專利名稱：用于肽構(gòu)建體的氨基酸替代物的制作方法
背景技術(shù)：
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)對(duì)如下臨時(shí)專利申請(qǐng)的提交內(nèi)容要求優(yōu)先權(quán)和權(quán)益2006年3月30日提交的名為“線形利尿鈉肽構(gòu)建體”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/743,963、2006年3月30日提交的名為“具有輔基的線形利尿鈉肽構(gòu)建體”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/743,964、2006年3月30日提交的名為“環(huán)狀利尿鈉肽構(gòu)建體”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/743,960以及2006年3月30日提交的名為“具有輔基的環(huán)狀利尿鈉肽構(gòu)建體”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/743,961，并且所述各篇專利文獻(xiàn)的說(shuō)明書及權(quán)利要求書通過(guò)引用的方式并入本文。
在此與本申請(qǐng)共同提交兩件相關(guān)的申請(qǐng)，即名為“線形利尿鈉肽構(gòu)建體”的代理人案號(hào)0307-042-PCT的專利合作條約國(guó)際申請(qǐng)PCT/US07/65656和名為“環(huán)狀利尿鈉肽構(gòu)建體”的代理人案號(hào)0307-041-PCT的專利合作條約國(guó)際申請(qǐng)PCT/US07/65645，并且其說(shuō)明書和權(quán)利要求書通過(guò)引用的方式并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域(技術(shù)領(lǐng)域) 本發(fā)明涉及環(huán)約束性氨基酸替代物，用于合成環(huán)約束性氨基酸替代物的方法和使用環(huán)約束性氨基酸替代物的方法，包括在包含多個(gè)氨基酸殘基和一個(gè)或多個(gè)環(huán)約束性氨基酸替代物的線形或環(huán)狀構(gòu)建體或化合物中的用途。

背景技術(shù)：
氨基酸替代物。眾多不同的肽模擬物是已知的，并且用來(lái)產(chǎn)生肽的關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域的模擬物。通常見于Bioorqanic ChemistryPeptides andProteins.S.M.Hecht編輯，Oxford University Press，1998和尤其第12章相關(guān)內(nèi)容，第395-419頁(yè)，以及其中援引的參考文獻(xiàn)。肽和蛋白質(zhì)是高度柔性的，這主要因?yàn)閱蝹€(gè)氨基酸殘基的高度旋轉(zhuǎn)自由度。此外，單個(gè)氨基酸殘基側(cè)鏈中的某些鍵也具有旋轉(zhuǎn)自由度。氨基酸殘基之間的非鍵合性立體相互作用迫使肽或蛋白質(zhì)按照其自由度形成某種自由能最小的穩(wěn)定構(gòu)型。局部結(jié)構(gòu)(又稱作“二級(jí)結(jié)構(gòu)”)在肽和蛋白質(zhì)中常見。這些結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-彎曲、片、伸展鏈、環(huán)等，并且往往對(duì)肽及蛋白質(zhì)的結(jié)合和受體特異性有影響。存在幾種類型的已知α-螺旋，區(qū)別在于實(shí)際轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基內(nèi)部的扭角和分子內(nèi)及分子間氫鍵作用方式。還存在眾多已知的不同β-彎曲，區(qū)別在于二面扭角Ψ(對(duì)于Ca-C鍵而言)或Φ(對(duì)于Ca-N鍵)或在這兩者。使用肽模擬物來(lái)提供分子中限制構(gòu)象的組件，其部分目的是固定對(duì)于所需生物學(xué)反應(yīng)為最適的限制性構(gòu)型中的關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域。
一般，設(shè)計(jì)肽模擬物并意圖使其固定及模擬二肽或三肽的功能。例如、見美國(guó)專利7,008,941、6,943,157、6,413,963、6,184,223、6,013,458和5,929,237和美國(guó)公開專利申請(qǐng)2006/0084655中公開的逆轉(zhuǎn)角模擬物，其中全部所述文獻(xiàn)描述聲稱模擬了二肽或三肽序列的多樣雙環(huán)狀環(huán)結(jié)構(gòu)。其它申請(qǐng)公開了眾多不同的小分子化合物，這些申請(qǐng)也聲稱模擬了二肽或三肽序列。見例如美國(guó)公開專利申請(qǐng)2006/0234923和2003/0191049。
利尿鈉肽系統(tǒng)。氨基酸替代物的一項(xiàng)潛在應(yīng)用是使用從1984年鑒定人心房鈉尿肽(ANP)序列和基因結(jié)構(gòu)以來(lái)已經(jīng)深入探究的利尿鈉肽系統(tǒng)。ANP是利尿鈉肽系統(tǒng)的部分，其中所述的利尿鈉肽系統(tǒng)在人類中包括因翻譯后加工差異而產(chǎn)生ANP和尿舒張肽的ANP基因、產(chǎn)生BNP或腦鈉肽的基因以及產(chǎn)生CNP或c-型利尿鈉肽的基因。ANP、尿舒張肽、BNP和CNP分別是環(huán)結(jié)構(gòu)，具有由半胱氨酸-半胱氨酸二硫鍵形成的一個(gè)17氨基酸環(huán)。人ANP(hANP)的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)示于

圖1中。ANP、尿舒張肽、BNP和CNP是密切相關(guān)的，區(qū)別在于環(huán)內(nèi)某5個(gè)或6個(gè)氨基酸，盡管氨基端尾和羧基端尾基本上是不同的。
ANP、BNP和CNP分別針對(duì)不同的受體利尿鈉肽受體A、B和C(NPRA、NPRB和NPRC)具有特異性。NPRA和NPRB與鳥苷酸環(huán)化酶連接，而NPRC是連接G蛋白的清除受體。ANP、BNP和CNP是迄今已鑒定的主要內(nèi)源性哺乳動(dòng)物利尿鈉肽。然而，存在已經(jīng)鑒定并可以在哺乳動(dòng)物中具有治療性用途的眾多非哺乳動(dòng)物利尿鈉肽。這些非哺乳動(dòng)物利尿鈉肽包括鮭利尿鈉肽或心臟肽(sCP)、心室利尿鈉肽(VNP)(在鰻魚和多種魚中鑒定到的一種心利尿鈉肽)、樹眼鏡蛇利尿鈉肽(DNP)(在樹眼鏡蛇蛇毒中鑒定到的一種利尿鈉肽)和三種從太攀蛇蛇毒中分離的利尿鈉樣肽(TNP-a、TNP-b和TNP-c)。通常參見Tervonen V，Ruskoaho H，Lecklin T，Ilves M，VuolteenahoO.Salmon cardiac natriuretic peptide is a volume-regulating hormone.Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.283E353-61(2002)；Takei Y，F(xiàn)ukuzawa A，ltaharaY，Watanabe TX，Yoshizawa Kumagaye K，Nakajima K，Yasuda A，Smith MP，Duff DW，Olson KR.A new natriuretic peptide isolated from cardiac atria oftrout，Oncorhynchus mykiss.FEBS Lett.414377-80(1997)；Schweitz H，VigneP，Moinier D，F(xiàn)relin C，Lazdunski M.A new member of the natriuretic peptidefamily is present in the venom of the green mamba(Dendroaspis angusticeps).J.Biol.Chem.26713928-32(1992)；Lisy O，Jougasaki M，Heublein DM，SchirgerJA，Chen HH，Wennberg PW，Burnett JC.Renal actions of syntheticdendroaspis natriuretic peptide.Kidney Int.56502-8(1999)和Fry BG，Wickramaratana JC，Lemme S，Beuve A，Garbers D，Hodgson WC，Alewood P.Novel natriuretic peptides from the venom of the inland(Oxyuranusmicrolepidotus)isolation，Chemical and biological characterization.Biochem.Biophys.Res.Comm.327101 1-1015(2005)。
ANP主要在應(yīng)答增加的心房壓時(shí)內(nèi)源性地分泌，但是其它因素(包括細(xì)胞因子受體刺激)可以促進(jìn)內(nèi)源性分泌。一旦釋放，則ANP是血壓、鈉和流體穩(wěn)態(tài)的激素性調(diào)節(jié)物，提供血管舒張效應(yīng)、影響心血管重塑等。因此，ANP(包括內(nèi)源性ANP)有效用于充血性心力衰竭和其它心血管病中，其部分原因在于提供針對(duì)慢性活化的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的防御。循環(huán)性ANP通過(guò)兩種機(jī)制即與利尿鈉肽受體結(jié)合和酶降解而從循環(huán)中迅速除去。
人ANP也稱作野生型人ANP、hANP、ANP(1-28)和ANP(99-126)(后者指前ANP(1-126)中的相關(guān)序列，其中所述的前ANP通常在分泌期間在羧基端區(qū)域內(nèi)在Arg98-Ser99處被切割)。下文中，人ANP有時(shí)候稱作“hANP”。
通常，認(rèn)為利尿鈉肽及其變體用于治療充血性心力衰竭、腎性高血壓、急性腎衰竭及相關(guān)病癥以及利尿反應(yīng)、促鈉尿排泄反應(yīng)和/或血管擴(kuò)張反應(yīng)將對(duì)其有治療或預(yù)防效果的任何病癥、疾病或綜合征中。一篇描述利尿鈉肽(包括ANP)及利尿鈉肽系統(tǒng)在心力衰竭中用途的綜述是Schmitt M.，Cockcroft J.R.和Frenneaux M.P.Modulation of the natriuretic peptide systemin heart failurefrom bench to bedside？Clinical Science 105141-160(2003)。
已經(jīng)產(chǎn)生為數(shù)眾多的ANP模擬物和變體，其中一些模擬物和變體在尺寸上比ANP大幅度縮小。一種尺寸上縮小但仍有生物學(xué)活性的ANP形式是如Li B，Tom JY，Oare D，Yen R，F(xiàn)airbrother WJ，Wells JA，Cunningham BC.Minimization of a polypeptide hormone.Science 2701657-60(1995)中所述的15聚二硫化環(huán)狀肽H-Met-環(huán)(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ ID NO1)。這種15聚肽常稱作“mini-ANP”。
發(fā)明簡(jiǎn)述 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供通式I的環(huán)約束性氨基酸替代物
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽，其中 R1是H、烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
R2是H或烷基，前提是R1和R2不都是H； R3是H或第一氮保護(hù)基團(tuán)； R4是H、烷基、(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2； R5是H或烷基； R6a是H、烷基、(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2； R6b是H或烷基； 前提是R4和R6a不均是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2； R7是H、C(＝O)烷基、C(＝O)(CH2)m(NR8)2、烷基、芳烷基或芳基； R8的每個(gè)存在獨(dú)立地是H、芳基或烷基； R11是肽固體支持物； R12是H或第二氮保護(hù)基團(tuán)； m的每個(gè)具體值是具有0與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)； q的每個(gè)具體值是具有1與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)； p是具有1與10之間的值的整數(shù)；并且 y是0或1。
在通式I的替代物的一個(gè)方面，y是1。在另一方面，y是0。
在通式I的替代物的一個(gè)方面，R4是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11，并且R6a是H或烷基。
在通式I的替代物的一個(gè)方面，R6a是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11，并且R4是H或烷基。
在通式I的替代物的一個(gè)方面，R3是下式的基團(tuán)
并且R9是叔丁基、烯丙基或下式的基團(tuán)
在通式I的替代物的一個(gè)方面，R1是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
并且R12是H或三苯亞甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺酰基、甲?；⑾趸蚱S氧羰基，并且n是具有2與6之間的值的整數(shù)。
在通式I的替代物的一個(gè)方面，提供具有下式的化合物
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽，其中 R6a是H或烷基；并且 R9是叔丁基、烯丙基或下式的基團(tuán)
在前式中，R1可以是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
其中R12是H或三苯亞甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺?；?、甲?；⑾趸蚱S氧羰基，并且n是具有2與6之間的值的整數(shù)。R7可以是H。R4可以是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)N(R8)2、(CH2)mC(＝O)NR11或(CH2)mC(＝O)OR11。
在通式I的替代物的一個(gè)方面，提供具有下式的化合物
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽，其中 R1是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
其中R4是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2；R6a是H或烷基；并且n是具有2與6之間的值的整數(shù)。
在前式中，R1可以是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
其中R12是H或三苯亞甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺?；?、甲酰基、硝基或芐氧羰基，并且n是具有2與6之間的值的整數(shù)。R7可以是H。R4可以是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)N(R8)2、(CH2)mC(＝O)NR11或(CH2)mC(＝O)OR11。
在通式I的替代物的一個(gè)方面，提供具有下式的化合物
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽，其中 R1是烷基-N(R8)2、(CH2)nOR8、(CH2)nC(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
R4是H或烷基； R6a是H或烷基；并且 n是具有2與6之間的值的整數(shù)。
在前式中，R3可以是下式的基團(tuán)
并且R9可以是叔丁基、烯丙基或下式的基團(tuán)
R1可以是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
其中R12是H或甲苯磺?；?、甲?；?、硝基或芐氧羰基，并且n是具有2與6之間的值的整數(shù)。R7可以是H。
在通式I的替代物的一個(gè)方面，提供具有下式的化合物
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽，其中 R1是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
R4是H或烷基；并且 R6a是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2。
在前式中，R3可以是下式的基團(tuán)
并且R9可以是叔丁基、烯丙基或下式的基團(tuán)
在前式中，R1可以是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
其中R12是H或三苯亞甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺酰基、甲酰基、硝基或芐氧羰基。R6a可以是(CCH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)N(R8)2、(CH2)mC(＝O)NR11或(CH2)mC(＝O)OR11。R7可以是H。
在通式I的替代物的一個(gè)方面，提供具有下式的化合物
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽，其中 R4是H或烷基；并且 R9是叔丁基、烯丙基或下式的基團(tuán)
在前式中，R1可以是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
其中R12是H或三苯亞甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺?；⒓柞；?、硝基或芐氧羰基，并且n是具有2與6之間的值的整數(shù)。R7可以是H。
R4可以是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)N(R8)2、(CH2)mC(＝O)NR11或(CH2)mC(＝O)OR11。
在通式I的替代物的一個(gè)方面，提供具有下式的化合物
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽，其中 R1和R2是獨(dú)立烷基。
在前式中，R3可以是下式的基團(tuán)
其中R9是叔丁基、烯丙基或下式的基團(tuán)
R4可以是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11或(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2，并且R6a是H或烷基。R6a可以是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2，并且R4是H或烷基。R7可以是H。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供合成包含下式基團(tuán)的肽的方法

或
所述方法包括使具有結(jié)構(gòu)式I的化合物
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其可用鹽與N-保護(hù)的氨基酸反應(yīng)的步驟， 其中 R1是H、烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
R2是H或烷基，前提是R1和R2不都是H； R3是H或第一氮保護(hù)基團(tuán)； R4是H、烷基、(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2； R5是H或烷基； R6a是H、烷基、(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2； R6b是H或烷基； 前提是R4和R6a不均是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2； R7是H、C(＝O)烷基、C(＝O)(CH2)m(NR8)2、烷基、芳烷基或芳基； R8的每次出現(xiàn)獨(dú)立地是H、芳基或烷基； R11是肽固體支持物； R12是H或第二氮保護(hù)基團(tuán)； m的每個(gè)具體值是具有0與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)； q的每個(gè)具體值是具有1與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)； p是具有1與10之間的值的整數(shù)；并且 y是0或1。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含多個(gè)氨基酸殘基和至少一個(gè)下式的基團(tuán)的化合物

或
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體，其中 R1是H、烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
R2是H或烷基，前提是R1和R2不都是H； R3是H或第一氮保護(hù)基團(tuán)； R4是H、烷基、(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2； R5是H或烷基； R6a是H、烷基、(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2； R6b是H或烷基； 前提是R4和R6a不均是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2； R7是H、C(＝O)烷基、C(＝O)(CH2)m(NR8)2、烷基、芳烷基或芳基； R8的每次出現(xiàn)獨(dú)立地是H、芳基或烷基； R11是肽固體支持物； R12是H或第二氮保護(hù)基團(tuán)； m的每個(gè)具體值是具有0與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)； q的每個(gè)具體值是具有1與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)； p是具有1與10之間的值的整數(shù)；并且 y是0或1。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，可以在本發(fā)明的化合物中使用一個(gè)氨基酸替代物，可以在本發(fā)明的化合物中使用二個(gè)氨基酸替代物，或可以在本發(fā)明的化合物中使用多于兩個(gè)氨基酸替代物。
在本發(fā)明的另一方面，提供包括其中氨基酸殘基之間一個(gè)或多個(gè)肽鍵由非肽鍵取代的氨基酸替代物的化合物。
在本發(fā)明的另一方面，提供包含至少一個(gè)氨基酸替代物和多個(gè)氨基酸殘基的化合物，其中所述化合物是這樣的環(huán)狀化合物，其通過(guò)兩個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈之間、氨基酸殘基側(cè)鏈與氨基酸替代物的基團(tuán)之間、兩個(gè)氨基酸替代物的基團(tuán)之間、該化合物的端基與氨基酸殘基側(cè)鏈之間、或該化合物的端基與氨基酸替代物的基團(tuán)之間的鍵環(huán)化。
式I的環(huán)約束性氨基酸替代物可以用來(lái)合成這樣的化合物，其中相對(duì)于不包含本發(fā)明氨基酸替代物的對(duì)應(yīng)氨基酸序列，該化合物在施用至哺乳動(dòng)物時(shí)顯示一個(gè)或多個(gè)優(yōu)勢(shì)，所述的優(yōu)勢(shì)選自增加的抗酶降解性、增加的循環(huán)半壽期、增加的生物利用度、增加的效力、延長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間及其前述組合。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可以通過(guò)置換原始多肽(parent peptide)的氨基酸殘基方式使用的式I的環(huán)約束性氨基酸替代物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用來(lái)合成化合物的式I的環(huán)約束性氨基酸替代物，其中所述的化合物具有由Ki(nM)值確定的平衡受體結(jié)合親和力，其小于不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列的Ki(nM)值。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用來(lái)合成化合物的式I環(huán)約束性氨基酸替代物，其中所述的化合物具有針對(duì)利尿鈉肽受體的受體結(jié)合親和力，其大于不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列的受體結(jié)合親和力。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用來(lái)合成化合物的式I環(huán)約束性氨基酸替代物，其中所述的化合物具有與至少相同劑量的不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列同樣有效或較之更有效的生物學(xué)效力。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用來(lái)合成化合物的式I環(huán)約束性氨基酸替代物，其中所述的化合物具有比相同劑量的不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列更有效的生物學(xué)效力。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用來(lái)合成化合物的式I環(huán)約束性氨基酸替代物，其中不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列具有與原始多肽序列的至少約60％的同源性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用來(lái)合成化合物的式I環(huán)約束性氨基酸替代物，其中不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列具有與原始多肽序列的至少約80％的同源性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用來(lái)合成化合物的式I環(huán)約束性氨基酸替代物，其中不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列具有與肽序列的至少約60％的同源性，其中所述的肽與ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-b或TNP-c的受體結(jié)合。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用來(lái)合成利尿鈉肽受體特異性化合物的式I環(huán)約束性氨基酸替代物，其中不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列具有與肽序列的至少約80％的同源性，其中所述的肽與ANP、BNP、CNP、sCP、DNP、TNP-a、TNP-b或TNP-c的受體結(jié)合。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用來(lái)合成包括如本文中所定義替代物的化合物的式I環(huán)約束性氨基酸替代物，其中不包含氨基酸替代物的相應(yīng)氨基酸序列是與已知受體結(jié)合的原始多肽。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用來(lái)合成化合物的式I環(huán)約束性氨基酸替代物，其中所述的化合物比原始多肽的天然形式或重組形式具有更大的生物利用度和半壽期。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用來(lái)合成化合物的式I環(huán)約束性氨基酸替代物，其中所述的化合物具有增加的抗降解性，但具有對(duì)其受體顯著高的結(jié)合親和力。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用來(lái)合成在持續(xù)釋放制劑中的化合物的式I環(huán)約束性氨基酸替代物。
本發(fā)明的其它目的、優(yōu)勢(shì)和新特性和可用性的其它范圍將部分地在以下詳細(xì)敘述中描述并且部分地在檢驗(yàn)下文時(shí)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言變得顯而易見，或可以通過(guò)實(shí)施本發(fā)明而習(xí)得。本發(fā)明的目的和優(yōu)勢(shì)可以通過(guò)所附權(quán)利要求書中具體指出的手段和組合而實(shí)現(xiàn)和達(dá)到。
發(fā)明詳述 1.定義 “烷基” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“烷基”意指飽和、單價(jià)、非分支或分支的烴鏈。烷基的實(shí)例包括，但不限于(C1-C6)烷基，如甲基、乙基、丙基、異丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2，2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2，2-二甲基-1-丁基、3，3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基和己基，以及更長(zhǎng)的烷基，如庚基和辛基。烷基可以是非取代的或任選地由一種或兩種合適的取代基取代。
“脂族” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“脂族”包括帶烴鏈的化合物，例如烷、烯、炔及其衍生物。
“Ω氨基脂族基團(tuán)”包括帶末端氨基的脂族部分。Ω氨基脂族基團(tuán)的實(shí)例包括7′-氨基-庚?；约傍B氨酸和賴氨酸的氨基酸側(cè)鏈部分。
“鏈烯基” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”意指其中具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵的單價(jià)、非分支或分支的烴鏈。鏈烯基的雙鍵可以不綴合或綴合至另一種不飽和基團(tuán)。合適的鏈烯基包括，但不限于(C2-C6)鏈烯基，如乙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基、2-乙基己烯基、2-丙基-2-丁烯基、4-(2-甲基-3-丁烯)-戊烯基。鏈烯基可以是非取代的或任選地由一種或兩種合適的取代基取代。
“炔基” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“炔基”意指其中具有一個(gè)或多個(gè)叄鍵的單價(jià)、非分支或分支的烴鏈。炔基的叄鍵可以不綴合或綴合至另一種不飽和基團(tuán)。合適的炔基包括，但不限于(C2-C6)炔基，如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、甲基丙炔基、4-甲基-1-丁炔基、4-丙基-2-戊炔基和4-丁基-2-己炔基。炔基可以是非取代的或任選地由一種或兩種合適的取代基取代。
“芳烷基” 術(shù)語(yǔ)“芳烷基”包括基團(tuán)-RaRb，其中Ra是鏈烯基(二價(jià)烴基)，并且Rb是如上所定義的芳基。芳烷基的實(shí)例包括芐基、苯乙基、3-(3-氯苯基)-2-甲基戊基等。
“芳基” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“芳基”意指包含碳原子和氫原子的單環(huán)或多環(huán)狀芳基。合適芳基的實(shí)例包括，但不限于苯基、甲苯基、蒽基(anthacenyl)、芴基、茚基、薁基(azulenyl)、萘基、1-萘基、2-萘基和聯(lián)苯基以及苯并稠合碳環(huán)部分如5，6，7，8-四氫萘基。芳基可以是非取代的或任選地由一種或兩種如下文所定義的合適取代基取代。芳基任選地可以與環(huán)烷基稠合、與另一種芳基稠合、與雜芳基稠合或與雜環(huán)烷基稠合。優(yōu)選的芳基包括但不限于6-12環(huán)原子的單環(huán)或雙環(huán)狀芳烴基，并且任選地用選自烷基、鹵烷基、環(huán)烷基、烷氧基、烷基硫代、鹵代、硝基、?；?、氰基、氨基、單取代氨基、雙取代氨基、羥基、羧基或烷氧羰基的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代。
在一個(gè)實(shí)施方案中，苯基是優(yōu)選的芳基，其在獨(dú)立地被“取代”時(shí)，包含直接連接或通過(guò)醚鍵連接的羥基、鹵素、烷基或芳基。在苯基環(huán)被如此取代的情況下，該氨基酸殘基可以稱作取代的，如在取代的Phe、取代的HPhe或取代的Pgl中那樣。
“雜芳基” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“雜芳基”意指單環(huán)或多環(huán)狀芳環(huán)，其包含碳原子、氫原子和一個(gè)或多個(gè)雜原子，優(yōu)選1-4個(gè)雜原子，所述雜原子獨(dú)立地選自氮、氧和硫。雜芳基的說(shuō)明性實(shí)例包括，但不限于吡啶基、吡嗪基、吡唑基、吲哚基、三嗪基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、(1，2，3)-三唑基、(1，2，4)-三唑基、吡嗪基、嘧啶基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噻唑基、噻二唑基、呋喃基、苯基、異噁唑基、噁唑基、吡唑基、四唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、異噁唑基、三嗪基和吡嗪基。雙環(huán)狀雜芳環(huán)包括，但不限于苯并噻二唑基、吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并異噁唑基、苯并噻唑基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噁唑基、異喹啉基、嘌呤基(purinyl)、呋喃并吡啶基(furopyridinyl)和噻吩并吡啶基。雜芳基可以是非取代的或任選地由一種或兩種如下文所定義的合適取代基取代。雜芳基任選地可以與另一種雜芳基稠合、與芳基稠合、與環(huán)烷基稠合或與雜環(huán)烷基稠合。
“環(huán)烷基” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”意指包含碳原子和氫原子并且沒有碳-碳多鍵的單環(huán)或多環(huán)狀飽和環(huán)。環(huán)烷基的實(shí)例包括，但不限于(C3-C7)環(huán)烷基，如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基，以及飽和環(huán)狀和雙環(huán)狀萜。環(huán)烷基可以是非取代的或任選地由一種或兩種如下文所定義的合適取代基取代。環(huán)烷基任選地可以與另一種環(huán)烷基稠合、與芳基稠合、與雜芳基稠合或與雜環(huán)烷基稠合， “雜環(huán)烷基” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)烷基”意指單環(huán)或多環(huán)狀環(huán)，其包含碳原子和氫原子以及至少一個(gè)雜原子，優(yōu)選1—3個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子。雜環(huán)烷基可以與芳基或雜芳基稠合。雜環(huán)烷基的實(shí)例包括，但不限于吡咯烷基、吡咯烷代(pyrrolidino)、哌啶基、哌啶子基(piperidino)、哌嗪基、哌嗪代(piperazino)、嗎啉基、嗎啉代、硫嗎啉基(thiomorpholinyl)、硫嗎啉代(thiomorpholino)和吡喃基。雜環(huán)芳基可以是非取代的或任選地由一種或兩種如下文所定義的合適取代基取代。雜環(huán)芳基任選地可以與環(huán)烷基稠合、與芳基稠合、與雜芳基稠合或與另一雜環(huán)烷基稠合。
例如，雜環(huán)芳基可以與芳基或雜芳基稠合或以之取代，所述的芳基或雜芳基例如是，但不限于1，2，3，4四氫異喹啉基和1，2，3，4-四氫喹啉基、四氫萘啶基(naphthyridinyl)、苯基哌啶基(phenylpiperidinyl)和哌啶基吡啶基(piperidinyl pyridinyl)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜環(huán)烷基是單環(huán)或雙環(huán)狀環(huán)，更優(yōu)選單環(huán)狀環(huán)，其中所述的環(huán)包含3-6個(gè)碳原子和1-3個(gè)雜原子，在本文中稱作(C3-C6)雜環(huán)烷基。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雜環(huán)芳基與芳基或雜芳基稠合或以之取代。
“雜環(huán)基”或“雜環(huán)狀環(huán)” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基”或“雜環(huán)狀環(huán)”意指雜環(huán)烷基或雜芳基。
“環(huán)狀基” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“環(huán)狀基”意指芳基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基或雜芳基。
“烷氧基” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“烷氧基”意指-O-烷基，其中烷基是如上所定義的。烷氧基可以是非取代的或任選地由一種或兩種合適的取代基取代。優(yōu)選地，烷氧基中烷基鏈的長(zhǎng)度是1-6個(gè)碳原子，在本文中稱作“(C1-C6)烷氧基”。
“芳氧基” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“芳氧基”意指-O-芳基，其中芳基是如上所定義的。芳氧基可以是非取代的或任選地由一種或兩種合適的取代基取代。優(yōu)選地，芳氧基的芳基環(huán)是單環(huán)狀環(huán)，其該環(huán)包含6個(gè)碳原子，在本文中稱作“(C6)芳氧基。
“烷氧羰基” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“烷氧羰基”意指式-C(＝O)-烷氧基的單價(jià)基團(tuán)。優(yōu)選地，烷氧羰基中烴鏈的長(zhǎng)度是1-8個(gè)碳原子，在本文中稱作“低級(jí)烷氧羰基”。
“氨基甲酰基” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“氨基甲?；币庵冈訄F(tuán)-C(＝O)N(R′)2，其中R′選自氫、烷基和芳基。
“羰基” 如本文中所用，“羰基”是式C(＝O)的二價(jià)基團(tuán)。
“氧代” 如本文中所用，“氧代”基團(tuán)是式(＝O)的基團(tuán)。
“?；? 術(shù)語(yǔ)“酰基”包括基團(tuán)R-C(＝O)-，其中R是有機(jī)基團(tuán)。實(shí)例是乙?；鵆H3-C(＝O)-，在本文中稱作“Ac”。
當(dāng)如上所定義的芳基、烷基或取代烷基經(jīng)一個(gè)或多個(gè)羰基{-(C＝O)-}連接時(shí)，肽或脂族部分是“?；钡?。肽最常見在氨基端處?；?。
“酰胺” “酰胺”包括連接至羰基的三價(jià)氮的化合物(-C(＝O)-NH2)，例如甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺等。
“酰亞胺” “酰亞胺”包括含有亞胺基(-C(＝O)-NH-C(＝O)-)的化合物。
“胺” “胺”包括含有氨基(-NH2)的化合物。
“腈” “腈”包括作為羧酸衍生物并含有與有機(jī)基團(tuán)結(jié)合的(-CN)基的化合物。
“鹵素” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“鹵素”意指氟、氯、溴或碘。因此，術(shù)語(yǔ)“鹵代”和“Hal”的意思包括氟代、氯代、溴代和碘代。
“肽固體支持物” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“肽固體支持物”意指(一般通過(guò)接頭)攜帶反應(yīng)基(游離羥基或氨基)的用于肽合成中的合成聚合物，其中所述的反應(yīng)基可以與N-保護(hù)的氨基酸官能團(tuán)或式I替代物的羧基反應(yīng)，因而將該氨基酸或式I替代物共價(jià)地結(jié)合至該聚合物上。在肽合成結(jié)束時(shí)，可以化學(xué)地切開羧基端氨基酸或替代物與該聚合物支持物之間的鍵。包含一個(gè)或多個(gè)式I替代物的肽或化合物隨后進(jìn)入溶液并可以從溶液中分離。肽固體支持物的實(shí)例包括，但不限于具有用于固相合成的合適接頭的聚酰胺樹脂和聚苯乙烯樹脂。樹脂的實(shí)例包括Merrifield樹脂、BHA樹脂、MBHA樹脂、Wang樹脂、肟樹脂等?？梢允褂玫慕宇^包括Fmoc-Rink、Sieber接頭、Weinreb接頭等。
“氮保護(hù)基團(tuán)” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“氮保護(hù)基團(tuán)”意指替換氨基氫、旨在防止反應(yīng)工序期間(例如，在肽合成期間)副反應(yīng)及降解的替換基團(tuán)。固相肽合成包括一系列反應(yīng)循環(huán)，包括偶聯(lián)N-保護(hù)的氨基酸或替代物的羧基與肽底物的氨基，隨后化學(xué)切除氮保護(hù)基團(tuán)以至可以偶聯(lián)下一個(gè)氨基受保護(hù)的合成元。用于本發(fā)明中的氮保護(hù)基團(tuán)包括在固相肽合成中眾所周知的氮保護(hù)基團(tuán)，包括但不限于t-Boc(叔丁氧羰基)、Fmoc(9-芴甲氧羰基)、2-氯芐氧羰基、烯丙氧羰基(alloc)、芐氧羰基、2-(4-聯(lián)苯基)丙基-2-氧羰基(Bpoc)、1-金剛烷氧羰基、三苯甲基(三苯甲基)和甲苯磺?；?。
“合適的取代基” 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“合適的取代基”意指不致使本發(fā)明化合物或用于制備本發(fā)明化合物的中間體的合成用途、治療用途或藥學(xué)用途失效的基團(tuán)。合適的取代基的實(shí)例包括，但不限于烷基；鏈烯基；炔基；芳基；雜芳基；雜環(huán)烷基；環(huán)烷基；O-烷基；O-鏈烯基；O-炔基；O-芳基；CN；OH；氧代；鹵代；C(＝O)OH；C(＝O)鹵代；OC(＝O)鹵代；CF3；N3；NO2；NH2；NH(烷基)；N(烷基)2；NH(芳基)；N(芳基)2；C(＝O)NH2；C(＝O)NH(烷基)；C(＝O)N(烷基)2；C(＝O)NH(芳基)；C(＝O)N(芳基)2；OC(＝O)NH2；C(＝O)NH(雜芳基)；C(＝O)N(雜芳基)2；NHOH；NOH(烷基)；NOH(芳基)；OC(＝O)NH(烷基)；OC(＝O)N(烷基)2；OC(＝O)NH(芳基)；OC(＝O)N(芳基)2；CHO；C(＝O)(烷基)；C(＝O)(芳基)；C(＝O)O(烷基)；C(＝O)O(芳基)；OC(＝O)(烷基)；OC(＝O)(芳基)；OC(＝O)O(烷基)；OC(＝O)O(芳基)；S-烷基；S-鏈烯基；S-炔基；SC(＝O)2-芳基；SC(＝O)2-烷基；SC(＝O)2-鏈烯基；SC(＝O)2-炔基和SC(＝O)2-芳基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于本發(fā)明化合物的合成法、穩(wěn)定性和藥理學(xué)活性而容易地選擇合適的取代基。

