專利名稱：：豬肺炎支原體疫苗的制作方法豬肺炎支原體疫苗通過引用合并本申請要求于2006年3月3日提交的美國臨時專利申請序列號60/778，987的權益。參考于2004年7月26日提交的美國專利申請序列號10/899，181，于1999年1月15日提交的USSN09/232，279(于2002年4月23日授予的現(xiàn)在的美國專利號6，376,473)，于1999年1月15日提交的USSN09/232,469(于2002年9月17日授予的現(xiàn)在的美國專利號6,451,770)，于1999年1月15日提交的USSN09/232，477(于2001年5月8日授予的現(xiàn)在的美國專利號6,228，846)，于1999年1月15日提交的USSN09/232,478(于2001年3月27日授予的現(xiàn)在的美國專利號6,207,166)，于1999年1月15日提交的USSN09/232,479(于2001年4月24日授予的現(xiàn)在的美國專利號6，221，362)，于1999年7月1日提交的USSN09/347，594(于2001年4月17日授予的現(xiàn)在的美國專利號6,217,883)，于2000年5月31日提交的USSN09/583,350(于2003年2月11日授予的現(xiàn)在的美國專利號6,517，843)，于2000年7月14日提交的USSN09/616，781(于2003年3月18日授予的現(xiàn)在的美國專利號6,534，066)，于2000年10月6日提交的USSN09/680,228，于2001年2月16日提交的USSN09/784,962，于2001年2月16日提交的USSN09/784,982(于2003年7月1日授予的現(xiàn)在的美國專利號6，586，412),于2001年2月16日提交的USSN09/784，990(于2002年10月15日授予的現(xiàn)在的美國專利號6,464,984)，于2001年2月16日提交的USSN09/785,055(于2003年5月6日授予的現(xiàn)在的美國專利號6，558，674),于2002年2月15日提交的USSN10/077,489(于2004年10月12日授予的現(xiàn)在的美國專利號6,803,361)，于2002年2月28日提交的USSN10/085,519(于2004年11月16日授予的現(xiàn)在的美國專利號6，818，628),于2002年8月2日提交的USSN10/211，502，于2002年8月28日提交的USSN10/229，412,于2002年9月10日提交的USSN10/238,114，于2002年2月18日提交的USSN10/368,861,于2003年3月18日提交的USSN10/391，498，于2003年4月4日提交的USSN10/406，686，于2003年12月8日提交的USSN10/730，206(于2005年6月21日授予的現(xiàn)在的美國專利號6，908，620),于2004年5月3日提交的USSN10/838,122，于2004年11月8日提交的USSN10/983,928，于2005年1月19日提交的USSN11，038，682，于2005年3月14日提交的USSN11/079，559，于2005年4月15日提交的USSN11/106,780(于2006年2月14日授予的現(xiàn)在的美國專利號6，998，127),于2005年6月20日提交的USSN11/156，829，于2005年7月19日提交的USSN11/184，236，于2005年8月3日提交的USSN11/196,722，于2005年9月25日提交的USSN11/211，983,于2006年2月6日提交的USSN11/348，084，于1999年8月31日提交的USSN60/151,564，于2001年9月12日提交的USSN60/318，686，于2002年3月20日提交的USSN60/366，014，于2002年4月5日提交的USSN60/370,282，于2002年12月9日提交的USSN60/432,298,于2003年7月24日提交的USSN60/490，345,于2003年11月13日提交的USSN60/519，571，于2004年3月12日提交的USSN60/522，636，于2004年6月4日提交的USSN60/575,771,于2004年6月15日提交的USSN60/581,689，于2004年6月21日提交的USSN60/581,698、于2004年11月15日提交的USSN60/627，878,于2005年3月17日提交的USSN60/662,646和于2005年11月14日提交的USSN60/736，452。前述申請和在其中或在其處理期間引用的所有文件("申請引用文件")，以及申請引用文件中引用或參考的所有文件，以及本文引用或參考的所有文件("本文引用文件")，以及本文引用文件中引用或參考的所有文件，連同關于本文或通過引用合并入本文的任何文件中提及的任何產品的任何制造商的說明書、描述、產品規(guī)格說明、和產品單，在此通過參考引用并入本文并可以在本發(fā)明的實踐中使用。發(fā)明領域本發(fā)明提供了豬肺炎支原體疫苗及其施用方法。
背景技術：
：豬肺炎支原體(lyco/7hs頂sAyo/wew/pon/ae)，地方寸生動物肺炎的起因，仍是養(yǎng)豬業(yè)中重要的病原體。這種小的、復雜的生物定殖在呼吸道的纖毛細胞中，導致很少暴露于免疫系統(tǒng)。通常在幼豬中觀察到的肺損傷的特征在于上皮細胞的增生以及單核細胞在血管周圍和細支氣管周圍積聚增加。豬肺炎支原體感染后，在豬中觀察到免疫反應并且誘導抗性。(在例如Thacker，AnimHealthResRev.2004Dec;5(2):317-20和Kobisch&Friis，RevSciTech.1996Dec;15(4):1569-605中綜述)。臨床癥狀和損傷發(fā)展是豬肺炎支原體的致病能力和肺中的防御反應的結果。肺炎的經濟關聯(lián)性很大程度受在初始豬肺炎支原體感染后常見的繼發(fā)感染影響。用于診斷單個豬和群體中的肺炎的不同測試是可獲得的。治療和控制并不簡單，因為地方性動物肺炎是多因素疾病(在例如Maes等人，VetQ.1"6Sep;18(3):104-9中綜述)。豬肺炎支原體還與包括幾種呼吸系統(tǒng)病原體的多因素呼吸系統(tǒng)綜合征-豬呼吸疾病復征(PRDC)相關。最常從具有PRDC臨床體征的豬中分離出來的病原體感染免疫系統(tǒng)的細胞或誘導顯著的免疫病理表現(xiàn)。因此，PRRSV和豬肺炎支原體，與PRDC相關的2種最常見的病原體，改變呼吸免疫系統(tǒng)對其存在和其他病原體存在應答的能力。通過改變呼吸免疫系統(tǒng)，這2種常見病原體增加對與PRDC相關的許多其他病原體的敏感性(在例如Thacker,VetCIinNorthAmFoodAnimPract.2001Nov;17(3):551-65中綜述)。針對豬肺炎支原體的已知疫苗中的大多數(shù)已基于佐劑化的豬肺炎支原體滅活完整細胞制劑。商業(yè)來源包括RESPIFEND(FortDodge,AmericanHomeProducts)、HYORESP(MerialLtd)、M+PAC(Schering5Plough)、PROSYSTEMM(Intervet)、I亂EVACM(Boehringer)、RESPIS職(PfizerInc.)、和STELLAMUNEMYCOPLASMA(PfizerInc.)。WO03/003941涉及以針施用的組合物。仍存在對在單劑量治療中起作用的有效的豬肺炎支原體疫苗的需要，其易于施用給大量動物且是經濟的。豬的幾種感染性疾病例如支原體病在過去數(shù)年中的流行，已使得必需開發(fā)疫苗和伴隨的疫苗接種方案。這些方案包括在成熟前給豬接種疫苗，這存在后勤困難，即要接種疫苗的豬的數(shù)目多，并且經由針注射的疫苗接種在抓住動物的同時進行-這是費力的，或者不抓住它們-這阻止確實實現(xiàn)施用接種的有效性。此類疫苗將消除多次給藥的需要，并從而顯著減少與豬群的全世界大量接種疫苗相關的成本和勞力。的現(xiàn)有技術得到。發(fā)明概述本發(fā)明提供了治療或預防動物(有利的是豬)中由豬肺炎支原體感染引起的疾病或病癥的方法，所述方法可以包括給動物(有利的是豬)施用有效量的單劑量的豬肺炎支原體疫苗。豬肺炎支原體疫苗可以包含完整或部分細胞制劑，例如菌苗或經修飾的活制劑，亞單位疫苗，例如可以包含一種或多種豬肺炎支原體衍生的多肽或蛋白質，此類多肽或蛋白質的免疫原性片段，或編碼此類蛋白質、多肽或免疫原性片段的一種或多種豬肺炎支原體基因的亞單位疫苗。有利的是，豬肺炎支原體疫苗是滅活的疫苗。在另一個有利的實施方案中，豬肺炎支原體疫苗可以進一步包含佐劑。