專利名稱：：對年幼動物免疫接種以抵抗胞內(nèi)勞森菌感染的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明概言之是關(guān)于用于免疫接種以對抗由專性胞內(nèi)細菌胞內(nèi)勞森菌增生性回腸炎的改良接種方法。特另i是，本發(fā)明提供一種藉:自一(1)天大開始接種年幼動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染來提供對抗胞內(nèi)勞森菌的增強性保護的方法。該等年幼動物優(yōu)選在1天大至21天大，更優(yōu)選在1天大至10天大，更優(yōu)選在1天大至9天大，更優(yōu)選在1天大至6天大，更優(yōu)選在1或2天大，且最優(yōu)選在1天大時接受接種。特別是，該年幼動物為年幼小豬(youngpiglet),優(yōu)選為斷奶前小豬(pre-weanedpiglet)?，F(xiàn)有技術(shù)豬增生性腸炎(Porcineproliferativeenteropathy,PPE)是天然發(fā)生的疾病，其可影響斷奶至成年期早年(yoimgadult)的豬。已確定其病原體為胞內(nèi)勞森菌。胞內(nèi)勞森菌是專性胞內(nèi)菌，不能在不含細胞的常規(guī)培養(yǎng)基上用普通的細菌學(xué)方法培養(yǎng)，一般認為其生長需要有細力包。S.McOristwa/.，InfectionandImmunity,Vol.61，No.19，4286-4292(1993)和G.Lawson"a/"J.ofClinicalMicrobiology,Vol.31,No.5，1136-1142(1993)討論了在常Mi且織培養(yǎng)瓶中、用正C-18大鼠單層腸上皮細胞培養(yǎng)胞內(nèi)勞森菌。美國專利5,714,375和5,885,823(都全文引入作參考)描述了在懸浮宿主細胞中培養(yǎng)胞內(nèi)勞森菌。胞內(nèi)勞森菌的致病抹和非致病減毒才朱是本領(lǐng)域熟知的。例如，WO96/39629和WO05/011731描述了胞內(nèi)勞森菌的非致病減毒抹。胞內(nèi)勞森菌的減毒抹可參見WO02/26250和WO03/00665。4該疾病的特征首先在于其肉眼及微觀病理，且隨后在于受感染細胞內(nèi)證實有胞內(nèi)細菌。該疾病的典型病理特征為在回腸(小腸的末端部分)、大腸或兩者的隱窩(crypt)中未成熟上皮細胞的增生。受感染組織的切片特征為類似"橡膠軟管(gardenhose)"的變紅增厚粘膜及腸損害。腸增厚最終阻止正常腸功能、吸收能力及營養(yǎng)轉(zhuǎn)移。該疾病的臨床表現(xiàn)為慢性重量減輕、不壯實(unthriftiness)、腹瀉及死亡。該疾病由于受感染動物死亡造成損失、醫(yī)療成本增加、增重困難及食物轉(zhuǎn)化率降低而具有經(jīng)濟學(xué)重要性。最值得注意的為在6-20周齡的豬中觀察到回腸炎的臨床病例。然而，已在剛斷奶不久的豬(3-4周齡)中證實(藉由PCR)胞內(nèi)勞森菌的存在，此表明暴露于胞內(nèi)勞森菌的情況發(fā)生在養(yǎng)殖場且可能源于勞森菌陽性母畜(Mauch及Bilkei(2004)VetRec155:532;Marsteller等人(2003).SwineHealthProd11:127-130;Stege等人(2004).VetMicro104:197-206)。此等觀察結(jié)果強調(diào)在生產(chǎn)系統(tǒng)中引入預(yù)防策略(諸如及早接種)的重要性。目前對抗回腸炎的免疫法的接種策略涉及僅對來自三周齡及三周齡以上的未接觸過勞森菌的豬進行疫苗口服投予，此是因為低于此年齡組的仔豬由于先前母豬的暴露或接種而可能具有對胞內(nèi)勞森菌呈陽性的母體抗體。在本發(fā)明的方法之前，一般認為母體抗體或其他催乳因子的存在可潛在地干擾該等仔豬中接種的功效，因為在仔豬的免疫系統(tǒng)可識別疫苗且開始分泌其自身抗體之前，母體抗體具有中和疫苗的能力。因此，已在面臨母體免疫時避免接種年幼仔豬。圖1展示在IFAT中對IgG、IgM及IgA呈陽性的初乳樣品的數(shù)目。圖2展示在具有不同Ig含量的母豬乳液樣品中胞內(nèi)勞森菌培養(yǎng)物的滴定度(兩次滴定的平均值)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是基于兩種令人驚奇的觀測結(jié)果。首先，在途經(jīng)胃腸道期間，母體抗體及母豬乳液并未顯現(xiàn)有效于滅活胞內(nèi)勞森菌。在室溫4小時培育期間以母豬初乳或乳液培育胞內(nèi)勞森菌不影響胞內(nèi)勞森菌培養(yǎng)物的滴定度。具有高或低Ig含量的樣品之間無差異。即使在1:20稀釋度(5%胞勞森菌培養(yǎng)物/95%乳液)下未觀測到對培養(yǎng)物滴定度的影響。總之，活體外未檢測到任何受測試母豬乳液樣品對胞內(nèi)勞森菌培養(yǎng)物的滴定度的直接影響。然而，由于年幼小豬通常不罹患回腸炎，因此已討論對抗胞內(nèi)勞森菌的母體免疫性(Holyoake,P.K.等人(1994)JClinMicrobiol32,第1980-1985頁；Mauch，C.H.Y.及G.Bilkei(2004)Vet.Rec.155,532)。如此研究中所示，在途經(jīng)胃腸道期間，母體抗體及母豬乳液并未顯現(xiàn)有效于滅活胞內(nèi)勞森菌。其次，母體抗體及母豬乳液并不干擾胞內(nèi)勞森菌抗原，且因此不防止由接種提供的對抗胞內(nèi)勞森菌感染的主動保護的建立。事實上，與未接種小豬相比，在1天大時接種的小豬的與該疾病有關(guān)的肉眼可見病理表現(xiàn)已有減少。因此，本發(fā)明克服先前技術(shù)的不足且提供新方法用于對動物提供對抗回腸炎(胞內(nèi)勞森菌感染)的增強性保護。詳言之，本發(fā)明提供一種接種年幼動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的方法，該方法包含投予該年幼動物有效劑量的胞內(nèi)勞森菌抗原的步驟。該年幼動物的年齡優(yōu)選為一(l)天大或一天大以上。此外，根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種用于接種具有或暴露于抗胞內(nèi)勞森菌抗體，尤其為母體來源的抗胞內(nèi)勞森菌抗體的年幼動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的方法，該方法包含投予該年幼動物有效劑量的胞內(nèi)勞森菌抗原的步驟。該年幼動物的年齡優(yōu)選為一(l)天大或一天大以上。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種用于接種具有或暴露于抗胞內(nèi)勞森菌抗體，尤其為母體來源的抗胞內(nèi)勞森菌抗體的動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的方法，該方法包含^L予該動物有效劑量的胞內(nèi)勞森菌抗原的步驟。如本文中所用的術(shù)語"接種，，("vaccination"或"vaccinating")意謂(但不限于)一種包括對動物投予胞內(nèi)勞森菌抗原的方法，其中該胞內(nèi)勞森菌抗原在投予該動物時在該動物體內(nèi)引發(fā)或能夠引發(fā)對抗胞內(nèi)勞森菌的免疫反應(yīng)。如本文中所用的術(shù)語"動物"意謂(但不限于)鳥、魚及諸如牛、豬、馬或靈長類動物等哺乳動物。然而，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，該動物為豬，優(yōu)選為斷奶前小豬。因此，根據(jù)另一方面，本發(fā)明是關(guān)于一種接種年幼動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的方法，該方法包含自一(l)天大開始投予該年幼動物有效劑量的胞內(nèi)勞森菌抗原的步驟，其中該動物為鳥、魚或諸如牛、豬、馬或靈長類動物等哺乳動物。該動物優(yōu)選為哺乳動物。該動物更優(yōu)選為豬。該動物最優(yōu)選為斷奶前小豬。如本文中所用的術(shù)語"年幼動物"是指1天大至20天大的動物。術(shù)語"年幼動物"優(yōu)選是指1天大至IO.天大的動物。術(shù)語"年幼動物"更優(yōu)選是指1天大至9天大，更優(yōu)選為1天大至8天大，更優(yōu)選為1天大至7天大，更優(yōu)選為1天大至6天大，更優(yōu)選為1天大至5天大，更優(yōu)選為1天大至4天大，更優(yōu)選為1天大至3天大，更優(yōu)選為1或2天大的動物，最優(yōu)選是指l天大的動物。