專利名稱：用于變態(tài)反應治療、結合tlr9和cd32且包含t細胞表位的雙特異性分子的制作方法
用于變態(tài)反應治療、結合TLR9和CD32 且包含T細胞表位的雙特異性分子
本發(fā)明涉及具有針對Toll樣受體9 (TLR9)和CD32二者的結合特異性且 包含一種或多種T細胞抗原表位的分子。
物方面的用途。 引言
變態(tài)反應被認為是對環(huán)境(空氣/水/食物)中蛋白質的過敏反應。變應 原是這樣的抗原，特應性患者對該抗原以IgE抗體應答做出響應，該IgE抗體 應答隨后引起變應性反應。復合物中或融合蛋白中的抗原可以是環(huán)境變應 原(例如房屋塵螨、樺樹花粉、草花粉、貓抗原、蟑螂抗原)、或食物變應 原(例如牛奶、花生、蚱、大豆)、或二者的組合。IgE分子是重要的，原因 在于它們在效應細胞(肥大細胞、嗜^喊細胞和嗜曙紅細胞)活化中的作用。 近來，已經接受IgE在變應性疾病的誘發(fā)階段中也起重要作用，其通過上調 B細胞和樹突細胞(DC)的抗原捕獲潛能，二者都是通過低親和力(CD23) 和高親和力(FcsRI)受體[l]。 IgE抗體的消極功能可以被變應原特異性IgG 抗體所抵消，例如由于它們將免疫應答從B細胞引導至單核細胞和DC [2]。 此外，它們與IgE分子竟爭變應原結合位點。因此，可以通過對變應原特異 性IgG分子的誘導來治療、治愈和預防變態(tài)反應。
與lgE分子僅為3天相比，IgG分子具有大約3周的血清半衰期。IgE分子 是由(幼稚)B細胞和Th2細胞間相互作用誘導的，Th2細胞提供IL-4和IL-l 以及CD40L表達，其是在記憶B細胞和漿細胞中誘導轉向IgE的類別轉換 (classswitch)所必需的[3]。相反的，產生IFN-Y和IL-2的Thl細胞誘導轉向IgG 的類別轉換。因此，針對變應原誘導Thl而不是Th2輔助T細胞應答對預防、 治療和治愈變應性疾病是有益的。
目前在應用幾種利用變應原的主動疫苗接種形式。最普遍的是所謂的 "免疫療法"，其依賴于用相對高濃度的變應原頻繁免疫接種。這種技術只是在少數變應性疾病中中等有效，諸如蜂毒變應原及鼻炎和結膜炎的一些情 況，而且近來一些報道顯示了在哮喘和特應性皮炎中的效力。最近已經提
議用結果稍好的突擊免疫療法(rush immunotherapy)，其中在相當短的時間框 架內注射漸增量的變應原[4; 5]。通常采用皮下路徑施用變應原，但是近來 該路徑與口服施用或甚至局部施用進行了比較，結果一般是肯定的但不總 是一致的。免疫療法的另 一種技術是由Saint-Remy (EP 0 178 085和0 287 361) 記載的，其利用在體外與相關變應原復合的自體IgG抗體。該技術允許使用 量小得多的變應原而具有較少的副作用。
這些療法后面的機理尚不清楚。在經典療法中，如果該療法誘導特異 性IgG抗體的增加，則出現有利的效果，盡管不是特異性IgG的每次顯著增 加都與成功的免疫療法相關聯。關于為何如此的一種可能的論據是IgG抗體 對B細胞、單核細胞和肥大細胞上的CD32相對低的親和力。Saint-Remy方法 從患者中選出特異性IgG抗體，隨后與相應變應原在體外混合。這樣他們確 保變應原不能與細胞或細胞上的其它抗體同種型諸如肥大細胞上的IgE自由 起反應。此外他們宣稱制備了針對特定IgG分子的抗獨特型抗體，它們在未 來將預防變態(tài)反應。
WO 97/07218中記載了變應原-抗CD32融合蛋白。在該公開出版物中， 克服了有關分離特異性IgG分子及這些IgG抗體對CD32的低親和力的問題， 并且降低了利用完整"IgE結合性，，變應原的經典免疫療法的風險因子。然而 所宣稱的由于僅僅可1導含抗CD32的疫苗至樹突細胞所致的Thl記憶應答的 誘導不能被證實。
應成功治療的藥物方面仍有4交大需求。
因此，本發(fā)明的目的是提供具有改進特性的、用于治療變應性疾病的 新分子。
根據本發(fā)明，該目的通過權利要求的主題得以實現。
發(fā)明簡述
背景
CD32在單核細胞/樹突細胞和B細胞上強表達，因此本發(fā)明的分子設計 用來引導免疫反應至這些重要的免疫學細胞，目的在于預防B細胞對變應原的呈遞，同時促進尤其是樹突細胞(DC)對變應原的呈遞，后者導致對針對 變應原的Thl應答的誘導，該變應原就是可配制成疫苗的分子或分子復合物 中的變應原。近來的認識顯示存在兩種類型的樹突細胞(DC):髓樣樹突細 胞(mDC)和類漿樹突細胞(pDC)[6]，這導致DC1和DC2細胞的新概念[7]。在 此概念中，DCl細胞在抗原特異性刺激后促進對Thl細胞發(fā)育的誘導，而DC2 細胞支持Th2細胞的發(fā)育。 一般認為單核細胞衍生的DC (mDC)是DCl類型 的，而認為pDC是DC2類型的[6]。這兩種類型的DC都表達CD32a,并且將 誘導變應原特異性T細胞應答；然而沒有保證結果將是Thl型的。事實上， 在變應性供體中更可能是Th2應答[8]。重要的是，pDC表達結合CpG-ODN (包含未曱基化CpG基序的寡聚脫氧核糖核苷酸[ODN])的TLR9受體。該 受體在pDC中的活化導致非常強的IFN-a和IL-12生成[9],其促進TM誘導， 并因而將潛在DC2轉換為DC1細胞。
因此，本發(fā)明的分子可以將TLR9受體在pDC中的活化與變應原特異性 Thl細胞的特異性刺激和誘導相結合，因此包含先前概念的顯著改進。
本發(fā)明包含具有toll樣受體9和CD32結合特異性的分子或分子復合物， 其中所述分子或分子復合物包含至少 一種抗原的至少一種表位，優(yōu)選至少 一種T細胞表位。
本發(fā)明的分子或分子復合物還將為了天然變應原規(guī)避攜帶IgE的肥大細 胞的效應器功能，該天然變應原的T細胞表位選擇作為融合蛋白的 一部分。
優(yōu)選的是，根據本發(fā)明的分子或分子復合物可以具有一項或多項下列 獨特特性
活化和誘導變應原特異性Thl細胞，但不活化變應原特異性B細胞。
活化和誘導變應原特異性Thl細胞，但不活化肥大細胞或任何其它效應細 胞，其通過變應原特異性IgE或IgG可以變?yōu)閮羝ぬ烊蛔儜罨?，該?然變應原的選定T細胞表位在本發(fā)明的分子或分子復合物中呈遞。
本發(fā)明分子或分子復合物的CD32結合部分選擇應當內在化整個分子或 分子復合物的相關細胞。
在根據本發(fā)明的融合蛋白被抗原呈遞細胞內在化后，本發(fā)明的分子降 解，并且多種肽(包括所摻入的T細胞表位)呈遞在抗原呈遞細胞的MHCII 類分子上，由此刺激變應原特異性T細胞。
本發(fā)明的分子或分子復合物中所摻入的TLR9結合結構對于通過結合至漿細胞(cytoplasmatic) [lO;ll] TLR9受體來誘導變應原特異性Thl記憶庫是 必需的。TLR9受體的活化導致對IFN-a和IL 12生成的強誘導[9]。
根據本發(fā)明，分子是由原子和/或其它分子通過共價一建構成的單獨實體。 分子可以是由單一類別物質或其組合構成的。物質的種類是例如多肽、碳 水化合物、脂質、核酸等。
分子復合物是彼此特異性且強烈相互作用的分子的集合體。各種/多個 分子的復合物可以是通過疏水作用而形成的(諸如例如Fv中抗體可變區(qū)的 結合)，或通過一個分子與另 一個分子經配體/受體相互作用而強烈結合而形 成的(諸如抗體-抗原結合或親合素-生物素)，或通過經螯合化學基團的復 合物形成而形成的，等等。
抗原可以是能夠被抗體、由I類或II類MHC分子呈遞時的B細胞受體或T 細胞受體所識別的結構。
表位是一皮抗體、由I類或II類MHC分子呈遞時的B細胞受體或T細胞受體 所特異性結合的最小結構。特異性定義為在某環(huán)境內對某種分子結構(在 抗體/抗原相互作用中也稱為表位)的優(yōu)先結合。
結構域或域是在蛋白質或多肽上找到的離散區(qū)域。單體結構域在沒有 側翼天然氨基酸序列存在時在溶液中形成天然三維結構。本發(fā)明的結構域 將特異性結合CD32和/或TLR9和/或展示或呈遞表位。結構域可以作為單一 結構域或單體結構域使用，或組合形成二聚體和多聚體結構域。例如，形 成結合至靶分子的三維結構的多肽是單體結構域。
白超家族的相關分子(諸如可溶性T細胞受體)?？贵w片段中有抗體的功能 性等同物或同源物，包括任何下述多肽，所述多肽包含免疫球蛋白結合結 構域或小的突變的免疫球蛋白結構域或模擬該結合結構域的肽，以及Fc區(qū) 或與Fc區(qū)同源的區(qū)或其至少一部分。包含免疫球蛋白結合結構域或等同物 且其融合至另一多肽的嵌合分子包括在內。
變應原是特應性患者對其以變應性應答做出響應的抗原。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了能夠結合toll樣受體9 (TLR9)和Fc y受體RII (CD32)且包含 至少 一種抗原的至少 一種表位的分子或分子復合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子或分子復合物包含至少三個部
分， 一個部分是特異性結合TLR9 (單價地、二價地或多價地)的結構，另 一個部分是特異性結合CD32 (單價地、二價地或多價地)的結構，以及至 少一個其它部分是抗原和/或變應原的一種或多種T細胞表位。各部分可以是 獨立結構，通過化學連接或遺傳融合或其它(非共價)相互作用諸如配體-受體或抗體相互作用而連接在一起。
不同部分之間的連接可以是不同的。例如，在一個優(yōu)選實施方案中， 結合TLR9和CD32的各部分間的連接是通過遺傳融合，與至少一個T細胞表 位的連接是通過受體/配體相互作用(例如生物素-鏈霉親合素)。這樣的結 構的優(yōu)點是制備的靈活性。所述分子復合物的雙特異性(抗TLR9/抗CD32 ) 通用部分(generic part)可以用同樣的方式為所有患者制備，根據需要將選定 的T細胞表位連接至分子復合物的通用部分。選擇可以基于疾病流行(disease prevalence)或基于患者的個體特異性測試結果(特定變應原)。復合物形成 可以集中或在床邊或在醫(yī)生辦公室進行。
相同或不同化學類型的各種結合分子的分子化學連接可以通過許多不 同技術來實現，或是生成限定分子比例的本發(fā)明分子或分子復合物各部分。合物。
本發(fā)明的各部分的比例可以是等摩爾的或不等摩爾的。所述分子對于 結合TLR9和/或CD32和/或T細胞表位可以是單價的。它還可以對于所述分子 或分子復合物的至少一個部分是二價、三價和多價的。如果對于結合TLR9 和/或CD32是二價或更高價的，那么結合特異性可以分別是針對CD32和/或 TLR9上的 一種或多種表位的。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述分子的結合特異性是交疊的，從 而使本發(fā)明分子或分子復合物的一個部分結合TLR9和CD32二者。可以通過 同時篩選結合CD32和TLR9二者的分子或通過工程改造結合CD32和TLR9 二者的分子來選擇這樣的部分。例如，蛋白質支架可以用來展示結合CD32 的環(huán)和其它結合TLR9的環(huán)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，蛋白質支架可以用來展示結合CD32的 結構、結合TLR9的結構和用來展示T細胞表位。疫球蛋白的Fc部分結合CD32。 CpG是TLR9的天然存在配體。
特異性結合分子可以是肽?？梢酝ㄟ^多種方法諸如噬菌體展示技術或
可以以多種形式選擇和使用所述肽，諸如線性的、受約束的(constrained)或 環(huán)狀的肽，為了穩(wěn)定性和/或特異性可以對所述肽進行化學修飾。
特異性結合肽還可以通過分離配體的最小結合位點，從天然存在的蛋
特異性結合肽可以像這樣的用于本發(fā)明的分子或分子復合物，或者摻 入其它結構，諸如通過移植入蛋白質支架、抗體和蛋白質結構域，或者通 過化學偶聯至可以作為本發(fā)明分子或分子復合物一部分的載體分子。
本發(fā)明的分子或分子復合物的結合部分可以由蛋白質構成，諸如抗體 或抗體片,史(諸如Fab、 Fv、 scFv、 dAb、 F(ab)2、《敬體(minibody)、小的突 變的免疫球蛋白結構域、可溶性T細胞受體等)?？梢愿鶕阎椒ㄖT如雜 交瘤技術、B細胞克隆、抗體庫的噬菌體展示、核糖體展示或細胞表面展示、 變體抗體的陣列篩選來生成和選擇結合TLR9和/或CD32的抗體和抗體片段 以及4汙生物。
本發(fā)明的分子或分子復合物的結合部分可以是天然存在的蛋白質結構 域或人工修飾的結構域。蛋白質結構域或結構域衍生物(例如具有突變諸 如氨基酸替代、刪除或插入的結構域)或化學修飾的結構域可以根據已知 方法(例如結構域或結構域變體文庫的噬菌體和細胞表面展示和篩選，分 子變體的陣列和篩選)選擇對TLR9和/或CD32的結合。所述結構域包括但 不限于來自下列類型的分子
EGF樣結構域、Kringle結構域、纖連蛋白I型結構域、纖連蛋白II型結構域、 纖連蛋白m型結構域、PAN結構域、Gla結構域、SRCR結構域、Kunitz/牛胰 臟胰蛋白酶抑制劑結構域、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑結構域、三葉草 (Trefoil) (P型)結構域、vonWillebrand因子C型結構域、過敏毒素樣結構域、 CUB結構域、曱狀腺球蛋白I型重復、LDL受體A類結構域、Sushi結構域、 連接(Link)結構域、血小板反應蛋白(thrombospondin) I型結構域、免疫球蛋 白結構域、免疫球蛋白樣結構域、C型凝集素結構域、MAM結構域、von Willebmnd因子A型結構域、A-結構域、生長調節(jié)素B結構域、WAP型四二硫 化物核結構域、F5/8C型結構域、血紅素結合蛋白(hemopexin)結構域、SH2結構域、SH3結構域、層粘連蛋白型EGF樣結構域、CTLA-4結構域、C2結構域。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分子或分子復合物的結合部分包含 小的突變的免疫球蛋白結構域(SMID)，如PCT/EP2006/050059中所記載的。
本發(fā)明的分子或分子復合物的結合部分可以是核酸，諸如RNA或DNA， 其可以才艮據已知方法諸如適體篩選和體外進化技術選擇對TLR9和/或CD32 的特異性結合。
設想了其它分子類型也將能夠顯示出對TLR9和/或CD3 2的特異性結 合。可以對上文所述以外的其它化學實體文庫(包括碳水化合物、脂質、 和有機小分子)篩選對TLR9和/或CD32的特異性結合，并且可以摻入本發(fā) 明的分子或分子復合物中。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是重組融合蛋白，其由至少一種抗原的至 少一種表位、至少一種與TLR9相互作用的結合位點和至少一種與CD32相互 作用的結合位點組成。所述抗原可以像來自 一種抗原的一種T細胞表位一樣 小，或者可以是來自 一種或多種不同抗原的一種或多種T細胞表位的混合物 (cocktail or mixture),其以允i午由MHC分子正確加工和呈遞的方式融合或連 接在一起。各表位的次序可以根據不同標準來選擇，諸如產物穩(wěn)定性、有 效加工、(不)；波受治療者中預先形成的抗體識別。通常選擇能夠^皮MHC有 效呈遞且導致被預先形成的抗體最低限度識別的穩(wěn)定分子。
本發(fā)明進一步包括至少一種與TLR9相互作用的分子、至少一種與CD32 相互作用的分子以及來自 一種或多種抗原的 一種或多種T細胞表位以隨機 形式連接在一起的物理偶聯物。