本發(fā)明的另一點是針對豬肺炎支原體的疫苗接種方法，所述方法可以包括使用液體噴射無針注射器給動物(有利的是豬)施用有效量的豬肺炎支原體疫苗的步驟，所述施用引發(fā)針對豬肺炎支原體的安全的和保護性的免疫應答。另一個目的是疫苗接種試劑盒或套組，其可以包含此類液體噴射無針注射器和至少一個包含豬肺炎支原體疫苗的疫苗小瓶，可操作地裝配以執(zhí)行給動物(有利的是豬)施用疫苗，并引發(fā)針對豬肺炎支原體的安全的和保護性的免疫應答。應當指出在本公開內容并且特別在權利要求和/或段落中，術語例如"包含/包括，，等可以具有美國專利法中歸于其的含義，例如，它們可以意指"包括，，等；并且術語例如"基本上由……組成，，具有美國專利法中歸于其的含義，例如，它們允許未明確描述的要素，但排除在現(xiàn)有技術中發(fā)現(xiàn)或影響本發(fā)明的基本或新特征的要素。這些及其他實施方案由以下詳述7>開、或由以下詳述顯而易見，并且包括在以下詳述中。詳述本發(fā)明提供了治療或預防動物(有利的是豬)中由豬肺炎支原體感染引起的疾病或病癥的方法，所述方法可以包括給動物(有利的是豬)施用有效量的單劑量的豬肺炎支原體疫苗。如本文所使用的，術語"動物"包括所有脊推動物，包括人。它還包括處于所有發(fā)育階段包括胚胎和胎兒期的個體動物。特別地，術語"脊推動物，，包括但不限于人、犬科動物(例如，犬)、貓科動物(例如，貓)；馬科動物(例如，馬)、牛科動物(例如，牛)、豬科動物(例如，豬)、以及禽類。如本文所使用的，術語"禽類"指分類學鳥綱的任何物種或亞種，例如，但不限于雞(種雞、適肉雞和蛋雞)、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、雉雞、鸚鵡、雀類、鷹類、鴉類和平胸鳥包括鴕鳥、鴯鹋和鶴鴕。如本文所使用的，術語"豬，，指豬起源的動物。術語"公豬"指預定為雄親種畜的超過6月齡的整體雄豬。術語"小母豬"指未生產第一窩小崽直至第一次產小豬的幼雌豬。術語"肉豬"指閹割的雄豬。術語"小豬，，指幼豬。術語"食用豬"指養(yǎng)殖用于良好的豬肉切割的豬品種。術語"儲備用豬(stores)"指可以是約10-12周齡的豬。術語"母豬"指為生育年齡并具有生育能力的雌性或已有第一窩小崽的雌豬。術語"斷奶小豬"或"斷奶的幼畜"指可以是約11-約24日齡、約2-3周齡、約3-5周齡或約5-8周齡的幼豬。如本文所使用的，術語"有毒力的"意指保留其在動物宿主中感7染性的能力的分離物。如本文所使用的，術語"滅活的疫苗"意指包含不能再復制或生長的感染性生物或病原體的疫苗組合物。病原體可以是細菌、病毒、原生動物或真菌來源的。滅活可以通過多種方法來完成，包括凍融、化學處理(例如，用硫柳汞或福爾馬林處理)、超聲處理、輻射、熱或足以阻止生物復制或生長同時保留其免疫原性的任何其他常規(guī)方法。如本文所使用的，術語"免疫應答"指在動物中引發(fā)的應答。免疫應答可以指細胞免疫(CMI);體液免疫或可以包含兩者。本發(fā)明還預期了限于免疫系統(tǒng)一部分的應答。例如，本發(fā)明的疫苗組合物可以特異性誘導增加的Y干擾素應答。如本文所使用的，術語"抗原"或"免疫原"意指在宿主動物中誘導特異性免疫應答的物質?？乖梢园麄€生物，被殺死的、減毒的或活的；生物的亞單位或部分；包含編碼免疫原的多核苷酸的重組栽體，其在呈遞給宿主動物后能夠誘導免疫應答；蛋白質、多肽、肽、表位、半抗原或其任何組合。如本文所使用的，術語"多價"意指包含超過一種來自不同屬或種的微生物的抗原的疫苗(例如包含來自多殺巴斯德菌(/^Weiyre/ya)、沙門氏菌屬(5W/zo/e"a)、大腸埃希桿菌(f"力er/c力/a)、睡眠嗜血桿菌(i^emopA//"^s0邁/2ws)和梭菌屬(C/o"r/c/2'咖)的抗原的疫苗)。如本文所使用的，術語"佐劑"意指加入疫苗中以增加疫苗的免疫原性的物質。佐劑如何起作用的機制仍未完全了解。某些佐劑被認為通過緩慢釋放抗原而增強免疫應答，而其他佐劑更高效率地或有效地將免疫原呈遞給宿主免疫系統(tǒng)或刺激特定細胞因子的產生。如本文所使用的，術語"藥學上可接受的載體"和"藥學上可接受的媒介物"可互換使用，并且指用于包含疫苗抗原的可以注射入宿主而無不良效應的流體媒介物。本領域已知的合適的藥學上可接受的載體包括但不限于無菌水、鹽水、葡萄糖、右旋糖、或緩沖溶液。載體可以包含輔助試劑，包括但不限于稀釋劑、穩(wěn)定劑(即，糖和氨基酸)、防腐劑、濕潤劑、乳化劑、pH緩沖劑、粘度增強添加劑、著色劑等。如本文所使用的，術語"疫苗組合物"包括在藥學上可接受的媒介物中用于在宿主中誘導免疫應答的至少一種抗原或免疫原。疫苗組合物可以以劑量并通過醫(yī)學或獸醫(yī)學領域技術人員眾所周知的技術進行施用，考慮此類因素如接受動物的年齡、性別、體重、物種和狀況、以及施用途徑。施用途徑可以是經皮例如皮內、肌內、皮下。疫苗組合物可以單獨施用，或可以與其他處理或治療共同施用或順次施用。組合物可以包含輔助物質例如濕潤或乳化劑、pH緩沖劑、佐劑、或粘度增強添加劑、防腐劑、著色劑等，取決于期望的施用途徑和制劑。可以參考標準藥學教科書例如"Remington'sPharmaceuticalSciences,"1990以制備合適的制劑，而無需過度實驗。豬肺炎支原體疫苗可以包含完整或部分細胞制劑和/或上清液，例如菌苗或經修飾的活制劑，亞單位疫苗，例如可以包含一種或多種豬肺炎支原體衍生的多肽或蛋白質，此類多肽或蛋白質的免疫原性片段，或編碼此類蛋白質、多肽或免疫原性片段的一種或多種豬肺炎支原體基因的亞單位疫苗。有利的是，豬肺炎支原體疫苗是滅活的疫苗。在另一個有利的實施方案中，豬肺炎支原體疫苗可以進一步包含佐劑。為了獲得滅活的免疫或疫苗組合物，病原體在能夠支持支原體生長的培養(yǎng)基中產生。所選擇的培養(yǎng)基可以包括本領域技術人員已知繁殖支原體的培養(yǎng)基，例如在R.Ross等人Am.J.Vet.Res.1984，45，1899-1905,B.Kristensen等人Am.J.Vet.Res.1981，42，784-788，WO91/18627，美國專利號5，338，543或其他類似參考文獻中描述的。支原體優(yōu)選在收獲后進行滅活，并且任選通過化學處理實施澄清，使用例如福爾馬林或曱醛、P-丙內酯、乙烯亞胺、二乙烯亞胺(BEI)、硫柳汞等，和/或通過物理處理(例如，熱處理或超聲處理)實施澄清。用于滅活的方法是本領域技術人員眾所周知的。豬肺炎支原體細菌可以通過甲醛處理(RossR.F.等人，Am.J.Vet.Res.,1984,1899-1905),通過乙烯亞胺或BEI處理(參見例如WO91/18627)，或通過硫柳汞處理(美國專利號5，968，525和5,338，543)進行滅活。滅活試劑可以被中和或通過純化步驟去除。滅活的病原體可以通過常規(guī)濃縮技術特別是通過超濾進行濃縮，述層析技術包括但不限于凝膠過濾。如本文所使用的，術語"免疫原性"意指能夠在宿主動物中產生針對一種或多種抗原的免疫應答。這基礎。本發(fā)明的方法可以使用亞單位疫苗進行實踐，所述亞單位疫苗含有純化的豬肺炎支原體免疫原性蛋白質、多肽以及此類蛋白質和多肽的免疫原性片段。此類蛋白質和多肽可以使用本領域已知的技術進行制備。此外，本領域技術人員眾所周知的方法可以用于測定蛋白質純度或同質性，例如樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后在染色凝膠上顯現(xiàn)單個多肽條帶。較高的分辨率可以使用HPLC或本領域眾所周知的其他類似方法確定。在一個具體實施方案中，本發(fā)明中使用的疫苗包含豬肺炎支原體的至少一種蛋白質，例如但不限于P46、P65、P97、P102、P70、P50和P44。關于豬肺炎支原體基因組的序列，參考Minion等人，JBacteriol.2004Nov;186(21):7123-33。在其他實施方案中，本發(fā)明的方法中使用的疫苗包含豬肺炎支原體菌苗(滅活的完整或部分細胞或經修飾的活的)或豬肺炎支原體蛋白質或多肽或其免疫原性片段，和至少一種其他的免疫原(滅活的完整或部分細胞或經修飾的活的)或免疫原性或抗原蛋白質、多肽或其免疫原性片段，并且優(yōu)選是病毒、細菌或寄生蟲多肽。在一個進一步的具體實施方案中，此類蛋白質或多肽的免疫原性片段具有這樣的序列，其包含本發(fā)明的方法中使用的免疫原性蛋白質和多肽的至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至10少95或至少IOO個連續(xù)氨基酸，所述免疫原性蛋白質和多肽包括但不限于P46、P65、P97、P102、P70、P50和P44。此外，用于疫苗中的豬肺炎支原體蛋白質是基本上純的或同質的。