專利名稱：：基于病毒顆粒的鼻內(nèi)流感疫苗的制作方法基于病毒顆粒的鼻內(nèi)流感疫苗發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及，例如，用于滅活流感疫苗的組合物以及給藥方式，其中，單次鼻內(nèi)或吸入給藥獲得了與臨床保護正相關(guān)的全身性免疫應(yīng)答。發(fā)明背景通過鼻內(nèi)或口咽途徑及4吏用滅活流感抗原針對流感進行免疫的多種設(shè)想已作為皮下或肌肉內(nèi)免疫的非注射(無針頭needle-less)替代途徑被研究。已在動物模型中產(chǎn)生了支持非注射手段的實驗數(shù)據(jù)。得到動物數(shù)據(jù)支持的、使用滅活流感抗原(例如化學(xué)方式滅活的完整病毒粒子，或者被進一步加工的病毒組分，例如被切開的病毒，或者經(jīng)純化的表面抗原血細(xì)胞凝集素(HA)和/或神經(jīng)氨酸酶(NA))經(jīng)鼻內(nèi)途徑進行免疫的思路包括使用佐劑或免疫刺激劑(immunestimulator)與滅活流感抗原組合，或者需要多次免疫。佐劑是能增強與其混合的抗原的免疫原性的任何物質(zhì)。在人類中，通過鼻內(nèi)途徑抵抗流感的成功疫苗接種僅報道過(a)活的(冷適應(yīng)性的林)流感疫苗(FluMist,MedlmmuneVaccinesInc)(參考文獻l、2、3)，(b)病毒顆粒型流感疫苗，其佐有大腸桿菌(E.coli)的熱不穩(wěn)定毒素(NasalFlu,BernaBiotechUd)(參考文獻4)或(c)使用高劑量抗原并且重復(fù)疫苗接種(參考文獻5、10、11)。雖然活疫苗能誘導(dǎo)滿意的免疫應(yīng)答，但其能變成活病毒的特定性質(zhì)帶來了額外的安全顧慮，而且由于需要在上呼吸道附近的病毒復(fù)制，因此有可能會誘導(dǎo)出副作用。此外，所需的貯藏條件也限制了這些產(chǎn)品的商業(yè)化。使用大腸桿菌HLT作為佐劑的鼻內(nèi)流感疫苗與面癱(Bell，sPalsy)之間的強烈相關(guān)性導(dǎo)致佐有HLT的病毒顆粒疫苗從市場撤出(參考文獻6)。流感疫苗在給定人群中的療效可通過下述方法來評估評定與接種后產(chǎn)生的抗流感抗體的數(shù)量相關(guān)的免疫原性參數(shù)。這些免疫原性參數(shù)通常被稱為CHMP標(biāo)準(zhǔn)，其用于對滅活流感疫苗進行每年重新許可認(rèn)證(參考文獻7)。至今為止，通過使用滅活疫苗的一次單次鼻內(nèi)施予，不加佐劑(其是疫苗中的附加成分，其不來自將用疫苗來預(yù)防的感染性試劑，并且是為了增強對抗原的免疫應(yīng)答的目的被加入到疫苗制劑中)，就符合這些免疫學(xué)要求或者CHMP標(biāo)準(zhǔn)(參考文獻7)的、對人類抵抗流感的成功免疫尚未有記栽。因此，人們認(rèn)識到，在本領(lǐng)域中仍有對下述滅活流感疫苗組合物的需求，所述組合物能在單次鼻內(nèi)給藥之后誘導(dǎo)滿意的全身性免疫反應(yīng)，并且不含佐劑，且通過所述單次給藥能符合CHMP標(biāo)準(zhǔn)(參考文獻7)。所述"CHMP標(biāo)準(zhǔn)，，按照下文所述被定義。在CHMP(CommitteeforMedicinalProductsforHumanUse)的iVofe尸orCw油/7ce/^sr邁o/z/sa〃ono尸Ae《u/re邊e/"尸orZn/7ue/zza「acc//2es中，定義了下述血清學(xué)參數(shù)，以評定滅活流感疫苗的免疫原性-血清保護率，其中血清保護被定義為紅血球凝聚抑制(HaemagglutinationInhibition,HI)效價>40,-血清轉(zhuǎn)化率，其中血清轉(zhuǎn)化被定義為接種前HI效價<10，接種后HI效價>40，或者，接種前HI效價>IO以及HI效價至少4倍的增加，-平均倍數(shù)增加值，這是對受試者內(nèi)增加的幾何平均值(即，接種后HI效價/接種前HI效價)。針對流感疫苗免疫原性的C服P要求是對于疫苗中三種病毒林中的每種而言，符合下述標(biāo)準(zhǔn)中的至少一項<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明還適用于兒童，從他們顯示出，他們以與成年人相當(dāng)?shù)姆绞阶鞒雒庖邞?yīng)答(參考文獻8)。本發(fā)明還適用于老年受試者。老年人為超過60歲的。發(fā)明描述令人吃驚地，與臨床前嚙齒類數(shù)據(jù)和關(guān)于人類臨床經(jīng)歷的文獻相反，我們發(fā)現(xiàn)，對于18-60歲年齡組而言，用包含重構(gòu)流感病毒包膜的滅活流感疫苗進行單次鼻內(nèi)接種后，人類的免疫應(yīng)答符合針對流感疫苗療效的全部三個CHMP標(biāo)準(zhǔn)。一次單次鼻內(nèi)施予是為符合針對滅活流感疫苗免疫原性的上述CHMP標(biāo)準(zhǔn)，通過一個或兩個鼻孔進行疫苗制劑的接種，而無需重復(fù)施予疫苗制劑。一次單次疫苗施予(通過鼻、吸入、口服、皮下或肌內(nèi)途徑)通常是下述接種安排，其不包括在本領(lǐng)域作為初次(priming)和強化(boosting)而已知的、以數(shù)天或數(shù)周的時間間隔對疫苗的多次施予。被z沒計為鼻內(nèi)或吸入給藥制劑的制劑包含一種或多種活性組分和賦形劑的混合物，是按照允許鼻內(nèi)或吸入給藥的方式制備的。本發(fā)明提供了一種方法，用于誘導(dǎo)符合CHMP標(biāo)準(zhǔn)的全身性免疫應(yīng)答(循環(huán)的免疫球蛋白或產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞)，有利地，所述方法用對病毒顆粒流感疫苗的單次鼻內(nèi)或吸入給藥來進行。本發(fā)明還提供了一種方法，用于誘導(dǎo)局部或粘膜免疫應(yīng)答，所述應(yīng)答包括粘膜膜表面上作為IgA已知的分泌免疫球蛋白的增加，有利地，所述方法用對病毒顆粒流感疫苗的單次鼻內(nèi)或吸入給藥來進行?；钚?參考文獻12)。此類組織作^^相關(guān)淋巴組織(WALT)已;，其還被顯示為用于細(xì)胞免疫應(yīng)答的粘膜誘導(dǎo)位點(參考文獻13)。因為已知病毒顆粒具有誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)免疫應(yīng)答妁可能性(參考文獻14、15),因此本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)的方法。病毒顆粒(virosome)是含有病毒糖蛋白的脂質(zhì)雙層。通常通過用去垢劑從帶包膜病毒提取膜蛋白和脂類，接著通過除去所述去垢劑來重構(gòu)特征性雙層來生產(chǎn)病毒顆粒。本發(fā)明還提供了流感病毒顆粒的組合物，其包含重構(gòu)的流感病毒包膜(具體而言，不再加脂類，并且不加免疫刺激劑(通常稱為佐劑)的免疫調(diào)節(jié)劑而重構(gòu))，用于通過氣溶膠進行接種，所述氣溶膠通過一個或兩個鼻孔施予鼻咽或口咽的粘膜，以獲得抵抗流感的全身性和局部免疫性。通過吸入進行的單次施予也是可行的。單次口服粘膜施予也是可行的?？蓮臏缁畈《緛碇苽渲貥?gòu)流感病毒顆粒，可以用不可透析的去垢劑對滅活病毒加以溶解，通過吸附到疏水珠粒上來除去所述去垢劑。制備物可包含一種或多種流感抗原的經(jīng)過純化的懸浮液，所述流感抗原選自血細(xì)胞凝集素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、血細(xì)胞凝集素的衍生物和神經(jīng)氨酸酶的衍生物。