專利名稱：：共價凝血因子Ⅶ-組織因子復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及凝血因子VII多肽和組織因子多肽的新穎共價復(fù)合物，尤其涉及具有功能活性并與相應(yīng)的游離凝血因子VII多肽相比對凝血因子X的蛋白水解活性增強的復(fù)合物。該類復(fù)合物被認為特別適用于出血性疾病的治療。
背景技術(shù)：
：生物活性增強的凝血因子Vila多肽是治療由于重組凝血因子Vila的次優(yōu)藥效而使傳統(tǒng)重組凝血因子Vila療法對其部分或完全不顯療效的不可控出血的有利分子。目前增強藥效的方法反映了重組凝血因子Vila的作用機制，即表現(xiàn)為不依賴于組織因子在活化的血小板上直接激活凝血因子X。組織因子是由263個氨基酸組成的完整膜糖蛋白受體，位于血管外膜細胞上。其由折疊成兩個各被單個二辟u鍵穩(wěn)定化的致密III型纖連蛋白-樣結(jié)構(gòu)域(l-219)的胞外部分、一個跨膜片段(220-242)和一個短的胞質(zhì)尾區(qū)(243-263)組成。它通過與凝血因子VII形成在血管損傷時可從血液循環(huán)中捕獲的緊密Ca"-依賴復(fù)合物作為凝血的關(guān)鍵抑制劑。組織因子也可以通過提供最優(yōu)大分子外結(jié)合位點相互作用的支架和通過誘導(dǎo)凝血因子Vila蛋白酶結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化使正確定義活性位點區(qū)域從而大大增加對其生理學(xué)底物凝血因子IX和凝血因子X的蛋白水解活性。由直接蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用引起的TF對凝血因子(sTF)的凝血因子Vila重現(xiàn)。Miyata等，生物化學(xué)(Biochemistry),36,1997，5120-5127公開了一種重組凝血因子Vila和可溶性組織因子通過同基雙功能胺特異性6試劑的方式化學(xué)交聯(lián)的共價復(fù)合物。但是該交聯(lián)復(fù)合物并未表現(xiàn)出對凝血因子X的蛋白水解活性。發(fā)明概述本發(fā)明涉及凝血因子VII多肽和組織因子多肽的新穎共價復(fù)合物。該復(fù)合物與相應(yīng)的游離凝血因子VII多肽相比對大分子底物凝血因子X表現(xiàn)出增強的蛋白水解活性。更具體而言，本發(fā)明涉及凝血因子VII多肽和組織因子多肽的共價復(fù)合物，其中凝血因子VII多肽和組織因子多肽通過(i)凝血因子VII多肽氨基酸和(ii)組織因子多肽氨基酸的組的氨基酸側(cè)鏈之間的一個或多個指定連接的方式共價連接。而且，本發(fā)明也涉及凝血因子Vila多肽和組織因子子多肽的共價復(fù)合物，其中凝血因子Vila多肽和組織因子多肽通過(i)凝血因子VIIa多肽氨基酸和(ii)組織因子多肽氨基酸的組的氨基酸側(cè)鏈之間的一個或多個連接的方式共價連接，其中經(jīng)本文定義的體外蛋白水解檢測測定，凝血因子Vila的蛋白水解活性是游離天然(野生型)凝血因子VIIa的至少2倍，例如至少50倍，如至少100倍，例如至少200倍或至少250倍。本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本文定義的凝血因子VII多肽和組織因子多肽復(fù)合物的方法，該方法包括a)用(i)包含編碼該凝血因子VII多肽的核酸分子和與其操作性連接的表達控制區(qū)域的表達載體和(ii)包含編碼組織因子多肽的核酸分子和與其操作性連接的表達控制區(qū)域的表達載體轉(zhuǎn)染細胞，b)在表達凝血因子VIIa多肽和組織因子多肽的條件下培養(yǎng)已轉(zhuǎn)染細胞，并c)通過適當方法分離已表達復(fù)合物。附圖簡述圖1顯示了凝血因子VIIa和可溶性組織因子共價復(fù)合物的模型，其包含可溶性組織因子V207C和凝血因子VilaF40C之間的跨界面二硫化物。從V207C或F40C到天然(野生型)半胱氨酸殘基跨越界面的Ca-距離顯著大于7A,這排除了兩個分子間無意二碌J匕物對的7形成。圖2分別顯示了非還原和還原條件下天然(野生型)凝血因子Vila(A泳道)和純化的凝血因子VilaF40C-sTF(l-219)V207C(B泳道)復(fù)合物的考馬斯染色SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。HC和LC表示VIIa的重鏈和輕鏈。圖3顯示了野生型凝血因子Vila(A泳道)、凝血因子VIIQ64C和sTF(l-219)G109C瞬間共表達的條件培養(yǎng)基(B泳道)和純化的凝血因子F40C-sTF(l-219)V207C復(fù)合物(C泳道)的免疫印記。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及凝血因子VII多肽和組織因子多肽的共價復(fù)合物，其中凝血因子VII多肽和組織因子多肽通過(i)凝血因子VII多肽氨基酸和(ii)組織因子多肽氨基酸的組的氨基酸側(cè)鏈之間一個或多個擅定連接的方式共價連接。