專(zhuān)利名稱(chēng)：：假性感染性黃病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，病毒學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。一般而言，本發(fā)明公開(kāi)了屬于黃病毒科的復(fù)制缺陷病毒的構(gòu)建和它們作為疫苗在預(yù)防由屬于該科的病毒引起的疾病中的用途。更特別地，本發(fā)明提供了復(fù)制缺陷黃病毒或假性感染性黃病毒(PIVakaRepliVAX)并公開(kāi)了其作為針對(duì)黃病毒相關(guān)疾病的預(yù)防性疫苗的用途。相關(guān)領(lǐng)域的描述黃病毒科的黃病毒屬包含了多種重要的人和動(dòng)物病原體，并且基于免疫學(xué)測(cè)試中的反應(yīng)性差異分類(lèi)為四種不同的抗原復(fù)合物。通常，黃病毒在禽類(lèi)或哺乳動(dòng)物擴(kuò)增宿主和蚊子或蜱(tick)載體之間循環(huán)。黃病毒基因組是缺少3'端聚(A)序列的陽(yáng)性極性的單鏈戴帽的RNA。它編碼單個(gè)多肽，所述單個(gè)多肽在翻譯時(shí)或翻譯后加工為病毒結(jié)構(gòu)蛋白，C、prM/M和E,形成病毒顆粒，和病毒基因組復(fù)制和包裝為感染性病毒體所需要的非結(jié)構(gòu)蛋白，NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5(Chambers,1990)。病毒體(virions)包含病毒基因組RNA的單個(gè)拷貝，所述病毒基因組RNA包裝為含C蛋白的核殼，被具有M和E蛋白的異源二聚體的脂質(zhì)體被膜包圍。與許多其它被膜病毒相比，核殼和被膜刺突之間的反應(yīng)不是非常特異性的，并且含M/E^f皮膜可在源于異源黃病毒的核殼周?chē)行纬?，證實(shí)了衣殼序列的有限水平的同源性(Lorenz,2002)?；蛘撸跊](méi)有C的情況下prM和E的表達(dá)可導(dǎo)致形成亞病毒顆粒(SVPs),其不包含RNA或C蛋白(Mason,1991)。生產(chǎn)亞病毒顆粒的prM/M-E盒已成為本領(lǐng)域已知的幾種疫苗候選物的基礎(chǔ)。這些疫苗候選物包括亞基(Konishi,1992;2001;2002;Qiao,2004),DNA(Phillpotts,1996;Kochel,1997;Schmaljohn,1997;Colombage,1998;Aberle,1999;Konishi,2000;Konishi,2000;Kochel,2000;Davis,2001),活載體(Mason,1991;Konishi,1992;Pincus,1992;Fonseca,1994;Pugachev,1995;Colombage,1998;Kanesa,2000;Minke,2004)疫苗。但是，這些疫苗具有嚴(yán)重的缺點(diǎn)。例如，亞基疫苗是使用安全的，但難以大量生產(chǎn)；DNA疫苗免疫原性很弱，病毒載體疫苗在存在載體免疫性時(shí)缺乏效價(jià)。因此，盡管人們非常關(guān)注黃病毒相關(guān)疾病和黃病毒持續(xù)擴(kuò)散到新領(lǐng)域，對(duì)于這些感染仍然沒(méi)有開(kāi)發(fā)出抗病毒治療劑，并且至今只生產(chǎn)出了非常有限量的批準(zhǔn)疫苗。失活病毒疫苗(INVs)已被批準(zhǔn)用于防止蜱傳腦炎(TBEV)和日本腦炎(JEV)。然而，像其它失活病毒疫苗一樣，這些疫苗具有低的有限的效價(jià)并且需要多次疫苗接種。盡管有這些缺陷，日本腦炎和蜱傳腦炎INVs具有好的安全性記錄的優(yōu)點(diǎn)。唯一批準(zhǔn)的針對(duì)黃病毒的活減毒疫苗(LAV)是廣泛應(yīng)用的基于黃熱病病毒(YFV)17D株的活減毒疫苗，所述黃熱病病毒17D抹是通過(guò)黃熱病病毒的野生型Asibi抹在雞胚組織中連續(xù)傳代而發(fā)展出的。盡管這種活減毒疫苗被認(rèn)為是非常安全和有效的，接種者中黃熱病的例子還是有報(bào)導(dǎo)，包括最近在美國(guó)新兵招募中的出現(xiàn)的例子(Gerasimon,2005)。而且，這種疫苗不推薦用于嬰兒、孕婦和免疫受損的個(gè)體中，因?yàn)橛懈狈磻?yīng)，包括疫苗相關(guān)腦炎。然而，黃病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的發(fā)展已經(jīng)引起了基于這些病毒的合理減毒的新型活減毒疫苗的生產(chǎn)和設(shè)計(jì)。這種新型的疫苗包括基于黃熱病病毒17D的嵌合體，其中黃熱病病毒prM-E-編碼基因組片段盒已被源于異源黃病毒的prM-E-盒取代(Chambers,1999)。類(lèi)似的基于嵌合病毒的方法應(yīng)用于基于登革熱和TBE的骨架(Pletnev,2002;Huang,2003)。在大多數(shù)例子中，嵌合黃病毒證實(shí)為高度減毒的表型并且能夠引起有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)并且在病毒感染之后進(jìn)行保護(hù)，所述病毒的結(jié)構(gòu)蛋白^L嵌合體表達(dá)(Monath,2002)。這些嵌合疫苗候選物的有效免疫接種沒(méi)有顯示出被預(yù)先存在的"載體"免疫性預(yù)防(Monath,2002),其干擾基于其它病毒載體的重組病毒疫苗的效價(jià)。而且，盡管嵌合黃病毒可能提供了相當(dāng)普遍的生產(chǎn)新疫苗的方法，仍然存在關(guān)于嵌合體自身可能至少在免疫受損個(gè)體中是致病性的考慮(Chambers,1999)，或存在可能會(huì)產(chǎn)生致病性嵌合體的考慮，因?yàn)樵谶@些病毒的繁殖過(guò)程中已經(jīng)檢測(cè)到突變(Pugachev,2004)。另一種在疫苗開(kāi)發(fā)中有前途的方向是基于在黃病毒基因組中產(chǎn)生不可修復(fù)的缺失，其使得被免疫宿主中的生產(chǎn)性病毒復(fù)制效率更低或成為不可能事件。在后一個(gè)情形中，編碼整個(gè)復(fù)制性機(jī)構(gòu)但缺少例如C-編碼區(qū)的病毒基因組可為體內(nèi)免疫而被遞送，其作為能夠自我復(fù)制的體外合成的RNA(Kofler,2004;Aberle,2005)，或可能地，以在RNA聚合酶II啟動(dòng)子的控制下的DNA形式或作為體外合成的RNA,并且其能夠自我復(fù)制(Kofler，2004;Aberle,2005)。用體外合成的缺陷性RNA基因組的直接免疫(其明確了在不存在完整病毒復(fù)制循環(huán)時(shí)SVPs的生產(chǎn))，已被證明在產(chǎn)生保護(hù)性免疫性中是安全和有效的(Kofler,2004;Aberle,2005)。但是，因?yàn)楹铣?、穩(wěn)定性和遞送的問(wèn)題，在生產(chǎn)基于RNA的疫苗候選物時(shí)可能存在顯著的障礙。因而，現(xiàn)有技術(shù)對(duì)于可用于針對(duì)由屬于黃病毒科的病毒感染引起的疾病的安全、有力和有效類(lèi)型的疫苗是有缺陷的。本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域長(zhǎng)期以來(lái)的需求和期望。發(fā)明概述在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了黃病毒科的復(fù)制缺陷4叚性感染性病毒。所述復(fù)制缺陷假性感染性病毒包含編碼衣殼(C)蛋白的核普酸序列中的缺失，所述缺失不破壞基因組環(huán)化所需要的RNA序列；prM/M的正常成熟所需要的prM蛋白的信號(hào)序列，或其組合，所述復(fù)制缺陷假性感染性病毒僅僅在表達(dá)黃病毒科病毒的C蛋白或C、prM、被膜蛋白、突變C蛋白、突變prM、突變被膜蛋白或其組合的細(xì)胞中復(fù)制。在本發(fā)明的另一相關(guān)實(shí)施方式中，提供了有效表達(dá)黃病毒科病毒的C蛋白或C、prM、被膜蛋白、突變C蛋白、突變prM、突變被膜蛋白或其組合的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，使上述黃病毒科的復(fù)制缺陷假性感染性病毒能夠在適當(dāng)條件下繁殖。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供了生產(chǎn)上述黃病毒科的復(fù)制缺陷假性感染性病毒的方法。所述方法包括產(chǎn)生黃病毒科的復(fù)制缺陷假性感染性病毒，所述病毒包含衣殼基因中的缺失，所述缺失不破壞基因組環(huán)化所需要的RNA序列，prM/M的正常成熟所需要的prM蛋白的信號(hào)序列，或其組合；產(chǎn)生表達(dá)黃病毒科病毒的C蛋白或C、prM、被膜蛋白、突變C蛋白、突變prM、突變被膜蛋白或其組合的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系提供高水平的黃病毒蛋白，所述蛋白為黃病毒科的復(fù)制缺陷假性感染性病毒的繁殖所需要；并且用黃病毒科的假性感染性病毒感染細(xì)胞系，從而生產(chǎn)黃病毒科復(fù)制缺陷假性感染性病毒。在本發(fā)明的另一相關(guān)實(shí)施方式中，提供了藥物組合物，其包含由本文描述的方法生產(chǎn)的黃病毒科的復(fù)制缺陷假性感染性病毒。在本發(fā)明的進(jìn)一步相關(guān)的實(shí)施方式中，提供了保護(hù)受試者免受由暴露于黃病毒引起的感染的方法。所述方法包括給予受試者免疫有效量的由本文描述的方法生產(chǎn)的藥物組合物，其在受試者中引起針對(duì)黃病毒的免疫反應(yīng)，從而保護(hù)受試者免受感染。附圖簡(jiǎn)述圖1是在生產(chǎn)C或用于缺陷的反式互補(bǔ)的所有病毒結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞中黃病毒PIV復(fù)制的圖示。PIVs在正常細(xì)胞中體內(nèi)或體外的復(fù)制導(dǎo)致不具有核殼的SVPs的釋放。圖2A-2C顯示表達(dá)YFVC以及YFVC、prM和E的細(xì)胞系可補(bǔ)助YFPIV復(fù)制。圖2A是表達(dá)YFV和GFP的YFPIV基因組的圖示。圖2B是表達(dá)具有prM信號(hào)肽的Pac基因和YFVC(錨定的C;VEErep/Cl/Pac)，或具有20a.a.的prM的錨定的C(VEErep/C2/Pac),或所有YFV結(jié)構(gòu)蛋白(VEErep/C-prM-E/Pac)的VEEV復(fù)制子的圖示。圖2C顯示了YFPIV被用體外合成的PIV基因組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的釋放。在顯示的時(shí)間點(diǎn)替換培養(yǎng)基，測(cè)定PIVs滴度。箭頭顯示了細(xì)胞以1:5的比例更替繼代接種的時(shí)間點(diǎn)。圖3A-3B顯示了在包裝細(xì)胞系上的YFPIV的生長(zhǎng)曲線。用顯示的每細(xì)胞感染單位MOIs的YFPIV感染包含VEErep/C2/Pac和VEErep/C-prM-E/Pac復(fù)制子的BHK-21細(xì)胞。在顯示的時(shí)間時(shí)，培養(yǎng)基被替換并且確定釋放的PIV的滴度。箭頭顯示了當(dāng)細(xì)胞以l:5的比例更替繼代接種時(shí)的時(shí)間點(diǎn)。圖3A顯示了在M0110inf.u/細(xì)胞時(shí)的生長(zhǎng)曲線并且圖3B顯示了在M010.1inf.u/細(xì)月包時(shí)的生長(zhǎng)曲線。圖4A-4C顯示了表達(dá)密碼子優(yōu)化的C基因的細(xì)胞生產(chǎn)的YFPIV。圖4A顯示了合成基因的核苷酸序列。引入的突變通過(guò)小寫(xiě)字母表示(SEQIDNO:l)。圖4B顯示了在包裝細(xì)胞系上的YFPIV的生長(zhǎng)曲線。