此外，本發(fā)明提供了含有根據本發(fā)明的融合蛋白的藥物制備物及其對 于變態(tài)反應治療的用途。所述藥物可以是含有根據本發(fā)明的分子或分子復 合物的疫苗配制物，尤其對于主動免疫療法有用。
本發(fā)明的分子或分子復合物的雙特異性結合結構(即結合CD32和結合 TLR9)的重組生產可以通過不同方式實現，例如通過 四源雜交瘤(quadroma)技術(融合雜交瘤)[12; 13]
雙特異性scFv，或是作為"雙抗體"(diabody)或是簡單的通過不同scFv的 遺傳融合[14]
單結構域抗體，其中VH識別一種抗原而VL識別另一種抗原 chi-bAb (如EP0640130中所記載的)
小的突變的免疫球蛋白結構域，通過在編碼完整抗體或抗體片段諸如Fab
結構域(根據PCT/EP2006/050059 ) 在本發(fā)明的語境中，對CD32的結合還可以通過單體的或多聚體的免疫5求
蛋白Fc區(qū)或其一部分來實現，尤其當Fc部分對CD32的親和力增強時，而
對TLR9的結合是通過抗體的常規(guī)結合位點(VH/VL)來實現的 免疫球蛋白的Fc區(qū)或其一部分，其結合CD32，融合至任何其它TLR9特異
性結合基序
上文所述抗體的Fc部分可以是"糖工程改造的"(glyco-engineered)以增加對 人類FcyR的親和力[15]
的支架并連接在一起。這些結合性支架可以是蛋白質結構域、纖連蛋白 III、脂籠蛋白(lipocalin)、蛋白A或a-淀粉酶抑制劑、錨蛋白重復蛋白、C2 結構域、A-結構域、EGFR樣結構域、dab、 chi-bAb、 CTLA-4、 y結晶體 或任何其它蛋白質、蛋白質結構域或其一部分。
本發(fā)明的分子或分子復合物由一種或多種表位以及一種或多種與TLR9 (優(yōu)選人類TLR9)相互作用的結合結構、 一種或多種與CD32 (優(yōu)選人類 CD32)相互作用的結合結構組成。對于本發(fā)明蛋白質的簡易體外測試，識 別人類TLR9和人類CD3 2的結合結構可以與猴或小鼠TLR9以及猴或小鼠
質或其一部分,；只要所述分子或分子口復合物中存在的序列上存在能夠被 MHCII類分子呈遞且能夠被T細胞識別的表位。所述分子或分子復合物中與 TLR9和CD32相互作用的部分可以是完整的或不完整的(修飾的)抗體或其 片段或衍生物，只要對TLR9和CD32的結合被保留。
或者，可以使用仍然特異性識別并結合人類TLR9和CD32 (諸如由B細 胞和樹突細胞所表達的)的抗TLR9和抗CD32抗體或其衍生物或片段。
或者，與TLR9或CD32相互作用的抗體是親和力高于初始抗體的改進抗體。
例示性的抗體分子是完整免疫球蛋白分子和那些包含互補位的免疫球 蛋白分子部分，包括那些稱為Fab、 Fab'、 F(ab')2、 Fc和F(v)、 dAb的部分。所述抗體可以是IgG、 IgM、 IgE、 IgA或IgD。與TLR9或CD32相互作用 的分子可以是任何起源的，優(yōu)選哺乳動物起源的，優(yōu)選人類、小鼠、駱駝、 犬或貓起源的或人源化的。優(yōu)選的是，所述分子是抗體，優(yōu)選人類抗體或 人源化抗體。
如本文中所使用的，如果本發(fā)明的分子或分子復合物是融合蛋白，那 么它可以在宿主細胞中表達，所述宿主細胞覆蓋可以修飾以表達該融合蛋 白的任何類型細胞系統(tǒng)。在本發(fā)明的范圍內，術語"細胞"意指個體細胞、組 織、器官、昆蟲細胞、鳥類細胞、哺乳動物細胞、雜交瘤細胞、原代細胞、 連續(xù)細胞系、干細胞和/或經遺傳工程改造的細胞，諸如表達根據本發(fā)明的 4元體的重纟且細月包。
細胞可以是細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、魚細胞和植
物細胞。
優(yōu)選的是，所述細胞是動物細胞，更優(yōu)選哺乳動物細胞。這些可以是 例如BSC-1細胞、LLC-MK細月包、CV-1細胞、CHO細胞、COS細月包、PerC6 細胞、鼠細胞、人類細胞、HeLa細胞、293細胞、VERO細胞、MDBK細胞、 MDCK細胞、MDOK細胞、CRFK細月包、RAF細月包、TCMK細月包、LLC-PK 細月包、PK15纟田胞、WI-38細胞、MRC-5細胞、T-FLY纟田月包、BHK細胞、SP2/0、 NSO細胞或其衍生物。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的分子或分子復合物中識別TLR9和CD32的結合結構 是小的突變的免疫球蛋白結構域，例如這樣的Fab片段，其中一個結合位點 (對CD32或TLR9特異性的)由VH/VL形成，并與第二結合位點(對TLR9 或CD32特異性的)組合，該第二結合位點可以是經工程改造的CL或經工程 改造的CH1、 CH2、 CH3、 CH4、 VL或VH結構域，根據PCT/EP/2006/050059; 或者這樣的完整抗體，其中一個結合位點由VH/VL形成，并與第二結合位 點組合，該第二位點可以是經工程改造的CL、 CH1、 CH2、 CH3、 CH4、 VL或VH結構域，才艮據PCT/EP/2006/050059。
根據本發(fā)明，所述分子或分子復合物包含至少一種特異性結合CD32的 結構。
抗CD32抗體可以由已知方法書f生(諸如雜交瘤4支術、B細胞克隆和抗 體庫篩選)。關于選擇，可以使用展示天然形式CD32的細胞，或可以使用 CD32的重組胞外部分，或可以使用選自CD32氨基酸序列的合成肽。選擇標準是結合結構識別CD32a。如果也識別CD32b，那么優(yōu)選對CD32a的親和力 三對CD32b的親和力。
舉例而言，可以使用從細胞系HB-217衍生的抗CD32 IV.3抗體的Fab片 段。利用例如由Orlandi等"記載的方法，將Fab片段從細胞系HB-217克隆出 來?；蛘?，可以構建已知V基因序列的其它形式，諸如scFv。然而，為了與 抗TLR9抗體或Fab片段或Fv片段的最佳組合，優(yōu)選利用從CH1、 CH2、 CH3、 CH4、 CL、 VL或VH而來的一種或多種小的突變的免疫球蛋白結構域庫來選 擇特異性結合物。然后可以將選定的CH1、 CH2、 CH3、 CH4、 CL、 VL或 VH結構域克隆入抗TLR9抗體或其Fab或Fv片段的現有序列，從而生成雙特 異性抗體或Fab片段。
選定的CD32結合實體應當優(yōu)選具有下列特征
1. 與CD32a的相互作用導致受體結合結構復合物的內在化、抗原呈遞細胞通 過受體胞質尾中ITAM基序的活化、和所連接的/所融合的T細胞表位的抗 原呈遞
2. 與CD32b的相互作用導致受體通過ITAM基序的負(negative)信號傳導
3. 相互作用應當顯示出人類和猴CD32間的交叉反應性(用于在相關體內模 型中測試功效)
4. 相互作用應當顯示出與小鼠CD32的交叉反應性(用于在已建立的變態(tài)反 應體內模型中測試)
為了獲得特異性結合TLR9的結合結構，可以利用幾種方法(諸如雜交 瘤技術、B細胞克隆和抗體庫篩選)。對于選擇，可以使用表達天然形式TLR9 的細胞來分離天然TLR9，或可以使用重組TLR9，或可以使用選自TLR9氨 基酸序列的合成肽?；蛘撸梢允褂眉兓腡LR9或由細胞系表達的TLR9。 可以在選擇對TLR9的結合后提取分別編碼VL和VH的抗體基因，并用于設 計對人類TLR9特異性的重組抗體或Fab片段。或者，還可以制備單鏈Fv并與 上文所述抗CD32 scFv融合。然而，為了與抗CD32抗體或scFv或Fab片段的 最佳組合，優(yōu)選利用從CH1、 CH2、 CH3、 CH4、 CL、 VL或VH而來的一種 或多種小的突變的免疫球蛋白結構域庫來選擇特異性結合物。然后可以將 選定的CH1、 CH2、 CH3、 CH4、 CL、 VL或VH結構域克隆入抗CD32抗體的 現有抗體或Fab片段或scFv片段，從而生成雙特異性Fab片段。選定的TLR9 結合實體應當優(yōu)選具有下列特征1. 與TLR9的相互作用導致信號轉導和細胞因子生成
2. 相互作用可顯示出人類和猴TLR9間的交叉反應性(用于在相關體內模型 中測試功效)
3. 相互作用可顯示出與小鼠TLR9 (用于在已建立的變態(tài)反應體內模型中測 試)和CD32的交叉反應性
當然可以類似地利用現有aTRL9單克隆抗體的Fab部分制備融合蛋白。 利用例如由Orlandi等"記載的方法，將Fab片段從例如可從Imgenex公司獲得 的克隆26C593克隆出來，如上文關于aCD32AblV，3的fab片段所描述的。再 次為了與抗TLR9Fab片段的最近組合，最好利用從CH1、 CH2、 CH3、 CH4、 CL、 VL或VH而來的一種或多種小的突變的免疫球蛋白結構域庫來選擇 CD32的特異性結合物。然后可以將選定的CH1、 CH2、 CH3、 CH4、 CL、 VL或VH結構域克隆入抗TLR9抗體的現有Fab片段，從而生成雙特異性分 子。
最后，例如在可利用的合適的現有CD32和TLR9抗體都不存在的情況 下，有可能利用從CH1、 CH2、 CH3或CL而來的小的突變的免疫球蛋白結構 域庫來構建雙特異性分子，以選擇CD32和TLR9二者的特異性結合物，隨后 將其組合以形成新的結構，其中存在至少1個/種對CD32特異性的結合結構 和至少1個/種對TLR9特異性的結合結構，二者衍生自任何可能的文庫且以 任意可能的方式組合(CH1-CH1或CH1-CH2或CH1-CH3或CH2-CH4或 CH3-CH4或CH1-CH4或CH2-CH3等)。
或者，可以選擇免疫球蛋白超家族的單 一 可變域用于以CDR環(huán)結合 TLR9或CD32。然后將選定的結合物在非結構環(huán)位置隨機化以產生可變域 庫，其用各自的其它抗原進行選擇，即在可變域以CDR環(huán)結合TLR9的情況 中，選擇對CD32的結合，反之亦然。還有可能對在CDR環(huán)內包含變異同時 在非CDR環(huán)中包含變異的V結構域庫先后或同時選擇對TLR9和CD32的結 合。
這樣的雙特異性V結構域還可以是抗體的部分或抗體片段，諸如單鏈 Fv、 Fab或完整抗體。
合適TLR9表位的選擇 成熟TLR9蛋白的序列244-256 (SEQ ID No 1)(以氨基酸單字母代碼表示)CPRHFP QLHPDTFS 244 250 257 將滿足標準1和2但不滿足3，而
成熟TLR9蛋白的序列176-191 (SEQ ID No 2)(以氨基酸單字母代碼表示) LTHL SLKY麗LTVV PR 176 180 191
和成熟TLR9蛋白的序列216-240 (SEQ ID No 3)(以氨基酸單字母代碼表 示)
ANLT ALRVLDVGGN CRRCDHAPNP C 216 220 230 240
將滿足所有三項標準，因此優(yōu)選用于本發(fā)明。
制備所述分子或分子復合物的方法是根據已知方法來實施的，例如通 過使用重組克隆技術或通過化學交聯。
本發(fā)明所述產品可以通過以下方式制備
將所獲得的抗CD32抗體的VH和VL分別融合至CH1和CL。所述CL以前 已經使用SMID^支術工程改造過(PCT/EP2006/050059)并且利用噬菌體展示 來選擇對TLR9的結合(如下所述)。CH1以其C端融合至編碼選定T細胞表 位的序列。將這兩種融合蛋白編碼基因克隆入允許兩個獨立基因表達的表 達載體(或克隆入兩個獨立的表達載體)并且在細菌、酵母或動物細胞或 任意其它合適的表達系統(tǒng)中共表達。從而產生具有期望特征的Fab，即結合 CD32、結合TLR9并攜帶相關T細胞表位。
應用SMID^支術的示例 針對TLR9的scFv衍生自噬菌體展示庫或現有雜交瘤，而CD32結合分子衍 生自CH2-CH4或CH3-CH4或CH1-CH4或小的突變的免疫球蛋白結構域 庫。將這兩種編碼序列連接在一起并連上編碼T細胞表位的序列。然后將 融合蛋白在細菌、酵母或動物細胞或任何其它合適表達系統(tǒng)中表達。
或者，將TLR9特異性和CD32特異性交換(swapped):針對CD32的scFv衍 生自例如噬菌體展示庫或現有雜交瘤，而TLR9結合分子衍生自CH2-CH4 或CH3 -CH4或CH1 -CH4或小的突變的免疫球蛋白結構域庫。將這兩種編 碼序列連接在一起并連上編碼T細胞表位的序列。然后將融合蛋白在細 菌、酵母或動物細胞或任何其它合適表達系統(tǒng)中表達。 將TLR9抗體的VH和VL分別融合至CH1和CL。 CL以前已經工程改造過并 且利用噬菌體展示選擇對CD32的結合(SMID)。 CH1以其C端融合至編碼T 細胞表位的序列。將這兩種融合蛋白編碼基因克隆入允許兩個獨立基因 表達的表達載體(或克隆入兩個獨立的表達載體)并且在細菌、酵母或 動物細胞或任何其它合適表達系統(tǒng)中共表達。(同樣，抗TLR9和抗CD32 可以交換。CH1和CL也可以交換)
抗TLR9抗體的重鏈和輕鏈基因作為整體。在重鏈基因中，CH2(或CH1 或CH3或CH4)區(qū)用以前已經工程改造過的CH2 (或CH1或CH3或CH4或 CL或VH或VL)區(qū)替換并利用噬菌體展示選擇對CD32的結合(小的突變 的免疫球蛋白結構域)。CH1、 CH2、 CH3或CH4以其C端融合至編碼T細 胞表位的序列。將這兩種基因同樣克隆入表達載體并在動物細胞中表達。
將兩種小的突變的免疫球蛋白結構域(一種對TLR9特異性的，另一種對 CD32特異性的)融合并與T細胞表位組合
將具有2種不同特異性(TLR9和CD32)的l種小的突變的免疫球蛋白結構 域與T細胞表位組合
作為根據本發(fā)明的分子或分子復合物的一部分的抗原可以是完整的變 應原、變性的變應原或以任何可能方式處理以防止結合至IgE的任何抗原。 此類處理可以包括抗原性蛋白質的表位遮蔽，其利用針對與患者IgE抗體相 同表位的高親和力IgM、 IgD、 IgA或IgG抗體，如Leroy等記載的[20]。此類 抗體還可以緊密結合IgE特異性表位，從而通過空間位阻來阻止IgE抗體的結 合。
通常將變應原定義為特應性患者以IgE抗體應答做出響應(隨后導致變 態(tài)反應)的抗原。在本發(fā)明的分子或分子復合物中使用的抗原可以是環(huán)境 變應原(例如房屋塵螨、樺樹花粉、草花粉、貓抗原、蟑螂抗原)、或食物 變應原(例如牛奶、花生、蝦、大豆)、或兩者的組合。非相關抗原諸如HSA 也可以作為根據本發(fā)明的分子或分子復合物的一部分。所述抗原可以是完 整的變應原，例如患有特應性皮炎、變應性哮喘、變應性鼻炎或變應性結 膜炎的患者對其是變應性的變應原。優(yōu)選的是，在根據本發(fā)明的分子或分 子復合物中使用的變應原不結合來自需要治療的患者的IgE。本發(fā)明中所使用的抗原和/或表位可以是來自天然來源或通過重組技術 制備或合成制備。本發(fā)明的抗原和/或表位可以包含便于經配體/受體相互作 用或抗體結合將抗原和/或表位摻入本發(fā)明分子復合物的配體結構。本發(fā)明 的抗原和/或表位可以包含便于將抗原和/或表位共價連接至本發(fā)明分子的
CD32和/或TLR9結合結構的化學基團。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明分子或分子復合物的抗原和表位 可以共價連接至CD32結合結構和/或TLR9結合結構。