術(shù)語"年幼動物"的個別含義(respectivemeaning)亦是指當以胞內(nèi)勞森菌抗原第一次接種動物時其年齡。因此，本發(fā)明的另一方面是關(guān)于一種接種年幼動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的方法，該方法包含投予該年幼動物有效劑量的胞內(nèi)勞森菌抗原的步驟，其中該動物在1天大至20天大時接受接種。根據(jù)另一實施例，本發(fā)明是關(guān)于該接種方法，其中該動物在1天大至10天大時接受接種。根據(jù)另一實施例，本發(fā)明是關(guān)于該接種方法，其中該動物在1天大至9天大時接受接種。根據(jù)另一實施例，本發(fā)明是關(guān)于該接種方法，其中該動物在1天大至8天大時接受接種。根據(jù)另一實施例，本發(fā)明是關(guān)于該接種方法，其中該動物在1天大至7天大時接受接種。根據(jù)另一實施例，本發(fā)明是關(guān)于該接種方法，其中該動物在1天大至6天大時接受接種。根據(jù)另一實施例，本發(fā)明是關(guān)于該接種方法，其中該動物在1天大至5天大時接受接種。才艮據(jù)另一實施例，本發(fā)明是關(guān)于該接種方法，其中該動物在1天大至4天大時接受接種。根據(jù)另一實施例，本發(fā)明是關(guān)于該接種方法，其中該動物在l天大至3天大時接受接種。根據(jù)另一實施例，本發(fā)明是關(guān)于該接種方法，其中該動物在1或2天大時接受接種。根據(jù)另一實施例，本發(fā)明是關(guān)于該接種方法，其中該動物在1天大時接受接種。術(shù)語"具有或暴露于抗胞內(nèi)勞森菌抗體"意謂(但不限于)具有或暴露于優(yōu)選為每毫升至少1:4,更優(yōu)選為1:16以上，更優(yōu)選為1:64以上，更優(yōu)選為1:128以上，更優(yōu)選為1:256以上，更優(yōu)選為1:512以上，且最優(yōu)選為1:1024以上的可檢測抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度的動物。彼抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度優(yōu)選在特異性抗胞內(nèi)勞森菌免疫試驗中，優(yōu)選在如實施例4中所述的試驗中是可檢測及量化的。彼等抗胞內(nèi)勞森菌抗體更優(yōu)選為母體來源的抗體。術(shù)語"暴露于抗胞內(nèi)勞森菌抗體，，意謂(但不限于)以例如初乳或乳液等營養(yǎng)物飼喂動物獲得優(yōu)選為每毫升或每克營養(yǎng)物至少1:4，更優(yōu)選為1:16以上，更優(yōu)選為1:64以上，更優(yōu)選為1:128以上，更優(yōu)選為1:256以上，更優(yōu)選為1:512以上，且最優(yōu)選為1:1024以上的可檢測抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度的事實。術(shù)語"具有抗胞內(nèi)勞森菌抗體"應(yīng)意謂(但不限于)在該動物的1ml血清中具有優(yōu)選為至少1:4，更優(yōu)選為1:16以上，更優(yōu)選為1:64以上，更優(yōu)選為1:128以上，更優(yōu)選為1:256以上，更優(yōu)選為1:512以上，且最優(yōu)選為1:1024以上的可檢測抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度。因此，根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種用于接種動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的方法,該方法包含投予該動物有效劑量的胞內(nèi)勞森菌抗原的步驟，其中該動物具有或暴露于優(yōu)選為每毫升至少1:4,更優(yōu)選為1:16以上，更優(yōu)選為1:64以上，更優(yōu)選為1:128以上，更優(yōu)選為1:256以上，更優(yōu)選為1:512以上，且最優(yōu)選為1:1024以上的可檢測抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度。彼等抗體優(yōu)選為母體來源的抗體。彼等抗體滴定度更優(yōu)選在接種日存在于彼動物體內(nèi)。因此，根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種用于接種年幼動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的方法，該方法包含投予該年幼動物有效劑量的胞內(nèi)勞森菌抗原的步驟，其中該年幼動物具有或暴露于優(yōu)選為每毫升至少1:4,更優(yōu)選為1:16以上，更優(yōu)選為1:64以上，更優(yōu)選為1:128以上，更優(yōu)選為1:256以上，更優(yōu)選為1:512以上，最優(yōu)選為1:1024以上的可沖企測抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度。彼等抗體優(yōu)選為母體來源的抗體。該年幼動物的年齡優(yōu)選為1天大至20天大之間。該年幼動物的年齡更優(yōu)選為1天大至10天大之間，更優(yōu)選為1天大至9天大之間，更優(yōu)選為1天大至8天大之間，更優(yōu)選為1天大至7天大之間，更優(yōu)選為1天大至6天大之間，更優(yōu)選為1天大至5天大之間，更優(yōu)選為1天大至4天大之間，更優(yōu)選為1天大至3天大之間，更優(yōu)選為1或2天大，最優(yōu)選為1天大。如本文中所用的術(shù)語"有效劑量"("aneffectivedose")意謂(但不限于)在投予該有效劑量的胞內(nèi)勞森菌抗原的動物中引發(fā)或能夠引發(fā)該動物的免疫反應(yīng)的抗原的量。對組合物或疫苗的"免疫學(xué)反應(yīng)或免疫反應(yīng)"為在宿主中對所關(guān)注的紐合物或疫苗發(fā)生細胞免疫反應(yīng)及/或抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。因此，術(shù)語"引發(fā)或能夠引發(fā)免疫反應(yīng)"意謂(但不限于)宿主內(nèi)的免疫學(xué)過程，其特征在于反應(yīng)。通常，"免疫反應(yīng)，，包括(但不限于)以下作用中的一或多者產(chǎn)生或激活特異性針對于包括在所關(guān)注的組合物或疫苗中的抗原的抗體、B細胞、輔助性T細胞、抑制性T細胞及/或細胞毒T細胞及/或ydT細胞。宿主優(yōu)選將展現(xiàn)治療或保護性免疫學(xué)反應(yīng)以便增強對新感染的抵抗力及/或降低疾病的臨床嚴重性。該保護作用將藉由與如上文所述的宿主感染相關(guān)的癥狀的量或嚴重性減少或缺乏來證實。在動物體內(nèi)有效于引發(fā)免疫反應(yīng)或能夠引發(fā)免疫反應(yīng)的抗原量視疫苗的成份及投予進程而定。通常，當殺死的細菌抗原用于疫苗時，疫苗每劑量含有約103至約1(^個菌落形成單位(CFU)的量的細菌，優(yōu)選每劑量含有約104至約1()S個(CFU)的細菌，更優(yōu)選每劑量含有約105至約1()S個(CFU)。特別是，當經(jīng)修飾的活胞內(nèi)勞森菌細菌用于疫苗時(例如，命名為分離抹B3903的細菌分離抹，ATCC保藏編號PTA-4926;及命名為分離才木N34NP40wk的細菌分離抹，ATCC保藏編號55783,二者描述于WO96/39629及WO05/011731中)，待^L予易感動物的推薦劑量優(yōu)選為約3.0TCIDso(組織培養(yǎng)半數(shù)感染劑量終點)/劑至約6.0TCIDso/劑且最優(yōu)選為約4.0TCID50M'J至約5.0TCIDso/劑。在一優(yōu)選實施例中，如藉由組織培養(yǎng)半數(shù)感染劑量終點稀釋試驗法(TCIDso)所測定，疫苗的滴定度為約4.9TCIDso/劑。一般而言，免疫原的量將在5與5000微克之間且在102°與109°TCID5。之間，優(yōu)選在1030與1060TCIDso之間，更優(yōu)選在1040與1050TCIDso之間(當使用純化細菌時)。