可以在病毒脂類(含有低水平的內(nèi)毒素和卵清蛋白)構(gòu)成的膜中，對病毒膜蛋白血細(xì)胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶進行重構(gòu)(見參考文獻9)。血清凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶的衍生物是具有經(jīng)修飾的氨基酸序列和/或結(jié)構(gòu)的血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶分子。氨基酸可例如被刪除、替換或添加到序列中。此外，糖基化方式可被改變。衍生物保留有導(dǎo)入宿主時誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力?？稍诶绾信咛サ碾u蛋中，或在附著的細(xì)胞或懸浮液中的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)用于制備重構(gòu)病毒顆粒的流感病毒。病毒例如可以是野生型的或重配的(reassortant)或經(jīng)過遺傳修飾的株。病毒類型可例如是任何流感A或B亞型，包括流行性的林。本發(fā)明還提供疫苗。術(shù)語疫苗應(yīng)被理解為具有免疫活性的藥物制備物。在某些實施方式中，疫苗可包含病原性微生物的無害變體或衍生物，例如，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對真實病原體的抵抗。在某些實施方式中，當(dāng)疫苗施予宿主時例如能誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫。疫苗可含有病原體或病原體組分的已死亡或削弱形式，例如病原體的抗原性組分。疫苗制備物可還含有藥物載體，所述藥物載體可針對疫苗將被施予的特定模式加以設(shè)計，例如針對鼻內(nèi)或吸入給藥設(shè)計的藥物載體。流感疫苗可包含一種或多種未變性流感抗原，其一種或多種能誘導(dǎo)流感特異的免疫應(yīng)答。本發(fā)明提供了含流感病毒顆粒的組合物，所述流感病毒顆粒包含所述病毒的重構(gòu)包膜，其中所述組合物被設(shè)計為鼻內(nèi)或吸入給藥制劑。本發(fā)明還提供了其中病毒顆粒包含流感抗原血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶或其衍生物的所述組合物。本發(fā)明還提供了其中病毒包膜完全從病毒粒子獲得的所述組合物。本發(fā)明還提供了其中沒有脂類從外源向重構(gòu)病毒顆粒加入的所述組合物。本發(fā)明還提供了其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑的所述組合物。本發(fā)明還提供了其中對受試者的單次鼻內(nèi)或吸入給藥能誘導(dǎo)全身性免疫應(yīng)答的所述組合物。本發(fā)明還提供了其中對受試者的單次鼻內(nèi)或吸入給藥還能誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答的所述組合物。本發(fā)明還提供了對受試者的單次鼻內(nèi)或吸入給藥還能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞應(yīng)答的所述組合物。本發(fā)明還或細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞應(yīng)答的能力的所述組::。^發(fā)明-還提供了P其中免疫應(yīng)答包含針對流感抗原血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶或其衍生物的免疫應(yīng)答的所述組合物。在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明還提供了其中免疫應(yīng)答符合用于流感疫苗的CHMP標(biāo)準(zhǔn)的所述組合物。本發(fā)明還提供了其中免疫應(yīng)答提供下述中的一種或多種的所述組合物對成年人而言>70%和/或?qū)夏耆硕?gt;60%的血清保護率，針對成年人>40%和/或針對老年人>30%的血清轉(zhuǎn)化率，以及針對成年人〉2.5和/或針對老年人〉2.0的平均倍數(shù)增加。在一種特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明還提供了其中每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素劑量等于或低于30ng的所述組合物。最后，本發(fā)明還提供了其中組合物是包含用于鼻內(nèi)或吸入給藥的藥物載體的疫苗制劑的所述組合物。本發(fā)明還提供了包含所述病毒的重構(gòu)包膜的流感病毒顆粒用于制備用于鼻內(nèi)或吸入給藥的組合物的用途。本發(fā)明還提供了這樣的所述用途其中，流感病毒顆粒包含流感抗原血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶或其衍生物。本發(fā)明還提供了這樣的所述用途其中病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得。本發(fā)明還提供了這樣的所述用途其中沒有脂類從外源加入到重構(gòu)病毒顆粒。本發(fā)明還提供了這樣的所述用途其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑。本發(fā)明還提供了這樣的所述用途其中向受試者的單次鼻內(nèi)或吸入給藥足以誘導(dǎo)全身性免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供了這樣的所述用途其中向受試者的單次鼻內(nèi)或吸入給藥還誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供了這樣的所述用途其中向受試者的單次鼻內(nèi)或吸入給藥還誘導(dǎo)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞應(yīng)答。本發(fā)明還提供了這樣的所述用途其中接受給藥的受試者是人類。本發(fā)明還提供了這樣的所述用途誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答包含針對流感抗原血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶或其衍生物的免疫應(yīng)答。在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明還提供了這樣的所述用途，其中組合物誘導(dǎo)符合針對流感疫苗的CHMP標(biāo)準(zhǔn)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供了這樣的所述用途，其中免疫應(yīng)答提供下述中的一種或多種對成年人而言>70%和/或?qū)夏耆硕?gt;60。/。的血清保護率，針對成年人>40°/。和/或針對老年人〉30。/。的血清轉(zhuǎn)化率，以及針對成年人>2.5和/或針對老年人>2.0的平均倍數(shù)增加。