shí)施例以下根據(jù)以下的實(shí)施例、比較例和試驗(yàn)例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。再有，本發(fā)明并不限于這些。再有，運(yùn)動(dòng)粘度的測(cè)定和特性粘度的計(jì)算采用上述的方法進(jìn)行。5.l.評(píng)價(jià)方法對(duì)于后述的實(shí)施例1~3中得到的低分子透明質(zhì)酸，采用以下的方法測(cè)定分子量分布和采用CPC沉淀法得到的液體的吸光度的測(cè)定。5.1.1.分子量分布本實(shí)施例中，低分子透明質(zhì)酸的分子量分布通過將凝膠過濾柱(商品名"Diol-120"，林式會(huì)社YMC制)與HPLC分析裝置(商品名"AlliancePDASystem",NihonWatersCo.，Ltd.)連接，以低分子透明質(zhì)酸的0.1%(w/v)水溶液作為分析樣品，對(duì)該分析樣品進(jìn)行液相色譜分析而測(cè)定。作為一例，將實(shí)施例2中得到的低分子透明質(zhì)酸的色譜示于圖1。此外，';^目色鐠分析的條件如下所述。柱溫度4OX:流速lmL/分低分子透明質(zhì)酸的0.1%(w/v)水溶液的注入量20jiL移動(dòng)相0.003M磷酸緩沖液(含有0.15MNaCl，pH7.0)在使用了本實(shí)施例涉及的^過濾柱的、;M目色譜中，保持時(shí)間越遲，則分子量越低。如圖l所示，按從右側(cè)起保持時(shí)間長(zhǎng)的順序，得到N-乙酰葡糖胺、D-葡糖醛酸、透明質(zhì)酸(二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)單元1個(gè))、透明質(zhì)酸(四糖重復(fù)結(jié)構(gòu)單元2個(gè))、透明質(zhì)酸(六糖重復(fù)結(jié)構(gòu)單元3個(gè))、透明質(zhì)酸(八糖重復(fù)結(jié)構(gòu)單元4個(gè))……的峰。算出各峰的保持時(shí)間和分子量，求出該保持時(shí)間對(duì)分子量的校正曲線(式5)。再有，在式5中，x表示保持時(shí)間，y表示分子量。其次，由式5所示的校正曲線，算出與規(guī)定的分子量(1萬或5萬)對(duì)應(yīng)的保持時(shí)間，通過用這些保持時(shí)間分割峰，從而求出處于規(guī)定的分子量范圍中的成分的比例。此外，各J^表示的分子量通過與對(duì)于分子量已知的透明質(zhì)酸的最小結(jié)構(gòu)單元(二糖)采用同樣的方法進(jìn)行液相色鐠分析而得到的色譜中的峰進(jìn)行對(duì)照而鑒定。例如，分子量1萬以下的成分的比例，由式5所示的校正曲線算出與分子量1萬對(duì)應(yīng)的保持時(shí)間，用該保持時(shí)間以下的成分的吸收面積除以總吸收面積而求得。同樣地，分子量5萬以上的成分的比例，由式5所示的校正曲線算出與分子量5萬對(duì)應(yīng)的保持時(shí)間，用該保持時(shí)間以上的成分的吸收面積除以總吸收面積而求得。作為一例，將由圖1所示的色鐠得到的各分子量成分的重復(fù)單元數(shù)和保持時(shí)間的關(guān)系示于表l。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*透明質(zhì)酸的分子量以游離的酸計(jì)算。(式5)y=—21.4x3+1296.2x2_26747.lx+189427.15.1.2.由CPC沉淀法得到的液體的吸光度的測(cè)定本實(shí)施例中，采用CPC沉淀法得到的液體的吸光度的測(cè)定由以下的方法進(jìn)行。將本實(shí)施例涉及的低分子透明質(zhì)酸O.Olg溶解于蒸餾水lOmL，制備O.1(g/mL)透明質(zhì)酸水溶液。此外，使CPClg溶解于蒸鎦水20mL，制備0.05(g/mL)CPC7jc溶液。將該0.05(g/mL)CPC水溶液52jiL(0.05g)加入到0.1(g/mL)透明質(zhì)酸水溶液10mL中，充分?jǐn)嚢韬螅?分鐘后測(cè)定660nm(渾濁)的吸光度。圖2中，示出了對(duì)于實(shí)施例2中得到的低分子透明質(zhì)酸(樣品C)，通過采用上述方法的測(cè)定得到的吸光度的測(cè)定結(jié)果。在此，作為對(duì)照，使用分子量已知的透明質(zhì)酸(樣品A、B)，進(jìn)行同樣的試驗(yàn)。再有，使用的樣品A是商品名"透明質(zhì)酸HA-L510"(Q.P.公司制)，樣品B為商品名"透明質(zhì)酸FCHFCH-A"(KibunFoodChemifaCo.，Ltd.制)。