用顯示的每細(xì)胞感染單位MOIs的YFPIV感染包含VEErep/C2/Pac、VEErep/C-prM-E/Pac、VEErep/C2opt/Pac和VEErep/Copt-prM-E/Pac復(fù)制子的BHK-21細(xì)胞。在顯示的時(shí)間替換培養(yǎng)基并確定釋放的PIV滴度。圖4C顯示了在37°C接種4天后YFV和YFPIV在包含VEErep/C2opt/Pac的細(xì)胞系中發(fā)展的噬菌斑。圖5A-5C顯示了WNPIV在包裝細(xì)胞中發(fā)展了彌漫性感染。圖5A是WNPIV基因組和表達(dá)WNV結(jié)構(gòu)基因的VEEV復(fù)制子的圖示。圖5B顯示了接種70小時(shí)后WNPIV生產(chǎn)WNV抗原陽(yáng)性細(xì)^^的集落(用NS1抗體-針對(duì)BHK(VEErep/C氣E、Pac)細(xì)胞感染顯示)。圖5C顯示了相同的WNPIV制劑針對(duì)Vero細(xì)胞單層感染僅僅生產(chǎn)單獨(dú)感染細(xì)胞(在感染之后70小時(shí)用與圖5B使用的相同黃芪膠染色方法顯示)。圖6A-6C顯示對(duì)于從用YF和WNPIVs感染的細(xì)胞釋放的E蛋白的檢測(cè)。在圖6A中，用5inf.u/細(xì)胞MOI的YFPIV感染BHK-21細(xì)胞。釋放的SVPs;故收獲并通過(guò)超速離心而純化。樣品通過(guò)SDSPAGE溶解，轉(zhuǎn)移到濾器，通過(guò)D1-4G2MAB檢測(cè)E蛋白。第一道，從未感染細(xì)胞收獲的培養(yǎng)基；第二道，感染48小時(shí)后從用YFPIV感染的細(xì)胞中收獲的培養(yǎng)基；第三道，感染72小時(shí)后從用YFPIVs感染的細(xì)胞中收獲的培養(yǎng)基；第四道，YFV(2X107PFU)。圖6B中，用WNPIV感染vero細(xì)月包24小時(shí),并且然后澄清培養(yǎng)液(在檢測(cè)任何細(xì)胞裂解之前收集)的部分，通過(guò)SDSPAGE溶解，轉(zhuǎn)移到濾器，并與E-特異性MAB反應(yīng)(7H2;Bioreliance)。相同樣品與多克隆血清的反應(yīng)沒(méi)有顯示在這種制劑中的任何細(xì)胞相關(guān)非結(jié)構(gòu)蛋白(結(jié)果未顯示)，確認(rèn)了E蛋白^L活3夭地分泌。第一道，WNV樣品；第二道，從未感染細(xì)胞中收獲的培養(yǎng)基；第三道，感染48小時(shí)后從用WNPIV感染的細(xì)胞中收獲的培養(yǎng)基。在圖6C中，western印跡顯示了獲自用YFVPIVRNA電穿孔的正常(非包裝)BHK細(xì)胞的SVPs的蔗糖密度梯度中制備的部分的E蛋白成分。E蛋白反應(yīng)的峰(在32%蔗糖時(shí))相應(yīng)于SVPs密度，并與這種事實(shí)一致，比在并行分析(42%)中運(yùn)行的YFV遷移得更慢。圖7A-7F顯示了用于黃熱病(YF)和西尼羅河(WN)假性感染性病毒(PIV)生產(chǎn)的質(zhì)粒的圖示。圖7A顯示pYFPIV,圖7B顯示pWNPIV,圖7C顯示pVEErep/Cl/Pac,圖7D顯示pVEErep/C2/Pac，圖7E顯示pVEErep/C3/Pac,圖7F顯示pVEErep/C*-E*-Pac。圖8A-8V顯示本文使用的質(zhì)粒的序列。圖8A-8D顯示pYFPIV的序列(SEQIDNO:6)，圖8E-8H顯示pVEErep/Cl/Pac的序列(SEQIDNO:7)，圖8I-8K顯示pVEErep/C2/Pac的序列(SEQIDNO:8)，圖8L-80顯示pVEErep/C陽(yáng)prM畫(huà)E/Pac的序列(SEQIDNO:9),圖8P-8R顯示pVEErep/C2opt/pac的序列(SEQIDNO:10)，圖8S-8V顯示pVEErep/C叩t-prM-E/Pac的序列(SEQIDNO:11)。圖9顯示用于反式(intrans)提供C的RepliVAX和VEE的重疊區(qū)域的圖示。1三十六種突變被插入VEErep/pac-Ubi-C*以最小化與RepliVAX基因組編碼的C片l殳的同源重組。25，和3，CS序列在RepliVAX基因組中的位置。圖10顯示了在第0代(從電穿孔開(kāi)始)和第10代通過(guò)WNRepliVAX在C-表達(dá)細(xì)胞系(BHK(VEErep/Pac-Ubi-C")中生產(chǎn)的感染性集落的并行(sidebyside)的比較，顯示出更好生長(zhǎng)的變體被容易地選擇出。圖11顯示在包含C-表達(dá)盒(VEErep/Pac-Ubi-C"的WHO-檢定(certified)的Vero細(xì)胞中生產(chǎn)的RepliVAXPIV的滴定。盡管產(chǎn)生的PIV比在BHK細(xì)胞中生產(chǎn)的滴度稍低，Vero細(xì)胞使高滴度PIV的收獲成倍增加，這對(duì)于BHK細(xì)胞是不可能的。圖12A-12B顯示了環(huán)化突變體。圖12A顯示具有單石咸基，匹配的CS突變的WNV/IRES-RLuc復(fù)制子的復(fù)制顯示一些單堿基突變以WT水平復(fù)制。圖的左邊部分顯示了在5'和3'CS序列之上的測(cè)試基因組。右邊顯示了利用Rluc報(bào)告基因檢測(cè)的復(fù)制水平，以WT復(fù)制水平的百分比表示。下劃線堿基表示突變的堿基。圖12B顯示源于通過(guò)組合ml0和ml3(圖A)的具有匹配雙堿基改變(ml7)的WNV/IRES-RLuc復(fù)制子的復(fù)制，與以每種可能的模式組合WT和突變的CS的突變體，以及設(shè)計(jì)為產(chǎn)生非活性聚合酶(陰性對(duì)照)的突變體檢測(cè)的復(fù)制水平相比較。圖的左邊部分顯示了在5'和3'CS序列之上的測(cè)試基因組。右邊顯示了利用Rluc報(bào)告基因檢測(cè)的復(fù)制水平，以WT復(fù)制水平百分比表示。下劃線堿基表示突變的堿基。*表示沒(méi)有檢測(cè)到復(fù)制。發(fā)明詳述人們僅僅為少數(shù)由黃病毒引起的疾病生產(chǎn)了安全和有效的疫苗。已經(jīng)用于生產(chǎn)針對(duì)YE、JE和TBEV的疫苗的經(jīng)典的失活病毒疫苗(INV)和活減毒疫苗(LAV)方法仍然沒(méi)有產(chǎn)生許可的產(chǎn)品以預(yù)防由其它黃病毒引起的疾病，特別是登革熱和西尼羅河腦炎(WNE)。對(duì)于現(xiàn)有的LAVs(殘余毒力和毒力逆轉(zhuǎn))和INV產(chǎn)品(由于抗原負(fù)荷和偶發(fā)抗原的反應(yīng)原性)存在安全性考慮。另外，INVs通常需要多次接種。而且，對(duì)兩種類(lèi)型的疫苗都有生產(chǎn)上的考慮，包括需要避免在活減毒疫苗的繁殖過(guò)程中的毒力逆轉(zhuǎn)，原因是生產(chǎn)對(duì)于失活病毒疫苗產(chǎn)品的強(qiáng)免疫反應(yīng)需要的大量物質(zhì)，和對(duì)繁殖用于生產(chǎn)INV產(chǎn)品的毒性病毒的高水平保存設(shè)施(highcontainmentfacilities)的需要。盡管存在對(duì)于新型黃病毒疫苗的有前途的候選物，它們的發(fā)展將需要克服這些問(wèn)題。本發(fā)明一般而言涉及屬于黃病毒科的復(fù)制缺陷假性感染性病毒的構(gòu)建和利用。在這點(diǎn)上，本發(fā)明描述了結(jié)合了失活疫苗的安全性和活減毒疫苗的效率和可規(guī)?；芰Φ男滦蛷?fù)制缺陷黃病毒，其也被稱(chēng)為RepliVAX。本發(fā)明中也稱(chēng)為假性感染性病毒(PIVs)的這些黃病毒包含基因工程化的黃病毒基因組，其具有大部分衣殼-編碼區(qū)域的缺失，從而防止該基因組在正常細(xì)胞系或接種了疫苗的動(dòng)物中產(chǎn)生感染性子代。但是，這些假性感染性病毒可在表達(dá)C,或C-prM-E盒的細(xì)胞系中繁殖，其中它們高水平復(fù)制。因此，由于缺少C蛋白的反式互補(bǔ)，這些假性感染性黃病毒不能在正常動(dòng)物中體內(nèi)或體外發(fā)展出彌漫性感染，并且因此不能在動(dòng)物中產(chǎn)生疾病。與本領(lǐng)域已知的疫苗和生產(chǎn)這些疫苗的方法相反，本發(fā)明提供了假性感染性黃病毒的產(chǎn)業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)系統(tǒng)，其將使得所述疫苗比失活疫苗更廉價(jià)地生產(chǎn)，同時(shí)比活減毒疫苗的利用更安全。通過(guò)提供新型重組疫苗達(dá)到這些目的，所述新型重組疫苗能夠在被免疫動(dòng)物和人中僅僅單輪復(fù)制，導(dǎo)致釋放缺少遺傳物質(zhì)但是作為有效免疫原的亞病毒顆粒(SVPs)。本發(fā)明已經(jīng)證明假性感染性黃病毒可對(duì)于黃病毒(YFV)和西尼羅河病毒(WNV)生產(chǎn)。基于此，本發(fā)明預(yù)料本文描述的方法可廣泛的應(yīng)用于對(duì)抗其它黃病毒的疫苗的發(fā)展。而且，用所述假性感染性黃病毒的正常細(xì)胞系的感染產(chǎn)生缺少核殼和遺傳物質(zhì)的SVPs。本文描述的假性感染性黃病毒證明不能引起任何疾病，因而是安全的。另夕卜，由于單輪復(fù)制和SVPs釋放的能力，這些假性感染性黃病毒在小鼠中是免疫原性的，呈遞病毒抗原。WNPIVs也保護(hù)小鼠免受WNV攻擊之后的致死腦炎。本文描述的PIVs可以允許在細(xì)胞培養(yǎng)物中高產(chǎn)量生產(chǎn)的方式生產(chǎn)，并且不能引起動(dòng)物中的疾病。這些產(chǎn)品可遞送給動(dòng)物，在動(dòng)物中它們的缺陷性復(fù)制過(guò)程預(yù)防了傳播和疾病，但允許SVPs,黃病毒亞基免疫原的產(chǎn)生，所述黃病毒亞基免疫原已經(jīng)顯示對(duì)于引起針對(duì)由幾種黃病毒導(dǎo)致的疾病的有效免疫反應(yīng)是有效的。本發(fā)明還證實(shí)了假性感染性黃病毒途徑可應(yīng)用于兩種聯(lián)系4艮遠(yuǎn)的蚊媒黃病毒。用于蜱媒黃病毒(Kofler,2004)的基于RNA的疫苗發(fā)展的類(lèi)似技術(shù)的適用性顯示了基于PIV的技術(shù)將適用于聯(lián)系更遠(yuǎn)的黃病毒。另外，利用基于TBEVRNA的疫苗的工作顯示了除了對(duì)于SVPs的抗體反應(yīng)之外(類(lèi)似于本文描述的)，具有復(fù)制活性的黃病毒基因組導(dǎo)入接種疫苗的宿主的細(xì)胞將也產(chǎn)生T細(xì)胞反應(yīng)(Kofler,2004;Aberle,2005)。雖然T細(xì)胞反應(yīng)在本文中沒(méi)有測(cè)量，預(yù)測(cè)PIVs能夠誘導(dǎo)模擬由病毒感染產(chǎn)生的T細(xì)胞反應(yīng)。雖然本文描述的PIV疫苗依賴于為T(mén)BEV制備的基于RNA的疫苗利用的相同黃病毒復(fù)制和SVP生產(chǎn)策略(Kofler,2004;Aberle,2005),這些PIV疫苗不需要基因槍傳遞給動(dòng)物，可在細(xì)胞培養(yǎng)物中容易地生長(zhǎng)，并且可遭受與目前應(yīng)用于商業(yè)上生產(chǎn)的YFV17D疫苗的相同類(lèi)型的穩(wěn)定化和儲(chǔ)存(凍干)條件，因而提供了一種可規(guī)?；蓛?chǔ)存，并且可市場(chǎng)化的疫苗產(chǎn)品。對(duì)于WNRepliVAX的穩(wěn)定性的測(cè)的滴度損失。為發(fā)展假性感染性黃病毒的有效反式互補(bǔ)(并且因此生產(chǎn)該病毒)所需要的高水平生長(zhǎng)條件，本發(fā)明利用了表達(dá)來(lái)自VEEV復(fù)制子的高水平的c(或C-prM-E)的細(xì)胞。VEEV復(fù)制子比源于其它曱病毒屬的復(fù)制子是較少引起細(xì)胞病變的，并且在脊推動(dòng)物和昆蟲(chóng)來(lái)源的一些細(xì)胞系中容易地建立起持久的復(fù)制。