在一個實施方案中，抗原和/或表位還可以通過配體/受體相互作用諸如 生物素和親合素連接至本發(fā)明的分子或分子復合物。例如，可以將本發(fā)明 分子中所使用的抗原或表位制備成附著有生物素或親合素模擬物?？梢詫?CD32結合結構和/或TLR9結合結構制備成附著有親合素或其它生物素特異 性配體。在將這些分子與不同附著物混合之后，按照本發(fā)明形成了穩(wěn)定的 分子復合物。或者，可以利用抗體/抗原的結合來形成本發(fā)明的分子復合物。 這些實施方案優(yōu)選高親和力相互作用(例如高親和力抗地高辛配基抗體和 地高辛配基標記的抗原和/或表位)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗原和/或表位通常融合至CD32結合 結構和/或TLR9結合結構。
如果本發(fā)明的分子是融合蛋白，那么所述抗原優(yōu)選從變應原的含至少 一種T細胞表位的DNA亞序列制備而來?；蛘?，所述T細胞表位可以來自一 種或多種相關的和/或不相關的變應原。
優(yōu)選的是，所述T細胞表位包含新的蛋白質，其與天然存在的蛋白質不 同，因此不被患者中現有的IgE或IgG抗體所識別。因此，作為選擇(多個) 短的T細胞表位、將它們切開并以不同次序再次融合在一起的替代，也可以 選擇較長的一段(多個)丁細胞表位(〉28個氨基酸)，其仍然處于天然次序， 但是它在以前被選擇為不結合變應原特異性IgE[21]。
原則上，所有已知的抗原都可以用來摻入本發(fā)明的分子或分子復合物， 變應性患者以IgE介導的過敏反應對本發(fā)明的分子或分子復合物做出響應。 在發(fā)達國家最常見的環(huán)境變應原為房屋塵螨、樺樹花粉、草花粉、貓和 蟑螂。這些變應原的每一種具有一種或多種"主要變應原"(例如房屋塵螨的 主要變應原DerPl;DerFl,樺樹花粉的主要變應原二BetVl )。然而，完整 的抗原，盡管是可能的，但不是必需的，因為分子或分子復合物應當僅誘導T細胞應答，而T細胞對II類MHC分子呈遞的小(長度為大約12-28個氨基 酸間)肽做出響應。應當將T細胞表位的選擇設計為HLAII類分子在可能所 有患者中的表達有保障。 一些HLAII類分子比其它分子表達更頻繁。有著廣 泛表達的此類HLAII類分子的一個恰當實例是HLADPw4，其在大約78%的 高加索人群中表達[22]。因此可以將T細胞表位的選擇包括進每種變應原的 分子或分子復合物，由此降低復合物的大小和分子量。如果來自不同遺傳 相關生物體(i者如屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)(Der Pl)和4分塵蟲葛 (Dermatophagoides farinae)(Der F1))的變應原之間存在交疊的交叉反應性表 位，那么它們是優(yōu)選的。
為了允許正確的抗原加工，比實際T細胞表位略長的區(qū)段的編碼DNA應 當包括進分子或分子復合物，和/或表位可以通過導入間隔物DNA區(qū)段而彼 此分開，所述間隔物DNA優(yōu)選包含被抗原呈遞細胞中的主要蛋白質加工酶 類(諸如天冬酰胺特異性內肽酶(AEP)或組織蛋白酶S、組織蛋白酶D或組織 蛋白酶L)所識別的(疏水性)表位[23〗。
為了融合對TLR9和CD32特異性的結合結構的編碼基因，優(yōu)選使用主要 變應原(諸如房屋塵螨主要變應原I(DerPl， DerFl)、房屋塵螨主要變應原 II (Der P2， Der F2)、或樺樹花粉變應原(Bet VI))的短DNA序列。這些短 DNA序列包含一種或多種T細胞表位的遺傳密碼，其在加工后，出現在抗原
來自Der Pl和Der P2的T細胞表位，而且來自Der P3 、 Der P4、 Der P5 、 Der P6、 DerP7等以及DerF3、 DerF4、 DerF5、 DerF6、 Der F7等的T纟田月包表4立也可 以用于本發(fā)明的分子或分子復合物。來自這些變應原的T細胞表位可以通過 利用T細胞克隆的經典表位做圖[24]或通過現代HLA II類預測軟件諸如 Tepitope程序[25;26]來選擇。對于可以配制成疫苗的分子或分子復合物，沒 有必要組合僅來自單一變應原來源的T細胞表位；相反，優(yōu)選包括盡可能多 的衍生自由一種或多種不同物種產生的不同變應原來源的T細胞表位，例如 來自房屋塵螨的變應原的和來自草花粉的變應原、貓和/或樺樹花粉的組合。 作為Der Pl的一個實例，大多數T細胞表位可以在如下成熟蛋白序列 101-143中發(fā)現(以氨基酸單字母代碼表示)(SEQIDNo4): QSCRRPNAQ RFGISNYCQI YPPNANKIRE ALAQPQRYCR HYWT 101 110 120 130 140 143尤其氨基酸序列101-131包含至少3個T細胞表位24，其結合一批HLA II 類分子(以氨基酸單字母代碼表示)(SEQ ID No 5): QSCRRPNAQ RFGISNYCQI YPPNANKIRE AL
101 110 120 131 序列107-119包含一個重要的T細胞表位，其結合HLA DPw4以及HLA
DPw524。這些HLA II類分子由大部分人群表達。以氨基酸單字母代碼表示 的表位(SEQ ID No 6): MQ RFGISNYCQI 107 110 119
由Der Pl和Der Fl共有的其它重要T細胞表位在成熟蛋白序列20-44和 203-226中發(fā)現(以氨基酸單字母代碼表示) RTVTPIRMQG GCGSCWAFSG VAATE(SEQ ID No 7) 20 30 40 44
和
YDGRTII Q薩GYQPNY HAVNIVGY(SEQ ID No 8) 203210 220 227
由Der P2和Der F2共有的T細胞表位實例在序列26-44、 89-107和102-123 中發(fā)現
PCI I HRGKPFQLEA VFEAN(SEQ ID No 9) 26 30 40 44
K YTWNVPKIAP KSENVVVT(SEQ ID No 10) 89 100 107
ENVVVTVK VMGDDGVLAC AIAT (SEQ ID No 11)
102 110 123 127
根據上文所述Der Pl/Fl和Der P2/F2的T纟田胞表位，可以設計幾種功能性 分子或分子復合物，例如
根據DerPl的下列序列 QSCRRPNAQ RFGISNYCQI YPP(序列A， SEQ ID No 12) 101 110 120CQI YPPNANKIRE AL (序列B， SEQ ID No 13) 117 120 130
IRE ALAQPQRYCR HYWT (序列C， SEQ ID No 14) 127 130 140 143
RTVTPIRMQG GCGSCWAFSG VAATE (序列D， SEQ ID No 7) 20 30 40 44
YDGRTII QRDNGYQPNY HAVNIVGY(序列E, SEQ ID No 8) 203210 220 227
以及根據Der P2的下列序列 PCII HRGKPFQLEA VFEAN(序列F， SEQ ID No 9) 26 30 40 44
K YT麗VPKIAP KSENVVVT (序列G， SEQ ID No 10) 89 100 107
ENVVVTVK VMGDDGVUC AI AT(序列H， SEQ ID No 11) 102 110 120 123
可以設計次序為B、 A、 E、 H、 G、 C、 F、 D或H、 A、 D、 C、 F、 G、 E、 B的cDNA，但是選定序列的任何可能組合均可。優(yōu)選的表位次序將主要 取決于完整重組分子的表達效率。序列重復(duplication)也是允許的，例如B、 B、 A、 E、 E、 G、 C、 G、 F、 A、 D等。T細胞表位部分當然也可以包含更 多和更少肽的更短肽或更長肽的遺傳密碼，只要來自一種或多種不同變應 原/抗原的 一種或多種T細胞表位包括在內。
來自其它變應原的具有類似特征的表位(諸如BetVl、 LolPl、 Feldl) 將優(yōu)選包括在根據本發(fā)明的分子或分子復合物內。
本發(fā)明還涉及治療疾病(尤其是變態(tài)反應)的方法，包括給需要此類 治療的受試者施用預防或治療有效量的根據本發(fā)明的分子或分子復合物，其用作藥物，尤其作為針對變態(tài)反應的藥劑。
所述分子或分子復合物可以與常規(guī)的藥學可接受稀釋劑和載體，以及 任選的其它賦形劑混合，而且可以胃腸外、靜脈內或腸道途徑施用，例如 肌肉內和皮下。所述分子或分子復合物的濃度當然將取決于例如所采用的 化合物、需要的治療和治療形式的性質。
對于不同的適應癥，適宜的劑量當然將取決于例如所使用的分子或分 子復合物、宿主、施用模式以及預期指標。然而，通常，顯示了在l-2年內
進行1到4次疫苗接種獲得滿意的結果，但是如果是必需的話，可以進行額 外的重復疫苗接種。顯示了對于這些治療而言，本發(fā)明的分子或分子復合 物可以以與常規(guī)采用相似的時間表、以2-4劑施用。
本發(fā)明進一步涉及根據本發(fā)明的分子或分子復合物作為藥物的用途， 特別是用于變態(tài)反應的治療和預防。
根據本發(fā)明制備的、用作疫苗配制劑的藥物組合物在本發(fā)明的分子或 分子復合物以外可以(但不是必須)包含至少一種在疫苗配制中常用的佐 劑?？梢酝ㄟ^這些佐劑來增強免疫應答。作為佐劑的實例，但不限于這些， 可列舉如下氫氧化鋁(Alu凝膠)、QS-21、 Enhanzyn、脂多糖衍生物、卡 介苗(BCG)、脂質體制備物、具有免疫系統(tǒng)已經對其產生強免疫應答的其它 抗原(諸如例如破傷風類毒素、假單胞菌外毒素、或流感病毒組分，任選 在脂質體制備物中)的配制物、生物學佐劑諸如粒細胞巨噬細胞刺激因子 (GM-CSF)、白介素2(IL-2)或Y干擾素(IFN力。氫氧化鋁是最優(yōu)選的疫苗佐劑。
根據本發(fā)明的融合蛋白的可能作用模式的總結
根據本發(fā)明的融合蛋白可以配制成任何可獲得的和可接受的藥物配制 劑，但是優(yōu)選配制成疫苗。根據本發(fā)明的融合蛋白的aCD32結合部分選擇相 關細胞。CD32在這些細胞上的觸發(fā)將積極誘導受體加上所附著的融合蛋白 的內在化，并由此促進融合蛋白的TLR9結合部分與TLR9的相互作用，所述 TLR9在相關抗原呈遞細胞的細胞質中表達[10; 11 ]。
作為CD32介導的內在化、對MHC II類分子上的選定T細胞表位的后續(xù) 加工和呈遞、與抗原呈遞細胞中細胞質TRL9的特異性活化聯合的結果，變 應原特異性T細胞將(重新)編程，變?yōu)門hl記憶細胞。這些變應原特異性 Thl記憶細胞在較晚時間點在遭遇由天然暴露的變應原特異性B細胞呈遞的 衍生自天然變應原的相同表位時將誘導變應原特異性IgG生成。這些Thl細胞因而是將免疫系統(tǒng)從以IgE為主重新平衡到以IgG為主的抗體生成所必需的。
實施例
下列實施例將更為詳細的解釋本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。 實施例l:
對TLR-9肽，例如成熟蛋白TLR9的序列216-240 ( SEQ ID No 3 )(以氨 基酸單字母代碼表示)淘選人類CL-噬菌體庫 ANLT ALRVLDVGGN CRRCDHAPNP C 216 220 230 240
按照標準方案實施3輪淘選。簡言之，可以使用下列方法。用代表TLR-9 部分序列的(合成的)肽包被Maxisorp 96孔板(Nunc )。為了在孔中包被肽， 每孔中添加200pl如下溶液O.IM碳酸鈉緩沖液，pH 9.6,含有如下濃度的 溶解的肽
第一輪篩選lmg/mlTLR-9肽 第二4侖篩選50(Vg/ml TLR-9肽 第三輪篩選100ng/mlTLR-9肽
在37。C溫育1小時，接著每孔用20(Hil2。/。奶粉(M-PBS)在室溫封閉l小時。添 加100pl噬菌體懸浮液和100pl 4。/。奶粉(M-PBS),接著在室溫搖動溫育45分 鐘，再在室溫不搖動溫育90分鐘，使表面展示噬菌體庫與所結合的肽起反 應。如下洗去未結合的噬菌體顆粒。在第一4侖篩選后10x300plT-PBS， 5x 300plPBS;在第二輪篩選后15x 300pl T-PBS, 10x 300^1 PBS;在第三輪 篩選后20x 30(^1 T-PBS, 20x 300pl PBS。通過每孔添加200jal O.IM甘氨酸， pH2.2,室溫搖動溫育30分鐘來洗脫所結合的噬菌體顆粒。隨后，通過添加 60nl 2MTris-堿來中和噬菌體懸浮液，接著通過將10ml指數期生長的培養(yǎng)物 與0.5ml洗脫的噬菌體混合并在37。C溫育30分鐘，感染入大腸桿菌TG1細胞。 最后，將受感染的細菌涂在含1 %葡萄糖和100ing/ml氨芐青霉素的TYE培養(yǎng) 基上，并在30。C溫育過夜。
實施例2:針對TLR-9選擇的人類CL突變體的選定克隆的克隆，用于可溶性表達 通過微量制備從通過3輪淘選選出的噬菌體分離噬菌粒DNA。編碼突變 型CL區(qū)的DNA通過PCR分批擴增并Ncol-Notl克隆入載體 pNOTBAD/Myc-His，其是插入有NotI限制性位點以便于克隆的大腸桿菌表 達載體pBAD/Myc-His (Invitrogen)。將連接得到的構建物通過電穿孔轉化入 大腸桿菌LMG194細胞(Invitrogen),在30。C在含l。/。葡萄糖和氨千青霉素的 TYE培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。將選定的克隆接種入200nl含氨千青霉素的2xYT培 養(yǎng)基，在30。C培養(yǎng)過夜，通過添加L-阿拉伯糖至終濃度0.1。/。進行誘導。在 16。C表達過夜后，通過離心收獲細胞并用100pl硼酸鈉緩沖液pH 8.0在4。C處 理過夜以制備周質提取物。在ELISA(見下文)中使用50nl周質提取物。
實施例3:
針對TLR-9選擇的人類CL突變體的ELISA
對選定的克隆通過ELISA測定對TLR-9的特異性結合。
包被微量滴定板(NUNC, Maxisorp)，每孔100pl， 20pg TLR-9肽/ml， 0.1M
碳酸鈉緩沖液，pH9.6， 37。Cl小時
清洗3x 200^1 PBS
去于閉1%BSA-PBS，室溫l小時
清洗3x200ialPBS
周質提取物結合50pl周質提取物，50nl2°/。BSA-PBS，室溫過夜 清洗3x200plPBS
第一抗體抗His4 (Qiagen)，在1% BSA-PBS中1:1000稀釋，室溫90分鐘，
每孔10(Hi1
清洗3x200(ilPBS
第二抗體山羊抗小鼠氺HRP(SIGMA)，在1%BSA-PBS中1:1000稀釋，室溫 90分鐘，每孔100nl 清洗3x 200^1 PBS
檢測含3mg/mlOPD的檸檬酸鈉/磷酸鹽緩沖液，pH4.5, 0.4pl 30% H202 終止100ml3MH2SO4 p及光度讀取492/620 nm
將在此第一初步ELISA中給出高信號的克隆以20ml體積在上述相同條件下進行培養(yǎng)。它們的周質提取物以l/20培養(yǎng)物體積如上所述分離并且用 ELISA (如上所述)測試以-瞼證。
實施例4:
從HB-217克隆抗CD32可變域
從細胞系HB-217 ( ATCC,抗CD32抗體IV.3 )分離mRNA，用于按照已 建立的常規(guī)方案制備cDNA。 cDNA進而用作模板以分別擴增抗體IV.3的Fab 片段的輕鏈和重鏈的編碼基因區(qū)域。此擴增中所使用的從可變區(qū)的5 ，端引發(fā) 的上游PCR引物衍生自已發(fā)表的小鼠可變區(qū)序列(IMGT，國際免疫遺傳學 信息系統(tǒng)(the international ImMunoGeneTics information system ) http:〃imgt.cines.fr )。簡并引物和/或不同引物的混合物用作上游引物。下游 引物設計為分別從CL或CH1結構域的3，端引發(fā)。