此外，圖3是表示進(jìn)行了吸光度測(cè)定的樣品AC的外觀的照片。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>如圖2所示，祁^據(jù)對(duì)于不同波長(zhǎng)的光的吸光度測(cè)定的結(jié)果，樣品A、B和樣品C明顯顯示出不同的行為。此外，如圖3所示，用目視對(duì)樣品A、B和樣品C進(jìn)行比較，結(jié)果看到明顯的渾濁的差別。具體地說，使用了樣品C(實(shí)施例2中得到的低分子透明質(zhì)酸的水溶液)時(shí)，由于其分子量和分子量分布的特性，即使添加CPC水溶液，液體也不形成沉淀，停留在白濁。與此相對(duì)，使用樣品A、B進(jìn)行上述操作的結(jié)果，由于添加CPC水溶液而產(chǎn)生沉淀，因此液體的透明度與使用了樣品C時(shí)相比高。由這些結(jié)果，能夠理解采用CPC沉淀法得到的液體的吸光度的測(cè)定是表示本發(fā)明的低分子透明質(zhì)酸和更高分子的透明質(zhì)酸的特性的不同的指標(biāo)之一。再有，對(duì)于在后述實(shí)施例1、3中得到的低分子透明質(zhì)酸，進(jìn)行采用CPC沉淀法得到的液體的吸光度的測(cè)定。其結(jié)果記載于后述的各實(shí)施例中。5.1.3.氯化鈉含量的測(cè)定本實(shí)施例中，如以下所述采用莫爾法測(cè)定低分子透明質(zhì)酸的氯化鈉含量。C領(lǐng)'J定方法)將實(shí)施例1中得到的低分子透明質(zhì)酸2.5g溶解于蒸餾水100mL中。此外，將10M鉻酸鉀溶液lmL加入低分子透明質(zhì)酸水溶液中，充分?jǐn)嚢韬?，用硝酸銀溶液進(jìn)行滴定直至成為微褐色。然后，由以下的式(4)算出低分子透明質(zhì)酸的食鹽含量。(式4)食鹽(。/0-(Xx滴定量(mL))/(樣品量(g)x1000)x100(4)(式(4)中，X為硝酸銀溶液的系數(shù)，本試驗(yàn)中X=13.345)。(測(cè)定結(jié)果)采用上述方法測(cè)定得到的實(shí)施例1中得到的低分子透明質(zhì)酸(樣品A)的氯化鈉含量的測(cè)定結(jié)果示于表3。在此作為對(duì)照，使用采用乙醇沉淀等現(xiàn)有方法制造的透明質(zhì)酸(樣品B、C)進(jìn)行同樣的試驗(yàn)，求出氯化鈉含量。再有，使用的樣品B，是商品名"透明質(zhì)酸HA-LF"(Q.P.公司制，平均分子量30萬)，樣品C是商品名"透明質(zhì)酸FCHFCH-A"(KibunFoodChemifaCo.，Ltd.制，平均分子量3萬)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>如表3所示，樣品A和樣品B、C的氯化鈉含量明顯不同得到確認(rèn)。能夠理解氯化鈉含量的測(cè)定是表示本發(fā)明的低分子透明質(zhì)酸和采用現(xiàn)有方法制造的透明質(zhì)酸的特性不同的指標(biāo)之一。再有，對(duì)于后述的實(shí)施例2、3中得到的低分子透明質(zhì)酸，采用同樣的方法進(jìn)行氯化鈉含量的測(cè)定。其結(jié)果記載于后述的各實(shí)施例中。5.2.實(shí)施例1在本實(shí)施例中，作為原料，準(zhǔn)備由雞冠提取、精制的透明質(zhì)酸鈉(以下也稱為"HANa")微粉末。該原料HANa的平均分子量約為210萬，純度為97%。首先，在裝備有攪拌機(jī)和夾套的300L容罐中裝滿含有0.5%硫酸的80%含水丙酮(酸性含水介質(zhì))110L,邊攪拌邊加熱以使液溫達(dá)到60C。該處理液的pH為1.08。在此，80W含7JC丙酮是含有80(W/W)%丙酮，含有20(W/W)%水的物質(zhì)，含有0.5%硫酸的80%含水丙酮是含有0.5(W/W)%硫酸，含有99.5(W/W)%的80%含水丙酮的物質(zhì)。升溫到60n后，邊攪拌邊將準(zhǔn)備的原料HANa微粉末6kg^A^罐中。邊進(jìn)行加熱以使含有硫酸的含水丙酮的溫度維持在60r，邊進(jìn)行攪拌以使原料HANa微粉末成為分散狀態(tài)。其次，攪拌15分鐘后靜置后，釆用傾析將上層澄清的含有硫酸的含水丙酮除去，從而得到沉淀物。在得到的沉淀物中加入預(yù)先加熱到6or:的含有0.5%硫酸的80%含水丙酮IIOL，同樣邊加熱到60X:邊進(jìn)行攪拌15分鐘，重復(fù)合計(jì)3次該^Mt。其次，在將含有硫酸的含水丙酮除去后得到的沉淀物中加入80%含水丙酮IIOL，為了除去硫酸進(jìn)行15分鐘攪拌。重復(fù)該操作直到硫酸的殘留不存在。此外，采用傾析將含水丙酮除去而得到殘留物。