專利名稱：：神經(jīng)變性疾病的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽在提高PP2A活性的方法和組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽在抑制或降低tau蛋白磷酸化的方法，抑制GSK3(3活性的方法，具體說(shuō)是治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的方法中的應(yīng)用。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及將硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽與其它治療藥物聯(lián)合用于治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的方法中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：神經(jīng)變性疾病是一些疾病的總稱，包括使腦功能正常的神經(jīng)元受損而致的腦控制自身或機(jī)體能力的喪失。神經(jīng)變性疾病是老年人的主要疾病。隨著預(yù)期壽命的增長(zhǎng)，世界人群活得更長(zhǎng)，神經(jīng)變性疾病患者的數(shù)目隨之增多。在一些神經(jīng)變性疾病中，腦中的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中存在異常tau蛋白的沉積。例如，在阿爾茨海默病(AD)特征性神經(jīng)原纖維纏結(jié)中發(fā)現(xiàn)了異常的tau蛋白。神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NT)是AD的二種神經(jīng)病理改變之一[Lee等，2001]。形成配對(duì)的螺旋纖維是NT的主要成分，其主要由微管相關(guān)蛋白tau組成[Lee等，1991;Grundke-Iqbal等，1986a;Grundke-Iqbal等，1986b]。PHF-tau(從PHF分離的tau蛋白)是高度不溶性的蛋白，在SDS凝膠(電泳)中顯示停滯不移動(dòng)，不能結(jié)合微管，因?yàn)樗划惓Ａ姿峄?與正常tau蛋白相比，有多個(gè)位點(diǎn)磷酸化)[Lee等，1991;Grundke-Iqbal等，1986a;Grundke-Iqbal等，1986b]。去磷酸化后，PHF-tau蛋白變成可溶性蛋白而如同正常tau蛋白那樣能結(jié)合和促進(jìn)微管裝配[Wang等，1995;Wang等，1996;Bramblett等，1993]。認(rèn)為是tau蛋白異常磷酸化引起了tau功能不全、微管不穩(wěn)定、軸突轉(zhuǎn)運(yùn)喪失、神經(jīng)變性和與AD相關(guān)的癡呆。4一種異常類型的tau蛋白是超磷酸化的tau蛋白。已知體內(nèi)糖原合酶的激酶3p(GSK3(3)可使tau蛋白的多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括阿爾茨海默病的特有Ser^殘基磷酸化[Li和Paudel，2006]。進(jìn)而，已知蛋白激酶Akt可使GSK3(3磷酸化，已知蛋白磷酸酶PP2A可減弱Akt的活性。PP2A是一種異質(zhì)三聚體全酶，存在多種形式，由結(jié)合于不同調(diào)節(jié)亞基的共同核心結(jié)構(gòu)組成[Mumby和Walter,1993]。此酶的核心是由催化(C)亞基和結(jié)構(gòu)(A)亞基組成的復(fù)合體。第三種亞基稱為B亞基，其包括能調(diào)節(jié)PP2A活性和特異性的幾種多肽[Mumby和Walter,1993;Kamibayashi等，1994]。PP2A的ABC同工型重要部分能與神經(jīng)元微管結(jié)合[Sontag等，1995]，意味著PP2A可能調(diào)節(jié)微管相關(guān)蛋白(MAP)如tau蛋白的磷酸化狀態(tài)。已證明含B調(diào)節(jié)亞基的PP2A，而非其它形式(即含B，和B"亞基)的PP2A能在體外結(jié)合tau蛋白使之強(qiáng)效去磷酸化。另外，抑制PP2A的ABC同工型可誘導(dǎo)tau蛋白超磷酸化、tau蛋白與微管分離、和喪失tau蛋白導(dǎo)致的微管穩(wěn)定性[Sontag等，1996]。近年來(lái)證明PP2A占人腦tau蛋白磷酸酶總活性的約7P/。[Liu等，2005]。AD病人腦中磷酸酶總活性和PP2A針對(duì)tau蛋白的活性顯著降低，而AD腦中的其它磷酸酶如PP2B的活性實(shí)際上升高[LIU等，2005]。人腦中PP2A活性與大多數(shù)磷酸化位點(diǎn)的tau蛋白磷酸化水平呈負(fù)相關(guān)。這表明PP2A是主要的tau蛋白磷酸酶，調(diào)節(jié)著人腦多處部位的tau蛋白磷酸化。這意味著AD腦中tau蛋白的異常超磷酸化部分是由于PP2A活性下調(diào)所致，因此其作用是能提高PP2A活性，特別是能提高PP2A的ABC同工型活性的制劑將具有臨床用途，可治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的發(fā)展。有證據(jù)證明，tau蛋白異常磷酸化的逐漸增多可能與存在異常的cx-共核蛋白(a-synuclein)的神經(jīng)變性疾病相關(guān)。在阿爾茨海默病、帕金森病、Guarn-帕金森-ALS-癡呆復(fù)合癥和由a-共核蛋白突變引起的帕金森病中tau蛋白和a-共核蛋白二者發(fā)生病變[Duda等，2002;Forman等，2002;Ishizawa等，2003]。a-共核蛋白看來(lái)在帕金森病(PD)的病理生理學(xué)中起著重要作用。雷維小體(Lewybody)是PD的病理學(xué)標(biāo)志，其主要由a-共核蛋白組成[Spillantini等，1997;Spillantini等，1998b]。認(rèn)為a-共核蛋白在PD的病理生理學(xué)中起著關(guān)鍵作用，因?yàn)樗诶拙S小體中積累，且因?yàn)檫z傳學(xué)研究鑒定到ot-共核蛋白中存在與家族性PD相關(guān)的突變[Kmger等，1998;Polymeropoulos等，1997;Singleton等，2003;Spillantini等，1998b;Za腿z等，2004]。a-共核蛋白中的A53T和A30P突變導(dǎo)致a-共核蛋白聚集傾向升高看來(lái)是PD的病因。這二種突變提高了a-共核蛋白自發(fā)性聚集或因?qū)ν庠匆蜃尤缃饘俸脱趸瘧?yīng)激的反應(yīng)而聚集的傾向[Conway等，2000;Hashimoto等，1999;Kruger等，1998;Ostreova-Golts等，2000;Paik等，1999、2000;Polymeropoulos等，1997〗。在轉(zhuǎn)基因小鼠和果蠅中，a-共核蛋白的A53T和A30P突變也可引起年齡依賴的a-共核蛋白聚集和神經(jīng)元損傷[Feany和Bender,2000;Giasson等，2002;Kahle等，2001;Masliah等，2000]。這些研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了a-共核蛋白與神經(jīng)變性相關(guān)。異常磷酸化的tau蛋白存在于散發(fā)PD病人的雷維小體中，出現(xiàn)在靠近含ot-共核蛋白病態(tài)微管裝配體區(qū)域的神經(jīng)元中[Ishizawa等，2003]。體外證據(jù)也將a-共核蛋白與tau蛋白相聯(lián)系，因?yàn)閍-共核蛋白在體外能結(jié)合tau蛋白和通過(guò)蛋白激酶A剌激tau蛋白磷酸化[Giasson等，2003;Jensen等，1999]。近年的研究結(jié)果表明a-共核蛋白體外能提高tau蛋白的纖維化，而異常的tau蛋白纖維存在于過(guò)度表達(dá)A53T突變型a-共核蛋白的有癥狀轉(zhuǎn)基因小鼠腦中[Giasson等，2003]。FrasierM等，2005證明，在過(guò)度表達(dá)A30Pa-共核蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠中，A30Pa-共核蛋白聚集發(fā)生在病理性tau蛋白旁邊，即產(chǎn)生的a-共核蛋白聚集與病理性tau蛋白平行分布，并證明有癥狀的A30Pa-共核蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)異常的tau蛋白磷酸化，這種磷酸化與c-jun激酶活化相關(guān)。除了a-共核蛋白(a-^")聚集外，氧化應(yīng)激和接觸某些神經(jīng)毒素如1_甲基_4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)與PD的病變相聯(lián)系。在小鼠和靈長(zhǎng)動(dòng)物中MPTP能誘導(dǎo)黑質(zhì)紋狀體多巴胺能(神經(jīng))通路的選擇性變性，如PD中所見，此與"-5>7表達(dá)水平和聚集升高相關(guān)，但不誘生真正的雷維小體[Dauer和Przedborski，2003]，而連續(xù)給予MPTP可引發(fā)對(duì)泛素和a-共核蛋白具有免疫反應(yīng)性的黑質(zhì)包涵體形成[Fomai等，2005]。某些雷維小體的另一種成分是異常磷酸化的tau蛋白[Ishizawa等，2003]。已報(bào)導(dǎo)在家族性阿爾茨海默病(AD)、唐氏綜合征和雷維小體病病人的腦中tau蛋白和作為聚集體或包涵體共同定位在神經(jīng)元中，或位于某些雷維小體或雷維小體樣包涵體內(nèi)部[Kotzbauer等，2001;Lippa等，1999;Arima等，1999;Iseki等，1999]。tau蛋白和a-^"之間的相似處包括在突觸前神經(jīng)元中的表達(dá)、體內(nèi)半壽期長(zhǎng)、它們的"天然不折疊"性質(zhì)使它們對(duì)熱穩(wěn)定，和它們通過(guò)疏水性殘基臂形成裝配纖維的核心的纖維化傾向[Friedhoff等，2000;Serpell等，2000]。S3E雙突變(模擬PHF-1磷酸化位點(diǎn)的偽磷酸化結(jié)構(gòu)，其中在最長(zhǎng)的人tau蛋白同工型-ht40中396位和404位的二個(gè)絲氨酸殘基被替換成谷氨酸殘基)的tau蛋白的其它體外資料也表明，Ser396/404的超磷酸化可引起tau蛋白C末端采取更為延伸的構(gòu)型，而改變其對(duì)tau蛋白寡聚化的抑制作用和提高纖維形成的速度[Abraha等，2000]。Duka等，2006現(xiàn)已證明，MPTP誘導(dǎo)的中腦多巴胺能神經(jīng)元a-S"表達(dá)水平升高促進(jìn)了tau蛋白PHF-1結(jié)合位點(diǎn)(Ser396/404)磷酸化模式的改變，導(dǎo)致這二種蛋白的失位(mislocation)，促進(jìn)其共同免疫沉淀，并提高了十二烷基肌氨酸鈉不溶性超磷酸化tau蛋白的水平，提示MPTP-誘導(dǎo)的帕金森病機(jī)理和神經(jīng)毒性的啟動(dòng)步驟是a-^w指導(dǎo)的tau蛋白Ser396/404超磷酸化。MPTP引起a-^"與微管分離增加和與細(xì)胞骨架結(jié)合分?jǐn)?shù)有關(guān)的磷酸化tau蛋白水平降低的發(fā)現(xiàn)，也可能是與神經(jīng)變性過(guò)程的機(jī)制相關(guān)。tau蛋白的超磷酸化大大降低了tau蛋白對(duì)微管的親和力，導(dǎo)致其失去穩(wěn)定[Drechsel等，1992;Biernat等，1993;Michaelis等，2002]。此外，也知道磷酸化的tau蛋白能結(jié)合其它微管結(jié)合蛋白如MAPI和MAP2并從微管上除去這些蛋白[Iqbal和Grundke-Iqba1,2005]。然而，由于已知a-5>"能結(jié)合微管[Wersinger和Sidhu，2005]并且在軸突信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)中可能起作用[Sidhu等，2004]，因此該蛋白與微管分離有可能進(jìn)一步加劇微管的不穩(wěn)定，破壞細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。因此，在導(dǎo)致與包涵體形成相關(guān)的神經(jīng)變性過(guò)程的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，a-S^7與微管分離和結(jié)合于微管的tau蛋白發(fā)生異?？赡馨硪环N聯(lián)系。MPTP-誘導(dǎo)的a-^"水平異常調(diào)節(jié)著磷酸化tau蛋白的形成，具體說(shuō)，tau蛋白的PHF-1形式使我們能夠了解PHF形成和重要神經(jīng)功能相關(guān)喪失的早期階段的情況，提示MPTP-誘導(dǎo)的帕金森綜合征或神經(jīng)毒性可能是tau蛋白疾病，伴隨使人聯(lián)想到共核蛋白病的"-^"改變。這提示，已知AD發(fā)病中的tau蛋白異常移動(dòng)也可能出現(xiàn)在帕金森病中，但發(fā)生在與AD不相關(guān)的腦部區(qū)域中，因此提示其在某些神經(jīng)變性疾病的發(fā)生中有相當(dāng)大的重疊。由此提出，看似無(wú)關(guān)的神經(jīng)變性疾病實(shí)際上可能有著共同的觸發(fā)機(jī)制和后續(xù)病理變化，啟動(dòng)了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性。因此需要能影響tau蛋白磷酸化的，臨床上可用于治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的制劑。發(fā)明概述本發(fā)明部分是基于以下發(fā)現(xiàn)，即蛋白磷酸化酶PP2A接觸硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽可提高其活性。提高PP2A活性可降低或抑制tau蛋白的磷酸化，特別是超磷酸化，包括二種分支方法i)去磷酸化滅活A(yù)kt，從而降低GSK3(3的磷酸化，然后降低tau蛋白的磷酸化，和ii)tau蛋白直接去磷酸化。降低tau蛋白磷酸化特別是超磷酸化水平可減少或防止神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中異常tau蛋白的積累或沉積，因而可用于治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病。因此，在一方面內(nèi)容中，本發(fā)明提供治療或預(yù)防對(duì)象神經(jīng)變性疾病的方法，包括給予所述對(duì)象有效量的硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽。在某些實(shí)施方式中，所述神經(jīng)變性疾病是tau蛋白疾病。在某些實(shí)施方式中，所述神經(jīng)變性疾病是a-共核蛋白疾病。在特定實(shí)施方式中，所述神經(jīng)變性疾病選自早老性癡呆、老年癡呆、阿爾茨海默病和帕金森病。在本發(fā)明另一方面內(nèi)容中，提供抑制或降低神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或雷維小體中tau蛋白磷酸化的方法，包括使神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞接觸有效量的硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽。在某些實(shí)施方式中，所述tau蛋白是微管相關(guān)tau蛋白。在某些實(shí)施方式中，所述tau蛋白位于神經(jīng)原纖維纏結(jié)中。在某些實(shí)施方式中，抑制或防止了tau蛋白的超磷酸化。在另一方面內(nèi)容中，本發(fā)明提供增強(qiáng)PP2A活性的方法，包括使PP2A接觸有效量的硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽。在某些實(shí)施方式中，所述PP2A是去磷酸化Akt的一種同工型。在某些實(shí)施方式中，所述PP2A是去磷酸化tau蛋白，特別是在神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和雷維小體中發(fā)現(xiàn)的微管相關(guān)tau蛋白的一種同工型。在另一方面內(nèi)容中，本發(fā)明提供抑制神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中GSK3(J活性的方法，該方法包括使神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞接觸有效量的硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽。在本發(fā)明還有一方面內(nèi)容中，提供硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽在制造治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病藥物中的應(yīng)用。