如本文中所用，在化學(xué)結(jié)構(gòu)圖中，以上的“波浪線”標(biāo)示在該點(diǎn)上一個(gè)化學(xué)基團(tuán)與另一個(gè)化學(xué)基團(tuán)連接的鍵。因此，根據(jù)該定義，以下化學(xué)式“A”
其中R′是式“B”的基團(tuán)
代表以下化合物
“組合物” 術(shù)語(yǔ)“組合物”，如在藥物組合物中，意圖包括包含活性成分和充當(dāng)載體的惰性成分的產(chǎn)物，以及直接或間接地因任意兩種或多種成分的組合、復(fù)合或聚集、因一種或多種成分的解離或因一種或多種成分的其它類型反應(yīng)或相互作用而產(chǎn)生的任何產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的藥物組合物包括通過(guò)將本發(fā)明化合物與可藥用載體混合而產(chǎn)生的任何組合物。
“EC50” 術(shù)語(yǔ)“EC50”意圖包括激動(dòng)劑的如此摩爾濃度，其產(chǎn)生針對(duì)該激動(dòng)劑的50％最大可能反應(yīng)。例如，構(gòu)建體在濃度72nM上產(chǎn)生如cGMP測(cè)定法中所測(cè)定的針對(duì)該構(gòu)建體的50％最大可能反應(yīng)，則該構(gòu)建體具有72nM的EC50。除非另外說(shuō)明，與EC50測(cè)定有關(guān)的摩爾濃度以納摩爾(nM)為單位。
“Ki(nM)” 術(shù)語(yǔ)“Ki(nM)”意圖包括受體平衡結(jié)合親和力，其代表平衡時(shí)在競(jìng)爭(zhēng)劑不存在下與半數(shù)的受體結(jié)合部位相結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性化合物的摩爾濃度。通常，Ki與化合物對(duì)受體的親和力成反比，以至于當(dāng)Ki低時(shí)，則親和力高。Ki可以使用Cheng和Prusoff等式(Cheng Y.，Prusoff W.H.，Biochem.Pharmacol.223099-3108，1973)測(cè)定
其中“配體”是配體的濃度，其中配體可以是放射性配體，并且Kd是引起50％受體占據(jù)的受體親和力的倒數(shù)量值。除非另外說(shuō)明，與Ki測(cè)定有關(guān)的摩爾濃度是nM。
“肽” 術(shù)語(yǔ)“肽”如本說(shuō)明書及權(quán)利要求書通篇范圍中所用，意圖包括由兩個(gè)或多個(gè)氨基酸(包括氨基酸的化學(xué)變型和衍生物)構(gòu)成的任何結(jié)構(gòu)。形成肽的全部或部分氨基酸可以是天然存在的氨基酸、此類氨基酸的立體異構(gòu)體和變型、非蛋白質(zhì)氨基酸、翻譯后修飾的氨基酸、酶修飾的氨基酸等。術(shù)語(yǔ)“肽”也包括肽的二聚體或多聚體?！爸圃斓摹彪陌ㄍㄟ^(guò)化學(xué)合成法、重組DNA技術(shù)、較大分子的生物化學(xué)片段化法或酶的片段化法、前述方法組合所產(chǎn)生的肽，或通常由任何其它方法制造的肽。
“氨基酸側(cè)鏈部分” 用于本發(fā)明中(包括如用于說(shuō)明書和權(quán)利要求書中)的術(shù)語(yǔ)“氨基酸側(cè)鏈部分”包括如本文中術(shù)語(yǔ)“氨基酸”所定義的任何氨基酸的任何側(cè)鏈。該術(shù)語(yǔ)因此包括在天然存在氨基酸中出現(xiàn)的側(cè)鏈部分。它還包括在修飾的天然存在氨基酸(如糖基化氨基酸)中的側(cè)鏈部分。它還包括在天然存在的蛋白質(zhì)氨基酸的立體異構(gòu)體和變型、非蛋白質(zhì)氨基酸、翻譯后修飾的氨基酸、酶合成的氨基酸、衍生化氨基酸、設(shè)計(jì)來(lái)模擬氨基酸的構(gòu)建體或結(jié)構(gòu)等中的側(cè)鏈部分。例如，在該定義的范圍內(nèi)包括本文中公開的任何氨基酸的側(cè)鏈部分。在氨基酸側(cè)鏈部分的定義范圍內(nèi)包括如本文以下所定義的“氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物”。
“氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物” “氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物”是針對(duì)任何氨基酸側(cè)鏈部分的修飾或在其中的變異，包括針對(duì)天然存在的或非天然的氨基酸側(cè)鏈部分的修飾或在其中的變異，其中所述的修飾或變異包括(a)向現(xiàn)有的烷基、芳基或芳烷基鏈添加一個(gè)或多個(gè)飽和或不飽和碳原子；(b)用另一種原子，優(yōu)選用氧或氮取代側(cè)鏈中的碳；(c)向側(cè)鏈的碳原子添加端基，所述的端基包括甲基(-CH3)、甲氧基(-OCH3)、硝基(-NO2)、羥基(-OH)或氰基(-C≡N)；(d)對(duì)于包括羥基、硫氫基或氨基的側(cè)鏈部分，添加合適的羥基、硫氫基或氨基保護(hù)基團(tuán)；或(e)對(duì)于包括環(huán)結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈部分，添加一個(gè)取代基或環(huán)狀取代基，包括直接連接或通過(guò)醚鍵連接的羥基、鹵素、烷基或芳基。對(duì)于氨基，合適的氨基保護(hù)基團(tuán)包括但不限于Z、Fmoc、Boc、Pbf、Pmc等。
“氨基酸” 在本發(fā)明實(shí)施方案中所用的“氨基酸”和如用于說(shuō)明書和權(quán)利要求書中的此術(shù)語(yǔ)包括已知的天然存在的蛋白質(zhì)氨基酸，所述氨基酸由其常用的三字母縮寫和單字母縮寫提及。通常參見Synthetic PeptidesA User’s Guide，編者G.A.Grant，W.H.Freeman & Co.，New York(1992)，其教導(dǎo)通過(guò)引用的方式并入本文中，包括在第11至24頁(yè)中所述的文本內(nèi)容及表格。“氨基酸”包括常規(guī)的α-氨基酸，并且還包括其中至少一個(gè)側(cè)鏈?zhǔn)侨绫疚闹兴x的氨基酸側(cè)鏈部分的β-氨基酸、α，α-雙取代氨基酸和N-取代氨基酸?！鞍被帷边€包括N-烷基α-氨基酸，其中氨基端氨基具有C1-C6直鏈或支鏈的烷基取代基。因此可以看出術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括天然存在的蛋白質(zhì)氨基酸的立體異構(gòu)體和變型、非蛋白質(zhì)氨基酸、翻譯后修飾的氨基酸、酶合成的氨基酸、衍生化氨基酸、為模擬氨基酸所設(shè)計(jì)的構(gòu)建體或結(jié)構(gòu)等。修飾及非天然氨基酸通常在上文援引的Synthetic PeptidesA User’s Guide；Hruby V.J.，Al-obeidi F.，Kazmierski W.，Biochem.J.268249-262(1990)；和Toniolo C，Int.J.Peptide Protein Res.35287-300(1990)中描述；全部文獻(xiàn)的教導(dǎo)通過(guò)引用的方式并入本文中。此外，下列縮寫(包括氨基酸及其保護(hù)基團(tuán)和修飾基團(tuán))具有給出的意思 Abu — γ-氨基丁酸 12-Ado— 12-氨基十二烷酸 Aib — α-氨基異丁酸 6-Ahx — 6-氨基己酸 Amc — 4-(氨甲基)-環(huán)己烷羧酸 8-Aoc — 8-氨基辛酸 Bip — 聯(lián)苯胺 Boc — 叔丁氧羰基 Bzl — 芐基 Bz— 苯甲酰 Dab — 二氨基丁酸 Dap — 二氨基丙酸 Dip — 3，3-二苯基丙氨酸 Disc — 1，3-二氫-2H-異吲哚羧酸 Et— 乙基 Fmoc — 芴甲氧羰基 Hept — 庚?；?CH3-(CH2)5-C(＝O)-) Hex — 己?；?CH3-(CH2)4-C(＝O)-) HArg — 高精氨酸 HCys — 高半胱氨酸 HLys — 高賴氨酸 HPhe — 高苯丙氨酸 HSer — 高絲氨酸 Me— 甲基 Met(O)— 甲硫氨酸亞砜 Met(O2) — 甲硫氨酸砜 Nva — 正纈氨酸 Pgl — 苯基甘氨酸 Pr— 丙基 Pr-i — 異丙基 Sar — 肌氨酸 Tle — 叔丁基丙氨酸 Z — 芐氧羰基 在本發(fā)明化合物的列表中，常規(guī)氨基酸殘基具有如《專利審查程序手冊(cè)》第8版第2400章中給出的常規(guī)含義。因此，“Nle”是正亮氨酸；“Asp”是天冬氨酸；“His”是組氨酸；“Arg”是精氨酸；“Trp”是色氨酸；“Lys”是賴氨酸；“Gly”是甘氨酸；“Pro”是脯氨酸；“Tyr”是酪氨酸；“Ser”是絲氨酸等。全部殘基處于L-異構(gòu)體構(gòu)型，除非指明D-異構(gòu)體，如“D-Ala”表示D-丙氨酸。
單個(gè)氨基酸，包括天然存在的蛋白質(zhì)氨基酸的立體異構(gòu)體和變型、非蛋白質(zhì)氨基酸、翻譯后修飾的氨基酸、酶合成的氨基酸、衍生化氨基酸、從任何前述項(xiàng)衍生的α，α-雙取代氨基酸(即這樣的α，α-雙取代氨基酸，其中至少一個(gè)側(cè)鏈與從中衍生該α，α-雙取代氨基酸的殘基的側(cè)鏈相同)、從任何前述項(xiàng)衍生的β-氨基酸(即這樣的β-氨基酸，其除存在β-碳之外與從中衍生所述β-氨基酸的殘基相同)和包括前述各項(xiàng)的其它情況，有時(shí)在本文中稱作“殘基” “α，α-雙取代氨基酸” “α，α-雙取代氨基酸”包括在α-位置中具有其它取代基的任何α-氨基酸，其中所述的取代基可以與α-氨基酸的側(cè)鏈部分相同或相異。除了α-氨基酸的側(cè)鏈部分之外，合適的取代基還包括C1-C6直鏈或支鏈的烷基。Aib是α，α-雙取代氨基酸的實(shí)例。在可以使用常規(guī)的L-和D-異構(gòu)體稱謂提及α，α-雙取代氨基酸時(shí)，將理解的是這些稱謂出于便利目的，并且其中取代基在α-位置上相異的情況下，此類氨基酸根據(jù)需要可以互換地稱作從具有所指明氨基酸側(cè)鏈部分的殘基的L-或D-異構(gòu)體衍生的α，α-雙取代氨基酸。因此(S)-2-氨基-2-甲基-己酸可以稱作從L-Nle衍生或稱作從D-Ala衍生的α，α-雙取代氨基酸。類似地，Aib可以稱作從Ala衍生的α，α-雙取代氨基酸。無(wú)論何時(shí)提供α，α-雙取代氨基酸，將理解為包括其全部(R)和(S)構(gòu)型。
“N-取代氨基酸” “N-取代氨基酸”包括其中氨基酸側(cè)鏈部分共價(jià)連接至主鏈氨基的任何氨基酸，任選其中在α-碳位置中除H之外沒有取代基。肌氨酸是N-取代氨基酸的實(shí)例。例如，肌氨酸可以稱作Ala的N-取代氨基酸衍生物，因?yàn)榧“彼崤cAla的氨基酸側(cè)鏈部分是相同的，即均為甲基。
“羧基端封端基團(tuán)” 術(shù)語(yǔ)“羧基端封端基團(tuán)”包括經(jīng)化合物的羧基端的末端環(huán)碳原子或(若提供)末端羧基連接的任何端基。末端環(huán)碳原子或(若提供)末端羧基可以形成殘基的一部分或可以形成氨基酸替代物的一部分。在優(yōu)選的方面，羧基端封端基團(tuán)形成在化合物的羧基端位置處的氨基酸替代物的一部分。羧基端封端基團(tuán)包括，但不限于-(CH2)n-OH、-(CH2)n-C(＝O)-OH、-(CH2)m-OH、-(CH2)n-C(＝O)-N(v1)(v2)、-(CH2)n-C(＝O)-(CH2)m-N(v1)(v2)、-(CH2)n-O-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-C(＝O)-NH-(CH2)m-CH3、-(CH2)n-C(＝O)-NH-(CH2)m-N(v1)(v2)、-(CH2)n-C(＝O)-NH-((CH2)m-N(v1)(v2))2、-(CH2)n-C(＝O)-NH-CH(-C(＝O)-OH)-(CH2)m-N(v1)(v2)、-C(＝O)-NH-(CH2)m-NH-C(＝O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))或-(CH2)n-C(＝O)-NH-CH(-C(＝O)-NH2)-(CH2)m-N(v1)(v2)，包括前述基團(tuán)的全部(R)或(S)構(gòu)型，其中v1和v2各自獨(dú)立地是H、C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈，m是0-17并且n是0-2；或任何Ω氨基脂族基團(tuán)、末端芳基或芳烷基，包括以下基團(tuán)，如甲基、二甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、己基、烯丙基、環(huán)丙烷甲基、己?；?、庚?；⒁阴；⒈；?、丁?；?、苯乙?；h(huán)己基乙?；?、萘乙酰基、肉桂酰基、苯基、芐基、苯甲酰、12-Ado、7′-氨基庚酰基、6-Ahx、Amc或8-Aoc或任意的單個(gè)天然或非天然α-氨基酸、β-氨基酸或α，α-雙取代氨基酸，包括前述基團(tuán)的全部(R)或(S)構(gòu)型，任選地與任意的前述非氨基酸封端基團(tuán)的組合。在前述基團(tuán)中，例如將理解-C(＝O)-NH-(CH2)m-NH-C(＝O)-CH(N(v1)(v2))((CH2)m-N(v1)(v2))是
“氨基端封端基團(tuán)” 術(shù)語(yǔ)“氨基端封端基團(tuán)”包括經(jīng)化合物末端的末端胺所連接的任何端基。該末端胺可以形成殘基的一部分或可以形成氨基酸替代物的一部分。在優(yōu)選的方面，氨基端封端基團(tuán)形成在化合物的氨基端位置處的氨基酸替代物的一部分。氨基端封端基團(tuán)包括，但不限于任何Ω氨基脂族基團(tuán)、?；鶊F(tuán)或末端芳基或芳烷基，包括下列基團(tuán)，如甲基、二甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、己基、烯丙基、環(huán)丙烷甲基、己酰基、庚?；⒁阴；⒈；?、丁?；?、苯乙?；?、環(huán)己基乙?；⑤烈阴；⑷夤瘐；?、苯基、芐基、苯甲酰、12-Ado、7′-氨基庚?；?、6-Ahx、Amc或8-Aoc，或備選地，氨基端封端基團(tuán)是-(CH2)m-NH(v3)、-(CH2)m-CH3、-C(＝O)-(CH2)m-CH3、-C(＝O)-(CH2)m-NH(v3)、-C(＝O)-(CH2)m-C(＝O)-OH、-C(＝O)-(CH2)m-C(＝O)-(v4)、-(CH2)m-C(＝O)-OH、-(CH2)m-C(＝O)-(v4)、C(＝O)-(CH2)m-O(v3)、-(CH2)m-O(v3)、C(＝O)-(CH2)m-S(v3)或-(CH2)m-S(v3)，其中v3是H或C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈，并且v4是C1-C17直鏈或支鏈的烷基鏈并且m是0-17。
本文中所用的化學(xué)命名方案和結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖采用并依賴如(可從Cambridgesoft Corp.，Cambridge，Mass.獲得的)ChemDraw程序所用的化學(xué)命名特征。尤其，使用Autonom程序從如Chemdraw Ultra或ISIS base(MDLCorp.)所用的結(jié)構(gòu)中衍生某些化合物名稱。通常，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖不描繪與碳原子連接的氫原子，除非在端基內(nèi)和在其它特定環(huán)境下。
描述了具有由結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖確定的替代物和由三字母縮寫確定的氨基酸殘基的某些化合物。除非另外說(shuō)明，可理解的是在在所述替代物和殘基之間、或者所述殘基和替代物之間、或者一個(gè)替代物和其氨基端和羧基端側(cè)上的殘基之間的鍵是常規(guī)肽鍵-C(＝O)-NH-，或在其中肽鍵與替代物的氨基端上的環(huán)氮連接時(shí)，是-C(＝O)-N-。通常，在此類鍵的描繪中，繪出氨基酸替代物的原子(例如-C(＝O)-或-N)，但是不繪出氨基酸殘基的原子。
2.異構(gòu)體的純度和分離 本發(fā)明的替代物可以含有一個(gè)或多個(gè)手性中心和/或雙鍵，并且因而作為立體異構(gòu)體如雙鍵異構(gòu)體(即幾何異構(gòu)體)、對(duì)映異構(gòu)體或非對(duì)映體存在。根據(jù)本發(fā)明，本文中所述的化學(xué)結(jié)構(gòu)并且因而本發(fā)明的化合物，包括本發(fā)明化合物的消旋形式以及全部的對(duì)映異構(gòu)體和立體異構(gòu)體，即立體純形式(例如幾何純、對(duì)映異構(gòu)體純或非對(duì)映體純)和對(duì)映異構(gòu)體混合物與立體異構(gòu)體混合物。
當(dāng)化合物相對(duì)于特定手性中心是約90％ee(對(duì)映體過(guò)量)或更大，優(yōu)選地等于或大于95％ee時(shí)，認(rèn)為本發(fā)明的替代物相對(duì)于該手性中心是光學(xué)活性的或?qū)τ钞悩?gòu)體純的(即基本上是R-形式或基本上是S-形式)。當(dāng)本發(fā)明的化合物具有大于約80％ee、優(yōu)選大于約85％ee的對(duì)映體過(guò)量時(shí)，認(rèn)為該化合物處于對(duì)映異構(gòu)體富集形式中。如本文中所用，消旋混合物意指相對(duì)于分子中全部手性中心的約50％一種對(duì)映異構(gòu)體和約50％其相應(yīng)的對(duì)映異構(gòu)體。因此，本發(fā)明包括本發(fā)明化合物的全部對(duì)映異構(gòu)體純的混合物、對(duì)映異構(gòu)體富集的混合物和消旋混合物。
因此，在一個(gè)方面，替代物具有以下的一般結(jié)構(gòu)
其中星號(hào)表示任何可能的立體化學(xué)構(gòu)象。該結(jié)構(gòu)因此包括以下對(duì)映異構(gòu)體形式