本發(fā)明的方法使用一般由宿主細胞純化的蛋白質或多肽，所述宿主細胞表達編碼這些蛋白質的重組核苷酸序列。此類蛋白質純化可以通過本領域眾所周知的多種方法來完成。參見，例如，"MethodsInEnzymology11，1990，AcademicPress,Inc.，SanDiego，"ProteinPurification:Principles和practice"，1982，Springer-Verlag，NewYork中描述的技術。本發(fā)明進一步包括至少一種豬肺炎支原體免疫原，其包含在載體分子或表達載體中，且與啟動子元件和任選與增強子可操作地連接。在一個有利的實施方案中，啟動子是巨細胞病毒(CMV)立即早期基因的啟動子。在另一個實施方案中，增強子和/或啟動子包括多種細胞或組織特異性啟動子(例如，肌肉、內皮細胞、肝臟、體細胞或干細胞)，多種病毒啟動子和增強子。肌肉特異性啟動子和增強子的例子已得到描述且是本領域技術人員已知的(參見，例如，Li等人，GeneTher.December1999;6(12):2005-11;Li等人，NatBiotechnol.March1999;17(3):241-5和Loirat等人，Virology.Jul.20，1999;260(1):74-83;其公開內容通過引用整體合并)?？梢栽诒景l(fā)明中使用的啟動子和增強子包括但不限于勞斯肉瘤病毒的LTR、HSV-1的TK、SV40的早期或晚期啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(MLP)、磷酸甘油酸激酶、金屬疏蛋白、ot-1抗胰蛋白酶、白蛋白、膠原酶、彈性蛋白酶I、P-肌動蛋白、p-珠蛋白、Y-珠蛋白、曱胎蛋白、肌肉肌酸激酶。"栽體"指重組DNA或RNA質粒或病毒，其包含在體外或體內待遞送給乾細胞的異源多核苷酸。異源多核苷酸可以包含用于治療目的的感興趣序列，并且可以任選為表達盒的形式。如本文所使用的，載體無需能夠在最終靶細胞或受試者中復制。該術語包括克隆栽體，也包才舌病毒載體。術語"重組"意指半合成、或合成來源的多核苷酸，其在自然界中不存在或以自然界中未發(fā)現(xiàn)的排列與另一種多核苷酸連接。"異源"意指衍生自與相比較的實體的其余部分在遺傳上不同的實體。例如，多核苷酸可以通過基因工程技術置于衍生自不同來源的質?；蜉d體內，并且是異源多核苷酸。從其天然編碼序列取出且與除天然序列外的編碼序列可操作地連接的啟動子是異源啟動子。本發(fā)明的多核苷酸可以包含另外的序列，例如在相同轉錄單位內的另外的編碼序列，控制元件例如啟動子、核糖體結合位點、多腺苷酸化位點、在相同或不同啟動子控制下的另外的轉錄單位，允許克隆、表達、同源重組和轉化宿主細胞的序列，和可能是提供本發(fā)明的實施方案所需要的任何此類構建體。本發(fā)明包括表達豬肺炎支原體免疫原或變體或類似物或片段的栽中。最低限度地，這包含下述元件、或基本上由下述元件組成、或由下述元件組成起始密碼子(ATG)、終止密碼子和啟動子、以及任選地還有對于某些載體例如質粒和某些病毒載體例如除痘病毒外的病毒栽體的多腺苷酸化序列。當多核苷酸編碼多聚蛋白質片段，例如豬肺炎支原體免疫原時，有利的是，在載體中，ATG置于讀碼框的5'處和終止密碼子置于3'處。可以存在用于控制表達的其他元件，例如增強子序列、穩(wěn)定序列、例如內含子和允許蛋白質分泌的信號序列。用于制備和/或施用載體或重組體或質粒以在體內或在體外表達本發(fā)明的基因的基因產物的方法可以是任何所需方法，例如，通過下之類似的方法美國專利號4，603，112;4，769，330;4,394,4484，722，848;4，745，0515，514，375;5，744，1405，766，599;5，990，0915，494，807;5，591，6394，769，3315，744，1415，174，9935，589，4664，945，0505，756，1035，505，9415，677，1785，494，8075，762，9385，338，6835，591，4395，552,143，5,580,859'6,130,066;6，004，777，6，130，0666,497，883，6,464,984'6,451,770;6，391，314,6,387,3766，376，4736，368，6036，348，196;6，306，400'6，228，8466，221，362:6，217，883;6，207，166;6，207，1656，159,4776，153，199:6，090，393;6，074，649;6，045，8036，033,6706，485，729;6，103，526;6,224,882;6，312,682;6，348,450和6312，683;于1986年10月16日提交的美國專利申請序列號920，197;WO90/01543;WO91/11525;WO94/16716;WO96/39491;WO98/33510;EP265785;EP0370573;Andreansky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11313-11318;Ballay等人，EMBOJ.1993;4:3861-65;Feigner等人，J.Biol.Chem.1994;269:2550-2561;Frolov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11371-11377;Graham,Tibtech1990;8:85-87;Grunhaus等人，Sem.Virol.1992;3:237-52;Ju等人,Diabetologia1998;41:736-739;Kitson等人，J.Virol.1991;65:3068-3075;McClements等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11414-11420;Moss,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11341-11348;Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11349-11353;Pe誦ck等人，Mol.Cell.Biol.1984;4:399406;Richardson(Ed)，MethodsinMolecularBiology1995;39，"BaculovirusExpressionProtocols,"HumanaPressInc.;Stnith等人(1983)Mo1.Cell.Biol.1983;3:2156-2165;Robertson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11334-11340;Robinson等人，Sem.Immunol.1997;9:271;和Roizman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:11307-11312。因此，本發(fā)明中的載體可以是任何合適的重組病毒或病毒載體，例如痘病毒(例如，痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、雞痘病毒、淀熊痘病毒、豬痘病毒等)，腺病毒(例如，人腺病毒、犬腺病毒)，皰滲病毒(例如犬皰滲病毒)，桿狀病毒，逆轉錄病毒等(如在通過引用合并入本文的在本發(fā)明的實踐中有用的載體的例子外，還可以提供關于待由一種或多種載體表達的非豬肺炎支原體免疫原的來源，例如非豬肺炎支原體免疫原，非豬肺炎支原體免疫原肽或其片段、細胞因子等，所述栽體在本發(fā)明的組合物中或包括在本發(fā)明的組合物中。本發(fā)明還涉及包含栽體例如表達載體的制劑，例如治療組合物。制劑可以包含一種或多種栽體，基本上由一種或多種栽體組成，或由一種或多種載體組成，所述載體例如表達栽體，例如體內表達栽體，包含一種或多種豬肺炎支原體免疫原，基本上由一種或多種豬肺炎支原體免疫原組成，或由一種或多種豬肺炎支原體免疫原組成(并有利地表達一種或多種豬肺炎支原體免疫原)。有利的是，載體包含并表達這樣的多核苷酸，其包含編碼一種或多種豬肺炎支原體免疫原的編碼區(qū)，或基本上由編碼一種或多種豬肺炎支原體免疫原的編碼區(qū)組成，或由編碼一種或多種豬肺炎支原體免疫原的編碼區(qū)組成；藥學上或獸醫(yī)學可接受的載體、賦形劑或媒介物。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，制劑中的其他一種或多種栽體包含這樣的多核苷酸，基本上由這樣的多核苷酸組成，或由這樣的多核苷酸組成，所述多核苷酸編碼豬肺炎支原體免疫原的一種或多種其他蛋白質或其片段，并且在合適環(huán)境下該栽體表達豬肺炎支原體免疫原的一種或多種其他蛋白質或其片段。