這種系統(tǒng)對(duì)于假性感染性黃病毒的生產(chǎn)看來(lái)是適合的，因?yàn)閕)VEEV復(fù)制子在異源蛋白的合成，和在本發(fā)明中合成的C合成到黃病毒基因組去衣殼化所需要水平中是高效的。ii)VEEV復(fù)制子不會(huì)可檢測(cè)地干擾黃病毒復(fù)制(Petrakova,2005)。而且，VEE復(fù)制子和YFPIV基因組可在BHK-21細(xì)胞中一起復(fù)制，而不導(dǎo)致CPE。iii)VEEV復(fù)制子可以高滴度包裝成VEE病毒體，所述病毒體可被用于快速建立生產(chǎn)黃病毒結(jié)構(gòu)蛋白的包裝細(xì)胞系。而且，C表達(dá)的前后對(duì)PIV生產(chǎn)的效果的監(jiān)測(cè)顯示表達(dá)錨定形式的C以及另外20a.a.的prM的包裝細(xì)胞比單獨(dú)表達(dá)錨定C的細(xì)胞產(chǎn)生更多的顆粒，暗示病毒體形成中處理事件的正確順序的重要性。被包含prM的起始20個(gè)氨基酸的構(gòu)建體增強(qiáng)的包裝效率的基礎(chǔ)是不清楚的，但是這種現(xiàn)象可通過(guò)兩個(gè)鄰近剪切位點(diǎn)(NS2B/NS3-和信號(hào)肽特異)(Yamshchikov和Compans,1994)的特定剪切順序的需要和/或C蛋白產(chǎn)品在這兩種不同的環(huán)境中的分配/穩(wěn)定性的差異而解釋。另外，觀察到C與prM和E(VEErep/C-prM-E/Pac)的共表達(dá)僅僅導(dǎo)致相對(duì)于VEErep/C2/Pac的PIV產(chǎn)量的微小增加，所述VEErep/C2/Pac表達(dá)錨定C與prM片段。當(dāng)檢查VEEV復(fù)制子-編碼C基因的密碼子最優(yōu)化以確定C基因序列的改變是否增加PIV的產(chǎn)量時(shí)，沒(méi)有顯示出在YFVPIV釋放上與不表達(dá)密碼子最優(yōu)化的C基因的細(xì)胞有很大的差別。這種觀察暗示了甚至利用沒(méi)有最優(yōu)化基因的VEEV復(fù)制子顯示出產(chǎn)生飽和水平的C。這些結(jié)果與其它研究是一致的，所述其它研究證實(shí)了表達(dá)編碼WNVC-E盒的VEEV復(fù)制子產(chǎn)生比在WNV感染細(xì)胞中監(jiān)測(cè)到的更高的E水平。盡管最優(yōu)化C基因的轉(zhuǎn)表達(dá)不能提高YFPIV的產(chǎn)量，包含表達(dá)Copt的VEEV復(fù)制子的細(xì)胞當(dāng)用YFPIV感染時(shí)發(fā)展了CPE并且產(chǎn)生了噬菌斑。這使得在Copt細(xì)胞中PIV的感染更類(lèi)似于通過(guò)有復(fù)制能力的的病毒發(fā)展的感染。利用編碼YFVCopt基因的VEEV復(fù)制子在假性感染性黃病毒生產(chǎn)中的用途的另外優(yōu)點(diǎn)是安全水平，因?yàn)槊艽a子的改變降低了與假性感染性黃病毒基因組的同源重組的機(jī)會(huì)。而且，C叩t基因還可在其環(huán)化序列中被改變(本文為BHK(VEErep/C、E、Pac)細(xì)胞的WNVC編碼區(qū)所述的)，以降低產(chǎn)生一種復(fù)制活性C-編碼黃病毒的重組機(jī)會(huì)。到目前為止，本文描述的WN或YFPIV系統(tǒng)都沒(méi)有產(chǎn)生可在細(xì)胞培養(yǎng)物或在高度易感染動(dòng)物中檢測(cè)的復(fù)制活性的黃病毒。另外，體內(nèi)實(shí)騶r證實(shí)YF和WNPIVs都是安全的，并且甚至在用高劑量的PIVsi.c.接種3到4天齡小鼠之后不會(huì)導(dǎo)致任何疾病。然而，WNPIVs能夠誘導(dǎo)高水平的中和抗體并且保護(hù)小鼠免受有復(fù)制能力的WNV的感染。而且，丙型肝炎與AIDS歸類(lèi)為目前沒(méi)有獲得疫苗的致病性和致死性的主要感染性原因。在日本和韓國(guó)，HCV現(xiàn)在對(duì)肝細(xì)胞癌癥的發(fā)展的作用超過(guò)了乙肝，肝細(xì)胞癌癥是一種最普遍類(lèi)型的癌癥和一種歸因于肝疾病的普遍死亡才莫式。這種方式在其它亞洲國(guó)家和其它發(fā)展中國(guó)家很可能變得越來(lái)越普遍，這歸因于越來(lái)越流行的HCV以及對(duì)乙肝的有效免疫。在埃及和其它國(guó)家的一些社區(qū)中，丙肝感染的流行驚人的高J艮可能至少部分歸因于傳統(tǒng)衛(wèi)生保健實(shí)踐和/或過(guò)去危險(xiǎn)的西方技術(shù)的引入(例如在對(duì)血吸蟲(chóng)病的公共健康運(yùn)動(dòng)中病毒的以針為媒介的傳播)。在許多發(fā)展中國(guó)家，肝癌和硬化的比例很高，在輸血過(guò)程中;[艮少有有效的丙肝的控制。丙肝也是美國(guó)的主要公共健康問(wèn)題，有大約4百萬(wàn)HCV攜帶者，許多由于肝病或肝癌的晚期面臨著死亡的威脅。目前估計(jì)在美國(guó)每年有8000到10000個(gè)由于丙肝的死亡。在沒(méi)有新的治療劑或預(yù)防性方法的情況下，這一數(shù)字很可能在接下來(lái)的10-20年中增至三倍，潛在地超過(guò)由于AIDS的死亡數(shù)。然而，沒(méi)有預(yù)防這種感染的疫苗，由于可以理解的技術(shù)困難、大藥廠對(duì)開(kāi)發(fā)疫苗通常缺少興趣，和主要基金機(jī)構(gòu)的慣性，發(fā)展疫苗的努力(國(guó)內(nèi)和國(guó)際)嚴(yán)重地受限。并且，由于有許多感染性疾病，面臨歸因于丙肝的嚴(yán)重肝疾病或死亡的很大風(fēng)險(xiǎn)的人是弱勢(shì)的。到目前為止，產(chǎn)生抗HCV感染的有效疫苗的努力是不成功的。然而，在最近幾年內(nèi)，HCV領(lǐng)域開(kāi)始迅速發(fā)展，并且現(xiàn)在這種病毒在組織培養(yǎng)物中復(fù)制到相當(dāng)高的滴度，到達(dá)106inf.u/ml。在HCV基因組和其它黃病毒，如YF,JEV,TBE和其它的基因組之間有明顯的相似。因此，設(shè)計(jì)復(fù)制缺陷黃病毒的策略可不僅應(yīng)用于黃病毒屬的成員，而且也可應(yīng)用于肝病毒(Z/e/^c^n^)屬(其包括HCV)。HCV衣殼蛋白可通過(guò)在許多細(xì)胞系中的重組曱病毒復(fù)制子(基于SINV，VEEVEEEV和其它)生產(chǎn)，所述細(xì)胞系包括目前已知對(duì)于HCV感染易感的Huh-7和Huh-7.5細(xì)胞。復(fù)制缺陷HCV基因組，缺少衣殼基因，可被轉(zhuǎn)染入衣殼生產(chǎn)細(xì)胞系并且將被包裝成感染性含衣殼的顆粒。大規(guī)才莫生產(chǎn)需要的連續(xù)輪感染也可在這些細(xì)胞上進(jìn)行。然而，在體內(nèi)，在原初肝細(xì)胞中(以及可能其它細(xì)胞類(lèi)型)，缺乏全衣殼基因或根本沒(méi)有衣殼基因的HCV基因組將僅僅產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)病毒蛋白和糖蛋白El和E2。這些蛋白將被呈遞給免疫系統(tǒng)i)在蛋白酶體降解之后；ii)在細(xì)胞表面上和iii)以具有含E1和E2一皮膜的病毒樣顆粒的形式。衣殼缺陷將使得病毒不能夠擴(kuò)散，并且因而限制被免疫接種感染的細(xì)胞。概括而言，本發(fā)明證實(shí)了衣殼缺陷性假性感染性黃病毒i)可在表達(dá)衣殼或所有黃病毒結(jié)構(gòu)基因的細(xì)胞系中產(chǎn)生一種彌漫性感染；ii)PIVs不能在正常細(xì)胞中產(chǎn)生彌漫性感染，iii)當(dāng)PIVs感染正常細(xì)胞時(shí)，PIVs產(chǎn)生含SVPs的E蛋白；iv)PIVs在動(dòng)物中顯示了高水平的安全性；v)PIVs保護(hù)小鼠免受隨后的黃病毒感染?？偟膩?lái)說(shuō)，本發(fā)明證實(shí)了黃病毒PIVs可能是一種對(duì)于抗黃病毒感染和類(lèi)似于黃病毒的病毒引起的感染的疫苗的發(fā)展安全，有力，并且有效的平臺(tái)。本發(fā)明涉及復(fù)制缺陷假性感染性黃病毒科，包含在編碼衣殼(C)的RNA序列，prM/M的正確成熟所需要的prM蛋白的信號(hào)序列，或其組合，所述黃病毒科僅僅在表達(dá)黃病毒科病毒的C蛋白或C，prM,被膜蛋白，突變C蛋白，突變prM,突變被膜蛋白或其重組體的細(xì)胞中復(fù)制。一般而言，黃病毒科包含屬于黃病毒屬、肝病毒屬或瘟病毒屬(Pestivims)的病毒，或通過(guò)將其它病毒的prM-E盒與假性感染性黃病毒科的prM-E盒交換而產(chǎn)生的所述病毒的其它嵌合體。屬于黃病16毒屬的病毒的例子不限于但可包括黃熱病病毒、西尼羅河病毒、登革熱病毒、蜱傳腦炎病毒、圣路易(SaintLouis)腦炎病毒、日本腦炎病毒、墨累谷(MurrayValley)腦炎病毒。而且，屬于肝病毒屬的病毒的例子包括但不限于丙型肝炎病毒，并且屬于瘟病毒屬的病毒包括但不限于牛病毒寸生腹瑪病毒(Bovinevirusdiarrhea)、豬痘病毒(swinefevervirus)或豬霍亂病毒(hogcholeravirus)。在黃病毒的例子中，缺失的編碼黃病毒C蛋白的核苷酸序列可編碼氨基酸26到100或C蛋白的氨基酸26到100之內(nèi)的氨基酸組合。所述組合可包括^旦不限于氨基酸26-93,31-100或31-93。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可利用相同的準(zhǔn)則從屬于黃病毒科的其它病毒或具有與這些病毒相同的基因結(jié)構(gòu)的其它病毒刪除C蛋白的核普酸序列。通常并且可適用于所有這些病毒的是，缺失的基因被編碼標(biāo)記蛋白或抗原的基因取代。標(biāo)記蛋白的例子可包括但不限于綠色熒光蛋白。本發(fā)明還涉及表達(dá)黃病毒科病毒的C蛋白或C、prM、帔膜蛋白、突變C蛋白、突變prM、突變被膜蛋白或其組合的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)對(duì)于保證上述復(fù)制缺陷黃病毒科在適當(dāng)條件下繁殖是有效的。為此目的，表達(dá)黃病毒科野生型或突變蛋白的細(xì)胞可利用基因工程化的源于病毒載體的復(fù)制子而產(chǎn)生。一般而言，復(fù)制子中編碼黃病毒科病毒的蛋白的基因被密碼子最優(yōu)化型的編碼病毒蛋白的基因取代，使得所述取代降低細(xì)胞系編碼基因與黃病毒科的假性感染性病毒的基因組重組的能力和/或提高黃病毒科假性感染性病毒的生產(chǎn)。例如，所述復(fù)制子可表達(dá)包含在編碼黃病毒科病毒的C蛋白的基因的至少36個(gè)核苷酸位點(diǎn)的突變的C蛋白。復(fù)制子可表達(dá)復(fù)制子中的C蛋白，所述C蛋白包含非天然環(huán)化序列使得環(huán)化序列的存在降低復(fù)制缺陷假性感染性病毒與天然病毒的生產(chǎn)性重組的機(jī)會(huì)。而且，復(fù)制子可表達(dá)蛋白，所述蛋白包含編碼截短的C-prM連接的改變的核苷酸序列，在體內(nèi)提高含prM/E的SVP的產(chǎn)量，或其組合，所述改變的序列的存在提高細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制缺陷z假性感染性病毒的產(chǎn)量。而且，通過(guò)利用體外合成的復(fù)制子RNAs轉(zhuǎn)染，通過(guò)用設(shè)計(jì)為從細(xì)胞RNA-聚合酶II-特異性啟動(dòng)子合成功能性甲病毒復(fù)制子的質(zhì)粒DNAs轉(zhuǎn)染，或通過(guò)利用包裝在曱病毒結(jié)構(gòu)蛋白之內(nèi)的曱病毒復(fù)制子感染，將表達(dá)黃病毒科蛋白的復(fù)制子引入細(xì)胞中。本文使用的病毒載體可以是甲病毒。