在上述已廣泛描述的方法和應(yīng)用的某些實(shí)施方式中，硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽與適合治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的其它療法，或與適合減輕神經(jīng)變性疾病癥狀的療法聯(lián)用。發(fā)明詳述1.定義除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員共同理解的相同含義。雖然與本文所述相似或等同的任何方法和材料可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但本文描述的是優(yōu)選的方法和材料。對(duì)于本發(fā)明的目的，下面定義了以下術(shù)語(yǔ)。本文所用冠詞"一個(gè)"和"一種"指該冠詞語(yǔ)法對(duì)象有一個(gè)或一個(gè)以上(即至少一個(gè))。例如，"一種元件"指一個(gè)元件或一個(gè)以上元件。本文所用術(shù)語(yǔ)"約"指與參比品的數(shù)量、水平、數(shù)值、維度、大小或用量相比，差異可高達(dá)30%、20%或10%的數(shù)量、水平、數(shù)值、維度、大小或用量。9在全篇說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，除非另有要求，以下詞語(yǔ)"包含"和其變體"含有"和"包括"應(yīng)理解為意指包括所述的整體或步驟，或一組整體或步驟，但不排除任何其它整體或步驟，或其它一組整體或步驟。術(shù)語(yǔ)"去磷酸化"本文用于指用化學(xué)方法去除生化物質(zhì)如蛋白質(zhì)中的磷酸基團(tuán)(P042—)。在細(xì)胞環(huán)境中，可通過(guò)酶如磷酸酶的酶促作用實(shí)現(xiàn)去磷酸化。本文所用術(shù)語(yǔ)"膠質(zhì)細(xì)胞"指非神經(jīng)元細(xì)胞，它們能為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元提供結(jié)構(gòu)和代謝支持。膠質(zhì)細(xì)胞也稱為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或膠質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"超磷酸化"指某生化物質(zhì)如蛋白質(zhì)中所有可利用的磷酸化位點(diǎn)都被磷酸化。該生化物質(zhì)不會(huì)發(fā)生進(jìn)一步磷酸化。短語(yǔ)"抑制或減少超磷酸化"包括防止該生化物質(zhì)所有的位點(diǎn)被磷酸化，和減少其所有磷酸化位點(diǎn)被磷酸化的生化物質(zhì)的數(shù)量。本文所用的術(shù)語(yǔ)"聯(lián)用"指用至少二種制劑治療對(duì)象，使得它們對(duì)神經(jīng)變性疾病的作用在同一段時(shí)間內(nèi)至少發(fā)揮一部分?？稍谝环N組合物中同時(shí)給予至少二種制劑，或可用分開的組合物同時(shí)或依次給予各制劑。術(shù)語(yǔ)"雷維小體"指神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)生的蛋白異常聚集。雷維小體中的主要蛋白聚集體由CX-共核蛋白組成。術(shù)語(yǔ)"神經(jīng)變性疾病"本文用于指特征為神經(jīng)元喪失或變性的神經(jīng)疾病。神經(jīng)變性疾病包括神經(jīng)變性運(yùn)動(dòng)疾病和與記憶喪失和/或癡呆相關(guān)的神經(jīng)變性疾病。神經(jīng)變性疾病包括tau蛋白病和a-共核蛋白病。神經(jīng)變性疾病的例子包括但不限于早老性癡呆、老年癡呆、阿爾茨海默病、與染色體17連鎖的帕金森綜合征(FTDP-17)、進(jìn)行性核上麻痹(PSP)、皮克病、原發(fā)進(jìn)行性失語(yǔ)癥、額顳葉癡呆、皮質(zhì)基底(核)癡呆、帕金森病、伴癡呆的帕金森病、伴有雷維小體的癡呆、唐氏綜合征、多發(fā)性系統(tǒng)性萎縮、淀粉樣側(cè)索硬化癥(ALS)和哈-斯綜合征。術(shù)語(yǔ)"神經(jīng)原纖維纏結(jié)"本文用于指位于腦中的異常結(jié)構(gòu)，其由成對(duì)的螺旋纖維絲(神經(jīng)原纖維和微管)的致密陣列組成。神經(jīng)原纖維纏結(jié)中包含有tau蛋白，特別是微管相關(guān)tau蛋白。認(rèn)為腦中存在的神經(jīng)原纖維纏結(jié)數(shù)量與對(duì)象癡呆程度相關(guān)。神經(jīng)原纖維纏結(jié)是阿爾茨海默病的一種區(qū)別特征。本文所用術(shù)語(yǔ)"神經(jīng)元"指在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞，它們是專門接收、加工和傳輸信息的細(xì)胞。神經(jīng)元也可稱為神經(jīng)細(xì)胞。本文所用術(shù)語(yǔ)"營(yíng)養(yǎng)量"包括能提供每日平均攝入硒量的硒用量。在美國(guó)每日平均攝入量是80—120微克/天。與硒酸鹽相關(guān)的本文所用的"藥學(xué)上的鹽"指對(duì)于人類和動(dòng)物給藥毒理學(xué)安全的金屬離子鹽。例如，合適的藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于藥學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)酸如氫氯酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、磺酸和氫溴酸的鹽，或藥學(xué)可接受的有機(jī)酸如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、延胡索酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲垸磺酸、對(duì)甲苯磺酸、苯磺酸、水楊酸、苯磺胺酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙二胺四乙酸、硬脂酸、棕櫚酸、油酸、月桂酸、泛酸、鞣酸、抗壞血酸和正戊酸的鹽。堿鹽包括但不限于與藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鐵、鎳、鋅、銨和垸基銨形成的那些鹽?？捎弥T如低級(jí)垸基鹵如甲基、乙基、丙基、丁基氯、溴和碘；二烷基硫酸鹽如二甲基和二乙基酸鹽；和其它鹽制劑季銨化堿性含氮基團(tuán)。合適的硒酸的金屬離子鹽包括但不限于鈉、鉀、鋰、鎂、鈣、鐵、鎳、鋅、銨和烷基銨鹽。在某些實(shí)施方式中，所述鹽不是硒酸鋰。優(yōu)選的硒酸鹽是鈉鹽Na2Se04。術(shù)語(yǔ)"磷酸化"本文用于指在生化物質(zhì)如蛋白質(zhì)中化學(xué)加入磷酸基團(tuán)(P042—)。在細(xì)胞環(huán)境中，可通過(guò)酶如激酶的酶促作用實(shí)現(xiàn)磷酸化。短語(yǔ)"抑制或減少磷酸化"包括防止生化物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)磷酸化位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，包括防止所有的磷酸化位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，如超磷酸化。此短語(yǔ)也包括通過(guò)防止一個(gè)或多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的磷酸化降低生化物質(zhì)的磷酸化程度，或?qū)е略谠撋镔|(zhì)的一個(gè)或多個(gè)磷酸化位點(diǎn)發(fā)生去磷酸化。術(shù)語(yǔ)"對(duì)象"或"個(gè)體"或"病人"本文中可互換使用，指需要預(yù)防或治療的任何對(duì)象，特別是脊椎動(dòng)物對(duì)象，更具體說(shuō)是哺乳動(dòng)物對(duì)象。合適的屬于本發(fā)明范圍的脊椎動(dòng)物對(duì)象包括但不限于靈長(zhǎng)類、禽類、家畜11動(dòng)物(如豬、綿羊、牛、馬、驢)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如家兔、小鼠、大鼠、豚鼠、豬、倉(cāng)鼠)、陪伴動(dòng)物(如貓和狗)和捕獲的野生動(dòng)物(如狐貍、鹿、野狗)。優(yōu)選的對(duì)象是需要治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病，特別是阿爾茨海默病或癡呆的人。然而，應(yīng)理解以上術(shù)語(yǔ)不暗示存在癥狀。術(shù)語(yǔ)"超營(yíng)養(yǎng)量"本文用于指所用劑量高于認(rèn)為符合營(yíng)養(yǎng)要求的量。在美國(guó)，平均每日的硒攝入量為80-120微克/天。超營(yíng)養(yǎng)的硒用量向?qū)ο筇峁┝烁哂谕扑]的每日允許量。例如，超營(yíng)養(yǎng)硒量可以是每天3ug-20mg/kg、每天0.015mg-20mg/kg、0.1mg-20mg/kg、0.1mg-14mg/kg、0.1mg-13mg/kg、0.1mg-12mg/kg、0.1mg-10mg/kg、0.1mg-9mg/kg、0.1mg-8mg/kg、0.1mg-7mg/kg、0.1mg-6mg/kg、0.15mg-5mg/kg、0.15mg-4mg/kg、0.15mg-3mg/kg、0.15mg-2mg/kg、0.15mg-lmg/kg，具體是每天0.1mg-14mg/kg、0.07mg-6.5mg/kg或0.15mg-54mg/kg，更具體說(shuō)是每天0.07mg-2mg/kg。本文所用的術(shù)語(yǔ)"a-共核蛋白病"指涉及腦神經(jīng)細(xì)胞中和a-共核蛋白聚集或異常(x-共核蛋白的神經(jīng)變性疾病或病癥。oc-共核蛋白病包括但不限于帕金森病、伴癡呆的帕金森病、伴有雷維小體的癡呆、唐氏綜合征、多發(fā)性系統(tǒng)性萎縮、淀粉樣側(cè)索硬化癥(ALS)和哈-斯綜合征。在治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病，或抑制或降低tau蛋白磷酸化，或抑制GSK3P活性的本文描述中所用術(shù)語(yǔ)"有效量"指以單劑量或一系列劑量的一部分給予或加入的硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽的用量，該用量能有效提高PP2A的活性，具體是能有效預(yù)防神經(jīng)變性疾病相關(guān)的癥狀、維持對(duì)癥狀的控制和/或治療現(xiàn)有癥狀。此有效量取決于所治療個(gè)體的健康和身體狀況，所治療個(gè)體的分類類別、組合物配方、醫(yī)療狀況的評(píng)估和其它相關(guān)因素。預(yù)計(jì)所述劑量范圍較廣，可通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)確定。在具體實(shí)施方式中，有效量是營(yíng)養(yǎng)量或超營(yíng)養(yǎng)量。術(shù)語(yǔ)"tau蛋白病"本文用于指涉及腦神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中異常tau蛋白沉積的神經(jīng)變性疾病或病癥。tau蛋白病包括的疾病和病癥中，tau蛋白異常磷酸化，包括tau蛋白超磷酸化。tau蛋白病包括但不限于早老性癡呆、老年癡呆、阿爾茨海默病、與染色體17連鎖的帕金森綜合征(FTDP-17)、進(jìn)行性核上麻痹(PSP)、皮克病、原發(fā)進(jìn)行性失語(yǔ)癥、額顳葉癡呆、皮質(zhì)基底(核)癡呆。么游或微機(jī)體疾微方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的預(yù)測(cè)部分基于確定硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽能有效提高PP2A的活性，進(jìn)而可通過(guò)GSK3P導(dǎo)致減少tau蛋白的磷酸化和/或提高tau蛋白去磷酸化的速率。本發(fā)明的方法通常包括使神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞中的PP2A接觸能增強(qiáng)PP2A活性用量的硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽。在某些實(shí)施方式中，硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽的用量，具體是硒酸鹽或其鹽的用量每日為約O.Ol5mg-20mg/kg，常為約0.1mg-14mg/kg、0.07mg-6.5mg/kg或0.15mg-5mg/kg，例如每日0.07mg-2mg/kg。本發(fā)明可有效用于治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病。神經(jīng)變性疾病包括神經(jīng)變性運(yùn)動(dòng)疾病和與記憶喪失相關(guān)的神經(jīng)變性疾病，包括tau蛋白病和a-共核蛋白病。神經(jīng)變性疾病的示范性例子包括早老性癡呆、老年癡呆、阿爾茨海默病、與染色體17連鎖的帕金森綜合征(FTDP-17)、進(jìn)行性核上麻痹(PSP)、皮克病、原發(fā)進(jìn)行性失語(yǔ)癥、額顳葉癡呆、皮質(zhì)基底(核)癡呆、帕金森病、伴癡呆的帕金森病、伴有雷維小體的癡呆、唐氏綜合征、多發(fā)性系統(tǒng)性萎縮、淀粉樣側(cè)索硬化癥(ALS)和哈-斯綜合征。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明適合治療或預(yù)防tau蛋白病，特別是阿爾茨海默病和癡呆。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明適合治療或預(yù)防a-共核蛋白病，特別是帕金森病。硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽的適合有效用量是營(yíng)養(yǎng)性或超營(yíng)養(yǎng)性硒酸量。在某些實(shí)施方式中，硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽的用量是0.015mg-20mg/kg，通常為每日約0.1mg-14mg/kg或0.07mg-6.5mg/kg或0.15mg-5mg/kg，例如每日0.07mg-2mg/kg。在優(yōu)選實(shí)施方式中，硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽是硒酸鈉(Na2Se04)。在某些實(shí)施方式中，給予硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽時(shí)聯(lián)用另一種能治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的藥物?？膳c硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽聯(lián)用的治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病藥物的示范性例子包括但不限于膽堿脂酶抑制劑如他克林(Cognex⑧)、杜尼匹次、加蘭他敏和雷司替明；N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑如美金剛胺；雌激素制劑如倍美力；非類固醇消炎藥物(NSAID)如阿斯匹林和布洛芬；左旋多巴(L-多巴)，多巴脫羧酶抑制劑如卡比多巴和芐絲肼，或左旋多巴和多巴脫羧酶抑制劑如信尼麥⑧和Stalevo⑧聯(lián)用；多巴胺激動(dòng)劑如溴隱亭(Parlode1⑧)、硫丙麥角林(Permax㊣)、派拉米蘇(Mirapex⑧)、羅比尼洛(Requip⑧)、卡麥角林、阿撲嗎啡(APOKYNTM)和稠環(huán)乙脲；單胺氧化酶B抑制劑如司來(lái)吉蘭(EldepryKS)和Carbex⑧)和拉撒斯林(rasasiline)(Azilect⑧)；抗膽堿能藥物如苯并托品甲磺酸溴隱亭(Cogentin⑧)和鹽酸苯海索(Artane⑧)；以及COMT抑制劑如恩他卡朋(Commtan)和托卡朋(Tasmar);或其它藥物如酒石酸雷司替明(Exelon)和金剛胺(Symmetrel⑧)；或左旋多巴、多巴脫羧酶抑制劑、多巴胺激動(dòng)劑、單胺氧化酶B抑制齊l」、抗膽堿能藥物和COMT抑制劑的二種或多種混合物。聯(lián)合治療可包括有效量的硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽，和通常在缺乏硒酸鹽時(shí)所用的一定量的治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的(其它)藥物。例如鹽酸他克林可作為聯(lián)用藥物的一部分與硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽一起給予神經(jīng)變性疾病如AD病人，用量為40mg-160mg/天，或可給予用量5-10mg/天的杜尼匹次。可給予癡呆病人劑量達(dá)到1.25mg/天偶聯(lián)馬雌激素(CEE)的倍美力?