通常以每劑至少0.2jig抗原、優(yōu)選以每劑約0.2至約400pg、更優(yōu)選以每劑約0.3至約200pg、更優(yōu)選以每劑約0.35至約100pg、更優(yōu)選以每劑約0.4至約50(ig、更優(yōu)選以每劑約0.45至約30(ig、更優(yōu)選以每劑約0.6至約15昭、更優(yōu)選以每劑約0.75至約8嗎、更優(yōu)選以每劑約1.0至約6嗎且更優(yōu)選以每劑約1.3至約3.0嗎的抗原內(nèi)含量投予亞單位疫苗。如本文中所用的術(shù)語"增強性保護，，意謂(但不限于)經(jīng)接種動物組與未接種對照動物組相比較，在前者中一或多種與胞內(nèi)勞森菌感染有關(guān)的臨床癥狀(交叉損害頻率等)在統(tǒng)計上顯著的降低。術(shù)語"臨床癥狀在統(tǒng)計上顯著的降低"意謂(但不限于)在以傳染性胞內(nèi)勞森菌攻擊后，在經(jīng)接種動物組中至少一種臨床癥狀的發(fā)生頻率比在未接種對照組中低至少20%,優(yōu)選30%，更優(yōu)選50%，最優(yōu)選70%。如本文中所用的術(shù)語"胞內(nèi)勞森菌"意謂由C.Gebhart等人，Int，l.J.ofSystemicBacteriology,第43巻，第3期，533-538(1993)及S.McOrist等人，Int，l.J.ofSystemicBacteriology,第45巻，第4期，820-825(1995)(各文獻以引用的方式全文并入本文中)詳述的胞內(nèi)彎曲革蘭氏陰性細菌且包括(i"旦不限于)WO96/39629及WO05/011731中所述的分離抹。詳言之，術(shù)語"胞內(nèi)勞森菌"亦意謂(但不限于)根據(jù)布達佩斯條約(BudapestTreaty)保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia離抹。分別在WO96/39629及WO05/011731中描述兩種分離林。術(shù)語"胞內(nèi)勞森菌"亦意謂(但不限于)任何其他胞內(nèi)勞森菌細菌抹或分離抹，該等細菌抹中的至少一者的免疫原性性質(zhì)，尤其具有根據(jù)布達佩斯條約保藏于ATCC，10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209且ATCC保藏編號為PTA4926或ATCC保藏編號為55783的分離抹中的至少一者的免疫原性性質(zhì)。當一種菌抹或分離抹可至少以WO06/01294中所述的抗胞內(nèi)勞森菌特異性抗體之一在一種亦描述于WO06/01294的檢測試驗中得以檢測時，該菌抹或分離抹具有WO96/39629及WO05/011731中所述的胞內(nèi)勞森菌菌抹，尤其以ATCC保藏編號PTA4926或ATCC保藏編號55783保藏的分離抹中至少一者的"免疫原性性質(zhì)"。該等抗體優(yōu)選是選自編號為301:39、287:6、268:29、110:9、113:2及268:18的抗體。該檢測試驗優(yōu)選為如WO06/12949的實施例2及3中所述的三明治EUSA,而抗體110:9用作捕捉抗體及抗體268:29用作偶聯(lián)抗體。WO06/12949中所揭示的所有抗體是藉由雜交瘤細胞制造，該等雜交瘤細胞根據(jù)布達佩斯條約作為專利保藏物保藏于應(yīng)用農(nóng)i生物學(xué)研究中心(CentreforAppliedMicrobiologyandResearch,CAMR)及歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)，Salisbury,WiltshireSP40JG,UK。保藏日期為2004年5月11日。以ECACC保藏編號04092204成功地保藏雜交瘤細胞系110:9。以ECACC保藏編號04092201成功地保藏雜交瘤細胞系113:2。以ECACC保藏編號04092202成功地保藏雜交瘤細胞系268:18。以ECACC保藏編號04092206成功地保藏雜交瘤細胞系269:29。以ECACC保藏編號04092203成功地保藏雜交瘤細^^包系287:6。以ECACC保藏編號04092205成功地保藏雜交瘤細胞系301:39。如本文中所用的術(shù)語"胞內(nèi)勞森菌抗原"意謂(但不限于)包含至少一種抗原的物質(zhì)的任何組合物，該抗原在投予動物時可誘發(fā)、刺激或增強對抗胞內(nèi)勞森菌引起的感染的免疫反應(yīng)。該胞內(nèi)勞森菌抗原優(yōu)選為完全胞內(nèi)勞森菌細菌(尤其為滅活形式)(所謂殺死的細菌)、經(jīng)修飾的活的或減毒的胞內(nèi)勞森菌細菌(所謂MLB)、胞內(nèi)勞森菌的任何亞單位、多肽或組分或任何嵌合載體(各自包含胞內(nèi)勞森菌的至少一個免疫原性氨基酸序列)。如本文中所用的術(shù)語"免疫原性蛋白"、"免疫原性多肽"或"免疫原性氨基酸序列"是指在宿主中引發(fā)對抗包含該免疫原性蛋白、免疫原性多肽或免疫原性氨基酸序列的病原體的免疫反應(yīng)的任何氨基酸序列。特別是，胞內(nèi)勞森菌的"免疫原性蛋白"、"免疫原性多肽"或"免疫原性氨基酸序列"意謂編碼在投予該"免疫原性蛋白"、"免疫原性多肽"或"免疫原性氨基酸序列"的宿主中引發(fā)對抗胞內(nèi)勞森菌的免疫學(xué)反應(yīng)的抗原的任何氨基酸序列。如本文中所用的"免疫原性蛋白"、"免疫原性多肽"或"免疫原性氨基酸序列"包括(但不限于)任何蛋白的全長序列、其類似物或其免疫原性片段。術(shù)語"免疫原性片段"意謂包括一或多個表位，且因此引發(fā)對抗相關(guān)病原體的免疫學(xué)反應(yīng)的蛋白的片段?？墒褂帽绢I(lǐng)域熟知的多種表位定位技術(shù)來識別此等片段。例如，參見EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,第66巻(GlennE.Morris編,1996)HumanaPress,Totowa，NewJersey。(其教示及內(nèi)容以引用方式并入本文中。)舉例而言，藉由在固體支持物上同時合成大量肽(該等肽對應(yīng)于蛋白分子的部分)及當該等肽仍附著至該等支持物時使該等肽與抗體反應(yīng)可測定線性表位。此等技術(shù)在本領(lǐng)域已知且描述于例如美國專利第4,708,871號；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002;Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715中。(其教示及內(nèi)容以引用方式并入本文中。)類似地，藉由測定氨基酸的空間構(gòu)象(諸如藉由例如X光晶體分析術(shù)及二維核磁共振)來容易i也石角定才勾象表4立(conformationalepitope)。i"列i口參見上述EpitopeMappingProtocol。在該定義中亦包括合成抗原，例如多表位(polyepitope)、側(cè)翼表位及其它重組或合成得到的抗原。例如，參見Bergmann等人(1993)Eur,丄liImmunol.23:2777-2781;Bergmann等人(1996)，J.Immunol.157:3242-3249;Suhrbier，A.(1997),Immunol,andCellBiol.75:402-408;Gardner等人，(1998)12thWorldAIDSConference,Geneva,Switzerland,6月28日畫7月3日，1998。(其教示及內(nèi)容以引用方式并入本文中。)合適胞內(nèi)勞森菌抗原包括(但不限于)彼等在EP1219711、US6,605,696、WO96/39629、WO97/20050、WO00/69903、WO00/69904、WO00/69卯5、WO00/69906、WO02/38594、WO02/26250、WO03/006665、WO04/033631、WO05/026200及WO05/011731中所述的抗原。因此，根據(jù)本發(fā)明供使用的疫苗包括如上所述的任何胞內(nèi)勞森菌抗原，其引起或能夠引起對抗胞內(nèi)勞森菌的免疫反應(yīng)。該疫苗優(yōu)選至少提供對抗胞內(nèi)勞森菌的增強性保護。因此，根據(jù)另一方面，本發(fā)明是關(guān)于一種接種年幼動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的方法，該方法包含自一(l)天大開始投予該年幼動物有效劑量的胞內(nèi)勞森菌抗原的步驟，其中該胞內(nèi)勞森菌抗原是選自由活的經(jīng)修飾的胞內(nèi)勞森菌細菌、殺死的胞內(nèi)勞森菌細菌或胞內(nèi)勞森菌細菌的一或多個亞單位組成的組。