在下一步驟中，將抗體IV.3的CL結構域去除并用 一個通過SMID技術修 飾且具有針對TLR9的結合親和力的，并如上文實施例l-3所述選出的CL結 構域置換。為了該置換，可以根據標準方案使用交疊PCR?；蛘?，為了將 VL連接至經SMID修飾的CL,可以使用一個唯一切割的限制性位點，其或
是在序列中天然存在的或是通過定點誘變而人工導入的(作為不改變氨基 酸序列的沉默突變)。例如，可以在VL和CL之間的鉸鏈區(qū)生成一個BstAPI 位點，其通過將序列乂人
KRADAAPTVSIF (SEQ ID No 65) AAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTC (SEQ ID No 66) 改變成
KRADAAPTVSIF (SEQ ID No 65) AAACGG^^W7T6TgaCCAACTGTATCCATCTTC (SEQ ID No 15)
在上面的序列中標示了新生成的BstAPI位點。新序列通過用恰當設計的 PCR引物分別擴增VL部分和CL部分而導入編碼區(qū)，用BstAPI切割PCR產物， 連接它們，并用初始使用的用于擴增Fab片段原始輕鏈部分的PCR引物來擴 增完整的連接產物。
為了表達經修飾的Fab片段，隨后將編碼重鏈和輕鏈的基因克隆入合適 的表達載體，或一起克隆入容許表達兩個獨立基因的一個表達載體。作為 表達系統(tǒng)，可以使用細菌、酵母、動物細胞或任何其它合適表達系統(tǒng)。關于這里的實例，將介紹一種載體在曱基營養(yǎng)型酵母巴斯德畢赤氏酵母
(尸/c/z/a/ oston's )中的表達
將經修飾的PCR片段的輕鏈部分以正確的閱讀框(使其與載體提供的a 因子分泌信號序列功能性融合)EcoRI/Kpnl克隆入巴斯德畢赤氏酵母表達載 體pPICZalphaA。類似地，將Fab片段的重鏈部分克隆入pPICZalphaA。為了 制備用于該克隆規(guī)程的插入物，使用恰當設計的PCR引物，其將所需要的限 制性位點附著至基因。在這兩個編碼區(qū)的3，端，必須插入終止密碼子，其同 樣由PCR引物來提供。然后用限制酶BglII和BamHI將輕鏈表達盒從載體中切 出，通過DNA聚合酶Klenow片段處理使DNA末端變成平末端。包含所插入 的Fab重鏈部分的載體通過限制酶BglII部分消化而被打開，通過DNA聚合酶 KIenow片段處理使DNA變成平末端，并插入編碼輕鏈部分的表達盒。由于 重鏈基因包含BglII位點，所以重鏈載體的部分消化是必需的。為了篩選最 后的構建物，必須注意使該內部BglII位點保持完整。最后的構建物具有一 個PmeI位點，其用于在轉化入巴斯德畢赤氏酵母之前將構建物線性化。此 線性化對于表達載體通過同源重組有效整合入宿主基因組是有利的。巴斯 德畢赤氏酵母用線性化的表達載體通過電穿孔轉化，經轉化的克隆用抗生 素Zeocin選擇，因為載體賦予了針對它的抗性，對隨機挑取的克隆的上清液 在用曱醇誘導表達后篩選Fab構建物的表達。對于篩選，可以使用例如Fab 特異性ELISA。如下實現重組蛋白的生產，即大規(guī)模培養(yǎng)經轉化的選定畢赤 氏酵母克隆，優(yōu)選在搖瓶中或在發(fā)酵罐中，通過添加曱醇來誘導表達，并 通過層析法純化重組蛋白。對于后面這些步驟，使用常規(guī)方案。
實施例5:
Der P11/F1和Der P2/F2衍生的T細胞表位的克隆
由序列B、 A、 E、 H、 G、 C、 F、 D形成的選定T細胞表位的組合表示如 下(SEQ ID No 16):
<formula>formula see original document page 26</formula>(Seq. F) (Seq. D)
為了構建編碼該氨基酸序列的合成基因，可以使用計算機法(in silico) 反向翻i奪。為該目的可利用計算機程序，諸如例如DNAWORKS (http:〃molbio.info.nih.gov/dnaworks/)。為了與框架中重鏈部分的編碼基因同 一閱讀框克隆編碼表位的合成基因，選擇了兩種限制性位點，其既不切割 該編碼區(qū)也不切割載體pPICZalphaA。例如，可以將AccIII和SpeI用于該目的。 這兩種限制性位點通過使用上文所述用于克隆規(guī)程的恰當設計的PCR 1物 附著至編碼Fab重鏈部分的基因。此外，必須注意不要在Fab重鏈部分的編 碼區(qū)域的末端含有終止密碼子，因為終止密碼子將在編碼表位的合成基因 的3，端提供。再次，有2個額外限制性位點位于3，端的此構建物EcoRI/Kpnl 克隆入巴斯德畢赤氏酵母表達載體pPICZalphaA。然后用限制酶AccIII和SpeI 打開構建物，插入編碼表位的插入物。該插入物如下生成
選定的氨基酸序列 CQIYPPNANKIREAL ,W腳馬/5m^7T尸尸YDGRTIIQRDNGYQPNYHAVN IVGY ，nT7WM7""6TU//Jr KYTW證KIAPKSENVVVT 7 ^r盯PCIIHRGKPFQLEAVFEAN 7 7Tr尸層(6^C"7^ (SEQ ID No 16)
與選定的限制性位點 一起(在該實施例中使用5 ，端的AccIII和3 ，端的Spel) 輸入公眾可得到的計算機程序DNAWORKS。此外，將終止密碼子添加在表 位序列和SpeI位點之間。
程序用于設計寡核苷酸的參數設定為建議的標準值，指示程序回避對 于克隆和轉化步驟所必需的限制性位點的序列，諸如AccIII、 SpeI和PmeI。 AccIII: tccgga Spel: actagt Pmel: gtttaaac
DNAWORKS生成一組交疊的且代表目的編碼區(qū)的兩條鏈的寡核苷酸。 例如，生成下面這組24種寡核苷酸，由其生成編碼變應原表位的合成 基因
1 TCCGGATGCCAAATTTACCCGCCAAACG 28卿ID No 17)
2 AGCCTCTCTGATCTTGTTCGCGTTTGGCGGGTAAATTTGG 40(SEQ ID No 18)
3 CGAACAAGATCAGAGAGGCTTTGCAATCTTGCAGGAGGCC 40(SEQ ID No 19)4TATGCCGAATCTCTGCGCATTGGGCCTCCTGCAAGATTGC40(SEQIDNo20)
5GCGCAGAGATTCGGCATATCCAACTACTGCCAGATCTACC40(SEQIDNo21)
6GTACGCCCATCGTATGGGGGGTAGATCTGGCAGTAGTTGG40(SEQIDNo22)
7CCCATACGATGGGCGTACAATCATACAGCGTGATAACGGC40(SEQIDNo23)
8GCGTGGTAGTTAGGCTGATAGCCGTTATCACGCTGTATGA40(SEQIDNo24)
9TATCAGCCTAACTACCACGCCGTGAACATCGTCGGCTACG40卿IDNo25)
10TCACAGTAACCACGACATTCTCGTAGCCGACGATGTTCAC40(SEQIDNo26)
11AGAATGTCGTGGTTACTGTGAAGGTAATGGGCGATGACGG40(SEQIDNo27)
12AGCTATGGCGCAAGCTAGAACCCCGTCATCGCCCATTACC40(SEQIDNo28)
13TCTAGCTTGCGCCATAGCTACCAAGTACACTTGGAACGTA40(SEQIDNo29)
14TTTTCGGCGCAATTTTGGGTACGTTCCAAGTGTACTTGGT40(SEQIDNo30)
15CCCAAAATTGCGCCGAAAAGTGAAAACGTCGTAGTGACCA40(SEQIDNo31)
16TGAGCCAATGCCTCCCTTATGGTCACTACGACGTTTTCAC40(SEQIDNo32)
17AGGGAGGCATTGGCTCAACCTCAAAGATACTGCAGACACT40(SEQIDNo33)
18TTATGCAGGGCGTCCAGTAGTGTCTGCAGTATCTTTGAGG40(SEQIDNo34)
19ACTGGACGCCCTGCATAATCCACCGTGGTAAACCCTTTCA40(SEQIDNo35)
20CTTCGAACACTGCCTCAAGTTGAAAGGGTTTACCACGGTG40(SEQIDNo36)
21ACTTGAGGCAGTGTTCGAAGCTAACAGGACGGTAACGCCA40(SEQIDNo37)
22CCGCACCCACCTTGCATACGAATTGGCGTTACCGTCCTGT40(SEQIDNo38)
23TGCAAGGTGGGTGCGGGTCTTGTTGGGCTTTTTCTGGTGT40(SEQIDNo39)
24ACTAGTTTATTCAGTAGCAGCCACACCAGAAAAAGCCCAACA 4 2(SEQIDNo40)
將這24種寡核苦酸溶解，混合在一起，煮沸幾分鐘，然后緩慢冷卻到 室溫以容許退火。在使用大量的兩種邊界引物(bordering primer)(引物#1和 #24)的后續(xù)PCR步驟中，擴增退火的基因，然后用選定的限制酶(在此實 施例中是AccIII和SpeI)切割PCR產物，并如上所述克隆入包含插入物的表 達載體，所述插入物是編碼經修飾Fab重鏈部分的基因。包含兩條鏈的最終 表達載體的制備、巴斯德畢赤氏酵母的轉化、克隆的選擇、以及對生產性 克隆的篩選如上所述進行。重組蛋白的表達和純化通過如下標準方案來進 行。
實施例6:抗CD32抗體IV.3融合物的VH和VL與抗TLR9 CH3結構域(SMIDS)的融
合
所 有 分 子 建 模 用 Swiss-Pdb Viewer 3.7 (http:〃swissmode1.expasy.org/spdbv/)來進行
作為小鼠Fab片段的同源性模型，使用來自蛋白質數據庫(Protein Data Bank)(www.pdb.org)的結構文件2BRR.pdb ，而lOQO.pdb用作人類IgG CH3 結構域的結構的來源。
IV.3抗體的VH和VL的分子4莫型是用 Swissmodel (http:〃swissmodel.expasy.org/SWISS-MODEL.html)的"第 一接近模式"(first approach mode)分別利用VH和VL的氨基酸序列而制作的。
利用Swiss-PdbViewer的"魔術擬合，，(magic fit)功能，將來自lOQO.pdb的 CH3結構域結構的2個拷貝分別擬合到2BRR.pdb的CHl和CL結構域上。隨 后，將IV.3 VH和VL的分子模型分別擬合(再次使用"魔術擬合"功能)到 2BRR.pdb的VH和VL上。
為了構建其中的CHl和CL二者都用CH3結構域置換的Fab樣蛋白質，必 須決定應當在哪個點處終結VH序列并連接至CH3序列，以及應當在哪個點 處終結VL序列并連接至CH3序列。對于這兩種構建物，選4奪疊加的結構和 模型(見上面)的主鏈顯示出最佳疊加的點。
對于輕鏈，發(fā)現直至Ala114 (2BRR,pdb的編號)的序列將被使用并連 接至CH3結構域的Pro343 ( lOQO.pdb的編號)。因此，這兩種序列之間的連 接點讀:取如下(VL部分以下劃線標示) -一Lysl12—Argll3-Ala114—Pro343-Arg344-Glu345- - -
為了容許使用限制酶位點和DNA連接來連接這兩種編碼序列，通過沉 默突變來改變連接點附近的序列以引入唯一的XhoI位點(ctcgag,以下劃線 標示)如下
K R A P R E (SEQ ID No 41)
AAACGGGCTCCTCGAGAA (SEQ ID No 42)
為了稍后插入變應原表位，引入一個AscI位點(ggcgcgcc)，在構建物 的終止密碼子前，加上一個額外的堿基用于維持閱讀框 ggg cgc gcc Gly Arg Ala此外，為了克隆入表達載體pPICZalphaA(巴斯德畢赤氏酵母表達系統(tǒng)， Invitrogen),在構建物的5，端(N端)添加一個EcoRI位點(gaattc )，并在構 建物的3，端(C端)添加一個KpnI位點(ggtacc)。
作為構建物的 一部分選擇的、將要分別融合至VH和VL的CH3結構域可 以是野生型人類IgG CH3結構域(其可以充當陰性對照)或以前通過SMID 技術經工程改造的并選擇以特異性結合TLR9的CH3結構域。在這里的此實 施例中，特異性結合TLR9且在專利申請PCT/EP2006/050059中記載的克隆 A23的序列融合至VH和VL二者。
因此，VL-CH3融合蛋白的完整序列具有如下氨基酸序列(VL部分以下 劃線標示)，(SEQIDNo43):
DIVMTQAAPS VPVTPGESVS ISCRSSKSLL HTNGNTYLHW FLQRPGQSPQ LLIYRMSVLA SGVPDRFSGS GSGTAFTLSI SRVEAEDVGV FYCMQHLEYP LTFGAGTKLE LKRAPREPQV YTLPPSRDEL GIAQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVLGRRWT LGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK&
VL-CH3融合蛋白的核酸序列(限制性位點以下劃線標示)，(SEQ ID No
44 ):
gaattcGACATTGTGATGACCCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCA
GTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATACTAATGGCAACACTTACTTG
CATTGGTTCCTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCGTC
CTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTG
AGCATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTTTTAC丁GTATGCAACATCTAGAA
TATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAACGGGCTCCTCGAGAACCA
CAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGACGAGCTCGGCATCGCGCAAGTCAGCCTGACC
TGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGGCAG
CCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCTTTCTTCCTC
TACAGCAAGCTTACCGTGTTGGGCCGCAGGTGGACCCTGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC
GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
AAATGAgggcgcgccggUcc
對于重鏈，發(fā)現直至Thr123 (28肌*(113的編號)的序列應被使用并連 接至CH3結構域的Arg344 ( lOQO.pdb的編號)。因此，這兩種序列之間的連 4妄點讀取如下(VH部分以下劃線標示)陽--Alal21-Lysl22-Thrl23-Arg344-Glu345-Pro346-- -