；蛘?，由于與硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽共同給藥，可減少治療神經(jīng)變性疾病所用的藥物劑量。在某些實(shí)施方式中，這種聯(lián)用可顯示協(xié)同效應(yīng)。本發(fā)明的某些實(shí)施方式涉及治療或預(yù)防對(duì)象神經(jīng)變性疾病的方法，該方法通常包括給予所述對(duì)象有效量的硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽。為實(shí)施這些方法，治療該對(duì)象的人員可根據(jù)該對(duì)象的具體情況和環(huán)境確定硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽的有效劑量。硒酸鹽的有效劑量是能有效治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病，包括預(yù)防癥狀，維持對(duì)癥狀的控制或治療癥狀的用量。在某些實(shí)施方式中，此有效量是營(yíng)養(yǎng)量。在其它實(shí)施方式中，此有效量是超營(yíng)養(yǎng)量。在具體實(shí)施方式中，所述硒酸或其藥學(xué)上可接受的鹽是硒酸鈉。以下敘述用于本發(fā)明方法的給藥方式，硒酸鹽的給藥量和硒酸鹽制劑。對(duì)于所要治療的神經(jīng)變性疾病，可通過(guò)測(cè)定能表明此類疾病進(jìn)程的一種或多種診斷參數(shù)并與合適的對(duì)照相比而確定。以對(duì)象是人為例，"合適的對(duì)照"可以是治療前的該個(gè)體，或可以是用安慰劑治療的人(年齡相配或類似的對(duì)照)。按照本發(fā)明，神經(jīng)變性疾病的治療包括但不限于(i)預(yù)防有患神經(jīng)變性疾病傾向但尚未診斷此病的對(duì)象發(fā)生此病，因此這種治療是對(duì)神經(jīng)變性疾病的預(yù)防性治療；(ii)抑制神經(jīng)變性疾病，即制止神經(jīng)變性疾病的發(fā)展；或(iii)緩解神經(jīng)變性疾病產(chǎn)生的癥狀。本發(fā)明的方法適合治療已診斷為神經(jīng)變性疾病，懷疑患有神經(jīng)變性疾病，或已知被懷疑和認(rèn)為可能發(fā)生神經(jīng)變性疾病的個(gè)體。在上述方法的某些實(shí)施方式中，所述神經(jīng)變性疾病是tau蛋白病，特別是帕金森病，所述治療任選還包括給予適合治療上述a-共核蛋白病的其它藥物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述硒酸鹽是硒酸鈉。可用本發(fā)明方法治療的對(duì)象例子是脊椎動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方式中，所述對(duì)象選自人、綿羊、牛、馬、母牛、豬、狗和貓。優(yōu)選的對(duì)象是人?？刹捎盟幬镞f送領(lǐng)域已知的以下任何技術(shù)配制硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽。當(dāng)然要記住，可以許多方式給予硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽，但并非所有的制劑都適合每種給藥途徑。可給予固體或液體形式的硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽。其應(yīng)用可經(jīng)口服、直腸、鼻、局部(包括口頰、舌下)或吸入途徑。硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽可與常規(guī)的藥學(xué)上可接受的輔佐劑、載體和/或稀釋劑一起給藥。給藥可用的固體劑型包括片劑、膠囊、粉劑、藥丸、糊劑、栓劑和顆粒形式。它們也可包含載體或添加劑，如調(diào)味劑、染料、稀釋劑、軟化劑、粘合劑、防腐劑、持久劑和/或包裹材料。給藥的液體劑型包括溶液、混懸液和乳液。這些也可與上述添加劑一起給予。具有合適粘度易于使用的硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽的溶液和混懸液可用于注射。如需要，對(duì)注射而言太過(guò)粘稠的混懸液可用設(shè)計(jì)的裝置將其植入(體內(nèi))?？赏ㄟ^(guò)腸胃道外途徑或腸溶裝置給予持續(xù)釋放劑型。腸胃道外給藥是用于實(shí)施本發(fā)明給予硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽的另一種途徑。"腸胃道外"包括適合注射和經(jīng)鼻、陰道、直腸和口頰給藥的制劑。硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽給藥可包括口服延長(zhǎng)給藥劑型?？诜苿﹥?yōu)選以緩釋膠囊或片劑劑型，或者以水溶液形式每日給藥l一3次?？擅咳?、連續(xù)、一周一次或一周三次經(jīng)靜脈內(nèi)給予硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽。硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽的給藥可包括每日給藥，優(yōu)選采用緩釋膠囊或片劑劑型每日給予一次，或每日給予一次水溶液。硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽與適合治療神經(jīng)變性疾病的至少一種藥物聯(lián)用時(shí)，可采用單一制劑或組合物，或采用分開的制劑或組合物的固體或液體劑型給藥。在某些實(shí)施方式中，硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽和治療神經(jīng)變性疾病的這種藥物，可作為單一片劑或膠囊，或作為分開的片劑或膠囊口服給藥。在其它實(shí)施方式中，硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽和治療神經(jīng)變性疾病的這種藥物，可作為單一組合物或分開的組合物靜脈內(nèi)給藥。本發(fā)明也提供含營(yíng)養(yǎng)量或超營(yíng)養(yǎng)量硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽的治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的藥物組合物。在某些實(shí)施方式中，所述組合物含有0.5mg-1.0g，例如5-450mg的硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的載體。在某些實(shí)施方式中，硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽的用量是約5.0-700mg或5-450mg。在說(shuō)明性例子中，硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽的用量是1.6mg-450mg、5-450mg、7.5-250mg，具體是50-200mg，例如50-100mg或100-150mg，每日一次或分幾次給藥。在某些實(shí)施方式中，所述藥物組合物可用于治療或預(yù)防tau蛋白病，特別是阿爾茨海默病或癡呆。在其它實(shí)施方式中，所述藥物組合物可用于治療或預(yù)防a-共核蛋白病，特別是帕金森病。含有硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物也可包含其它治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的藥物。例如，所述組合物可含硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽，和膽堿脂酶抑制劑如他克林、杜尼匹次、加蘭他敏或雷司替明；N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑如美金剛胺；雌激素制劑如倍美力；或非類固醇消炎藥物(NSAID)如阿斯匹林或布洛芬；左旋多巴，多巴脫羧酶抑制劑；左旋多巴和多巴脫羧酶抑制劑聯(lián)用；和/或COMT抑制劑；多巴胺激動(dòng)劑；單胺氧化酶B抑制劑；抗膽堿能藥物；COMT抑制劑或其它藥物16如酒石酸雷司替明或金剛胺。本發(fā)明的藥物組合物可包含作為整個(gè)分子而無(wú)免疫原性、與硒酸鹽生物相容的、能生物吸收、可生物降解而消除的任何其它成分。所述制劑可以即用劑型提供，或以給藥前需加入運(yùn)載體的滅菌粉末或液體劑型提供。如需無(wú)菌，可在無(wú)菌條件下制備該制劑，可滅菌混合物的各成分，或可除菌過(guò)濾該制劑后再使用。這種溶液還可含適當(dāng)?shù)乃幬镙d體，例如但不限于緩沖劑、鹽、賦形劑、防腐劑等。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明方法采用緩釋的口服劑型給予硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽。這些制劑通常所含的硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽溶解性較低以延緩其被吸收入血流中。此外，這些制劑可包含也能延緩硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽吸收的其它成分、藥物、載體等?？赡芑蚩赡懿粫?huì)發(fā)生生物腐蝕的微膠囊、聚合物包裹系統(tǒng)和滲透泵也可用于延緩或控制硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽從膠囊或基質(zhì)中釋放。硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽可單用，或作為另一種藥物的組成部分使用。因此，本發(fā)明也考慮含有用于治療神經(jīng)變性疾病的硒酸鹽或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物。為了更清楚了解本發(fā)明的性質(zhì)和付諸實(shí)施，現(xiàn)參考以下非限制性實(shí)施例描述本發(fā)明的特別優(yōu)選實(shí)施方式。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1A是治療后，PC3細(xì)胞的完整細(xì)胞中和無(wú)細(xì)胞環(huán)境中磷酸化Akt水平的比較報(bào)告。圖1B是采用卡爾生物化學(xué)公司(Calbioehem)K-LISATMAkt活性檢測(cè)試劑盒，比較硒酸鈉與星孢素(一種非特異性的蛋白激酶強(qiáng)抑制劑)對(duì)重組人Aktl酶活性影響的示意圖。圖2A是存在硒酸鈉或?qū)锼?一種紅潮藻類的聚醚毒素，能抑制磷酸蛋白的磷酸酶PP1和PP2A)時(shí)，Akt在Se/"位點(diǎn)磷酸化的比較圖。圖2B是存在硒酸鈉，或一些磷酸蛋白的磷酸酶抑制劑、互變霉素、岡田酸、內(nèi)皮肽A(endothallA)、花萼海綿誘癌素A(calyculinA)和環(huán)孢菌素A時(shí)，Akt在Ser473位點(diǎn)磷酸化的比較圖。圖2C提供PC3細(xì)胞中的Akt的免疫沉淀圖，顯示在缺乏(對(duì)照)和存在硒酸鹽(ATE)或胎牛血清(FCS)時(shí)，與PP2A形成復(fù)合物的Akt量。圖2D是在存在或缺乏硒酸鈉時(shí)，PC3細(xì)胞中磷酸酶PP2A活性的示意圖。圖3是PP2A磷酸酶活性翻譯后調(diào)節(jié)及底物特異性的示意圖(LCMT-亮氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶，PME-l-磷酸酶甲基酯酶l，PTPA-磷酸酪氨酰(phospholyrosyl)磷酸酶激活劑)。圖4A(i)是在缺乏(對(duì)照)或存在硒酸鈉或?qū)锼?OKA)時(shí)，PP2A磷酸酶相對(duì)活性的示意圖。.圖4A(ii)示意圖顯示，硒酸鈉對(duì)PP2A磷酸酶作用下絲氨酸磷酸肽釋放無(wú)機(jī)磷酸濃度的影響。一圖4B是顯示硒酸鈉對(duì)PP1的磷酸酶活性影響的示意圖。圖5A是在氧化環(huán)境中PP2A失活的示意圖。圖5B顯示硒酸鈉和過(guò)氧化氫對(duì)Akt磷酸化水平的影響。圖5C是在存在N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)、過(guò)氧化氫、硒酸鈉、硒酸鈉和過(guò)氧化氫時(shí)，PP2A磷酸酶中的游離巰基示意圖。圖5D是有或沒有過(guò)氧化氫時(shí)，用硒酸鈉或N-乙酰半胱氨酸(NAC)處理的細(xì)胞的熒光分布圖。圖5E示意圖顯示，用過(guò)氧化氫、硒酸鈉、過(guò)氧化氫和硒酸鈉、NAC、過(guò)氧化氫和NAC處理時(shí)，熒光細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)。圖6A示意圖顯示，用硒酸鈉(ATE500^M)或內(nèi)皮肽A(ETA100pM)或不用添加劑(對(duì)照)時(shí)，免疫沉淀的PP2A的相對(duì)磷酸酶活性。圖6B是以岡田酸(OKA500nM)預(yù)處理或不預(yù)處理時(shí)，用LY294003(LY50(iM)或硒酸鈉(ATE500pM)處理后，磷酸化p70S6K水平的比較圖。圖6C是用能識(shí)別Akt的抗體檢測(cè)PP2A的不同B家族亞基(B和B，)的比較報(bào)告。Akt只與PP2A的B家族亞基共沉淀。圖7顯示硒酸鈉對(duì)GSK3(5活化的影響。圖8是顯示硒甲硫氨酸不影響Akt磷酸化水平，而硒酸鹽抑制Akt磷酸化的比較圖。18圖9是顯示不同的硒化合物對(duì)Akt活化影響的示意圖。處理對(duì)照(con);硒酸鈉(ATE);硒酸(Sdacid);亞硒酸鈉(ITE);二氧化硒(Se02);硫化硒(SeS2);甲基硒代半胱氨酸(MSC);和硒代半胱氨酸(SeC)?；钚訟kt信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度與Akt蛋白總水平相關(guān)，顯示在y-軸上。此圖表明只有硒酸鈉(ATE)才能抑制Akt的活化，使磷酸化Akt的水平降低到對(duì)照(con)水平之下。相反，硒酸(Selacid)、亞硒酸鈉(ITE)、二氧化硒(Se02)、硫化硒(SeS2)、甲基硒代半胱氨酸(MSC)、硒代半胱氨酸(SeC)均導(dǎo)致Akt活化高于對(duì)照(con)水平。圖10A和10B示意圖顯示，在用pNPP(圖IOA)或絲氨酸磷酸肽(圖10B)作為底物的pNPP水解試驗(yàn)中，硒酸鈉(ATE)、亞硒酸鈉(ITE)和硒甲硫氨酸(SeMet)對(duì)PP2A磷酸酶活性的影響。圖11是在不同包被條件下存在(+)或缺乏(-)硒酸鈉時(shí)，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤BE2M17細(xì)胞系用抗人PHF-tau蛋白抗體作免疫印跡的比較圖。圖12是在不同包被條件下存在(+)或缺乏(-)硒酸鈉時(shí)，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SY5Y細(xì)胞系用抗人PHF-tau蛋白抗體AT270(圖12A)和HT-7(圖12B)作免疫印跡的比較圖。圖13是在存在(+)或缺乏(-)硒酸鈉時(shí)，14周齡Balb/cNuNu雄性裸小鼠的全腦裂解物用抗人PHF-tau蛋白抗體AT100(圖13A)、AT180(圖13B)、AT270(圖13C)和HT-7(圖13D)作免疫印跡的比較圖。圖14示意圖顯示，在場(chǎng)地自主活動(dòng)試驗(yàn)(趨觸性(thigmotaxis))輪次l(圖"A)和輪次2(圖14B)中，硒酸鈉處理對(duì)所測(cè)試行為的影響。圖15示意圖顯示，在以逃離潛伏期(時(shí)間秒，圖15A)和游泳路徑(長(zhǎng)度米，圖15B)進(jìn)行評(píng)估的Morris水迷宮試驗(yàn)中，硒酸鈉治療對(duì)(小鼠)學(xué)習(xí)和記憶力的影響。圖16示意圖顯示，在hTAU441轉(zhuǎn)基因TMHT小鼠中，用HT7免疫組化方法測(cè)定，硒酸鈉對(duì)腦海馬回(圖16A)和腦扁桃體(amygdala)(圖16B)中tau蛋白載量的影響。圖17示意圖顯示，在hTAU441轉(zhuǎn)基因TMHT小鼠中，用AT180免疫組化方法測(cè)定，硒酸鈉對(duì)腦海馬回(圖17A)和腦扁桃體(圖17B)中tau蛋白載量的影響。實(shí)施例敬虔辨遞過(guò)席麥教劍使爿"去錄麼眾硒酸鈉能一致地誘導(dǎo)前列腺癌完整細(xì)胞中的Akt去磷酸化。這種去磷酸化可能是由于對(duì)Akt蛋白本身的直接抑制作用。或者可能是通過(guò)增強(qiáng)對(duì)Akt磷酸化的負(fù)調(diào)節(jié)或抑制其正調(diào)節(jié)而間接實(shí)現(xiàn)。為鑒別直接與間接作用機(jī)制，在無(wú)細(xì)胞環(huán)境中測(cè)定了硒酸鈉對(duì)Akt磷酸化和活性的影響。將PC3前列腺癌細(xì)胞接種在100mm平皿中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70-80%鋪滿時(shí)血清饑餓過(guò)夜。