對(duì)于該殘留物進(jìn)行離心分離處理，從而進(jìn)一步將含水丙酮除去后，使用真空干;^在70C下減壓下加熱干燥12小時(shí)。通過以上的工序，得到白色微粉末的低分子透明質(zhì)酸5.3kg(收率約88%)。該低分子透明質(zhì)酸，使用烏氏粘度計(jì)測(cè)定的1°/4水溶液的運(yùn)動(dòng)粘度為1.5mm7s,由特性粘度換算的平均分子量為9000,分子量分布中，分子量1萬以下的成分的比例為49重量％以上并且分子量5萬以上的成分的比例為0.5重量％。此夕卜，得到的低分子透明質(zhì)酸的0.lg/mL水溶液(lOmL)中，添加0.5g/mL的十六烷基氯化吡啶水溶液(0.05g)得到的液體的吸光度(A66。)為0.57Abs。5.3.實(shí)施例2本實(shí)施例中，作為原料準(zhǔn)備實(shí)施例1中使用的HANa微粉末。首先，在裝備有攪拌機(jī)和夾套的300L容罐中裝滿含有2%鹽酸的73%含水乙醇(酸性含水介質(zhì))110L,邊攪拌邊加熱以使液溫達(dá)到50匸。該處理液的pH為0.70。在此，73%含水乙醇是含有73(W/W)%乙醇，含有27(W/W)%水的物質(zhì)，含有2%鹽酸的73。/4含7jc乙醇是^^有2(W/W)%鹽酸，含有98(W/W)%的73%含水乙醇的物質(zhì)。升溫到50X:后，邊攪拌邊將準(zhǔn)備的原料HANa微粉末6kg^罐中。邊進(jìn)行加熱以將含有鹽酸的含水乙醇的溫度維持在601C,邊進(jìn)行攪拌以使原料HANa^t粉末成為^t狀態(tài)。其次，攪拌15分鐘后靜置后，采用傾析將上層澄清的含有鹽酸的含水乙醇除去，從而得到沉淀物。在得到的沉淀物中加入預(yù)先加熱到50"的含有2%鹽酸的73%含水乙醇IIOL，同樣1^>熱到50n邊進(jìn)行攪拌15分鐘，重復(fù)合計(jì)3次該^Mt。其次，在將含有鹽酸的含水乙醇除去后得到的沉淀物中加入73%含水乙醇110L，為了除去鹽酸進(jìn)行15分鐘攪拌。重復(fù)該^Mt直到鹽酸的殘留不存在。此外，采用傾析將含水乙醇除去而得到殘留物。對(duì)于該殘留物進(jìn)行離心分離處理，從而進(jìn)一步將含水乙醇除去后，使用真空干^W^8ox:下減壓下加熱干燥24小時(shí)。通過以上的工序，得到白色微粉末的低分子透明質(zhì)酸5.5kg(收率約92%)。該低分子透明質(zhì)酸，使用烏氏粘度計(jì)測(cè)定的1%水溶液的運(yùn)動(dòng)粘度為l.lmm7s，由特性粘度換算的平均分子量為6000，分子量分布中，分子量1萬以下的成分的比例為58重量％以上并且分子量5萬以上的成分的比例為0.2重量％。此夕卜，得到的低分子透明質(zhì)酸的0.lg/mL水溶液(10mL)中，添加0.5g/mL的十六烷基氯化吡啶水溶液(0.05g)得到的液體的吸光度(A66。)為1.16Abs。此外，得到的低分子透明質(zhì)酸的氯化鈉含量為0.10%。5.4.實(shí)施例3本實(shí)施例中，作為原料，準(zhǔn)備由通過培養(yǎng)產(chǎn)生透明質(zhì)酸的鏈球菌屬的微生物得到的含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵物提取、精制的原料透明質(zhì)酸(以下也稱為"HA")微粉末。該原料HA的平均分子量為約160萬，純度為97%。首先，在裝備有攪拌機(jī)的300L容罐中裝滿含有2%鹽酸的80%含水乙醇(酸性含7jc介質(zhì))IIOL，邊攪拌邊加熱以使液溫達(dá)到701C。該處理液的pH為0.76。在此，80%含水乙醇是含有80(W/W)%乙醇，含有20(W/W)%水的物質(zhì)，含有2%鹽酸的80%含水乙醇是^^有2(W/W)%鹽酸，含有98(W/W)%的80%含水乙醇的物質(zhì)。升溫到70X:后，邊攪拌邊將準(zhǔn)備的原料HA微粉末6kg^罐中。邊調(diào)節(jié)溫度以將含有鹽酸的含水乙醇的溫度維持在701C，邊進(jìn)行攪拌以使原料HA粉末成為^t狀態(tài)。其次，攪拌60分鐘后靜置后，采用傾析將上層澄清的含有鹽酸的含水乙醇除去，得到殘留物。對(duì)得到的殘留物進(jìn)行離心分離，從而將含水乙醇進(jìn)一步除去后，使用真空干B在常溫、M存在下減壓下干燥12小時(shí)。通過以上的工序，得到白色微粉末的低分子透明質(zhì)酸5.5kg(收率約92%)。該低分子透明質(zhì)酸，使用烏氏粘度計(jì)測(cè)定的1%水溶液的運(yùn)動(dòng)粘度為1.8mm7s，由特性粘度換算的平均分子量為14000,分子量分布中，分子量1萬以下的成分的比例為43重量％以上并且分子量5萬以上的成分的比例為2.1重量％。