根據(jù)另一個實施方案，制劑中的一種或多種載體包含這樣的多核苷酸，基本上由這樣的多核苷酸組成，或由這樣的多核苷酸組成，所述多核苷酸編碼編碼豬肺炎支原體免疫原的一種或多種蛋白質或其片段，所述一種或多種載體具有所述多核苷酸的表達。本發(fā)明的制劑有利地包含至少2種載體，基本上由至少2種載體組成，或由至少2種載體組成，所述載體包含來自不同豬肺炎支原體分離株的編碼相同蛋白質和/或不同蛋白質(但有利的是相同蛋白質)的多核苷酸，基本上由來自不同豬肺炎支原體分離林的編碼相同蛋白質和/或不同蛋白質(但有利的是相同蛋白質)的多核苷酸組成，或由來自不同豬肺炎支原體分離林的編碼相同蛋白質和/或不同蛋白質(但有利的是相同蛋白14質)的多核苷酸組成，并且有利地在體內在適當?shù)臈l件下或合適的條件下或在合適的宿主細胞中，有利地還表達來自不同豬肺炎支原體分多核苷酸r包;一種或多:載體5的制劑包含這樣的多核J酸，基本上由這樣的多核苷酸組成，或由這樣的多核苷酸組成，所述多核苷酸編碼并有利地表達(有利地在體內)豬肺炎支原體肽、融合蛋白或其表位。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，表達載體是病毒載體，特別是體內表達載體。在一個有利的實施方案中，表達載體是腺病毒載體。有利的是，腺病毒是人Ad5載體，El缺失和/或E3缺失型腺病毒。在一個具體實施方案中，病毒載體是痘病毒，例如痘苗病毒或減毒的痘苗病毒(例如，MVA，安卡拉疫苗林在雞胚成纖維細胞上超過570次傳代后獲得的經修飾的安卡拉林；參見SUckl&Hochstein-Mintzel，Munch.Med.Wschr.,1971，113,1149-1153;Sutter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1992，89，10847-10851;可作為ATCCVR-1508獲得；或NYVAC，參見美國專利號5，494，807，例如美國專利號5,494,807中討論NYVAC的構建的實施例1-6等，以及從哥本哈根抹痘苗病毒基因組中刪除另外的ORF，并且異源編碼核酸分子插入這種重組體的位點內的NYVAC變體，以及匹配啟動子的使用；還參見WO96/40241)，禽痘病毒或減毒的禽痘病毒(例如，金絲雀痘、雞痘、鳩痘、鴿痘、鵪鶉痘、ALVAC或TROVAC;參見，例如，美國專利號5，505，941、5,494,807)豬痘，浣熊痘，駱駝痘或粘液瘤病病*^。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，痘病毒栽體是金絲雀痘病毒或雞痘病毒載體，有利的是減毒的金絲雀痘病毒或雞痘病毒。在這點上，提及在登錄號VR-lll下可從ATCC獲得的金絲雀痘。減毒的金絲雀痘病毒在美國專利號5，756，103(ALVAC)和WO01/05934中得到描述。眾多雞痘病毒疫苗接種林也是可獲得的，例如由MERIAL上市的DIFTOSECCT林，和由INTERVET上市的NOBILISVARIOLE疫苗；并且15還參考涉及減毒的雞痘病毒林TROVAC的美國專利號5，766，599。關于產生其重組體和如何施用其重組體的方法的信息，技術人員可以參考本文引用的文件和W090/12882,例如，關于痘苗病毒，特別提及美國專利號4,769,330，4,722,848，4,603,112,5,110,587,5，494，807和5，762，938;關于雞痘，特別提及美國專利號5,174,993，5，505，941和美國專利號5，766，599;關于金絲雀痘特別提及美國專利號5，756，103;關于豬痘特別提及美國專利號5，382，425;和關于浣熊痘，特別提及WO00/03030。當表達載體是痘苗病毒時，待表達的一種或多種多核苷酸的一個或多個插入位點有利地在胸苷激酶(TK)基因或插入位點、血凝素(HA)基因或插入位點、編碼A型包含體(ATI)的區(qū)域處；還參見本文引用的文件，特別是涉及痘苗病毒的那些。在金絲雀痘的情況下，有利的是一個或多個插入位點是ORF(s)C3，C5和/或C6;還參見本文引用的文件，特別是涉及金絲雀痘病毒的那些。在雞痘的情況下，有利的是一個或多個插入位點是ORFsF7和/或F8;還參見本文引用的文件，特別是涉及雞痘病毒的那些。MVA病毒區(qū)域的一個或多個插入位點有利地如多種出版物中所述，包括Carrol1M.W.等人，Vaccine,l997，15(4)，387-394;StittelaarK.J.等人，J.Virol.，2000,74(9)，4236-4243;SutterG.等人，1994，Vaccine,12(11)，1032-1040;并且，在這方面，還應當指出完整的MVA基因組在AntoineG.，Virology,1998，244,365-396中得到描述，所述參考文獻使得技術人員能夠使用其他插入位點或其他啟動子。有利的是，待表達的多核苷酸插入在特定痘病毒啟動子的控制下，例如，特別是痘苗啟動子7.5kDa(Cochran等人，J.Virology,1985,54，30-35),痘苗啟動子I3L(Riviere等人，J.Virology,1992，66，3424-3434)，痘苗啟動子HA(Shida，Virology,1986,150，451-457),牛痘啟動子ATI(Funahashi等人，J.Gen,Virol.,1988，69，35-47)，痘苗啟動子H6(TaylorJ.等人，Vaccine,1988，6，504-508;GuoP.等人J.Virol.，1989，63，4189-4198;PerkusM.等人，J.Virol.，1989，63，3829-3836)。在一個具體實施方案中，病毒載體是腺病毒，例如人腺病毒(HAV)或犬腺病毒(CAV)。在一個實施方案中，病毒栽體是人腺病毒，特別是血清型5腺病毒，通過病毒基因組El區(qū)中的缺失致使無法復制，特別是約核苷酸4"-約核苷酸3510，參考Genbank中在登錄號M73260下和參考的出版物J.Chroboczek等人Virol.1992,186,280-285中公開的hAd5序列。缺失型腺病毒在表達E1的293(F.Graham等人J.Gen.Virol.1977，36,59-72)或PER細胞特別是PER.C6細胞(F.Falloux等人HumanGeneTherapy1998，9，1909-1917)中進行繁殖。人腺病毒可以在E3區(qū)中缺失，特別是約核苷酸28592-約核苷酸30470。El區(qū)中的缺失可以與E3區(qū)中的缺失組合完成(參見，例如J.Shriver等人Nature,2002，415,331-335，F(xiàn).Graham等人MethodsinMolecularBiology第7巻GeneTransferandExpressionProtocolsEditedbyE.Murray,TheHumanPressInc，1991，第109-128頁；Y.Ilan等人Proc.Natl.Acad.Sci.1997，94，2587-2592;美國專利號6，133，028;美國專利號6，692，956;S.Tripathy等人Proc.Natl.Acad.Sci.1994，91，11557-11561;B.TapnellAdv.DrugDeliv.Rev.1993,12，185-199;X.Danthinne等人GeneThrapy2000，7，1707-1714;K.BerknerBioTechniques1988，6，616-629;K.Berkner等人Nucl.AcidRes.1983，11，6003-6020;C.Chavier等人J.Virol.1996，70，4805-4810)。插入位點可以是最終在El和/或E3區(qū)域部分或完全缺失后的El和/或E3基因座(區(qū)域)。有利的是，當表達載體是腺病毒時，待表達的多核苷酸插入在真核細胞中有功能的啟動子的控制下，例如強啟動子，優(yōu)選巨細胞病毒立即早期基因啟動子(CMV-IE啟動子)，特別是M,Boshart等人Cell1985，41,521-530中的約核普酸-734至約核苷酸+7的增強子/啟動子區(qū)，或來自PromegaCorp的pCI載體的增強子/啟動子區(qū)。CMV-IE啟動子有利地是鼠源或人源的。還可以使用延伸因子la的啟動子。在一個17具體實施方案中，可以使用由缺氧調節(jié)的啟動子，例如K.Boast等人HumanGeneTherapy1999，13，2197-2208中描述的啟動子HRE。還可以使用肌特異性啟動子(X.Li等人Nat.Biotechnol.1999，17，241-245)。強啟動子還在本文中關于質粒栽體進行討論。