所述曱病毒的代表性例子包括但不限于委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VenezuelanEquineEncephalitisVirus)(VEEV),辛德畢斯病毒(Sindbisvirus)，東方馬腦炎病毒(EasternEquineEncephalitisvims)(EEEV)，西方馬腦炎病毒(WesternEquineEncephalitisvirus)(WEEV)或羅斯河病毒(RossRivervirus)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)黃病毒科的復(fù)制缺陷假性感染性病毒的方法，包含產(chǎn)生黃病毒科的復(fù)制缺陷假性感染性病毒，所述病毒包含衣殼基因中的缺失，prM/M的正確成熟所需要的prM蛋白的信號(hào)序列，或其組合，所述缺失不破壞基因組環(huán)化所需要的RNA序列；產(chǎn)生表達(dá)黃病毒科病毒的C蛋白或C、prM、；故膜蛋白、突變C蛋白、突變prM、突變被膜蛋白或其組合的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系提供黃病毒科的復(fù)制缺陷假性感染性病毒繁殖所需要的高水平蛋白；和用黃病毒科的假性感染性病毒感染細(xì)胞系，因而產(chǎn)生黃病毒科的復(fù)制缺陷假性感染性病毒。關(guān)于病毒類(lèi)型，衣殼基因缺失位點(diǎn)，產(chǎn)生表達(dá)黃病毒科的突變和野生型蛋白的細(xì)胞系的方法，復(fù)制子類(lèi)型和復(fù)制子中的突變和編碼復(fù)制子中黃病毒科突變和野生型蛋白的基因的修飾的所有其它方面都與上面討論的相同。本發(fā)明還涉及包含通過(guò)上述方法生產(chǎn)的黃病毒科的復(fù)制缺陷假性感染性病毒的藥物組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及保護(hù)受試者免受由于暴露于黃病毒科導(dǎo)致的感染的方法，包含給予受試者免疫有效量的本文所述的藥物組合物，所述組合物在受試者中引起抗黃病毒科的免疫反應(yīng)，因而保護(hù)受試者免受感染。所述組合物可通過(guò)腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、口服或鼻內(nèi)途徑給藥。而且，受益于所述組合物的使用的受試者可以是人，或動(dòng)物。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"一種(a或an)"可表示一種或多種。如本文在權(quán)利要求所用的，當(dāng)與"包含"聯(lián)用時(shí)，"一種"可表示一種或多于一種。如本文所用的，"另一種"或"其它"可表示至少第二或更多種與其相同或不同的要求的成分或組分。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"黃病毒矛ip'包4舌黃病毒、肝病毒、瘕病毒屬。屬于黃病毒屬的病毒的例子包括但不限于黃熱病病毒、西尼羅河病毒、登革熱病毒、蜱傳腦炎病毒、圣路易腦炎病毒、日本腦炎病毒、墨累谷腦炎病毒，類(lèi)似的，屬于肝病毒屬的病毒的例子包括但不限于丙型肝炎病毒，并且屬于瘟病毒屬的例子包括但不限于牛病毒性腹瀉病毒(Bovinevirusdiarrhea)、豬痘病毒(swinefevervirus)或豬霍亂病毒(hogcholeravirus)。而且，盡管本發(fā)明公開(kāi)了屬于黃病毒屬的復(fù)制缺陷假性感染性黃病毒科病毒的構(gòu)建和用途，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可利用相同的準(zhǔn)則構(gòu)建包含屬于黃病毒科的其它病毒的嵌合體，或通過(guò)置換黃病毒科或其它類(lèi)似病毒之內(nèi)的病毒的prM-E盒構(gòu)建嵌合體。包含本文討論的屬于黃病毒科的假性感染性病毒的藥物組合物可彼此或與其它藥物組合物同時(shí)或序貫給藥。所述組合物共給藥的效果是為了保護(hù)個(gè)體免受由所述病毒引起的感染和其它疫苗可治療的疾病。本文所述的組合物，其它藥物組合物，或其組合可通過(guò)本領(lǐng)域的任何標(biāo)準(zhǔn)方法全身或局部獨(dú)立給藥，例如，皮下、靜脈內(nèi)、腸胃外、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、局部、經(jīng)腸、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、向頰地、經(jīng)陰道或通過(guò)吸入噴霧，通過(guò)藥泵或包含在透皮貼劑(patch)或植入片中。本文所述的組合物的劑量制劑可包含適于本給藥方法的傳統(tǒng)的無(wú)毒，生理或藥學(xué)可接受的載體或媒介，這對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。本文所述的組合物，其它藥物組合物，或其組合，可獨(dú)立給藥一次或多次，以獲得，維持或提高治療劑效果。確定劑量或確定組合物中的每種或兩種的適當(dāng)劑量是包含單個(gè)給藥劑量還是多個(gè)給藥劑量是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)的。適當(dāng)?shù)膭┝恳蕾囉谑茉囌叩慕】?，?duì)個(gè)體免受黃病毒感染的保護(hù)，給藥途徑和利用的制劑。下述實(shí)施例是為了解釋本發(fā)明的不同實(shí)施方式而給出，不意味著以任何方式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解到本發(fā)明非常適于實(shí)現(xiàn)目的并獲得提到的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)，以及本發(fā)明固有的目的，結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到包含在如權(quán)利要求范圍所限定的本發(fā)明的精神之內(nèi)的改變和其它用途。實(shí)施例1細(xì)月包培養(yǎng)BHK國(guó)21細(xì)月包由PaulOlivo(WashingtonUniversity,St.Louis,Mo)提供。它們?cè)?7°C下保持在補(bǔ)充了10%胎牛血清(FBS)和維生素的a極限必需培養(yǎng)基(aMEM)中。WHO-核定的Vero細(xì)胞，最初為用于人疫苗生產(chǎn)而制備，由NIH的Dr.SteveWhitehead提供。Vero細(xì)胞保持在包含6%FBS的MEM中。實(shí)施例2質(zhì)粒構(gòu)建對(duì)于所有的質(zhì)粒構(gòu)建體使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)。使用的質(zhì)粒的圖示顯示于圖7A-7F。圖和序列顯示于圖8A-8F。在別處已經(jīng)描述了包含YFV17D抹基因組的感染性cDNA的親本低拷貝量的質(zhì)粒pACNR/FLYF-17Dx(Bredenbeeketal.,2003),所述質(zhì)粒由Dr.CharlesM.Rice提供(RockefellerUniversity,NewYork,N.Y.)。pYFPIV包含有缺陷的YFV基因組(YFPIV),其中編碼YF衣殼基因的氨基酸26-93的片段被源于pEGFP-Nl(Clontech)的密碼子最優(yōu)化的GFP基因取代。WNPIV基因組(pWNPIV)源于Texas2002感染性cDNA(Rossietal.,2005),通過(guò)融合C的密碼子30與C的密碼子101(見(jiàn)圖5A)。質(zhì)粒pVEErep/Cl/Pac,pVEErep/C2/Pac和pVEErep/C-prM畫(huà)E/Pac(圖2A)編碼雙亞基因組VEEV復(fù)制子，其中第一亞基因組啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)RNAs的轉(zhuǎn)錄，所述RNAs包含VEEV26SRNA的5，UTR,后面分別緊接著對(duì)應(yīng)于YFV基因組的nt119-481,119-541和119-2452的序列。第二亞基因組啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)噤呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Pac)基因的表達(dá)，其產(chǎn)品使細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)由噤呤霉素(Pur)引起的翻譯阻滯的抗性。表達(dá)與Pac基因融合的WNV的C-prM-E盒(源于Sindbis病毒復(fù)制子(Scholleetal.,2004))的非細(xì)胞致病性VEEV復(fù)制子(命名為pVEErep/C、E、Pac)從VEE非細(xì)胞致病性復(fù)制子中(Petrakovaetal.,2005)產(chǎn)生；E-編碼序列與Pac基因通過(guò)連接體融合，所述連接體由NS1的起始9密碼子和NS2B的最后25密碼子，緊接著與直接融合于FMDV2A的NS3的2密碼子組成(見(jiàn)圖5A)。編碼YFV17D衣殼的密碼子和prM的起始20氨基酸的最優(yōu)化序列利用別處描述的密碼子頻率數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)(Haasetal.,1996)。這種基因通過(guò)PCR從重疊人工寡核苷酸中合成。擴(kuò)增的片段在克隆入表達(dá)盒VEErep/C2opt/Pac和VEErep/Copt-prM-E/Pac之前被測(cè)序。后一個(gè)復(fù)制子具有與pVEErep/C2/Pac和pVEErep/C-prM-E/Pac基本上相同的設(shè)計(jì)，但包含圖4A所示的密碼子最優(yōu)化的序列。另外，還產(chǎn)生了表達(dá)JEVprM-E的嵌合WN-RepliVAX。這通過(guò)取代編碼WNV基因組的ARepliVAX中的JEV的Nakayama株的prM和E基因而構(gòu)建。基因交換是通過(guò)將截短的WNVC蛋白的最后密碼子與JEV的prM編碼序列的起始密碼子(Nakayama株)直接融合而獲得。相同的融合策略應(yīng)用于盒的3'末端，JEVE蛋白的最后密碼子與WNV的NS1的起始密碼子直接融合。這些融合被引入編碼結(jié)合了T7啟動(dòng)子和核酶的全WNRepliVAXcDNA的BAC質(zhì)粒，并且從這種BACDNA回收的RNA被引入BHK(VEErep/Pac-Ubi-C承)細(xì)胞。產(chǎn)生成彌漫性感染性集落(foci)。對(duì)于WNRepliVAX,形成于這種細(xì)胞系上的集落比通過(guò)完全感染性WNV-JEV嵌合體產(chǎn)生的小。JERepliVAX生長(zhǎng)到比WNRepliVAX低大約10倍的滴度，獲得在BHK(VEErep/Pac-Ubi-C"中超過(guò)106U/ml的滴度。如所期望的，JERepliVAX與JE-特異性Mabs反應(yīng)，并且期望類(lèi)似的嵌合黃病毒，JERepliVAX將誘導(dǎo)高水平的JEV-中和抗體，并產(chǎn)生抗JE保護(hù)。實(shí)施例3RNA轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒通過(guò)在CsCl梯度中離心而純化。在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前，質(zhì)粒通過(guò)Xhol(用于pYFPIV)或Mhul(用于VEE復(fù)制子和VEE輔助編碼質(zhì)粒)或5V"I(用于pWNPIV)線性化。RNAs在帽子類(lèi)似物的存在下通過(guò)SP6或T7RNA聚合酶合成。轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)量和完整性在非變性條件下通過(guò)凝膠電泳而分析。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的等分試樣用于電穿孔而不用另外純化。