在一種特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明還提供了這樣的所述用途，其中每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的施予劑量等于或低于30ng。最后，本發(fā)明還提供了其中制備的組合物是疫苗制劑的所述用途。因此，在一種實施方式中，本發(fā)明提供了包含所述病毒的重構(gòu)包膜的流感病毒顆粒的組合物，其中所述病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得，其中沒有從外源向重構(gòu)病毒顆粒加入脂類，其中病毒顆粒包含流感抗原血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶或其衍生物，其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑，以及其中所述組合物作為鼻內(nèi)或吸入給藥制劑來設(shè)計，所述組合物特征在于所述制劑向人類的單次鼻內(nèi)或吸入給藥能誘導(dǎo)抵抗所述流感抗原的全身性免疫應(yīng)答和/或局部免疫應(yīng)答，所述全身性應(yīng)答能符合用于流感疫苗的CHMP標(biāo)準(zhǔn)，以及其中，每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素劑量等于或低于30ng。根據(jù)另一種實施方式，本發(fā)明提供了包含所述病毒的重構(gòu)包膜的流感病毒顆粒用于制備用于鼻內(nèi)或吸入給藥的組合物的用途，其中所述病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得，其中沒有從外源向重構(gòu)病毒顆粒加入脂類，其中病毒顆粒包含流感抗原血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶或其衍生物，其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑，所述流感病毒顆粒用于制備用于鼻內(nèi)或吸入給藥的組合物的用途的特征在于，所述組合物向人類的單次鼻內(nèi)或吸入給藥足以誘導(dǎo)抵抗所述流感抗原的全身性免疫應(yīng)答和/或局部免疫應(yīng)答，所述應(yīng)答能符合針對流感疫苗的CHMP標(biāo)準(zhǔn)，以及其中每種病毒株每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素劑量等于或低于30pg。根據(jù)另一種實施方式，本發(fā)明提供了一種包含流感病毒顆粒的組合物的疫苗制劑，所述病毒顆粒包含所述病毒的重構(gòu)包膜，其中，所述病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得，其中沒有從外源向重構(gòu)病毒顆粒加入脂類，其中病毒顆粒包含流感抗原血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶或其衍生物，其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑，其中疫苗特征在于針對向人類的單次鼻內(nèi)或吸入給藥來設(shè)計疫苗，并且，其中每種病毒株每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素劑量等于或低于30jug。有利地，所述制劑的所述單次鼻內(nèi)或吸入給藥能在所述人類中誘導(dǎo)全身性和/或局部免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明還提供了包含一定量的用于單次鼻內(nèi)或吸入給藥的所述疫苗制劑的裝置。每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用劑量還可以低于或等于25jLig、20|ig、15|ig、10lig或5jug。引用的文獻(1)MaassabHF.Adaptationandgrowthcharacteristicsofinfluenzavirusat25。C，Y"wre213，612-14(1967)(2)MaassabHF.BryantML.Thedevelopmentof1iveattenuatedcold—adaptedinfluenzavirusvaccineforhumans.Aey.J/ed.P7rc>/,1999Oct-Dec;9(4):237-44(3)KeitelW，PiedraPA.Livecold-adapted，reassortantininfluenzavaccines(USA).In:TextbookofInfluenza.NicholsonKG,WebsterRG,HayAJ(Ed),BlackwelScienceOxford,UK,373-390(1998)(4)GluckU，GebbersJ0，GluckR，Phase1evaluationofintranasalvirosomalinfluenzavaccinewithandwithoutEscherichiacoliheat-labiletoxininadultvolunteers.JVirol.1999Sep;73(9):7780-6(5)SamdalHH，BakkeH，OftungF，HoistJ，HaugenIL，KorsvoldGE，KristoffersenAC，KroghG，NordK，RappuoliR，BerstadAKH，HanebergB,Anon-LivingNasalInfluenzaVaccineCanInduceMajorHumoralandCellularImmuneResponsesinHumanswithouttheNeedforAdjuvants.HumanVaccines1:2，85-90;March/April2005(6)MutschM，ZhouW，RhodesP，BoppM，ChenRT，LinderT，SpyrC，SteffenR.UseoftheinactivatedintranasalinfluenzavaccineandtheriskofBeirspalsyinSwitzerland.NEnglJMed，2004Feb26;350(9):896-903(7)NoteforGuidanceonHarmonisationofRequirementsforInfluenzaVaccines.EMEA/CpMP/BWP/214/96(8)Daubeney,P.，Taylor,C.J.，McGaw，J.,Brown，B而n，E.M.，Ghosal，S.，Keeton，B.R.，Palache，B.，Kerstens，R.Immunogenicityandtolerabilityofatrivalentinfluenzasubunitvaccine(InfluvacR)inhigh-riskchildrenaged6monthsto4years.BJCP1997March,51(2):87-90(9)Stegmann,T.，Morselt，H.W.M.，Booy，F(xiàn).P.，VanBreemen，J.F丄，Scherphof，G.，Wilschut，J.Functionalreconstitutionofinfluenzavirisenvelopes.EMBOJournal1987，6(9):2651-2659(10)TreanorJ，NolanC，0，BrienD，BurtD，LowellG，LindenJ，F(xiàn)riesL.Intranasaladministrationofaproteosome-influenzavaccineiswell-toleratedandinducesserumandnasalsecretioninfluenzaantibodiesinhealthyhumansubjects.Vaccine2006;24(3):254-62(11)ReadR.C.