該疫苗優(yōu)選包含經(jīng)修飾的活胞內(nèi)勞森菌細菌。疫苗更優(yōu)選為EnterisolIleitisB3903(BoehringerIngelheimVetmedica,Inc.)。如上所述，接種優(yōu)選在1天大至20天大時，更優(yōu)選在1天大至10天大時，更優(yōu)選在1天大至9天大時，更優(yōu)選在1天大至8天大時，更優(yōu)選在1天大至7天大時，更優(yōu)選在l天大至6天大時，更優(yōu)選在1天大至5天大時，更優(yōu)選在1天大至4天大時，更優(yōu)選在1天大至3天大時，更優(yōu)選在1或2天大時，且最優(yōu)選在1天大時發(fā)生。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種用于接種動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的方法，該方法包含投予該動物有效劑量的胞內(nèi)勞森菌抗原的步驟，其中該動物具有或暴露于優(yōu)選為每毫升至少1:4,更優(yōu)選為1:16以上，更優(yōu)選為1:64以上，更優(yōu)選為1:128以上，更優(yōu)選為1:256以上，更優(yōu)選為1:512以上，且最優(yōu)選為1:1024以上的可檢測抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度，且其中該胞內(nèi)勞森菌抗原是選自由活的經(jīng)修飾的胞內(nèi)勞森菌細菌、殺死的胞內(nèi)勞森菌細菌或胞內(nèi)勞森菌細菌的一或多個亞單位組成的組。該疫苗優(yōu)選包含經(jīng)修飾的活胞內(nèi)勞森菌細菌。疫苗更優(yōu)選為EnterisolIleitisB3903(BoehringerIngelheimVetmedica,Inc.)。此外，彼等抗體優(yōu)選為母體來源的抗體。彼等抗體滴定度更優(yōu)選在接種日存在于彼動物體內(nèi)。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種用于接種年幼動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的方法，該方法包含投予該年幼動物有效劑量的胞內(nèi)勞森菌抗原的步驟，其中該年幼動物具有或暴露于優(yōu)選為每毫升至少1:4，更優(yōu)選為1:16以上，更優(yōu)選為1:64以上，更優(yōu)選為1:128以上，更優(yōu)選為1:256，更優(yōu)選為1:512以上，最優(yōu)選為1:1024以上的可檢測抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度，且其中該胞內(nèi)勞森菌抗原是選自由活的經(jīng)修飾的胞內(nèi)勞森菌細菌、殺死的胞內(nèi)勞森菌細菌或胞內(nèi)勞森菌細菌的一或多個亞單位組成的組。該疫苗優(yōu)選包含經(jīng)修飾的活胞內(nèi)勞森菌細菌。疫苗更優(yōu)選為EnterisolIleitisB3903(BoehringerIngelheimVetmedica，Inc.)。jt匕夕卜，4皮等4元體優(yōu)選為母體來源的抗體。彼等抗體滴定度更優(yōu)選在接種日存在于纟皮動物體內(nèi)。該年幼動物的年齡優(yōu)選為1天大至20天大之間。該年幼動物的年齡更優(yōu)選為1天大至10天大之間，更優(yōu)選為1天大至9天大之間，更優(yōu)選為1天大至8天大之間，更優(yōu)選為1天大至7天大之間，更優(yōu)選為1天大至6天大之間，更優(yōu)選為1天大至5天大之間，更優(yōu)選為1天大至4天大之間，更優(yōu)選為1天大至3天大之間，更優(yōu)選為1或2天大，最優(yōu)選為1天大。根據(jù)另一方面，本發(fā)明是關(guān)于一種接種年幼動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的方法，該方法包含以下步驟自一(l)天大開始投予該年幼動物約3.0TCIDs。至約6.0TCIDs。的劑量的活的經(jīng)修飾的胞內(nèi)勞森菌細菌。優(yōu)選地，該纟田菌為疫苗EnterisolIleitisB3903(BoehringerIngelheimVetmedica,Inc.)中所包括的細菌。如上所述，接種優(yōu)選在1天大至20天大時，更優(yōu)選在1天大至10天大時，更優(yōu)選在1天大至9天大時，更優(yōu)選在1天大至8天大時，更優(yōu)選在1天大至7天大時，更優(yōu)選在1天大至6天大時，更優(yōu)選在1天大至5天大時，更優(yōu)選在1天大至4天大時，更優(yōu)選在1天大至3天大時，更優(yōu)選在1或2天大時，且最優(yōu)選在1天大時發(fā)生。因此，根據(jù)另一方面，本發(fā)明是關(guān)于一種接種動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的方法，該方法包含以下步驟投予該動物約3.0TCID5q至約6.0TCID50的劑量的活的經(jīng)修飾的胞內(nèi)勞森菌細菌，其中該動物具有或暴露于優(yōu)選為每毫升至少1:4,更優(yōu)選為1:16以上，更優(yōu)選為1:64以上，更優(yōu)選為1:128以上，更優(yōu)選為1:256，更優(yōu)選為1:512以上，且最優(yōu)選為1:1024以上的可;險測抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度。該細菌優(yōu)選為疫苗EnterisolIleitis13B3903(BoehringerIngelheimVetmedica,Inc.)中所包4舌的細菌。因此，根據(jù)另一方面，本發(fā)明是關(guān)于一種接種年幼動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的方法，該方法包含以下步驟投予該年幼動物約3.0TCIDs。至約6.0TCID50的劑量的活的經(jīng)修飾的胞內(nèi)勞森菌細菌，其中該年幼動物具有或暴露于優(yōu)選為每毫升至少1:4,更優(yōu)選為1:16以上，更優(yōu)選為1:64以上，更優(yōu)選為1:128以上，更優(yōu)選為1:256,更優(yōu)選為1:512以上，且最優(yōu)選為1:1024以上的可4企測抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度。該細菌優(yōu)選為疫苗EnterisolIleitisB3903(BoehringerIngelheimVetmedica,Inc.)中所包括的纟田菌。如上所述，接種優(yōu)選在1天大至20天大時，更優(yōu)選在1天大至10天大時，更優(yōu)選在1天大至9天大時，更優(yōu)選在1天大至8天大時，更優(yōu)選在1天大至7天大時，更優(yōu)選在1天大至6天大時，更優(yōu)選在1天大至5天大時，更優(yōu)選在1天大至4天大時，更優(yōu)選在1天大至3天大時，更優(yōu)選在1或2天大時，且最優(yōu)選在1天大時發(fā)生。根據(jù)另一方面，本發(fā)明是關(guān)于一種接種年幼動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的方法，該方法包含自一(l)天大開始投予該年幼動物有效劑量的胞內(nèi)勞森菌抗原的步驟，其中該年幼動物對胞內(nèi)勞森菌及抗胞內(nèi)勞森菌母體抗體呈陰性。如上所述，接種優(yōu)選在1天大至20天大時，更優(yōu)選在1天大至10天大時，更優(yōu)選在1天大至9天大時，更優(yōu)選在1天大至8天大時，更優(yōu)選在1天大至7天大時，更優(yōu)選在1天大至6天大時，更優(yōu)選在1天大至5天大時，更優(yōu)選在1天大至4天大時，更優(yōu)選在1天大至3天大時，更優(yōu)選在1或2天大時，且最優(yōu)選在1天大時發(fā)生。根據(jù)另一方面，本發(fā)明亦是關(guān)于一種胞內(nèi)勞森菌抗原的新穎醫(yī)療用途，其用于制備在一(l)天大時開始對年幼動物接種以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的藥劑(優(yōu)選為疫苗組合物)，其中該年幼動物是在一(l)天大或一天大以上時經(jīng)有效劑量的該胞內(nèi)勞森菌抗原接種。