實(shí)施例4RNA轉(zhuǎn)染和PIV復(fù)制分析BHK-21細(xì)胞的電穿孔在前述條件下進(jìn)行(Liljestrometal.,1991)。為建立包裝的細(xì)胞培養(yǎng)物，VEEV復(fù)制子電穿孔24小時(shí)后將Pur加入到培養(yǎng)基中達(dá)到10g/ml。體外合成的YFPIV基因組的轉(zhuǎn)染在5天后進(jìn)行，那時(shí)含復(fù)制子細(xì)胞重新開(kāi)始有效生長(zhǎng)。在圖示時(shí)間點(diǎn)通過(guò)用含Pur的相同培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基而收獲樣品。在許多實(shí)驗(yàn)中，PIV分泌細(xì)胞在到達(dá)匯合時(shí)分裂。VEEV復(fù)制子通過(guò)體外合成的復(fù)制子和2輔助RNAs(Volkovaetal.,2006)的共電穿孔入BHK-21細(xì)胞而包裝入VEEV感染性病毒顆粒。含復(fù)制子病毒顆粒在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收獲，用于感染原初BHK-21細(xì)胞，緊接著Pur選擇。在WNPIV的例子中，體外合成的PIVRNA轉(zhuǎn)染入含表達(dá)WNC、prM和E和Pac的VEErep/C*-E*-Pac復(fù)制子的BHK細(xì)胞[BHK(VEErep/C、E、PAC)細(xì)胞]。VEErep/C*-E*-PAC基因組的THE方案示于圖5A。收獲的PIVs利用標(biāo)準(zhǔn)方法在這些細(xì)胞上傳^(Rossietal.,2005)。實(shí)施例5測(cè)量YFPIV的滴度為測(cè)量釋放的YFPIV的滴度，BHK-21細(xì)胞以5xl05細(xì)胞/孔接種入六孔Costar皿。四小時(shí)后，用不同稀釋的包裝病毒子感染細(xì)月包，37°C下在5%C02培養(yǎng)箱中培育1小時(shí)之后，用補(bǔ)充了10%FBS的2mlMEM覆蓋它們。感染的細(xì)胞數(shù)量通過(guò)在倒置UV顯微鏡下計(jì)數(shù)GFP-陽(yáng)性細(xì)胞而評(píng)價(jià)。來(lái)自接種量的感染細(xì)胞分?jǐn)?shù)通過(guò)計(jì)數(shù)限定區(qū)域的顯微鏡視野中熒光-產(chǎn)生細(xì)胞而確定。平均5個(gè)不同視野的計(jì)數(shù)，重新計(jì)算對(duì)應(yīng)于每系列稀釋的滴度。在后一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，滴度也通過(guò)單層BHK-21細(xì)月包上的噬菌斑測(cè)定而測(cè)量，所述BHK-21細(xì)月包攜帶VEErep/Copt-prM-E/Pac復(fù)制子，所述測(cè)量利用前述條件(Lemmetal.,1990)，除了細(xì)胞為了噬菌斑發(fā)展在瓊脂糖下培育5天，然后用2.5%的曱醛固定并用結(jié)晶紫染色。實(shí)施例6YFPIVs的傳代包裝的細(xì)胞系通過(guò)體外合成的VEEV復(fù)制子RNAs的轉(zhuǎn)染或通過(guò)用包裝入VEEV結(jié)構(gòu)蛋白的相同復(fù)制子以10inf.u/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染細(xì)胞而建立。Pur選擇之后，用YFPIV以不同MOIs感22染它們。在圖示時(shí)間點(diǎn)通過(guò)替換培養(yǎng)基收獲樣品。實(shí)施例7YFSVP生產(chǎn)的分析BHK-21細(xì)胞以每100-mm皿2xl()6的濃度接種。在37。C下培育4小時(shí)之后，用YFPIV以10inf.u/細(xì)胞的MOI感染細(xì)胞，并且然后在補(bǔ)充了10%FBS的10ml的MEM中培育24小時(shí)。然后培養(yǎng)基被每24小時(shí)替換的10ml無(wú)血清培養(yǎng)基VP-SF(Invitrogen)替換以分析SVP釋放。收集的VP-SF樣品通過(guò)低速離心而澄清(5,000r.p.m,10分鐘,4°C)，并且然后通過(guò)超速離心濃縮，所述超速離心通過(guò)2ml的10%蔗糖，制備于PBS上，在SW-41轉(zhuǎn)子上以39,000r.p.m在4°C進(jìn)行6小時(shí)。粒狀沉淀材料溶解于用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的缺少b-巰基乙醇(為了保持與D1-4G2MAB的結(jié)合)的加載的緩沖液中，并進(jìn)一步通過(guò)Western印跡分析。蛋白轉(zhuǎn)移之后，用D1-4G2MAB和購(gòu)自SantaCmzBiotechology的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-連接驢抗小鼠二級(jí)抗體處理硝化纖維素膜。利用Western印跡Luminol試劑(SantaCruzBiotechnology)根據(jù)制造者的建議檢測(cè)HRP。為獲得陽(yáng)性對(duì)照樣品，如對(duì)于SVPs所述的那樣將YFV(2xl08PFU)通過(guò)10%蔗糖墊進(jìn)行超速離心。對(duì)于YFVSVPs的蔗糖密度梯度分析，BHK-21細(xì)胞用體外合成的YFPIV基因組RNA進(jìn)行電穿孔。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)時(shí)，完全MEM被VP-SF培養(yǎng)基替代，其在24小時(shí)后收獲。在此時(shí)間時(shí)，超過(guò)95%的細(xì)胞是GFP-陽(yáng)性的并且不顯示任何CPE的征兆。收獲的樣品通過(guò)低速離心澄清(5000rpm,10分鐘，4°C)，并且然后通過(guò)在SW-28轉(zhuǎn)子在25,000rpm,4°C下進(jìn)行過(guò)夜離心而濃縮。得到的粒狀沉淀懸浮于TN緩沖液中(10nmTrisHC1(pH7.5),lOOmMNaCl,0.1%BSA)并且進(jìn)一步的分析如所述的進(jìn)行(Schalichetal.，1996)。簡(jiǎn)要地，0.5ml樣品被加載到不連續(xù)的蔗糖梯度中(1.5ml50%,1.5ml35%和1.5ml10%的制備于PBS緩沖液中的蔗糖)。離心在OptimaMAXUltracentrifuge(Beckman)中在SW-55轉(zhuǎn)子中以45,000rpm在4°C下進(jìn)行1小時(shí)。粒狀沉淀溶解于用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的缺少b_巰基乙醇(為了保持與D1-4G2MAB的結(jié)合)的加載的緩沖液中，并進(jìn)一步通過(guò)Western印跡分析。蛋白轉(zhuǎn)移之后，用D1國(guó)4G2MAB和購(gòu)自SantaCruzBiotechology的夢(mèng)束才艮過(guò)氧^:物酶(HRP)-連接驢抗小鼠二級(jí)抗體處理硝化纖維素膜。利用Western印跡Luminol試劑(SantaCruzBiotechnology)根據(jù)制造者的建議檢測(cè)HRP。用YFV(2X108PFU)進(jìn)行并行的(sidebyside)梯度分析，進(jìn)行如上述用于YFV-PIV源的SVPs相同的程序。實(shí)施例8WNPIV的分析WNPIV的滴度通過(guò)用病毒的系列稀釋感染Vero細(xì)胞單層而確定，并且然后24小時(shí)后固定，用特異于WNV的多克隆超免疫小鼠腹水液進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，如前面所描述的一樣進(jìn)4亍(Rossietal.,2005)。感染的細(xì)胞^^皮計(jì)數(shù)并用于確定滴度。為評(píng)價(jià)WNPIV用于在Vero細(xì)胞，或BHK(VEErep/C、E、PAC)細(xì)胞上形成集落的能力，單層用WNPIV稀釋液感染，用半固體黃芪膠覆蓋層覆蓋，在37。C下培育，并且然后固定并用特異于WNVNS1的MAB染色(E.Konishi,Kobe,Japan提供)，如上面所描述的一樣進(jìn)行。實(shí)施例9PIV安全研究通過(guò)將不同劑量的病毒(回收自親本感染性cDNAs的YFV17D或WNVTX02)或PIV通過(guò)顱骨內(nèi)(i.e.)途徑(20ml體積)接種入3-到4-天齡小鼠(outbredSwissWebster,Harlan)或通過(guò)腹膜內(nèi)(i.p.)途徑(100ml體積)接種入4-5周齡雌性小鼠(outbredSwissWebster,Harlan)建立PIV安全。監(jiān)測(cè)14天小鼠疾病和死亡的征兆，垂死并且表現(xiàn)為不能存活到接下來(lái)的一天的動(dòng)物:被人道地處死，并記錄為接下來(lái)的一天"死亡"。實(shí)施例10WNPIV歲文〗介和效率研究用上述WNPIV4姿種的選擇的動(dòng)物;波處以安樂(lè)死，在接種后21天流血。血清從動(dòng)物中收獲，合并，并利用上述方法測(cè)試它們降低在Vero細(xì)胞單層上WNV集落形成的能力。剩余的動(dòng)物用1,000inf.u(通過(guò)在Vero細(xì)胞上集落形成測(cè)試而確定)接種，對(duì)應(yīng)于WNV的NY99林的大約100LD5Q(Xiaoetal.,2001),并且動(dòng)物然后如上所述另外觀察14天。實(shí)施例11YFVC-和YFVC-prM-E-表達(dá)盒都可補(bǔ)助YFVPIV的復(fù)制補(bǔ)助黃病毒基因組中C缺失缺陷的一般策略顯示于圖1。它是基于缺少C基因的基因組的發(fā)展，和在表達(dá)C(或所有病毒結(jié)構(gòu)蛋白)的細(xì)胞中但不在正常細(xì)胞中的這些假性感染性病毒基因組(PIV基因組)的繁殖。后者細(xì)胞中的復(fù)制，不產(chǎn)生PIV基因組中缺陷的反式互補(bǔ)需要的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，導(dǎo)致包含關(guān)鍵保護(hù)性免疫原E但缺少包含C和病毒遺傳物質(zhì)的核殼的SVPs的釋放。重組YFC基因組(YFPIV基因組)被工程化以包含GFP代替C的氨基酸26-93,與剩下的多肽框內(nèi)克隆(圖2A)。GFP的表達(dá)提供了在實(shí)驗(yàn)中確定含基因組PIVs滴度的方便的方法。C-編碼序列從這種PIV基因組的缺失期望可破壞C形成功能性核殼的能力，但不期望影響功能性形式的prM和E的產(chǎn)生。因而，表達(dá)這種基因組的細(xì)胞，其產(chǎn)生GFP熒光，不能釋放感染性病毒。然而，感染性子代期望可從表達(dá)高水平的C的"包裝"細(xì)胞中產(chǎn)生。為了用于有效PIV生產(chǎn)的細(xì)胞系的快速開(kāi)發(fā)，利用了基于委內(nèi)瑞4立馬腦炎病毒(VenezuelanEquineEncephalitisVims)(VEEV)基因組的表達(dá)系統(tǒng)(復(fù)制子)(Petrakovaetal.,2005)。VEEV復(fù)制子比源于其它甲病毒的復(fù)制子致細(xì)胞病變性更小，并且在脊推動(dòng)物和昆蟲(chóng)起源的一些細(xì)胞系中容易地建立持久的復(fù)制。表達(dá)盒被設(shè)計(jì)為雙亞基因組結(jié)構(gòu)(圖2B),其中一種亞基因組啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Pac的表達(dá)，提供消除不包含Pac表達(dá)VEEV復(fù)制子的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物中的細(xì)胞的有效方法。