在一個實施方案中，剪接序列可以位于增強子/啟動子區(qū)的下游。例如，從CMV-IE基因中分離的內含子1(R.Stenberg等人J.Virol.1984，49，190)，從兔或人p-珠蛋白基因中分離的內含子，特別是來自b-珠蛋白基因的內含子2,從免疫球蛋白基因中分離的內含子，來自SV40早期基因的剪接序列或從來自PromegeCorp的pCI載體中分離的嵌合體內含子序列，其包含與小鼠免疫球蛋白受體序列(在Genbank中在登錄號CVU47120下的約核苷酸890-約核苷酸1022)融合的人p-珠蛋白供體序列。多聚(A)序列和終止子序列可以插入待表達的多核苷酸下游，例如牛生長激素基因特別是在Genbank中在登錄號B0VGHRH下的約核苷酸2339-約核苷酸2550，兔P-珠蛋白基因或SV40晚期基因多腺苷酸化信號。在另一個實施方案中，病毒載體是犬腺病毒，特別是CAV-:2(參見，例如，L.Fischer等人Vaccine,2002,20，3485-3497;美國專利號5，529，780;美國專利號5,688,920;PCT申請?zhí)朩O95/14102)。對于CAV，插入位點可以在E3區(qū)和/或位于E4區(qū)和右ITR區(qū)之間的區(qū)域中(參見美國專利號6,090,393;美國專利號6，l56，567)。在一個實施方案中，插入片段在啟動子的控制下，例如巨細胞病毒立即早期基因啟動子(CMV-IE啟動子)或已對人腺病毒栽體描述的啟動子。多聚(A)序列和終止子序列可以插入待表達的多核苷酸下游，例如牛生長激素基因或兔P-珠蛋白基因多腺苷酸化信號。在另一個具體實施方案中，病毒載體是皰疹病毒例如偽狂犬病病毒(PRV)。對于PRV,插入位點可以特別在胸苷激酶基因中，在gE基因中，或在UL43ORF中(參見WO96/13575，WO87/04463)。在一個實施方案中，待表達的多核苷酸插入在真核細胞中有功能的啟動子的控制下，優(yōu)選CMV-IE啟動子(鼠或人)。在一個具體實施方案中，可以使用由缺氧調節(jié)的啟動子，例如K.Boast等人HumanGeneTherapy1999，13，2197-2208中描述的啟動子HRE。多聚(A)序列和終止子序列可以插入待表達的多核苷酸下游，例如牛生長激素或兔(3-珠蛋白基因多腺苷酸化信號。根據(jù)本發(fā)明的一個再進一步的實施方案，表達栽體是質粒載體或DM質粒載體，特別是體內表達載體。在一個具體的、非限制性例子中，pVR1020或1012質粒(VICALInc.;LukeC.等人，JournalofInfectiousDiseases,1997，175，91-97;HartikkaJ.等人，Hu議GeneTherapy,1996，7，1205-1217，參見，例如，美國專利號5，846，946和6，451，769)可以用作栽體用于插入多核苷酸序列。pVR1020質粒衍^生自pVR1012并且包含人tPA信號序列。在一個實施方案中，人tPA信號包含在Genbank中在登錄號HUMTPA14下的氨基酸M(1)-氨基酸S(23)。在另一個具體的、非限制性例子中，用作載體用于插入酸M(24)-氨基酸:(48)的馬IGF1的信號肽序列。關于可以在^踐中參考或使用的DNA質粒的另外信息在例如美國專利號6，852，705;6,818,628;6,586,412;6，576，243;6,558,674;6,464,984;6,451,770;6，376，473和6，221，362中找到。術語質粒涵蓋任何DNA轉錄單位，其包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和其在所需宿主或靶的細胞中體內表達所必需的元件；并且在這方面，應當指出超螺旋結構或非超螺旋結構、環(huán)狀質粒以及線性形式旨在包括在本發(fā)明的范圍內。每個質粒包含或含有或基本上組成為除了包含編碼豬肺炎支原體免疫原或其變體、類似物或片段的多核苷酸外，其還與啟動子可操作地連接或在啟動子的控制下或依賴啟動子。一般而言，利用在真核細胞中有功能的強啟動子是有利的。優(yōu)選的強啟動子是人源或鼠源的立即早期巨細胞病毒啟動子(CMV-IE)，或任選其它來源例如大鼠或豚鼠。CMV-IE啟動子可以包含實際啟動子部分，其可以與增強子部分結合或不結合。可以參考EP-A-260148，EP-A-32359"美國專利號5，168，062，5，385，839和4，968，615，以及PCT申請?zhí)柈?/03905。CMV-IE啟動子有利地是人CMV-IE(BoshartM.等人，Cell.，1985，41，521-530)或鼠類CMV-IE。更一般而言，啟動子具有病毒或細胞來源?？梢栽诒景l(fā)明的實踐中成功使用的除CMV-IE外的強病毒啟動子是SV40病毒的早期/晚期啟動子或勞斯肉瘤病毒的LTR啟動子?？梢栽诒景l(fā)明的實踐中成功使用的強細胞啟動子是細胞骨架的基因的啟動子，例如結蛋白啟動子(KwissaM.等人，Vaccine,2000，18，2337-2344)，或肌動蛋白啟動子(MiyazakiJ.等人,Gene，1989，79，269-277)。這些啟動子的功能亞片段即這些啟動子中保留足夠的啟動活性的部分包括在本發(fā)明內，例如，根據(jù)PCT申請?zhí)朩O98/00166或美國專利號6，156，567的截短的CMV-IE啟動子可以用于本發(fā)明的實踐中。在本發(fā)明的實踐中的啟動子因此包括全長啟動子的衍生物和亞片段，其保留足夠的啟動活性且因此充當啟動子，優(yōu)選地基本上類似于衍生物或亞片段所來源的實際或全長啟動子的啟動活性，例如象美國專利號6，156，567的截短的CMV-IE啟動子的活性類似于全長CMV-IE啟動子的活性。因此，在本發(fā)明的實踐中的CMV-IE啟動子可以包含全長啟動子的啟動子部分和/或全長啟動子的增強子部分、以及衍生物和亞片段，或基本上由其組成，或由其組成。優(yōu)選地，質粒包含其他表達控制元件，或基本上由其他表達控制元件組成。摻入穩(wěn)定序列例如內含子序列是特別有利的，優(yōu)選hCMV-1E的第一個內含子(PCT申請?zhí)朩O89/01036)，兔b-珠蛋白基因的內含子II(vanOoyen等人，Science,1979，206，337-344)。關于用于質粒和除痘病毒外的病毒載體的多腺苷酸化信號(多聚A)，可以使用牛生長激素(bGH)基因的多聚(A)信號(參見美國專利號5，122，458)，或兔P-珠蛋白基因的多聚(A)信號或SV40病毒的多聚(A)信號。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案中，表達載體是用于在合適的細胞系統(tǒng)中體外表達蛋白質的表達載體。所表達的蛋白質可以在培養(yǎng)上清20液中收獲或由培養(yǎng)上清液收獲，在分泌后或不在分泌后進行收獲(如果不存在分泌，那么一般發(fā)生或執(zhí)行細胞裂解)，任選通過濃縮方法例如超濾進行濃縮，和/或通過純化方法例如親和、離子交換或凝膠過濾類型的層析法進行純化。可以在本發(fā)明中使用的宿主細胞包括但不限于肌細胞、角質形成細胞、成肌細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、vero細胞、BHK21、sf9細胞等。本領域技術人員應當理解用于培養(yǎng)宿主細胞的條件根據(jù)特定基因而改變，并且常規(guī)實驗有時是必要的，以測定取決于宿主細胞用于培養(yǎng)豬肺炎支原體的最適條件。"宿主細胞"指已在遺傳上改變，或能夠通過施用外源多核苷酸例如重組質?；蛟泽w而在遺傳上改變的原核或真核細胞。當指的是遺傳上改變的細胞時，該術語指原始改變的細胞及其后代。包含所需序列的多核苷酸可以插入合適的克隆或表達載體內，并且栽體進而可以引入合適的宿主細胞內用于復制和擴增。多核苷酸可以通過本領域已知的任何方法引入宿主細胞內。包含目的多核苷酸的栽體可以通過眾多合適的方法中的任何一種引入宿主細胞內，包括直接攝取，胞吞作用，轉染，f-接合，電穿孔，使用氯化鈣、氯化銣、磷酸釣、DEAE-葡聚糖或其他物質的轉染；微粒轟擊；脂轉染；和感染(當載體是感染性的，例如逆轉錄病毒栽體)。引入載體或多核苷酸的選擇通常將依賴宿主細胞的特征。在一個有利的實施方案中，本發(fā)明提供了施用治療有效量的制劑用于在靶細胞中遞送和表達豬肺炎支原體免疫原。治療有效量的確定是本領域普通技術人員的常規(guī)實驗。在一個實施方案中，制劑包含表達栽體，所述表達載體包含表達豬肺炎支原體免疫原的多核苷酸和藥學或獸醫(yī)學上可接受的載體、媒介物或賦形劑。在一個有利的實施方案中，藥學或獸醫(yī)學上可接受的載體、媒介物或賦形劑促進轉染和/或改善載體或蛋白質的保存。