該接種優(yōu)選在1天大至20天大時，更優(yōu)選在1天大至10天大時，更優(yōu)選在1天大至9天大時，更優(yōu)選在1天大至8天大時，更優(yōu)選在1天大至7天大時，更優(yōu)選在1天大至6天大時，更優(yōu)選在1天大至5天大時，更優(yōu)選在1天大至4天大時，更優(yōu)選在1天大至3天大時，更優(yōu)選在1或2天大時，且最優(yōu)選在1天大時發(fā)生。根據(jù)另一方面，本發(fā)明亦是關(guān)于一種胞內(nèi)勞森菌抗原的新醫(yī)療用途，其用于制備接種動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的藥劑(優(yōu)選為疫苗組合物)，其中該動物具有或暴露于優(yōu)選為每毫升至少1:4,更優(yōu)選為1:16以上，更優(yōu)選為1:64以上，更優(yōu)選為1:128以上，更優(yōu)選為1:256,更優(yōu)選為1:512以上，且最優(yōu)選為1:1024以上的可檢測抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度。根據(jù)另一方面，本發(fā)明亦是關(guān)于一種胞內(nèi)勞森菌抗原的新穎醫(yī)療用途，其用于制備接種年幼動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染的藥劑(優(yōu)選為疫苗組合物)，其中該年幼動物具有或暴露于優(yōu)選為每毫升至少1:4，更優(yōu)選為1:16以上，更優(yōu)選為1:64以上，更優(yōu)選為1:128以上，更優(yōu)選為1:256,更優(yōu)選為1:512以上，且最優(yōu)選為1:1024以上的可檢測抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度。該接種優(yōu)選在1天大至20天大時，更優(yōu)選在1天大至10天大時，更優(yōu)選在1天大至9天大時，更優(yōu)選在1天大至8天大時，更優(yōu)選在1天大至7天大時，更優(yōu)選在1天大至6天大時，更優(yōu)選在1天大至5天大時，更優(yōu)選在1天大至4天大時，更優(yōu)選在1天大至3天大時，更優(yōu)選在1或2天大時，且最優(yōu)選在l天大時發(fā)生。根據(jù)上述該等醫(yī)療用途的另一方面，該胞內(nèi)勞森菌抗原是選自由活的經(jīng)修飾的胞內(nèi)勞森菌細菌、殺死的胞內(nèi)勞森菌細菌或胞內(nèi)勞森菌細菌的一或多個亞單位組成的組。該胞內(nèi)勞森菌抗原優(yōu)選為活的經(jīng)修飾的胞內(nèi)勞森菌細菌。更優(yōu)選地，該等動物是經(jīng)約3.0TCIDso至約6.0TCID5o的劑量的活的經(jīng)修飾的胞內(nèi)勞森菌細菌投予。人員所知。舉例而言，熟習(xí)此項技術(shù)者能夠確定該組合物中可包含的額外組分(亦參見Remington'sPharmaceuticalSciences.(1990).第18版，MackPubl.Easton)。專業(yè)人員可使用已知的可注射、生理學(xué)上可接受的無菌溶液。對于制備適于非經(jīng)腸注射或灌注的即用(ready-to-use)溶液而言，諸如鹽水或相應(yīng)血漿蛋白溶液之類等滲水溶液可容易地獲得。該等疫苗組合物可以凍干態(tài)或干燥制劑形式存在，例如，作為組配試劑盒(kitsofparts),其可在使用之前在無菌條件下直接用已知的可注射溶液重建。此外，本發(fā)明的免疫原性及疫苗組合物可包括一或多種獸醫(yī)可接受的載劑。如本文中所用的"獸醫(yī)可接受的載劑"包括任何溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、佐劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑及其類似物。"稀釋劑"可包括水、鹽水(saline)、葡萄糖、乙醇、甘油及其類似物。等滲劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖等。穩(wěn)定劑包括白蛋白及乙二胺四乙酸的堿鹽等。如本文中所使用的"佐劑"可包括氪氧化鋁及硫酸鋁，皂素例如QuilA、QS-21(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)，油包水乳'液，7K包油孝L液，？jc包油包水乳液。乳液可特別地基于下列物質(zhì)輕液態(tài)石蠟油(歐洲藥典類型)；類異戊二烯油諸如角蓋烷或角豊烯；由烯烴，尤其為異丁烯或癸烯低聚得到的油；含有直鏈烷基的酸類或醇類的酯類，更尤其為植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸〃務(wù)酸)酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇的酯類，尤其為異硬脂酸酯類。將油與乳化劑組合使用以形成乳液。該等乳化劑優(yōu)選為非離子表現(xiàn)活性劑，尤其為視情況經(jīng)乙氧基化的脫水山梨糖醇酯、二縮甘露醇酯(例如無水甘露糖醇油酸酯)、乙二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯及油酸、異硬脂酸、蓖麻酸或羥基硬脂酸的酯，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其為Pluronic產(chǎn)物，特別為L121)。參見Hunter等人，TheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants(Stewart-Tull，D.E.S.編)。JohnWiley及Sons,NY,第51-94頁(1995)及Todd等人，Vaccine15:564-570(1997)。(其教示及內(nèi)容據(jù)此以引用方式并入本文。)舉例而言，有可能4吏用由M.Powell及M.Newman所編的"VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach"，PlenumPress,1995的第147頁上所述的SPT乳液及同一本書的第183頁上所述的乳液MF59。(其教示及內(nèi)容據(jù)此以引用方式并入本文。)佐劑的另一實例為選自丙烯酸或曱基丙烯酸的聚合物及順丁烯二酸酐與烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐劑化合物為聯(lián)的丙烯酸或曱基丙烯酸的聚合物，尤其與糖類或多元醇類的聚烯基醚交聯(lián)的丙烯酸或曱基丙烯酸的聚合物。此等化合物藉由術(shù)語卡波姆(carbomer)而為人所知(Phameuropa第8巻，第2期，1996年6月)。熟悉此項4支術(shù)者亦可參考美國專利第2，909，462號，其描述此類與具有至少3個羥基，優(yōu)選為不超過8個羥基的多羥基化化合物交聯(lián)的丙烯酸聚合物，至少3個羥基的氫原子被具有至少2個碳原子的不飽和脂族基團置換。優(yōu)選基團為彼等含有2至4個碳原子的基團，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團。該等不飽和基團本身可含有諸如曱基等其他取代基。以卡巴浦爾(Carbopol)為名稱所出售的產(chǎn)品(BFGoodrich,Ohio,USA)特別適合。其與烯丙基蔗糖或與烯丙基異戊四醇交聯(lián)。其中，可提及Carbopol974P、934P及971P。最優(yōu)選4吏用Carbopol9"P。在順丁烯二酸酐與烯基書f生物的共聚物中，有共聚物EMA(Monsanto),其為順丁煤二酸酐與乙烯的共聚物。此等聚合物在水中的溶解產(chǎn)生酸性溶液，其將被中和，優(yōu)選中和至生理pH值以產(chǎn)生佐劑溶液，再向該佐劑溶液中并入免疫原性組合物、免疫組合物或疫苗組合物本身。另外合適的佐劑包括(但不限于)RIBI佐劑系統(tǒng)(RibiInc.)、嵌段共聚物(CytRx，AtlantaGA)、SAF-M(Chiron,EmeryvilleCA)、單磷?；|(zhì)A、阿夫立定(Avridine)脂質(zhì)-胺佐劑、來自大腸桿菌(E.coli)的熱不穩(wěn)定腸毒素(重組或其他方式)、霍亂毒素、IMS1314或胞壁?；牡取?yōu)選以每劑量約100叱至約10mg的量添加佐劑。更優(yōu)選以每劑量約100嗎至約10mg的量添加佐劑。更優(yōu)選以每劑量約500ng至約5mg的量添加佐劑。更優(yōu)選以每劑量約750jig至約2.5mg的量添加佐劑。