為了容許使用限制酶位點和DNA連接來連接這兩種編碼序列，通過沉 默突變來改變連接點附近的序列以引入唯一的XhoI位點(ctcgag，以下劃線 標示)如下 A K T R E P (SEQ ID No 45)
GCCAAAACTCGAGAACCA (SEQ ID No 46)
此外，為了克隆入表達載體pPICZalphaA(巴斯德畢赤氏酵母表達系統(tǒng)， Invitrogen)，在構建物的5，端(N端)添加一個EcoRI位點(gaattc)，并在構 建物的3，端(C端)添加一個XbaI位點(tctaga)。沒有添加終止密碼子至該 序列且將XbaI位點置于正確的閱讀框中從而將構建物融合至由載體提供 的、用于稍后使用固定化金屬親和層析進行的蛋白質純化的六His標簽。
因此，VH-CH3融合蛋白的完整序列具有如下氨基酸序列(VH部分以 下劃線標示)，(SEQ ID No 47 ):
EVQLQQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NYG匪WVKQA PGKGLKWMGW LNTYTGESIY PDDFKGRFAF SSETSASTAY LQ雇LK酵MATYFCARGD YGYDDPL歸GQGTSVTVSS 里REPQVYT LPPSRDELGI AQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVLGRRWTLG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKSLE QKLISEEDLN SAVDHHHHHH&
VH-CH3融合蛋白的核酸序列(限制性位點以下劃線標示)，(SEQ ID No
48 ): GAATTCGAGGTTCAGCTTCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTC
AAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAG
CAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGTTAAACACCTACACTGGAGAGTCA
ATATATCCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTCGGAAACCTCTGCCAGCACT
GCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACATGGCTACATATTTCTGTGCAAGA
GGGGACTATGGTTACGACGACCCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTC
TCCTCAGCCAAAACTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGACGAGCTC
GGCATCGCGCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCC
GTGGAGTGGGAGAGCAACGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTG
GACTCCGACGGCTCTTTCTTCCTCTACAGCAAGCTTACCGTGTTGGGCCGCAGGTGGACC
CTGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAATCT CTAGAACAAA AACTCATCTC AGAAGAGGAT CTGAATAGCG CCGTCGACCA TCATCATCAT CATCATTGA
詳細的克隆計劃 重鏈
使用？ 1物4.3HupEco和4.3HdownXho通過PCR擴增抗體IV.3的VH區(qū)，隨 后用EcoRI和XhoI消化。使用引物CH3upXhoA和CH3XBA2通過PCR擴增經 SMID工程改造的克隆A23的CH3,隨后用XhoI和XbaI消化。將VH序列和CH3 序列經XhoI位點連接在 一起，然后連接入事先用EcoRI和XbaI消化的 pPICZalphaA (Invitrogen)。所得載體命名為pPICHA23 。
引物列表
4. 3HUPEC0 cagagaattc gaggttcagc Ucagcagtc (SEQ ID No 49)
4. 3H廳NXH0 gatgctcgag ttttggctga ggagacggtg (SEQ ID No 50)
CH3UPXH0A aaaactcgag aaccacaggt gtacaccctg cc (SEQ ID No 51) CH3XBA2actgatctag acctttaccc ggagacaggg agag(SEQ ID No 52) 輕鏈
使用引物4,3LupEco和4.3LdownXho通過PCR擴增抗體IV.3抗體的VL 區(qū)，隨后用EcoRI和XhoI消化。使用引物CH3upXhoB和CH3StopKpn通過PCR 擴增經SMID工程改造的克隆A23的CH3，隨后用XhoI和KpnI消化。將VL序 列和CH3序列經XhoI位點連接在一起，然后連接入事先用EcoRI和KpnI消化 的pPICZalphaA (Invitrogen)。所得載體命名為pPICLA23 。
引物列表
4. 3LUPEC0 gatagaattc gacattgtga tgacccaggc tg (SEQ ID No 53)
4. 3U)0WNXH0 attactcgag gagcccgttt cagttccagc t (SEQ ID No 54) CH3UPX鵬 gctcctcgag aaccacaggt gtacaccctg cc (SEQ ID No 55)
CH3ST0PKPNacgtggtacc tcaggcgcgc cctttacccg gagacaggga gag
(SEQ ID No 56) 在一個載體中組合這兩個表達框
用BglII (第l位)和BamHI (第2319位)將輕鏈盒從pPICLA23 ( 4235bp ) 中切出，并通過制備性凝膠電泳純化2319bp片段。丟棄1916bp片段。用BamHI 消化載體pPICHA23 (4219bp)，并將前面純化的、來自pPICLA23的2319bp片段插入其中。對所得巴斯德畢赤氏酵母表達載體進行篩選(其攜帶兩個
表達框， 一個是VL-CH3融合蛋白， 一個是VH-CH3融合蛋白)，使得這兩個 插入物具有相同的轉錄方向。然后將所得載體pPICHLA23 (6537bp)在轉 化入巴斯德畢赤氏酵母之前用例如BamHI或用BssSI線性化，通過電穿孔轉 化入巴斯德畢赤氏酵母，并用Zeocin選擇陽性轉化體。對幾個克隆篩選重組 蛋白的表達。然后選擇一個克隆用于大規(guī)模生產，并使用標準規(guī)程通過固 定化金屬親和層析純化重組融合蛋白。所有畢赤氏酵母的操作、培養(yǎng)和表 達通過下述標準方案進行(Invitrogen)。
將變應原表位插入載體pPICHLA23和表達重組融合蛋白 將實施例5中描述的編碼變應原表位的序列如下插入載體pPICHLA23: 用AscI (4174-4182)消化載體，使其線性化。在這個AscI位點中，插 入編碼變應原表位的DNA序列。為了將AscI位點附著至序列的兩端，用引 物EpiTLRl和EpiTLR2擴增編碼變應原表位的序列。 引物列表
EpiTLRl TAAAGGGCGC GCCTCCGGAT GCCAAATTTA CC (SEQ ID No 57) EpiTLR2 TACCTCAGGC GCGCCTTATT CAGTAGCAGC CACAC (SEQ ID No 58) 將所得PCR產物用AscI消化并連接入事先經消化的載體。所得載體命名 為pHLA23EP ( 7046bp)。畢赤氏酵母的轉化、重組融合蛋白的表達和純化 如上文關于未插入有表位的構建物所述來進行。
抗體IV.3的VL:
氨基酸序列
DIVMTQAAPS VPVTPGESVS ISCRSSKSLL HTNGNTYLHW FLQRPGQSPQ LLIYRMSVLA SGVPDRFSGS GSGTAFTLSI SRVEAEDVGV FYCMQHLEYP LTFGAGTKLE LKRA (SEQ ID No 59) 核酸序列
GACATTGTGA TGACCCAGGC TGCACCCTCT GTACCTGTCA CTCCTGGAGA GTCAGTATCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTAA GAGTCTCCTG CATACTAATG GCAACACTTA CTTGCATTGG TTCCTACAGA GGCCAGGCCA GTCTCCTCAG CTCCTGATAT ATCGGATGTC CGTCCTTGCC TCAGGAGTCC CAGACAGGTT CAGTGGCAGT GGGTCAGGAA CTGCTTTCAC ACTGAGCATC AGTAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTGGGTGTT TTTTACTGTA TGCAACATCT AGAATATCCGCTCACGTTCG GTGCTGGGAC CAAGCTGGAA CTGAAACGGG CT (SEQ ID No 60)
抗體rV3的VH:
氨基酸序列 EVQLQQSGPE LKKPGETVKI PDDFKGRFAF SSETSASTAY AKT (SEQ ID No 61)
核酸序列 GAGGTTCAGC TTCAGCAGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGGTA CCAGGAAAGG GTTTAAAGTG CCTGATGACT TCAAGGGACG TTGCAGATCA ACAACCTCAA TATGGTTACG ACGACCCTTT GCCAAAACA(SEQ ID No
SCKASGYTFT NYGM麗VKQA LQINNLKNED MATYFCARGD
TGGACCTGAG CTGAAGAAGC TACCTTCACA AACTATGGAA GATGGGCTGG TTAAACACCT GTTTGCCTTC TCTTCGGAAA AAATGAGGAC ATGGCTACAT GGACTACTGG GGTCAAGGAA 62)
PGKGLK麗GW LNTYTGESIY YGYDDPLDYW GQGTSVTVSS
CTGGAGAGAC AGTCAAGATC TGAACTGGGT GAAGCAGGCT ACACTGGAGA GTCAATATAT CCTCTGCCAG CACTGCCTAT ATTTCTGTGC AAGAGGGGAC CCTCAGTCAC CGTCTCCTCA
包含TLR9和CD32結合區(qū)的最終表達載體pPICHCLA23.seq (SEQ ID No 63) 6537 bp
agatetaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag
61
gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc ageagacegt
121
tgeaaacgea ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgeca tcgaaaaacc 181
ageccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 241
acaccatgac tttattagee tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 301
tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 361
agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacget 421
gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 481
ttgaaatget aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagteggea taccgtttgtcttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 601
ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct "1
ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact
721
gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 781
atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 841
actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 901
caacttgaga agateaaaaa acaactaatt attcgaaacg atgagatttc cttcaatttt 961
tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctget ccagtcaaca ctacaacaga 1021
agatgaaacgr gcacaaattc eggctgaage tgtcatcggt tactcagatt tagaagggga 1081
tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat aacgggttat tgtttataaa 1141
tactactatt gecagcattg ctgetaaaga agaaggggta tctctcgagai aaagagaggc 1201
tgaagctgaa ttcgaggttc agcttcagca gtctggacct gagctgaaga agectggaga 1261
gacagtcaag atctcctgca aggcttctgg gtataccttc acaaactatg gaatgaactg 1321
ggtgaagcag gctccaggaa agggtttaaa gtggatgggc tggttasaca cctacactgg 1381
agagtcaata tatcctgatg acttcaaggg aeggtttgee ttctcttegg aaacctctgc 1441
cagcactgcc tatttgeaga tcaacaacct caaaaatgag gacatggcta catattttctg 1501
tgcaagaggg gactatggtt acgacgaccc tttggactac tggggtcaag gaacctcagt 1561
caccgtctcc teagecaaaa ctcgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga 1621
tgagctgggc ategegcaag tcagcctgac ctgcctggtc asaggcttct atcccagcga 1681