第二亞基因組啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)編碼YFV結(jié)構(gòu)蛋白的亞基因組RNA的轉(zhuǎn)錄。為鑒定最有效的包裝盒，VEEV復(fù)制子編碼i)具有prM信號(hào)肽的YFVC,也已知為錨定的C(LindenbachandRice,2001)，(VEErep/Cl/Pac),或ii)具有prM的信號(hào)肽和20氨基酸的C(VEErep/C2/Pac),或iii)所有YFV結(jié)構(gòu)蛋白(VEErep/C-prM-E/Pac)。該設(shè)計(jì)的基本原理是在C-編碼盒中保持信號(hào)肽，其期望對(duì)于將C靶向到正確的細(xì)胞區(qū)室是關(guān)鍵的。體外合成的VEEV復(fù)制子RNAs轉(zhuǎn)染到BHK-21細(xì)胞中，并且在接下來(lái)的4-5天內(nèi)在含Pur培養(yǎng)基中選擇Pui"R穩(wěn)定細(xì)胞系。在轉(zhuǎn)染后起始的2-3天中，源于VEEV的RNAs的復(fù)制導(dǎo)致生長(zhǎng)阻滯，然后，如先前所描述的(Petrakovaetal.,2005)，復(fù)制變得效率更低并且細(xì)胞重新開(kāi)始生長(zhǎng)。產(chǎn)生的Pui^培養(yǎng)物用體外合成的YFPIVRNAs轉(zhuǎn)染，并且在轉(zhuǎn)染后不同的時(shí)間點(diǎn)，釋放的包含GFP-表達(dá)基因組的感染性顆粒的滴度被確定(圖2C)。令人驚訝的是，BHK-21細(xì)胞中兩種不同的復(fù)制RNAs(YFV-和VEEV-特異性)的存在不產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),并且保持對(duì)Pur的抗性和高水平GFP的表達(dá)，顯示出VEEV復(fù)制子和YFPIVRNA的復(fù)制。如圖2C所示，表達(dá)這兩種標(biāo)記物基因的培養(yǎng)物能夠生長(zhǎng)并需要更替繼代接種(以每4天1:5的比例)以防止培養(yǎng)物到達(dá)匯合。圖2的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了所有的三種VEEV復(fù)制子能夠供應(yīng)為形成感染性PIVs的充分水平的YFVC;在沒(méi)有VEEV復(fù)制子的情況下從用YFPIVRNA轉(zhuǎn)染的原初BHK-21細(xì)胞中沒(méi)有釋放感染性顆粒(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，表達(dá)這些包裝盒的細(xì)胞生產(chǎn)PIV的能力是不同的。表達(dá)YFVC后面緊接著prM信號(hào)肽的構(gòu)建體(錨定的C;VEErep/Cl/Pac)證實(shí)了與表達(dá)更長(zhǎng)蛋白序列的盒相比較最低水平的YFPIVRNA包裝。C1構(gòu)建體的更低包裝效率的基礎(chǔ)是不清楚的，但這種現(xiàn)象可能通過(guò)在兩個(gè)相鄰剪切位點(diǎn)的特定順序的剪切的需要(NS2B/NS3和信號(hào)肽酶)(Yamshchikov和Compans,1994),和/或在這兩種不同的背景中產(chǎn)生的C蛋白的分配/穩(wěn)定性的不同，而解釋。因而，這些實(shí)驗(yàn)之后，從所有進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中清除VEErep/Cl/Pac。VEErep/C2/Pac和VEErep/C-prM-E/Pac復(fù)制子都包裝了YFPIV到類(lèi)似滴度，達(dá)到超過(guò)107inf.u/ml。而且，PIV顆粒的釋放持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每24小時(shí)的時(shí)期內(nèi)每種細(xì)胞釋放20感染性YFPIV。相同的細(xì)胞可能也釋放缺少核殼和基因組的包含prM/E的SVPs,但這種可能性沒(méi)有進(jìn)一步研究。實(shí)施例12具有缺陷基因組的YFPIVs可大規(guī)才莫生產(chǎn)PIV作為疫苗候選物的最終用途依賴于以需要的規(guī)模生產(chǎn)這些顆粒的能力，例如，為商業(yè)化生產(chǎn)。對(duì)用于疫苗制備的基于RNA的反式互補(bǔ)系統(tǒng)(VEEV復(fù)制子)的依賴需要進(jìn)一步的標(biāo)準(zhǔn)化，因?yàn)榇嬖谠诳寺∪隦NA病毒基因組的異源基因中突變累積的可能性。低傳代細(xì)胞系的利用，是克服這種限制的一種方法。替代地，可通過(guò)將復(fù)制子重復(fù)轉(zhuǎn)染入初始細(xì)胞，或通過(guò)生產(chǎn)包裝的VEEV復(fù)制子然后感染初始細(xì)胞而最小化VEErep基因組中的突變累積。包裝的VEE復(fù)制子的利用被認(rèn)為是建立包裝細(xì)胞系的一種簡(jiǎn)單和有效的方法。為有效生產(chǎn)PIVs，利用一種允許在先前包裝的VEEV復(fù)制子中生產(chǎn)甲病毒復(fù)制子表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)物的技術(shù)。簡(jiǎn)短地，VEEV復(fù)制子利用先前描述的二輔助系統(tǒng)(Volkovaetal.,2006)包裝為VEEV感染性病毒體，包裝為包含到達(dá)109inf.u/ml滴度的制劑。用這些顆粒感染和在Pur存在下選擇的BHK-21細(xì)胞可用于在3-5天內(nèi)獲得YFV結(jié)構(gòu)蛋白編碼細(xì)胞培養(yǎng)物。建立之后，含VEErep/C2/Pac-和VEErep/C-prM-E/Pac-包含細(xì)胞系用先前產(chǎn)生的YFPIVs樣品以高(lOinf.u/細(xì)胞)和低(0.1inf.u/細(xì)胞)MOIs感染。在所有例子中，缺陷YFVs生產(chǎn)性地復(fù)制(見(jiàn)圖3)并且感染單層中所有細(xì)胞，產(chǎn)生高滴度的PIVs。因而，通過(guò)用包裝的VEEV復(fù)制子感染細(xì)胞建立包裝的細(xì)胞系，然后用PIVs感染，看來(lái)是一種用于大規(guī)模生產(chǎn)基因組中缺失C序列的PIVs的簡(jiǎn)單和有效的系統(tǒng)。實(shí)施例13利用表達(dá)密碼子最優(yōu)化形式的YFCC基因的VEE復(fù)制子的YFPIVs在利用包裝系統(tǒng)支持缺陷病毒的復(fù)制中的另一可能的問(wèn)題是在缺陷病毒基因組和編碼反式互補(bǔ)基因的RNAs之間的重組。所述重組可能導(dǎo)致感染性病毒的產(chǎn)生。在本文描述的實(shí)驗(yàn)中，利用噬菌斑測(cè)試不再檢測(cè)到感染性YFV,但有必要排除掉病毒可在這些細(xì)胞中形成的可能性。另外，許多節(jié)肢動(dòng)物傳播病毒編碼的蛋白期望發(fā)展為利用兩種非常不同的宿主的翻譯機(jī)制。因而，它們的密碼子使用不期望為對(duì)于每種宿主中的表達(dá)是最佳的。因此，表達(dá)盒中C-編碼序列被修飾以達(dá)到兩個(gè)目標(biāo)i)提高C生產(chǎn)的產(chǎn)量和ii)降低YFPIV基因組和VEE復(fù)制子的C-編碼亞基因組RNA之間的同源重組的可能性。利用在最有效翻譯的哺乳動(dòng)物基因中發(fā)現(xiàn)的密碼子頻率合成YFVC(圖4A)。這些沉默的突變也破壞了黃病毒基因組復(fù)制需要的環(huán)化序列，因而，降低了YFPIV基因組和VEEV復(fù)制子的YFVC-編碼RNA之間的重組事件中產(chǎn)生有復(fù)制能力的YFV的可能性。Copt基因利用與VEErep/C2/Pac和VEErep/C-prM-E/Pac相同的策略克隆入VEErep構(gòu)建體，VEErep/C叩t/Pac和VEErep/Copt-prM-E/Pac,并且反式互補(bǔ)PurR細(xì)胞系通過(guò)RNA轉(zhuǎn)染或通過(guò)用包裝的RNAs感染細(xì)胞而建立。用體外合成的PIV基因組RNA轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞有效產(chǎn)生了PIV，其類(lèi)似于用表達(dá)VEEV復(fù)制子的細(xì)胞選擇的那些，所述VEEV復(fù)制子表達(dá)非最優(yōu)化YFVC基因(圖4B)。然而，表達(dá)密碼子最優(yōu)化的C的細(xì)胞證明是有用的試劑，因?yàn)楫?dāng)用YFPIV感染并用含具有低密度FBS的培養(yǎng)基的瓊脂糖覆蓋時(shí)，它們能夠發(fā)展CPE并清楚地形成可見(jiàn)的噬菌斑(圖4C)。因而，盡管YFVC基因的密碼子最優(yōu)化沒(méi)有改變PIV從這些細(xì)胞中的生產(chǎn)，表達(dá)密碼子最優(yōu)化的YFVC的細(xì)胞代表了一種對(duì)于評(píng)價(jià)YFPIVs非常有用的系統(tǒng)，特別是不表達(dá)熒光標(biāo)記物的那些。在另外的測(cè)試中，在用噬菌斑形成測(cè)試和GFP-焦點(diǎn)測(cè)試中確定的相同樣品的滴度之間觀察到非常好的相關(guān)性。YFPIV形成的噬菌斑比YFV的噬菌斑小，顯示了結(jié)構(gòu)蛋白最可能以順式功能(cisfunction)在病毒顆粒形成中更有效地生產(chǎn)。獲得形成噬菌斑的能力的原因尚不清楚。然而，預(yù)測(cè)YFVC具有一定水平的細(xì)胞毒性，因?yàn)榘磉_(dá)密碼子最優(yōu)化形式的蛋白的VEEV復(fù)制子的細(xì)胞系證實(shí)了比編碼天然C基因的復(fù)制子的相應(yīng)物具有更低的生長(zhǎng)率。因而，YFPIV基因組復(fù)制可能導(dǎo)致足以引起CPE的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的另外改變。實(shí)施例14可為其它黃病毒產(chǎn)生PIVs為證明可容易地為其它黃病毒產(chǎn)生PIVs,將上述策略應(yīng)用于WNV。為達(dá)到這一點(diǎn)，生產(chǎn)了一種具有35-氨基酸長(zhǎng)的C蛋白的WNPIV基因組(圖5A)。為包裝這種WNPIV基因組，利用通過(guò)用非細(xì)胞致病性VEEV復(fù)制子轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞而產(chǎn)生的包裝細(xì)胞系，所述非細(xì)胞致病性VEEV復(fù)制子表達(dá)WNVC/prM/E和Pac[BHK(VEErep/C*-E*-Pac)]。為最小化在這種細(xì)胞系中復(fù)制的WNPIV基因組與VEErepRNA-編碼C蛋白之間的重組可導(dǎo)致產(chǎn)生感染性WNV的可能性，在VEEV復(fù)制子中的WNVC-編碼基因被修飾以包含在WNV環(huán)化區(qū)域中的群生(clustered)沉默突變。細(xì)胞的培養(yǎng)基能夠生產(chǎn)包裝細(xì);包中的抗原-陽(yáng)性集落(圖5B)，顯示感染性WNPIV已經(jīng);故生產(chǎn)。然而，對(duì)于用相同樣品的Vero細(xì)月包單層的感染僅僅檢測(cè)到抗原-陽(yáng)性細(xì)胞(圖5C)。1x108inf.u/ml的滴度的WNPIV在包裝細(xì)胞上一皮生產(chǎn)，并且如期望的，WNPIV可在這種細(xì)胞系上反復(fù)傳遞(passed)。因而，利用一種已建立的細(xì)胞系，可利用與上面對(duì)于YFV描述的相同的補(bǔ)助系統(tǒng)容易地獲得高滴度儲(chǔ)量的WNPIV。令人感興趣的，在WNV包裝細(xì)胞系和WNPIV的例子中，觀察到病毒產(chǎn)量在感染后期達(dá)到穩(wěn)定水平，同時(shí)出現(xiàn)CPE(結(jié)果未顯示)，然而，共復(fù)制YFPIV基因組和VEEV復(fù)制子的細(xì)胞持續(xù)生產(chǎn)PIV許多天(圖2).