為檢測(cè)對(duì)完整細(xì)胞中Akt磷酸化的作用，用新鮮無(wú)血清培養(yǎng)液配的500pM硒酸鈉處理PC3細(xì)胞1小時(shí)。裂解細(xì)胞，用活化特異性抗體作免疫印跡分析測(cè)定AktSer473位點(diǎn)的磷酸化水平，與表達(dá)的Akt蛋白水平作比較。為檢測(cè)對(duì)純化Akt的作用，類似地接種但不處理PC3細(xì)胞，用RIPA(磷酸酶負(fù)調(diào)節(jié)劑，一種嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募?xì)胞裂解緩沖液，能最大程度降低對(duì)蛋白-蛋白復(fù)合物的維持)裂解。用泛Akt單克隆抗體作免疫沉淀純化得到等量(40-500ng)全細(xì)胞裂解液(WCL)中的Akt，然后在37。C金屬加熱塊上與50(HiM硒酸鈉一起培育1小時(shí)。如上所述用免疫印跡分析分辨免疫沉淀蛋白和測(cè)定Akt活化水平。圖1A比較了PC3細(xì)胞的完整細(xì)胞與無(wú)細(xì)胞環(huán)境經(jīng)處理后的磷酸化Akt水平。完整PC3細(xì)胞用500pM硒酸鈉處理1小時(shí)后Akt磷酸化大為降低。為驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，用卡爾生物化學(xué)公司的K-LISAtmAkt活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了曬酸鈉對(duì)重組人Akt酶活性的作用，將其與星孢素(一種非特異性的蛋白激酶抑制劑)的作用相比較。此ELISA試驗(yàn)采用的生物素化肽底物(GRPRTSSFAEG)在第二個(gè)絲氨酸處被Akt磷酸化。在鏈霉親和素包被孔中將250ng的重組人Akt加或不加500pM硒酸鈉或lpM星孢素，與生物素化Akt底物一起3(TC培育30分鐘。用磷酸絲氨酸的檢測(cè)抗體，然后用HRP-抗體偶聯(lián)物和TMB底物產(chǎn)生的顏色，來(lái)測(cè)定結(jié)合的磷酸化底物。測(cè)定450nm吸光值和590nm參比值?？偨Y(jié)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，計(jì)算出平均吸光值(A45o-A59o-空白)士SEM，見圖1B所示。與以上發(fā)現(xiàn)相一致，沒有檢測(cè)到硒酸鈉對(duì)重組人Akt激酶活性的直接作用。相反，非特異性抑制劑星孢素強(qiáng)烈抑制了Akt的激酶活性。小結(jié)這些數(shù)據(jù)表明，硒酸鈉對(duì)Akt活性無(wú)直接抑制作用，說(shuō)明觀察到的去磷酸化必然是通過(guò)一種間接機(jī)制完成。實(shí)蘑伊"，薪麼欽邀過(guò)腐激尸尸Z4游艨廢朦舒絲新去錄麼眾^,通過(guò)防止最初的Akt磷酸化，或提高Akt去磷酸化，可間接降低Akt的凈活性[Kohn等，1996]。然而，鑒于硒酸鈉誘導(dǎo)的Akt磷酸化為雙向反應(yīng)(起初是瞬間增強(qiáng)，隨后是深度和持續(xù)減弱)，似乎硒酸鈉的作用不可能是簡(jiǎn)單地減弱上游激酶磷酸化Akt的能力。因此測(cè)定了硒酸鈉的蛋白磷酸酶抑制作用能否誘導(dǎo)Akt去磷酸化。先用岡田酸，一種紅潮藻類的聚醚毒素(是導(dǎo)致有殼水生生物造成毒性腹瀉的致病因子)，其能抑制磷酸化蛋白的磷酸酶PP1和PP2A(二種調(diào)節(jié)Akt去磷酸化的磷酸酶)[Fernandez等.，2002]。在6孔板的每孔中接種5xl(^個(gè)PC3前列腺癌細(xì)胞，使細(xì)胞貼壁8小時(shí)，然后血清饑餓過(guò)夜。在無(wú)血清的新鮮培養(yǎng)液中用或不用5nM或1000nM的岡田酸預(yù)處理細(xì)胞30分鐘，然后加入最終濃度500pM的硒酸鈉培養(yǎng)1小時(shí)。用SDS-PAGE分辨裂解的細(xì)胞，然后用能特異性識(shí)別AktSer^殘基位點(diǎn)磷酸化的抗體作免疫印跡分析，檢測(cè)Akt該位點(diǎn)的磷酸化，與表達(dá)的Akt蛋白總水平作比較(圖2A)。用硒酸鈉處理PTEN缺陷的PC3細(xì)胞，如預(yù)期那樣顯著降低了該細(xì)胞系中觀察到的長(zhǎng)期Akt磷酸化高水平，這種降低不受先前與5nM岡田酸培育的影響。相反，用1000nM岡田酸預(yù)處理不僅增強(qiáng)了非硒酸鹽對(duì)照中的Akt磷酸化，而且完全抵消了硒酸鈉的抑制作用。為進(jìn)一步精細(xì)辨別參與的磷酸酶，篩檢了范圍廣泛的一組磷酸化蛋白的磷酸酶(PPP)抑制劑(它們對(duì)PPP抑制的特異性不相同)能否抵消硒酸鈉對(duì)Akt磷酸化的抑制作用。這組(抑制劑)包括500^iM互變霉素(PPl)、500pM岡田酸(低劑量PP2A〉PP1)、lOOinM內(nèi)皮肽A(PP2AA)、2nM花萼海綿誘癌素A(低劑量PP1〉PP2A)、10nM花萼海綿誘癌素A(高劑量抑制PP1和PP2A)和400ng/ml環(huán)孢菌素A(PP2B)?；旧习慈缟纤?，接種PC3前列腺癌細(xì)胞，類似地用500pM硒酸鈉處理1小時(shí)，之前用或不用PPP抑制劑預(yù)處理30分鐘。另外，用SDS-PAGE分辨細(xì)胞裂解液，用能特異性識(shí)別AktSer^殘基位點(diǎn)磷酸化的抗體作免疫印跡分析，檢測(cè)細(xì)胞膜上Akt該位點(diǎn)的磷酸化，與表達(dá)的Akt蛋白總水平作比較，見圖2B所示。沒用PP1或PP2B特異性PPP抑制劑預(yù)處理，或處理的細(xì)胞，接觸硒酸鈉后導(dǎo)致Akt磷酸化的顯著降低。相反，用低劑量岡田酸或內(nèi)皮肽A(PP2A的特異性或相對(duì)特異性抑制劑)處理細(xì)胞完全阻斷了硒酸鈉誘導(dǎo)的Akt去磷酸化。硒酸鈉可能通過(guò)提高PP2A與Akt之間復(fù)合物的形成速率，或提高已結(jié)合于PP2A的磷酸酶固有活性，或二者而增強(qiáng)PP2A介導(dǎo)的Akt去磷酸化。為有助于鑒別這二種機(jī)制，先測(cè)定了硒酸鈉上否能提高PP2A與Akt之間形成復(fù)合物的水平。將lx106PC3前列腺癌細(xì)胞接種在6cm平皿上，讓其貼壁8小時(shí)然后血清饑餓過(guò)夜。用新鮮無(wú)血清培養(yǎng)液或10%FCS配的500pM硒酸鈉處理細(xì)胞1.5小時(shí)，然后用ELB緩沖液裂解。用捕獲在蛋白A-瓊脂糖珠上的抗Akt單克隆抗體免疫沉淀每份400pg全細(xì)胞裂解液中的總Akt。陰性對(duì)照裂解液(空白)省略免疫沉淀抗體。洗滌減少非特異性結(jié)合后，在3xSDS蛋白加樣緩沖液中煮沸珠5分鐘，高速離心后用SDS-PAGE分辨上清液。用能特異性識(shí)別此磷酸酶催化亞基的抗體作免疫印跡分析，測(cè)定PP2A結(jié)合水平，與珠結(jié)合的Akt量和沉淀抗體(IgG)的濃度作比較。如圖2C所示，免疫沉淀去除未處理PC3細(xì)胞中的Akt，將可檢測(cè)到的PP2A催化亞基量提高到高于非特異性結(jié)合于珠(空白)的量，表明即使在基礎(chǔ)狀態(tài)下也有高水平的Akt磷酸化，至少某些Akt已與PP2A形成了復(fù)合物。用硒酸鈉處理促進(jìn)了PP2A催化亞基與Akt的結(jié)合，而用血清刺激使復(fù)合物的形成降低到基礎(chǔ)水平之下。為了定量測(cè)定復(fù)合物形成的這種增加，數(shù)字化三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的免疫印跡數(shù)據(jù)，進(jìn)行光密度分析，按每次實(shí)驗(yàn)的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化。檢測(cè)值為(檢測(cè)的)PP2A催化亞基量與免疫沉淀得到的Akt總蛋白量的平均比率土SEM。見圖2C所示，觀察到硒酸鈉處理后，PP2A催化亞基與Akt的結(jié)合提高了大約50%。為了確定硒酸鈉對(duì)Akt去磷酸化的作用是否完全可用簡(jiǎn)單促進(jìn)這二種蛋白之間的結(jié)合來(lái)解釋，檢測(cè)了硒酸鈉對(duì)Akt-相關(guān)磷酸酶活性的作用。將2xl(^個(gè)PC3前列腺癌細(xì)胞接種在10cm平板上，讓其貼壁8小時(shí)然后血清饑餓過(guò)夜。用或不用新鮮無(wú)血清培養(yǎng)液配的50(HlM硒酸鈉處理細(xì)胞1小時(shí)，再用低濃度磷酸緩沖液裂解。用抗Akt單克隆抗體(1:100)和30pl蛋白A漿液免疫沉淀得到的總蛋白500-600ng，為了檢測(cè)洗滌后有無(wú)磷酸污染，將25^最終洗滌緩沖液與孔雀綠一起培育。3(TC與500)iM合成的磷酸化蘇氨酸培育10分鐘，檢測(cè)免疫沉淀物的磷酸酶活性。每個(gè)樣品一式二份加入孔雀綠溶液，讀取590nm吸光值檢測(cè)游離磷酸鹽。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均磷酸酶活性土SEM見圖2D。用硒酸鈉處理的PC3細(xì)胞使得與免疫沉淀Akt蛋白相關(guān)的磷酸酶活性高二倍以上，顯著高于先前觀察到的PP2A結(jié)合的簡(jiǎn)單增加。小結(jié)這些數(shù)據(jù)表明，硒酸鈉是間接通過(guò)磷酸化蛋白的磷酸酶，特別是PP2A誘導(dǎo)了Akt去磷酸化。雖然硒酸鈉提高了PP2A與Akt的結(jié)合量，但相關(guān)的磷酸酶活性卻提高了約二倍，表明硒酸鈉主要是影響酶活性。實(shí)雄i'繊斜直接潛蔬尸尸24拔ur鋪微艇絲PP2A的核心結(jié)構(gòu)由36kD的催化亞基(PP2Ac)和65kD的調(diào)控亞基(PR65或A亞基)組成。與第三個(gè)調(diào)節(jié)性B亞基結(jié)合可調(diào)節(jié)底物特異性[Wera禾口Hemmings，1995]。PP2A磷酸酶的活性受翻譯后修飾的調(diào)節(jié)，其示意圖見圖3。已證明體外PP2A可被受體和非受體酪氨酸激酶二者，如EGFR、胰島素受體p60v-src和p561ck磷酸化[Chen等，1992]。體內(nèi)也鑒定到此種磷酸化，在用血清或EGF刺激或用p60v-src轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞中此種磷酸化增加，而血清饑餓使其減少[Chen等，1992]。毗鄰的Thr304磷酸化也與磷酸酶活性顯著喪失相關(guān)[Guo和Damuni，1993]。與Tyr307相反，看來(lái)Thr304是通過(guò)自身磷酸化激活的蛋白激酶作用而磷酸化，從而放大了最初的抑制信號(hào)。二種情況中，PP2A的作用是其自身的磷酸酶，因?yàn)橛脤锼峄蛭⒛以逅?LR抑制提高了磷酸化[Chen等，1994，Guo和Damuni，1993]。因此，去除抑制性刺激后PP2A可水解二者的磷酸基團(tuán)而快速再生活性磷酸酶。PP2Ac也受羧基末端賴氨酸殘基L309的可逆性甲基化調(diào)節(jié)。亮氨酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶可催化此甲基化反應(yīng)[Xie和Clarke，1994]，這看來(lái)是亞基正確結(jié)合形成活性三聚體所需[Wu等，2000，Tulstylch等，2000，Bryant等，1999]。磷酸酶甲基脂酶l(PME-l)可去除PP2A的甲基[Lee等，1996]。令人感興趣的是，據(jù)報(bào)導(dǎo)PME-1也能結(jié)合并明顯穩(wěn)定PP2A二聚體及三聚體的無(wú)活性構(gòu)型，一種先前鑒定到的能刺激PP2A酪胺酰磷酸酶活性的磷酸酪胺酰磷酸酶激活劑(PTPA)可逆轉(zhuǎn)此情況[Cayla等，1994，Langin等，2004，VanHoof等，2005]。為了確定觀察到的硒酸鈉增強(qiáng)PP2A磷酸酶活性不依賴于對(duì)上游參與翻譯后調(diào)節(jié)成分的作用，測(cè)定了在存在或缺乏硒酸鈉時(shí)培育的從血紅細(xì)胞純化得到的人PP2AA-C異質(zhì)二聚體的酶活性。在初步試驗(yàn)中，采用了磷酸酶催化作用的化學(xué)底物對(duì)-硝基苯磷酸(pNPP)，其磷酸基團(tuán)水解后可產(chǎn)生對(duì)-硝基苯酚，一種堿性條件下可溶解的深黃色色素。37。C將0.05單位的純化PP2A二聚體與5pM的硒酸鈉或500nM的岡田酸一起培育30分鐘，測(cè)定產(chǎn)生的對(duì)-硝基苯酚量，作為磷酸酶活性的讀數(shù)，與未處理對(duì)照樣品作比較。一式二份地測(cè)定各樣品的405nm吸光值，以590nm值為參比值。用以下公式計(jì)算PP2A活性活性-(樣品體積升數(shù))xA405/1.78x104M力cm(消光系數(shù))x0.25cmx15分x0.05U酶提供的數(shù)據(jù)是至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的磷酸酶相對(duì)平均活性士SEM。如圖4A(i)所示，即使用如此低濃度的純化酶，磷酸酶的活性也相當(dāng)明顯，但與岡田酸一起培育完全消除了此活性。相反，PP2A與硒酸鈉一起培育觀察到的磷酸酶活性幾乎為三倍。接著通過(guò)檢測(cè)硒酸鈉對(duì)PP2AA-C二聚體由內(nèi)部蘇氨酸殘基上磷酸化的合成的6氨基酸肽釋放無(wú)機(jī)磷酸的作用的影響，來(lái)確定磷酸酶活性的增強(qiáng)是否為底物特異性。37。C培育0.01-0.05UPP2A與500pM磷酸化肽15分鐘，加或不加50pM硒酸鈉。酶活性釋放的無(wú)機(jī)磷酸量通過(guò)加入孔雀綠測(cè)定，讀取590nm吸光值。在存在鉬酸鹽和正磷酸鹽時(shí)孔雀綠形成穩(wěn)定的綠色復(fù)合物，得以檢測(cè)存在的無(wú)機(jī)磷酸濃度。提供的數(shù)據(jù)為至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均590mn吸光度土SEM。見圖4A(ii)所示，硒酸鈉再次使絲氨酸磷酸化肽因PP2A磷酸酶的作用而釋放的無(wú)機(jī)磷酸濃度升高二倍以上。PP1的催化亞基與PP2A的催化亞基具有大約50%的序列同源性，這是任何相關(guān)磷酸酶中最高的[Barton等，1994]。為了確定硒酸鈉刺激增強(qiáng)磷24酸酶活性是否對(duì)PP2A有特異性，測(cè)定了它對(duì)PP1活性的影響。37C培育從家兔骨骼肌純化的0.05UPP1與500jiM磷酸化蘇氨酸合成肽15分鐘，加或不加50nM硒酸鈉，游離磷酸的濃度如上所述用孔雀綠檢測(cè)。提供的數(shù)據(jù)為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均590nm吸光度士SEM。見圖4B所示，硒酸鈉不影響PP1的磷酸酶活性。敏麼斜不嚴(yán)聘戶PZ4效奪眾還嚴(yán)謬夢(mèng)不斷增長(zhǎng)的工作提示，可逆性氧化是負(fù)調(diào)節(jié)蛋白磷酸酶的常見機(jī)制[Wang等，1996，Barrett等，1999，Sohn和Rudolph2003]。催化結(jié)構(gòu)域中的保守性半胱氨酸殘基是它們酶活性的關(guān)鍵，但在氧化環(huán)境中，此結(jié)構(gòu)域可能通過(guò)形成分子內(nèi)二硫鍵或磺酰胺鍵而受到修飾(圖5A)喪失了磷酸酶活性[Salmeen等，2003，Kwon等，2004]。鑒于硒化合物可能影響細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，研究了硒酸鈉通過(guò)減輕對(duì)氧化的抑制作用而激活PP2A的可能性。先測(cè)定硒酸鈉誘導(dǎo)的Akt去磷酸化是否對(duì)細(xì)胞氧還狀態(tài)敏感。在6孔板的每孔中接種5xl()S個(gè)PC3前列腺癌細(xì)胞，使細(xì)胞貼壁8小時(shí)，然后血清饑餓過(guò)夜。用或不用50(HiM以新鮮培養(yǎng)液配的硒酸鈉處理細(xì)胞，然后使其接觸0.25mM或1mM的過(guò)氧化氫10分鐘。分析等量全細(xì)胞裂解液，然后進(jìn)行免疫印跡測(cè)定磷酸化AktSe,"的水平。與表達(dá)的Akt蛋白總水平作比較。如圖5B所示，用硒酸鈉處理細(xì)胞顯著降低了Akt磷酸化水平，并且不受緊急加入0.25mM過(guò)氧化氫的影響。相反，緊急接觸高劑量的lmM過(guò)氧化氫完全消除了硒酸鈉的去磷酸化作用，表明這種阻斷是氧還敏感的。使蛋白磷酸酶的可逆性氧化作用失活涉及到催化結(jié)構(gòu)域中關(guān)鍵半胱氨酸的修飾，最終導(dǎo)致形成分子內(nèi)二硫鍵或磺酰胺鍵。為了確定硒酸鈉是否對(duì)PP2A的半胱氨酸有修飾作用，用Ellman試驗(yàn)[Ellman，1958]定量測(cè)定各種處理后純化人PP2AA-C二聚體中游離巰基的數(shù)目。Ellman試劑(5，5，-二硫-二(2-硝基苯甲酸)，DTNB)能與游離的巰基迅速形成二硫鍵，伴隨釋放色素磺酸鹽離子。37。C培育0.01UPP2A與10mMN-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)，或10mM過(guò)氧化氫，或10mM硒酸鈉，或10mM硒酸鈉和lOmM過(guò)氧化氫15分鐘。加入Ellman試劑然后檢測(cè)412nm吸光值來(lái)測(cè)定磷酸酶25中游離巰基的量(圖5C)。與NEM(—種巰基浣化劑)和過(guò)氧化氫二者培育后顯著降低了存在的游離巰基數(shù)目。