此外，得到的低分子透明質(zhì)酸的0.lg/mL水溶液(10mL)中，添加0.5g/mL的十六M^氯化吡啶水溶液(0.0化)得到的液體的吸光度(A66。)為0.44Abs。此夕卜，得到的低分子透明質(zhì)酸的氯化鈉含量為0.07%。5.5.試驗(yàn)例1本試驗(yàn)例中，將本發(fā)明的低分子透明質(zhì)酸經(jīng)皮給藥于小鼠，進(jìn)行經(jīng)皮吸收性的評(píng)價(jià)。5.5.1.試驗(yàn)方法5.5.1-1.動(dòng)物無毛小鼠(Hos:HR-1)雄6周齡(試驗(yàn)開始時(shí))(由日本SLC林式會(huì)社購入)再有，小鼠^V后進(jìn)行1周馴化后用于試驗(yàn)。5.5.1-2.試料試料1:上述實(shí)施例2中得到的低分子透明質(zhì)酸試料2:透明質(zhì)酸(商品名"透明質(zhì)酸HA-LQH"、Q.P.公司制、分子量180萬)試料3(對(duì)照)蒸鎦水5.5.1-3.熒光化試料的制備為了區(qū)別涂布的試料和皮趺中的透明質(zhì)酸，用熒光標(biāo)記化物質(zhì)(DMEQ-酰肼)將試料1、2的透明質(zhì)酸熒光化，將得到的試料用于試驗(yàn)。具體地說，通過使透明質(zhì)酸的羧酸基和DMEQ-酰肼反應(yīng)而進(jìn)行熒光化。在此使用的透明質(zhì)酸的熒光化方法記載于例如李梅花、上田秀雄等的《超聲波照射對(duì)角質(zhì)保濕劑透明質(zhì)酸鈉的皮膚吸收產(chǎn)生的影響》(DrugDeliverySystem,12，415-419(1997))。5.5.1-4.試料組試驗(yàn)組1:貼附熒光化的試料1的1%水溶液的組15只試驗(yàn)組2:貼附熒光化的試料2的1%水溶液的組15只試驗(yàn)組3(對(duì)照)將蒸餾水貼附在皮膚上的組15只5.5.1-5.試驗(yàn)方法首先，在小鼠腹部貼附每個(gè)浸染了100mg的熒光化后的試料或蒸餾水的lcm2的棉絨布，對(duì)于各試驗(yàn)組，每5只在1、3、5小時(shí)后剝離棉絨布，對(duì)皮膚表面殘留的試料進(jìn)行水洗。水洗后充分干燥，將貼附有試料的皮膚部分切取約lcn^后，用剪刀剪開。此時(shí)，采取小鼠的皮膚后，由于劇度清晰地出現(xiàn)，因此確認(rèn)采取到了真皮。其次，將切取的皮膚轉(zhuǎn)移到離心沉淀管，加入2mL蒸熘7jc進(jìn)行均化后，在4C下以3000轉(zhuǎn)進(jìn)行10分鐘離心分離，將上層澄清液作為分析樣品。通過測(cè)定該分析樣品中的熒光物質(zhì)的量，評(píng)價(jià)試料1或2是否浸透到了皮趺內(nèi)部。再有，對(duì)于試驗(yàn)組3(對(duì)照組)和試驗(yàn)組1,以及試驗(yàn)組3和試驗(yàn)組2，分別進(jìn)行Student的T檢驗(yàn)，P<0.05i人為具有顯著性差異。5.5.1-6.HPLC分析4Ht和分析結(jié)果在以下的條件下對(duì)上述試驗(yàn)方法得到的分析樣品(上層澄清液)進(jìn)行HPLC分析。HPLC的分析條件如下所述。分析設(shè)備Waters2690+470柱shodexsugerKS807(凝膠過濾柱)柱溫度4OX:流速0.5mL/分注入量20jiL移動(dòng)相0.003mol/L磷酸緩沖液.含有0.15mol/L氯化鈉熒光分析條件激發(fā)波長(zhǎng)365nm熒光波長(zhǎng)447nm圖4表示將試料貼附了5小時(shí)的試驗(yàn)組1~3的分析樣品的HPLC分析圖。此外，表4中示出各試驗(yàn)組中貼附了規(guī)定時(shí)間的棉絨布時(shí)得到的分析樣品的峰面積的平均值。HPLC分析的結(jié)果，試驗(yàn)組l中得到的分析樣品中，確認(rèn)皮膚中的熒光強(qiáng)度顯著地增加。與其相對(duì)，試驗(yàn)組2中沒有確認(rèn)到顯著性差異。貼附時(shí)間平均峰面積Ws)標(biāo)準(zhǔn)誤差試驗(yàn)組ll小時(shí)1,12(],686163,8103小時(shí)1,365.70789,1105小時(shí)1,313,111l肌705試驗(yàn)組2l小時(shí)356,63446,9693小時(shí)248,83217，8195小時(shí)214,38935,097試驗(yàn)組3l小時(shí)510,210105,7793小時(shí)279,14122,0335小時(shí)306,91518,7795.5.1-6.被皮膚吸收的低分子透明質(zhì)酸的定量其次，在試驗(yàn)組1~3中，由表4所示的分析樣品中的熒光峰面積，分別算出透明質(zhì)酸的經(jīng)皮吸收量。