實(shí)施例15用YF或WNPIVs感染的細(xì)胞生產(chǎn)SVPs為證實(shí)用PIVs感染的細(xì)胞生產(chǎn)SVPs,BHK-21細(xì)胞用體外合成的YFPIVRNA轉(zhuǎn)染或用在C-表達(dá)細(xì)胞中產(chǎn)生的YFPIVs感染。從BHK-21細(xì)胞中釋放的顆粒通過(guò)超速離心而純化，并且通過(guò)利用特異于E,D1-4G2的小鼠單克隆抗體的western印跡而分析(Gentryetal.,1982)。RNA-轉(zhuǎn)染和PIV-感染的細(xì)胞產(chǎn)生可從培養(yǎng)基中成粒狀沉淀的E蛋白(圖6A)，顯示其可以微粒形式存在。由于這些細(xì)胞不顯示任何CPE,并且樣品在超速離心之前以低速離心而被澄清，在粒狀沉淀部分中4企測(cè)的E蛋白不可能代表細(xì)胞碎片。類(lèi)似的，western印跡分析證實(shí)用WNPIV感染的Vero細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外形式的E(在CEP的任何征兆發(fā)展之前)，其與通過(guò)WNV-感染Vero細(xì)胞生產(chǎn)的在大小上是不能區(qū)別的(圖6B)。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)PIV-感染細(xì)胞釋放的E蛋白的物理性質(zhì)，從僅包含復(fù)制PIV基因組的細(xì)胞中收集的培養(yǎng)基根據(jù)已公開(kāi)的數(shù)據(jù)進(jìn)行蔗糖密29度梯度分析(Schalichetal.,1996)。SVPs在具有2%蔗糖組分中被發(fā)現(xiàn)(圖6C)。在同樣的實(shí)驗(yàn)中，YFV病毒體證實(shí)了高密度，并且在具有42%蔗糖組分中被檢測(cè)到。以WNVSVPs期望大小遷移的E蛋白-包含顆粒也在WNVPIVs感染的培養(yǎng)物中祐J險(xiǎn)測(cè)。E在PIV-感染細(xì)胞的培養(yǎng)基中的存在與通過(guò)僅表達(dá)缺少功能性C基因的prM/E或TBEVRNA疫苗的SVPs的生產(chǎn)是一致的。實(shí)施例16PIV在動(dòng)物中的安全性，效<介，和歲文率WN和YFPIVs的安全性通過(guò)i.c.接種數(shù)胎的(littersof)3到4天齡的小鼠而建立。這些研究顯示接種了WTYFV或WNV的小鼠祐二快速殺死，并且這些病毒在這些動(dòng)物中展現(xiàn)了大約1PFU的50%致死劑量(LD5q)(表1)。然而，以2x106inf.u劑量接種到乳鼠的WN和YFPIVs沒(méi)有殺死任何小鼠(表1)。安全性進(jìn)一步通過(guò)用野生型(wt)病毒和WNPIVsi.p.接種成體小鼠而證明。這些研究顯示了WNPIVs在成體小鼠中是完全安全的(表2)。而且，wtWNV殺死了顯著一部分的成體小鼠，LD5o小于1PFU,3x106inf.u的劑量的WNPIV不能導(dǎo)致任何死亡(表2)。然而，最令人感興趣的是如下發(fā)現(xiàn)WNPIVs是非常有力的免疫原(利用接種30,000inf.u檢測(cè)NEUT滴度)，并且免疫接種了3x104,3x105,或3xl06inf.u的100%的動(dòng)物獲得抗WNV的NY99株的100LD5Q攻擊的保護(hù)(表2)。表l:在乳鼠中的PIVs的安全性。接種物a劑量(inf.u)b%存活c平均存活時(shí)間WNPIV2,000,000100(9/9)NAeWNVTX020.256(5/9)8.5(+/-2.9)WNVTX0220(0/9)5.4(+/-0.5)WNVTX02200(0/8)6(+/誦0)WNVTX022000(0/10)4.9(+/-0.3)YFPIV2,000,000100(10/10)NAeYFV17D0.289(8/9)8(+/-0)YFV17D256(5/9)7(+/-0)YFV17D2011(1/9)6.9(+/-2.4)YFV17D_^_0(0/12)_6(+/-0)a接種制劑，在具有10%FBS的培養(yǎng)基中稀釋。b通過(guò)i.C.途徑以20ml/動(dòng)物的體積遞送。e接種后14天的存活(存活/死亡)。d來(lái)自死于感染的動(dòng)物的平均存活時(shí)間(標(biāo)準(zhǔn)偏差)。e不適用。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>a接種制劑，在具有10%FBS的培養(yǎng)基中稀釋。b通過(guò)i.p.途徑以100ml/動(dòng)物的體積遞送。。接種后14天的存活(存活/死亡)。d來(lái)自死于感染的動(dòng)物的平均存活時(shí)間(標(biāo)準(zhǔn)偏差)。'e在接種后21天收集自2個(gè)動(dòng)物的匯集血清的NEUT滴度(顯示的滴度是最高稀釋度，產(chǎn)生WNV集落形成80%的降低)。f抗100LD5q的WNV的NY99抹的攻擊的保護(hù)被攻擊后14天的存活所證實(shí)；來(lái)自稀釋接種組的單個(gè)存活者從笫8-14天顯示了疾病的征兆(駝背，皺毛，和不適)。PIV接種動(dòng)物在14天的攻擊后觀察期中沒(méi)有顯示任何疾病的征兆。s不適用。h來(lái)自未免疫小鼠血清的NEUT滴度與來(lái)自WNPIV-接種小鼠的血清被并行地測(cè)試。實(shí)施例17進(jìn)一步修飾以提高PIVs/RepliVAX的產(chǎn)量和安全性本發(fā)明證實(shí)了RepliVAX的反復(fù)傳代不產(chǎn)生重組，但是具有增強(qiáng)的生長(zhǎng)的變體^皮選擇WNVRepliVAX在編碼WNVC蛋白的細(xì)胞系上反復(fù)傳代。通過(guò)將WNVC基因的一種拷貝與Pac基因融合，其由一種非細(xì)胞致病性VEErep亞基因組啟動(dòng)子(Petrakovaetal.，2005)驅(qū)動(dòng)，而生產(chǎn)C蛋白。在獲得的構(gòu)建體中(VEErep/Pac-Ubi-C",泛素(Ubi)基因被插入到C基因之前，并且C后面緊接著終止密碼子。在本背景中，可生產(chǎn)Pac-Ubi融合蛋白連同成熟C蛋白(缺少疏水性錨；見(jiàn)圖9)。在VEErep中的C基因(表示為"C^")通過(guò)插入36個(gè)突變被進(jìn)一步修飾，所述36個(gè)突變切除CS信號(hào)，將GUCAAUAUGCU(SEQIDNO:2)的11堿基區(qū)域轉(zhuǎn)變?yōu)镚UgAAcAUGuU(SEQIDNO:3)同時(shí)保持C編碼能力。這種大量的突變顯著降低了同源重組的可能性，并且，如果不發(fā)生基因組之間的重組，復(fù)制活性基因組的生產(chǎn)不能發(fā)生，因?yàn)楫a(chǎn)生的RNA將具有不匹配的CSs，這防止了復(fù)制(圖9)。為測(cè)試生產(chǎn)性重組的不可能性，從表達(dá)VEErep/Pac-Ubi-C*(BHK(VEErep/Pac-Ubi-C")的BHK細(xì)胞產(chǎn)生了一種克隆細(xì)胞系，并且這種細(xì)胞系^L用于傳代WNRepliVAXlO次(在每個(gè)例子中以0.01的MOI感染)，并且產(chǎn)生的RepliVAX已經(jīng)詳細(xì)描述。為確定lO-(plO)代群體是否包含任何活病毒，用p10WNRepliVAX以0.1,l,和10的復(fù)數(shù)感染Vero細(xì)胞單層，并且廣泛清洗以去除細(xì)胞外RepliVAX。這些單層在24小時(shí)后重新清洗，并且然后在2天后收獲。當(dāng)用WNV的高敏感多克隆抗體染色時(shí)來(lái)自這些培養(yǎng)物的上清液傳遞到新鮮Vero細(xì)胞培養(yǎng)物上不能顯示出任何免疫陽(yáng)性細(xì)胞，顯示出RepliVAX沒(méi)有與包裝的細(xì)胞系編碼的C蛋白生產(chǎn)性重組。令人感興趣的是，當(dāng)p10WNRepliVAX與p0RepliVAX在BHK(VEErep/Pac-Ubi-C"細(xì)胞系上比較時(shí)，p10RepliVAX產(chǎn)生了感染的多態(tài)集落，許多比p0RepliVAX產(chǎn)生的大得多(圖10)。而且，p10RepliVAX與p0RepliVAX相比在早期時(shí)間點(diǎn)復(fù)制高10倍，終點(diǎn)滴度為兩倍。獲自產(chǎn)生自用p10RepliVAX感染的Vero細(xì)胞的cDNA的PCR產(chǎn)品的分析證實(shí)沒(méi)有包含全長(zhǎng)C編碼區(qū)的產(chǎn)品。然而，跨越這些區(qū)域變。如從在包裝細(xì)胞上的p10RepliVAX生產(chǎn)的集落的異源性質(zhì)所期望的(圖10),兩種突變都表示為具有初始RepliVAX序列的混合物。一種突變，其表現(xiàn)為存在于這些序列反應(yīng)中一半核酸群體之上(在兩個(gè)方向的測(cè)序)，由在RepliVAX基因組的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)(S(c)VGA|VTLS(SEQIDNO:4)之前的P4位點(diǎn)的AGOuGC(S〉C)突變組成。第二種突變，其僅僅存在于大約30%的擴(kuò)增序列中(也在兩個(gè)方向完成的反應(yīng)中)，由在NS2B/NS3剪切位點(diǎn)(QKKR|GGK(m)T)(SEQIDNO:5)之后的位點(diǎn)P3中的AAG〉A(chǔ)uG(K〉M)組成。盡管這些突變?cè)谌笔Я薙L5的位點(diǎn)中，它們不改變預(yù)測(cè)的RNA結(jié)構(gòu)。更好生長(zhǎng)的RepliVAX的快速選擇(僅僅10個(gè)生長(zhǎng)循環(huán))是非常令人興奮的，因?yàn)樗@示出更好生長(zhǎng)變體的選擇是一種改進(jìn)RepliVAX的有力的方法。這些突變的位點(diǎn)不是不期望的，因?yàn)橐阎狽S2B/NS3對(duì)(versus)信號(hào)肽剪切的改變效率可影響黃病毒顆粒產(chǎn)量和感染性(Keelapangetal.,2004;Leeetal.,2000;LobigsandLee,2004;Yamschikovetal.,1997)。持續(xù)研究了甚至更好生長(zhǎng)的變體的選擇，并且為插入第二代RepliVAX構(gòu)建體這兩種突變被革巴向，以確認(rèn)它們分別(或一起)提高RepliVAX產(chǎn)量和抗原生產(chǎn)的能力。然而，本文表示的數(shù)據(jù)顯示在這些傳代條件下l)沒(méi)有發(fā)生重組，2)陽(yáng)性選擇可用于生產(chǎn)改善的RepliVAXs。JERepliVAX的盲目傳代類(lèi)似地產(chǎn)生了具有在基因組相同區(qū)域突變的更好生長(zhǎng)的變體。對(duì)于生產(chǎn)更好生長(zhǎng)的變體盲目傳代RepliVAX產(chǎn)品的能力是本發(fā)明的關(guān)鍵特征，和相對(duì)于傳統(tǒng)LAV的一種清楚的優(yōu)點(diǎn)，所述傳統(tǒng)LAV中由于考慮到更好生長(zhǎng)變體可能已經(jīng)喪失了它們?cè)谌酥械臏p毒性，更好生長(zhǎng)變體的生產(chǎn)通常是復(fù)雜的。而且，突變的改善的C-表達(dá)盒(VEErep/Pac-Ubi-C",其已經(jīng)顯示為穩(wěn)定的并證實(shí)了當(dāng)用于BHK細(xì)胞系(對(duì)于人疫苗生產(chǎn)沒(méi)有批準(zhǔn))中時(shí)不會(huì)重組，當(dāng)引入Vero細(xì)胞(一種已經(jīng)接受的用于人疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系)中時(shí)也已經(jīng)顯示出對(duì)于PIV繁殖是穩(wěn)定并有用的。特別的，33對(duì)應(yīng)于VEE復(fù)制子的RNAs已利用與應(yīng)用于BHK細(xì)胞相同的方法從合格種引入Vero細(xì)胞。