相反，與硒酸鈉一起培育沒有作用，特別是不能保護(hù)PP2A的巰基不受到過(guò)氧化氫介導(dǎo)的修飾。實(shí)際上，過(guò)氧化氫對(duì)巰基的修飾在存在硒酸鈉時(shí)更顯著有效。接著用二乙酸2',7'-二氯二氫熒光素(DCFDA)測(cè)定硒酸鈉是否影響了完整細(xì)胞的氧還電勢(shì)。DCFDA無(wú)熒光可自由滲透入細(xì)胞，但在存在活性氧物質(zhì)(ROS)時(shí)可快速轉(zhuǎn)變成不能滲透細(xì)胞但發(fā)出亮熒光的2',7'-二氯二氫熒光素(DCF)[Bass等，1983]。在60mm平板中接種1x1()6個(gè)PC3前列腺癌細(xì)胞，使細(xì)胞貼壁8小時(shí)，然后血清饑餓過(guò)夜。細(xì)胞用5pMDCFDA培育15分鐘然后處理。細(xì)胞用500pM硒酸鈉或lmMN-乙酰半胱氨酸(NAC)處理1小時(shí)，然后接觸500nM過(guò)氧化氫IO分鐘。用流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光細(xì)胞比例。圖5D顯示各處理組的熒光分布圖。圖5E小結(jié)了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的熒光細(xì)胞平均百分比。如預(yù)計(jì)的那樣，PC3細(xì)胞接觸過(guò)氧化氫導(dǎo)致胞內(nèi)氧自由基的顯著增加，如分布圖中峰形向右偏移所示。用硒酸鈉預(yù)處理細(xì)胞對(duì)熒光細(xì)胞的基礎(chǔ)比例無(wú)影響，不能保護(hù)細(xì)胞在接觸過(guò)氧化氫后不產(chǎn)生ROS。相反，用氫供體NAC預(yù)處理導(dǎo)致熒光細(xì)胞基礎(chǔ)比例的微小降低，特別是顯著減弱了過(guò)氧化氫所產(chǎn)生的ROS。小結(jié)這些數(shù)據(jù)表明，雖然硒酸鈉誘導(dǎo)的Akt磷酸化對(duì)細(xì)胞氧還狀態(tài)敏感，但硒酸鈉不能通過(guò)減輕固有、可逆的抑制性氧化作用而增強(qiáng)PP2A的磷酸酶活性。實(shí)蘑伊/5:敏虔辦育教/^M^驊廢艨話絲屋示秀庶欽錄,性PP2A是一種遍在的高表達(dá)蛋白質(zhì)，估計(jì)占細(xì)胞總蛋白的0.1-l。/。[GallegoM和Virshup2005;Cohen，1997],涉及調(diào)節(jié)的蛋白底物數(shù)量不斷增加[Zhu等，2004;Woetmann等，2003;Silverstein等，2002]?？刂芇P2A底物特異性的機(jī)制尚不完全了解，但特異性調(diào)節(jié)B亞基的差異性結(jié)合看來(lái)至關(guān)重要[VanKanegan等，2005]。檢測(cè)了對(duì)于特定異質(zhì)三聚體硒酸鈉刺激的PP2A磷酸酶活性增強(qiáng)是否不加選擇或有特異性。上面已證明，硒酸鈉能增強(qiáng)從PC3前列腺癌細(xì)胞免疫沉淀的Akt相關(guān)的磷酸酶活性，和硒酸鈉能直接刺激純化的PP2AA-C二聚體的磷酸酶活性。為了確定這種磷酸酶活性的增強(qiáng)是否遍在化，用500nM硒酸鈉或100pM內(nèi)皮肽A處理1小時(shí)和用抗PP2A催化亞基的單克隆抗體檢測(cè)從PC3細(xì)胞免疫沉淀得到的PP2A。使細(xì)胞裂解液通過(guò)脫鹽柱除去游離磷酸，用磷酸化絲氨酸酸肽和孔雀綠檢測(cè)磷酸酶活性。不同條件下免疫沉淀的PP2A的磷酸酶活性見圖6A，為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均吸光度士SEM。用硒酸鈉處理PC3細(xì)胞不影響胞內(nèi)PP2A混合物的磷酸酶活性。相反，用PP2A磷酸酶特異性抑制劑內(nèi)皮肽A處理顯著降低了磷酸酶活性。檢測(cè)了硒酸鈉對(duì)另一種已知的PP2A底物p70S6K的作用[Peterson等，1999]。在6孔板的每孔中接種5xl()S個(gè)PC3前列腺癌細(xì)胞，使細(xì)胞貼壁8小時(shí)，然后血清饑餓過(guò)夜。用或不用500nM岡田酸預(yù)處理30分鐘，然后用50|iM的LY294002或500pM的硒酸鈉處理細(xì)胞1小時(shí)。用SDS-PAGE分析等量全細(xì)胞裂解液(75pg)，用能特異性識(shí)別Thr389位磷酸化的p70S6K蛋白的抗體作免疫印跡分析，測(cè)定p70S6K磷酸化水平。與蛋白加載對(duì)照卩微管蛋白作比較。如圖6B所示，即使在基礎(chǔ)條件下，p70S6K的磷酸化也很明顯，用PI3K抑制劑LY294002處理可消除此現(xiàn)象。與已知岡田酸是p70S6K磷酸化的負(fù)調(diào)節(jié)劑作用相符，用此酸抑制PP2A提高了所觀察的磷酸化水平。然而與硒酸鈉誘導(dǎo)Akt去磷酸化相反，在類似條件下p70S6K的磷酸化不受影響。嘗試了檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞中哪個(gè)B亞基家族可與Akt形成復(fù)合物。在100mm平皿中接種2xl(^個(gè)PC3前列腺癌細(xì)胞，使細(xì)胞貼壁8小時(shí)，然后血清饑餓過(guò)夜。用ELB(—種溫和的洗滌劑緩沖液)裂解細(xì)胞。用泛-Akt單克隆抗體(1:100)和3(^1蛋白A瓊脂糖珠免疫沉淀500pg裂解液中的總Akt蛋白。陰性對(duì)照(空白)中省略免疫沉淀抗體。反復(fù)洗滌后在3xSDS蛋白加樣緩沖液中煮沸珠5分鐘，高速離心，用凝膠電泳分析得到的上清液。在同一凝膠上將lO(Hig全細(xì)胞裂解液跑電泳，用能特異性識(shí)別B或B'家族亞基的抗體檢測(cè)得到的膜。用識(shí)別泛-Akt的抗體檢測(cè)相同印跡斑證實(shí)已成功將Akt去除。如圖6C所示，此系統(tǒng)中只有B家族調(diào)節(jié)性亞基才能與Akt共沉淀，提示PP2Ac、A和R2B亞基家族成員的三聚體才能介導(dǎo)這些細(xì)胞中的Akt去磷酸化。實(shí)婦6胰島素的代謝作用受Akt的直接下游底物糖原合酶激酶3(GSK-3)介導(dǎo)。GSK-3是一種遍在表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能磷酸化和滅活糖原合酶。在對(duì)胰島素受體活化的反應(yīng)中，Akt磷酸化和滅活了阻抑蛋白GSK-3，因而刺激了糖原的合成[Cross等，1995]。此外，GSK-3涉及對(duì)蛋白質(zhì)翻譯的控制，細(xì)胞周期進(jìn)程和Wnt信號(hào)傳遞[Diehl等，1998，Welsh等，1996，He等，1995]。為了測(cè)定硒酸鈉處理對(duì)GSK-3P活化的影響，接種PC3前列腺癌細(xì)胞，使細(xì)胞血清饑餓過(guò)夜，然后用新鮮培養(yǎng)液配的500pM硒酸鈉處理(圖7)所示的不同時(shí)間。用只能特異性識(shí)別Ser9位磷酸化(此位點(diǎn)是其激酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn))的GSK-3|3的抗體作免疫印跡分析全細(xì)胞裂解液，與作為加樣對(duì)照的細(xì)胞骨架蛋白(3微管蛋白相比較。對(duì)照泳道(0時(shí))觀察到的高度磷酸化表明，PC3細(xì)胞中GSK-3(3基礎(chǔ)活化水平高。用硒酸鈉處理導(dǎo)致磷酸化顯著降低，l小時(shí)和3小時(shí)最大，6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)回復(fù)到基礎(chǔ)水平。為定量測(cè)定硒酸鈉導(dǎo)致的抑制程度，制備數(shù)字化的免疫印跡結(jié)果，比較500pM硒酸鈉3小時(shí)與50LY2940021小時(shí)的效果，并測(cè)定GSK-3p磷酸化程度，光密度表示表達(dá)蛋白質(zhì)的比例。硒酸鈉平均降低了GSK-3(3超過(guò)20%,而LY294002導(dǎo)致磷酸化水平降低約60%。實(shí)應(yīng)伊/7..麻麼辦瓶求^伊疏賓麼遂！滯歩y:T/^/歪^激艨5游話眾為了測(cè)定硒酸鈉能否干擾PI3K通路的活性，用500nM硒酸鈉處理PC3細(xì)胞不同時(shí)間。用活化特異性抗體檢測(cè)全細(xì)胞裂解液中的Akt磷酸化狀態(tài)。因?yàn)榧词共患尤胙錚TEN也會(huì)喪失，故(認(rèn)為)Akt的Ser473和Thr308二個(gè)位點(diǎn)被強(qiáng)激活。加入硒酸鈉在接觸的IO分鐘內(nèi)誘導(dǎo)了Akt此二位點(diǎn)磷酸化增強(qiáng)。這種增強(qiáng)之后是顯著和長(zhǎng)久的失活，同時(shí)細(xì)胞的總Akt(泛Akt)水平基本上維持不變。用500nM各化合物處理不同時(shí)間評(píng)估Akt的Ser473磷酸化(情況)，將硒酸鈉對(duì)激活PC3細(xì)胞Akt的作用與與硒甲硫氨酸相比較。如圖8所示，硒甲硫氨酸不影響所測(cè)定的所有時(shí)間點(diǎn)的Akt磷酸化水平，而硒酸鈉明顯抑制了Akt磷酸化。誘導(dǎo)J"去鏵麼眾^激力麼敏麼欽教,效鑒于硒酸鈉一直能誘導(dǎo)關(guān)鍵的激酶Akt深度去磷酸化而硒甲硫氨酸無(wú)此作用，測(cè)定了此能力是否為硒酸鈉所獨(dú)有或是與其它化學(xué)形式的硒所共有。測(cè)試了其它無(wú)機(jī)硒(硒酸鈉、二氧化硒、硫化硒和硒酸)和有機(jī)硒物質(zhì)(甲基硒半胱氨酸、硒半胱氨酸)能否影響Akt活化。除了硫化硒溶于DMSO外，所有形式的硒均溶于水，以500pM濃度將它們加入血清饑餓的PC3細(xì)胞中1小時(shí)。分析全細(xì)胞裂解液，用能特異性識(shí)別AktSe一"位點(diǎn)磷酸化的抗體作免疫印跡分析，檢測(cè)Akt該位點(diǎn)的活化狀態(tài)，以及Akt表達(dá)總水平(泛Akt)。為了定量測(cè)定Akt活化程度，將免疫印跡結(jié)果數(shù)字化，以光密度測(cè)定磷酸化Akt與總Akt的比例。圖9小結(jié)了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)測(cè)定的磷酸化Akt與總Akt蛋白水平的平均比例士SEM。與未處理細(xì)胞相比，用500pM硒酸鈉處理PC3細(xì)胞1小時(shí)導(dǎo)致Akt的Ser473位磷酸化降低80%以上(p<0.05，斯氏t-檢驗(yàn))。相反，在相同條件下用其它無(wú)機(jī)和有機(jī)硒物質(zhì)處理PC3細(xì)胞對(duì)Akt磷酸化程度無(wú)顯著影響。小結(jié)這些數(shù)據(jù)表明誘導(dǎo)Akt去磷酸化的能力是硒酸鈉獨(dú)有的。實(shí)蘑激入獰裔PP24話絲游激力老敏麼辦救,游在實(shí)施例7中，數(shù)據(jù)顯示所有測(cè)試的化學(xué)形式硒中，只有硒酸鈉能顯著誘導(dǎo)Akt去磷酸化。為了明確對(duì)PP2A活性的不同影響可否解釋這種特異性，在pNPP水解試驗(yàn)中分別用pNPP和絲氨酸磷酸肽作為底物，比較了硒酸鈉(5mM或50pM)、亞硒酸鈉(5mM或50nM)和硒甲硫氨酸(5mM或50nM)對(duì)PP2A磷酸酶活性的影響(圖IOA和10B)。與觀察到的用硒酸鈉明顯增強(qiáng)磷酸酶活性相反，亞硒酸鈉或硒甲硫氨酸均不顯著影響PP2A磷酸酶活性。實(shí)施例1一9的材料和方法試劑^^^系實(shí)驗(yàn)程序中所用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系詳情列于表1中。__細(xì)胞系起源來(lái)源參考文獻(xiàn)^衍生自62歲高加索男性IV級(jí)ATCC「KaighnME等，前列腺腺癌的骨轉(zhuǎn)移1979)所有培養(yǎng)物維持在含5%或10%二氧化碳的37°C富馬科技公司(FormaScientific)培養(yǎng)箱中，按照標(biāo)準(zhǔn)在培養(yǎng)液RPMI1641中加入L-谷氨酰胺(吉布科英杰公司(GibcoInvitrogen)#11875-119)、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100pg/ml)和兩性霉素B(25ng/ml)(吉布科英杰公司#15240-062)。作為常規(guī)，細(xì)胞用5%或10%胎牛血清(吉布科英杰公司#10099-141)培養(yǎng)，除非另有說(shuō)明。將接近鋪滿的細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA(吉布科英杰公司M5400-054)消化后傳代。辦效郝做沐在上述實(shí)驗(yàn)中釆用了許多商品購(gòu)得的第一抗體和辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的或熒光標(biāo)記的或生物素化的第二抗體，其詳細(xì)情況小結(jié)如下.-兔抗-Akt多克隆抗體，商品目錄號(hào)9272，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)公司(CellSignallingTechnology,CST》小鼠抗-Akt(5G3)單克隆抗體，商品目錄號(hào)2966，CST;兔抗磷酸化Akt(ser473)多克隆抗體，商品目錄號(hào)9271，CST;兔抗磷酸化GSK3(3(ser9)多克隆抗體，商品目錄號(hào)9336，CST;不同的抗-PP2A抗體，商品目錄號(hào)05-421、06-2221、07-334和05-592，安普斯特公司(Upstate)。'、驊廢艨鄰激浙布錄眾游錄;表2:激酶和磷酸酶抑制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>餅發(fā)、審棘潛養(yǎng)基所有溶液貯存在室溫(RT)除非另有說(shuō)明。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>硒化合物硒酸鈉購(gòu)自西格瑪公司(Sigma)。所有溶液用蒸餾水新鮮制備，按說(shuō)明濃度使用。蛋白表達(dá)SZW-^兩辨激嚴(yán)凝皮冶妖(37^-iMG②按說(shuō)明處理后，用PBS洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞一次，然后4。C在細(xì)胞刮刀幫助下，用含蛋白酶抑制劑混合物(卡爾生物化學(xué)公司的蛋白酶抑制劑混合物，編號(hào)#539131)和磷酸酶抑制劑(10mM正釩酸鹽和10mM氟化鈉)的雞蛋裂解緩沖液(ELB)或RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞。4°C，14,000rpm離心15分鐘澄清樣品液，用上清液分析。用二辛可寧酸溶液試驗(yàn)(BCA)檢測(cè)樣品的蛋白濃度。取lpl裂解液在96孔板中用蒸餾水作l:25稀釋。各樣品中加入200pl二辛可寧酸溶液和4%(w/v)硫酸銅的80:1溶液，37°C培育30分鐘。檢測(cè)一系列蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的590nm吸光度(珀金埃爾瑪公司(PerkinElmer)MBA2000)。用變性聚丙烯酰胺凝膠(包括濃縮膠和分離膠)電泳分析蛋白質(zhì)樣品。將不同濃度的50-100pg蛋白質(zhì)加到SDS-PAGE凝膠上。在加樣前加入與樣品相等體積的SDS樣品緩沖液100°C煮沸5分鐘。以大約100V跑凝膠電泳。利用各凝膠上加有的蛋白大小標(biāo)記(伯樂萬(wàn)花筒(BioradKaleidoscope))評(píng)估感興趣蛋白質(zhì)的分子量。Western印跡分析將(電泳)分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(ImmobilonP，密理博公司(Millipore))后，將此膜浸入100%甲醇中10分鐘，用蒸餾水淋洗，用印跡轉(zhuǎn)移緩沖液平衡，室溫IOOV轉(zhuǎn)移1.5小時(shí)或4。C過(guò)夜。用TBS-T洗滌膜5分鐘后讓其干燥1小時(shí)。用含3%奶粉和0.1%吐溫的TBS室溫封閉1小時(shí)。用TBS-T洗滌此膜5次后，與用3%奶粉/0.1%TBS-T或3%BSA/0.1%TBS-T稀釋的第一抗體在室溫下輕輕攪拌培育l一2小時(shí)或4°C培育過(guò)夜。用0.1%TBS-T洗滌5分鐘三次，將此膜與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體(用封閉緩沖液配)一起培育。再洗滌此膜5分鐘三次，然后用SuperSignalWestDura時(shí)間延長(zhǎng)底物(皮爾斯公司(Pierce)弁34075)或ECLWestern印跡檢測(cè)試劑(安瑪西亞生物科學(xué)公司(AmershamBiosciences)#RPN2106)進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，以檢測(cè)抗體結(jié)合。用CL-曝光膠片(柯達(dá)公司(Kodak))記錄放射自顯影的發(fā)光。初步分析免疫印跡條帶后用膜剝離緩沖液(62.5mMTRISpH7，2%SDS，7%P-巰基乙醇)60°C剝離15分鐘，以TBS-T洗滌三次后封閉，可用于再探測(cè)。