或
對(duì)映異構(gòu)體和立體異構(gòu)體混合物可以通過(guò)眾所周知的方法拆解成其組成性對(duì)映異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，所述的方法例如是手性相氣相色譜法、手性相高效液相色譜法、使化合物結(jié)晶成手性鹽復(fù)合體或使化合物在手性溶劑中結(jié)晶。對(duì)映異構(gòu)體和立體異構(gòu)體也可以通過(guò)眾所周知的非對(duì)稱合成方法從立體純的或?qū)τ钞悩?gòu)體純的中間體、試劑和催化劑中獲得。
3.本發(fā)明的化合物 本發(fā)明提供式I環(huán)約束性氨基酸替代物和包含式I環(huán)約束性氨基酸替代物的線形或環(huán)狀化合物
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽，其中 R1是H、烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
R2是H或烷基，前提是R1和R2不都是H； R3是H或第一氮保護(hù)基團(tuán)； R4是H、烷基、(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2； R5是H或烷基； R6a是H、烷基、(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2； R6b是H或烷基； 前提是R4和R6a不均是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2； R7是H、C(＝O)烷基、C(＝O)(CH2)m(NR8)2、烷基、芳烷基或芳基； R8的每次出現(xiàn)獨(dú)立地是H、芳基或烷基； R11是肽固體支持物； R12是H或第二氮保護(hù)基團(tuán)； m的每個(gè)具體值是具有0與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)； q的每個(gè)具體值是具有1與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)； p是具有1與10之間的值的整數(shù)；并且 y是0或1。
式I環(huán)約束性氨基酸替代物可以用于置換由多個(gè)氨基酸殘基組成的多肽化合物的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘。
式I環(huán)約束性氨基酸替代物優(yōu)選地是這樣的，以至于它可以用常規(guī)的氨基受保護(hù)氨基端(使用保護(hù)基團(tuán)(如Fmoc))和羧基端活性羧基產(chǎn)生，并且可以因此用于常規(guī)的肽合成方法學(xué)中?？衫斫獾氖侨羰絀氨基酸替代物偶聯(lián)在化合物的羧基端位置處，則可以使用在此種替代物上除羧基端之外的位置。
因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于通過(guò)肽合成方法學(xué)(其根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整)摻入多肽化合物的環(huán)約束性氨基酸替代物，其中所述的多肽化合物包含多個(gè)氨基酸殘基。
除了R1和R2均是H之外，將理解的是本發(fā)明的每種替代物可以具有四種不同對(duì)映異構(gòu)體形式之一。因此，例如，當(dāng)R1或R2基團(tuán)是Arg的氨基酸側(cè)鏈部分，該化合物可以類屬地顯示為
其中每個(gè)星號(hào)代表可以處于任何立體化學(xué)構(gòu)型的手性中心。因此，將理解以下每種構(gòu)型是可能的、構(gòu)思的及想要的
類似地，就每種替代物而言，對(duì)于在使用常規(guī)肽合成方法學(xué)的化合物合成中的用途，可理解如果替代物處于除N末端位置之外的位置，則R3位置將包括氮保護(hù)基團(tuán)而非H，并且因此該替代物將具有以下的一般結(jié)構(gòu)
其中PRG是氮保護(hù)基團(tuán)，例如并且是不限于下式的基團(tuán)
其中R9是叔丁基、烯丙基或下式的基團(tuán)
因此，在R1或R2基團(tuán)是Arg的氨基酸側(cè)鏈部分、并且R3是氮保護(hù)基團(tuán)Fmoc的實(shí)例中，可以明白以下每種結(jié)構(gòu)是可能的、構(gòu)思的及想要的


或
在上文的具體實(shí)施例中，也有可能和構(gòu)思的是將在胍基內(nèi)使用氮保護(hù)基團(tuán)，例如Pbf。也可以明白有可能并構(gòu)思類似的替代物，此時(shí)使用另一種基團(tuán)作為氮保護(hù)基團(tuán)或使用另一種氨基酸側(cè)鏈部分或氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物作為R1或R2基團(tuán)，或者備選地，其中它們中至少一個(gè)是烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
其中R8是H、芳基或烷基，并且R12是H或第二氮保護(hù)基團(tuán)。
若替代物用于使用常規(guī)肽合成方法學(xué)合成化合物中并且位于羧基端位置，則該替代物可以是與肽固體支持物(如樹脂)結(jié)合的化合物。在這種情況下，該替代物可以具有以下的一般結(jié)構(gòu)
其中橢園形表示樹脂和接頭或另一種肽固體支持物。這里，R1或R2基團(tuán)也可以是任何氨基酸側(cè)鏈部分或氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物，或者它們中至少一個(gè)可以是烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
其中R8是H、芳基或烷基，并且R12是H或第二氮保護(hù)基團(tuán)。在一個(gè)方面，本發(fā)明因此提供具有以下一般結(jié)構(gòu)的替代物
其中R1是以下基團(tuán)之一

或
其中R3是H或第一氮保護(hù)基團(tuán)；R4是H、烷基、(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2；R5是H或烷基；R8是H、芳基或烷基；R11是肽固體支持物；m的每個(gè)具體值是具有0與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)；q的每個(gè)具體值是具有1與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)；p是具有1與10之間的值的整數(shù)；并且任何芳基可以獨(dú)立地由選自烷基、鹵烷基、環(huán)烷基、烷氧基、烷基硫代、鹵代、硝基、?；?、氰基、氨基、單取代氨基、雙取代氨基、羥基、羧基或烷氧羰基的一個(gè)或多個(gè)取代基取代。因此，在一個(gè)方面，提供帶R1基團(tuán)的替代物，其中所述R1基團(tuán)是以下19種天然編碼的氨基酸殘基(省去Pro)之一的氨基酸側(cè)鏈部分，包括下列

6-氧代-哌嗪-2-羧酸

5-甲基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸

5-異丙基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸

5-異丁基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸

5-仲丁基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸

5-(2-甲硫基-乙基)-6-氧代-哌嗪-2-羧酸

5-芐基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸

5-(4-羥基-芐基)-6-氧代-哌嗪-2-羧酸


5-羧基甲基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸

5-(2-羧基-乙基)-6-氧代-哌嗪-2-羧酸

5-(4-氨基-丁基)-6-氧代-哌嗪-2-羧酸

5-(3-胍基-丙基)-6-氧代-哌嗪-2-羧酸


5-氨基甲?；谆?6-氧代-哌嗪-2-羧酸


5-羥甲基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸

5-(1-羥基-乙基)-6-氧代-哌嗪-2-羧酸

5-巰基甲基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸 在前述每種結(jié)構(gòu)中，除不是H之外，R3位置中可以存在任意的氮保護(hù)基團(tuán)；除不是-C(＝O)OH之外，R4位置可以是烷基、(CH2)qC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2，其中R8是H、芳基或烷基，R11是肽固體支持物，m是具有0與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)，q是具有1與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)并且p是具有1與10之間的值的整數(shù)；除不是H之外，R5位置可以是烷基；并且除不是H之外，R7位置可以是C(＝O)烷基或C(＝O)(CH2)m(NR8)2。類似的，除不是前述氨基酸側(cè)鏈部分之一外，R1可以是烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)