不過，由于由作為對(duì)照組的試驗(yàn)組3檢測(cè)出了峰，因此為了排除其影響，從分析樣品的熒光峰面積中減去試驗(yàn)組3的峰面積的平均值。再有，由試驗(yàn)組3也檢測(cè)出了峰，推測(cè)生物體內(nèi)原本就含有發(fā)熒光的物質(zhì)(例如維生素類、芳香族氨基酸、膽甾醇等)。此時(shí)，因各分析樣品的不同，皮膚采取量不同，因此使用分別用皮膚樣品的重量去除而得到的值，由以下的計(jì)算式(式6)算出透明質(zhì)酸的經(jīng)皮吸收量。(式6)每ig皮膚吸收的透明質(zhì)酸的重量(g)_T對(duì)照的峰面積、=樣品的峰面積Z|^]^^樣重量(^"J皮膚取樣重量(g)n(l組的樣本數(shù)).....(6)再有，對(duì)于STD(標(biāo)準(zhǔn))溶液，將實(shí)際用于試驗(yàn)的試料1%水溶液稀釋100倍，用HPLC進(jìn)行分析，求出峰面積。圖5中示出試驗(yàn)組1的試料的貼附時(shí)間和試驗(yàn)組1的分析樣品的每lg皮膚的透明質(zhì)酸增加量的關(guān)系。根據(jù)圖5，試料的貼附時(shí)間在1~3小時(shí)中，透明質(zhì)酸的經(jīng)皮吸收量經(jīng)時(shí)增大，但試料的貼附時(shí)間為3~5小時(shí)中，認(rèn)為透明質(zhì)酸的經(jīng)皮吸M本上達(dá)到平衡。即，試驗(yàn)組1(給予了低分子透明質(zhì)酸的組)，在1小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)的全部中，與對(duì)照組(試驗(yàn)組3)相比，能夠確認(rèn)顯著的熒光峰的增加。與其相對(duì)，試驗(yàn)組2中，與試驗(yàn)組3相比沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異，每lg皮膚的透明質(zhì)酸增加量基本上為0。由該結(jié)果，確認(rèn)試驗(yàn)組2的透明質(zhì)g本上沒有被經(jīng)皮吸收。此外，由試驗(yàn)組2中得到的皮膚均化液沒有確認(rèn)透明質(zhì)酸的吸收，因此確認(rèn)貼附結(jié)束后的皮膚洗滌充分進(jìn)行了。由以上推測(cè)，本發(fā)明的低分子透明質(zhì)酸由皮膚表面被吸收到皮膚中，而試驗(yàn)組2中使用的透明質(zhì)酸的分子量大到180萬，因此沒有被皮膚吸收，滯留在皮膚上。5.5.1-7.確i^試驗(yàn)再有，對(duì)于上述試驗(yàn)方法中得到的分析樣品(上層澄清液)，進(jìn)行低分子柱色語分析的結(jié)果，確認(rèn)檢測(cè)到的熒光峰是熒光化的透明質(zhì)酸或來自STD'溶液的峰面積^w。、X-;-X樣品溶液i(g)STD的峰面積xiOO皮膚的熒光物質(zhì)，不是未反應(yīng)的熒光標(biāo)記化用物質(zhì)(DMEQ-酰肼)。圖6中示出了低分子柱色譜分析中各分析樣品的HPLC分析圖。此外，以下示出低分子柱色鐠分析的條件。分析設(shè)備HPLC(Waters2690+470)柱YMC-PackDiol120(凝膠過濾柱)柱溫度室溫流速lmL/分注入量20jiL移動(dòng)相0.003mol/L-磷酸緩沖液(含有0.15mol/L氯化鈉)熒光分析條件激發(fā)波長(zhǎng)365nm熒光波長(zhǎng)447nm5.6.試驗(yàn)例2本試驗(yàn)例中，將本發(fā)明的低分子透明質(zhì)酸經(jīng)皮給藥于人，進(jìn)行經(jīng)皮吸收性的評(píng)價(jià)。更具體地說，對(duì)將滲入了本發(fā)明的低分子透明質(zhì)酸的紗布平均每1天8小時(shí)、共3天(8h/dx3d)貼附到試驗(yàn)者的前腕部后的皮膚的水分量i^f于測(cè)定，與貼附了滲入了對(duì)照(蒸餾水)的紗布時(shí)皮膚的水分量進(jìn)行比較。5.6.l.使用樣品樣品I:實(shí)施例2中得到的低分子透明質(zhì)酸的1%水溶液樣品II:分子量140萬的透明質(zhì)酸(商品名"透明質(zhì)酸HA-LQ"、Q.P.公司制)的1%水溶液樣品III:蒸餾水5.6.2.測(cè)定設(shè)備水分量測(cè)定器商品名"SKICON-200"，I.B.S.Co.，LTD制5.6.3.測(cè)定方法將分別滲入了lmL的樣品I~III的紗布(面積3x3cm2)貼附到試驗(yàn)者(2550歲的成人15名)的前腕部48小時(shí)后，剝離該紗布，用水分量測(cè)定器測(cè)定貼附部位的皮膚的水分量。