光密度分析用Vista數(shù)字掃描儀(優(yōu)麥公司(Umax))以第8版科勒爾照片繪圖軟件(CorelPhoto-Paint)(科勒爾公司(CorelCorporation))將有關(guān)免疫印跡條帶轉(zhuǎn)換成.tif文件。采用為Windows設(shè)計(jì)的專業(yè)圖像軟件(Image-Pro-Plus)V4.5丄22版(媒體控制公司(MediaCybernetics))進(jìn)行光密度分析。采用線性校正法，其中白色值設(shè)為0，黑色值設(shè)為225，選擇對(duì)應(yīng)于有關(guān)條帶的感興趣區(qū)域測(cè)定其信號(hào)強(qiáng)度。免疫沉淀在轉(zhuǎn)臺(tái)上的微量離心管中將100-500pg的全細(xì)胞裂解液與1:100稀釋的不同抗體在室溫下培育l-2小時(shí)或4。C培育16小時(shí)。簡(jiǎn)單離心后，各管加入30-40^1的預(yù)先洗滌過(guò)的50%蛋白A瓊脂糖快速流動(dòng)珠(西格瑪#9424)，室溫或4。C轉(zhuǎn)動(dòng)1小時(shí)。簡(jiǎn)單離心后，棄上清液用500pl細(xì)胞裂解緩沖液洗滌沉淀。如此洗滌三次后用珠作酶試驗(yàn)，或用3xSDS蛋白加樣緩沖液煮沸5分鐘洗脫蛋白質(zhì)，在SDS-PAGE凝膠上分析。磷酸酶試驗(yàn)將純化的人PP2A和兔PP1用提供的稀釋緩沖液稀釋到0.01U/pl，分裝等份-20。C保存。用純化磷酸酶進(jìn)行的磷酸肽試驗(yàn)將1mg合成的磷酸肽K-R-pT小R-R(安普斯特公司#12-219)和R-R-A-pS-V-A(安普斯特公司弁12-220)溶于1.10-1.285ml蒸餾水中制備1mM溶液，然后分裝等份-20。C保存待用。將從人血紅細(xì)胞純化的0.01-0.05U純化PP2AA-C二聚體，或0.05U由骨骼肌純化的兔PP1與500pM磷酸肽混合，在存在的所示不同處理?xiàng)l件下在37°C加熱塊上培育15分鐘。各反應(yīng)物總體積為25pi,由pNPP緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.0，100CaCl2)組成。加入100pl孔雀綠溶液(用10mM鉬酸銨、1NHC1、3.4%乙醇、0.01%吐溫-20液配制的0.034。/?？兹妇G)終止酶反應(yīng)?？兹妇G在存在鉬酸鹽和正磷酸鹽時(shí)可形成穩(wěn)定的綠色復(fù)合物，得以檢測(cè)無(wú)機(jī)磷酸存在的量。讀取每個(gè)樣品一式二份590nm的吸光度。PP2A免疫沉淀和磷酸酶試驗(yàn)將lxl()S個(gè)PC3前列腺癌細(xì)胞接種在60mm平板上，讓其貼壁8小時(shí)然后血清饑餓過(guò)夜。如所示進(jìn)行各種處理后，吸棄培養(yǎng)液，細(xì)胞用TBS洗滌一次。用0.3ml裂解緩沖液(20mMTris-HCl，pH7.0，1%Igepal-CA，2mMEDTA，2mMEGTA，lx蛋白酶完全抑制劑混合液)裂解細(xì)胞，使裂解液通過(guò)2mlZeba脫鹽離心柱(皮爾斯公司#89890)除去磷酸。脫鹽后裂解液所含蛋白嘗試用上述BCA試驗(yàn)檢測(cè)。用4嗎抗PP2A單克隆抗體和30nl蛋白A瓊脂糖珠漿液4。C免疫沉淀100-150pg總蛋白2小時(shí)。14,000rpm離心樣品1分鐘，用過(guò)量TBS洗滌三次，pNPP試驗(yàn)緩沖液洗滌一次。最后一次離心后小心除去所有的上清液，在珠中加入500nM磷酸蘇氨酸肽，終體積80^。30。C攪拌培育樣品IO分鐘，加入孔雀綠溶液終止反應(yīng)。讀取每個(gè)樣品一式二份5卯nm的吸光度。pNPP水解試驗(yàn)對(duì)-硝基苯磷酸(pNPP)是磷酸酶的一種化學(xué)底物，磷酸部分水解后產(chǎn)生對(duì)-硝基苯酚是一種深黃色色素，在堿性條件下可溶。檢測(cè)磷酸酶相對(duì)活性的試驗(yàn)，在微離心管中將0.05U純化的PP2A與5p140mMNiCl2和5plBSA液(5mg/ml)混合。如所示加入不同的處理液，用pNPP試驗(yàn)緩沖液調(diào)體積至80)iil。樣品37°C預(yù)培育15分鐘。每次試驗(yàn)前新鮮配制pNPP底物液，將用50mMTris-HCl，pH7.0溶解pNPP至1.5mg/ml。為啟動(dòng)磷酸酶反應(yīng)，加入120plpNPP，37。C再培育樣品15分鐘。檢測(cè)每個(gè)樣品一式二份的405nm吸光度，以590nm吸光度作參比。用以下公式計(jì)算PP2A活性活性=(樣品體積升數(shù)八A405/1.78x1()4M力cm(消光系數(shù))x0.25cmx15分x0.05U酶檢測(cè)游離巰基總含量用Ellman試劑檢測(cè)不同處理后純化PP2A中游離巰基的變化。將0.01UPP2A加到37.5nl稀釋緩沖液(30mMTris-HCl，3mMEDTA，pH8.2)、12.5nlDTNB試劑(Ellman試劑)和200|il甲醇中，室溫培育樣品5分鐘，然后檢測(cè)每個(gè)樣品一式二份的412nm消光(extinction)。結(jié)果與用N-乙酰半胱氨酸產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較。Akt激酶活性試驗(yàn)用K-LISAAKT活性試劑盒(卡爾生物化學(xué)公司弁CBA019)檢測(cè)硒酸鈉對(duì)重組人Aktl激酶活性的影響。此ELISA試驗(yàn)采用生物素化的肽底物(GRPRTSSFAEG)，其第二個(gè)絲氨酸可被Aktl、Akt2、Akt3、SGK(血清糖皮質(zhì)素激酶)和MSK1磷酸化。生物素化的Akt底物和Akt樣品在鏈霉親和素包被的96孔板孔中與ATP—起培育，得以在一步中磷酸化和捕獲底物。用磷酸絲氨酸檢測(cè)抗體檢測(cè)磷酸化的底物，然后用HRP-抗體偶聯(lián)物處理，用TMB底物顯色檢測(cè)。每次試驗(yàn)開始時(shí)，用蒸餾水l:IOO稀釋生物素化Akt底物貯存液制備其新的工作液等份。按以下順序加入各孔10^15x激酶試驗(yàn)緩沖液；lOpl生物素化Akt底物工作溶液；含250ng重組人Aktl的10pi蒸餾水；含500pM硒酸鈉或l^M星孢素的10pi蒸餾水，或只用水的陽(yáng)性對(duì)照；10^5xATP/MgCl2混合液，每孔總體積50pl。用密封條密封平板，微孔板振蕩器上簡(jiǎn)單混合，37。C培育30分鐘。各孔加入10^激酶終止液終止激酶反應(yīng)。倒棄各孔中內(nèi)容物，用lxELISA洗滌液(將ELISA貯存液用水1:20稀釋制制備)洗滌三次，倒置在印跡紙墊上拍打干。各孔加入ioow磷酸絲氨酸檢測(cè)抗體工作溶液(用蒸餾水1:1000稀釋磷酸絲氨酸抗體貯存液制備)室溫培育1小時(shí)。如上所述洗滌平板。然后各孔加入100plHRP-抗體偶聯(lián)物工作溶液(每次試驗(yàn)全部用蒸餾水1:1000稀釋HRP-抗體貯存液得以新鮮制備)室溫培育1小時(shí)。再如上所述洗滌平板。各孔加入IO(HUTMB底物，室溫發(fā)色20分鐘。各孔加入100plELISA終止液以停止反應(yīng)，用微孔板讀板儀讀取450nm吸光度，以590nm吸光度為參比。細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)可用二乙酸2',7'-二氯二氫熒光素(DCFDA)測(cè)定。DCFDA無(wú)熒光，可自由滲透入細(xì)胞，但在存在活性氧物質(zhì)(ROS)時(shí)可快速轉(zhuǎn)變成不能滲透細(xì)胞但具有亮熒光的2'，7'-二氯二氫熒光素(DCF)。先用5pMDCFDA平衡細(xì)胞15分鐘再進(jìn)行不同處理。然后收獲貼壁細(xì)胞，用PBS洗二次，用流式細(xì)胞術(shù)立即檢測(cè)熒光細(xì)胞比例。本文所引用的每一項(xiàng)專利、專利申請(qǐng)和出版物，其內(nèi)容納入本文作參考。本文對(duì)任何參考文獻(xiàn)的引用不代表承認(rèn)這些參考文獻(xiàn)是本申請(qǐng)的"現(xiàn)有技術(shù)"。本說(shuō)明書的目的是描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，而不是將本發(fā)明限制于任何一種實(shí)施方式或具體的特征集合。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，借助本文可對(duì)示范性的具體實(shí)施方式進(jìn)行各種修改和變化，但這不脫離本發(fā)明的范圍。所有這類修改和變化都包括在附件權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。實(shí)施例10:硒酸鹽對(duì)小鼠腦組織和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系tau蛋白磷酸化的影響材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SY5Y禾BBE2M17細(xì)胞獲自JanettaCulvenor(墨爾本大學(xué)病理學(xué)系，VIC)。SY5Y細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在添加10%胎牛血清(FBS，英杰公司(Invitrogen)，吉布科(GIBCO))、1%非必須氨基酸(美國(guó)密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司(Sigma，StLouis，MO，USA))、10mMHEPES(英杰公司，吉布科(GIBCO))、lmM丙酮酸鈉(英杰公司，吉布科(GIBCO))禾卩1。/?？股?抗霉菌素混合物(Invitrogen,GIBCO)的RPMI1640培養(yǎng)基(新西蘭奧克蘭的英杰公司(Invitrogen，Auckland,NewZeal))中，。BE2M17細(xì)胞培養(yǎng)在添加1。/。FBS(英杰公司，吉布科)、1%非必須氨基酸(美國(guó)密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司)、10mMHEPES(英杰公司，吉布科)、1mM丙酮酸鈉(英杰公司，吉布科)和1%抗菌素/抗霉菌素混合物(英杰公司，吉布科)的OPTI-MEM1血清減少的培養(yǎng)基(英杰公司，吉布科)中。37°C/5%C02培養(yǎng)細(xì)胞。硒酸鈉獲自西格瑪公司(美國(guó)密蘇里州圣路易斯)。抗體除非另有說(shuō)明，以下抗體均購(gòu)自美國(guó)洛克福特(Rockford，USA)的皮爾斯公司(Pierce)Endogen:抗人PHF-Tau單克隆抗體(克隆AT100;AT180;AT270)和抗人Tau單克隆抗體(克隆HT-7)。多克隆山羊抗小鼠免疫球蛋白/HRP37(丹麥大科公司(Dako，Denmark))和抗微管蛋白(G712A，普洛麥格公司)。體外試驗(yàn)在有包被或無(wú)包被表面的Falcon6孔板每孔中接種2x105個(gè)SY5Y或B2M17細(xì)胞，在5%C02/37°C和完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中讓其貼壁過(guò)夜(如前所述)。用含100nM濃度硒酸鈉的新鮮完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基置換舊培養(yǎng)基，培養(yǎng)3小時(shí)。細(xì)胞培養(yǎng)在用0.1%明膠(美國(guó)密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司)、基質(zhì)膠(目錄號(hào)#354234，BD，NSW，澳大利亞)或用0.5fxg/ml纖連蛋白(美國(guó)密蘇里州圣路易斯的西格瑪公司)包被表面的Falcon6孔板中。體內(nèi)試驗(yàn)14周齡Balb/CNuNu雄小鼠購(gòu)自ARC。小鼠接受300嗎硒酸鈉/200plPBS的一次皮下注射。注射后在不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，收集血、液和腦標(biāo)本。制備裂解液和免疫印跡用冷PBS洗滌細(xì)胞，用150pl冷RIPA緩沖液(含10%甘油、20mMTris、137mMNaCl、0.1%SDS、0.05%IGEPAL、1%TritonX-IOO、2mMEDTA、10%NaV、2%NaF和4X蛋白酶抑制劑)裂解，類似地，在干冰上用研缽和碾槌勻漿腦組織，用150(!lRIPA緩沖液裂解。冰上培育樣品30分鐘，然后4。C，13000rpm離心10分鐘。收集上清液用BCA試劑(Sigma)計(jì)算各樣品的蛋白估計(jì)值。將等量蛋白加到10。/。SDS-聚丙烯酰胺凝膠的各泳道中。(電泳后)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(密理博公司)上用5%脫脂奶粉溶液封閉2小時(shí)。封閉膜后加入第一抗體或抗人PHF-Tau抗體(ATlOO為1:200;AT180為1:1000;AT270為1:2500)，或抗人Tau蛋白抗體(HT-7為1:1000)，在5%脫脂奶粉溶液中4°C培育過(guò)夜。加二抗培育前，用含0.01%吐溫的Tris緩沖鹽水室溫淋洗膜三次3x5分鐘。然后加入用5%脫脂奶粉溶液1:10000稀釋的偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠多克隆第二抗體(丹麥大科公司)，室溫培育1小時(shí)。按上述洗滌膜用安瑪西亞ECLwestern印跡檢測(cè)試劑(英國(guó)白金漢郡的安瑪西亞生物禾斗學(xué)公司(AmershamBioscience，Buckinghamshire，UK))檢測(cè)。用20/。SDS/(3-巰基乙醇剝離緩沖液剝離膜，重新探測(cè)微管蛋白(普洛麥格)以驗(yàn)證蛋白加樣量。在存在(+)或缺乏(_)硒酸鈉時(shí)，在不同包被表面用抗人PHF-Tau抗體免疫印跡人神經(jīng)母細(xì)胞瘤BE2M17細(xì)胞系，見圖ll所示。BE2M17完全培養(yǎng)基中含100pM硒酸鈉。在纖連蛋白包被、未包被(塑料)或基質(zhì)膠包被的表面上用硒酸鈉培養(yǎng)細(xì)胞3小時(shí)(如方法章節(jié)中所述)。結(jié)果在6Mi^必?fù)?/教貧乂iWF-7Vi"克虔爿77卯。培養(yǎng)在纖連蛋白和基質(zhì)膠表面上的細(xì)胞在硒酸鈉存在時(shí)的PHF-Tau信號(hào)似乎比不用硒酸鹽處理的細(xì)胞更低。在7M/M浙必檢,教貧乂iWF-7Viw^"虔v477卵。培養(yǎng)在纖連蛋白、塑料(未包被)和基質(zhì)膠上的硒酸鈉處理細(xì)胞的PHF-Tau信號(hào)似乎比不用硒酸鹽處理的細(xì)胞更弱。培養(yǎng)在基質(zhì)膠上的細(xì)胞在67kDa產(chǎn)生的PHF-Tau信號(hào)比纖連蛋白和塑料上培養(yǎng)的細(xì)胞更強(qiáng)。在界6MZM必檢,/^/貧乂^^虔爿r27tf。培養(yǎng)在纖連蛋白、塑料(未包被)和基質(zhì)膠上的硒酸鈉處理細(xì)胞的PHF-Tau信號(hào)似乎比不用硒酸鹽處理的細(xì)胞更弱。注意，培養(yǎng)在基質(zhì)膠上的硒酸鈉處理和不處理的細(xì)胞之間只有輕微差異。在68、64和57kDa檢測(cè)到抗人PHF-Tau克隆HT-7。在纖連蛋白上培養(yǎng)硒酸鈉處理的細(xì)胞似乎能降低Tau蛋白的表達(dá)?？刮⒐艿鞍讬z測(cè)顯示蛋白加樣量相等。在存在(+)或缺乏(一)硒酸鈉時(shí)，在不同培養(yǎng)表面用抗人PHF-Tau抗體免疫印跡人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SY5Y細(xì)胞系，見圖12所示。SY5Y完全培養(yǎng)基中含100nM硒酸鈉。在明膠、纖連蛋白、未包被(塑料)或基質(zhì)膠包被表面上用硒酸鈉培養(yǎng)細(xì)胞3小時(shí)(如方法章節(jié)中所述)。結(jié)果在7MZ^必錄^絲檢,教貧乂iWF-rfl"克虔爿m相比，培養(yǎng)在明膠和纖連蛋白表面上的硒酸鹽處理細(xì)胞的PHF-Tau信號(hào)似乎比不用硒酸鈉處理的細(xì)胞更弱。在6^D"必檢,/身貧乂^^廣flT-7?；|(zhì)膠和纖連蛋白似乎降低了抗Tau信號(hào)。具體說(shuō)，培養(yǎng)在纖連蛋白表面用硒酸鈉處理的細(xì)胞的39抗Tau信號(hào)似乎比不用硒酸鈉處理的培養(yǎng)細(xì)胞更弱?？刮⒐艿鞍讬z測(cè)顯示蛋白加樣量相對(duì)等量。用抗人PHF-Tau免疫印跡14周齡Balb/CNuNu雄小鼠存在(+)或缺乏(一)硒酸鈉時(shí)的全腦裂解液(如指示的那樣)，見圖13。皮下注射1.5嗎/pl硒酸鈉處理小鼠，不注射硒酸鈉的小鼠(-)皮下注射PBS。在不同時(shí)間點(diǎn)0、2和6小時(shí)收集腦組織(如方法章節(jié)中所述)。結(jié)果PBS似乎對(duì)所有研究的克隆(AT100，AT180禾BAT270)抗人PHF-Tau信號(hào)有影響。為驗(yàn)證蛋白加樣量相等，按方法章節(jié)中所述剝離所有膜，并再檢測(cè)微管蛋白。圖13A顯示抗人PHF-Tau克隆AT100在60kD處有免疫反應(yīng)。存在硒酸鈉時(shí)的2和6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，PHF-Tau信號(hào)似乎比不用硒酸鈉處理的細(xì)胞低。圖13B顯示抗人PHF-Tau克隆AT180在60kD處有免疫反應(yīng)。