最優(yōu)選以每劑量約lmg的量添加佐劑。疫苗組合物可進一步包括一或多種其他免疫調(diào)節(jié)劑，諸如白介素、干擾素或其他細胞因子。疫苗組合物亦可包括遺傳霉素(Gentamicin)及硫柳汞(Merthiolate)。雖然熟習(xí)技工可容易地確定適用于本發(fā)明的上下文中的佐劑及添加劑的量及濃度，但本發(fā)明涵蓋了在每毫升疫苗組合物劑量中包含約50|ig至約2000嗎佐劑且優(yōu)選為約250嗎佐劑的組合物。在另一優(yōu)選實施例中，本發(fā)明涵蓋包含約lfig/ml至約60嗎/ml的抗生素且更優(yōu)選為小于約30[ig/ml的抗生素的疫苗組合物。以任何習(xí)知方式，最優(yōu)選經(jīng)由經(jīng)口灌服(oraldrench)將疫苗投予動物，優(yōu)選為哺乳動物且更優(yōu)選為豬。待投予的劑量將視具體病例而定，但在任的量:、、、'"、5'、、u'、'通常將本發(fā)明的疫苗以一或多個劑量投予易感動物，優(yōu)選投予年幼小豬及/或具有抗胞內(nèi)勞森菌抗體或暴露于抗胞內(nèi)勞森菌抗體的小豬?？稍谧畛踅臃N之后以2至4周間隔1或2次投予活的或殺死的疫苗。對于減毒活疫苗而言，一劑為優(yōu)選。如上所述，第一次或單一投予優(yōu)選在1天大至20天大時，更優(yōu)選在1天大至10天大時，更優(yōu)選在1天大至9天大時，更優(yōu)選在1天大至8天大時，更優(yōu)選在1天大至7天大時，更優(yōu)選在1天大至6天大時，更優(yōu)選在1天大至5天大時，更優(yōu)選在1天大至4天大時，更優(yōu)選在1天大至3天大時，更優(yōu)選在1或2天大時，且最優(yōu)選在1天大時進行。若需要或必需第二次投予，則在第一次投予疫苗之后約1至約4周進行第二次投予。根據(jù)另一方面，在任何先前接種投予之后以3至12個月的間隔進行再接種。優(yōu)選以6個月至一年的間隔進行隨后疫苗劑量的投予。在另一優(yōu)選方面中，在約2至3周齡之前接種的動物應(yīng)再接種。優(yōu)選以一年的間隔進行隨后疫苗劑量的投予。在以下實施例中進一步描述本發(fā)明，提供以下實施例僅為說明的目的，不應(yīng)解釋為具有限制性。實際上，本發(fā)明的其他變體應(yīng)為熟習(xí)此項才支術(shù)者顯而易見。本文中所引用的所有公開案及專利是以引用的方式全文并入。實施例實施例1在來自母豬(生育不止i窩)及初產(chǎn)母豬(第一窩)的初乳及乳液樣品中檢測對胞內(nèi)勞森菌具特異性的抗體材料與方法在產(chǎn)仔后24h內(nèi)自25只母豬及25只初產(chǎn)母豬(gilt)取得初乳樣品。在哺乳期第一周及第二周自相同豬取得乳液樣品。在4。C兩次將樣品以2000g離心10min以分離乳液的脂肪部分。將樣品的水樣部分儲存在-20。C下直至分析。在IFAT中自l:20最初稀釋度開始連續(xù)2倍稀釋后，檢測抗胞內(nèi)勞森菌的特異性抗體。除對于各樣品而言，將FITC標記抗豬IgG、IgM及IgA抗體用于檢測不同類Ig之外，如實施例5中及別處所述進行IFAT。在產(chǎn)仔后24小時內(nèi)取得來自母豬及初產(chǎn)母豬的平行血樣。根據(jù)制造商的指示以EnterisolIleitisELISA檢驗此等樣品。結(jié)果圖1中概述在初乳樣品中抗體檢測的結(jié)果。該圖展示在IFAT中對于不同稀釋度的IgG、IgM及IgA得到陽性結(jié)果的樣品數(shù)目。在所有檢驗中初乳樣品都不是陰性。僅一個來自母豬的初乳樣品及一個來自初產(chǎn)母豬的初乳18樣品為IgG陰性，而在一個來自初產(chǎn)母豬的樣品中及三個來自母豬的樣品未檢測出特異性IgM。分別自初產(chǎn)母豬及母豬獲得的25個樣品中八個的對胞內(nèi)勞森菌具特異性的IgA得分為陰性。在哺乳期第二周獲得的乳液樣品中，僅兩個來自母豬的樣品的IgG得到1:20的滴定度，而一個來自初產(chǎn)母豬的樣品的IgA得分為陽性(l:20)。在哺乳期第三周，來自一只母豬及三只初產(chǎn)母豬的樣品在1:20的稀釋度得到IgG陽性結(jié)果。所有其他來自哺乳期第二周及第三周的樣品測得為IgG、IgM及IgA陰性。所有在產(chǎn)仔后24h內(nèi)取自母豬的血樣在EnterisofIleitisELISA中為陽性，而自初產(chǎn)母豬獲得的25個樣品中2個樣品得到陰性結(jié)果。來自血樣的結(jié)果與來自初乳樣品的結(jié)果之間無明顯相關(guān)性?？煽偨Y(jié)出，在來自母豬及初產(chǎn)母豬的初乳中，存在對胞內(nèi)勞森菌具特異性的IgG、IgM及IgA抗體。然而，在產(chǎn)仔后一周取得的乳液樣品中，僅在6%的樣品中可檢測到低滴定度的胞內(nèi)勞森菌特異性抗體。參考文獻1.McOrist,S,等人(2003)PigJ.51,26-352.Collins,A.M.等人(2001)AllenD.LemanSwine,Conference3.Holyoake,P.K.等人(1994)JClinMicrobiol32,1980-1985,Kruse,P.E.(1983)Ann.Rech.Vet.14,349-3534.Bollwein,J.(2004)Doctoralthesis,LMU,Munich5.Knittel,J.P.等人(1998)AJVR59,722-726實施例2在途經(jīng)胃腸道期間乳液抗體對胞內(nèi)勞森菌的直接影響材料與方法在出生后24h內(nèi)自母豬及初產(chǎn)母豬取得初乳樣品。在哺乳期第一周及第二周取得母豬乳液樣品。在4。C兩次將樣品以2000g離心lOmin以分離乳液的脂肪部分。將樣品的水樣部分儲存在-20。C直至分析。在IFAT中自1:20最初稀釋度開始連續(xù)2倍稀釋后，；險測抗胞內(nèi)勞森菌的特異性抗體。除對于各樣品而言，將FITC標記抗豬IgG、IgM及IgA抗體用于檢測不同類Ig之外，如實施例5中及別處(5)所述進行IFAT?；贗FAT結(jié)果選擇具有不同Ig含量的乳液樣品。以不同稀釋度在初乳或母豬乳液樣品中在室溫培育胞內(nèi)勞森菌培養(yǎng)物。將每一樣品測試兩次。在培育開始時(O小時)及在4小時后在室溫量測胞內(nèi)勞森菌的組織培養(yǎng)半數(shù)感染劑量(TCID50)。培養(yǎng)物的未稀釋樣品充當測試效能的對照。每次測TCIDso值時，使樣品20次通過20號針來均質(zhì)化。McCoy細胞在75cm"且織培養(yǎng)燒瓶中用DMEM/HAM，sF12培養(yǎng)基培養(yǎng)至100%長滿的單層，將細胞用胰蛋白酶消化，分裝于四個96孔微滴板上。將10"至10-7連續(xù)稀釋的樣品各接種六次于新鮮McCoy細胞上。在37。C在微嗜氧性條件下培育6天后，藉由冰冷丙酮/甲醇(50:50,v/v)固定細胞。藉由使用特異性單克隆抗勞森菌抗體且隨后用FITC標記抗小鼠抗體進行標記，來檢測胞內(nèi)勞森菌的生長。將含有一或多個帶5個或更多熒光胞內(nèi)勞森菌的McCoy細胞的各孔判為陽性。藉由使用根據(jù)Spearmann及Karber(6)的50%終點公式求出TCID50。結(jié)果圖1中概述來自TCID5o測試的結(jié)果及8個初乳(第l-5號)及乳液(第6-8號)樣品的IgG、IgA及IgM滴定度。在所有實驗中，培養(yǎng)物的對照樣品得到所預(yù)期的TCID5o值。在室溫培育4小時期間，所述測試無一發(fā)生胞內(nèi)勞森菌滴定度的實質(zhì)變化。因此，如此研究中所示，在途經(jīng)胃腸道期間，母體抗體及母豬乳液似乎并不有效于滅活胞內(nèi)勞森菌。參考文獻1.vanAken;N.等人(2002)Proc.17thIPVS,Ames,Iowa,USA2.Kruse,P.E.(1983)Ann.Rech.Vet.14,349-3533.Collins,A.M.等人(2001)AllenD.LemanSwine，Conference4.Holyoake,P.K.等人(1994)JClinMicrobiol32,第1980-1985頁5.Knittel，J.P.等人(1998)AJVR59,722-726.6.Karber，G.(1931)Arch.exp.Path.Pha腿.162,4807.Mauch，C.H.Y.及G.Bilkei(2004)Vet.Rec.155,532實施例3接種一天大的小豬的抗胞內(nèi)勞森菌感染功效材料與方法本研究由三個涉及1天大的胞內(nèi)勞森菌陰性及抗勞森菌母體抗體陰性哺乳小豬的實驗組組成。在研究第0天，第1組的20只小豬各自(被接種)接受口服劑量的EnterisolIleitis(疫苗分離抹B3903)(按說明書(3)指示)。