水分量的測(cè)定分別在貼附前即刻、貼附結(jié)束后即刻、貼附結(jié)束后經(jīng)過l天時(shí)、貼附結(jié)束后經(jīng)過4天時(shí)進(jìn)行。將其結(jié)果示于表5中。表5中所示的數(shù)值為試驗(yàn)者5名的平均的數(shù)值。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>根據(jù)表5，貼附樣品I時(shí)，與貼附了樣品II、III時(shí)相比，確認(rèn)皮膚的水分量多且能夠持續(xù)地保持。特別是貼附了樣品I時(shí)，與貼附了樣品n、ni時(shí)相比，確認(rèn)剝離紗布后也能夠持續(xù)保持皮膚的水分量。5.7.試驗(yàn)例3本試驗(yàn)例中，作為化妝品，采用以下所示的配方，分別制備配合了實(shí)施例1~3中分別得到的低分子HA的化妝水(裝入內(nèi)容量100mL/塑料制容器)。《配方》辛酸十六烷基酯0.30%甲lL&月桂酸辛酯0.15%生育酚醋酸酯0.10%EMALEXRWIS-158(異硬脂酸PEG-58氫化荒麻油)2.00%EldewPS-306(月桂iltjj^酸二(辛基十二烷基/植物甾醇基/二十二烷基)0.50%對(duì)羥基苯甲酸丁酯0.10%對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.20%1，3-丁二醇5.00%低分子透明質(zhì)酸0.02%水91.63%合計(jì)100.00%根據(jù)本試驗(yàn)例，通過配合實(shí)施例1~3中得到的低分子HA，能夠得到能夠良好地保持皮膚的水分量的化妝水。5.8.試驗(yàn)例4本試驗(yàn)例中，作為化妝品，采用以下所示的配方，分別制備配合了實(shí)施例1~3中分別得到的低分子HA的化妝水(*^內(nèi)容量100mL/塑料制容器)?！杜浞健范譓氧烷2.00%環(huán)甲基珪氧烷21.00%荷荷芭油0.10%EMALEXSS—1906EX(PEG—10二甲_^氧烷)4.00%二曱基甲珪烷基化二氧化硅0.20%Pe咖lenTR-2((丙烯酸/丙烯酸烷基酯(C10-30))共聚物)0.05%生育酚醋酸酯0.10%對(duì)羥基苯曱酸丙酯0.05%對(duì)羥基苯曱酸丁酯0.05%對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.10%氧化鐵0.00%1，3-丁二醇1.00%低分子透明質(zhì)酸0.05%甘油25.00%疏酸鎂0.20%水46.10%合計(jì)100.00%根據(jù)本試驗(yàn)例，通過S&合實(shí)施例1~3中得到的低分子HA，能夠得到能夠良好地保持皮膚的水分量的化妝水。5.9.試驗(yàn)例5本試驗(yàn)例中，作為化妝品，采用以下所示的配方，分別制備配合了實(shí)施例1~3中分別得到的低分子HA的乳液("內(nèi)容量100mL/塑料制容丙二醇7.92%海藻糖0.03%低分子透明質(zhì)酸O.01%礦物油3.00%三辛酸甘油酯1.50%三十碳六烯1.00%硬脂酸O.50%棕櫚醇0.50%羊毛脂0.30%石錯(cuò)0.20%硬脂酸脫水山梨醇酯l眉TetraoleateSolbase-301.00%聚山梨醇酯600.80%對(duì)羥基苯曱酸甲酯O.20%對(duì)羥基苯曱酸丙酯0.10%乙醇0.01%苯氧基乙醇適量卡波姆(Carbomer)0.10%氫氧化鉀0.10%BHT0.02%生育酚適量EDTA-2鈉0.02%水使總量為畫根據(jù)本試驗(yàn)例，通過配合實(shí)施例1~3中得到的低分子HA，能夠得到能夠良好地保持皮膚的水分量的乳液。5.10.試驗(yàn)例6本試驗(yàn)例中，作為化妝品，采用以下所示的配方，分別制備配合了實(shí)施例1~3中分別得到的低分子HA的乳骨(裝入內(nèi)容量50g/帶螺帽的塑料制容器)。《配方》三十碳六烯11.00%二甲絲氧烷1.00%二十二烷醇3.00%月桂iti^氨酸二辛基十二烷基酯2.00%EMALEXGMS-50(硬脂酸甘油酯(SE))8.00%EMALEX805(硬脂酸PEG-5)對(duì)羥基苯甲酸丙酯丙二醇對(duì)羥尿素低分子透明質(zhì)酸水合計(jì)2.00%0.10%5.00%0.20%5.00%0.03%62.67%100.00%根據(jù)本試驗(yàn)例，通過配合實(shí)施例1~3中得到的低分子HA，能夠得到能夠良好地保持皮膚的水分量的乳骨。5.ll.試驗(yàn)例7本試驗(yàn)例中，作為化妝品，采用以下所示的配方，分別制備配合了實(shí)施例1~3中分別得到的低分子HA的潔面乳(^X內(nèi)容量50g/帶螺帽的塑料制容器)?！