，NaylorS.C.PotterC.W.，BondJ.，Jabbal-Gi11I.,FisherA.，IliumL.，JenningsR.Effectivenasalinfluenzavaccinedeliveryusingchitosan.Vaccine2005;23(35):4367-74(12)KuperCF，KoornstraPJ，HameleersDM,BiewengaJ，SpitBJ，DuijvesteinAM,vanBredaVriesmanPJ，SminiaT.Theroleofnasopharyngeallymphoidtissue./鵬"/70人7Wfl7199213:219-24(13)ZuercherAW，CoffinSE，Th證heerMC，F(xiàn)undovaP，CebraJJ.Nasal—associatedlymphoidtissueismucosalinductivesiteforvirus—specifichumoralandcellularimmuneresponses.LImmunol.2002168:1796-803(14)HuckriedeA，BungenerL，StegmannT，DaemenT，MedemaJ，PalacheAM,WilschutJ.Thevirosomeconceptforinfluenzavaccines.Vaccine200523(Suppl1):S26-38(15)GltickR，BurriKG,MetcalfeI，Adjuvantandantigendeliverypropertiesofvirosomes.Curr.20052:395-400實施例實施例1在8周齡的BALB/C小鼠中的LPP病毒顆粒疫苗；次優(yōu)HA劑量水平上，對多種HA/LPP比例的鼻內(nèi)比較流感血清陰性雌性Balb/c小鼠組成的組(每組10只)通過鼻內(nèi)施予獲得LPP(脂肽)-病毒顆粒疫苗，其HA/LPP比例為1:1.5、1:0.7、1:0.4、1:0(即沒有LPP)，并且每份劑量具有2jag的HA。此外，IO只雌性小鼠的對照組接受0pgHA/劑量(載體的鼻內(nèi)施予)。制備含有LPP的病毒顆粒的四種制備物。簡言之，通過離心對30-40%蔗糖溶液中的滅活流感病毒進行沉淀。重新懸浮病毒，溶解于含有去垢劑八聚乙二醇單十二烷基醚(Octaethyleneglycolmonododecylether)(OEG)的緩沖液中。隨后，通過超離心除去病毒核殼體。將含有0EG的上清液分為4等分體積，加入不同量的含0EG緩沖液中的脂肽P3CSK4(P3CSK4:N-棕櫚酰-S-[2，3-雙(棕櫚酰氧)-(2RS)-丙基]-[R]-半胱氨酰-[S]-絲氨酰-[S]-賴氨酰-[S]-賴氨酰-[S]-賴氨酰-[S]-賴氨酸)。用含OEG的緩沖液調(diào)節(jié)體積。通過吸附到疏水樹脂上除去0EG。這導(dǎo)致了含LPP的病毒顆粒的形成，一種在它們膜中含有HA和NA以及(可選地)在它們膜中含有LPP的重構(gòu)的病毒小泡。OEG去除之后，將病毒顆粒經(jīng)孔徑為0.22um的PVDF膜過濾。起始原料為20mg的HA，其來自甲型流感/Wyoming/3/2003X-147(類A/Fujian/411/200(H3N2)株)，含有252I.U.內(nèi)毒素/100pgHA。溶解后，按照表l所概述的制備4批。表1病毒顆津立的制備<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>載體由5mMHepes、145mMNaCl、1mMEDTA(pH7.4)構(gòu)成。對組E(見表2)來說，將載體經(jīng)孔徑為0.22)im的PVDF膜過濾。按照表2所述，針對鼻內(nèi)免疫，將制備的4批病毒顆粒稀釋至200|ug/ml的濃度，針對肌內(nèi)免疫，稀釋至67jLig/ml的濃度，分裝進lml的小瓶(每組2瓶)。按照表4所概迷的來使用這些疫苗組。表2疫苗的制備<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>'載體:經(jīng)孔徑為O.22jam的PVDF膜的5mMHepes、145mMNaCl、1mMEDTA(pH7.4)過濾。對制劑的分析針對表3所示的若干種變量來分析用于本研究的制劑。表3對于用于制備疫苗的病毒顆粒的分析數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>純度「主要是HA主要是HA主要是HA主要是HAaLowry試驗，原理用堿式石克酸銅和Folin-ciocalteu酚試劑處理之后，蛋白質(zhì)形成藍色。使用白蛋白BSA標(biāo)準(zhǔn)作為參考，從"Onm處的吸光度來測定蛋白質(zhì)含量。Lowry,OH，NJRosebrough,AI>Farr，andRJRandall./.C力復(fù)7":265.1951.Oostra，GM,NSMathewson,andGNCatravas.細(xì)/.5/oc力e瓜狄31.1978.Stoscheck，CM.QuantitationofProtein./'/紐，/柳7《么50-69(1990).Hartree，EF.J/ja/S/oc力e/B4及422-427(1972).bphEur:專題文章2053和2.7.1節(jié)。原理每個磷脂含有單個磷原子，其可用于對磚脂進行定量。通過高氯酸來破壞磷脂，通過鉬酸鹽絡(luò)合產(chǎn)生的磷酸鹽/酯，鉬酸鹽被抗壞血酸還原產(chǎn)生藍色的產(chǎn)物。用分光光度計在812nm處測定顏色。通過包括磷酸校準(zhǔn)物來對樣品中磷脂的量加以定量。AmesBN.Assayofinorganicphosphate,totalphosphateandphosphatases.Meth.Enzymol.1966;8:115—118B6ttcherCJF，vanGentCM&PriesC.Arapidandsensitivesub-microphosphorusdetermination.Anal.Chim.Acta1961;24:203-204dPh.Eur.2.6.146卵清蛋白ELISA是直接的三明治式酶免疫方法，其中使用用于捕捉的固定的多克隆抗卵清蛋白抗體以及抗卵清蛋白-HRP結(jié)合物作為檢測系統(tǒng)。對結(jié)合物和樣品進行同時培養(yǎng)。通過洗滌步驟去除未結(jié)合的組分。將底物(TMB和H202)加入到孔中。通過藍色的顯色來指示孔中特異性結(jié)合的結(jié)合物的存在。向底物中加入硫酸來終止反應(yīng)，其導(dǎo)致產(chǎn)物中顏色變化為黃色。在450nm讀取吸光度(0D)。為獲得最優(yōu)結(jié)果，在620nm處使用參照濾光器。從試驗中包括的卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)(0.3-20.0ng/ml)的應(yīng)答來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的濃度從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來讀取。