存在硒酸鈉時(shí)的2和6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，PHF-Tau信號(hào)比不用硒酸鈉處理的細(xì)胞顯著降低。圖13C顯示AT270的免疫反應(yīng)信號(hào)與AT180克隆相似?？磥?lái)AT270克隆能檢測(cè)到73、70和60kDa的三種PHF-Tau蛋白同工型。圖13D顯示在存在(+)或缺乏(一)硒酸鈉時(shí)小鼠全腦裂解液中的Tau蛋白表達(dá)?？谷薚au蛋白，特別是克隆HT-7在小鼠腦組織中似乎無(wú)特異性。實(shí)施例11:硒酸鈉對(duì)過(guò)度表達(dá)人Tau441轉(zhuǎn)基因小鼠(TMHT)的行為和腦Tau蛋白病理學(xué)的影響方法岸享設(shè)計(jì)此項(xiàng)研究以評(píng)價(jià)用硒酸鈉治療對(duì)過(guò)度表達(dá)在腦特異性小鼠Thy-l啟動(dòng)子控制下的人TAU441基因(含二處突變V337M和R406W)的TAU441轉(zhuǎn)基因(Tg)TMHT小鼠(C57BL6背景)的行為和腦形態(tài)的影響。評(píng)價(jià)治療后1.5和3個(gè)月在開場(chǎng)(OpenField，OF)試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)桿(RotaRod，RR)試驗(yàn)和伸鼻(Nosepoke)好奇心和活動(dòng)試驗(yàn)(后者是評(píng)價(jià)好奇心行為的試驗(yàn))中所有Tg小鼠的行為。治療結(jié)束時(shí)另在莫利斯(Morris)水迷宮(MWM)試驗(yàn)中評(píng)價(jià)記憶和學(xué)習(xí)能力。也用OF試驗(yàn)、RR試驗(yàn)、鼻觸試驗(yàn)和MWM任務(wù)測(cè)定未治療的基線組小鼠。先檢測(cè)每個(gè)治療組3只動(dòng)物的腦TAU病理學(xué)變化。動(dòng)欽所用的TgTMHT雄性和雌性小鼠表達(dá)人TAU441，其攜帶有在腦特異性小鼠Thy-l啟動(dòng)子調(diào)控下的錯(cuò)義突變V337M和R406W。在奧地利格拉茨的JSW研究中心(JSW-Research，Graz，Austria)中繁殖和育種小鼠。這些小鼠的C57BL/6背景導(dǎo)致小鼠具有所知的良好學(xué)習(xí)能力。此小鼠模型類似于人阿爾茨海默病的Tau蛋白病理。治療開始時(shí)小鼠為5個(gè)月士2周齡，這也是基線組的年齡。動(dòng)激辨W浙銜養(yǎng)小鼠靠耳環(huán)標(biāo)記辨認(rèn)，飼養(yǎng)在單個(gè)通風(fēng)籠子(IVC)中，籠子中裝有由ABEDD⑧提供的標(biāo)準(zhǔn)鼠類草墊。每只籠子最多裝5只小鼠。按照基于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程保持飼養(yǎng)小鼠。每只籠子用顏色卡片辨認(rèn)，表明研究的動(dòng)物數(shù)目、性別、個(gè)體登記號(hào)(IRN)、出生日期及篩選日期和治療組分配。研究期間的溫度維持在大約24。C，相對(duì)濕度維持約40—70%。在恒定的光照周期(12小時(shí)光照/黑暗)下飼養(yǎng)動(dòng)物。動(dòng)物可自由獲得干燥的顆粒狀鼠類餅干(Altromin⑧)和普通自來(lái)水。潛伊將小鼠隨機(jī)分配到A組(硒酸鈉)、B組(運(yùn)載體)和C組(基線)。治療組A通過(guò)飲水接受硒酸鈉12周，而對(duì)照組(B)小鼠可飲用普通自來(lái)水。為了應(yīng)用，將1.2mg硒酸鈉溶于100ml滅菌水，記錄重量，將水瓶放在籠子中，每周一、三、五這樣做，換瓶時(shí)測(cè)定消耗的水重量。行為試驗(yàn)開場(chǎng)^#,最標(biāo)準(zhǔn)化的通用運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)是開場(chǎng)(OF)試驗(yàn)中的自主活動(dòng)。本項(xiàng)研究采用Plexiglas開場(chǎng)(48x48cm;TSE-System⑧)試驗(yàn)。將紅外光束置于盒子周圍1.4cm距離。為檢測(cè)后腿站立，將另一排光束固定在第一束光上方4cm處。測(cè)試持續(xù)5分鐘以檢査小鼠在新環(huán)境中的行為和習(xí)慣。然后，計(jì)數(shù)糞團(tuán)數(shù)目作為情緒激動(dòng)的衡量。每只鼠活動(dòng)后用70%乙醇清洗OF去除味道痕跡。試驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)的晝夜節(jié)律光照期室內(nèi)光照條件下進(jìn)行。應(yīng)存^f^11^利用該試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)TAUTg小鼠可能的運(yùn)動(dòng)缺陷。在加速的5道旋轉(zhuǎn)桿(TSE-Systems⑧)上進(jìn)行研究。小鼠必須在最多300秒內(nèi)完成程序。它們開始時(shí)的速度為5rpm，120秒后桿旋轉(zhuǎn)速度達(dá)到60rpm。此后，計(jì)算出跌倒的潛伏期和當(dāng)時(shí)的速度。辦葬好^A浙薪動(dòng)試驗(yàn)洞板裝置提供檢測(cè)小鼠對(duì)新環(huán)境反應(yīng)的簡(jiǎn)單方法，其優(yōu)點(diǎn)是利用了小鼠的好奇心和它們將鼻子伸入洞內(nèi)的傾向。在裝配有洞板(每板16個(gè)洞)的OF盒中進(jìn)行好奇心行為研究。頭伸入洞即阻斷了剛好裝在每只洞邊緣下方的紅外光束。計(jì)算出每只動(dòng)物在5分鐘內(nèi)頭伸入的次數(shù)和時(shí)間。,符資水迷宮(M『i^試驗(yàn)?zāi)顾詫m(MWM)試驗(yàn)在直徑100cm的黑色圓形水池中進(jìn)行。水池裝滿自來(lái)水，溫度22士1。C，水池實(shí)際上分成4區(qū)。透明平臺(tái)(直徑8cm)安置在水表面下方約0.5cm處。整個(gè)試驗(yàn)期間，除了預(yù)測(cè)試，平臺(tái)都位于水池的西南1/4區(qū)。在4天持續(xù)訓(xùn)練課程前一天，動(dòng)物必須進(jìn)行所謂的"預(yù)試驗(yàn)"(二次60秒試驗(yàn))以確保每只動(dòng)物的視力正常。只有完成這種試驗(yàn)的動(dòng)物才繼續(xù)MWM試驗(yàn)。在MWM任務(wù)中，每只小鼠必須在連續(xù)4天內(nèi)進(jìn)行三次試驗(yàn)。一次試驗(yàn)持續(xù)最長(zhǎng)一分鐘。在這段時(shí)間，小鼠有機(jī)會(huì)找到隱藏的模糊目標(biāo)。如果動(dòng)物不能找到離開水的"路"，研究人員可引導(dǎo)或?qū)⒋诵∈蠓诺狡脚_(tái)上。每次訓(xùn)練后讓小鼠在平臺(tái)上休息10—15秒。此時(shí)小鼠可能弄清周圍的方向。研究在昏暗的光照條件下進(jìn)行以防止跟蹤系統(tǒng)受到不良影響(Kaminski;PCS，生物醫(yī)學(xué)研究系統(tǒng)公司(BiomedicalResearchSystems))。在水池四周池壁上，貼有固定的黑色醒目的幾何符號(hào)(如園圈和方塊)，使小鼠可利用這些符號(hào)作為定向標(biāo)志。每次游泳訓(xùn)練一組有5—6只小鼠，以保證訓(xùn)練間隙約5—10分鐘。為了定量測(cè)定逃脫潛伏期(小鼠找到隱藏的平臺(tái)而從水中逃脫的以秒計(jì)的時(shí)間)、路徑(以米計(jì)的到達(dá)目標(biāo)的游泳軌跡長(zhǎng)度)和在目標(biāo)1/4區(qū)停留的時(shí)間，采用計(jì)算機(jī)處理的跟蹤系統(tǒng)。將計(jì)算機(jī)連接于水池中央上方放置的照相機(jī)。用照相機(jī)檢測(cè)用小發(fā)夾固定在小鼠尾巴上的發(fā)光二極管(LED)的信號(hào)。凍縈試驗(yàn)^P/^e7W^:第4天最后一次訓(xùn)練后1小時(shí)，小鼠必須完成所謂的探索試驗(yàn)。此時(shí)，拆去水池中的平臺(tái)，在一分鐘探索試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者計(jì)算出(小鼠)穿越先前平臺(tái)位置的次數(shù)。測(cè)定在此1/4區(qū)停留的時(shí)間。組織的制備和取樣治療結(jié)束和完成所有的行為測(cè)試后，處死各動(dòng)物，采集血液(血漿和血清)、CSF和腦，立即加工或貯存待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。為此目的，用標(biāo)準(zhǔn)吸入麻醉劑(異氟垸，Baxter)鎮(zhèn)定所有小鼠。鈍性解剖并暴露枕骨大孔，獲得腦脊液。暴露時(shí)，將巴斯得(Pasteur)移液器尖頭插入枕骨大孔內(nèi)約0.3-lmm深處。依靠抽吸和毛細(xì)管作用收集CSF直到液流完全停止。立即-80。C凍存各樣品，直到用ELISA進(jìn)行分析。CSF取樣后，將各小鼠置于背平臥位，用套在1ml注射器上的26號(hào)針頭插入胸腔通過(guò)橫隔膜深入約2cm。向針頭施加輕微吸力，通過(guò)回血確認(rèn)已將針頭置于小鼠的心室中。抽取血液直到血流停止。將血液收集在EDTA小瓶中-20。C保存待用。采集轉(zhuǎn)基因小鼠血樣后心內(nèi)灌注0.9%氯化鈉。迅速取出腦，右半側(cè)浸沒在新配制的4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋作組織學(xué)檢査。左半球在干冰上凍結(jié)，于-80。C保存用于隨后可能進(jìn)行的生化分析。先進(jìn)行9個(gè)腦半球(每個(gè)Tg小鼠組^3個(gè))的組織學(xué)評(píng)價(jià)以定量和定性評(píng)價(jià)Tau蛋白病變。按照Paxinos和Franklin編著的"小鼠腦"(TheMouseBrain)(第2版)的形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)集選擇在大腦前鹵的-1.82與-1.34mm之間的不同5層，在各層中切取厚5pm的15張冠狀連續(xù)切片(LeicaSM2000R)，作Gallyas染色，用特異性抗體(AT180和HT7)檢測(cè)Tau蛋白病理變化。以精確相同的方法操作研究的所有轉(zhuǎn)基因小鼠組織以避免由于此方法的差異引起的偏差。保存和儲(chǔ)存未使用的剩余的腦半球或組織，直到負(fù)責(zé)人決定如何處理或直到研究結(jié)束。^度教眾檢漱7Vi"^A癰潘變眾用單克隆TAU-抗體AT180和HT7(皮爾斯公司Endogen⑧)檢測(cè)Tau蛋白的沉積。AT180能識(shí)別PHF-TAU和形成的纖維纏結(jié)[此抗體識(shí)別的表位是磷酸化的Thr231殘基]，HT7識(shí)別正常人Tau蛋白及PHF-TAU[此抗體識(shí)別的表位在人Tau蛋白的殘基159與163之間]。用上述單克隆小鼠抗人Tau蛋白抗體(AT180—l:100;HT7—1:1000)處理不同5層各層的5pm厚冠狀石蠟切片，用抗小鼠Cy3二抗(1:500，杰克遜實(shí)驗(yàn)室公司(JacksonLaboratories))顯色。染色的詳細(xì)方法見下檢測(cè)人PHF-TAU蛋白沉積的AT180培育方法1.)使組織切片通過(guò)組織清洗液(櫻花(Sakum)⑧)和一系列等級(jí)酒精(Merck⑧)脫蠟和水化。2.)用重蒸餾水(Fresenius-Kabi⑧)洗滌2分鐘。3.)將組織切片置于10。/。檸檬緩沖液(Labvision⑧)中在95°C蒸氣中蒸15分鐘然后冷卻到室溫15分鐘，以便進(jìn)行抗原暴露(unmasking)4.)用PBS洗滌切片2x5分鐘。5.)室溫用1。/。過(guò)氧化氫(Linaris⑧)的甲醇(Merck⑧)溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10分鐘。6.)用PBS洗滌切片2x5分鐘。7.)在潮濕室中用MOM-封閉試劑(Vector⑧)在室溫下封閉非特異性結(jié)合60分鐘。8.)用PBS洗滌切片2x5分鐘。9.)用MOM-稀釋液(Vector㊣)在室溫下封閉非特異性結(jié)合5分鐘。10.)在潮濕室中與AT180(皮爾斯公司Endogen;用MOM-稀釋液1:100稀釋)一起于室溫下培育60分鐘。11.)用PBS洗滌切片3x5分鐘。12.)在潮濕室中用10。/。非免疫山羊正常血清(Dako⑧)封閉非特異性結(jié)合10分鐘。13.)用PBS洗滌切片2x5分鐘。14.)在潮濕室中與Cy3山羊抗小鼠抗體(Jackson⑧；用MOM-稀釋液1:500稀釋)一起于室溫下培育60分鐘。15.)用PBS洗滌切片5分鐘。16.)用重蒸餾水洗滌切片5分鐘。17.)用香柏油(Moviol)和蓋玻片覆蓋切片?；瘜W(xué)試劑1%過(guò)氧化氫的甲醇溶液60mL甲醇+2mL30%過(guò)氧化氫+0.6mLTritonX-100(Amresco)。MOM-封閉試劑2滴MOM-小鼠IgG封閉試劑(來(lái)自MOM-試劑盒(Vector⑧))+2.5mLPBS。MOM-稀釋液10mLPBS+800蛋白濃縮液(來(lái)自MOM-試劑盒(Vector⑧))?？贵wAT180:用MOM-稀釋液1:100稀釋抗體Cy3山羊抗小鼠用MOM-稀釋液1:500稀釋檢測(cè)正常人Tail蛋白和PHF-Taii蛋白沉積的HT7培育方法1)使組織切片通過(guò)組織清洗液(櫻花(Sakura)⑧)和一系列等級(jí)酒精(Merck⑧)脫蠟和水化。2)用重蒸餾水(Fresenius-Kabi⑧)洗滌2分鐘。3)將組織切片置于10。/。檸檬緩沖液(Labvision⑧)中在95°C蒸氣中蒸15分鐘然后冷卻到室溫15分鐘，以便進(jìn)行抗原暴露。4)用PBS洗滌切片2x5分鐘。5)室溫用"/。過(guò)氧化氫(Linaris⑧)的甲醇(Merck⑧)溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10分鐘。6)用PBS洗滌切片2x5分鐘。7)在潮濕室中用MOM-封閉試劑(Vector⑧)在室溫下封閉非特異性結(jié)合60分鐘。8)用PBS洗滌切片2x5分鐘。9)用MOM-稀釋液(Vector⑧)在室溫下封閉非特異性結(jié)合5分鐘。10)在潮濕室中與HT7(皮爾斯公司Endogen;用MOM-稀釋液1:100045稀釋)一起于室溫下培育60分鐘。11)用PBS洗滌切片3x5分鐘。12)在潮濕室中用10。/。非免疫山羊正常血清(Dako⑧)封閉非特異性結(jié)合IO分鐘。13)用PBS洗滌切片2x5分鐘。14)在潮濕室中與Cy3山羊抗小鼠抗體(Jackson⑧；用MOM-稀釋液1:500稀釋)一起于室溫下培育60分鐘。15)用PBS洗滌切片5分鐘。16)用重蒸餾水洗滌切片5分鐘。17)用香柏油(Moviol)和蓋玻片覆蓋切片?；瘜W(xué)試劑1%過(guò)氧化氫的甲醇溶液60mL甲醇+2mL30%過(guò)氧化氫+0.6mLTritonX-100(Amresco)。MOM-封閉試劑2滴MOM-小鼠IgG封閉試劑(來(lái)自MOM-試劑盒(Vector))+2.5mLPBS。MOM-稀釋液10mLPBS+800蛋白濃縮液(來(lái)自MOM-試劑盒(Vector))?？贵wHT7:用MOM-稀釋液1:100稀釋抗體Cy3山羊抗小鼠用MOM-稀釋液1:500稀釋評(píng)價(jià)療為在開場(chǎng)(OF)試驗(yàn)中，檢測(cè)了水平和垂直運(yùn)動(dòng)、排便次數(shù)、直立次數(shù)和持續(xù)時(shí)間、過(guò)度活動(dòng)及在開場(chǎng)中心與外圍消耗的時(shí)間比例在伸鼻好奇心和活動(dòng)試驗(yàn)中，計(jì)算了小鼠頭伸入(洞)的次數(shù)和持續(xù)時(shí)間。在旋轉(zhuǎn)桿(RotaRod)試驗(yàn)中，計(jì)算了跌倒的潛伏期和當(dāng)時(shí)的桿旋轉(zhuǎn)速度。在莫利斯水迷宮(MWM)試驗(yàn)中,記錄了游泳路徑的長(zhǎng)度和逃離潛伏期。游泳速度的計(jì)算方法為游泳路徑長(zhǎng)度除以逃離潛伏期。在探索試驗(yàn)中，拆去平臺(tái)進(jìn)行試驗(yàn)，在記錄紙上記錄(小鼠)穿越先前平臺(tái)位置的次數(shù)，以及在水池每一1/4區(qū)消耗的時(shí)間。辦經(jīng)i^潘學(xué)變眾為測(cè)定腦海馬回和腦扁桃體中的Tau蛋白免疫反應(yīng)性程度，采用專用的圖象分析軟件(專業(yè)圖像軟件(ImageProPlus)，4.5丄29版)。評(píng)價(jià)和計(jì)算了以下參數(shù)每張切片的腦海馬回和腦扁桃體區(qū)域面積；特定腦區(qū)域海馬回和扁桃體中免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞所占的絕對(duì)面積；免疫反應(yīng)陽(yáng)性面積與海馬回和扁桃體特定腦區(qū)域面積之比。定著,促方法a)調(diào)整該圖像的對(duì)比度以更好觀察切片形狀，但不應(yīng)將該對(duì)比度施加于該圖像。b)人機(jī)交互繪制海馬回輪廓圖測(cè)量其面積(=區(qū)域面積)c)人機(jī)交互繪制感興趣區(qū)域(AOI)，其中檢測(cè)到高于強(qiáng)度閾值水平的染色對(duì)象。