第2組(對照)的二十只小豬接受由生長培養(yǎng)基組成的安慰劑。使所有組的小豬在研究第20天斷奶。在第21天，第1組及第2組的小豬經(jīng)由管伺(gavage)而接受含有3.5xl(f個毒性胞內(nèi)勞森菌2688/2685的小腸勻漿物。第三組的IO只豬(嚴格對照)在研究期間任何時期未接受疫苗、安慰劑或細菌攻擊。在第42天，人道地使所有組的豬安樂死且進行尸體解剖。主要功效參數(shù)包括特別由胞內(nèi)勞森菌所引起的回腸、盲腸及結(jié)腸的肉眼及微觀損害。次要參數(shù)包括臨床健康狀態(tài)(行為、體況及糞便硬度)、平均每日體重增加量、糞便排菌(PCR)及血清轉(zhuǎn)化(IFAT)(1)。結(jié)果在尸體解剖(第42天)時，與未接種的對照豬(回腸=1.16、盲腸=0.42、結(jié)腸=0.16)相比，受接種者(第1組)具有顯著(pO.0003)較小的平均肉眼損害得分(回腸(0.21)、盲腸(0.0)及結(jié)腸(0.0))。與經(jīng)接種豬(l."cm)相比，在對照組中小腸損害平均總長度(回腸、盲腸及結(jié)腸)顯著(pO.0001)較高(8.89cm)。第3組(嚴格對照組)的平均肉眼腸損害得分為0.22,被認為是正常的。與經(jīng)接種豬(0,53)相比，在對照組中回腸的勞森菌特異性平均微觀損害得分顯著(pO.02)較高(2.47)。此外，與經(jīng)接種組相比，在對照組中總微觀損害得分(pO.006)及IHC陽性豬百分比(pO.0001)顯著較高。在盲腸及結(jié)腸方面，對照組具有比經(jīng)接種組略高一點的平均微觀損害得分及IHC陽性動物百分比(p〉0.05)。顯著地(p0.05),與經(jīng)接種組相比，細菌攻擊(第35天)2周后較多對照豬為PCR陽性。在研究最后一天(第42天)，與彼等經(jīng)接種組的豬(3/19)相比，對照組的豬(8/19)排出略多一點的胞內(nèi)勞森菌(pX).05)。在研究期間第1組與第2組之間平均每日體重增加量或平均臨床得分無顯著(pX).05)差異?？偠灾?，主要功效參數(shù)(肉眼及微觀小腸損害進展)表明，當對1天大、母體抗體陰性、未接觸過勞森菌的小豬投予時，單一口服劑量的EnterisolIleitis有效對抗毒性細菌攻擊。在此研究中，哺乳期間初乳及乳液中潛在的非勞森菌特異性催乳特性不干擾或妨礙疫苗對抗毒性胞內(nèi)勞森菌攻擊的效力。表l.胞內(nèi)勞森菌糞便排菌者的比率。_組"且ID第0至21曰第28曰第35曰第42曰_PCR陽性PCR陽性PCR陽性PCR陽性<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>a'b相同字母表示無顯著差異(p0.05)。0嚴格對照組未作統(tǒng)計分析。*各組有一只豬由于與胞內(nèi)勞森菌無關(guān)的不良健康狀態(tài)而被移除。參考文獻1.McOrist等人(l993)InfectionandImmunity61:4286-42922.Knittel等人(1998)AmJVetRes59:722-726.3.Kroll等人(2004)AmJVetRes65:559-5654.Mauch及Bilkei(2004)VetRec155:5325.Marsteller等人(2003).SwineHealthProd11:127-1306.Stege等人(2004).VetMicro104:197-206實施例4用于檢測及量化抗胞內(nèi)勞森菌抗體的IFAT材料與方法在研究開始之前，將16只健康、懷孕及胞內(nèi)勞森菌陰性母豬隨機分為2組8只為超免疫組(A組)，8只為安慰劑投予對照組(B組)。在產(chǎn)仔之前倒數(shù)第55、35及14天，A組的各只母豬以市售EnterisolIleitis藉由直接經(jīng)口灌服進行超免疫。用此方法投予疫苗劑涉及使用10ml無菌塑料注射器將疫苗應(yīng)用于口腔后部。對照組(B組)接受等劑量的由懸浮于生長培養(yǎng)基中的未感染McCoy細胞組成的安慰劑。使A組懷孕母豬超免疫以求在產(chǎn)仔之前誘導(dǎo)高水平的母體免疫力。使每個懷孕母豬組住在多個分開的室中(以避免交叉污染)但處于相同條件(溫度、通風(fēng)及豬欄(pen)大小)。將每個室的母豬關(guān)在相同豬欄中。盡管研究調(diào)查者努力使受孕及產(chǎn)仔日期一致，但母豬并不都在同一天產(chǎn)仔。實情為，產(chǎn)仔發(fā)生在10天期間。為防止出現(xiàn)多個接種日及細菌攻擊曰以致該研究中豬群之間變動過大，將產(chǎn)仔期間的平均產(chǎn)仔日期確定為研究的第0天。因此，在接種時(第21天)豬為3周±5天大。在第21天，按窩(litter)揀選100只健康、斷奶小豬且隨機分為六個處理組。住所限制及條件類似于上述母豬組。將超免疫母豬(A組)所生的小豬隨機分至第1至3組，并在此后研究中稱其為"超免疫來源，，小豬。將對照母豬(B組)所生的小豬隨機分至第4至6組，并在此后研究中稱其為"安慰劑來源"小豬。第1組及第4組(分別為20只豬/組)藉由直接經(jīng)口灌服給予單一2ml劑量的EnterisolIleitis。第2組及第5組(分別為20只豬/組)給予等劑量的安慰劑(未感染的McCoy細胞+培養(yǎng)基)。第3組及第6組(IO只豬/組)為"嚴格陰性對照組"，在此研究期間其不接受疫苗或安慰劑處理，且不受細菌攻擊。在斷奶期后第22天，人道地使母豬安樂死且進行尸體解剖以用于評估由于PE引起的小腸損害進展。在研究的第42天，第1、2、4及5組經(jīng)由胃內(nèi)管飼接受每劑量lxl073TCID5o的異源毒性純培養(yǎng)物胞內(nèi)勞森菌分離抹N101494。細菌攻擊的21天后，每天檢驗所有小豬的與PE相關(guān)的臨床癥狀、腹瀉、行為及體況，根據(jù)嚴重程度給出1至4級的評分(1=臨床正常；4=嚴重疾病)。在研究第21、42及63天將豬稱重以計算每組豬的平均每日體重增加量。計算平均每曰體重增加量(ADWG)以分析與豬正常生長性能有關(guān)的處理效果。豬在最初稱重以獲得在接受疫苗或安慰劑處理之前的組平均體重基數(shù)。發(fā)現(xiàn)所有組大小均勻(差異0.63公斤/豬)。組間第一關(guān)鍵ADWG評估時期發(fā)生于第21天(接種)至第42天(細菌攻擊)，以測量疫苗接種或安慰劑接種的即刻效果。第二評估時期為第42天至63天(尸體解剖)，以測量以毒性純培養(yǎng)物胞內(nèi)勞森菌攻擊的效果。于PE引起的小腸損害進展。結(jié)果母體抗體檢測A組(超免疫)母豬在產(chǎn)仔期間在血清及初乳中檢測到胞內(nèi)勞森菌特異性IgG、IgA及IgM抗體。產(chǎn)仔時，63%的A組母豬(5只/8只母豬)對抗勞森菌IgG抗體為血清抗體陽性，而B組(對照)中0%的母豬(0/8)為陽性。此夕卜，A組母豬所生小豬僅在產(chǎn)仔日(第0天)至5周齡(第28天)時檢測到血清IgG抗體，見圖1。A組母豬分別有50。/。、75%及12.5%在初乳中檢測到抗勞森菌IgG、IgA及IgM。A組母豬的初乳中平均抗體濃度為l:14(IgG，范圍=1至1:64)、l:10(IgA，范圍=1至l:32)及l(fā):4(IgM，范圍=1至1:4)。B組B組母豬中的一只豬在1:16的滴定度為IgA陽性。母體保護比較第2組(A組母豬所生豬)與第5組(B組母豬所生豬)中未接種的對照豬，以評估經(jīng)疫苗超免疫的母豬(A組母豬)對抗毒性胞內(nèi)勞森菌暴露的潛在母體保護作用。表1中概述所有組的平均肉眼及微觀損害得分。與第2組豬(27.5°/。)相比，第5組豬(77%)的回腸及結(jié)腸中勞森菌特異性損害百分比較高。在研究的第63天，與第5組相比，第2組豬的回腸平均肉眼損害得分以及回腸及結(jié)腸平均微觀(IHC)損害得分都顯著(pO.05)較低。在研究的第21天(接種)至第42天(細菌攻擊)，在任一組的糞便中由PCR未檢測到胞內(nèi)勞森菌排出，見圖3。第2及第5組的糞便從第49天開始呈PCR陽性，且分別有5-25%及15-72%的在此期間排出胞內(nèi)勞森菌的豬保持陽性直至第63天(研究終止)。在研究的第63天，與第5組(72%)相比，第2組中藉由PCR檢測到顯著(pO.05)較少的糞便排出(25。/。)。在研究第63天，與第2組(25%)相比，第5組豬的回腸中發(fā)現(xiàn)較高的組織PCR陽性百分比(45%)。第2組豬在扁桃體、腸系膜淋巴結(jié)及結(jié)腸中為胞內(nèi)勞森菌PCR陰性。如上文第3.4節(jié)所述，在第5組豬的結(jié)腸及腸系膜淋巴組織中觀察到不同PCR陽性。表2中概述所有測試組間平均體重增加量的比較。