f根據(jù)專題文章0869和2053:通過聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢查單價合并的(monovalentpooled)收集物的純度。電泳按照Ph.Eur2.2.31來進行。測試系統(tǒng)測試動物j吏用七組動物，每組十只雌性Balb/c小鼠(BALB/cAnNCrl)。在處理的一開始，小鼠為8-9周齡，重量為17-19g。在第0天和第14天用單價LPP病毒顆粒流感疫苗(A/Wyoming)對動物進行鼻內(nèi)接種，在第二次接種后21天進行尸體檢查。鼻內(nèi)在背部輕度異氟烷/02/&0麻醉的動物中鼻內(nèi)接種測試物質(zhì)(10jul，分成兩個鼻孔上進行)。表4處理安排<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>在第一次接種之前以及第一次接種14天之后，在異氟烷/02/&0麻醉下收集眼窩血樣。第35天，處死動物，收集血樣(在02/002麻醉下通過腹部大動脈或心臟穿刺放血)。收集來自全部樣品的血清，深度冷凍，于低于-iox:貯存在聚丙烯管中直到進行處理。流感病毒使紅血球細(xì)胞(RBCs)凝集，在存在足夠的病毒特異性抗體時這會被阻止。該現(xiàn)象提供了血細(xì)胞凝集抑制(HI)試驗的基礎(chǔ)，該試驗被用于探測和定量血清中的特異性抗病毒抗體。將血清加入到流感病毒和火雞RBCs中。對若千稀釋液加以測試(效價分析)。HI效價被定義為仍能抑制血細(xì)胞凝集的最高稀釋度的倒數(shù)。按下文所述來計算幾何平均值效價(GMT):1)對各個log(效價)進行計算，得到兩次重復(fù)的算術(shù)平均值[1(^(效價1)+1og(效價2)]/22)計算各個log(效價)的算術(shù)平均值3)GMT(組)-10EXP(組平均值log(效價))統(tǒng)計學(xué)分析通過接種組和天數(shù)，使用幾何平均偉效價來概括HI效價。通過線性回歸來分析經(jīng)log轉(zhuǎn)化的第35天組的HI效價，以研究疫苗中LPP的量與GMT之間的劑量應(yīng)答關(guān)系。結(jié)果HI效價分析GMT示于表5中。表5幾何平均值效價<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>第0天，在小鼠中不能探測到HA特異性抗體(即，所有HI效價<10)。第14天，在通過鼻內(nèi)途徑(i.n.)接種的小鼠中的大多數(shù)中不能探測到HA特異性抗體。所有效價<10，除了組A中的一只小鼠(HI效價80)、組C中的一只小鼠(HI效價35)和組D中的一只小鼠(HI效價160)之外。第35天，觀察到了HA特異性抗體產(chǎn)生中的劑量應(yīng)答，即，向疫苗中加入更多的LPP導(dǎo)致更高的抗體效價。通過線性回歸在組間比較(經(jīng)log轉(zhuǎn)換的)第35天的HI效價。擬合的回歸斜率有高度顯著差異(P<0.0001)。因此，觀察到的疫苗中的LPP含量與GMT之間的劑量應(yīng)答關(guān)系在統(tǒng)計上是顯著的。結(jié)論用無佐劑的重構(gòu)流感病毒顆粒對小鼠進行重復(fù)鼻內(nèi)接種不誘導(dǎo)可被測量到的全身性免疫應(yīng)答。以同樣HA劑量水平(2jLigHA/劑量)，采用上升的LPP劑量，用佐以LPP的重構(gòu)流感病毒顆粒進行的重復(fù)鼻內(nèi)接種顯示出了LPP劑量依賴型免疫應(yīng)答。與本發(fā)明完全相反(見下面的實施例2)，這些數(shù)據(jù)之前被認(rèn)為支持本領(lǐng)域的公認(rèn)結(jié)論，即，使用免疫刺激劑(在這種情況下LPP)對于用滅活流感疫苗進行鼻內(nèi)接種是必要的，即使流感抗原(HA)存在于重構(gòu)病毒顆粒中。實施例2雙盲、隨機、平行的組研究，以研究脂肽佐劑的安全性及其對于病毒顆粒亞基流感疫苗療效的效果(在年齡>18和<40的健康年輕成年人中鼻內(nèi)運送之后)用含有每抹150mcgHA/mL和315mcgLPP/mL的、佐有LPP(脂肽)的重構(gòu)流感病毒顆粒以0.2ml的劑量體積(每個鼻孔0.1ml)對健康人類志愿者進行鼻內(nèi)接種。用含有每林150mcgHA/mL的、沒有LPP的重構(gòu)流感病毒顆粒以0.2ml的劑量體積(每個鼻孔0.1ml)對類似的組進行鼻內(nèi)接種。研究目的是在男人中驗證小鼠中展示的觀點，即，為在用滅活流感疫苗進行鼻內(nèi)接種后獲得滿意的全身性免疫應(yīng)答，需要使用佐劑(例如LPP)。研究設(shè)計這是在年齡>18和<40的健康年輕受試者中進行的雙盲、隨機平行組研究。該研究在一個研究中心進行SwissPharmaContractLtd.，瑞士巴塞爾。主要的研究者是M.Seiberling博士。研究具有兩個部分。在部分I中，在12名受試者中評定佐有LPP的病毒顆粒亞基流感疫苗的安全性。用LPP-RVM(LPP重構(gòu)的病毒膜；流感疫苗-表面抗原，滅活的，病毒顆粒-佐有LPP)接種九名受試者，用RVM(流感疫苗-表面抗原，滅活的，病毒顆粒-)來接種三名受試者。在研究的部分II中，在一百名受試者中(每組50名)評定LPP-RVM的療效和安全性。研究在健康受試者中進行。此外，在研究開始前三年期間，參與研究的部分II的受試者都沒有針對流感進行接種。這通過盡量減小具有預(yù)先存在的針對流感的抗體的受試者的數(shù)目，增加了部分II中研究人群的均一性。部分I:在接種前14天(第l次訪問)，在所述受試者已經(jīng)給出知情同意后，針對包括和排除標(biāo)準(zhǔn)對他或她加以篩選，并對他或她進行身體檢查。在該次就診中，釆集鼻上皮細(xì)胞的樣品用于細(xì)胞學(xué)分析，用糖精試驗來測量基線纖毛(cilia)活性。在第2次就診(第1天)，取4-6mL血樣，用于標(biāo)準(zhǔn)血液學(xué)分析，取6-10mL血樣用于標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)分析，并評定生命體征。經(jīng)過隨機化后，用兩種疫苗制劑之一來接種受試者，在接種之后受試者就地停留第一個24小時，以監(jiān)測立即產(chǎn)生的局部和全身性反應(yīng)以及不良事件。在接種后第四和二十四小時評定生命體征。此外，24小時后，取兩份血樣用于標(biāo)準(zhǔn)血液學(xué)(4-6mL)和生物化學(xué)(6-10mL)分析；接種后，采集鼻上皮細(xì)胞的樣品用于細(xì)胞學(xué)分析，用糖精試驗進行接種后纖毛活性分析。向受試者發(fā)放調(diào)查問巻(調(diào)查問巻I)，讓他們帶回家，評定下一天(第3天)的局部和全身性反應(yīng)。受試者必須在他們被釋放回家后兩周回到研究點第3次就診(第4天)。在該次就診中，評定局部和全身性反應(yīng)，記錄前次和本次就診之間發(fā)生的任何自發(fā)不良事件。此外取兩份血樣用于標(biāo)準(zhǔn)血液學(xué)(4-6mL)和生物化學(xué)(6-10mL)分析，并評定生命體征。在第一次接種后兩周，在第15天，所述受試者回到研究點(第4次訪問)。在該次就診中，收集鼻上皮細(xì)胞的樣品用于細(xì)胞學(xué)分析，用糖精試驗測量纖毛活性，記錄第3次就診和第4次就診間發(fā)生的不良事件。部分II:在第一次采血和鼻洗出物(wash)釆樣前H天(第l次訪問)，在所述受試者已經(jīng)給出知情同意后，針對包括和排除標(biāo)準(zhǔn)對他或她加以篩選，通過身體檢查來檢測他或她的健康。