杜浞健返V物油石蠟辛酸十六烷基酯二十二烷硬脂酸甘油酯30.00%3.00%2.00%25.00%5.00%L00%EMALEX600di-ISEX(二異硬脂酸PEG-12)3.00%EMALEX620(石更脂庫^聚醚-20)1.00%生育酚醋酸酯O.10%對(duì)羥基苯曱酸丙酯0.15%硬脂酰l^氨酸Na0眉1，3-丁二醇3.00%對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.15%黃原膠10.00%低分子透明質(zhì)酸0.10%水16.10%合計(jì)100.00%根據(jù)本試驗(yàn)例，通過配合實(shí)施例1~3中得到的低分子HA，能夠得到能夠良好地保持皮膚的水分量的潔面乳。5.12.試驗(yàn)例8本試驗(yàn)例中，作為化妝品，采用以下所示的配方，分別制備配合了實(shí)施例1~3中分別得到的低分子HA的化妝粉底(^JV內(nèi)容量30g/帶蓋的塑料制容器)?！杜浞健芬掖急『纱几视虰G低分子透明質(zhì)酸二甲絲氧烷10.00%0.02%5.00%3.00%0.01%2.00%三辛酸甘油酯2.00°>4辛基二甲基PABA0.50%羥甲氧苯酮0.05%卡波姆O.30%二氧化硅0.20%AMP0.20%對(duì)羥基苯甲酸甲酯0.16%苯氡基乙醇適量生育酚O.02%EDTA-2鈉0.01%水使總量為100%根據(jù)本試驗(yàn)例，通過配合實(shí)施例1~3中得到的低分子HA,能夠得到能夠良好地保持皮膚的水分量的化妝粉底。5.13.試驗(yàn)例9本試驗(yàn)例中，作為化妝品，采用以下所示的配方，分別制備配合了實(shí)施例1~3中分別得到的低分子HA的護(hù)發(fā)素(裝入內(nèi)容量500mL/塑料制容器)。《配方》二甲基眭氧烷3.00%丙二醇8.00%礦物油2.00%甘油3.00%PPG-300.50%硬脂醇聚醚-41.00%十六烷基三甲基溴化銨2.00%鯨蠟醇2.00%低分子透明質(zhì)酸0.50%水解縣1.00%水解蠶絲1.00%山脊基三甲基銨甲基琉酸鹽0.80%苯SJ^乙醇0.40%十六十八烷醇0.50%硬脂醇0.50%EDTA-2鈉0.10%對(duì)羥基苯曱酸曱酯0.10%香料適量水75.10%合計(jì)100.00%根據(jù)本試驗(yàn)例，通過配合實(shí)施例1~3中得到的低分子HA，能夠得到能夠良好地保持皮膚的水分量的護(hù)發(fā)素。5.14曙試驗(yàn)例10本試驗(yàn)例中，作為化妝品，采用以下所示的配方，分別制備配合了實(shí)施例1~3中分別得到的低分子HA的曬后用護(hù)膚液(^/v內(nèi)容量100mL/塑料制容器)。《配方》乙醇11.04%BG4.16%黃茶提取物適量低分子透明質(zhì)酸0.50%硬脂醇0.72%跨梨油0.72%硬脂酸0.02%谷維素適量聚山梨醇酯0.23%PPG-6一"^基十四醇聚醚-200.20%辛基酚聚醚-30.08%對(duì)羥基苯甲酸曱酯0.14%對(duì)羥基苯甲酸丙酯0.07%卡波姆0.13%PVP適量氫氧化鉀0.04%EDTA-2鈉0.01%生育酚適量水75.10%合計(jì)進(jìn)00%根據(jù)本試驗(yàn)例，通過配合實(shí)施例1~3中得到的低分子HA,能夠得到能夠良好地保持皮膚的7jc分量的曬后用護(hù)膚液。5.15.試驗(yàn)例11本試驗(yàn)例中，作為化妝品，采用以下所示的配方，分別制備配合了實(shí)施例1~3中分別得到的低分子HA的剃須后用護(hù)膚液("內(nèi)容量100mL/塑料制容器)。《配方》乙醇薄荷醇丙二醇甘草酸二鉀低分子透明質(zhì)酸香料水58.00%0.10%2,00%0.05%2.00%0.10%使總量為畫根據(jù)本試驗(yàn)例，通過配合實(shí)施例1~3中得到的低分子HA，能夠得到能夠良好地保持皮膚的水分量的剃須后用護(hù)膚液。5.16.試驗(yàn)例12本試驗(yàn)例中，作為化妝品，采用以下所示的配方，分別制備配合了實(shí)施例1~3中分別得到的低分子HA的入浴劑(裝入內(nèi)容量200mL/塑料制容《配方》辛酸十六烷基酯辛基十二醇聚醚-IO對(duì)羥基苯甲酸丁酯對(duì)羥基苯甲酸甲酯甘油低分子透明質(zhì)酸43.80°>48.00%0.20%0.10%2.00%1.00%水44.90%合計(jì)100.00%根據(jù)本試驗(yàn)例，通過配合實(shí)施例1~3中得到的低分子HA，能夠得到能夠良好地保持皮膚的水分量的入浴劑。5.17.試驗(yàn)例13本試驗(yàn)例中，作為醫(yī)藥組合物，采用以下所示的配方，分別制備配合了實(shí)施例1~3中分別得到的低分子HA的溫感刺激糊劑。