藥學或獸醫(yī)學上可接受的栽體或媒介物或賦形劑是本領域技術人員眾所周知的。例如，藥學或獸醫(yī)學上可接受的栽體或媒介物或賦形劑可以是0.9%NaCl(例如，鹽水)溶液或磷酸鹽緩沖液?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法的其他藥學或獸醫(yī)學上可接受的栽體或媒介物或賦形劑包括但不限于，聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。藥學或獸醫(yī)學上可接受的載體或媒介物或賦形劑可以是促進載體(或在體外由本發(fā)明的栽體表達的蛋白質)的施用的任何化合物或化合物的組合；有利的是，載體、媒介物或賦形劑可以促進轉染和/或改善載體(或蛋白質)的保存。劑量和劑量體積在本文的一般描述中討論，并且也可以由技術人員根據(jù)本公開內容結合本領域中的知識進行確定，而無需過度實驗。有利但并非唯一適合于質粒的包含季銨鹽的陽離子脂質有利地是具有下式的那些RtO-ch"h-ch廠n—r「xorchs其中R:是具有12-18個碳原子的飽和或不飽和的直鏈脂肪族基團，l是包含2或3個碳原子的另一種脂肪族基團，而X是胺或羥基基團，例如DMRIE。在另一個實施方案中，陽離子脂質可以與中性脂質例如DOPE結合。在這些陽離子脂質中，優(yōu)先考慮DMRIE(N-(2_羥乙基)-N，N-二曱基-2，3-雙(十四烷氧基)-l-丙烷銨；WO96/3"09)，有利地結合中性脂質，有利的是D0PE(二油酰-磷脂酰-乙醇胺；BehrJ.P.，1994，BioconjugateChemistry,5，382-389)，以形成DMRIE-D0PE。有利的是，質粒與佐劑的混合物臨時并有利地與制劑的施用同時或在制劑施用前不久形成；例如，在施用前不久形成質粒-佐劑混合物，有利地致使在施用前給予足夠的時間使混合物形成復合物，例如在施用前約10-約60分鐘，例如在施用前約30分鐘。當DOPE存在時，DMRIE:DOPE摩爾比有利地為約"約5-約5:約95,更有利的是約1:約1，例如，1:1。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗有利地包含一種或多種佐劑，或基本上由一種或多種佐劑組成。在本發(fā)明實踐中使用的合適佐劑是(l)丙烯酸或曱基丙烯酸的聚合物、馬來酸酐和烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS),例如具有一個或多個非曱基化的CpG單元的寡脫氧核糖核苷酸序列(KlinmanD,M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,1996，93，2879-2883;W098/16247)，(3)水包油乳劑，例:i口由M.Powell,M.Newman,PlenumPress1995出版的"VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach"的第147頁上描述的SPT乳劑，和同一著作第183頁上描述的乳劑MF59，(4)包含季銨鹽的陽離子脂質，(5)細胞因子，(6)氫氧化鋁或磷酸鋁或(7)皂苷，(8)溴化二甲基雙十八烷基銨(VaccineDesign第157頁)，(9)Aridine(VaccineDesign第148頁)在引用和通過引用合并入本申請的任何文件中討論的其他佐劑，或(8)其任何組合或混合物。特別適合于病毒載體的水包油乳劑(3)可以基于輕液態(tài)石蠟(歐洲藥典類型)，類異戊二烯油例如角鯊烷，角鯊烯，烯烴寡聚化產生的油，例如異丁烯或癸烯，具有直鏈烷基的酸或醇的酯，例如蔬菜油，油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或支鏈脂肪醇或酸的酯，特別是異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以形成乳劑。乳化劑可以是非離子型表面活性劑，例如一方面山梨聚糖、二縮甘露醇(例如無水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油或丙二醇，和另一方面油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥硬脂酸的酯，所述酯任選是乙氧基化的，或聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，例j。Pluronic,例4口L121。丙烯酸或曱基丙烯酸的聚合物(1)優(yōu)選特別與糖或多元醇的聚烯基醚交聯(lián)。這些化合物以術語卡波姆為人所知(Pharmeuropa第8巻，No.2，1996年6月)。本領域技術人員還可以參考美國專利號2，909，462，其描述了與具有至少3個羥基、優(yōu)選不超過8個的多羥基化合物交聯(lián)的此類丙烯酸聚合物，其中至少3個羥基的氫原子由具有至少2個碳原子的不飽和脂肪族基團替換。優(yōu)選的基團是包含2-4個碳原子的那些，例如乙烯基、烯丙基和其他乙烯不飽和基團。不飽和基團其自身可以包含其他取代基，例如甲基。在名稱Carbopol(BFGoodrich,Ohio,USA)下出售的產品是特別合適的。它們與烯丙基蔗糖或與烯丙基季戊四醇交聯(lián)。在它們中，可以提及CarbopolTM974P、934P和971P。在馬來酸酐和烯基衍生物的共聚物中，EMAtm共聚物(Monsanto)是優(yōu)選的，其為馬來酸酐和乙烯的共聚物，其為線性或交聯(lián)的，例如與二乙烯醚交聯(lián)?？梢詤⒖糐.Fields等人，Nature,186:778-780，Jun.4，1960。有用的佐劑比例是本領域技術人員眾所周知的并且容易荻得的。例如，最終疫苗組合物中的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或馬來酸酐和烯基共聚物的濃度將為0.01%-1.5%W/V，更特別地0.05-1%W/V,優(yōu)選0.1-0.4%W/V。在一個有利的實施方案中，佐劑是于2004年7月26日提交且于2005年4月14日作為美國專利公開號2005/0079185公開的美國專利申請序列號10/899，181中公開的佐劑。在一個有利的實施方案中，佐劑是TS6佐劑。任選地根據(jù)本發(fā)明的方法使用的疫苗可以包含細胞因子。細胞因子可以作為蛋白質或作為插入重組病毒載體內的編碼這種細胞因子的基因存在。細胞因子可以在貓科細胞因子中進行選擇，例如貓白介素18(fIL-18)(TaylorS.等人，DNASeq.，2000，10(6)，387-394)，fIL-16(LeuteneggerC.M.等人，DNASeq.，1998，9(1)，59-63)，fIL-12(FehrD.等人,DNASeq.，1997，8(1-2)，77-82;Im謹raT.等人，J.Vet.Med.Sci.，2000，62(10)，1079-1087)和貓科GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)(GenBankAF053007)。在一個具體實施方案中，藥物組合物直接在體內施用，并且編碼的產物由栽體在宿主中進行表達。有利的是，根據(jù)本發(fā)明的藥物和/或治療組合物和/或制劑包含引發(fā)治療反應有效量的如本文所討論的一種或多種表達載體和/或多肽，或基本上由其組成，或由其組成；有效量可以根據(jù)本公開內容，包括合并入本文的文件，和本領域的知識進行確定，而無需過度實驗。24在基于質粒載體的治療和/或藥物組合物的情況下，一般而言，劑量可以包含下述量的表達豬肺炎支原體免疫原的質粒，基本上由其組成，或由其組成約1約2000Pg，優(yōu)選約50約1000Jig，和更優(yōu)選約100Pg-約800Pg。當基于質粒載體的治療和/或藥物組合物用電穿孔施用時，質粒的劑量一般為約0.1Pg-1mg，有利的是約1100有利的是約2Pg-50Pg。治療和/或藥物組合物每劑包含約104-約1011，有利的是105-約10"，和更更有利的是約106-約l(T表達豬肺炎支原體免疫原的重組腺病毒的病毒顆粒。在基于痘病毒的治療和/或藥物組合物的情況下，劑量可以為約102pfu-約109pfu。藥物組合物每劑包含約105-109，有利的是約106-108pfu表達豬肺炎支原體免疫原的痘病毒或皰滲病毒重組體。本領域技術人員應當理解本文的公開內容通過舉例方式提供，并且本發(fā)明并不限于此。根據(jù)本文的公開內容和本領域的知識，技術人員可以確定施用次數(shù)、施用途徑、和對于每種注射方案待使用的劑量，而無需過度實驗。本發(fā)明預期了給動物施用至少一次有效量的根據(jù)本發(fā)明制備的治療組合物。