在第21天(接種)，第2組與第5組間平均初始體重一致，豬重分別為6.35及6.10公斤/豬。第21天(接種)至第42天(細菌攻擊)，第2組(0.40公斤/豬)與第5組(0.41公斤/豬)間ADWG無顯著差異。然而，在研究的第42天(細菌攻擊)至第63天(研究終止)的21天評估期期間，與第5組豬(0.40公斤/豬)相比，第2組豬(0.46公斤/豬)的ADWG顯著(pO.05)較高。超免疫豬中的疫苗功效將第1組中以EnterisolIleitis接種的豬與第2組中未接種的對照豬進行比較，以證實，可藉由評估3周齡的豬接種后對抗PE的保護性免疫來實現(xiàn)面臨母體免疫時的接種。兩個組中的豬都來自經(jīng)疫苗超免疫的母豬(A組母豬)。此外，分析第1組與第4組的經(jīng)疫苗處理的豬之間的主要及次要功效參數(shù)，以判定，疫苗對抗毒性胞內(nèi)勞森菌攻擊的功效是否類似。表1中概述所有組的平均肉眼及微觀損害得分。與第1組豬(12.5%)相比，第2組豬(27,5%)的回腸及結(jié)腸中勞森菌特異性損害百分比較高。在研究的第63天，與第2組相比，第1組豬的平均肉眼損害得分(回腸)顯著(pO.0》較低，且平均微觀(IHC)損害得分(回腸及結(jié)腸)數(shù)值較低。此外，在接受接種的豬(第1組及第4組)中平均肉眼與微觀損害得分或損害嚴重程度間無顯著差異。在研究的第21天(接種)至第35天期間，在任一組(l或2組)的糞便中藉由PCR未檢測到胞內(nèi)勞森菌排出，見圖3。第1組豬的糞便從第42天(細菌攻擊)開始呈PCR陽性，在此期間排出胞內(nèi)勞森菌的豬有11-16%保持陽性直至第63天(研究終止)。第2組豬的糞便從第49天開始呈PCR陽性，在此期間排出胞內(nèi)勞森菌的豬有5-25%保持陽性直至第63天(研究終止)。第4組豬直到第42天(細菌攻擊)才變?yōu)閯谏鶧NAPCR陽性，并將陽性保持至第63天(研究終止)，期間排出者比率從25%減少至5%。在研究期間第l組與第2組、第l組與第4組之間胞內(nèi)勞森菌糞便排菌者比率無顯著差異的跡象。在研究的第63天(研究終止)，與第1組(20%)相比，第2組豬的回腸中發(fā)現(xiàn)略高的組織PCR陽性百分比(25%)。在研究終止時，發(fā)現(xiàn)第4組的組織PCR陽性百分比(5%)比第1組及第2組低。第1組與第2組、第1組與第4組間PCR陽性無顯著差異。所有三組豬在扁桃體、腸系膜淋巴結(jié)及結(jié)腸中對胞內(nèi)勞森菌為PCR陰性。表2中概述所有測試組間平均體重增加量的比較。在第21天(接種)，第1組與第2組間平均初始體重一致，豬重分別為6.53及6.35公斤/豬。第21天，在第1組與第4組間亦觀測到一致的平均體重(分別為6.53公斤/豬及6.44公斤/豬)。第21天(接種)至第42天(細菌攻擊)，第1紐(0.40公斤/豬)與第2組(0.41公斤/豬)間、或第1組與第4組(0.44公斤/豬)間ADWG無顯著差異。第42天(細菌攻擊)至第63天(研究終止)的21天評估期期間，第1組豬(0.45公斤/豬)與第4組豬(0.51公斤/豬)的ADWG有顯著差異(p0.05)。在此研究的第21天至第63天，第1組與第2組間ADWG無顯著差異。實施例5用IFAT檢測及量化抗胞內(nèi)勞森菌抗體25藉由免疫熒光抗體測試(IFAT),使用固定于96孔聚苯乙烯微滴板上的勞森菌全抗原及針對豬IgG的FITC標記抗體(knittel等人1998)，測試來自各母豬及豬的血液的血清樣品中對抗胞內(nèi)勞森菌的IgG抗體的存在。藉由使用針對豬IgM及IgA的FITC標記抗體略微修改IFA測試。將此經(jīng)修改的方法用于在各母豬初乳中4企測除IgG外的此等抗體，以用于測定不同勞森菌特異性免疫球蛋白的濃度。將初乳在PBS中一式兩份作2倍稀釋，且轉(zhuǎn)移(100)Lll/孔)至兩組如上所述包被了勞森菌的96孔培養(yǎng);f反中。將這些板在37。C培育30分鐘，接著以PBS洗滌3次。將事先已在PBS中1:200稀釋的4元豬IgM或IgAFITC4禺耳關(guān)^t體(KirkegaardandPerryLaboratories,Inc.)添力口至培養(yǎng)板中，接著重復(fù)培育及洗滌步驟。使用UV顯微術(shù)檢測各種特異性抗勞森菌抗體的滴定度。計算各種免疫球蛋白的IFAT陽性百分比及平均滴定度值用于組間比較，以求出母豬間IgG、IgM及IgA初乳抗體的頻率及含量。參考文獻1.Knittel等人(1998)AmJVetRes59:722-726。權(quán)利要求1.一種方法，其用于接種年幼動物以對抗胞內(nèi)勞森菌(L.intracellularis)感染或用于接種具有抗胞內(nèi)勞森菌抗體或暴露于抗胞內(nèi)勞森菌抗體的動物，該方法包括投予有效劑量的胞內(nèi)勞森菌抗原的步驟。2.權(quán)利要求1的方法，其中該等動物在1天大至9天大時接種。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中該等動物在1天大至6天大時接種。4.權(quán)利要求l-3之一的方法，其中該等動物在1或2天大時接種。5.權(quán)利要求l-4之一的方法，其中該等動物具有或暴露于每毫升血清或流體至少1:4的可檢測的抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度。6.權(quán)利要求1-4之一的方法，其中該等動物具有或暴露于每毫升血清或流體至少1:64的可檢測的抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度。7.權(quán)利要求1-6之一的方法，其中該胞內(nèi)勞森菌抗原是選自由活的經(jīng)修飾的胞內(nèi)勞森菌細菌、殺死的胞內(nèi)勞森菌細菌、或胞內(nèi)勞森菌細菌的一或多個亞單位組成的組。8.權(quán)利要求l-6之一的方法，其中該胞內(nèi)勞森菌抗原為活的經(jīng)修飾的胞內(nèi)勞森菌細菌。9.權(quán)利要求8的方法，其中該年幼動物是投予約3.0TCIDso至約6.0TCID5Q的劑量的該活的經(jīng)修飾的胞內(nèi)勞森菌細菌。10.權(quán)利要求l-9之一的方法，其中該等動物為鳥、魚、及哺乳動物諸如牛、豬、馬及靈長類動物之類。11.權(quán)利要求10的方法，其中該等動物為豬。12.胞內(nèi)勞森菌抗原的用途，其用于制備接種年幼動物以對抗胞內(nèi)勞森菌感染或接種具有抗胞內(nèi)勞森菌抗體或暴露于抗胞內(nèi)勞森菌抗體的動物的藥劑，其中該等動物被接種有效劑量的該胞內(nèi)勞森菌抗原。13.權(quán)利要求12的用途，該等動物在1天大至9天大時接種。14.權(quán)利要求12或13的用途，該等動物在1天大至6天大時接種。15.權(quán)利要求12-14之一的用途，其中該等動物在天或2天大時接種。16.權(quán)利要求12-15之一的用途，其中該等動物具有或暴露于每毫升血清或流體至少1:4的可一企測的抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度。17.權(quán)利要求12-16之一的用途，其中該等動物具有或暴露于每毫升血清或流體至少1:64的可檢測的抗胞內(nèi)勞森菌抗體滴定度。18.權(quán)利要求12-17之一的用途，其中該胞內(nèi)勞森菌抗原是選自由活的經(jīng)修飾的胞內(nèi)勞森菌細菌、殺死的胞內(nèi)勞森菌細菌、或胞內(nèi)勞森菌細菌的一或多個亞單位組成的組。19.權(quán)利要求12-18之一的用途，其中該胞內(nèi)勞森菌抗原為活的經(jīng)修飾的胞內(nèi)勞森菌細菌。20.權(quán)利要求19的用途，其中該年幼動物是投予約3.0TCIDso至約6.0TCID5。的劑量的該活的經(jīng)修飾的胞內(nèi)勞森菌細菌。21.權(quán)利要求12-20之一的用途，其中該等動物為鳥、魚、及哺乳動物諸如牛、豬、馬及靈長類動物。22.權(quán)利要求21的用途，其中該等動物為豬。全文摘要本發(fā)明提供了對年幼動物進行免疫接種以抵抗胞內(nèi)勞森菌的方法，包括對該動物給予有效量的胞內(nèi)勞森菌抗原的步驟。本發(fā)明還提供了對具有抗胞內(nèi)勞森菌抗體或已暴露于抗胞內(nèi)勞森菌抗體的動物、尤其是年幼動物進行免疫接種的方法。尤其是，這些抗胞內(nèi)勞森菌抗體是來自母體的抗體。文檔編號A61K39/02GK101454020SQ200780019257公開日2009年6月10日申請日期2007年5月24日優(yōu)先權(quán)日2006年5月25日發(fā)明者杰里米·克羅爾申請人:貝林格爾·英格海姆維特梅迪卡有限公司