在第2次就診(-1天；該就診可以與第1次就診合并進行)，取6-10mL血樣用于基線血細(xì)胞凝集抑制(HI)效價測定，并且取血樣進行標(biāo)準(zhǔn)血液學(xué)(4-6mL)和標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)(6-10mL)分析。收集鼻洗出物樣品用于測定基線鼻IgA抗體效價。下一天，在第3次就診(第1天)，在對生命體征的評定之后，對所述受試者進行隨機化，用鼻流感疫苗的兩種制劑之一的單一劑量進行接種。在接種后的第一個小時中，就地監(jiān)測任何立即的局部反應(yīng)、全身性反應(yīng)和不良事件。之后，重新評定生命體征，受試者獲得調(diào)查問巻帶回家，在接種后的第一個七天，記錄每天的局部和全身性反應(yīng)。兩周后(第4次就診；第15天)，取6-10mL血樣用于HI效價測定，取兩份額外血樣用于標(biāo)準(zhǔn)血液學(xué)(4-6mL)和生物化學(xué)(6-10mL)分析，取鼻洗出物樣品用于鼻IgA抗體效價分析。效果評定為評定效果，在第-1天(基線)和第15天收集血樣和鼻洗出物樣口口o血樣收集6-10mL血，以測定血細(xì)胞凝集抑制(HI)抗體效價。！血液收集和凝固之后(室溫下至少30分鐘)，分離血清，并保持冷凍(-20。C)，直到進行效價分析。以雙份重復(fù)進行抗體效價分析。樣品的效價是兩次測定的幾何平均值。接種前和接種后的血清被同時進行效價分析。鼻洗出物樣品為收集鼻洗出物樣品，于一個鼻孔，在鼻鏡檢查控制下，應(yīng)用6mL預(yù)熱的鹽水(37匸)。所述受試者被要求將頭傾60°角，使得洗液可以流動。收集的洗液應(yīng)用于第二個鼻孔，其在相同的條件下被洗滌。向樣品中加入防腐溶液(樣品體積的1/100)。防腐溶液含有10mg/ml溶解于IOOmMTrisHC1緩沖液中的牛血清白蛋白，pH8。通過低速離心(800xg，10分鐘)來直接澄清樣品，將其分為小份(以避免今后對樣品的重復(fù)解凍)，將其放置在干水上，直到轉(zhuǎn)移進-8ox:。通過ELISA來測定鼻洗滌樣品中的IgA水平，用Wilcoxon試驗來進行統(tǒng)計分析。流感疫苗在96孔板中被用作包被抗原。通過與封閉緩沖液一起溫育來封閉非特異性結(jié)合位點。將鼻洗出物以封閉緩沖液兩1PalmerDF，DowdleWR，ColemanMT，SchildGC.血細(xì)胞凝集反應(yīng)抑制實驗.用于流感診斷的先進的實驗室技術(shù).U.S.Dept.H"h.Ed.Welfare,P.H.S.Atlanta;1975:25-62倍稀釋(每份樣品12份稀釋液)，用于將流感特異性抗體吸附到96孔板的抗原上。在與酶結(jié)合的抗人抗體(結(jié)合有馬辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)一起溫育之前對96孔板加以洗滌。通過洗滌除去未結(jié)合的抗人抗體，通過在加入用于酶反應(yīng)的底物之后測量光密度來測定流感林特異性抗體的量。疫苗制劑兩種不同的流感疫苗制劑用于本項研究。兩種制劑都含有WHO為2005年南半球推薦的病毒抗原2，其劑量水平為每O.2ml的劑量每林30mcg。-A/NewCaledonia/20/99/(H1N1)才豐林-A/Wellington/1/2004(H3N2)樣林-B/Shanghai/361/2002樣抹簡言之，通過離心對30-40%蔗糖溶液中的滅活流感病毒進行沉淀。重新懸浮病毒，溶解于含有去垢劑，八聚乙二醇單十二烷基醚(OEG)的緩沖液中。隨后，通過超離心除去病毒核殼體。用含0EG緩沖液中的脂肽P3CSK4來調(diào)節(jié)含OEG的上清液，或者在不含LPP的重構(gòu)病毒膜的情況下，僅用含0EG的緩沖液來調(diào)節(jié)(P3CSK4:N-棕櫚酰-S-U，3_雙(棕櫚酰氧)-(2RS)-丙基]-[R]-半胱氨酰-[S]-絲氨酰-[S]-賴氨酰-[S]-賴氨酰-[S]-賴氨酰-[S]-賴氨酸)。通過吸附到疏水樹脂上除去0EG。這導(dǎo)致了含LPP或不含LPP的病毒膜(在膜中含有HA和NA以及可選地在膜中含有LPP的重構(gòu)病毒小泡)的形成。OEG去除之后，將病毒顆粒經(jīng)孔徑為0.22iam的PVDF膜過濾。對于病毒的每種林而言，制備具有或不具有LPP的單獨的制備物(表6)。加入的LPP的量相應(yīng)于1:0.7(w/w)的HA/LPP比例。2WHO推薦的用于2005年流感季節(jié)的流感病毒疫苗組合物.WeeklyEpidemRec.2004;W:369.376表6病毒顆粒的制備<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表7對制劑的分析<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>aLowry試驗，原理用堿式石危酸銅和Folin-ciocalteu酚試劑處理之后，蛋白質(zhì)形成藍色。使用白蛋白BSA標(biāo)準(zhǔn)作為參考，從7S0認(rèn)處的吸光度來測定蛋白質(zhì)含量。Lowry，OH，NJRosebrough，ALFarr，andRJRandall./.S/o厶C力e瓜265.1951.Oostra，GM，NSMathewson，andGNCatravas.S/cc/eiZ7.狄31.1978.Stoscheck，CM.QuantitationofProtein,yf/"ef力oc^/刀50-69(1990).Hartree，EF.細(xì)/脅c細(xì)化422-427(1972).bPhEur:專題文章2053和2.7.1節(jié)。原理每個磷脂含有單個磷原子，其可用于對磷脂進行定量。通過高氯酸來破壞磷脂，通過鉬酸鹽絡(luò)合產(chǎn)生的磷酸鹽/酯，鉬酸鹽被抗壞血酸還原產(chǎn)生藍色的產(chǎn)物。用分光光度計在812nm處測定顏色。通過包括磷酸校準(zhǔn)物來對樣品中磷脂的量加以定量。AmesBN.Assayofinorganicphosphate,totalphosphateandphosphatases.Meth.Enzymol.1966;8:115—118B(UtcherCJF，vanGentCM&PriesC.Arapidandsensitivesub-microphosphorusdetermination.Anal.Chim.Acta1961;24:203-204dPh.Eur.2.6.14，6卵清蛋白ELISA是直接的三明治式酶免疫方法，其中使用用于捕捉的固定的多克隆抗卵清蛋白抗體以及抗卵清蛋白-HRP結(jié)合物作為檢測系統(tǒng)。對結(jié)合物和樣品進行同時培養(yǎng)。通過洗滌步驟去除未結(jié)合的組分。將底物(TMB和H20J加入到孔中。通過藍色的顯色來指示孔中特異性結(jié)合的結(jié)合物的存在。向底物中加入硫酸來終止反應(yīng)，其導(dǎo)致產(chǎn)物中顏色變化為黃色。在450nm讀取吸光度(0D)。為獲得最優(yōu)結(jié)果，使用620nm處的參照濾光器。從試驗中包括的卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)(0.3-20.0ng/ml)的應(yīng)答來制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的濃度從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來讀取。f根據(jù)專題文章0869和2053:通過聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢查單價合并的收集物的純度。