動物可以是雄性的、雌性的、妊娠雌性和新生兒。這種施用可以經由各種途徑，包括但不限于肌內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)注射或經由鼻內或經口施用。根據(jù)本發(fā)明的治療組合物還可以通過無針裝置(例如用Pigjet、Biojector或Vitajet裝置(Bioject，Oreg.，USA))進行施用。施用質粒組合物的另一種方法是使用電穿孑L(參見，，J:i口，S.Tollefsen等人Vaccine,2002，20，3370—3378;S.Tollefsen等人Scand.J.Immunol.,2003，57,229-238;S.Babiuk等人，Vaccine,2002，20,3399-3408;PCT申請?zhí)朩O99/01158)。在另一個實施方案中，質粒通過基因槍或金顆粒轟擊遞送給動物。在一個有利的實施方案中，動物是豬。有利的是，豬肺炎支原體疫苗施用于斷奶的豬(約2-3周齡)。豬可以是約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19日齡、約20、約21、約22、約23、約24日齡。必要時25可以在第一次施用后約3-5周進行加強施用。在另一個有利的實施方案中，本發(fā)明的豬肺炎支原體疫苗施用于母豬，從而使得小豬獲得針對豬肺炎支原體的免疫性。施用是皮膚的(表皮和真皮)或皮下的(皮下組織和/或皮下和/或肌內)，有利地在頸部，更有利地在耳尾側的頸部區(qū)域中。這種施用途徑可以允許將免疫原靶向至樹突狀朗格漢斯細胞。液體噴射無針注射器是通過微小孔口在高壓下執(zhí)行特定量液體注射的設備。注射器的機械規(guī)格可以調節(jié)或選擇，以便控制穿透組織的深度。使用注射器或無針注射器施用液體導致液體在組織中的不同分布。使用注射器(syringe)導致局限性團塊或池。使用注射器(injector)導致在耙向組織的層中彌散分布，如WO-A-01/13975中舉例說明的。在一個有利的實施方案中，無針注射是DERMA-VACNF透皮接種器系統(tǒng)。穿透深度主要由液體壓力控制。這種液體壓力取決于注射器的機械規(guī)格，例如彈簧或任何其他推進工具的強度以及活塞和噴嘴孔口的直徑。這對于本領域技術人員是容易獲得的。注射深度可以在優(yōu)選具有與預期疫苗相同粘度的有色液體施用后，通過對注射部位的組織(優(yōu)選對應疫苗待施用的位置，和測試有利的是對與待接種疫苗的群體相同的物種和年齡的動物進行)進行解剖而容易地確定。這種測試可以直接用進一步包含染料的預期疫苗來進行。這種測試允許本領域技術人員調整注射器的機械規(guī)格。無針注射器可以配備包含一個或數(shù)個噴嘴的頭部。數(shù)個噴嘴的使用允許增加疫苗在更大面積上的分散模式。可以存在l-10個噴嘴，優(yōu)選1-6個。幾種注射器是商購可得的。Vitajet3(BiojectInc.)特別適合于根據(jù)本發(fā)明的方法。使用配備允許標準小瓶或安瓿直接配合注射器的工具的注射器是有利的。另外，疫苗小瓶可以包含幾個疫苗劑量，允許使用注射器和同一小瓶幾次注射疫苗和/或給幾個動物接種疫苗。因此，注射器優(yōu)選26能夠執(zhí)行從同一小瓶的連續(xù)注射。在本發(fā)明的一個方面，針對豬肺炎支原體的疫苗接種可以與針對另一種豬疾病的疫苗接種結合。疫苗包含根據(jù)本發(fā)明的豬肺炎支原體疫苗和能夠保護對抗其他豬疾病的疫苗組分。注射的劑量體積可以是約0.1ml-約1.0ml,優(yōu)選地約0.1ml-約0.8ml,更優(yōu)選地約0.2ml-約0.5ml。才艮據(jù)定義，一劑的體積意指一次施用于一個動物的疫苗總體積。疫苗可以包含約1045-約108°TCIDs。/劑(50%組織培養(yǎng)感染劑量/劑疫苗)和優(yōu)選地約1055_約10"TCIDs。/劑。任選地，必要或需要時，可以以合適的間隔作為加強施用進行重復施用，例如在第一次施用后約2-約8周，和優(yōu)選在第一次施用后約3_約5周。加強施用還可以每年重復進行，特別是對于母豬。本發(fā)明的另一個目的是使用有效量的如上所述的豬肺炎支原體疫苗和可接受的媒介物或稀釋劑，用于制備設計為如上所述使用液體噴射無針注射器施用于動物的疫苗，并且導致引發(fā)針對豬肺炎支原體的安全的和保護性的免疫應答。另一個目的是疫苗接種試劑盒或套組，其包含此類液體噴射無針注射器和至少一個包含豬肺炎支原體疫苗的疫苗小瓶，可操作地裝配以執(zhí)行給豬科的動物施用疫苗。疫苗的分布基本上在真皮和皮下組織中完成。此類疫苗接種試劑盒或套組能夠引發(fā)針對豬肺炎支原體的安全的和保護性的免疫應答。本發(fā)明現(xiàn)在將通過下述非限制性實施例進行進一步描述。實施例1:新豬肺炎支原體菌苗的無針透皮遞送的功效和安全性豬肺炎支原體仍是豬中的呼吸系統(tǒng)疾病的主導病因之一。疫苗接種現(xiàn)在是全球標準管理實踐的組成部分。將增加疫苗接種程序的總效率的任何改善將是非常需要的。這些將包括通過新制劑和抗原呈遞改善的疫苗功效，改善的依從性、對于動物和疫苗接種者改善的安全性、和消除針在最終產物中的危險(參見，例如，AlmondG.W.和J.D.Roberts,2004，AssessmentofaNeedlelessInjectionDeviceforIronDextranadministrationtopiglets,ProceedingsoftheIPVS，618;HouserT.A.，J.G.Sebranek,T.J.Baas,B.J.Thacker，D.Nilubol和E.Thacker，2002，F(xiàn)easibilityofTransdermal,NeedlelessInjectionsforPreventionofPorkCarcassDefectshttp://www.ipic.iastate.edu/reports/02swinereports/as1-1814.pdf;MeredithM.J.，2004，AASVNewarchive,Needle-FreeVaccinationhttp://www,aasp.org/news/stroy.phpid=1279;SweatJ.M.,M.Abdy，B.G.Weniger，R.Harrington,B.Coyle，R.A.Abuknesha和E.P.J.Gibbs，2000，SafetyTestingofNeedleFree,JetInjectionDevicestoDetectContaminationwithBloodandOtherTissueFluids,AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences916:681-682和WillsonP.，2004,CouncilResearchNews,Needle-FreeImmunizationasEffectiveasNeedleandSyringeMethodhttp://www.manitobapork.com/admin/docs/research—news一ly.pdf)。特另U設計為使用DERMA-VACTMNFTransdermalVaccinatorSystem透皮施用的新制劑的長期功效和安全性在這個實施例中呈現(xiàn)。無針施用具有解決這些目的的安全性和質量方面以及提供疫苗向免疫系統(tǒng)的優(yōu)化呈遞的潛力(參見，例如，CharreyreC.，F(xiàn).Milward，R.Nordgren和G.Royer,2005，DemonstrationofefficacyinpigsofMycoplasmahyopneumoniaeexperimentalvaccinesbyaninnovativeneedle—freeroute,ProceedingsoftheAmericanAssociationofSwineVeterinarians)。16-19日齡的48頭常規(guī)豬從源自低豬肺炎支原體發(fā)病率豬群的常規(guī)圖(dam)獲得。疫苗接種用DERMA-VACNFTransdermalVaccinatorSystem來進行。這種設備使用壓縮空氣以遞送O.5ml特別配制的菌苗。在耳尾側的頸部區(qū)域中用配制用于無針施用的豬肺炎支原體菌苗對豬進行注28射。疫苗在動物到達試驗場所當天(第o天)進行施用。豬按照平行實驗組(replicate)分圏飼養(yǎng)，平行實驗組中的所有成員由同窩出生的仔畜組成。在平行實驗組內將豬隨機分配到處理組，從而使得平行實驗組中的每個處理組有相同表現(xiàn)*組1(24頭豬)由未疫苗接種的對照組成。，組2(24頭豬)通過透皮途徑進行疫苗接種。