《配方》聚丙烯酸鈉4.00g羧甲基纖維素鈉2.00g高嶺土5.00g明膠3.OOg甘油20.OOg辣椒提取物0.15g低分子透明質(zhì)酸5.00g水65.85g合計(jì)100.OOg根據(jù)本試驗(yàn)例，通過配合實(shí)施例1~3中得到的低分子HA，能夠得到能夠良好地保持皮膚的水分量的溫感刺激糊劑。5.18.試驗(yàn)例14本試驗(yàn)例中，作為醫(yī)藥組合物，采用以下所示的配方，分別制備配合了實(shí)施例1~3中分別得到的低分子HA的冷感經(jīng)皮吸收型糊劑?！杜浞健返头肿油该髻|(zhì)酸2.50g消炎痛0.30gL-薄荷醇0.40g聚丙烯酸鈉6.50g羧甲基纖維素鈉l.OOg明膠3.00g甘油29.70g甘氨酸鋁0.08g聚氧乙烯硬化荒麻油0.50g乳酸l.OOg水55.02g合計(jì)100,OOg根據(jù)本試驗(yàn)例，通過配合實(shí)施例1~3中得到的低分子HA，能夠得到能夠良好地保持皮膚的水分量的冷感經(jīng)皮吸收型糊劑。5.19.試驗(yàn)例15本試驗(yàn)例中，作為食品組合物，采用以下所示的配方，分別制備配合了實(shí)施例1~3中分別得到的低分子HA的^噴口袋中的葡萄果凍妖:料(^內(nèi)容量10Og/透明噴口袋)?！杜浞健返头肿油该髻|(zhì)酸O.lg5倍濃縮葡萄水果果汁2.Og鹿角菜(凝膠化劑)l.Og黃原膠(增粘劑)0.5g三氯蔗糖(^5MH0O.lg檸檬酸1.Og檸檬酸鈉0.2g葡萄水果香料0.5g精制水94.lg合計(jì)100.0g根據(jù)本試驗(yàn)例，通過配合實(shí)施例1~3中得到的低分子HA,能夠得到風(fēng)味和食感優(yōu)異的葡萄果凍飲料。權(quán)利要求1.一種低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，其平均分子量為5000～20000，并且在分子量分布中，分子量1萬以下的成分的比例為40重量％以上且分子量5萬以上的成分的比例為5重量％以下。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，其中，在所述分子量分布中，分子量l萬以下的成分的比例為40重量％以上，并且分子量5萬以上的成分的比例為1重量％以下。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，其中，在所述分子量分布中，分子量1萬以下的成分的比例為50重量％以上。4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，通過使透明質(zhì)酸和/或其鹽^t^酸性含水介質(zhì)中而得到。5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，通過在加熱下使透明質(zhì)酸和/或其鹽^fc在pH2以下的含水介質(zhì)中后，對(duì)除去所述含水介質(zhì)而得到的殘留物進(jìn)行加熱千燥而得到。6.根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，其中，1重量％水溶液的運(yùn)動(dòng)粘度為2咖7s以下。7.—種低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，在權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽的0.lg/mL水溶液10mL中添加0.5g/mL的十六烷基氯化吡啶水溶液0.05g而得到的液體的吸光度A嗣為0.4Abs以上。8.根據(jù)權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，其中，氯化鈉的含量為0.5%以下。9.一種化妝品，含有權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽。10.—種醫(yī)藥組合物，含有權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽。11.一種食品組合物，含有權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽。全文摘要低分子透明質(zhì)酸和/或其鹽，平均分子量為5000～20000，并且在分子量分布中，分子量1萬以下的成分的比例為40重量％以上且分子量5萬以上的成分的比例為5重量％以下。文檔編號(hào)A61P17/16GK101415731SQ20078000641公開日2009年4月22日申請(qǐng)日期2007年2月21日優(yōu)先權(quán)日2006年2月24日發(fā)明者吉田拓史,瀧澤佳津枝申請(qǐng)人:丘比株式會(huì)社