或
其中R8是H、芳基或烷基，并且R12是H或第二氮保護(hù)基團(tuán)。
4.本發(fā)明化合物的用途 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了產(chǎn)生包含替代物的化合物的方法，其中所述的化合物基于與目的靶結(jié)合的已知原始多肽。所述原始多肽可以是肽、多肽或蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的另一方面，提供用于鑒定原始多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，其中所述的二級(jí)結(jié)構(gòu)參與或負(fù)責(zé)對(duì)目的靶的結(jié)合。該方法包括(a)提供與具有已知一級(jí)結(jié)構(gòu)的目的靶結(jié)合的已知原始多肽，這種一級(jí)結(jié)構(gòu)由n個(gè)氨基酸殘基組成；(b)構(gòu)建其中替代物取代原始多肽中氨基酸殘基的多種化合物，取代的替代物優(yōu)選地具有這樣的R1或R2基團(tuán)，其與該替代物所取代氨基酸殘基的氨基酸側(cè)鏈部分相同或是該替代物所取代氨基酸殘基的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物；(c)篩選包括替代物的多種化合物；和(d)選擇顯示與目的靶結(jié)合的化合物，因而這種化合物包含與目的靶結(jié)合的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明的相關(guān)方面，提供用于鑒定原始多肽中參與或負(fù)責(zé)對(duì)目的靶結(jié)合的二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括構(gòu)建其中替代物取代原始多肽中氨基酸殘基的多種化合物的步驟，取代的替代物優(yōu)選地具有在兩個(gè)位置中均限定是H或在一個(gè)位置中限定是甲基而在剩余位置中限定是H的R1和R2基團(tuán)。按照這種方式，可以容易地確定氨基酸側(cè)鏈部分對(duì)效力或任何其它可確定參數(shù)的影響。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供對(duì)原始多肽的系統(tǒng)分析以確定原始多肽中參與原始多肽與靶物質(zhì)相互作用(如結(jié)合)的至少一個(gè)活性序列或結(jié)構(gòu)域。如本文中所用，“原始多肽”指顯示與靶物質(zhì)相互作用(如結(jié)合)并且可以因此構(gòu)成肽、多肽或蛋白質(zhì)的任何氨基酸殘基序列。原始多肽一般是如本文中所定義的多肽，具有約3-約100個(gè)氨基酸殘基，不過(guò)術(shù)語(yǔ)“原始多肽”也可以包括更大的構(gòu)建體，其通常在本領(lǐng)域中被視為大的多肽或蛋白質(zhì)。為使用本發(fā)明的方法，必須可獲得至少部分并且優(yōu)選全部的原始多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)(也即序列)。然而，不需要具有關(guān)于原始多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的任何信息以實(shí)施本發(fā)明的方法。
原始多肽可以是顯示與例如細(xì)胞、組織、器官或其它生物材料上存在的受體相結(jié)合的任何序列。原始多肽的實(shí)例包括而不限于生物學(xué)活性肽、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、酶、抗體等。此類原始多肽可以通過(guò)與受體結(jié)合而直接或間接地傳遞信號(hào)，并且因此原始多肽可以是激動(dòng)劑、拮抗劑或混合的激動(dòng)劑-拮抗劑。合適的本發(fā)明原始多肽的實(shí)例包括黑皮質(zhì)素-受體特異性肽、尿激酶型組織纖溶酶原激活蛋白、淀粉樣β-蛋白相關(guān)肽、朊蛋白病相關(guān)肽、血管升壓素肽、催產(chǎn)素肽、利尿鈉肽、血管緊張素肽、降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽、阿片樣肽、人生長(zhǎng)激素、人促乳素受體配體、多種干擾素如α-干擾素、表皮生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子和多種致低血壓肽、纖維蛋白溶解肽、趨化肽、生長(zhǎng)促進(jìn)肽、細(xì)胞粘附肽和多肽、促分裂原、免疫調(diào)節(jié)劑等。
通常，為了使用本發(fā)明，利用至少一種測(cè)定法或試驗(yàn)以確定本發(fā)明構(gòu)建體針對(duì)目的受體的參數(shù)。在一個(gè)方面，利用了本發(fā)明構(gòu)建體與目的受體的結(jié)合，并且優(yōu)選地平行測(cè)定原始多肽與目的受體的結(jié)合。然而，可以利用除結(jié)合之外的其它參數(shù)，包括多種功能性測(cè)定系統(tǒng)、效力測(cè)定系統(tǒng)等。此類參數(shù)可以相對(duì)于任何相關(guān)的測(cè)量單位(包括在功能性測(cè)定系統(tǒng)中表達(dá)一種或多種化合物、Ki值、EC50值等)進(jìn)行確定。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用競(jìng)爭(zhēng)性抑制測(cè)定法或相似的測(cè)定法，因而本發(fā)明構(gòu)建體的結(jié)合活性或功能活性可以直接與原始多肽比較，并且因而直接測(cè)定相對(duì)結(jié)合活性或功能活性。在其它實(shí)施方案中，可以使用其它測(cè)定法或試驗(yàn)。這些測(cè)定法可以，但不需要是功能性測(cè)定法。測(cè)定法的實(shí)例包括多種競(jìng)爭(zhēng)性抑制測(cè)定法、直接結(jié)合測(cè)定法、功能測(cè)定法等中的任一種。也有可能和構(gòu)思的是使用這樣的測(cè)定法，其中所述的測(cè)定法確定例如本發(fā)明的構(gòu)建體是否是激動(dòng)劑、拮抗劑或混合激動(dòng)劑-拮抗劑，并且進(jìn)一步確定是否可以分別測(cè)定結(jié)合和功能，以獨(dú)立地測(cè)定受體親和力和特異性以及功能活性。測(cè)定法和試驗(yàn)的實(shí)例是本領(lǐng)域眾所周知并有許多資料證明的，并且通常對(duì)于任何原始多肽已知有一種或多種測(cè)定法或試驗(yàn)。
在本發(fā)明的一項(xiàng)方法中，使用原始多肽作為模板以產(chǎn)生一種或多種化合物，和更優(yōu)選一系列化合物，其中每種所述的化合物包括取代原始多肽中至少一個(gè)氨基酸殘基的至少一個(gè)替代物。在一個(gè)方面，具有至少一種替代物的化合物可以省去原始多肽中存在的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。在另一方面，具有至少一個(gè)替代物的化合物含有如原始多肽中存在的相同氨基酸殘基或其同系物，同時(shí)用替代物取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)方面，取代的替代物優(yōu)選地具有這樣的R1或R2基團(tuán)，其與該替代物所取代氨基酸殘基的氨基酸側(cè)鏈部分相同或是該替代物所取代氨基酸殘基的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物。在另一方面，取代的替代物優(yōu)選地具有在兩個(gè)位置中均限定是H、或在一個(gè)位置中限定是甲基而在剩余位置中限定是H的R1和R2基團(tuán)。
例如，假定存在與一種指定及已知受體結(jié)合的具有6個(gè)氨基酸殘基的原始多肽。該原始多肽可以描述為X1-X2-X3-X4-X5-X6。
本發(fā)明的替代物(稱作“S”)用來(lái)合成如下所述的化合物 X1-X2-X3-S-X5-X6 在化合物X1-X2-X3-S-X5-X6的一個(gè)方面，其中氨基酸殘基X4由S替換，S具有與X4的氨基酸側(cè)鏈部分相同或作為X4的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物的R1或R2基團(tuán)。在另一方面，在X4不是Gly或Ala的情況下，S具有在兩個(gè)位置中均是H、或在一個(gè)位置中是甲基而在剩余位置中是H的R1和R2基團(tuán)。對(duì)化合物X1-X2-X3-S-X5-X6的結(jié)合或?qū)πЯΦ哪承┢渌攘窟M(jìn)行測(cè)定，并與原始多肽X1-X2-X3-X4-X5-X6比較。
有可能并構(gòu)思的是可以進(jìn)行系統(tǒng)性評(píng)估。假定存在與指定已知受體結(jié)合的具有15個(gè)氨基酸殘基的原始多肽。該原始多肽可以描述為 NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH 在這種原始多肽中，X可以是任意殘基，其中殘基可以按照任意順序或次序重復(fù)多次。因此，在位置X1中的殘基可以與位置X2中的殘基相異或相同，其中位置X2中的殘基可以與X1或X3等中的殘基相異或相同。產(chǎn)生了其中替代物“S”以依次方式或逐步方式取代氨基酸殘基的一系列化合物，因此，例如可以產(chǎn)生以下化合物 S-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH NH2-X1-S-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH NH2-X1-X2-S-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH NH2-X1-X2-X3-S-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH NH2-X1-X2-X3-X4-S-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH NH2-X1-X2-X3-X4-X5-S-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-S-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-S-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-S-X10-X11-X12-X13-X14-X15-COOH NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-S-X11-X12-X13-X14-X15-COOH NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-S-X12-X13-X14-X15-COOH NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-S-X13-X14-X15-COOH NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-S-X14-X15-COOH NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-S-X15-COOH NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-S 在前述化合物中，對(duì)于每種化合物，替代物S具有這樣的R1或R2基團(tuán)，其與該替代物所取代氨基酸殘基的氨基酸側(cè)鏈部分相同或是該替代物所取代氨基酸殘基的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物。對(duì)于每個(gè)位置，可以采用并評(píng)估全部對(duì)映體形式。此外，對(duì)于每個(gè)位置，可以評(píng)估“敲除”方法，其中在X不是Gly或Ala的情況下，S具有在兩個(gè)位置中均是H或在一個(gè)位置中是甲基而在剩余位置中是H的R1和R2基團(tuán)。
也有可能和構(gòu)思的是用另一種氨基酸殘基取代原始多肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，同時(shí)還用本發(fā)明的替代物取代原始多肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)方面，D-異構(gòu)體取代在天然存在的原始多肽中的L-異構(gòu)體。包含至少一個(gè)式I替代物的對(duì)應(yīng)氨基酸序列可以與已知原始多肽相同或可以與其同源，如至少60％同源或更優(yōu)選至少約80％同源的對(duì)應(yīng)氨基酸序列。出于這些目的，通過(guò)參照已知氨基酸序列的同源性而確定不包括一個(gè)或多個(gè)式I替代物置換或添加的化合物的同源性。
在另一方面，本發(fā)明提供這樣的式II環(huán)約束性氨基酸替代物，其用來(lái)合成在與利尿鈉肽受體結(jié)合的已知肽上建模而包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代物的化合物，此類替代物取代了在已知肽中含有的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，或?qū)τ诎阎牡男蛄惺穷~外的。已知肽可以是本領(lǐng)域已知的任意利尿鈉肽，包括但不限在本文援引的任何出版物、專利、申請(qǐng)或參考文獻(xiàn)中公開的那些利尿鈉肽，包括但不限于在美國(guó)專利4,496,544；4,609,725；4,656,158；4,673,732；4,716,147；4,757,048；4,764,504；4,804,650；4,816,443；4,824,937；4,861、755；4,904,763；4,935,492；4,952,561；5,047,397；5,057,495；5,057,603；5,091,366；5,095,004；5,106,834；5,114,923；5,159,061；5,204,328；5,212,286；5,352,587；5,376,635；5,418,219；5,665,704；5,846,932；5,583,108；5,965,533；6,028,055；6,083,982；6,124,430；6,150,402；6,407,211；6,525,022；6,586,396或6,818,619中；在美國(guó)專利申請(qǐng)公開2004/0002458；2004/0063630；2004/0077537；2005/0113286；2005/0176641或2006/0030004中；或在多種非美國(guó)專利和專利申請(qǐng)，包括WO 85/04870；WO 85/04872；WO 88/03537；WO 88/06596；WO 89/10935；WO 89/05654；WO 90/01940；WO 90/14362；WO 92/06998；WO 95/13296；WO 99/08510；WO 99/12576；WO 01/016295；WO 2004/047871；WO 2005/072055；EPO 0 291 999；EPO0 323 740；EPO 0 341 603；EPO 0 350 318；EPO 0 356 124；EPO 0 385 476；EPO 0 497 368；或EPO 0 542 863中公開的利尿鈉肽。在一個(gè)方面，已知肽是在美國(guó)專利4,656,158、4,824,937、4,935,492、5,159,061、5,204,328、5,376,635、5,665,704、5,846,932、6,028,055、6,407,211、6,525,022、6,586,396或6,818,619，美國(guó)專利申請(qǐng)公開2004/0002458、2004/0063630或2005/0176641或國(guó)際專利申請(qǐng)公開WO 2004/047871或WO 2005/072055中公開的肽或其同系物。前述每篇專利和專利申請(qǐng)的教導(dǎo)通過(guò)引用的方式如完整所述那樣并入。在一個(gè)方面，與利尿鈉肽受體結(jié)合的氨基酸序列在置換之前是H-Met-環(huán)(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ ID NO1)。在另一方面，本發(fā)明提供這樣的式I環(huán)約束性氨基酸替代物，其用于合成與利尿鈉肽受體(包括ANP或BNP的受體)結(jié)合的化合物。
使用一種或多種式I替代物所產(chǎn)生的化合物既可以用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用，也可以用于畜牧業(yè)或獸醫(yī)應(yīng)用。通常，該化合物或包含該化合物的藥物組合物用在人體中，不過(guò)也可以用在其它哺乳動(dòng)物中使用。術(shù)語(yǔ)“患者”意圖指哺乳動(dòng)物個(gè)體，并且在本說(shuō)明書通篇范圍內(nèi)和在權(quán)利要求書中如此使用。本發(fā)明的主要應(yīng)用涉及人類患者，不過(guò)本發(fā)明可以應(yīng)用至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、動(dòng)物園動(dòng)物、野生動(dòng)物、寵物、體育動(dòng)物或其它動(dòng)物。
在本文中公開或通過(guò)本文中公開的方法所產(chǎn)生的化合物可以用于治療任何病癥、綜合征或疾病，并且尤其用于治療原始多肽對(duì)其具有某些效力的任何病癥、綜合征或疾病。在本文中公開或通過(guò)本文中公開的方法所產(chǎn)生的化合物可以具有相對(duì)于原始多肽的一個(gè)或多個(gè)優(yōu)勢(shì)，包括但不限于以下優(yōu)勢(shì)，如增加的抗酶降解性、增加的循環(huán)半壽期、增加的生物利用度、增加的效力、延長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間及其前述組合。此類優(yōu)勢(shì)從整體上或部分地歸因于使用本發(fā)明的式I替代物。
在一個(gè)方面，本文中公開的化合物用于早期(如1類)充血性心力衰竭的治療中。在另一方面，本文中公開的化合物用于慢性或代償失調(diào)性充血性心力衰竭的治療中。在另一方面，本文中公開的化合物用于急性充血性心力衰竭(包括在休息及最小活動(dòng)情況下呼吸困難的患者的急性代償失調(diào)性充血性心力衰竭)的治療中。
化合物的鹽形式。本發(fā)明的化合物可以處于任何可藥用鹽形式。術(shù)語(yǔ)“可藥用鹽”指從可藥用的無(wú)毒堿或無(wú)毒酸(包括無(wú)機(jī)堿或有機(jī)堿和無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸)制備的鹽。從無(wú)機(jī)堿衍生的鹽包括鋁、銨、鈣、銅、高鐵、亞鐵、鋰、鎂、錳、亞錳、鉀、鈉、鋅等的鹽。特別優(yōu)選銨、鈣、鋰、鎂、鉀和鈉鹽。從可藥用的有機(jī)無(wú)毒堿中衍生的鹽包括伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、環(huán)狀胺和堿性離子交換樹脂如精氨酸、甜菜堿、咖啡因、膽堿、N，N′-二芐基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基-嗎啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡糖、組氨酸、哈胺、異丙基胺、賴氨酸、甲基葡糖胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、多胺樹脂、普魯卡因、嘌呤、可可堿、三乙胺、三甲胺、三丙基胺、氨丁三醇等的鹽。
當(dāng)本發(fā)明的化合物呈堿性時(shí)，酸加成鹽可以從可藥用的無(wú)毒酸(包括無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸)制備。此類酸包括乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟腦磺酸、羧酸、檸檬酸、乙磺酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖酸、谷氨酸、氫溴酸、氫氯酸、羥乙磺酸、乳酸、馬來(lái)酸、蘋果酸、扁桃酸、甲磺酸、丙二酸、粘酸、硝酸、雙羥萘酸、泛酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、對(duì)甲苯磺酸、三氟乙酸等。本發(fā)明的化合物的酸加成鹽從該化合物和過(guò)量的酸如氫氯酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、檸檬酸、酒石酸、馬來(lái)酸、琥珀酸的或甲基磺酸在合適的溶劑中制備。乙酸鹽形式尤其是有用的。在本發(fā)明實(shí)施方案的化合物包括酸性部分的情況下，合適的可藥用鹽可以包括堿金屬鹽(如鈉或鉀鹽)或堿土金屬鹽(如鈣或鎂鹽)。
藥物組合物。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供包括本發(fā)明化合物和可藥用載體的藥物組合物。載體可以是液體制劑，并且優(yōu)選地是緩沖、等張的水溶液劑?？伤幱幂d體也包括賦形劑如稀釋劑、載體等，以及添加劑，如穩(wěn)定劑、防腐劑、增溶劑、緩沖劑等，如下文所述。
本發(fā)明的數(shù)個(gè)實(shí)施方案的化合物可以配制成或復(fù)合成包括至少一種本發(fā)明化合物連同一種或多種可藥用載體的藥物組合物，其中所述的可藥用載體可以根據(jù)需要包括賦形劑如稀釋劑、載體等和添加劑如穩(wěn)定劑、防腐劑、增溶劑、緩沖劑等。制劑用賦形劑可以包括聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯膠、聚乙二醇、甘露醇、氯化鈉和檸檬酸鈉。對(duì)于注射劑或其它液態(tài)施用制劑，優(yōu)選含有至少一種或多種緩沖組分的水，并且也可以使用穩(wěn)定劑、防腐劑和增溶劑。對(duì)于固態(tài)施用制劑，可以使用任意的多種增稠劑、填料、填充劑和載體添加劑，如淀粉、糖、脂肪酸等。對(duì)于局部施用制劑，可以使用任意的多種乳膏劑、軟膏劑、凝膠劑、洗劑等。對(duì)于絕大多數(shù)藥物制劑，按照重量或體積，非活性成分將構(gòu)成制劑的主要部分。對(duì)于藥物制劑，還構(gòu)思的是可以施用任意的多種定量釋放性、緩釋性或定時(shí)釋放性制劑和添加劑，以至可以配制出這樣的劑量來(lái)實(shí)現(xiàn)經(jīng)一段時(shí)間送遞本發(fā)明的化合物。
通常，施用至患者的化合物的實(shí)際量將在相當(dāng)寬泛的范圍內(nèi)變化，這取決于施用模式、使用的制劑和想要的反應(yīng)。
在實(shí)際使用中，化合物可以根據(jù)常規(guī)藥學(xué)復(fù)合技術(shù)作為摻合劑中的活性成分與藥用載體組合。載體可以采取種類繁多的形式，這取決于施用(例如口服、胃腸道外(包括靜脈內(nèi))、尿道、陰道、鼻、皮膚、經(jīng)皮、肺、肺深部、吸入、口頰、舌下等)所需要的制劑形式。在制備用于口服劑量形式的組合物中，可以使用任何常見的藥用介質(zhì)，例如在口服液體制劑例如混懸劑、酏劑和溶液劑的情況下，使用水、二醇、油、醇、增香劑、防腐劑、著色劑等；或如在口服固體制劑例如粉劑、硬膠囊劑和軟膠囊劑和片劑的情況下，使用載體，如淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、造粒劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、崩解劑等。
因?yàn)槠湟子谑┯?，片劑和膠囊劑代表有利的口服劑量單位形式。若需要，包括本發(fā)明化合物的組合物可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的含水或不含水技術(shù)加以包衣?；钚曰衔镌诖祟愔委熡媒M合物中的量是這樣的，以至于將獲得有效劑量。在另一種有利的劑量單位形式中，可以使用舌下藥物組合物，如薄片(sheet)、糯米紙囊劑、片劑等?；钚曰衔镆部梢宰鳛槔缫簯B(tài)滴劑或噴霧劑進(jìn)行鼻內(nèi)施用。
片劑、丸劑、膠囊劑等也可以含有粘合劑如黃芪樹膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑如磷酸氫二鈣；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或藻酸；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂和甜味劑如蔗糖、乳糖或糖精。當(dāng)劑量單位形式是膠囊劑時(shí)，除以上類型的材料之外，它還可以含有液態(tài)載體如動(dòng)物油。
多種其它材料可以用作包衣層或用來(lái)對(duì)劑量單位的物理形式修飾。例如，片劑可以用紫膠、糖或這兩者加以包衣。除活性成分外，糖漿劑或酏劑還可以含有蔗糖作為甜味劑、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯作為防腐劑、染料和香料如櫻桃香料或橙香料。
化合物也可以作胃腸道外施用。這些活性肽的溶液劑或混懸劑可以在適度與表面活性劑(如羥丙基纖維素)混合的水中制備。也可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇及其在油中的混合物內(nèi)制備分散體。這些制劑可以任選地含有防止微生物生長(zhǎng)的防腐劑。也可以使用凍干的單個(gè)單位劑量，如其在緊鄰施用前用鹽水重構(gòu)，并且因此不需要防腐劑 適于可注射用途的藥物形式，包括，例如用于臨時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液劑或分散體的無(wú)菌水溶液或分散體和無(wú)菌粉末，如凍干制劑。在所有情況下，該形式必須是無(wú)菌的并且必須具有如此程度的流動(dòng)性，以至于它可以通過(guò)注射器施用。該形式必須在制造和儲(chǔ)存條件下是穩(wěn)定的并且必須保存避免微生物(如細(xì)菌和真菌)污染作用。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇)或液態(tài)聚乙二醇、其合適混合物及植物油的溶劑或分散體介質(zhì)。
如本文中公開的化合物可以通過(guò)鼻施用方式治療性地應(yīng)用。“鼻施用”意指鼻內(nèi)施用本發(fā)明的任意化合物的任何形式。化合物可以存在于水溶液劑如包含鹽、檸檬酸鹽或其它常見賦形劑或防腐劑的溶液劑中?；衔镆部梢源嬖谟诟稍镏苿┗蚍蹌┲苿┲?。
在備選實(shí)施方案中，化合物可以直接施用至肺內(nèi)。肺內(nèi)施用可以通過(guò)定量投藥吸入器(當(dāng)由患者在呼吸期間開動(dòng)時(shí)允許自行施用本發(fā)明化合物的定量大丸劑的一種裝置)而進(jìn)行。可以使用干粉吸入氣霧劑和噴灑氣霧劑。
根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方案，本發(fā)明的化合物可以與增加藥物(包括肽藥物)的有效鼻吸收效果的多種藥劑中的任一種一起配制。這些藥劑應(yīng)當(dāng)增加鼻吸收效果，而不對(duì)粘膜造成不可接受的損傷。美國(guó)專利5,693,608、5,977,070和5,908,825及其它美國(guó)專利教授了可以使用的包括吸收增強(qiáng)劑的眾多藥物組合物，并且前述每篇專利的教導(dǎo)及其中援引的全部參考文獻(xiàn)和專利通過(guò)引用的方式并入。
若在水溶液中，本發(fā)明的某些化合物可以通過(guò)可以處于任何生理可接受性pH(一般約pH4-約pH7)上的鹽水、乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽或其它緩沖劑而適度受到緩沖。也可以使用緩沖劑的組合，如磷酸鹽緩沖鹽水、鹽水和乙酸鹽緩沖劑等。在鹽水的情況下，可以使用0.9％鹽水溶液。在乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽等的情況下，可以使用50mM溶液。除了緩沖劑之外，還可以使用防止或限制細(xì)菌生長(zhǎng)和其它微生物生長(zhǎng)的合適防腐劑。一種可以使用的此種防腐劑是0.05％苯扎氯銨。
還有可能并構(gòu)思的是化合物可以是干燥顆粒形式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，顆粒大小為約0.5μm至6.0μm，從而所述顆粒具有足夠質(zhì)量以停留在肺表面上并且不被呼出，然而是足夠小的以至于它們?cè)诘诌_(dá)肺之前不沉積在氣道表面上。多種不同技術(shù)均可以用來(lái)產(chǎn)生干粉微粒，包括但不限于微碾磨法、噴霧干燥法和氣霧劑快速冷凍隨后凍干法。利用微粒子，構(gòu)建體可以沉積至肺深部，因而提供迅速及高效的進(jìn)入血流的吸收。此外，采用這種方法，則不需要滲透增強(qiáng)劑，正如有時(shí)在經(jīng)皮、鼻或口粘膜送遞途徑的情況。多種吸入器均可以使用，包括基于推進(jìn)劑的氣霧劑、霧化吸入器、單次劑量干粉吸入器和多劑量干粉吸入器。當(dāng)前使用的常見裝置包括定量劑量吸入器，其用來(lái)送遞用于治療哮喘、慢性閉塞性肺病等的藥物。優(yōu)選的裝置包括干粉吸入器，其設(shè)計(jì)旨在形成具有總是小于約6.0μm粒度的細(xì)微粉末的云霧或氣霧劑 可以通過(guò)制造方法控制微粒大小，包括平均大小分布。對(duì)于微碾磨法，碾磨頭的尺寸、轉(zhuǎn)子速度、加工時(shí)間等控制微粒大小。對(duì)于噴霧干燥法，噴嘴尺寸、流速、干燥器熱度等控制微粒大小。對(duì)于通過(guò)氣霧劑快速冷凍隨后凍干法的產(chǎn)生而言，噴嘴尺寸、流速、氣霧化溶液的濃度等控制微粒大小。這些參數(shù)和其它參數(shù)可以用來(lái)控制微粒大小。
本發(fā)明的化合物可以通過(guò)注射定時(shí)釋放的可注射制劑而治療性地施用，其中所述的注射一般是深部肌內(nèi)注射，如在臀肌或三角肌中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物與PEG如聚乙二醇3350和任選一種或多種其它賦形劑和防腐劑(包括但不限于賦形劑如鹽、聚山梨醇酯80、調(diào)節(jié)pH的氫氧化鈉或氫氯酸等)一起配制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物與聚(原酸酯)和任選地一種或多種其它賦形劑一起配制，其中所述的聚(原酸酯)可以是在聚合物主鏈中具有任何可變百分含量乳酸的自催化性聚(原酸酯)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物(PLGA聚合物)，優(yōu)選地使用具有親水端基的PLGA聚合物，如來(lái)自BoehringerIngelheim，Inc.(Ingelheim，Germany)的PLGA RG502H。此類制劑可以例如通過(guò)將合適溶劑(如甲醇)中的本發(fā)明化合物與PLGA的二氯甲烷溶液合并，并在反應(yīng)器中于適宜混合條件下向其添加聚乙烯醇的連續(xù)相溶液而產(chǎn)生。通常，眾多可注射及生物可降解的聚合物均可以在定時(shí)釋放的可注射制劑中使用，所述的聚合物優(yōu)選地也是粘性聚合物。美國(guó)專利4,938,763、6,432,438和6,673,767的教導(dǎo)及其中公開的生物可降解聚合物及配制方法通過(guò)引用的方式并入本文。制劑可以是這樣的，以至需要基于周、月或其它周期基礎(chǔ)提供注射，這取決于化合物的濃度和量、聚合物的生物降解速率和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。
施用途徑。若通過(guò)注射法施用本發(fā)明的化合物，則注射可以是靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或本領(lǐng)域已知的其它方式。本發(fā)明的化合物可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法配制成(包括但不限于以下的)制劑，如片劑、膠囊劑、小膠囊、混懸劑、粉劑、凍干制劑、栓劑、滴眼劑、皮膚貼劑、口服可溶性制劑、噴霧劑、氣霧劑等，并可以與緩沖劑、粘合劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑和本領(lǐng)域已知的其它添加劑混合及配制。通常，可以使用經(jīng)表皮細(xì)胞層導(dǎo)入本發(fā)明化合物的任何施用途徑。施用方法可以因此包括經(jīng)粘膜施用、口頰施用、口服施用、皮膚施用、吸入施用、肺施用、鼻施用、尿道施用、陰道施用等。
在一個(gè)方面，本發(fā)明的化合物通過(guò)定時(shí)釋放的可注射制劑(如在具有PEG、聚(原酸酯)或PLGA聚合物的制劑中的本發(fā)明化合物)施用。在另一方面，本發(fā)明的化合物通過(guò)提供連續(xù)或間歇式皮下送遞的自動(dòng)送遞裝置施用。任意的前述方法和制劑特別適用于治療慢性病癥或綜合征，包括慢性充血性心力衰竭并且特別是慢性代償失調(diào)性充血性心力衰竭。
在一個(gè)方面，本發(fā)明的任意化合物可以通過(guò)皮下施用法(包括在美國(guó)專利6,586,396中公開的全部方法)施用。在另一方面，患者，尤其相對(duì)受到補(bǔ)償?shù)幕蜃鳛殚T診患者環(huán)境下充血性心力衰竭患者的患者可以通過(guò)如美國(guó)專利申請(qǐng)公開2004/0077537和國(guó)際專利申請(qǐng)公開WO 2003/079979中公開的方法并以其中公開的劑量而施用本發(fā)明的化合物。在另一方面，患者可以通過(guò)如美國(guó)專利申請(qǐng)公開2005/0113286中公開的方法施用本發(fā)明的化合物。在又一方面，可以通過(guò)如美國(guó)專利申請(qǐng)公開2006/0019890中公開的方法為心臟重塑而治療已經(jīng)遭受心肌損傷的患者。
本發(fā)明的化合物也可以通過(guò)經(jīng)皮施用法施用，包括通過(guò)如美國(guó)專利申請(qǐng)公開2006/0034903中公開的裝置和方法的送遞系統(tǒng)。類似地，在其中公開的水凝膠制劑和固態(tài)制劑可以改進(jìn)以與本發(fā)明的化合物一起使用。
治療有效量。通常，施用至患者的本發(fā)明化合物的實(shí)際量將在相當(dāng)寬泛的范圍內(nèi)變化，這取決于施用模式、使用的制劑和想要的反應(yīng)。用于治療的劑量，即足以產(chǎn)生想要的治療效果的量，通過(guò)前述任意方法或本領(lǐng)域已知的任何其它方法施用。因此，治療有效量包括足以誘導(dǎo)預(yù)期效果的本發(fā)明化合物或藥物組合物的量。在其中利尿鈉肽在產(chǎn)生包括式I替代物之一的化合物中用作原始多肽的一個(gè)方面，治療有效量是產(chǎn)生想要的鈉尿排泄、利尿和/或血管舒張的量。
通常，本發(fā)明的化合物具有高度活性。例如，化合物可以按照約0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50或100μg/kg體重施用，這取決于所選的具體化合物、想要的治療應(yīng)答、施用途徑、制劑和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。
5.用于式I替代物的合成方法 本發(fā)明的式I替代物可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的合成方法學(xué)獲得。在下文方案中顯示一些常規(guī)方法。用于制備本發(fā)明化合物和所述化合物的中間體的起始材料是市售的或可以使用已知合成方法和試劑從市售材料制備。
本文中使用的保護(hù)基團(tuán)指這樣的基團(tuán)，其一般不存于最終治療化合物中，但在某些合成階段有意地導(dǎo)入以便保護(hù)可能在化學(xué)操作期間受到改變的基團(tuán)。此類保護(hù)基團(tuán)在合成的較晚階段被除去或轉(zhuǎn)化成想要的基團(tuán)，并且攜帶此類保護(hù)基團(tuán)的化合物因此主要作為化學(xué)中間體是重要的(雖然一些衍生物也表現(xiàn)生物學(xué)活性)。因此，保護(hù)基團(tuán)的精確結(jié)構(gòu)不是關(guān)鍵性的。
用于形成和除去此類保護(hù)基團(tuán)的眾多反應(yīng)在眾多標(biāo)準(zhǔn)著作中描述，所述的著作例如包括Protective Groups in Organic Chemistry，Plenum Press，London和New York，1973；Greene，Th.W.Protective Groups in OrganicSynthesis，Wiley，NewYork，1981；The Peptides，第I卷，Schroder和Lubke，Academic Press，London和New York，1965；以及Methoden der organischenChemie，Houben-Weyl，第四版，第15/1卷，Georg Thieme Verlag，Stuttgart1974，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用的方式并入本文。
以下合成本發(fā)明式I氨基酸替代物的方法的實(shí)例將是說(shuō)明性的，并且將理解對(duì)所述方法實(shí)例的變型可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施，并且將在本文中包括這類變型。
合成模擬無(wú)官能化R側(cè)鏈的氨基酸的哌嗪酮支架(方法A和B) 該構(gòu)建體通過(guò)如方法A和B中描述的多種方法制備。
方法A二肽(3)通過(guò)混合酐法，使用Boc-絲氨酸(OBn)-OH(1)和α-氨基酯(2)形成。該二肽以高產(chǎn)率獲得并且通常無(wú)需純化。使用乙硼烷-四氫呋喃還原甲基酯和酰胺基團(tuán)，其中保護(hù)仲胺以產(chǎn)生二-Boc保護(hù)的氨基醇中間體(4)。用重鉻酸吡啶鎓(PDC)氧化該醇并伴隨環(huán)化而在一個(gè)步驟中產(chǎn)生哌嗪-2-酮(5)。通過(guò)氫化除去二芐醚，隨后交換保護(hù)基團(tuán)，產(chǎn)生Fmoc保護(hù)的哌嗪-2-酮(6)。最后，將伯醇通過(guò)眾多不同方法(PDC、Jones氧化法、氯化釕-高碘酸鈉法、2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧自由基(TEMPO)氧化法)中的任一種氧化成酸以產(chǎn)生終產(chǎn)物(7)。
方法A
2-(3-芐氧基-2-叔丁氧羰基氨基-丙酰氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(3)的合成向保持在-20℃于氮?dú)庀碌脑?0mL無(wú)水四氫呋喃中的10mmol Boc絲氨酸二芐醚(1)的溶液添加22mmol三乙胺，隨后緩慢添加11.4mmol氯甲酸異丁酯。白色固體析出。漿液攪拌15分鐘，并且隨后以一個(gè)份額添加11.1mmolα-氨基酯(2)。漿液在-20℃攪拌30分鐘并隨后升溫至室溫，攪拌2小時(shí)，并隨后濃縮至干燥?；旌衔镫S后在50mL乙酸乙酯/30mL1N氫氯酸溶液之間分配。使各層分開，并且有機(jī)層用1×20mL1N氫氯酸和1×20mL飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮?；衔?3)通常以高于90％的產(chǎn)率獲得，并且無(wú)需純化。

雙-Boc-2-取代-(2-氨基-3-芐氧基-丙基-氨基)-乙醇(4)的合成向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?0mL無(wú)水四氫呋喃中的35mmol(3)溶液添加在四氫呋喃中的200mL 1N乙硼烷溶液。溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，并且隨后緩慢傾倒在200mL 1N氫氯酸的冰冷溶液上。雙相溶液隨后用固體氫氧化鈉中和。添加140mL飽和碳酸氫鈉溶液，隨后添加70mmol二-叔丁基-二碳酸酯，并且將混合物在室溫?cái)嚢?日，用200mL乙酸乙酯稀釋并使各層分開。有機(jī)層經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。產(chǎn)物(4)通過(guò)硅膠柱層析法純化。


1，4-二-Boc-6-芐氧基甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(5)的合成70mmol(4)和在300mL無(wú)水二甲基甲酰胺中的400mmol重鉻酸吡啶鎓的溶液在48℃于氮?dú)庀聰嚢?小時(shí)，冷卻至室溫，傾倒至1500mL水中，并用4×500mL乙醚萃取。將醚層合并、經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。產(chǎn)物(5)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成在200mL乙醇中的19mmol(5)和2g10％鈀碳的混懸液在室溫及常壓下氫化過(guò)夜?；鞈乙航?jīng)硅藻土過(guò)濾并濃縮。殘余物重溶解在二氯甲烷中的40mL50％三氟乙酸中。溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并且隨后濃縮。殘余物重溶解在60mL四氫呋喃/40mL水中，并用固體碳酸氫鈉中和，隨后添加40mmol固體碳酸氫鈉以及20mmol芴甲氧羰酰氯。混合物隨后在室溫?cái)嚢?小時(shí)，用300mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分離。有機(jī)層經(jīng)硫酸鎂干燥、濃縮并通過(guò)硅膠柱層析法純化。

4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成通過(guò)幾種方法制備化合物(7)。
(a)向冷卻至0℃的在180mL乙腈中的10mmol(6)、180mL四氯化碳和240mL水的雙相溶液添加112mmol固體高碘酸鈉，隨后添加340mg氯化釕。使反應(yīng)升溫至室溫，攪拌2小時(shí)并且隨后經(jīng)硅藻土過(guò)濾。使各層分開，并且水層用2×75mL乙酸乙酯再萃取。將有機(jī)層合并，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。
(b)在48℃于氮?dú)庀聰嚢柙?0mL無(wú)水二甲基甲酰胺中的12mmol(6)和59mmol PDC的溶液約5小時(shí)，將溶液冷卻至室溫并且傾倒在600mL水上，并用3×200mL二氯甲烷提取。將有機(jī)層合并，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。
(c)向在室溫保持的在350mL丙酮中的17mmol(6)的溶液添加(從8.0g鉻酸、17.4mL水和6.9mL濃硫酸中制備的)25mL Jones試劑?；旌衔飻嚢?小時(shí)，添加150mL異丙醇并將混合物經(jīng)硅藻土過(guò)濾。硅藻土用乙酸乙酯洗滌。將有機(jī)層合并及濃縮。殘余物溶解在250mL乙酸乙酯中并用2×50mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。
(d)向在室溫保持的在810mL乙腈中的81mmol醇(6)的溶液添加磷酸鹽緩沖液(用7.2g磷酸二氫鈉和14.3g磷酸氫二鈉在295mL水中制備)，隨后添加3.3g(20.7mmol)TEMPO和18.6g(164.4mmol)亞氯酸鈉，并將雙相溶液置于維持在43℃的油浴中，并且隨后緩慢添加(通過(guò)混合19.3mL10-13％次氯酸鈉溶液與24mL水而制備的)43.3mL(25.9mmol)次氯酸鈉溶液。反應(yīng)在43℃攪拌4小時(shí)。溶液冷卻至室溫，并添加200mL10％亞硫酸氫鈉溶液，攪拌10分鐘，用500mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分開。有機(jī)層用1×100mL鹽水、1×160mL 1N氫氯酸溶液洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮。
產(chǎn)物(7)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