電泳按照Ph.Eur2.2.31來進行。效果通過Wilcoxon，s排名總和試驗以0.05的雙側(cè)顯著水平，在兩個接種組之間對第15天每種病毒林的經(jīng)log轉(zhuǎn)化的HI抗體效價與第15天的鼻IgA抗體效價加以比較。還通過對每種病毒林和每個接種組計算下述三個參數(shù)來分析第15天的HI抗體效價。-血清保護率，其中血清保護被定義為紅血球凝聚抑制(HI)效價>40，-血清轉(zhuǎn)化率，其中血清轉(zhuǎn)化被定義為接種前HI效價<10，接種后HI效價>40,或者，接種前HI效價>IO以及HI效價至少4倍的增力口，-平均倍數(shù)增加，即所述HI效價倍數(shù)增加的幾何平均值。根據(jù)per-protocol和意向治療(intent-to-treat)的原理對效果數(shù)據(jù)加以分析。但是，鑒于這是所謂的原理驗證型研究，per-protocol分析被認(rèn)為是基本的一種。意向治療的樣本由被接種受試者的一些接種后效果數(shù)據(jù)組成。per-protocol樣本由完成了方案并且沒有發(fā)生主要的方案偏差的被接種受試者組成。主要的偏差包括(不限于)包含或排除標(biāo)準(zhǔn)的偏差，禁藥使用等。此外，實驗室驗證的并發(fā)流感感染的受試者以及失去了基本效果數(shù)據(jù)的受試者也被從per-protocol樣品中排除。在研究數(shù)據(jù)庫非盲之前，決定是否將受試者從per-protocol中排除。結(jié)果表8決定是否將受試者從per-protocol中排除。用病毒顆粒流感疫苗(RVM)進行鼻內(nèi)接種后對體液免疫應(yīng)答的CHMP評估<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>RVM:病毒顆粒流感疫苗LPP-RVM:佐有脂肽的病毒顆粒流感疫苗表8用病毒顆粒流感疫苗(RVM)進行鼻內(nèi)接種后對體液免疫應(yīng)答的CHMP評估(續(xù))血清轉(zhuǎn)化率<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>RVM:病毒顆粒流感疫苗LPP-RVM:佐有脂肽的病毒顆粒流感疫苗表8用病毒顆粒流感疫苗UVM)進行鼻內(nèi)接種后對體液免疫應(yīng)答的CHMP評估(續(xù))HI抗體效價的平均倍數(shù)增加值<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>注'幾何平均值RVM:病毒顆凈立流感疫苗LPP-RVM:佐有脂肽的病毒顆粒流感疫苗表9鼻洗出物IgA效價(GMT)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>結(jié)論出人意料地并與用同樣的疫苗批次的得的臨床前數(shù)據(jù)(實施例1)以及WO04/110486和臨床數(shù)據(jù)所描述的(GluckU，GebbersJ0，GluckR，Phase1evaluationofintranasalvirosomalinfluenzavaccinewithandwithoutEscherichiacoliheat—labiletoxininadultvolunteers.JVirol.1999Sep;73(9):7780-6)相反，在用無佐劑的重構(gòu)病毒顆粒流感疫苗僅進行一次接種的人類群體中，觀察到了令人滿意的、符合針對流感疫苗的CHMP標(biāo)準(zhǔn)的全身性免疫應(yīng)答。權(quán)利要求1.包含流感病毒顆粒的組合物，所述病毒顆粒包含所述病毒的重構(gòu)包膜，其中所述病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得，其中沒有從外源向所述重構(gòu)病毒顆粒加入脂類，其中所述病毒顆粒包含所述流感抗原血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶或其衍生物，其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑，并且其中所述組合物作為鼻內(nèi)或吸入給藥制劑來設(shè)計，所述組合物特征在于所述制劑向人類的單次鼻內(nèi)或吸入給藥能誘導(dǎo)抵抗所述流感抗原血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶或其衍生物的全身性免疫應(yīng)答和/或局部免疫應(yīng)答。2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素劑量低于或等于30pg。3.如權(quán)利要求1或2中任意一項所述的組合物，其中所述制劑的單次鼻內(nèi)或吸入給藥還能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞應(yīng)答。4.如權(quán)利要求1至3中任意一項所述的組合物，其中所述免疫應(yīng)答符合針對流感疫苗的CHMP標(biāo)準(zhǔn)。5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述免疫應(yīng)答提供下述中的一種或多種對成年人而言〉70%和/或?qū)夏耆硕?gt;60°/。的血清保護率，針對成年人>40°/。和/或針對老年人>30%的血清轉(zhuǎn)化率，以及針對成年人>2.5和/或針對老年人>2.0的平均倍數(shù)增加。6.如權(quán)利要求2至5中任意一項所述的組合物，其中，每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的劑量低于或等于25jag。7.如權(quán)利要求2至5中任意一項所述的組合物，其中，每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的劑量低于或等于20jag。8.如權(quán)利要求2至5中任意一項所述的組合物，其中，每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的劑量低于或等于15jig。9.如權(quán)利要求2至5中任意一項所述的組合物，其中，每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的劑量低于或等于10jng。10.如權(quán)利要求2至5中任意一項所述的組合物，其中，每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的劑量低于或等于5ng。11.如權(quán)利要求1至10中任意一項所述的組合物，其中，所述組合物是包含用于鼻內(nèi)或吸入給藥的藥物栽體的疫苗制劑。12.包含所述病毒的重構(gòu)包膜的流感病毒顆粒用于制備用于鼻內(nèi)或吸入給藥的組合物的用途，其中所述病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得，其中沒有從外源向所述重構(gòu)病毒顆粒加入脂類，其中所述病毒顆粒包含流感抗原血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶或其衍生物，其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑，所述組合物特征在于所述組合物向人類的單次鼻內(nèi)或吸入給藥足以誘導(dǎo)抵抗所述流感抗原血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶或其衍生物的全身性免疫應(yīng)答和/或局部免疫應(yīng)答。