catcgccgtg gagtgggaga geaaegggea geeggagaac aactacaaga ccacgcctcc 1741
cgtgctggac tccgacggct ctttcttcct ctacagcaag cttaccgtgt tgggccgcag 1801
gtggaccctg gggaaegtet tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta 1861cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatctcta gaacaaaaac tcatctcaga 1921
agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat cattgagttt gtagccttag 1981
acatgactgt tcctcagttc aagttgggca cttacgagaa gaccggtctt gctagattct 2041
aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc tgagagatgc aggcttcatt tttgatactt 2101
ttttatttgt aacctatata gtataggatt ttttttgtca ttttgtttct tctcgtacga 2161
gcttgctcct gatcagccta tctcgcagct gatgaatatc ttgtggtagg ggtttgggaa 2221
aatcattcga gtttgatgtt tttcttggta tttcccactc ctcttcagag tacagaagat
2281
taagtgagac cttcgtttgt gcagatccaa catccaaaga cgaaaggttg aatgaaacct
2341
ttttgccatc cgacatccac aggtccattc tcacacataa gtgccaaacg caacaggagg 2401
ggatacacta gcagcagacc gttgcaaacg caggacctcc actcctcttc tcctcaacac 2461
ccacttttgc catcgaaaaa ccagcccagt tattgggctt gattggagct cgctcattcc 2521
aattccttct attaggctac taacaccatg actttattag cctgtctatc ctggcccccc 2581
tggcgaggtt catgtttgtt tatttccgaa tgcaacaagc tccgcattac acccgaacat 2641
cactccagat gagggctttc tgagtgtggg gtcaaatagt ttcatgttcc ccaaatggcc 2701
caaaactgac agtttaaacg ctgtcttggai acctaatatg acaaaagcgt gatctcatcc 2761
aagatgaact aagtttggtt cgttgaaatg ctaacggcca gttggtcetaa asigaLaacttc 2821
caaaagtcgg cataccgttt gtcttgtttg gtattgattg acgaatgctc aaaaataatc 2881
tcattaatgc ttagcgcagt ctctctattcg cttctgaacc ccggtgcacc tgtgccgaaa 2941
cgcaaatggg gaaacacccg ctttttggat gattatgcat tgtctccaca ttgtatgctt 3001
ccaagattct ggtgggaata ctgctgatag cctaacgttc atgatcaaaa tttaactgtt 3061
ctaaccccta cttgacagca atatataaac agaaggaagc tgccctgtct taaacctttt 3121
tttttatcat cattattagc ttactttcat aattgcgact ggttccaatt gacaagcttt 3181
tgattttaac gacttttaac gscascttga gaagatcaaa aaLacaactaa ttattcgaaa3241
cgatgagatt tccttcaatt tttactgctg ttttattcgc agcatcctcc gcattagctg 3301
ctccagtcaa cactacaaca gaagatgaaa cggcacaaat tccggctgaa gctgtcatcg 3361
gttactcaga tttagaaggg gatttcgatg ttgctgtttt gccattttcc aacagcacaa 3421
ataacgggtt attgtttata aatactacta ttgccagcat tgctgctaaa gaagaagggg 3481
tatctctcga gaaaagagag gctgaagctg aattcgacat tgtgatgacc caggctgcac 3541
cctctgtacc tgtcactcct ggagagtcag tatccatctc ctgcaggtct agtaagagtc 3601
tcctgcatac taatggcaac acttacttgc attggttcct acagaggcca ggccagtctc 3661
ctcagctcct gatatatcgg atgtccgtcc ttgcctcagg agtcccagac aggttcagtg 3721 gcagtgggtc aggaactgct ttcacactgai gcatcagtag agtggaggct ga_ggatgtgg 3 781 gtgtttttta ctgtatgcaa catctagaat atccgctcac gttcggtgct gggaccaagc 3 841 tggaactgaa acgggctcct cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg 3901 agctgggcat cgcgcaagtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca 3961
tcgccgtgga g"tgggagagc aacgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg 4021
tgctggactc cgacggctct ttcttcctct acagcaagct taccgtgttg ggccgcaggt 4081 ggaccctggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca 4141
cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aagggcgcgc ctgaggtacc tcgagccgcg 4201
gcggccgcca gctttctaga acaaaaactc atctcagaag aggatctgaa tagcgccgtc 4261
gaccatcatc atcatcatca ttgagtttgt agccttagac atgactgttc ctcagttcaa 4321
gttgggcact tacgagaaga ccggtcttgc tagattctaa tcaagaggat gtcagaatgc 4381
catttgcctg agagatgcag gcttcatttt tgatactttt ttatttgtaa cctatatagt 4441
ataggatttt ttttgtcatt ttgtttcttc tcgtacgagc ttgctcctga tcagcctatc 4501
tcgcagctga tgaatatctt gtggtagggg tttgggaaaa tcattcgagt ttgatgtttt 4561
tcttggtatt tcccactcct cttcagagta cagaagatta agtgagacct tcgtttgtgc 4621
ggatccccca cacaccatag cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc ttccagattt 4681
tctcggactc cgcgcatcgc cgtaccactt caaaacaccc aagcacagca tactaaattt4741
tccctctttc 4801
aagagaccgc 4861
tctttttctt
4921
taagttai5Lta 4981
aacttttttt 5041
gttgacaatt 5101
ta_aia_ccatgg 5161
gcggtcgagt 5221
gccggtgtgg 5281
5341
tcggaggtcg 5401
gagcagccgt 54S1
gtggccgagg 5521
tccgtccccc 5581
ccctcccccc 5641
ccctatttat 5701
tctttttttt 5761
gaaggttttg 5821
aggccaigcas 5881
ccgcccccct 5941
aggactaLtaLa 6001
gaccctgccg 6061
ttcctctagg ctcgtttctt gaa_3tttttt aacggtcttc acttcttgtt aatcatcggc ccaagttgac tctggaccga tccgggacga ccctggcctg tgtccacgaa gggggcggga sgcaggactg ttttcctttg acatccgctc ttttttatag ctgtacagac ggacgctcga aaggccagga gacgagcatc agaLtaccagg cttaccggat
gtgtcgttaa tttcttcgtc tttttagttt aatttctcaa
atagtatatc cagtgccgtt ccggctcggg cgtgaccctg ggtgtgggtg cttccgggac gttcgccctg a_ca_cgtccga_ tcgatatcat taaccga^aa ttatgttagt gcgtgtacgc aggctttaat accgta^5ia^ 3caaaa^tcg cgtttccccc acctgtccgc
ttacccgtac ta_a5iggtttg ga^aaga^as gaaaaaggca ataaaaattt ttatcacgtt ttttctcttt cagtgacctc
gtttcagttt ageatage ggcatagtat ccggtgctca ttctcccggg ttcatcagcg cgcggcctgg gcctccgggc cgcgacccgg cggcggccca gtaattagtt ggaaggagtt attaagaacg atgtaacatt ttgcaagctg ggccgcgttg aegctcaagt tggaagctcc ctttctccct
38
catttttctt aatctaatct aatacgacaa ccgcgcgcga acttcgtgga eggtccagga acgagctgta cggccatgac ccggcaactg cgggtcccag atgtcacgct agacaacctg
cattgatatt gttctattac
"ggggcggt
ggtgaggaac cgtcgccgga ggacgacttc ccaggtggtg cgccgagtgg egagategge cgtgcacttc gecteggsga tacattcacg aagtctaggt
ttatttatat ttcaaatttt
3tactga^a^
ctggcgtttt cagaggtggc ctcgtgcgct tegggaageg
ecttgettga tgtgagcaaa tccataggct gaaacccgac ctcctgttcc tggegcttte<formula>formula see original document page 39</formula>
包含TLR9和CD32結合區(qū)和表位序列(見SEQ ID No 16)的最終表達載體 。HLA23EP,seq (SEQ ID No 64) 7046 bp
<formula>formula see original document page 39</formula>721
gctgatagcc taacgttcat 781
atataaacag aaggaagctg 841
actttcataa ttgcgactgg 901
c3acttgag3 agatcaaaaa 961
tactgctgtt ttattcgcag 1021
agatgaiaacg gca_ca_a_attc 1081
tttcgatgtt gctgttttgc 1141
tactactatt gccagcattg 1201
tgaagctgaa ttcgaggttc 1261
gacagtcaag atctcctgca 1321
ggtga_a_gca_g gctccagga>a_ 1381
agagtcaata tatcctgatg 1441
cagcactgcc tatttgcaga 1501
tgc5L5tgaggg ga_ctstggtt 1561
CELCcgtctcc tcsLgccsia^a 1621
tgagctgggc atcgcgcaag 1681
catcgccgtg gagtgggaga 1741
cgtgctggac tccgacggct 1801
gtggaccctg gggaacgtct 1861
cacgcagaag agcctctccc 1921
agsggatctg 33tagcgccg 1981
acatgactgt tcctcagttc 2041
gatcaaaatt taactgttct ccctgtctta aacctttttt ttccaattga caagcttttg acaactaaitt aittcga_a_3cg catcctccgc attagctgct cggctgasgc tgtcatcggt cattttccaa cagcacaaat ctgctaaaga agaaggggta agcttcagca gtctggacct aggcttctgg gtataccttc agggtttaaa gtggatgggc acttcaaggg acggtttgcc tcaacaacct caaaaatgag acgacgaccc tttggactac ctcgagaacc acaggtgtac tcagcctgac ctgcctggtc gca^cgggca gccggageLac ctttcttcct ctacagcaag tctcatgctc cgtgatgcat tgtctccggg taaatctcta tcgaccatca teatcatcat a_a_gttgggca_ cttaicgaiga^