方法B使用TEMPO/異氰尿酸試劑，如方法A中所述那樣制備的中間體雙-Boc-2-取代-(2-氨基-3-芐氧基-丙基-氨基)-乙醇(4)氧化成酸，并且隨后用碘甲烷酯化以產(chǎn)生完全受保護(hù)的還原二肽類似物(8)。Boc基團(tuán)和二芐醚的脫保護(hù)產(chǎn)生了3-取代的5-羥甲基-哌嗪-2-酮，其作為Fmoc衍生物受到保護(hù)以產(chǎn)生(6)，后者被氧化成如方法A中所述的終產(chǎn)物。
方法B
二-Boc-(2-氨基-3-芐氧基-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(8)的合成向保持在0℃的在680mL丙酮中的76mmol(4)和210mL飽和碳酸氫鈉溶液的混懸液添加21mmol固體溴化鈉和2.9mmol TEMPO，隨后緩慢添加156mmol三氯異氰尿酸。反應(yīng)在0℃攪拌30分鐘，并且隨后在室溫過(guò)夜，用1N氫氯酸溶液酸化，并用2×300mL乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用3×50mL的1N氫氯酸洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。殘余物重溶解在40mL無(wú)水二甲基甲酰胺和95mmol固體碳酸氫鈉中，并添加112mmol碘甲烷，并將混合物在室溫于氮?dú)庀聰嚢柚敝罤PLC顯示反應(yīng)結(jié)束；溶液隨后用200mL乙醚稀釋，并用2×100mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。產(chǎn)物(8)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成將二氯甲烷中的40mL50％三氟乙酸中36mmol(8)的溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并且隨后傾倒在200mL飽和碳酸氫鈉溶液內(nèi)。使各層分開，并且將有機(jī)層濃縮。殘余物重溶解在100mL乙酸乙酯中，并用2×50mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。殘余物溶解在100mL乙醇中，并且添加5g的10％鈀碳和35mL的1N氫氯酸溶液，并將混合物在室溫及常壓下氫化直至HPLC顯示反應(yīng)結(jié)束；溶液隨后經(jīng)硅藻土過(guò)濾并濃縮。殘余物重溶解在80mL乙酸乙酯中，添加在30mL水中的70mmol碳酸氫鈉，并且混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。除去乙酸乙酯并添加100mL四氫呋喃，隨后添加178mmol固體碳酸氫鈉和43mmol芴甲氧羰酰氯，并且將混合物攪拌直至HPLC顯示反應(yīng)結(jié)束，用300mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分開。有機(jī)層用2×50mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。產(chǎn)物(6)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成化合物(7)如方法A中所述那樣制備。
用于制備適用于具有或沒有官能化R側(cè)鏈的化合物的哌嗪酮支架的一般常見合成方法(方法C、E、F) 方法C(2-Fmoc-氨基-3-R′-O-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(10)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基酯(2)使Fmoc O-保護(hù)的絲氨醛(9)還原氨化而制備。還原氨化所需要的Fmoc O-保護(hù)的絲氨醛(9)根據(jù)方法D通過(guò)用二-異丁基氫化鋁還原酯(12)，通過(guò)用Dess-Martin高價(jià)碘化合物氧化Fmoc O-保護(hù)的絲氨醇(13)或通過(guò)用氫化鋰鋁還原Fmoc O-保護(hù)的絲氨酸Weinreb酰胺(14)而制備。用于制備Fmoc O-保護(hù)的絲氨醛(9)的優(yōu)選方法是Weinreb酰胺類似物還原法。(2-Fmoc-氨基-3-R′-O-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(10)隨后進(jìn)行N和O脫保護(hù)、環(huán)化和Fmoc保護(hù)以產(chǎn)生3-取代的6-羥甲基-哌嗪-2-酮(6)，后者隨后氧化成如方法A中所述的終產(chǎn)物。
合成中所用在Fmoc-O-保護(hù)的絲氨醛(9)的羥基上的保護(hù)基團(tuán)(R′)取決于氨基酯的側(cè)鏈R的性質(zhì)。當(dāng)R不含官能團(tuán)時(shí)，將Fmoc絲氨酸的側(cè)鏈保護(hù)為tBu醚。當(dāng)R含有官能團(tuán)時(shí)，將Fmoc絲氨酸的側(cè)鏈保護(hù)為三苯甲基醚。
方法C
方法D
方法D多種Fmoc-O-保護(hù)的絲氨醛(9)的合成。Fmoc-O-R’絲氨酸甲基酯(12)的合成將保持在氮?dú)庀碌脑?0mL無(wú)水二甲基甲酰胺中的80mmolFmoc O-R’絲氨酸(11)、10.0g(120mmol)固體碳酸氫鈉和10.0mL(160mmol)碘甲烷的輕度混懸液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。反應(yīng)混合物隨后傾倒在500mL水上，并濾出固體。將該固體重溶解在800mL乙酸乙酯中，并用1×200mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。無(wú)需純化。
Fmoc-O-R′絲氨醇(13)的合成向保持在-20℃于氮?dú)庀碌脑?0mL無(wú)水四氫呋喃中的10.0mmol Fmoc O-R′絲氨酸(11)的溶液添加1.77mL(12.7mmol)三乙胺，隨后緩慢添加1.57mL(12.0mmol)氯甲酸異丁酯。混合物攪拌30分鐘，并且隨后緩慢地傾倒在10mL水中的3.77g(99.6mmol)硼氫化鈉的冰冷溶液上，維持溫度低于5℃。反應(yīng)在0℃攪拌15分鐘，并且隨后用1N氫氯酸溶液猝滅。反應(yīng)混合物用100mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分開。有機(jī)層用2×25mL 1N氫氯酸溶液、2×25mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。化合物通過(guò)硅膠柱層析法純化。
Fmoc-O-R′絲氨酸Weinreb酰胺(14)的合成在80mL無(wú)水二氯甲烷中的20.2mmol Fmoc O-R′絲氨酸(11)、6.98g(21.6mmol)2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和2.5mL(22.7mmol)N-甲基-嗎啉的混懸液在室溫于氮?dú)庀聰嚢?0分鐘，并且隨后添加3.02g(31mmol)N，O-二-甲基-羥胺鹽酸鹽和3.3mL(30mmol)N-甲基-嗎啉，并且該混懸液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將形成的溶液隨后濃縮至干燥，在200mL乙酸乙酯與100mL水之間再分配，用2×40mL 1N氫氯酸溶液并且隨后用2×40mL飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。無(wú)需純化。
從酯(12)合成Fmoc-O-R′絲氨醛(9)向保持在-78℃于氮?dú)庀碌脑?mL四氫呋喃中的3.5mmol(12)的溶液緩慢添加10mL 1N二異丁基氫化鋁(DIBAL)溶液，攪拌15分鐘并通過(guò)緩慢添加酒石酸鉀鈉飽和溶液被猝滅。將反應(yīng)升溫至室溫，用50mL乙酸乙酯稀釋，并且添加50mL酒石酸鉀鈉飽和溶液。使各層分開，并且水層用1×50mL乙酸乙酯再萃取。將有機(jī)層合并，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮?；衔?9)用于以下步驟中，無(wú)需進(jìn)一步純化。
從醇(13)合成Fmoc-O-R′絲氨醛(9)向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?00mL無(wú)水二氯甲烷中的80mmol Fmoc-O-R’絲氨醇(13)的溶液添加88mmolDess-Martin高價(jià)碘化合物，并且反應(yīng)攪拌2.5小時(shí)并通過(guò)添加400mL10％硫代硫酸鈉水溶液被猝滅。使各層分開，并且將有機(jī)層濃縮，用300mL乙醚稀釋并用含有10％硫代硫酸鈉的飽和碳酸氫鹽水溶液洗滌三次，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。
從Weinreb酰胺(14)合成Fmoc-O-R′絲氨醛(9)向冷卻至-78℃于氮?dú)庀碌脑?0mL無(wú)水四氫呋喃中的8.8g(20.2mmol)粗制Fmoc-O-R′絲氨酸Weinreb酰胺中間體(14)的溶液添加四氫呋喃中的30mL 1N氫化鋰鋁溶液。將溶液攪拌15分鐘并且隨后通過(guò)緩慢添加30mL 1.4N硫酸氫鉀溶液被猝滅。升溫至室溫后，濾除固體并濃縮濾液至干燥。殘余物在50mL乙酸乙酯與25mL1N氫氯酸溶液之間再分配。使各層分開，并且有機(jī)層經(jīng)硫酸鎂干燥，過(guò)濾，并濃縮。
(2-Fmoc-氨基-3-R′-O-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(10)的合成化合物(10)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，通過(guò)還原氨化法制備。
氰基硼氫化鈉法向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?0mL甲醇中的8.5mmol(2)氫氯酸鹽的溶液添加2.3mmol固體氫氧化鉀，并將混合物攪拌25分鐘。添加在10mL甲醇中的Fmoc-O-R′絲氨醛(9)溶液至上述混懸液中，并且將反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)。緩慢添加在四氫呋喃中的8.5mL 1N氰基硼氫化鈉溶液，并將反應(yīng)攪拌另外1小時(shí)，過(guò)濾并濃縮。殘余物在水與乙酸乙酯之間分配，并且有機(jī)層用1×20mL飽和碳酸氫鈉洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮。
三乙酰氧基硼氫化鈉法在50mL無(wú)水四氫呋喃中的21mmol(2)氫氯酸鹽與2.9mL(21mmol)三乙胺的混懸液在室溫?cái)嚢?5分鐘，并且隨后添加在30mL四氫呋喃中的約20mmol粗制Fmoc-(O-R′)-絲氨醛(9)的溶液，隨后添加1.7g的4A粉末狀分子篩，并將此混懸液攪拌另外2小時(shí)。添加6.4g(30mmol)固體三乙酰氧基硼氫化鈉并將此混懸液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜?；鞈乙河眉状枷♂?，用分子篩過(guò)濾，并濃縮濾液。殘余物在100mL乙酸乙酯與50mL水之間分配。有機(jī)層經(jīng)硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并濃縮。
化合物(10)通過(guò)硅膠柱層析法純化。



4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成為制備化合物(6)，需要三個(gè)步驟(a)Fmoc脫保護(hù)，同時(shí)伴隨環(huán)化、(b)Fmoc保護(hù)和(c)羥基脫保護(hù)。
除去Fmoc基團(tuán)及環(huán)化將30mL乙酸乙酯溶液中30％二乙胺中的10mmol環(huán)狀化合物的溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜并隨后濃縮至干燥。
(a)Fmoc保護(hù)向在20mL四氫呋喃和10mL水中的10mmol化合物的雙相溶液添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉，隨后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl?；旌衔飻嚢?小時(shí)，用乙酸乙酯稀釋，使各層分開，并且有機(jī)層用水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。
(b)羥基脫保護(hù)對(duì)于含有tBu醚保護(hù)基團(tuán)的化合物化合物用在二氯甲烷中的90％三氟乙酸的溶液脫保護(hù)1-2小時(shí)，并隨后濃縮至干燥。殘余物溶解在乙酸乙酯中并用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并隨后濃縮。對(duì)于含有Trt醚保護(hù)基團(tuán)的化合物化合物通過(guò)添加在含有2-10％三異丙基硅烷的二氯甲烷中的1-10％三氟乙酸的溶液加以脫保護(hù)。反應(yīng)是瞬時(shí)作用的。溶液隨后通過(guò)傾入飽和碳酸氫鈉溶液進(jìn)行中和。使各層分開，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮。
化合物(6)通過(guò)硅膠柱層析法純化。


4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成化合物(7)如方法A中所述那樣制備?；衔?7)通過(guò)硅膠柱層析法純化。


方法E2-Fmoc-氨基-3-羥丙基-Cbz-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(15)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α氨基酯(2)使Fmoc絲氨醛(OR′)(9)還原氨化而制備。仲胺用氯甲酸芐酯保護(hù)，并且隨后羥基用三氟乙酸溶液脫保護(hù)?；衔?15)隨后進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)。氨基酯中間體立即環(huán)化以形成4-Cbz-3-取代的6-羥甲基-哌嗪-2-酮(16)。Fmoc3-取代的6-羥甲基-哌嗪-2-酮(6)通過(guò)保護(hù)基團(tuán)交換而制備，并且隨后被氧化成如方法A中所述的預(yù)期產(chǎn)物(7)。
方法E
(2-Fmoc-氨基-3-羥丙基-Cbz-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(15)的合成67mmol氫氯酸氨基酯(2)和在80mL甲醇中的20.9mmol固體氫氧化鉀的混懸液在室溫?cái)嚢?5分鐘，并且隨后添加至在250mL甲醇中的(9)的混懸液內(nèi)。反應(yīng)混合物攪拌1.5小時(shí)，隨后緩慢添加在四氫呋喃中的70mL1N氰基硼氫化鈉的溶液。反應(yīng)攪拌過(guò)夜并且隨后濃縮。殘余物在300mL四氫呋喃與50mL1N氫氯酸溶液之間分配。使各層分開，并且有機(jī)層用在50mL水中的239mmol碳酸氫鈉的溶液中和，并且隨后緩慢添加66mmol氯甲酸芐酯，并且將反應(yīng)攪拌3小時(shí)，用200mL乙酸乙酯稀釋并使各層分開。有機(jī)層經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。殘余物溶解在二氯甲烷內(nèi)的三氟乙酸的溶液中并在室溫?cái)嚢?小時(shí)。將溶液傾倒在200mL飽和碳酸氫鈉溶液上。使各層分開，并且有機(jī)層經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮?；衔?15)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

4-Cbz-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(16)的合成在乙酸乙酯中的100mL30％二乙胺中的24mmol(15)的溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，并隨后濃縮至干燥?；衔锿ㄟ^(guò)硅膠柱層析法純化
4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成在50mL乙醇中的15mmol(16)和1.8g 10％鈀碳的混懸液在室溫及常壓下氫化直至HPLC顯示反應(yīng)結(jié)束?；旌衔镫S后經(jīng)硅藻土過(guò)濾，濃縮，并且殘余物溶解在35mL四氫呋喃和10mL水中，并且隨后添加62mmol固體碳酸氫鈉，隨后添加16mmol Fmoc-Cl，并且將混合物攪拌3小時(shí)，用100mL乙酸乙酯和10mL水稀釋。使各層分開，并且有機(jī)層經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮?；衔?6)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成化合物(7)如方法A中所述那樣制備并通過(guò)硅膠柱層析法純化。

方法F(2-Cbz-氨基-3-芐氧基-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(20)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基酯(2)使Cbz絲氨醛(OBn)(19)還原氨化而制備。對(duì)于還原氨化所需要的Cbz O-芐基絲氨醛(19)通過(guò)用Dess-Martin高價(jià)碘化合物氧化Cbz絲氨醇(OBn)(18)而制備。(20)的氫化及隨后環(huán)化產(chǎn)生了3-取代的6-羥甲基-哌嗪-2-酮，后者隨后經(jīng)Fmoc保護(hù)成為4-Fmoc-3-取代的6-羥甲基-哌嗪-2-酮(6)。終產(chǎn)物(7)如方法A中所述而獲得。
方法F

Cbz-絲氨醇(OBn)(18)的合成化合物(18)如對(duì)化合物(13)所述那樣制備?；衔?18)在硅膠柱層析純化后以79％產(chǎn)率獲得。1HNMR δ(CDCl3)3.57-3.74(兩個(gè)m，3H，CHN，和CH2O)，3.76-3.96(兩個(gè)m，2H，CH2O)，4.50(s，2H，CH2O)，5.10(s，2H，CH2O)，5.40-5.50(br.d，1H，NH)，7.22-7.38(m，10H，Ph)；HPLC tR＝5.33min，(M++Na+)＝337.64。
Cbz絲氨醛(OBn)(19)的合成化合物(19)如對(duì)化合物(9)所述那樣制備。向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?00mL無(wú)水二氯甲烷中的80mmol Cbz-O-Bn絲氨醇(18)的溶液添加88mmol Dess-Martin高價(jià)碘化合物，并且反應(yīng)攪拌2.5小時(shí)，并隨后通過(guò)添加400mL 10％硫代硫酸鈉水溶液被猝滅。使各層分開，并且將有機(jī)層濃縮，用300mL乙醚稀釋并用含有10％硫代硫酸鈉的飽和碳酸氫鹽水溶液洗滌三次，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮?；衔?19)以99％粗產(chǎn)率獲得并且無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用。1H NMR δ(CDCl3)3.69-3.78(dd，1H，CH2O)，3.99-4.06(dd，1H，CH2O)，4.37-4.46(m，1H，CHN)，4.47-4.52(d，2H，CH2O)，5.14(s，2H，CH2O)，5.65-5.75(br.d，1H，NH)，7.14-7.48(一系列m，9H，Ph)，7.98-8.08(dd，1H，Ph)，9.63(s，1H，CHO)。
(2-Cbz-氨基-3-芐氧基-丙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(20)的合成化合物(20)如對(duì)化合物(10)所述那樣制備，不過(guò)使用Cbz絲氨醛(19)作為醛?；衔?20)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(6)的合成將160mL乙醇中的38mmol(20)、38mL1N氫氯酸和20g10％鈀碳的混懸液在室溫及常壓下氫化直至HPLC顯示反應(yīng)結(jié)束?；旌衔镫S后經(jīng)硅藻土過(guò)濾并濃縮至干燥。殘余物用75mL四氫呋喃稀釋并用飽和碳酸氫鈉溶液中和。添加106mmol固體碳酸氫鈉和53mmol芴甲氧羰酰氯，并且反應(yīng)在室溫?cái)嚢柚敝罤PLC顯示反應(yīng)結(jié)束，用300mL乙酸乙酯和300mL鹽水稀釋。使各層分開，并且有機(jī)層用鹽水洗滌兩次，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。產(chǎn)物(6)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
4-Fmoc-5-取代-δ-氧代-哌嗪-2-羧酸(7)的合成化合物(7)如方法A中所述那樣制備。
模擬無(wú)官能化側(cè)鏈的氨基酸的2，2-雙取代哌嗪酮支架的合成(方法G) 使用方法G實(shí)施模擬無(wú)官能化側(cè)鏈的氨基酸的4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸支架的合成。2-Boc-氨基-3-甲氧羰基-1-取代-甲基氨基-2-甲基-丙酸叔丁基酯(23)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基酯(2)使2-Boc-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸甲基酯(22)還原氨化而制備。對(duì)于還原氨化所需要的化合物(22)通過(guò)用Dess-Martin高價(jià)碘化合物氧化α-甲基-Boc絲氨酸叔丁基酯(21)而獲得。用二噁烷中的2N氯化氫除去(23)的Boc基團(tuán)，并且將氨基酯環(huán)化成非保護(hù)的5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸叔丁基酯(24)，后者用芴甲氧羰酰氯保護(hù)以產(chǎn)生4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸叔丁基酯，其用三氟乙酸脫保護(hù)以產(chǎn)生終產(chǎn)物(25)。
方法G
2-Boc-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸叔丁基酯(22)的合成Boc α-甲基絲氨酸叔丁基酯(21)的氧化使用如前所述的Dess-Martin高價(jià)碘化合物進(jìn)行，以96％粗產(chǎn)率產(chǎn)生目的產(chǎn)物(22)。該化合物用于下一步驟中，無(wú)需進(jìn)一步純化。1H NMR δ(CDCl3)1.44(s，18H，tBu)，1.46(s，3H，CH3)，5.63-5.70(br.s，1H，NH)，9.5(s，1H，CHO)。
2-Boc-氨基-3-甲氧羰基-1-取代-甲基氨基-2-甲基-丙酸叔丁基酯(23)的合成使用與對(duì)化合物(10)所述方法相似的方法制備化合物(23)，不過(guò)使用化合物(22)作為醛?；衔?23)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

2-甲基-6-氧代-5-取代-哌嗪-2-羧酸(25)的合成二噁烷中的8mL 2N氯化氫的4mmol(23)的溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并隨后濃縮至干燥。殘余物在20mL四氫呋喃中懸浮，用10mmol三乙胺中和，并在60℃攪拌2日。隨后將殘余物濃縮至干燥，在20mL四氫呋喃和10mL水中重懸，添加固體碳酸氫鈉以調(diào)節(jié)pH至堿性，隨后添加5.6mmol固體芴甲氧羰酰氯，并將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，用1N氫氯酸溶液調(diào)節(jié)pH，用100mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分開。有機(jī)層用2×100mL鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。殘余物溶解在二氯甲烷內(nèi)的10mL 50％三氟乙酸中，并且將溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)。濃縮溶劑，并且產(chǎn)物(25)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

模擬具有官能化側(cè)鏈的氨基酸的2，2-雙取代哌嗪酮支架的合成(方法H) 使用方法H實(shí)施模擬具有官能化側(cè)鏈的氨基酸的4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸支架的合成。2-烯丙氧羰基-氨基-3-(甲氧羰基-1-取代-甲基氨基-2-甲基-丙酸甲基酯(30)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基烯丙基酯(29)使2-烯丙氧羰基-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸甲基酯(28)還原氨化，隨后用氯甲酸芐酯保護(hù)仲胺而制備。對(duì)于還原氨化所需要的化合物(28)通過(guò)用Dess-Martin高價(jià)碘化合物氧化(27)而獲得。類似物(30)的烯丙基酯和烯丙氧羰基使用四(三苯膦)鈀(O)予以除去，并且氨基酸通過(guò)與肽偶聯(lián)試劑反應(yīng)被環(huán)化以產(chǎn)生5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸甲基酯(31)。4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-甲基-2-羧酸(25)通過(guò)使甲基酯皂化，隨后交換保護(hù)基團(tuán)而獲得。
方法H
烯丙氧羰基α-甲基絲氨酸甲基酯(27)的合成將保持于氮?dú)庀碌脑?mL無(wú)水二甲基甲酰胺中的8mmol Boc α-甲基絲氨酸(26)、1.0g(12mmol)固體碳酸氫鈉和1.0mL(16mmol)碘甲烷的溶液攪拌過(guò)夜。反應(yīng)混合物隨后傾倒在50mL水上并用50mL二乙醚萃取，并用1×20mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。殘余物溶解在二氯甲烷中的20mL 90％三氟乙酸中，并且溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并隨后濃縮至干燥。殘余物溶解在35mL四氫呋喃和10mL水中，隨后添加30mmol固體碳酸氫鈉，并且緩慢添加12mmol氯甲酸烯丙酯?；旌衔镌谑覝?cái)嚢?小時(shí)，用50mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分開。有機(jī)層隨后用1×10mL飽和碳酸氫鈉和1×10ml的1N氫氯酸和1×10mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮?；衔?27)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
2-烯丙氧羰基-氨基-2-甲基-3-氧代-丙酸甲基酯(28)的合成使用如上所述的Dess-Martin高價(jià)碘化合物進(jìn)行烯丙氧羰基α-甲基絲氨酸甲基酯(27)的氧化以產(chǎn)生目的產(chǎn)物(28)。
2-烯丙氧羰基-氨基-3-甲氧羰基-1-取代-甲基-Cbz-氨基-2-甲基-丙酸烯丙基酯(30)的合成化合物(30)使用與對(duì)化合物(15)所述方法相似的方法而制備，不過(guò)使用化合物(28)作為醛。
4-Cbz-2-甲基-6-氧代-5-取代-哌嗪-2-羧酸甲基酯(31)的合成向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?0mL二氯甲烷中的10mmol化合物(30)的溶液添加2當(dāng)量苯基硅烷和0.3當(dāng)量四(三苯基膦)鈀(O)，并且溶液攪拌2小時(shí)，并隨后添加11mmol TBTU和14mmol N-甲基-嗎啉，并且溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并隨后濃縮至干燥。
4-Fmoc-2-甲基-6-氧代-5-取代-哌嗪-2-羧酸(25)的合成向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?5mL甲醇中的10mmol化合物(31)的溶液緩慢添加11mmol1N氫氧化鈉溶液，并且反應(yīng)在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，用21mL 1N氫氯酸溶液中和，添加1g 10％鈀碳，并且混懸液在室溫及常壓下氫化3小時(shí)?；鞈乙航?jīng)硅藻土過(guò)濾并濃縮。殘余物重溶解在25mL四氫呋喃和10mL水中，隨后添加30mmol固體碳酸氫鈉和10mmol芴甲氧羰酰氯，并且反應(yīng)在室溫于氮?dú)庀聰嚢?小時(shí)。隨后將反應(yīng)用50mL乙酸乙酯稀釋并用1N氫氯酸溶液酸化。隨后使各層分開并且有機(jī)層用1×20mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮?；衔?25)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸支架的合成(方法I、J、K) 通過(guò)幾種方法實(shí)施(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸支架的合成 方法I(叔丁基3-保護(hù)-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(35)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基酯(2)使叔丁基3-保護(hù)-氨基-4-氧代-丁酸酯(34)還原氨化而制備。對(duì)于還原氨化所需要的叔丁基3-保護(hù)-氨基-4-氧代-丁酸酯(34)通過(guò)氫化鋰鋁(LAH)使Weinreb酰胺衍生物(33)還原而制備。叔丁基(3-保護(hù)-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯類似物(35)隨后進(jìn)行脫保護(hù)、環(huán)化和Fmoc保護(hù)以產(chǎn)生叔丁基(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸酯(36)，后者隨后脫保護(hù)以產(chǎn)生終產(chǎn)物(37)。
方法I
氨基保護(hù)的Asp-(OtBu)Weinreb酰胺(33)的合成化合物(33)使用與對(duì)化合物(14)所述方法相似的方法而制備。
叔丁基3-氨基保護(hù)的-氨基-4-氧代-丁酸酯(34)的合成化合物(34)使用與對(duì)化合物(9)所述方法相似的方法而制備 叔丁基3-保護(hù)-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(35)的合成化合物(35)使用與對(duì)化合物(10)所述方法相似的方法而制備，不過(guò)使用化合物(34)作為醛。