豬詞養(yǎng)在適合于其年齡和大小的環(huán)境控制的建筑物中。從第0天到笫21天，豬飼養(yǎng)在前保育室(pre-nursery)內固邊圍欄中架高的、商業(yè)化的豬用塑料槽式地板上。從第21天直到第51天，豬飼養(yǎng)在常規(guī)保育室中。保育室設施利用在凹坑上具有電鍍金屬木柵門圍欄的商業(yè)化的豬用塑料槽式地板。從第51天到尸檢(第189、190或191天)，豬飼養(yǎng)在利用在凹坑上具有電鍍金屬木柵門圍欄的混凝土板條的最后建筑物中。在研究至始至終維持平行圏養(yǎng)。祠料和水可隨意獲得。在第2天(實驗場外)，第21、42、125、155天(攻擊前)，以及在第189、190或191天(尸檢當天)采集血液樣品。檢測來自血液樣品的血清以測定豬肺炎支原體ELISA抗體滴度。在第160和161天時，所有豬用25ml豬肺炎支原體肺勻漿以1/100稀釋度用Friis(豬肺炎支原體232林)進行鼻內攻擊。在第162天時，豬經由鼻內途徑接受20ml豬肺炎支原體SC2林的預先冷凍的培養(yǎng)物。攻擊材料用注射器施用到用手限制的、警醒的豬的雙側鼻孔開口中。在尸檢時，取出肺、進行拍照并就豬肺炎支原體特征性的肺炎組織的百分比進行評分。肺由對處理指定不知情的2個不同個體進行獨立評分。特別地，對于每個動物測定損傷累及的肺的總百分比。肺炎組織的百分比通過前(cranial)葉、中葉和下(caudal)葉的背側和腹側表面以及副葉的所有可視表面的目視觀察進行評估。肺炎組織中的損傷百分比的計算基于如表1中所示的每個葉表示的總肺質量的百分比。表1:用于計算肺炎組織中的損傷百分比的每個葉表示的總肺質量的百分比。左前葉7%左中葉7%左尾葉30%右前葉12%右中葉7%右尾葉32%副葉5%在一個分開的現(xiàn)場安全性研究中，位于美國的3個不同地理區(qū)域(MO、PA、NC)中的商業(yè)場所的663頭豬用配制用于無針施用的Merial豬肺炎支原體菌苗的2個不同許可前系列之一進行疫苗接種。菌苗使用DE醒-VACNFTransdermalVaccinatorSystem進行施用。就注射后的全身不良事件對豬進行觀察。在所有豬中在第1、3、7、14和21天時以及在具有持續(xù)注射部位腫脹的豬中在第34或35天時目測和通過觸診觀察注射部位。在功效研究中，來自組1的1頭豬在第162天時在損傷后被去除。由于存在過度粘著，來自組1中的另外1頭豬的肺評分未包括在分析中。最終組大小是*組1,未疫苗接種的對照，23頭豬(血清學)，"頭豬(肺評分)*組2，測試疫苗透皮，24頭豬在對照組中豬肺炎支原體抗體的平均ELISA抗體滴度保持在被認為陰性的值直至攻擊后。測試疫苗接種的豬到疫苗接種后第21天時已血清轉化至抗體陽性狀態(tài)，保持陽性直到笫1"天，在第1"天抽血時進入懷疑狀態(tài)并顯示實質性的攻擊后既往應答(表2)。表2:隨時間的平均豬肺炎支原體ELISA抗體滴度。第2天第21天第42天第125天第155天第189-191天組1對照<0.0010.030.050.110.180.64組2測試疫苗0.0000.450.570.510.331.30對照組中的肺炎組織的平均百分比為4.35%,相對于疫苗接種組的1.72%(表3)。用經由透皮途徑施用的豬肺炎支原體菌苗接種的豬顯示出顯著低于(p<0.05)未接種疫苗的對照中觀察到的肺炎肺損傷百分比。在現(xiàn)場安全性研究期間，未觀察到與疫苗接種相關的全身不良事件?？捎|及的注射部分腫脹是佐劑化菌苗典型的現(xiàn)象，并且到疫苗接種后第35天降至可忽略的水平。表3:肺中肺炎組織的平均百分比和標準偏差。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>在3周齡前施用單次疫苗注射后160天，使用DERMA-VACNFTransdermalVaccinatorSystem施用的豬肺炎支原體菌苗安全和顯著地保護豬對抗豬肺炎支原體攻擊。用DERMA-VACNFTransdermalVaccinatorSystem施用的豬肺炎支原體菌苗的總體安全性也在現(xiàn)場條件下在大量動物中得到證實。新DERMA-VACNFTransdermalVaccinatorSystem提供了特別配制用于無針使用的豬肺炎支原體疫苗的獨特呈遞，實現(xiàn)安全、便利和有效的疫苗接種方案。實施例2:將以通過ELISA測定的不同免疫原劑量，用根據(jù)美國專利申請?zhí)?005/0079185的TS6水包油乳劑配制的豬肺炎支原體菌苗通過肌內途徑(IM)用注射器和針(2ml)或通過透皮途徑(ID)用無針設備(0.5ml)在頸部區(qū)域中施用于16-19日齡的小豬。無針注射器是具有#3噴嘴的DERMA-VACNF透皮疫苗接種器系統(tǒng)。豬在免疫接種后35天時通過氣管內施用以Friis培養(yǎng)基l/100稀釋的10ml豬肺炎支原體(232抹)肺勻漿，和在免疫接種后36天時通過鼻內途徑施用10ml相同懸浮液進行攻擊。免疫接種后61-62天，對豬進行尸檢，并且如實施例1中所述對肺損傷進行評分。31<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>在對應疫苗1-3中每一種的組中，與對照組比較，肺炎肺組織的百分比顯著減少(p<0.0001)。在疫苗接種組1、2和3中的損傷評分沒有不同。無針注射器的使用允許疫苗中免疫原劑量減少1/4。本發(fā)明通過下述編號段落進行進一步描述1.引發(fā)針對豬肺炎支原體的安全的和保護性的免疫應答的方法，其包括用液體噴射無針注射器給豬科動物施用單劑量的疫苗，所述疫苗包含滅活的豬肺炎支原體和佐劑。2.根據(jù)段落l的方法，其中所述佐劑是TS6佐劑。3.根據(jù)段落1或2的方法，其中所述豬科動物是斷奶小豬。4.根據(jù)段落3的方法，其中所述斷奶小豬是約11-約24日齡。5.根據(jù)段落3的方法，其中所述斷奶小豬是約2-3周齡。6.根據(jù)段落1-5中任一的方法，其中所述豬科動物是母豬。7.根據(jù)段落1-5中任一的方法，其中所述無針注射器是DERMA-VACNF注射器。8.疫苗接種試劑盒或套組，其包含液體噴射無針注射器和至少一個包含豬肺炎支原體疫苗的疫苗小瓶，可操作地裝配以執(zhí)行給豬科動9.段落8的疫苗接種試劑盒或套組，其包含段落l-7中任一的組合物和用于執(zhí)行段落1_7中任一的方法的說明書。***盡管已詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但應當理解由上述段落限定的本發(fā)明不限于上文說明書中闡述的具體細節(jié)，因為無需背離本發(fā)明的精神或范圍其許多顯而易見的變化是可能的。權利要求1.引發(fā)針對豬肺炎支原體的安全的和保護性的免疫應答的方法，其包括用液體噴射無針注射器給豬科動物施用單劑量的疫苗，所述疫苗包含滅活的豬肺炎支原體和佐劑。2.根據(jù)權利要求l的方法，其中所述佐劑是TS6佐劑。3.根據(jù)權利要求l的方法，其中所述豬科動物是斷奶小豬。4.根據(jù)權利要求2的方法，其中所述豬科動物是斷奶小豬。5.根據(jù)權利要求3的方法，其中所述豬科動物是斷奶小豬。6.根據(jù)權利要求4的方法，其中所述斷奶小豬是約11-約24日齡,齡,7.根據(jù)權利要求5的方法，其中所述斷奶小豬是約11-約24日8.根據(jù)權利要求4的方法，其中所述斷奶小豬是約2-3周齡。9.根據(jù)權利要求5的方法，其中所述斷奶小豬是約2-3周齡。10.根據(jù)權利要求l的方法，其中所述豬科動物是母豬。11.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述無針注射器是DERMA-VACNF注射器。12，疫苗接種試劑盒或套組，其包含液體噴射無針注射器和至少一個含有豬肺炎支原體疫苗的疫苗小瓶，可操作地裝配以執(zhí)行給豬科動物13.權利要求12的疫苗接種試劑盒或套組，其中所述佐劑是TS6佐劑。14.權利要求12的疫苗接種試劑盒或套組，其中所述無針注射器是DERMA-VACNF注射器。15.權利要求13的疫苗接種試劑盒或套組，其中所述無針注射器是DERMA-VACNF注射器。全文摘要本發(fā)明提供了通過給斷奶小豬或母豬施用單劑量的有效量的豬肺炎支原體疫苗而對豬接種疫苗以對抗豬肺炎支原體的新方法。豬肺炎支原體疫苗可以是完整或部分細胞滅活或經修飾的活制劑、亞單位疫苗、或核酸或DNA疫苗。文檔編號A61K39/02GK101448521SQ200780013976公開日2009年6月3日申請日期2007年2月27日優(yōu)先權日2006年3月3日發(fā)明者C·沙雷爾,F·W·米爾沃德,G·C·羅耶,R·豪塞爾申請人:梅瑞爾有限公司