aacccctaict tgacagcaat tttatcatca ttattagctt attttaacga cttttaatcga atgagatttc cttcaatttt ccagtca3ca ctacaacaga tactcagstt tagaaggggai aacgggttat tgtttataaa tctctcga_ga_ aasigagaiggc gagctgaaga agectggaga acaaactatg gaatgaactg tggttaaaca cctacactgg ttctcttegg aaacctctgc gacatggcta catatttctg tggggtcaag gaacctcagt accctgcccc catcccggga asaggcttct atcccagcga aactacaaga ccacgcctcc cttaccgtgt tgggccgcag gaggctctgc acaaccacta gaacaaaaac tcatctcaga cattgagttt gtagecttag gaeeggtett gctagattct
40aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc tgagagatgc aggcttcatt tttgatactt 2101
ttttatttgt aacctaitatai gtataggatt ttttttgtca ttttgtttct tctcgtacga 2161
gcttgctcct gatcagccta tctcgcagct gatgaatatc ttgtggtagg ggtttgggaa 2221
aatcattcga gtttgatgtt tttcttggta tttcccactc ctcttcagag tacagaagat 2281
tasgtgagac cttcgtttgt gcagatccaa catccaaaga cgaaaggttg aatgaaacct 2341
ttttgccatc cgacatccac aggtccattc tcacacataa gtgccaaacg caacaggagg 2401
ggatacacta gcagcagacc gttgcaaacg caggacctcc actcctcttc tcctcaacac 2461
ccacttttgc catcgaaaaa ccagcccagt tattgggctt gattggagct cgcteattec
2521
aattccttct attaggctac taacaccatg actttattag cctgtctatc ctggcccccc 2581
t9"9"C9"ag"9"tt catgtttgtt tatttccgaa tgeaacaage tccgcattac acccgaacat 2641
cactccagat gagggctttc tgagtgtggg gtcaaatagt ttcatgttcc ccaaatggcc
2701
caaaactgac agtttaaacg ctgtcttgga acctaatatg acaaaagegt gatctcatcc 2761
aagatgaact aagtttggtt cgttgaaatg ctaacggcca gttggtcaaa aagaaacttc 2821
caaaagtegg cataccgttt gtcttgtttg gtattgattg aegaatgetc aaaaataatc 2881
teattaatge ttagcgcagt ctctctatcg cttctgaacc ccggtgcacc tgtgccgaaa 2 941
cgcaaatggg gaaacacccg ctttttggat gattatgeat tgtctccaca ttgtatgctt 3001
ccaagattct ggtgggaata ctgetgatag cctaacgttc atgatcaaaa tttaactgtt 3061
ctaaccccta cttgacagca atatataaac agaaggaagc tgccctgtct taaacctttt 3121
tttttatcat cattattagc ttactttcat aattgegact ggttccaatt gacaagcttt 3181
tgattttaac gacttttaac gacaacttga gsagatcsaa aaacaactaa ttattcgaaL3 3241
cgatgagatt tccttcaatt tttactgctg ttttattege agcatcctcc gcattagctg 3301
ctccagtcaa cactacaacs gaagatgaaa eggcacsaat teeggctgas gctgtcatcg 3361
gttactcaga tttagaatggg gatttcgatg ttgctgtttt gccattttcc aacagcacaa3421
ataacgggtt attgtttata aatactacta ttgccagcat tgctgctaaa gaagaagggg 3481
tatctctcga gaaaagagag gctgaagctg aattcgacat tgtgatgacc caggctgcac 3541
cctctgtacc tgtcactcct ggagagtcag tatccatctc ctgcaggtct agtaagagtc 3601
tcctgcatac taatggcaac acttacttgc attggttcct acagaggcca ggccagtctc 3661
ctcagctcct gatatatcgg atgtccgtcc ttgcctcagg agtcccagac aggttcagtg 3721
gcagtgggtc aggaatctgct ttcacactga gcatcagtag agtggaggct gaggatgtgg 3781
gtgtttttta ctgtatgcaa catctagaat atccgctcac gttcggtgct gggaccaagc 3841
tggaactgaa acgggctcct cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg 3901
agctgggcat cgcgcaagtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat: cccagcgaca 3961
tcgccgtgga gtgggagagc sacgggcagc cggagaaicaaL ctacaagacc acgcctcccg 4021
tgctggactc cgacggctct ttcttcctct acagcaagct taccgtgttg ggccgcaggt 4081
ggaccctggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca 4141
cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aagggcgcgc ctccggatgc caaatttacc 4201
cgccaaacgc gaacaagatc agagaggctt tgcaatcttg caggaggccc aatgcgcaga 4261
gattcggcat atccaactac tgccagatct accccccata cgatgggcgt acaatcatac 4321
agcgtgataa cggctatcag cctaactacc acgccgtgaa cattcgtcggc tacgagaatg 4381
tcgtggttac tgtgaaggta atgggcgatg acggggttct agcttgcgcc atagctacca 4441
agtacacttg gaacgtaccc aaaatttgcgc cgaaaagtga aaacgtcgta gtgaccataa 4501
gggaggcatt ggctcaacct caaagatact gcagacacta ctggacgccc tgcataatcc 4561
accgtggtaa accctttcaa cttgaggcag tgttcgaagc taacaggacg gtaacgccaa 4621
ttcgtatgca aggtgggtgc gggtcttgtt gggctttttc tggtgtggct gctactgaat 4681
aaggcgcgcc tgaggtacct cgagccgcgg cggccgccag ctttctagaa caaaaactca 4741tctcagaaga ggatctgaat agcgccgtcg accatcatca tcatcatcat tgagtttgta 4801
gccttagaca tgactgttcc tcagttcaag ttgggcactt acgagaagac cggtcttgct 4861
agattctaat caagaggatg tcagaatgcc atttgcctga gagatgcagg cttcattttt 4921
gatacttttt tatttgtaac ctatatagta taggattttt tttgtcattt tgtttcttct 4981
cgtacgagct tgctcctgat cagcctatct cgcagctgat gaa_tatcttg tggtaggggt 5041
ttgggaaaat cattcgagtt tgatgttttt cttggtattt cccactcctc ttcagagtac 5101
agaagattaa gtgagacctt cgtttgtgcg gatcccccac acaccatagc ttcaaaatgt 5161
ttctactcct tttttactct tccagatttt ctcggactcc gcgcatcgcc gtaccacttc
5221
aaaacaccca agcacagcat actaaatttt ccctctttct tcctctaggg tgtcgttaat 5281
tacccgtact aaaggtttgg aaaagaaaaa agagaccgcc tcgtttcttt ttcttcgtcg 5341
aaaaaggcaa taaaaatttt tatcacgttt ctttttcttg aaattttttt ttttagtttt 5401
tttctctttc agtgacctcc attgatattt aagttaataa acggtcttca atttctcaag 5461
tttcagtttc atttttcttg ttctattaca acttttttta cttcttgttc attagaaaga 5521
aagcatagcEi atctaatcta aggggcggtg ttgacaatta atcatcggca tagtatatcg 5581
gcatagtata atacgacaag gtgaggaact aaaccatggc caagttgacc agtgccgttc 5641
cggtgctcac cgcgcgcgac gtcgccggag cggtcgagtt ctggaccgac cggctcgggt 5701
tctcccggga cttcgtggag gacgacttcg ccggtgtggt ccgggacgac gtgaccctgt 5761
tcatcagcgc ggtccaggac caggtggtgc cggacaacac cctggcctgg gtgtgggtgc 5821
gcggcctgga cgagctgtac gccgagtggt cggaggtcgt gtccacgaac ttccgggacg 5881
cctccgggcc ggccatgacc gagatcggcg agcagccgtg ggggcgggag ttcgccctgc 5941
gcgacccggc cggcaactgc gtgcacttcg tggccgagga gcaggactga cacgtccgac 6001
ggcggcccac gggtcccagg cctcggagat ccgtccccct tttcctttgt cgatatcatg 6061
taattagtta tgtcacgctt acattcacgc cctcccccca catccgctct aaccgaaaag6121
gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc cctatttatt tttttatagt tatgttagta 6181
ttaagaacgt tatttatatt tcaaattttt cttttttttc tgtacagacg cgtgtacgca 6241
tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt 6301
tgcaagctgg agaccaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 6361
gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga S421
cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 6481
ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 6541
tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg
gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 6661
tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg" taagacacga cttatcgcca 6721
ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 6781
ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 6841
ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc
accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 6961
tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 7021
cgttaagggaL ttttggtcat ga_ga>tc
〃
所有溫度為攝氏度形式。文中使用了下列縮略語 CD32 = FcyRII TLR9 = Toll樣受體9
DerPl = Dermatophagoides pteronissyus (表皮蟲離屬)的主要變應原l Der P2 = Dermatophagoides pteronissyus (表皮螨屬)的主要變應原2 Der Fl = Dermatophagoides farinae (表皮螨屬)的主要變應原1參考文獻
1. Mudde,G.C.， I.G.Reischl, N.Corvai'a， A.Hren, and E,MP6llabauer. 1996. Antigen presentation in allergic sensitization. 7mmwwo/. Ce// J5/o/. 74:167-173.