叔丁基(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸酯(36)的合成對(duì)于含有Fmoc氨基保護(hù)基團(tuán)的化合物，將在30mL乙酸乙酯溶液中的30％二乙胺中的10mmol化合物(35)的溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，并隨后濃縮至干燥。對(duì)于含有Cbz氨基保護(hù)基團(tuán)的化合物，將30mL乙醇中的10mmol化合物(35)的溶液在室溫及常壓下氫化2小時(shí)，經(jīng)硅藻土過(guò)濾并濃縮至干燥。為進(jìn)行Fmoc保護(hù)，殘余物溶解在20mL四氫呋喃中和10mL水中并添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉，隨后添加3.3g(13mmol)Fmoc-Cl。將混合物攪拌3小時(shí)并用乙酸乙酯稀釋。使各層分開并且有機(jī)層用水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮?；衔?36)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸酯(37)的合成對(duì)化合物(36)用二氯甲烷中的90％三氟乙酸溶液脫保護(hù)持續(xù)3小時(shí)，并隨后濃縮至干燥。終產(chǎn)物(37)通過(guò)硅膠柱層析法純化。

方法J二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(41)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基酯(2)使二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-氧代-丁酸酯(40)還原氨化而制備。對(duì)于還原氨化所需要的二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-氧代-丁酸酯(40)通過(guò)氫化鋰鋁還原Weinreb酰胺衍生物(39)而制備，其中Weinreb酰胺衍生物(39)通過(guò)在Mitsunobu條件下保護(hù)β-酯而從市售的Fmoc-天冬氨酸α-烯丙基酯衍生物(38)中形成。使用鈀(O)催化劑除去烯丙基酯，隨后使用TBTU作為偶聯(lián)劑形成Weinreb酰胺。隨后二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(41)經(jīng)Fmoc脫保護(hù)、環(huán)化、通過(guò)氫化除去二苯基甲基酯，隨后進(jìn)行Fmoc保護(hù)以產(chǎn)生終產(chǎn)物(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸(37)。
方法J
Fmoc-Asp-(OCHPh2)Weinreb酰胺(39)的合成向保持在0℃于氮?dú)庀碌脑?0mL無(wú)水四氫呋喃中的5.1g(13.0mmol)Fmoc-天冬氨酸α-烯丙基酯(38)的溶液緩慢添加2.6mL(13.4mmol)偶氮二甲酸二異丙酯，其中所述的溶液含有3.4g(13mmol)三苯基膦和2.41g(13.1mmol)二苯基甲醇。撤去冰浴，并且反應(yīng)在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，濃縮至干燥并且隨后通過(guò)硅膠柱層析法純化。1H NMR δ(CDCl3)2.96-3.06(dd，1H，CH2CO)，3.15-3.26(dd，1H，CH2CO)，4.18-4.76(一系列m，3H，CH，CH2)，5.14-5.32(m，1H，CHN)，5.76-5.86(m，1H，CHO)，7.20-7.80(一系列m，18H，富烯，和Ph)；HPLCtR＝7.68分鐘，(M++Na+)＝583.90。
該產(chǎn)物(9.8mmol)隨后溶解在含有1.5g(1.3mmol)四(三苯基膦)鈀(O)的40mL二氯甲烷:乙酸:N-甲基嗎啉37:2:1的溶液中，并且溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，濃縮至干燥并在100mL乙酸乙酯和30mL水之間分配。使各層分開，并且有機(jī)層用1×50mL水洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮。殘余物懸浮在20mL無(wú)水二氯甲烷中，并添加1.65mL(15mmol)N-甲基嗎啉和4.07g(12.7mmol)TBTU，并且混懸液在室溫?cái)嚢?0分鐘，隨后添加1.65mL(15mmol)N-甲基嗎啉和1.52g(15.6mmol)N，O-二甲基羥胺氫氯酸鹽?；鞈乙涸谑覝?cái)嚢?小時(shí)，濃縮，在100mL乙酸乙酯與50mL水之間分配。有機(jī)層用1×30mL水、1×30mL飽和碳酸氫鈉溶液和1×30mL 1N氫氯酸溶液洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮。產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱層析法純化。1H NMR δ(CDCl3)2.76-2.88(dd，1H，CH2CO)，2.89-3.00(dd，1H，CH2CO)，3.16(s，3H，CH3N)，3.70(s，3H，CH3O)，4.14-4.22(dd，1H，CH)，4.28-4.40(t，2H，CH2)，5.07-5.16(dd，1H，CHN)，5.69-5.76(d，1H，CHO)，7.24-7.8(一系列m，18H，富烯，和Ph)；HPLC tR＝7.08，(M++Na+)＝587.03. 二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-氧代-丁酸酯(40)的合成化合物(40)使用與對(duì)化合物(9)所述方法相似的方法而制備。
二苯基甲基3-Fmoc-氨基-4-(甲氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(41)的合成化合物(41)使用與對(duì)化合物(10)所述方法相似的方法而制備，不過(guò)使用化合物(40)作為醛。

(4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸(37)的合成將在30mL乙酸乙酯中的30％二乙胺中的10mmol化合物(41)的溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)。該溶液隨后濃縮至干燥，重溶解在2×30mL乙酸乙酯中并再濃縮。殘余物溶解在50mL乙醇和20mL1N氫氯酸溶液中，并且在室溫及常壓下氫化過(guò)夜，經(jīng)硅藻土過(guò)濾并濃縮至干燥。殘余物溶解在20mL四氫呋喃和10mL水中，并添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉，隨后添加3.3g(13mmol)Fmoc-Cl?；旌衔飻嚢?小時(shí)，用100mL乙酸乙酯稀釋，使層分離并且有機(jī)層用2×50mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱層析法純化。

方法K從市售Fmoc-天冬氨酸α叔丁基酯(42)開始進(jìn)行(5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基)-乙酸支架的合成。Fmoc-天冬氨酸α叔丁基酯通過(guò)混合酐用硼氫化鈉還原成Fmoc-高絲氨酸α叔丁基酯，隨后用溴化芐保護(hù)醇，以產(chǎn)生Fmoc-高絲氨酸二芐醚α叔丁基酯(43)。隨后用三氟乙酸除去叔丁基酯，并且將酸用硼氫化鈉通過(guò)混合酐法還原成醇，以產(chǎn)生2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-1-丁醇(44)。醇(44)隨后使用如前所述的Dess-Martin高價(jià)碘化合物轉(zhuǎn)化成2-Fmoc-氨基-4-芐氧基丁醛(45)。2-Fmoc-氨基-4-芐氧基丁醛(45)和α-氨基酯(2)的還原氨化產(chǎn)生了(2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-丁基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(46)。用二乙胺的Fmoc脫保護(hù)產(chǎn)生了自發(fā)環(huán)化成6-芐氧乙基-3-取代-哌嗪-2-酮的游離伯胺。通過(guò)氫化作用除去二芐醚，并且將仲胺作為其Fmoc衍生物加以保護(hù)，以產(chǎn)生4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(47)。最后，將伯醇氧化成酸，以如方法A中所述產(chǎn)生終產(chǎn)物(48)。
方法K
Fmoc-高絲氨酸(OBn)α叔丁基酯(43)的合成向保持在-20℃于氮?dú)庀碌脑?0mL無(wú)水四氫呋喃中的10.0mmol Fmoc Asp-OtBu(42)的溶液添加1.77mL(12.7mmol)三乙胺，隨后緩慢添加1.57mL(12.0mmol)氯甲酸異丁酯。將混合物攪拌30分鐘并且隨后緩慢傾倒在10mL水中的3.77g(99.6mmol)硼氫化鈉的冰冷溶液上，維持溫度低于5℃。反應(yīng)在0℃攪拌15分鐘，并且隨后用1N氫氯酸溶液猝滅。反應(yīng)混合物用100mL乙酸乙酯稀釋并使各層分開。有機(jī)層用2×25mL 1N氫氯酸溶液，2×25mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮，并且通過(guò)硅膠柱層析法純化。純化的化合物隨后溶解在30mL四氫呋喃中，并添加礦物油中的12mmol 60％氫化鈉分散體，隨后添加0.2mmol四丁基碘化銨和12mmol溴化芐，并且混合物攪拌過(guò)夜，用50mL飽和碳酸氫鈉水溶液猝滅，并用100mL乙酸乙酯萃取?；衔镫S后通過(guò)硅膠柱層析法純化。
2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-1-丁醇(44)的合成如對(duì)方法I中化合物(37)所述，使用90％三氟乙酸對(duì)叔丁基酯脫保護(hù)，隨后將酸如對(duì)化合物(13)所述通過(guò)混合酐中間體用硼氫化鈉還原成所述醇。
2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-丁醛(45)的合成如對(duì)(9)合成所述，使用Dess-Martin高價(jià)碘化合物將2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-1-丁醇(44)氧化成所述醛。
(2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-丁基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(46)的合成如對(duì)(10)合成所述，使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基酯(2)使2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-丁醛(45)還原氨化。
4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(47)的合成以伴隨環(huán)化對(duì)(2-Fmoc-氨基-4-芐氧基-丁基氨基)-2-取代乙酸甲基酯(46)進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)，隨后如對(duì)方法中化合物(37)所述進(jìn)行去芐化作用和Fmoc再保護(hù)。
4-Fmoc-5-取代-6-氧代-哌嗪-2-基-乙酸(37)的合成如方法A中所述將4-Fmoc-6-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(47)氧化成所述的酸。所用酸的選擇基于5-位的基團(tuán)的性質(zhì)。
2-取代的3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸支架的合成(方法L、M、N) 使用幾種方法進(jìn)行2-取代的3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸支架的合成。
方法L叔丁基2-Cbz-氨基-4-(芐氧羰基-取代-甲基-Boc氨基)-丁酸酯(52)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以氨基酯(51)使叔丁基Cbz-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(50)還原氨化，隨后進(jìn)行仲胺的Boc保護(hù)而制備。對(duì)于還原氨化所需要的叔丁基Cbz-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(50)通過(guò)氫化鋰鋁還原Weinreb酰胺衍生物(49)而制備。二氮雜卓環(huán)通過(guò)除去保護(hù)基團(tuán)形成，隨后與肽形成試劑環(huán)化以產(chǎn)生(53)。最后，4-Fmoc-2-取代的3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸(54)通過(guò)保護(hù)基團(tuán)交換而形成。
方法L
Cbz-Asp-(Weinreb酰胺)-OtBu(49)的合成化合物(49)使用與對(duì)化合物(14)所述方法相似的方法而制備。
叔丁基3-Cbz-氨基-4-氧代-丁酸酯(50)的合成化合物(50)使用與對(duì)化合物(9)所述方法相似的方法而制備。
叔丁基2-Cbz-氨基-4-(芐氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(52)的合成還原氨化用與對(duì)化合物(10)所述方法相似的方法進(jìn)行。仲胺通過(guò)粗制混合物與在四氫呋喃中的2當(dāng)量Boc二碳酸酯反應(yīng)而得以保護(hù)。
叔丁基1-Boc2-取代-3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸酯(53)的合成在30mL乙醇中的10mmol化合物(52)的溶液在室溫及常壓下氫化2小時(shí)，經(jīng)硅藻土過(guò)濾并濃縮至干燥。殘余物溶解在100mL二氯甲烷和1.2當(dāng)量TBTU中并且添加2.6當(dāng)量N-甲基-嗎啉。溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，并且隨后濃縮。殘余物在50mL乙酸乙酯與25mL 1N氫氯酸溶液之間分配，用1×20mL飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。
1-Fmoc 2-取代-3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸(54)的合成在10mL二氯甲烷中的90％三氟乙酸中的10mmol化合物(53)的溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并且隨后將溶液濃縮至干燥。殘余物溶解在20mL四氫呋喃和10mL水中，并且添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉，隨后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl。將混合物攪拌3小時(shí)并且隨后用乙酸乙酯稀釋。使各層分開并且有機(jī)層用2×50mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。
方法M還原的二肽類似物(60)通過(guò)使用氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以氨基酯(29)使二苯基甲基烯丙氧羰基-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(59)還原氨化，隨后進(jìn)行仲胺的Cbz保護(hù)而制備。對(duì)于還原氨化所需要的二苯基甲基烯丙氧羰基-2-氨基-4-氧代-丁酸酯(59)通過(guò)氫化鋰鋁還原Weinreb酰胺衍生物(58)而制備，其中Weinreb酰胺衍生物(58)通過(guò)Weinreb酰胺衍生物(57)的保護(hù)基團(tuán)交換而制備。二氮雜卓環(huán)隨后通過(guò)除去烯丙基和烯丙氧羰基，隨后在肽形成試劑存在下的環(huán)閉合而形成。2-取代的3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸支架(54)通過(guò)保護(hù)基團(tuán)交換而形成。
方法M
Fmoc-Asp-(Weinreb酰胺)-CHPh2(57)的合成化合物(57)使用與對(duì)化合物(39)所述方法相似的方法而制備。
烯丙氧羰基-Asp-(Weinreb酰胺)-OCHPh2(58)的合成將20mL乙酸乙酯中的30％二乙胺中的10mmol化合物(56)的溶液攪拌2小時(shí)并濃縮至干燥。殘余物溶解在20mL四氫呋喃和10mL水中，并添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉，隨后添加13mmol烯丙氧羰基-Cl。混合物攪拌3小時(shí)，并且隨后用乙酸乙酯稀釋。使各層分開，并且有機(jī)層用水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮?；衔?58)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
二苯基甲基3-烯丙氧羰基-氨基-4-氧代-丁酸酯(59)的合成化合物(59)使用與對(duì)化合物(9)所述方法相似的方法而制備。
二苯基甲基2-烯丙氧羰基-氨基-4-(烯丙氧羰基-取代-甲基氨基)-丁酸酯(60)的合成化合物(60)通過(guò)還原氨化，使用與對(duì)化合物(15)所述方法相似的方法而制備，不過(guò)使用化合物(59)作為醛。產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱層析法純化。
二苯基甲基1-Cbz 2-取代-3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸酯(61)的合成向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?0mL二氯甲烷中的10mmol化合物(60)的溶液添加2當(dāng)量苯基硅烷和0.3當(dāng)量四(三苯基膦)鈀(O)，并且溶液攪拌2小時(shí)，并且隨后添加1.2當(dāng)量TBTU和1.3當(dāng)量N-甲基-嗎啉。溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜并濃縮。殘余物在50mL乙酸乙酯與25mL 1N氫氯酸溶液之間分配，用1×20mL飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。
1-Fmoc 2-取代-3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸(54)的合成將30mL乙醇中的10mmol化合物(61)的溶液在室溫氫化2小時(shí)，經(jīng)硅藻土過(guò)濾，并隨后將溶液濃縮至干燥。殘余物溶解在20mL四氫呋喃和10mL水中，并添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉，隨后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl?；旌衔飻嚢?小時(shí)并隨后用乙酸乙酯稀釋。使各層分開并且有機(jī)層用水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。
方法NFmoc-天冬氨酸β叔丁基酯通過(guò)混合酐用硼氫化鈉還原成Fmoc-天冬氨醇(Aspartanol)β叔丁基酯(63)，隨后用烯丙基溴保護(hù)該醇以產(chǎn)生Fmoc-天冬氨醇烯丙基醚β叔丁基酯(64)。隨后用三氟乙酸除去叔丁基酯，并將酸用硼氫化鈉通過(guò)混合酐法還原成醇以產(chǎn)生3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-1-丁醇(65)。醇(65)隨后使用如前所述的Dess-Martin高價(jià)碘化合物轉(zhuǎn)化成3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基丁醛(66)。將3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基丁醛(66)和α氨基酯(51)還原氨化，隨后在仲胺上進(jìn)行烯丙氧羰基保護(hù)，產(chǎn)生(3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁基-烯丙氧羰基-氨基)-2-取代的乙酸芐基酯(67)。烯丙氧羰基7-烯丙氧基甲基-3-取代-[1，4]-二氮雜卓-2-酮(68)通過(guò)芐基酯的皂化，隨后用二乙胺進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)以產(chǎn)生游離伯胺而形成，其中所述的游離伯胺使用肽形成試劑如TBTU而環(huán)化。終產(chǎn)物(54)通過(guò)保護(hù)基團(tuán)交換而形成通過(guò)鈀(O)除去烯丙基醚和烯丙氧羰基并且將仲胺作為其Fmoc衍生物加以保護(hù)，以產(chǎn)生4-Fmoc-7-芐氧基甲基-3-取代-[1，4]-二氮雜卓-2-酮，隨后使伯醇氧化成酸以產(chǎn)生終產(chǎn)物(54)。所用氧化劑的選擇基于2-位的基團(tuán)的性質(zhì)。
方法N
Fmoc-天冬氨醇β叔丁基酯(63)的合成使用Fmoc-天冬氨酸β叔丁基酯(62)作為起始材料，如對(duì)化合物(13)的合成所述而制備化合物(63)。
3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁酸叔丁基酯(64)的合成向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?0mL四氫呋喃中的10mmol(63)的溶液添加礦物油中的12mmol60％氫化鈉分散體、2mmol四丁基碘化銨和13mmol烯丙基溴，并且混合物攪拌過(guò)夜，用10mL飽和碳酸氫鈉水溶液猝滅并用50m L乙酸乙酯萃取。3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-1-丁醇(65)的合成化合物(65)如對(duì)化合物(44)的合成所述而制備。
3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁醛(66)的合成如對(duì)(9)的合成所述，使用Dess-Martin高價(jià)碘化合物將3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-1-丁醇(65)氧化成醛。
(3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁基-烯丙氧羰基-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(67)的合成如對(duì)化合物(15)所述，使用如對(duì)化合物(10)所述的氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉作為還原劑，以α-氨基酯(51)使3-Fmoc-氨基-4-芐氧基-丁醛(66)還原氨化，隨后將仲胺保護(hù)為烯丙氧羰基衍生物，不過(guò)使用氯甲酸烯丙酯代替氯甲酸芐酯。
4-烯丙氧羰基-7-烯丙氧基甲基-3-取代-[1，4]-二氮雜卓-2-酮(68)的合成將20mL甲醇中10mmol(3-Fmoc-氨基-4-烯丙氧基-丁基-烯丙氧羰基-氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(67)、20mmol碳酸鉀和10mL水的溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，用21mL 1N氫氯酸溶液中和，并隨后濃縮至干燥。殘余物溶解在乙酸乙酯中的20mL 30％二乙胺中并攪拌3小時(shí)，并且隨后濃縮至干燥。殘余物溶解在100mL二氯甲烷中，并且添加12mmol TBTU和24mmolN-甲基嗎啉，并且溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，并隨后濃縮至干燥。殘余物在30mL乙酸乙酯與30mL 1N氫氯酸溶液之間分配，并且隨后使層分離。有機(jī)層用30mL飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥并通過(guò)硅膠柱層析法純化。
4-Fmoc-2-取代-3-氧代-[1，4]-二氮雜卓-5-羧酸(54)的合成向保持在室溫于氮?dú)庀碌脑?0mL二氯甲烷中的10mmol化合物(68)的溶液添加2當(dāng)量苯基硅烷和0.3當(dāng)量四(三苯基膦)鈀(O)，并且溶液隨后攪拌2小時(shí)，并濃縮至干燥。仲胺溶解在20mL四氫呋喃和10mL水中，隨后添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉和1.2當(dāng)量Fmoc-Cl，并且雙相溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，用30mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分開。將4-Fmoc-7-羥甲基-3-取代-[1，4]-二氮雜卓-2-酮如方法A中所述氧化成終產(chǎn)物(54)。所用氧化劑的選擇基于2-位的基團(tuán)的性質(zhì)，如方法A中對(duì)(6)轉(zhuǎn)化成(7)那樣。
6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸支架的合成(方法O) 如方法O中概述，合成6-位含有非官能化側(cè)鏈的6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸支架從使用Dess-Martin高價(jià)碘化合物氧化成酮(70)的市售3-Fmoc-氨基-1，2-丙二醇1-氯-三苯甲基樹脂(69)開始而進(jìn)行。以α氨基酯(2)對(duì)酮(70)的還原氨化產(chǎn)生了結(jié)合樹脂的(1-氨基甲基-2-氯-三苯甲基氧-乙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(71)，后者在胺的脫保護(hù)后環(huán)化成5-氯三苯甲基氧甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(72)。仲胺受到再保護(hù)，隨后從樹脂上切下，產(chǎn)生Fmoc-5-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(73)，后者使用方法A中所述的兩種方法之一而氧化成6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸(74)。
方法O
1-氨基-3-氯三苯甲基氧-2-丙酮(70)的合成結(jié)合樹脂的醇(69)的氧化通過(guò)三氧化硫氧化、NMO/TPAP(N-甲基嗎啉-N-氧化物/高錸酸四丙胺)氧化或PDC氧化而進(jìn)行。對(duì)于三氧化硫氧化，使用與Parikh，J.R.和Doering，W.V.，J.Am.Chem.Soc.895505-5507(1967)中所述方法相似的方法。對(duì)于NMO/TPAP氧化，向0.3mmol結(jié)合樹脂的醇添加在10mL無(wú)水二甲基甲酰胺中的3mmol N-甲基嗎啉N-氧化物的溶液，并且隨后將0.06mmol高錸酸四丙胺(TPAP)添加至樹脂混懸液中。反應(yīng)振搖80分鐘。排干溶劑，將樹脂用四氫呋喃和二氯甲烷洗滌并且隨后在真空下干燥。對(duì)于PDC氧化，將二甲基甲酰胺中0.2M重鉻酸吡啶鎓中的結(jié)合樹脂的醇的混懸液在37℃振搖4小時(shí)，排干溶劑并且將樹脂用二甲基甲酰胺、四氫呋喃和二氯甲烷洗滌。
(1-氨基甲基-2-氯-三苯甲基氧-乙基氨基)-2-取代的乙酸甲基酯(71)的合成用氨基酯對(duì)樹脂結(jié)合酮(70)的還原氨化通過(guò)兩種不同方法之一進(jìn)行。在一種方法中，向二甲基甲酰胺中的20mL 1％乙酸中的2.6mmol α氨基酯(2)的溶液添加2.6mmol三乙酰氧基硼氫化鈉，隨后立即添加0.5mmol酮衍生化樹脂(70)，并且混合物振搖60分鐘，用甲醇、10％二異丙基乙胺、二甲基甲酰胺和甲醇漂洗。在第二種方法中，將含有0.05M氰基硼氫化鈉的甲醇中的0.05mmol酮衍生化樹脂(70)和2.0M氫氯酸α氨基酯(2)的混懸液在室溫振搖5小時(shí)，排干并洗滌。
5-氯三苯甲基氧甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(72)的合成將10mL二甲基甲酰胺中的20％哌啶中的0.05mmol樹脂的混懸液在室溫振搖2小時(shí) Fmoc-5-羥甲基-3-取代-哌嗪-2-酮(73)的合成將含有0.25mmolFmoc-Cl和0.25mmol三乙胺的10mL二氯甲烷中的0.05mmol(72)的混懸液在室溫?cái)嚢?小時(shí)，排干并用氯甲烷洗滌。樹脂重懸在二氯甲烷內(nèi)的10mL 95％三氟乙酸中，并將混懸液振搖2小時(shí)，過(guò)濾，并濃縮濾液。
Fmoc-6-取代-5-氧代-哌嗪-2-羧酸(74)的合成將(73)氧化成目的產(chǎn)物通過(guò)對(duì)方法A所述的任意方法進(jìn)行。
α，α-雙取代氨基酸的合成(方法P和Q) 在本發(fā)明的某些構(gòu)建體中，有可能并構(gòu)思的是利用雙取代氨基酸殘基，如其中取代基相同或不同的α，α-雙取代氨基酸。在一個(gè)方面，在Aaa1或Aaa8位置中利用α，α-雙取代氨基酸，其中α，α-雙取代氨基酸的至少一個(gè)側(cè)鏈?zhǔn)荖le、Ala、Leu、Ile、Val、Nva、Met(O)或Met(O2)的側(cè)鏈。以下合成方法P和Q描述α，α-二-正丁基甘氨酸(2-氨基-2-丁基-己酸)的產(chǎn)生，其中每個(gè)側(cè)鏈?zhǔn)?(CH2)3-CH3，并且因此每個(gè)側(cè)鏈與Nle的側(cè)鏈相同。然而，將理解的是相似方法和方案可以用于其中取代基相同或不同的其它α，α-雙取代氨基酸的產(chǎn)生中。此外，產(chǎn)生α，α-雙取代氨基酸的任何方法可以用于本發(fā)明的實(shí)施中，并且本發(fā)明的實(shí)施不限于以下合成方案的方法。因此，用于合成α，α-雙取代氨基酸的本領(lǐng)域已知任何方法可以用于本發(fā)明的實(shí)施中。下文教授用于產(chǎn)生α，α-雙取代氨基酸的替代方法Clark J.S.和Middleton M.D.Synthesis of novel alpha-substituted and alpha，alpha-disubstituted amino acidsby rearrangement of ammonium ylides generated from metal carbenoids.Org.Lett.4(5)765-8(2002)；Guino M.，Hii K.K.Wang-aldehyde resin as arecyclable support for the synthesis of alpha，alpha-disubstituted amino acidderivatives.Org Biomol.Chem.3(17)3188-93(2005)；和Kotha S.，Behera M.Synthesis andmodification of dibenzylglycine derivatives via theSuzuki-Miyaura cross-coupling reaction.J.Pept.Res.64(2)72-85(2004)。
方法P
苯甲酰二-正丁基甘氨酸(80)的合成向保持在0℃于氮?dú)庀碌脑?0mL二氯甲烷中的10mmol苯甲酰甘氨酸(75)的溶液緩慢添加12mmol N，N′-二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)，并且反應(yīng)攪拌2小時(shí)以產(chǎn)生化合物(76)。濾除固體并濃縮濾液。殘余物溶解在15mL四氫呋喃中，冷卻至0℃，并且隨后添加24mmol氫化鈉，隨后添加30mmol正丁基溴?；鞈乙涸?℃攪拌2小時(shí)，并且隨后升溫至室溫，并將溶液濃縮至干燥以產(chǎn)生化合物(77)?；蛘?，化合物(77)也可以按照相似方式從苯甲酰正亮氨酸(78)中制備，除使用12mmol氫化鈉和15mmol正丁基溴之外。化合物(77)溶解在甲醇中，添加50mL1N氫氯酸溶液，并且將此溶液攪拌2小時(shí)并濃縮。化合物(80)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
Fmoc二-正丁基甘氨酸(81)的合成10mmol化合物(80)溶解在30mL二噁烷中，并添加10mL6N氫氯酸溶液，并使溶液回流過(guò)夜。將反應(yīng)冷卻至室溫、濃縮至干燥，重溶解在30mL四氫呋喃中，并添加10mL水和30mmol碳酸氫鈉，隨后添加15mmol Fmoc-Cl。攪拌雙相溶液1小時(shí)并且在真空下除去四氫呋喃。水溶液用1×50mL二乙醚提取，用1N氫氯酸溶液酸化，并用2×50mL乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯層合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮?；衔?81)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
相似的方法可以通過(guò)始自(與化合物78相似的)任何適宜的氨基酸衍生物而使用，并且通過(guò)使用適宜的烷基丁基、芳基丁基或芳烷基丁基試劑，該方案將產(chǎn)生其中R和R′不同的多種雙取代(R，R′)氨基酸替代物。
方法Q
Fmoc-α，α二-正丁基甘氨酸(87)的合成向室溫下保持的在40mL無(wú)水四氫呋喃中的20mmol甘氨酸甲基酯氫氯化物(82)和2g粉末狀分子篩的混懸液添加24mmol氫氧化鉀，隨后添加22mmol苯甲醛?；鞈乙簲嚢?小時(shí)，過(guò)濾，并濃縮濾液。殘余物重溶解在40mL無(wú)水甲苯中，并且隨后添加至在甲苯中的60mmol氫化鈉的混懸液內(nèi)，隨后添加60mmol正丁基溴。混懸液攪拌12小時(shí)，隨后添加30mL 6N氫氯酸溶液，在室溫?cái)嚢?小時(shí)，并且隨后使層分離。因此獲得的(84)的氫氯酸鹽原位地用于制備(87)。為分離作為氫氯酸鹽的(84)，將水層濃縮至干燥并使產(chǎn)物從無(wú)水甲醇-醚中結(jié)晶。
或者，化合物(84)可以使用相似的合成方法自正亮氨酸甲基酯氫氯化物制備，除了30mmol氫化鈉和30mmol正丁基溴用于轉(zhuǎn)化(86)成(84)之外。
將如上文所獲得氫氯酸化物形式的化合物(84)的水性混合物加熱至回流1小時(shí)并且隨后冷卻至室溫。該混合物用固體氫氧化鈉中和并且隨后用30mL四氫呋喃稀釋。添加碳酸氫鈉(30mmol)，隨后添加15mmol Fmoc-Cl。將雙相溶液攪拌1小時(shí)，并將四氫呋喃在真空下除去。水溶液用1×50mL二乙醚萃取，用1N氫氯酸溶液酸化，并用2×50mL乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯層合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮?；衔?87)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
相似的方法可以通過(guò)始自(與化合物85相似的)任何適宜的氨基酸衍生物而使用，并且通過(guò)使用適宜的烷基丁基、芳基丁基或芳烷基丁基試劑，該方案將產(chǎn)生其中R和R′不同的多種雙取代(R，R′)氨基酸替代物。
雙取代(R，R′)支架的合成(方法R) 本發(fā)明還提供其中使用具有兩種R基團(tuán)即R和R′的氨基酸替代物的構(gòu)建體。以下方法描述Fmoc保護(hù)的(R)-5，5-二丁基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸的合成，其中R和R′分別是對(duì)應(yīng)于正亮氨酸側(cè)鏈部分的基團(tuán)?？梢悦靼滓韵碌姆椒梢曰谇笆龇椒ú糠值丶右哉{(diào)整以產(chǎn)生相似的雙取代(R，R′)氨基酸替代物。相似的方法可以通過(guò)始自(與化合物84相似的)任何適宜的氨基酸衍生物而使用，該方案將產(chǎn)生其中R和R′不同的多種雙取代(R，R′)氨基酸替代物。
方法R
(2-Fmoc-氨基-3-叔丁氧基-丙基氨基)-2，2，二-正丁基乙酸甲基酯(88)的合成50mL無(wú)水四氫呋喃中的21mmol(84，方案Q)和2.9mL(21mmol)三乙胺的混懸液在室溫?cái)嚢?5分鐘，并且隨后添加在30mL四氫呋喃中的約20mmol粗制Fmoc-(O-叔丁基)-絲氨醛(9，方案D)的溶液，隨后添加1.7g的4