RNA引入Vero細(xì)胞之后，細(xì)胞維持在含噪呤霉素的無(wú)血清培養(yǎng)基中(一種對(duì)于疫苗生產(chǎn)重要的問(wèn)題)，并且這些細(xì)胞顯示出對(duì)于PIV繁殖是有用的。在這些繁殖條件下，這些細(xì)胞顯示出生產(chǎn)比類(lèi)似來(lái)源的BHK細(xì)胞稍低的PIV滴度，但VEErep/Pac-Ubi-C*-Vero細(xì)胞在這些培養(yǎng)條件下進(jìn)行得更好，允許多重收獲。圖11顯示了為在無(wú)血清條件下的多重收獲可獲得PIV從這些細(xì)胞的生產(chǎn)。總之，表達(dá)C(特別是包含prM的信號(hào)序列，或該區(qū)加上prM和E基因的部分的C盒)的細(xì)胞系中PIVs的繁殖理論上可與PIV基因組重組，產(chǎn)生可導(dǎo)致疾病的活病毒，增加疫苗生產(chǎn)方法的風(fēng)險(xiǎn)。為克服這一問(wèn)題，本發(fā)明證實(shí)了用于WNPIV繁殖的細(xì)胞系可利用C蛋白生產(chǎn)，所述C蛋白正好終止于NS2B/NS3剪切位點(diǎn)，使在PIV基因組該區(qū)域的重組機(jī)會(huì)最小化，提供了相對(duì)于其它繁殖方法的優(yōu)點(diǎn)，在所述其它方法中，細(xì)胞系編碼RNAs,所述RNAs編碼與PIV共享的C的錨部分(也已知為prM的信號(hào)肽)。為進(jìn)一步增強(qiáng)這種C-表達(dá)盒的安全性，本發(fā)明證實(shí)了用于制備補(bǔ)助PIV基因組的VEErep-編碼C的盒的部分(也就是由于病毒復(fù)制需要的潛在的RNA元件，編碼生產(chǎn)復(fù)制性PIV基因組所需要的氨基酸序列的最初30密碼子，)可被特異性突變以生產(chǎn)與PIV基因組在36核苷酸位點(diǎn)不同的盒(不改變蛋白產(chǎn)品地引入)，產(chǎn)生顯著降低與PIV基因組的重組可能性的C基因(圖9)。而且，這種突變的C基因被產(chǎn)生以具有在環(huán)化信號(hào)(CS)中的三種突變，其必須與PIV基因組的3，UTR中的CS互補(bǔ)以允許病毒復(fù)制，提供了防止重組的進(jìn)一步的安全性特征(圖9)。最后，通過(guò)將泛素基因利用到來(lái)自得到的多聚蛋白的完整C產(chǎn)品(替代的自我剪切序列例如FMDV的自身-蛋白酶2A,或其它相關(guān)序列可容易地替代泛素)將這種C基因插入到VEE復(fù)制子，在可選擇標(biāo)記物基因(pac)之后。這種單獨(dú)-多聚蛋白盒的產(chǎn)生提供了生產(chǎn)遺傳上更穩(wěn)定的VEE復(fù)制子的優(yōu)點(diǎn)，降低了在繁殖細(xì)胞系中的重組機(jī)會(huì)，消除了C-表達(dá)盒，并降低了PIV產(chǎn)量。得到的構(gòu)建體(VEErep/Pac-Ubi-C氣圖9)被引入BHK細(xì)胞，并且利用已經(jīng)建立的方法將細(xì)胞用于生產(chǎn)表達(dá)VEE復(fù)制子的克隆細(xì)胞系(Fayzulinetal.,Virology2006)。從單個(gè)細(xì)胞克隆18次傳代之后檢查克隆細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有任何C盒的遺傳缺失的證據(jù)(通過(guò)RT-PCR),也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在C-表達(dá)盒中有任何可檢測(cè)的突變。最重要的是，這種細(xì)胞系顯示出以41的傳代水平繁殖WNVPIV的類(lèi)似能力。最后，在細(xì)胞系上10次傳代之后，沒(méi)有觀察到重組生產(chǎn)的能夠在不表達(dá)C盒的細(xì)胞(也就是WTVero細(xì)胞)上生產(chǎn)性復(fù)制的PIV-重組體的證據(jù)，也沒(méi)有觀察到通過(guò)RTPCR將C-編碼序列fI入到PIV基因組的證據(jù)。而且，為處理PIV可能與疫苗中的黃病毒在免疫時(shí)重組產(chǎn)生新的有毒的黃病毒的考慮，本發(fā)明證實(shí)了具有"非天然"存在于所有已知的天然循環(huán)黃病毒中的環(huán)化信號(hào)(CS)的WNV基因組可被產(chǎn)生，復(fù)制到高水平。在一些實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生了在所有黃病毒基因組的5，和3，末端發(fā)現(xiàn)的兩種CS必須是100%互補(bǔ)以提供生產(chǎn)性病毒復(fù)制的證據(jù)(Khromykhetal.J.Virol.,2001;Loetal.,J.Virol.,2003;Alvarezetal.,Virol.,2003)。這些研究還證實(shí)了非天然CSs可生產(chǎn)復(fù)制性基因組，只要CS是100%互補(bǔ)。然而這些研究者報(bào)告了具有非天然CS序列的所有基因組具有復(fù)制缺陷。通過(guò)WNV基因組中的CS系統(tǒng)性分析，特別是測(cè)試仔細(xì)選擇的單個(gè)堿基交換產(chǎn)生高水平復(fù)制的能力，鑒定了允許高水平的基因組復(fù)制的單堿基交換，和后來(lái)的雙堿基交換(圖12A)。圖12B證實(shí)了具有兩個(gè)堿基取代的WNV基因組的高水平復(fù)制是可能的，并且具有錯(cuò)配CS序列的故意生產(chǎn)的基因組(也就是WT和2-堿基突變體)不具有復(fù)制活性。這種突變，和其它類(lèi)似的突變，可因此被利用以生產(chǎn)具有很好安全性能的PIV,因?yàn)楫a(chǎn)生自CS-修飾PIV疫苗和在接受免疫接種的人群的區(qū)域傳播的病毒之間的單點(diǎn)遺傳重組的任何重組病毒將不具有復(fù)制活性，并因而不能導(dǎo)致疾病。實(shí)施例18表達(dá)WNVC基因的BHK細(xì)胞維持它們的表型多代對(duì)源于用VEErep/Pac-Ubi-C承轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞的WNVC-表達(dá)克隆細(xì)胞系的研究已經(jīng)證實(shí)了由于幾種原因的其在產(chǎn)生RepliVAX中長(zhǎng)期穩(wěn)定性和實(shí)用性。首先，這些細(xì)胞對(duì)于RepliVAX的反復(fù)傳代是有用的。第二，在兩種不同的代水平時(shí)(單個(gè)細(xì)胞克隆后8&24代)對(duì)于細(xì)胞的并行(sidebyside)集落形成測(cè)試顯示不能區(qū)別的WNRepliVAX滴度和集落大小。最后，對(duì)在24代水平的這些細(xì)胞的C-編碼盒的序列的直接分析顯示相對(duì)于原初VEErep序列沒(méi)有改變。將這些數(shù)據(jù)拿到一起顯示了含有C-表達(dá)VEEreps的細(xì)胞應(yīng)該對(duì)于在目前接受的用于生產(chǎn)人疫苗的主細(xì)胞種子批模式(mastercellseedlotformat)的應(yīng)用是足夠穩(wěn)定的。而且，VEEreps已^皮用于人的實(shí)-瞼中的事實(shí)使得4艮可能VEErep-細(xì)胞技術(shù)在Vero細(xì)胞中的應(yīng)用在規(guī)章審批過(guò)程中不會(huì)遇到任何意想不到的障礙。實(shí)施例19WNVVLPs的'淋巴組織革巴向如上所示，WNVVLPs與RepliVAX類(lèi)似，除了代替了黃病毒prM/E蛋白之外，它們可編碼報(bào)道基因，或它們可簡(jiǎn)單地包含不具有報(bào)道基因的黃病毒復(fù)制子。VLPs可在表達(dá)所有三種WNV結(jié)構(gòu)蛋白的包裝細(xì)胞中容易地生產(chǎn)，并且已經(jīng)以高滴度被生產(chǎn)(Fayzulinetal.,2006)。當(dāng)107U的VLP被接種入小鼠時(shí)，接種24小時(shí)后這些動(dòng)物在血清中產(chǎn)生了1,000到5,000U/ml的I型干擾素(IFN)。通過(guò)ip和皮下足墊注射(fp)產(chǎn)生了IFN響應(yīng)。而且，fp接種b-半乳糖苷酶-表達(dá)VLPs24小時(shí)后切割的腿彎部淋巴結(jié)包含大量b-半乳糖苷酶-陽(yáng)性細(xì)胞，顯示VLPs,其以不可區(qū)別于RepliVAX的方式進(jìn)入細(xì)胞，是靶向于重要的淋巴器官的。這種結(jié)果與通過(guò)VLP-注射引發(fā)的高水平IFN是一致的，并且暗示了類(lèi)似的靶向是RepliVAX的高效價(jià)和高效率的原因。下列參考文獻(xiàn)在此引用Aberle,J.H.等,1999,//畫(huà)畫(huà)/163，6756-61.Aberle,J.H.等,2005,/79，15107-13.Bredenbeek,P.J.等，2003JK,'ra/84，1261-8.Chambers,T.J.等,1999/K/ra/73，3095-101.Clyde和HArris,2006,JVirol80:2170-2182.Colombage,G.等，1998,K/ra/ogy250，151-63.Davis,B.S.等，2001,Jbw歷/q/Tz油gy75，4040-4047.Fayzulin等，2006,Virology351:196-209.Filomatori等，2006,GenesDev20:2238-2249.Fonseca,B.A.等，1994,Fac""e12，279-85.Gentry,M.K等，1982,爿mJ7>op31，548-55.Gemsimon,G.,和Lowry,K,,2005,SowAA/^/J98，653-6.Haas,J.等,1996C群編6，315-24.Hall,R.A.等，2003，尸tocA^"cac/&/t/S爿100，10460-10464.Huang,C.Y.等,2003,/77,11436-47.Kanesa,T.N.等,200019，483-491.Keelapang等，2004，JVirol78:2367-2381.Kochel,T等，1997,Fac""e15，547-52.Kochel,T.J.等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(WEEV)或羅斯河病毒。32.藥物組合物，其包含通過(guò)權(quán)利要求18所述方法生產(chǎn)的黃病毒科的復(fù)制缺陷假性感染性病毒。33.保護(hù)受試者免受暴露于黃病毒導(dǎo)致的感染的方法，其包括給受試者施用免疫有效量的權(quán)利要求32的藥物組合物，其中所述組合物在受試者中產(chǎn)生針對(duì)黃病毒的免疫反應(yīng)，從而保護(hù)受試者免受感染。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述施用是通過(guò)腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、口服或鼻內(nèi)途徑。35.權(quán)利要求33的方法，其中所述受試者是人或動(dòng)物。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了缺失了衣殼基因的屬于黃病毒科的復(fù)制缺陷假性感染性病毒，其中所述復(fù)制缺陷假性感染性病毒僅僅在表達(dá)黃病毒的衣殼或衣殼、prM和被膜蛋白的細(xì)胞中繁殖。本發(fā)明還公開(kāi)了大規(guī)模生產(chǎn)所述病毒的方法和這些假性感染性病毒作為疫苗的用途，所述疫苗用于預(yù)防由屬于該家族的病毒感染人或動(dòng)物引起的疾病。文檔編號(hào)A61K39/12GK101454022SQ200780015007公開(kāi)日2009年6月10日申請(qǐng)日期2007年2月27日優(yōu)先權(quán)日2006年2月27日發(fā)明者E·弗羅洛瓦,I·弗羅洛夫,P·C·梅森申請(qǐng)人:得克薩斯系統(tǒng)大學(xué)評(píng)議會(huì)