為檢測(cè)此域值，人機(jī)交互繪制在靠近AOI的沒有可見免疫反應(yīng)區(qū)域中的線直方圖。此線直方圖所有像素的平均強(qiáng)度水平，加上一個(gè)常數(shù)，得到此強(qiáng)度域值水平。排除小于7^11112的對(duì)象。d)測(cè)定各對(duì)象的面積和AOI中染色面積之和，e)對(duì)腦扁桃體重復(fù)步驟a)-d)，f)計(jì)算相對(duì)Tau蛋白免疫陽(yáng)性面積(==Tau蛋白免疫反應(yīng)性的總面積/區(qū)域面積x100)g)將數(shù)據(jù)自動(dòng)輸出到Excel電子數(shù)據(jù)表中，包括參數(shù)"圖像標(biāo)題、區(qū)域面積、Tau總面積和Tau面積百分比"。利用注釋區(qū)分別記錄圖像質(zhì)量和排除標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)是該切片的丟失部分、許多是皺紋和明顯裂縫。h)關(guān)閉該圖像而不保存(以保留原始數(shù)據(jù))。統(tǒng)^學(xué)必潘計(jì)算所有測(cè)定參數(shù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差或SEM。結(jié)果一^^^^:一般說(shuō)，用硒酸鈉治療不會(huì)導(dǎo)致不良副作用或引起成熟前死亡。綠試教翁菜開場(chǎng)試驗(yàn)雖然硒酸鈉治療不影響活動(dòng)參數(shù)(活動(dòng)、過(guò)度活動(dòng)和直立行為)，但硒酸鈉治療小鼠在第一次OF試驗(yàn)中顯示趨觸行為被擾亂。這導(dǎo)致在該開場(chǎng)盒的中心區(qū)停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)，意味著第一輪治療后與運(yùn)載體相比硒酸鈉治療的動(dòng)物的趨觸性差(見圖14一"趨觸性"，治療組動(dòng)物的T檢驗(yàn)p=0.019)。第二輪治療結(jié)束時(shí)，將趨觸性行為按運(yùn)載體對(duì)照組水平標(biāo)準(zhǔn)化。一個(gè)半月后，與所研究的二個(gè)治療組相比，OF試驗(yàn)中基線動(dòng)物的特征是排便率較高(二個(gè)治療組的ANOVA分析p=0.018，p<0.05)，表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)此試驗(yàn)方法有較高的情緒反應(yīng)。旋轉(zhuǎn)桿(RotaRod)試驗(yàn)，硒酸鈉治療不會(huì)改變小鼠的運(yùn)動(dòng)行為。伸鼻好奇心和活動(dòng)試驗(yàn)，硒酸鈉治療不會(huì)改變小鼠的好奇心行為。莫利斯水迷宮(MWMH式驗(yàn)，圖15顯示了二個(gè)不同治療組加基線(5月齡動(dòng)物治療)的莫利斯水迷宮(MWM)行為結(jié)果，表4顯示其統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。此MWM任務(wù)深刻揭示在某些情況下(見表4)，與運(yùn)載體組、甚至是年幼3個(gè)月的基線組相比，硒酸鈉治療動(dòng)物之間差異的顯著性甚至更高。48表4:莫利斯水迷宮(MWM)試驗(yàn)結(jié)果的MannWhitneyU-檢驗(yàn)結(jié)果表:時(shí)間硒酸鈉與運(yùn)載體nn硒酸鈉運(yùn)載體p-值15160.002015160.008215160.026715160.1015硒酸鈉與基線nn硒酸鈉基線p-值15150.029515150.682715150.366915150.5125運(yùn)載體與基線nn運(yùn)載體基線p-值16150.519616150.065516150.119516150.1751長(zhǎng)度硒酸鈉與運(yùn)載體nn硒酸鈉運(yùn)載體p-值第l天15160.4945第2天15160.4701第3天15160.6823第4天15160.5196硒酸鈉與基線nn硒酸鈉基線p匿什第l天15150.6236第2天15150.8063第3天15151.0000第4天15150.9349運(yùn)載體與基線nn運(yùn)載體基線p-值第l天16150.6260第2天16150.7701第3天16150.7112第4天16150.6260此結(jié)果清楚表明硒酸鈉能夠提高認(rèn)知功能。腦組織學(xué)和免疫組化檢測(cè)結(jié)果在AT180和HT7IHC定量中，在所有受檢腦中海馬回和扁桃體區(qū)的區(qū)域面積高度恒定，排除了免疫組化染色步驟中對(duì)組織的不良作用(如皺縮、切割環(huán)境不同)，因此進(jìn)一步表明治療不會(huì)導(dǎo)致萎縮。檢測(cè)到的Tau蛋白含量數(shù)據(jù)與切片的個(gè)別區(qū)域大小相關(guān)，能應(yīng)對(duì)小差異。丑77浙/477卵與運(yùn)載體組(ANOVA:p0.05，治療組T-檢驗(yàn)p=0.04)和未治療的基線組(ANOVA:p<0.05，見圖16A)相比，硒酸鈉(1.2mg)治療的動(dòng)物海馬回中HT7-Tau相對(duì)面積的百分比顯著降低。這種作用在扁桃體天天天天1234第第第第天天天天1234第第第第天天天天1234第第第第中更顯著(見圖16B)，其中與未治療基線組(ANOVA:p〈0.01)和運(yùn)載體治療動(dòng)物(ANOVA:p<0.05，治療組T-檢驗(yàn)pL0018)相比，硒酸鈉治療小鼠的HT7-Tau相對(duì)面積百分比明顯降低。與HT7-Tau類似，硒酸鈉(1.2mg)治療的動(dòng)物海馬回中AT180-Tau相對(duì)面積的百分比低于運(yùn)載體組(治療組T-檢驗(yàn)p=0.04，見圖17A)，然而顯著性水平更低。還有，這種作用在扁桃體中更顯著(見圖17B)，其中硒酸鈉治療小鼠的HT7-Tau相對(duì)面積百分比顯著低于運(yùn)載體組(ANOVA:p<0.05，治療組T-檢驗(yàn)p=0.0045)，但不低于未治療基線組。海馬回和扁桃體中的AT180和HT7免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元顯示在與PHF-Yau緊密擠在一起的神經(jīng)元細(xì)胞體中有大量的Tau蛋白沉積。硒酸鈉治療顯著減少扁桃體和海馬回CA1區(qū)神經(jīng)元層中的Tau蛋白載量和Tau陽(yáng)性細(xì)胞。作用小結(jié)和結(jié)論在硒酸鈉治療轉(zhuǎn)基因小鼠中，治療開始后一個(gè)半月趨觸性降低，表明與扁桃體樣結(jié)構(gòu)相關(guān)的恐懼心理變化。經(jīng)長(zhǎng)期硒酸鈉治療后，小鼠在第二輪開場(chǎng)試驗(yàn)處死之前，趨觸行為恢復(fù)到與運(yùn)載體治療對(duì)照組相仿和正常的水平。硒酸鈉治療不影響所有的運(yùn)動(dòng)參數(shù)，如旋轉(zhuǎn)桿能力、開場(chǎng)活動(dòng)、過(guò)度活動(dòng)和直立行為。硒酸鈉治療可提高小鼠在Mffi水迷宮(MWM)試驗(yàn)中的認(rèn)知能力。第1、2和3天硒酸鈉治療動(dòng)物找到平臺(tái)明顯快于運(yùn)載體組動(dòng)物(p《0.01)，第1天也快于基線組的年幼3個(gè)月的動(dòng)物。當(dāng)評(píng)價(jià)TMHTTg小鼠海馬回和扁桃體中的HT7免疫陽(yáng)性Tau蛋白沉積和Tau蛋白載量時(shí)，可見硒酸鈉治療的顯著影響。與未治療的基線組相比，甚至在扁桃體中也可與運(yùn)載體(水)治療的對(duì)照相比，可觀察到這種治療顯著減少了海馬回和扁桃體中HT7陽(yáng)性Tau蛋白區(qū)域面積。HT7-Tau沉積的結(jié)果得到AT180培育的支持。硒酸鈉治療后海馬回和扁桃體中的AT180陽(yáng)性Tau蛋白比運(yùn)載體(水)治療對(duì)照組顯著減少。參考文獻(xiàn)_Alonso，A.D.C.等，阿爾茨海默病神經(jīng)原纖維纏結(jié)和失裝配微管中超磷酸化的Tau蛋白螯合正常Tau蛋白C4/z/ze/附e,sWwa^ti/sa^，6/es/m'cr齒6w/e51.)Nat.Med.，1996.2:p.783-787。Barrett,W.C.等.，過(guò)氧自由基離子在蛋白酪氨酸磷酸IB可逆性調(diào)節(jié)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用o/swperox/t/e/W/c"/am'o"/"w'g""/加朋f/wWo"/neapedreww'6/eregw/Wowo//ro^'"-(yro57'we//zos//atoseJBiolChem，1999.274(49):p.34543-6。Barton,G丄，P.T.Cohen和D.Barford，蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶的保守分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與大腸桿菌二腺苷四磷酸酶序列相似提示此二蛋白磷酸酶同源(Co/werv加.owawa/戸i"m/欲w"wre/7rWc,/owo/Ae/rWw;/zo—齒薦)EurJBiochem，1994.220(1):p.225-37。Bass，D.A.等，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)研究中性白細(xì)胞氧化產(chǎn)物的形成指導(dǎo)對(duì)膜刺激的應(yīng)答(F/owcyfomefn'cWwWeso/ox/t/a"ve/rot/w"/orma".o"6>>wew&o/jA/As.'flgrac/ed;-e5po"sefowe附6ra"e幼'wm/油'ow)JImmunol,1983.130(4):p.1910-7。Bramblett，G.T.等，阿爾茨海默病中Tau蛋白Ser396位的異常磷酸化改變了對(duì)減少微管結(jié)合發(fā)生的貢獻(xiàn)046"orma/faw//zo印/7wj/^m'o"WSer396m/cr幽6w/eZuW/wg).Neuron，1993.10:p.1089-1099。Bryant,J.C.，R.S.Westphal，禾卩B.E.Wadzinski，PP2A催化亞基的甲基化C-末端亮氨酸殘基對(duì)調(diào)節(jié)Balpha亞基的結(jié)合至關(guān)重要(Me^y/W^/o/regw/a組yjBa/p/zaswZmm力.BiochemJ，1999.339(Pt2):p.241-6。Cayla，X.等，能激活蛋白磷酸酶2A的酪氨酸磷酸酶活性的蛋白PTPA的分子克隆、表達(dá)和特征鑒定(Afo/ecw/arc/om>zg,oc,/vz(yo//roWwp/w—w認(rèn)Z4).JBiolChem，1994.269(22):p.15668-75。Chen，J.，B丄.Martin和D丄.Bmutigan，酪氨酸磷酸酶可調(diào)節(jié)蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶2A(/egw/a"'oo//roe/w"W"e-Areom."e;Aay;^atose妙e-Z4/yms/"e/^osp/iOAj/af/o")Science,1992.257(5074):p.1261-4。Chen，J.，S.Parsons和D丄.Brautigan，蛋白磷酸酶2A的酪氨酸在對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)刺激和v-src轉(zhuǎn)化應(yīng)答反應(yīng)中磷酸化(7>row'"eflwc/v-wcfra/wybrma"ow/6ro6/a加).JBiolChem，1994.269(11):P.7957-62。Cohen，P.T.，新的蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶多樣化是生命的調(diào)味品TrendsBiochemSci，1997.22(7):p.245-51。Conway，K.，Harper,J.，Lansbury，P.,1998.與早期發(fā)作帕金森病有關(guān)的突變a-共核蛋白加速了體內(nèi)纖維結(jié)形成G4cce/era&dw>oy6n7Nat.Med.4，1318-1320。Cross,D.A.等，胰島素介導(dǎo)的蛋白激酶B抑制糖原合酶的激酶3(/"/n.6"/o"o/g7_ycogewi^W/^eA:/"iwe-3/wsw//"/nW她d;ro^'wh'wase5).Nature,1995.378(6559):p.785-9。Diehl，J.A.等，糖原合酶的激酶3(3調(diào)節(jié)周期蛋白Dl的水解和細(xì)胞定c函/or/婦fea"ow).GenesDev.，1998.12(22):p.3499-511。Duda，J.E.，Giasson，B丄，Mabon，M.E.，Miller,D.C.，Golbe，L丄，Lee，V.M.，Trojanowski，J.Q.，2002.在腦挫傷親屬中同時(shí)發(fā)生的a-共核蛋白病禾口Tau蛋白病(Cowcw^rewceo//"w6ra/"/"fAo/ogy/"/zeCo幽ns/h'w<irecO.ActaNeuropathol.(Berl.)104，7-11。Ellman，G.L.，檢測(cè)低濃度硫醇的比色方法(^co/on'me^cme^od/or<ie&/vm>7/"g/owcowcew加"'o/wo/werca/tow).ArchBiochemBiophys，1958.74(2):p.443-50。Feany，M.B.，Bender,W.W.，2000.帕金森綜合征的果蠅模型C4Z)mso//H7a歸ce/o/ParhVwow'scfeease).Nature404，394-398。Fern和ez，J丄，等，研究細(xì)胞過(guò)程的有用工具岡田酸(Ote由/cac/《"■se/w/foo//orce〃w/arCurrMedChem，2002.9(2):p.229-62。Forman，MS.，Schmidt,M丄.，Kasturi，S.，Perl，D.P.，Lee，V.M.，Trojanowski,J.Q.，2002.Gwam帕金森綜合征癡呆復(fù)合體扁桃體中的Tau蛋白禾口ot-共核蛋白病理學(xué)(rawawea/p/za-"wwc/eZ"paf/zo/ogvo/尸flrA7Vwomim-cfemewf,acow//exo/Gwcrm).Am.J.Pathol.160，1725-1731。Frasier，M.等.實(shí)驗(yàn)神經(jīng)病學(xué)(ExperimentalNeurology)192(2005)274-287285。Gallego，M.和Virshup，D.M.，2005.蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶生、死禾口睡目民CfVo&Zwsen'we々/weom'wep/zc^sp/zatoses:/z/e,deafA,am/s/ee//wg)CurrOpinCellBiol，17(2):197-202。Giasson，B丄，Duda，J.E.，Quinn，S.M.，Zhang,B.，Trojanowski,J.Q.，Lee，V.M.，2002.表達(dá)A53Tot-共核蛋白小鼠的a-共核蛋白病和嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)障石尋(A^wo"a/fl/p/za-"wwc/e/wo/7a一w"/severewovemewfcfcwc/er/w/n/ceex/re肌'"gJ53TA膽awa/p/za-^wwe/e/w).Neuron34，521-533。Giasson，B丄，F(xiàn)orman，M.S.，Higuchi，M.，Golbe，L丄，Graves,C丄.，Kotzbauer，P.T.，Trojanowski,J.Q.，Lee，V.M.，2003.Tau蛋白和a-共核蛋白啟動(dòng)和協(xié)同神經(jīng)纖維纏結(jié)形成(/wY/af/owan""werg/W/c/6〃7/,zaO'owo/她a"c/a/p/za-^wwe/e/w).Science300，636-640。Grundke-Iqbal，I.等，微管相關(guān)蛋白Tau蛋白，阿爾茨海默病成對(duì)螺旋纖維纏結(jié)的一禾中成分CM/trofw6M/e-aj^oc/fl^ec;rWe/wtow,爿com/owewo//e//ca///fl,w^)J.Biol.Chem.1986a.261:p.6084-6089。Grundke-Iqbal，I.等，在阿爾茨海默病細(xì)胞骨架病理學(xué)中微管相關(guān)蛋白Tau蛋白的異常磷酸化(j&鮮應(yīng)/p/zo—o/。"o"o/Aem/cTOfw6w/e-a%soc/a&t/t(7aw」j/z/ze/膨rcytos&e/eto//^/zo/ogy)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1986b.83:p4913-4917。Guo，H.和Z.Damuni，自身磷酸化活化的蛋白激酶可磷酸化滅活蛋白/wac"V她51/n^e/w/7/c^/2fltoeZ4)ProcNatlAcadSciUSA，1993.90(6):p.2500-4。Hashimoto,M.，LJ，H.，Xia，Y.，Takeda，A.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