粉末狀分子篩，并且混懸液攪拌額外2小時(shí)，添加6.4g(30mmol)固態(tài)三乙酰氧基硼氫化鈉，并且混懸液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。混懸液用甲醇稀釋，濾除分子篩并濃縮濾液。殘余物在100mL乙酸乙酯與50mL水之間分配。有機(jī)層經(jīng)硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并濃縮。化合物(88)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
4-Fmoc-6-羥甲基-3，3-二-正丁基-哌嗪-2-酮(89)的合成在30mL乙酸乙酯中的30％二乙胺中的10mmol化合物(88)的溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，并隨后濃縮至干燥。殘余物溶解在20mL四氫呋喃和10mL水中，添加2.52g(30mmol)固體碳酸氫鈉，隨后添加3.36g(13mmol)Fmoc-Cl。將混合物攪拌3小時(shí)，用50mL乙酸乙酯稀釋，使各層分開，并且有機(jī)層用30mL水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮。粗制混合物溶解在二氯甲烷中的10mL 90％三氟乙酸溶液中，攪拌2小時(shí)，并隨后濃縮至干燥。殘余物溶解在乙酸乙酯中并用50mL飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，并濃縮?；衔?89)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
4-Fmoc-5，5-二-正丁基-6-氧代-哌嗪-2-羧酸(90)的合成向在室溫保持的在81mL乙腈中的8mmol醇(89)的溶液添加磷酸鹽緩沖液(用0.72g磷酸二氫鈉和1.43g磷酸氫二鈉在29.5mL水中制備)，隨后添加0.33g(2.1mmol)TEMPO及1.86g(16.5mmol)亞氯酸鈉，并將雙相溶液置于維持在43℃的油浴中。緩慢添加(通過(guò)混合1.9mL 10-13％次氯酸鈉溶液與2.4mL水而制備的)4.3mL(2.6mmol)次氯酸鈉溶液。反應(yīng)在43℃攪拌4小時(shí)，冷卻至室溫，添加20mL 10％亞硫酸氫鈉，攪拌10分鐘，用50mL乙酸乙酯稀釋，并使各層分開。有機(jī)層用1×10mL鹽水、1×10mL 1N氫氯酸溶液洗滌，經(jīng)硫酸鈉干燥，并濃縮?；衔?90)通過(guò)硅膠柱層析法純化。
6.用于包括式I替代物的化合物的合成方法 如本發(fā)明幾個(gè)實(shí)施方案中公開的包括一種或多種式I替代物的化合物可以通過(guò)在氨基酸之間形成肽鍵的任何已知常規(guī)方法容易地合成。此類常規(guī)方法包括例如任何液相方法，其中所述的液相方法允許使其羧基或其它反應(yīng)基受保護(hù)的氨基酸殘基的游離α氨基與其氨基或其它反應(yīng)基受保護(hù)的另一種氨基酸殘基的游離伯羧基之間縮合。在優(yōu)選的常規(guī)方法中，本發(fā)明的化合物可以通過(guò)固相合成法合成并根據(jù)本領(lǐng)域的已知方法純化。本發(fā)明的氨基酸替代物可以通過(guò)與對(duì)于殘基所用的方法基本上相似或相同的方法摻入本發(fā)明化合物中。利用多種樹脂和試劑的眾多熟知方法均可以用來(lái)制備本發(fā)明的化合物。
用于合成化合物的過(guò)程可以通過(guò)每個(gè)氨基酸或氨基酸替代物以所需的序列一次一個(gè)連續(xù)添加至另一個(gè)氨基酸殘基或氨基酸替代物的方法，或通過(guò)首先常規(guī)合成具有所需氨基酸序列的肽片段(其可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代物)并隨后縮合以提供所需化合物的方法而實(shí)施。使產(chǎn)生的化合物環(huán)化以產(chǎn)生本發(fā)明的環(huán)狀化合物。
固相肽合成方法是眾所周知的并在本領(lǐng)域中實(shí)施。在此類方法中，本發(fā)明化合物的合成可以根據(jù)固相方法的一般原理，通過(guò)將想要的氨基酸殘基或氨基酸替代物一次一個(gè)依次摻入增長(zhǎng)的肽鏈而實(shí)施。這些方法在眾多參考文獻(xiàn)中公開，所述文獻(xiàn)包括Merrifield R.B.，Solid phase synthesis(Nobellecture).Angew.Chem.24799-810(1985)和Barany等，The Peptides，Analysis，Synthesis和Biology，第2卷，Gross E.和Meienhofer J.編輯.Academic Press，1-284(1980)。
在化合物的化學(xué)合成中，用合適的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)多種氨基酸殘基或氨基酸替代物的活性側(cè)鏈基團(tuán)，其中所述的保護(hù)基團(tuán)防止化學(xué)反應(yīng)在該部位上發(fā)生直至除去該保護(hù)基團(tuán)為止。還常見是保護(hù)氨基酸殘基或氨基酸替代物的α氨基而該實(shí)體在羧基處發(fā)生反應(yīng)，隨后選擇性地除去α氨基保護(hù)基團(tuán)以允許后續(xù)反應(yīng)在該位點(diǎn)上發(fā)生。具體的保護(hù)基團(tuán)已經(jīng)公開并且在固相合成法和液相合成法中是已知的。
α氨基可以由合適的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，包括氨基甲酸乙酯型保護(hù)基團(tuán)(如芐氧羰基(Z))和取代的芐氧羰基，如對(duì)氯芐氧羰基、對(duì)硝基芐氧羰基、對(duì)溴芐氧羰基、對(duì)聯(lián)苯基-異丙氧羰基、9-芴甲氧羰基(Fmoc)和對(duì)甲氧基芐氧羰基(Moz)；脂族氨基甲酸乙酯型保護(hù)基團(tuán)，如叔丁氧羰基(Boc)、二異丙基甲氧羰基、異丙氧羰基和烯丙氧羰基。Fmoc優(yōu)選用于α氨基保護(hù)。
胍基可以由合適的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，如硝基、對(duì)甲苯磺?；?Tos)、Z、五甲基色烷磺酰基(Pmc)、金剛烷氧羰基、五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?Pbf)、Fmoc和Boc。Pbf是用于Arg的一種優(yōu)選保護(hù)基團(tuán)。其它優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)包括Z、Fmoc和Boc。尤其將理解的是胍基保護(hù)基團(tuán)可以在合成過(guò)程期間被切除或除去，或可以備選地不被切除或除去，此時(shí)帶保護(hù)基團(tuán)的側(cè)鏈形成如本文中所定義的氨基酸側(cè)鏈部分的衍生物。特別在保護(hù)基團(tuán)不穩(wěn)定以及可能在施用至患者時(shí)因某種機(jī)制而被除去的情況下，化合物變成“前藥”，也就是說(shuō)作為藥物前體的化合物，其中所述的藥物前體在施用至患者后通過(guò)某些化學(xué)或生理過(guò)程在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成所需藥物形式(例如前藥在接觸于生理pH時(shí)或因酶作用轉(zhuǎn)化成想要的藥物形式)。
本文中所述的本發(fā)明化合物可以使用固相合成法，手工地或借助自動(dòng)肽合成儀，使用如由制造商提供的編程模塊并遵循由制造商描述的方案或通過(guò)改良制造商的方案以改善苛刻偶聯(lián)的產(chǎn)率而制備。
固相合成通過(guò)使保護(hù)的α-氨基酸、α-氨基酸替代物或α-氨基醇模擬物偶聯(lián)至合適樹脂而始于化合物的羧基端。通過(guò)如下方式制備這種起始材料，即α-氨基-受保護(hù)氨基酸或α-氨基-受保護(hù)氨基酸替代物通過(guò)酯鍵連接至對(duì)芐氧基芐醇(Wang)樹脂或2-氯三苯甲基氯樹脂，通過(guò)Fmoc-接頭如對(duì)-[(R，S)-α-[1-(9H-芴-9-基)-甲氧基甲酰胺基]-2，4-二甲氧基芐基]-苯氧乙酸(Rink接頭)之間的酰胺鍵連接至二苯甲基胺(BHA)樹脂，或通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的其它方法，如通過(guò)α-氨基-保護(hù)的醇模擬物連接至與氯甲基聚苯乙烯樹脂連接的3，4-二氫-2H-吡喃-2基-甲醇接頭。Fmoc-接頭-BHA樹脂支持物是市售的并且通常在可行時(shí)使用。在重復(fù)循環(huán)期間根據(jù)需要攜帶這些樹脂以依次添加氨基酸。在堿性條件下除去α氨基Fmoc保護(hù)基團(tuán)。為此目的可以使用在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的哌啶、哌嗪、二乙胺或嗎啉(20-40％v/v)。
在除去α氨基保護(hù)基團(tuán)后，以想要的次序逐步偶聯(lián)后繼受保護(hù)的氨基酸或氨基酸替代物以獲得中間態(tài)的保護(hù)的肽-樹脂。用于肽固相合成中偶聯(lián)氨基酸的活化試劑是本領(lǐng)域眾所周知的。在合成化合物后，根據(jù)需要，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法除去正交保護(hù)的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)以便使化合物進(jìn)一步衍生化。
化合物中的活性基團(tuán)可以在固相合成期間或從樹脂上切下后選擇性地加以修飾。例如，化合物可以在樹脂上時(shí)被修飾以獲得氨基端修飾，如乙?；?，或可以通過(guò)使用切除試劑從樹脂上切下并且隨后加以修飾。用于氨基端修飾(如乙?；?或羧基端修飾(如酰胺化)或?qū)隢-乙?；姆椒ㄊ潜绢I(lǐng)域已知的。類似地，用于修飾氨基酸側(cè)鏈的方法是肽合成領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。對(duì)化合物上存在的反應(yīng)基修飾的選擇部分地由化合物中想要的特征決定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物在從樹脂上切下之前被環(huán)化。對(duì)于通過(guò)活性側(cè)鏈部分的環(huán)化，使想要的側(cè)鏈脫保護(hù)，并將化合物懸浮在合適的溶劑中并添加環(huán)狀偶聯(lián)劑。合適的溶劑包括例如DMF、二氯甲烷(DCM)或1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。合適的環(huán)化偶聯(lián)劑包括例如2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、苯并三唑-1-基-氧代-三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)、苯并三唑-1-基-氧基-三(吡咯烷基)磷鎓六氟磷酸鹽(PyBOP)、2-(7-氮雜-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TATU)、2-(2-氧代-1(2H)-吡啶基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TPTU)或N，N′-二環(huán)已基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑(DCCI/HOBt)。通過(guò)使用合適的堿如N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)、均三甲基吡啶(sym-collidine)或N-甲基嗎啉(NMM)而常規(guī)地啟動(dòng)偶聯(lián)。
合成后從固相上切下化合物之后，該化合物可以通過(guò)任何數(shù)目的方法如反相高效液相色譜(RP-HPLC)法，使用合適的柱(如C18柱)加以純化。也可以使用其它分離方法或純化方法，如基于化合物大小或電荷的方法。一旦純化，則化合物可以通過(guò)任何數(shù)目的方法如高效液相色譜(HPLC)、氨基酸分析法、質(zhì)譜法等表征。
通過(guò)固相合成法制備具有取代的酰胺衍生的羧基端(一般是N-烷基)的本發(fā)明化合物，其中所述的固相合成法通過(guò)將保護(hù)的α氨基酸或氨基酸替代物偶聯(lián)至合適樹脂而始于化合物的羧基端。此類用于固相上制備取代的酰胺衍生物的方法已經(jīng)在本領(lǐng)域中描述。見，例如Barn D.R.，Morphy J.R.，Rees D.C.Synthesis of an array of amides by aluminum chloride assistedcleavage of resin-bound esters.Tetrahedron Lett.37，3213-3216(1996)；DeGrado W.F.Kaiser E.T.Solid-phase synthesis of protected peptides on apolymer bound oximePreparation of segments comprising the sequences of acytotoxic 26-peptide analogue.J.Org.Chem.473258-3261(1982)。此類起始材料可以通過(guò)熟知的方法將α氨基受保護(hù)的氨基酸或氨基酸替代物經(jīng)酯鍵連接至對(duì)芐氧基芐醇(Wang)樹脂而制備。肽鏈按照想要的氨基酸或氨基酸替代物序列增長(zhǎng)，使產(chǎn)物環(huán)化并用二氯甲烷中的適宜胺和氯化鋁(如甲胺、二甲胺、乙胺等)的溶液處理樹脂。產(chǎn)生的酰胺衍生的化合物從樹脂釋放在溶液內(nèi)。濾除樹脂并將酰胺衍生的化合物通過(guò)濃縮溶劑隨后用醚沉淀加以回收。干燥粗制化合物并使用三氟乙酸(TFA)在水和三異丙基硅烷(TIS)存在下切除仍存在的氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。終產(chǎn)物通過(guò)添加冷醚沉淀并通過(guò)過(guò)濾收集。通過(guò)RP-HPLC，使用C18柱開展最終純化。
在一個(gè)優(yōu)選的方法中，化合物通過(guò)以下方法合成。每種化合物具有一個(gè)或兩個(gè)基于酮-哌嗪結(jié)構(gòu)的氨基酸替代物。該氨基酸替代物如上文所述合成?；衔锸褂肍moc化學(xué)合成。使用手工合成方法以便在摻入酮-哌嗪氨基酸替代物之前和之后立即偶聯(lián)。
以下方案用來(lái)連接氨基酸替代物至樹脂，例如，其中氨基酸替代物位于末端位置。Rink酰胺樹脂(以0.3mmol/g載量，Advanced ChemTech)在DMF中溶脹30分鐘。使用20％哌啶/DMF持續(xù)20分鐘，實(shí)現(xiàn)樹脂的Fmoc脫保護(hù)。通過(guò)在DMF中與PyBop(2當(dāng)量)和DIEA(4當(dāng)量)過(guò)夜溫育而實(shí)現(xiàn)該樹脂與所選擇的Fmoc-保護(hù)的酮-哌嗪氨基酸替代物(2當(dāng)量)的偶聯(lián)。若Kaiser檢驗(yàn)后，獲得陽(yáng)性結(jié)果，則進(jìn)行第二次偶聯(lián)反應(yīng)。使用DMF中的Ac2O(10當(dāng)量)和吡啶(20當(dāng)量)實(shí)施乙酰化。
以下方案用來(lái)連接酮-哌嗪氨基酸替代物至肽-樹脂。通過(guò)混合在DMF中的Fmoc-保護(hù)的酮哌嗪氨基酸替代物(2當(dāng)量)、TBTU(2當(dāng)量)和DIEA(4當(dāng)量)并允許溫育過(guò)夜而實(shí)施偶聯(lián)，若獲得陽(yáng)性Kaiser檢驗(yàn)，則重復(fù)偶聯(lián)反應(yīng)。使用在DMF中的Ac2O(10當(dāng)量)和吡啶(20當(dāng)量)實(shí)施乙?；?。
以下方案用來(lái)將Fmoc-保護(hù)的氨基酸偶聯(lián)至固相上的酮-哌嗪氨基酸替代物。在大多數(shù)情況下，需要至少兩個(gè)偶聯(lián)循環(huán)，并且往往使用三個(gè)循環(huán)。在常見循環(huán)中，F(xiàn)moc-保護(hù)的氨基酸(4當(dāng)量)與HOAt(4當(dāng)量)和DIC(4當(dāng)量)在DMF中混合30分鐘。產(chǎn)生的混合物隨后在SPE管中與直接地或經(jīng)中間體連接至樹脂的酮-哌嗪氨基酸替代物混合過(guò)夜。
使用固相肽合成的標(biāo)準(zhǔn)方案實(shí)施序列中不與酮-哌嗪氨基酸替代物直接相鄰的氨基酸之間的偶聯(lián)。使用以下保護(hù)基團(tuán)Boc用于Lys和Orn，叔丁基用于Tyr和Ser，三苯甲基用于Cys和His，O-叔丁基用于Asp和Pbf用于Arg。
使用TFA/苯甲硫醚/苯酚/H2O/DTT/TIS(87.5/2.5/2.5/5/2.5)的混合物(5mL)3小時(shí)而從樹脂切下化合物。產(chǎn)生的材料經(jīng)過(guò)濾并在冷凍條件下持續(xù)1小時(shí)而從冷醚中析出。析出的半胱氨酰肽在用于氧化步驟中之前用冷醚洗滌至少三次。
為通過(guò)空氣氧化而環(huán)化以形成二硫鍵，將粗制半胱氨酰化合物溶解在乙腈與水的混合物中。使用5％ NH4OH調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的pH至7-8。將得到的溶液與150mg粒狀活性碳一起緩慢攪拌2日。環(huán)化的完成在進(jìn)入下個(gè)加工步驟之前通過(guò)LC-MS分析證實(shí)。在環(huán)化后，從溶液中濾除固體碳。將濾液凍干或在speed-vac中干燥以獲得粗制環(huán)狀化合物。
可以通過(guò)以下方案合成其中替代物與樹脂或其它肽固體支持物結(jié)合并且位于羧基端位置的本發(fā)明某些化合物。