2. Bheekha Escura，R.， E.Wasserbauer, F,Hammerschmid, A.Pearce, P.Kidd, and G.C.Mudde. 1995. Regulation and targetting of T-cell immune responses by IgE and IgG antibodies, /ww朋o/ow 86:343-350.
3. PSne，J.， RRousset, F.BriSre， I.ChrStien， J.-Y.Bonnefoy， H.Spits, T.Yokota, K.-I.Arai, J.Banchereau, and J:E.De Vries. 1988. IgE production by normal human lymphocytes is induced by interleukin 4 and suppressed by interferons gamma and alpha and prostaglandin E2. iVoc. 7Vaf/. ^C(3(i. 5bz.. 85:6880-6884.
4. Ebner,C. 1999. Immunological mechanisms operative in allergen-specific immunotherapy, /"f Xrc/z ^4//ergy /mwwwo/ 119:1-5.
5. Ferreira，F., C.Ebner， B.Kramer， G.Casari， P.Briza， A丄Kungl, R.Grimm, B.Jahn-Schmid, H,Breiteneder， D.Kraft, M.Breitenbach, H丄Rheinberger， and O.Scheiner. 1998. Modulation of IgE reactivity of allergens by site-directed mutagenesis: potential use of hypoallergenic variants for immunotherapy.化Sfi^ 加，/12:231-242.
6. Rissoan，M.C.， V.Soumelis, N.Kadowaki, GGrouard, RBriere, R.D.Malefyt, and Y.J丄iu. 1999. Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation. 5b/ewce 283:1183-1186.
7. Kapsenberg,M丄.，C.M.Hilkens， E.A.\Vierenga, and RKalinski, 1999. The paradigm of type 1 and type 2 antigen-presenting cells. Implications for atopic allergy. C"w. Exp. J〃e， 29:33-36.
8. Charbonnier,A.S., H.Hammad, RGosset, G.A.Stewart, S.Alkan, A.B.Tonnel， and J.Pestel. 2003. Der pi-pulsed myeloid and plasmacytoid dendritic cells from house dust mite-sensitized allergic patients dysregulate the T cell response. /
所o/. 73:91-99.
9. Rothenfbsser,S.， E.Tuma, S.Endres, and G.Hartmann. 2002, Plasmacytoid dendritic cells: The key to CpG. i/wm. i/wwwwo/. 63:1111-1119.
10. Latz，E., A.Schoenemeyer， A.Visintin， K.A.Fitzgerald, B.G.Monks,C. F.Knetter， E丄ien, N丄Nilsen， T.Espevik， and D.T.Golenbock. 2004. TLR9 signals after translocating from the ER to CpG DNA in the lysosome. /m附畫/. 5:190-198.
11. Leifer，C.A.， M.N.Kennedy, A.Mazzoni, C.W.Lee， M丄Kruhlak, and
D. A.Segal. 2004. TLR9 Is localized in the endoplasmic reticulum prior to stimulation. 乂 /附附w"o/. 173:1179-1183.
12. Wang，W.W.， D.Das， X丄.Tang， W.Budzynski, and M.R.Suresh. 2005. Antigen targeting to dendritic cells with bispecific antibodies. J! /www"o/.
13. van Schaijk，RG, E.Oosterwijk， A.C.Soede, M.Broekema, C.Frielink， W丄McBride, D,M.Goldenberg， F.H,Corstens, and O.C.Boerman. 2005. Pretargeting of carcinoembryonic antigen-expressing tumors with a biologically produced bispecific anticarcinoembryonic antigen x anti-indium-labeled diethylenetriaminepentaacetic acid antibody. CVz'w. Ca"ceri es. ll:7130s-7136s.
14. Le,G.F., U.Reusch, G.Moldenhauer, M丄ittle, and S,M.Kipriya爾.2004. Immunosuppressive properties of anti-CD3 single-chain Fv and diabody. >/ /mm，o/. Afe Aocfe 285:111-127.
15. Schuster,M,, RUmana， C.Ferrara， P.Brunker， C.Gerdes， G.Waxenecker， S.Wiederkum, C.Schwager, H丄oibner， G.Himmler, and G.C.Mudde. 2005. Improved effector functions of a therapeutic monoclonal Lewis Y-specific antibody by glycoform engineering. Ca"cer 65:7934-7941.
16. Orlandi,R.， D.H,Gussow， P.T.Jones, and G.Winter. 1989. Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. Prac. 7Vw/.t/. X力.86:3833-3837.
17. Barton,G.M., J.C.Kagan, and R.Medzhitov. 2005. Intracellular localization of Toll-like receptor 9 prevents recognition of self DNA but facilitates access to viral DNA. 7V^. /www"o/.,.
18. Chen,W丄.，J丄.Wang, H.Z.An, J.Zhou， L.H.Zhang， and X.T.Cao. 2005. Heat shock up-regulates TLR9 expression in human B cells through activation of ERK and NF-kappaB signal pathways, /m羅wo/. Z^", 98:153-159.
19. Eaton-Bassiri，A.， S.B.Dillon， M.Cunningham, M.A.Rycyzyn， J.Mills,R.T.Sarisky， and M丄.Mbow. 2004. Toll-like receptor 9 can be expressed at the cell surface of distinct populations of tonsils and human peripheral blood mononuclear cells, /"/ec/. Tw薦w. 72:7202-7211.
20. Leroy,B.P.， J.國M丄achapelle， M.Jacquemin, and J.-M.Saint-Remy. 1992. Treatment of atopic dermatitis by allergen-antibody complexes: Long-term clinical results and evolution of IgE antibodies. Z)erw她/og7'ca 184:271-274.
21. Chua，K.Y" W.K.Greene, RKehal， and W.R.Thomas. 1991, IgE binding studies with large peptides expressed from Der p II cDNA constructs. C7/".五x/ . 是，21:161-166.
22. Baselmans,P.J., E.Pollabauer, F.C.Van Reijsen, H.C.Heystek, A.Hren， RStumptner, M.GTila聽，W,C.Vooijs， and G.C.Mudde. 2000. IgE production after antigen-specific and cognate activation of HLA- DPw4-restricted T-cell clones, by 787。 of randomly selected B-cell donors, //wm. Tmwwwo/. 61:789-798.
23. Beck，H.， G.Schwarz, C.J.Schroter， MDeeg, D.Baier， S.Stevanovic, E. Weber, C.Driessen, and H.Kalbacher. 2001. Cathepsin S and an asparagine-specific endoprotease dominate the proteolytic processing of human myelin basic protein in vitro.五wr //mmw"o/ 31:3726-3736.
24. Higgins,丄A., C J.Thorpe, J.D.Hayball， R.E.O'Hehir， and J.R丄amb. 1994. Overlapping T-cell epitopes in the group I allergen of De，a啤/7ag0zWes species restricted by HLA-DP and HLA-DR class II molecules. J C7f". /www"o/. 93:891-899.
25. Bian,H., J,F.Reidhaar-Olson, and J.Hammer. 2003. The use of bioinformatics for identifying class II-restricted T-cell epitopes. 她&O(is 29:299-309.
26. Stumiolo,T., E.Bono, J.Ding, L.Raddrizzani, O.Tuereci， U.Sahin, M.Braxenthaler， RGallazzi, M.P.Protti, RSinigaglia, and J.Hammer. 1999. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Ato Sz'ofec/zwo/. 17:555-561
權利要求
1. 能夠結合TLR9和CD32且包含至少一種抗原的至少一種表位的分子或分子復合物。
2. 根據權利要求l的分子或分子復合物，其特征在于所述表位是T細胞 表位。
3. 根據權利要求1或2任一項的分子或分子復合物，其特征在于所述表 位書f生自變應原。
4. 根據權利要求1至3任一項的分子或分子復合物，其特征在于至少一 種表位是非共價連接至所述分子的。
5. 根據權利要求1至4任一項的分子或分子復合物，其特征在于至少一 種表位是非共價連接至TLR9和/或CD32結合區(qū)的。
6. 根據權利要求5的分子或分子復合物，其特征在于至少一種表位是通 過抗體相互作用和/或配體相互作用連接至TLR9和/或CD32結合區(qū)的。
7. 根據權利要求1至6任一項的分子或分子復合物，其特征在于所述表 位是從合成肽或抗原的包含至少 一種T細胞表位的DNA區(qū)段生成的。
8. 根據權利要求1至7任一項的分子或分子復合物，其特征在于所述表 位選自特應性皮炎、變應性哮喘、變應性鼻炎或變應性結膜炎中的變應原。
9. 根據權利要求1至8任一項的分子或分子復合物，其特征在于所述表 位是從完整抗原、變性抗原或經修飾以阻止與IgE結合的抗原分離的。
10. 根據權利要求1至9任一項的分子或分子復合物，其特征在于其包含 至少一種抗體或其衍生物或片段。
11. 根據權利要求10的分子或分子復合物，其特征在于所述抗體或其片 段或衍生物是IgG、 IgM、 IgE、 IgA或IgD。
12. 根據權利要求1至1H壬一項的分子或分子復合物，其特征在于其是 人類結構的或人源化結構的。
13. 根據權利要求1至12任一項的分子或分子復合物，其特征在于其是鼠結構的或部分鼠結構的。
14. 根據權利要求1至13任一項的分子或分子復合物，其特征在于其是 駱駝結構的或部分駱駝結構的。
15. 根據權利要求1至14任一項的分子或分子復合物，其特征在于其包含至少一種經工程改造的結合支架。
16. 根據權利要求15的分子或分子復合物，其特征在于所述結合支架選 自纖連蛋白III、脂籠蛋白、蛋白A、 a淀粉酶抑制劑、錨蛋白重復蛋白、C2 結構域、A-結構域、EGFR樣結構域、dab、 chi-bAb、 CTLA-4、 y結晶體及 任何其它蛋白質。
17. 根據權利要求1至16任一項的分子或分子復合物，其特征在于其包 含小的突變的免疫球蛋白結構域(SMID)的至少 一部分。
18. 根據權利要求1至17任一項的分子或分子復合物，其特征在于其包 含抗CD3 2抗體或其衍生物或片#殳的至少 一部分。
19. 根據權利要求1至18任一項的分子或分子復合物，其包含SEQIDNo 59的氨基酸序列或其一部分。
20. 根據權利要求1至19任一項的分子或分子復合物，其包含SEQIDNo 61的氨基酸序列或其一部分。
21. 藥用組合物，其包含至少一種根據權利要求1至20任一項的分子或 分子復合物，任選與至少一種藥學可接受載體或稀釋劑一起。
22. 根據權利要求21的藥用組合物用于主動免疫療法的用途。
23. 治療變態(tài)反應的方法，其中將至少一種根據權利要求1至20任一項 的分子或分子復合物以預防或治療有效量施用給需要此類治療的受試者， 任選與至少一種藥學可接受載體一起。
24. 至少一種根據權利要求1至20任一項的分子或分子復合物用于生產治療變態(tài)反應的藥物的用途。
25. 使用重組技術制備根據權利要求1至20任一項的分子或分子復合物 的方法，其中針對TLR9、 CD32的結合結構和表位的編碼基因在載體中構建 并在宿主細胞中表達。
26. 核酸載體，其用于表達根據權利要求1至20任一項的分子并包含 SEQ ID No 60的核酸序列。
27. 核酸載體，其用于表達根據權利要求1至20任一項的分子并包含 SEQ ID No 62的核酸序列。
28. 核酸載體，其用于表達根據權利要求1至20任一項的分子并包含 SEQ ID No 63的核酸序列。
29. 核酸載體，其用于表達根據權利要求1至20任一項的分子并包含SEQ ID No 64的核酸序列。 一
30.使用化學交聯制備根據權利要求1至20任一項的分子或分子復合物 的方法。
全文摘要
能夠結合TLR9和CD32且包含至少一種抗原的至少一種表位的分子或分子復合物，及其制備和作為藥物的用途，尤其用于變態(tài)反應治療。
文檔編號A61K39/395GK101432023SQ200780015546
公開日2009年5月13日 申請日期2007年2月28日 優(yōu)先權日2006年3月3日
發(fā)明者戈特福里德·希姆勒, 格爾特·馬德 申請人:F-星生物技術研究與開發(fā)有限公司