13.如權(quán)利要求12所述的用途，其中每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素劑量等于或低于30jLig。14.如權(quán)利要求12或13中任意一項所述的用途，其中所述制劑的單次鼻內(nèi)或吸入給藥還誘導(dǎo)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞應(yīng)答。15.如權(quán)利要求12至14中任意一項所述的用途，其中所述免疫應(yīng)答符合針對流感疫苗的CHMP標(biāo)準(zhǔn)。16.如權(quán)利要求15所述的用途，其中所述免疫應(yīng)答提供下述中的一種或多種對成年人而言〉70°/。和/或?qū)夏耆硕?gt;60°/。的血清保護率，針對成年人>40%和/或針對老年人>30°/。的血清轉(zhuǎn)化率，以及針對成年人>2.5和/或針對老年人>2.0的平均倍數(shù)增加。17.如權(quán)利要求13至16中任意一項所述的用途，其中每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的劑量低于或等于25mg。18.如權(quán)利要求13至16中任意一項所述的用途，其中每種病毒株每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的劑量低于或等于20jig。19.如權(quán)利要求13至16中任意一項所述的用途，其中每種病毒株每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的劑量低于或等于15pg。20.如權(quán)利要求13至16中任意一項所述的用途，其中每種病毒抹每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的劑量低于或等于10/ig。21.如權(quán)利要求13至16中任意一項所述的用途，其中每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的劑量低于或等于5"g。22.如權(quán)利要求12至21中任意一項所述的用途，其中制備的組合物是疫苗制劑。23.包含流感病毒顆粒的組合物的疫苗制劑，所述病毒顆粒包含所述病毒的重構(gòu)包膜，其中所述病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得，其中沒有從外源向重構(gòu)病毒顆粒加入脂類，其中病毒顆粒包含流感抗原血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶或其衍生物，其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑，該疫苗特征在于針對向人類的單次鼻內(nèi)或吸入給藥來設(shè)計所述疫苗，并且其中每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素劑量等于或低于30jig。24.如權(quán)利要求23所述的疫苗制劑，其中每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的劑量低于或等于25pg。25.如權(quán)利要求23所述的疫苗制劑，其中每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的劑量低于或等于20jag。26.如權(quán)利要求23所述的疫苗制劑，其中每種病毒林每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的劑量低于或等于15/Lig。27.如權(quán)利要求23所述的疫苗制劑，其中每種病毒株每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的劑量低于或等于10jag。28.如權(quán)利要求23所述的疫苗制劑，其中每種病毒株每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素的劑量低于或等于5pg。29.如權(quán)利要求23至28中任意一項所述的疫苗制劑，其中所述制劑的單次鼻內(nèi)或吸入給藥能在所述人類中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答包括抵抗流感抗原血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶或其衍生物的全身性免疫應(yīng)答，抵抗流感抗原血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶或其衍生物的局部免疫應(yīng)答，以及細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中的一項或多項。30.如權(quán)利要求29所述的疫苗制劑，其中所述免疫應(yīng)答符合針對流感疫苗的CHMP標(biāo)準(zhǔn)。31.如權(quán)利要求30所述的疫苗制劑，其中，所述免疫應(yīng)答提供下述中的一種或多種對成年人而言〉70%和/或?qū)夏耆硕?gt;60%的血清保護率，針對成年人>40°/。和/或針對老年人>30%的血清轉(zhuǎn)化率，以及針對成年人〉2.5和/或針對老年人>2.O的平均倍數(shù)增加。32.用于鼻內(nèi)或吸入給藥的裝置，所述裝置包含根據(jù)權(quán)利要求23至31中任意一項所述的疫苗制劑。33.如權(quán)利要求32所述的裝置，其中，所述裝置包含一定量的用于單次鼻內(nèi)或吸入給藥的疫苗制劑。34.如權(quán)利要求32或33述的裝置，其中，所述裝置是一次性的。全文摘要本發(fā)明提供了流感病毒顆粒的組合物，所述病毒顆粒包含所述病毒的重構(gòu)包膜，其中所述病毒包膜完全從流感病毒粒獲得，其中沒有從外源向重構(gòu)病毒顆粒加入脂類，其中病毒顆粒包含流感抗原血細(xì)胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶或其衍生物，其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑，并且其中所述組合物作為鼻內(nèi)或吸入給藥制劑來設(shè)計，所述組合物特征在于所述制劑向人類的單次鼻內(nèi)或吸入給藥足以誘導(dǎo)抵抗所述流感抗原的全身性免疫應(yīng)答和/或局部免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞應(yīng)答，所述全身性應(yīng)答能符合針對流感疫苗的CHMP標(biāo)準(zhǔn)，并且其中每種病毒株每次鼻內(nèi)或吸入給藥的血細(xì)胞凝集素劑量等于或低于30μg。本發(fā)明還提供了重構(gòu)的流感病毒顆粒用于制備所述組合物的用途，以及由此制備的疫苗制劑。文檔編號A61K39/145GK101405027SQ200780010217公開日2009年4月8日申請日期2007年3月21日優(yōu)先權(quán)日2006年3月22日發(fā)明者A·J·克斯坦,D·H·范蕾內(nèi)科萊希思,J·J·P·瑙塔,L·杰勒茲,P·J·舍恩申請人:索爾瓦生物學(xué)有限公司