通過(guò)上文的方法A的方案或任何替代方法制備替代物(7)。Fmoc保護(hù)的Sieber酰胺樹脂通過(guò)將該樹脂在二甲基甲酰胺和二氯甲烷1:1的200mL混合物中溶脹45分鐘，隨后過(guò)濾并用二甲基甲酰胺洗滌而處理。洗滌的樹脂隨后用在二甲基甲酰胺中的20％哌啶脫保護(hù)，過(guò)濾并用二甲基甲酰胺洗滌。
在二甲基甲酰胺中的Fmoc-保護(hù)的替代物(7)的溶液添加至如上文所制備的脫保護(hù)的Sieber酰胺樹脂，隨后添加固體PyBop和二異丙基乙胺，隨后又添加額外的二甲基甲酰胺?；旌衔飻噭?dòng)過(guò)夜并吹氮。將樹脂濾出并用二甲基甲酰胺洗滌，用由二甲基甲酰胺:乙酸酐:吡啶的3:2:1溶液構(gòu)成的封端溶液封端30分鐘，過(guò)濾并用二甲基甲酰胺洗滌，以提供與樹脂復(fù)合的替代物(7)。
與樹脂復(fù)合的所得Fmoc-保護(hù)的替代物(7)用在二甲基甲酰胺中的20％哌啶脫保護(hù)15分鐘，過(guò)濾并用二甲基甲酰胺洗滌，以產(chǎn)生與樹脂復(fù)合的替代物(7)。在二甲基甲酰胺中的想要的Fmoc-AA-OH(4當(dāng)量，其中AA是任何想要的氨基酸)的溶液添加至與樹脂復(fù)合的替代物(7)中，隨后添加在DMF中的HCTU(60mmol，4當(dāng)量)和二異丙基乙胺(120mmol，8當(dāng)量)的溶液并偶聯(lián)過(guò)夜，同時(shí)吹氮。產(chǎn)生的Fmoc-AA-替代物(7)-樹脂經(jīng)過(guò)濾分離并用二甲基甲酰胺洗滌。為確保完全偶聯(lián)，產(chǎn)物再次用如上Fmoc-AA-OH的溶液過(guò)夜處理，并吹氮。將樹脂濾出并用二甲基甲酰胺洗滌。
產(chǎn)生的Fmoc-AA-替代物(7)-樹脂隨后用如上文的封端溶液封端30分鐘。隨后將樹脂濾出，用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、MeOH和二乙醚洗滌，并隨后在真空下干燥。
此后可以使用常規(guī)的肽偶聯(lián)方法偶聯(lián)每個(gè)后繼的氨基酸。
可以實(shí)行使用本發(fā)明式I替代物產(chǎn)生的化合物的任選PEG化，包括通過(guò)下文所述的那些方法。
活性胺基(如賴氨酸或鳥氨酸側(cè)鏈)、氨基端位置內(nèi)的Ω氨基脂族基團(tuán)或在羧基端位置內(nèi)的式I替代物的胺基的PEG化通過(guò)在2mL二甲基亞砜中溶解0.005mmol純化的化合物，隨后添加55.5mg(0.011mmol，2當(dāng)量)PEG-5K-OSu(帶琥珀酰亞胺丙酸酯反應(yīng)基的分子量5,000Da的甲氧基-PEG)，隨后添加17.7μL(0.13mmol，20當(dāng)量)三乙胺。并將略微渾濁的溶液在室溫?cái)嚢?小時(shí)而實(shí)現(xiàn)。過(guò)量的PEG-5K-OSu通過(guò)添加7μL(0.111mmol，10當(dāng)量)乙醇胺而猝滅，并將反應(yīng)攪拌過(guò)夜。
活性羧基(如Asp或Glu側(cè)鏈或殘基)或在末端氨基酸殘基或末端式I替代物上的化合物上的末端羧基的PEG化通過(guò)偶聯(lián)PEG-NH2(PEG-胺)至在Asp或Glu的側(cè)鏈中或在羧基端處含有羧基的化合物上而實(shí)現(xiàn)。肽構(gòu)建體(0.005mmol)溶解在DMSO(2mL)中，隨后添加55.5mg(0.011mmol，2當(dāng)量)PEG-NH2和HOBt(0.01mmol)。通過(guò)添加0.0055mmol偶聯(lián)試劑N-乙基-N’-(3-二甲胺基丙基)-碳二亞胺(EDAC)啟動(dòng)偶聯(lián)。將略微渾濁的溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。PEG化的肽構(gòu)建體隨后通過(guò)HPLC純化。
活性硫氫基如Cys或Hcys側(cè)鏈或在式I替代物的R1中的硫氫基的PEG化在DMSO中用PEG-甲基-馬來(lái)酰亞胺試劑(SunBio，Orinda，California)處理肽化合物過(guò)夜而實(shí)現(xiàn)。PEG化的化合物隨后通過(guò)HPLC純化。
PEG化后，產(chǎn)生的粗制化合物混合物隨后通過(guò)HPLC純化，產(chǎn)生PEG衍生化的包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代物的化合物。
7.測(cè)定包括式I替代物的化合物的效力的測(cè)定法 通常，可以使用適于原始多肽的任何測(cè)定系統(tǒng)。下文例舉了使用的測(cè)定系統(tǒng)，其中原始多肽是ANP肽，如mini-ANP。在測(cè)定法中檢驗(yàn)所選擇的包括至少一種式I替代物的化合物，以確定結(jié)合狀態(tài)和功能狀態(tài)。使用以下的測(cè)定法。
細(xì)胞培養(yǎng)。從Bio S&T Inc.(Montreal，Quebec)購(gòu)買編碼人利尿鈉肽受體A(NPRA)的cDNA克隆。將該cDNA克隆插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3.1(Invitrogen)并轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞。通過(guò)在硫酸G418存在下培養(yǎng)細(xì)胞而選擇到穩(wěn)定的克隆。通過(guò)[125I]-心房鈉尿肽([125I]-ANP)與從克隆細(xì)胞系制備的膜勻漿物結(jié)合而檢驗(yàn)NPRA的表達(dá)。HEK-hNPRA細(xì)胞在37℃于5％CO2下維持培養(yǎng)在補(bǔ)充有10％ FBS、硫酸G418(300μg/mL)、谷氨酸鈉(0.29mg/mL)、青霉素(100單位s/mL)和鏈霉素(100ug/mL)的Dulbecco改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中。
競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法。使用從HEK-hNPRA細(xì)胞制備的粗制膜勻漿實(shí)施競(jìng)爭(zhēng)性抑制結(jié)合測(cè)定法。為制備膜勻漿物，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水漂洗并在4℃在低滲裂解緩沖液(10mM Tris，pH7.4+5mM EDTA)中溫育15分鐘。將細(xì)胞從平板中轉(zhuǎn)移至聚丙烯管內(nèi)并均化。勻漿物在25,000×g離心20分鐘。沉淀重懸在由50mM Tris(pH7.4)和1mM EDTA組成的緩沖液中，均化，并在25,000×g離心20分鐘。沉淀重懸在由100mM Tris(pH7.4)和10mM MgCl2組成的緩沖液中并在-80℃貯存直至需要。在分析當(dāng)日，融化勻漿并均化。對(duì)[125I]-ANP的結(jié)合在含有25mM Hepes(pH7.4)、100mMNaCl、2mM CaCl2、5mM MgCl2、0.1％ BSA和1mM 1，10-菲咯啉的緩沖液中實(shí)施。勻漿物(1-10μg蛋白質(zhì)/孔)在4℃與[125I]-ANP(25-30pM)和遞增濃度的競(jìng)爭(zhēng)性配體在Millipore濾盤中溫育120分鐘。通過(guò)添加冷的洗滌緩沖液(磷酸鹽緩沖鹽水)而終止測(cè)定，隨后使用真空多歧管過(guò)濾。使用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定結(jié)合放射活性。非特異性結(jié)合由[I125]-hANP與非轉(zhuǎn)染HEK293膜的結(jié)合而定義。使用GraphPad

曲線擬合軟件分析數(shù)據(jù)。
用于測(cè)定EC50的通用方法。通過(guò)測(cè)量胞內(nèi)cGMP在表達(dá)重組hNPR-A的HEK-293細(xì)胞中的聚積而開展化合物的功能性評(píng)價(jià)。HEK-NPRA細(xì)胞通過(guò)在細(xì)胞解離緩沖液(Gibco，Life Technologies)中洗滌并離心而收獲。沉淀的細(xì)胞重懸在含有10mM Hepes(pH7.4)、5mM MgCl2、200mM L-谷氨酰胺、1mM1，10-菲咯啉和BSA(0.5mg/mL)的Hank氏平衡鹽溶液(HBSS)中。離心后，細(xì)胞重懸在補(bǔ)充有0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)的以上緩沖液中。細(xì)胞(約2×105/孔)添加至96孔平板的各孔中并在37℃溫育15分鐘。在預(yù)溫育時(shí)間后，將細(xì)胞在遞增濃度的化合物存在下溫育額外15分鐘。反應(yīng)通過(guò)用溫度休克(temperature shock)法裂解細(xì)胞而終止。反應(yīng)平板在干冰/乙醇浴中孵育15分鐘，隨后在90℃溫育10分鐘。使用cGMPFlashplate RIA(Perkin-Elmer)測(cè)量cGMP的聚積。通過(guò)使用非線性回歸分析用GraphPad

軟件測(cè)定數(shù)據(jù)分析和EC50值。
質(zhì)量測(cè)定和核磁共振分析。使用Waters MicroMass ZQ裝置，利用陽(yáng)性模式測(cè)定質(zhì)量值。質(zhì)量測(cè)定值與計(jì)算值進(jìn)行比較并以質(zhì)量(mass weight)加二除以二((M+2)/2)的形式表述，除非另外說(shuō)明。
使用Bruker 300MHz分光計(jì)獲得質(zhì)子NMR數(shù)據(jù)。光譜在化合物溶解在氘化溶劑如氯仿、DMSO或(如適合)甲醇中后獲得。
使用帶YMC Pack Pro C18柱(4.6 x 50mm，3μ)的Waters Alliance HT進(jìn)行HPLC測(cè)量，其中所述的柱通過(guò)逐步方法以1mL/分鐘洗脫。使用溶劑A(含有0.1％三氟乙酸v/v的水)和溶劑B(含有0.1％三氟乙酸v/v的乙腈)作為流動(dòng)相。對(duì)于酮哌嗪中間體的分析，柱用10％ B平衡并且隨后經(jīng)8分鐘時(shí)間段增加B至90％。對(duì)于肽的分析，柱用2％ B平衡并且隨后經(jīng)8分鐘時(shí)間段增加B至90％。
8.包含式I替代物的化合物 進(jìn)一步由以下非限制性實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1 合成以下基于原始多肽H-Met-環(huán)(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ IDNO1)的化合物，每種化合物的合成使用前述一種或多種方法的單種式I氨基酸替代物。出于合成原因，1位的Met以Nle取代。純化得到的化合物并測(cè)定其質(zhì)量，結(jié)果顯示如下 表1



在表1的化合物中，化合物1-1、1-5、1-7、1-8、1-12、1-15、1-18、1-20和1-22在相關(guān)的測(cè)定系統(tǒng)中無(wú)活性。其余化合物有活性。如上所述測(cè)試具有以下結(jié)構(gòu)的化合物1-2。

在受體結(jié)合研究中，該化合物在測(cè)定系統(tǒng)中的平均Ki為0.3nM，其中hANP的Ki為0.05nM并且mini-ANP的Ki為0.6nM。化合物1-2在測(cè)定系統(tǒng)中的EC50為2nM，其中hANP的EC50為0.6nM并且mini-ANP的EC50為3.3nM。
如上所述測(cè)試具有以下結(jié)構(gòu)的化合物1-14。

在受體結(jié)合研究中，該化合物在測(cè)定系統(tǒng)中的平均Ki為0.9nM，其中hANP的Ki為0.05nM并且mini-ANP的Ki為0.6nM?；衔?-14在測(cè)定系統(tǒng)中的EC50為3.5nM，其中hANP的EC50為0.6nM并且mini-ANP的EC50為3.3nM。
如上所述測(cè)試具有以下結(jié)構(gòu)的化合物1-13。

在受體結(jié)合研究中，該化合物在測(cè)定系統(tǒng)中的平均Ki為0.2nM，其中hANP的Ki為0.05nM并且mini-ANP的Ki為0.6nM?；衔?-13在測(cè)定系統(tǒng)中的EC50為2nM，其中圖1的化合物的EC50為0.6nM和mini-ANP的EC50為3.3nM。
實(shí)施例2 合成以下基于原始多肽H-Met-環(huán)(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ ID NO1)的化合物，每種化合物的合成使用前述一種或多種方法的兩種式I氨基酸替代物。出于合成原因，1位的Met以Nle取代。純化得到的化合物，并測(cè)定質(zhì)量，結(jié)果顯示如下 表2

在表2的化合物中，化合物2-2和2-4在相關(guān)的測(cè)定系統(tǒng)中無(wú)活性。其余化合物有活性。如上所述測(cè)試具有以下結(jié)構(gòu)的化合物2-6。

在受體結(jié)合研究中，該化合物在測(cè)定系統(tǒng)中的平均Ki為0.027nM，其中hANP的Ki為0.05nM并且mini-ANP的Ki為0.6nM?；衔?-6在測(cè)定系統(tǒng)中的EC50為0.2nM，其中hANP的EC50為0.6nM并且mini-ANP的EC50為3.3nM。
實(shí)施例3 使用前述一種或多種方法的三種式I氨基酸替代物，合成以下基于原始多肽H-Met-環(huán)(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ ID NO1)的化合物。出于合成原因，1位的Met以Nle取代。純化得到的化合物并測(cè)定其質(zhì)量，結(jié)果顯示如下 表3
實(shí)施例4 使用前述一種或多種方法的兩種式I氨基酸替代物和PEG輔基，合成以下基于原始多肽H-Met-環(huán)(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ ID NO1)的化合物。出于合成原因，1位的Met以Nle取代。純化得到的化合物并測(cè)定其質(zhì)量，結(jié)果顯示如下 表4

在表4的化合物中，化合物4-6在相關(guān)的測(cè)定系統(tǒng)中無(wú)活性。其余化合物有活性。
實(shí)施例5 使用前述一種或多種方法的一種或兩種式I氨基酸替代物，合成以下基于原始多肽H-Met-環(huán)(Cys-His-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Ser-Cys)-Tyr-Arg-NH2(SEQ ID NO1)的化合物。盡管原始多肽是環(huán)狀的，然而這些化合物是線形的，每個(gè)Cys殘基以Ala殘基取代。出于合成原因，1位的Met以Nle取代。
如上所述測(cè)試具有以下結(jié)構(gòu)的化合物5-1
在受體結(jié)合研究中，該化合物在測(cè)定系統(tǒng)內(nèi)中的平均Ki為88.5nM的，其中hANP的Ki為0.05nM并且mini-ANP的Ki為0.6nM?；衔?-1在測(cè)定系統(tǒng)中的EC50為340nM，其中hANP的EC50為0.6nM并且mini-ANP的EC50為3.3nM。
如上所述測(cè)試具有以下結(jié)構(gòu)的化合物5-2。

在受體結(jié)合研究中，該化合物在測(cè)定系統(tǒng)中的平均Ki為14.5nM，其中hANP的Ki為0.05nM并且mini-ANP的Ki為0.6nM。化合物5-2在測(cè)定系統(tǒng)中的EC50為550nM，其中hANP的EC50為0.6nM并且mini-ANP的EC50為3.3nM。
如上所述測(cè)試具有以下結(jié)構(gòu)的化合物5-3。

在受體結(jié)合研究中，該化合物在測(cè)定系統(tǒng)中的平均Ki為8.7nM，其中hANP的Ki為0.05nM并且mini-ANP的Ki為0.6nM。化合物5-3在測(cè)定系統(tǒng)中的EC50為80.5nM，其中hANP的EC50為0.6nM并且mini-ANP的EC50為3.3nM。
實(shí)施例6 使用前述一種或多種方法的單種式I氨基酸替代物，合成以下基于催產(chǎn)素原始多肽H-環(huán)(Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys)-Pro-Leu Gly-NH2(SEQ IDNO3)的化合物。
表6
實(shí)施例7 使用前述一種或多種方法的單種式I氨基酸替代物，合成以下基于催產(chǎn)素原始多肽H-環(huán)(Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys)-Pro-Leu Gly-NH2(SEQ IDNO3)的化合物。盡管原始多肽是環(huán)狀的，然而這些化合物是線形的，每個(gè)Cys殘基以Ala殘基取代。
表7

前述實(shí)施例可以通過(guò)用本發(fā)明一般描述或具體描述的反應(yīng)物和/或操作條件替代于先前實(shí)施例中使用的那些反應(yīng)物和/或操作條件而重復(fù)，獲得相似的成功。
盡管已經(jīng)參考那些優(yōu)選的實(shí)施方案詳細(xì)地說(shuō)明了本發(fā)明，然而其它實(shí)施方案可以顯示相同的結(jié)果。本發(fā)明的變體和變型對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，并且本發(fā)明意圖覆蓋全部此類變型和等效物。上文援引和/或附件中的所有參考文獻(xiàn)、申請(qǐng)、專利和出版物的全部公開內(nèi)容和相應(yīng)申請(qǐng)的全部公開內(nèi)容因而通過(guò)引用的方式并入。
權(quán)利要求
1.一種具有結(jié)構(gòu)I式的化合物
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽，其中
R1是H、烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)
R2是H或烷基，前提是R1和R2不都是H；
R3是H或第一氮保護(hù)基團(tuán)；
R4是H、烷基、(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2；
R5是H或烷基；
R6a是H、烷基、(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2；
R6b是H或烷基；
前提是R4和R6a不均是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2；
R7是H、C(＝O)烷基、C(＝O)(CH2)m(NR8)2、烷基、芳烷基或芳基；
R8的每次出現(xiàn)獨(dú)立地是H、芳基或烷基；
R11是肽固體支持物；
R12是H或第二氮保護(hù)基團(tuán)；
m的每個(gè)具體值是具有0與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)；
q的每個(gè)具體值是具有1與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)；
p是具有1與10之間的值的整數(shù)；并且
y是0或1。
2.權(quán)利要求1所述的化合物，其中y是1。
3.權(quán)利要求1所述的化合物，其中y是0。
4.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R4是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11，并且R6a是H或烷基。
5.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R6a是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11，并且R4是H或烷基。
6.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R3是下式的基團(tuán)
并且R9是叔丁基、烯丙基或下式的基團(tuán)
7.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)
或
并且R12是H或三苯亞甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺?；⒓柞；?、硝基或芐氧羰基，并且n是具有2與6之間的值的整數(shù)。
8.權(quán)利要求1所述的化合物，其中R7是H。
9.權(quán)利要求1所述的化合物，其具有下式
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽，其中
R6a是H或烷基；并且
R9是叔丁基、烯丙基或下式的基團(tuán)
10.權(quán)利要求9所述的化合物，其中R1是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)
或
并且R12是H或三苯亞甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺?；?、甲?；?、硝基或芐氧羰基，并且n是具有2與6之間的值的整數(shù)。
11.權(quán)利要求9所述的化合物，其中R7是H。
12.權(quán)利要求9所述的化合物，其中R4是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)NR11。
13.權(quán)利要求1所述的化合物，其具有下式
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽，其中
R1是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)
或
R4是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2；
R6a是H或烷基；并且
n是具有2與6之間的值的整數(shù)。
14.權(quán)利要求13所述的化合物，其中R1是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)
或
并且R12是H或三苯亞甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺?；⒓柞；⑾趸蚱S氧羰基，并且n是具有2與6之間的值的整數(shù)。
15.權(quán)利要求13所述的化合物，其中R7是H。
16.權(quán)利要求13所述的化合物，其中R4是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11。
17.權(quán)利要求1所述的化合物，其具有下式
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽，其中
R1是烷基-N(R8)2、(CH2)nOR8、(CH2)nC(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)
或
R4是H或烷基；
R6a是H或烷基；并且
n是具有2與6之間的值的整數(shù)。
18.權(quán)利要求17所述的化合物，其中R3是下式的基團(tuán)
并且R9是叔丁基、烯丙基或下式的基團(tuán)
19.權(quán)利要求17所述的化合物，其中R1是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)
或
并且R12是H或三苯亞甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺?；?、甲酰基、硝基或芐氧羰基，并且n是具有2與6之間的值的整數(shù)。
20.權(quán)利要求17所述的化合物，其中R7是H。
21.權(quán)利要求1所述的化合物，其具有下式
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽，其中
R1是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)
或
R4是H或烷基；
R6a是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2；并且
n是具有2與6之間的值的整數(shù)。
22.權(quán)利要求21所述的化合物，其中R3是下式的基團(tuán)
并且R9是叔丁基、烯丙基或下式的基團(tuán)
23.權(quán)利要求21所述的化合物，其中R1是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)
或
并且R12是H或三苯亞甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺?；?、甲?；⑾趸蚱S氧羰基，并且n是具有2與6之間的值的整數(shù)。
24.權(quán)利要求21所述的化合物，其中R6a是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11。
25.權(quán)利要求21所述的化合物，其中R7是H。
26.權(quán)利要求1所述的化合物，其具有下式
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽，其中
R4是H或烷基；并且
R9是叔丁基、烯丙基或下式的基團(tuán)
27.權(quán)利要求26所述的化合物，其中R1是烷基-N(R8)2、烷基-OR8、(CH2)n-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)
或
并且R12是H或三苯亞甲基、叔丁氧羰基、甲苯磺?；⒓柞；?、硝基或芐氧羰基，并且n是具有2與6之間的值的整數(shù)。
28.權(quán)利要求26所述的化合物，其中R7是H。
29.權(quán)利要求26所述的化合物，其中R4是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11。
30.權(quán)利要求1所述的化合物，其具有下式
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽，其中
R1和R2是獨(dú)立烷基。
31.權(quán)利要求26所述的化合物，其中R3是下式的基團(tuán)
并且R9是叔丁基、烯丙基或下式的基團(tuán)
32.權(quán)利要求26所述的化合物，其中R4是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2，并且R6a是H或烷基。
33.權(quán)利要求26所述的化合物，其中R6a是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2，并且R4是H或烷基。
34.權(quán)利要求26所述的化合物，其中R7是H。
35.合成包含下式基團(tuán)的肽的方法
或
所述的方法包括使具有以下結(jié)構(gòu)式I的化合物
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體或其合成上可接受的鹽與N-保護(hù)的氨基酸反應(yīng)的步驟，
其中
R1是H、烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)
或
R2是H或烷基，前提是R1和R2不都是H；
R3是H或第一氮保護(hù)基團(tuán)；
R4是H、烷基、(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2；
R5是H或烷基；
R6a是H、烷基、(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2；
R6b是H或烷基；
前提是R4和R6a不均是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2；
R7是H、C(＝O)烷基或C(＝O)(CH2)m(NR8)2；
R8的每次出現(xiàn)獨(dú)立地是H、芳基或烷基；
R11是肽固體支持物；
R12是H或第二氮保護(hù)基團(tuán)；
m的每個(gè)具體值是具有0與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)；
q的每個(gè)具體值是具有1與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)；
p是具有1與10之間的值的整數(shù)；并且
y是0或1。
36.一種化合物，其包含多個(gè)氨基酸殘基和至少一個(gè)具有下式的基團(tuán)
或
或其對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體，其中
R1是H、烷基、芳基、烷基芳基、烷基-N(R8)2、烷基-OR8、烷基-C(＝O)OR8、C(＝O)OR8、烷基-NH2、烷基-S-R8、烷基-C(＝O)N(R8)2或下式的基團(tuán)
或
R2是H或烷基，前提是R1和R2不都是H；
R3是H或第一氮保護(hù)基團(tuán)；
R4是H、烷基、(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2；
R5是H或烷基；
R6a是H、烷基、(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2；
R6b是H或烷基；
前提是R4和R6a不均是(CH2)mC(＝O)OH、(CH2)mC(＝O)NR11、(CH2)mC(＝O)OR11、(CH2)qOH、(CH2)qOBn、(CH2)qO烯丙基、(CH2)mC(＝O)N(R8)2或(CH2)mC(＝O)N(R8)(CH2)pN(R8)2；
R7是H、C(＝O)烷基或C(＝O)(CH2)m(NR8)2；
R8的每次出現(xiàn)獨(dú)立地是H、芳基或烷基；
R11是肽固體支持物；
R12是H或第二氮保護(hù)基團(tuán)；
m的每個(gè)具體值是具有0與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)；
q的每個(gè)具體值是具有1與6之間的值的獨(dú)立整數(shù)；
p是具有1與10之間的值的整數(shù)；并且
y是0或1。
全文摘要
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6a、R6b、R7和y如本說(shuō)明書中所定義的式I的環(huán)約束性氨基酸替代物，用于合成式I的環(huán)約束性氨基酸替代物的方法，使用式I環(huán)的約束性氨基酸替代物的方法，包括用于包含多個(gè)氨基酸殘基和一個(gè)或多個(gè)式I的環(huán)約束性氨基酸替代物的線形或環(huán)狀化合物以及包括多個(gè)氨基酸殘基和一個(gè)或多個(gè)式I的環(huán)約束性氨基酸替代物的線形或環(huán)狀化合物中。
文檔編號(hào)A61K31/4965GK101484171SQ200780019752
公開日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月30日
發(fā)明者S·D·夏爾馬, M·巴斯托斯, 煒 楊, 蔡慧芝 申請(qǐng)人:帕拉丁科技公司