在本文中，術(shù)語"共價復(fù)合物"指通過至少一個共價連接或共價4建和多種非共價相互作用(例如氫鍵、疏水相互作用等)結(jié)合在一起的兩個分子(本文中指凝血因子VII多肽和組織因子多肽)。因此，在這種方式中該凝血因子VII多肽和該組織因子多肽為共價連接。這兩個多肽通過(i)凝血因子VII多肽氨基酸和(ii)組織因子多肽的氨基酸的組的氨基酸側(cè)鏈之間一個或多個指定連接的方式共價連接。如本文中使用，術(shù)語"凝血因子vn多肽，，包括野生型凝血因子VII(即具有美國專利4,784,950公開的氨基酸序列的多肽)及與野生型凝血因子VII相比表現(xiàn)出幾乎相同或更高的生物活性的凝血因子VII變體、凝血因子VII衍生物和凝血因子VII綴合物。術(shù)語"凝血因子vn，，包括非剪切(酶原)形式以及被蛋白水解加工產(chǎn)生它們各自的活性形式的凝血因子VII多肽，其可為指定凝血因子VIIa。通常凝血因子VII在殘基152和153之間被剪切產(chǎn)生凝血因子VIIa。術(shù)語"凝血因子VII多肽，，也包括與野生型凝血因子Vila的活性相比其凝血因子Vila生物活性被顯著改變或有些降低的多肽，包括變體。這些多肽包括但不限于這類凝血因子VII或凝血因子VIIa，其中引入了可改變或干擾該多肽生物活性的特異氨基酸序列變動。凝血因子Vila凝血方面的生物活性來自于其(i)與組織因子(TF)結(jié)合和(ii)催化凝血因子IX或凝血因子X蛋白水解產(chǎn)生活化凝血因子IX或X(分別為凝血因子IXa或Xa)的能力。在本文中，術(shù)語"功能活性凝血因子VII多肽，，指被蛋白水解加工產(chǎn)生其各自生物活性形式的"凝血因子VII多肽"，其也常被稱作"凝血因子VIIa多肽"。在一些重要的實施方案中，該凝血因子VII多肽是具有功能活性的。如本文所使用，"野生型人FVIIa"為具有美國專利4,784,950中公開的氨基酸序列的多肽。如本文所使用的術(shù)語"凝血因子VII衍生物"指顯示出與野生型凝血因子VII相比生物活性幾乎相同或4是高的FVII多肽，其中母體肽的一個或多個氨基酸被基因工程和/或化學(xué)和/或酶催化修飾，例如通過烷基化、糖基化、PFG化、?；?、酯形成或酰胺形成或類似方式。這包括但不限于PEG化人凝血因子VIIa、半胱氨酸-PEG化人凝血因子Vila及其變體。凝血因子VII衍生物的非限制性實例包括如WO03/31464和美國專利申請US20040043446、US20040063911、US20040142856、US20040137557和US2004132640(NeoseTechnologies公司)公開的糖基PEG化FVII衍生物；如WO01/0428、美國專利申請20030165996、WO01/58935、WO03/93465(MaxygenApS)和WO02/02764、美國專利申請20030211094(明尼蘇達大學(xué))公開的FVII綴合物。術(shù)語"提高的生物活性，，指i)與重組野生型人凝血因子VIIa相比具有幾乎相同或增強的蛋白水解活性的FVII多肽或ii)與重組野生型人凝血因子Vila相比具有幾乎相同或增強的TF結(jié)合活性的FVII9多肽或iii)與重組野生型人凝血因子Vila相比具有幾乎相同或增加的血漿半衰期的FVII多肽。術(shù)語"PEG化人凝血因子VIIa，，指具有與人凝血因子Vila多肽綴合的PEG分子的人凝血因子FVIIa。需要理解的是該PEG分子可與凝血因子Vila多肽的任何部分結(jié)合，包括該凝血因子Vila多肽的任何氨基酸殘基或碳水化合物部分。術(shù)語"半胱氨酸-PEG化人凝血因子VIIa，，指具有與引入人凝血因子Vila的半胱氨酸的巰基綴合的PEG分子的凝血因子VIIa。可使凝血因子多肽與重組野生型人凝血因子Vila相比具有幾乎相同或增強的蛋白水解活性的其他氨基酸置換的非限制性實例包括S52A、S60A(Lino等.，Arch.Biochem.Biophys.352:182-192，1998);如美國專利5,580,560公開的可使FVIIa多肽顯示出增強的蛋白水解穩(wěn)定性的置換；可提供在殘基290和291或殘基315和316之間被蛋白水解剪切的FVIIa多肽的置換(Mollerup等.，Biotechnol.Bioeng.48:501-505，1995);凝血因子Vila的氧化形式(Komfelt等.，Arch.Biochem.Biophys.363:43-54，1999);如WO02/077218公開的FVIIa多肽中的置換；如WO02/38162(ScrippsResearchInstitute)公開的顯示出增強的蛋白水解穩(wěn)定性的FVIIa多肽中的置換；如WO99/20767、美國專利US6017882和US6747003、美國專利申請20030100506(明尼蘇達大學(xué))和WO00/66753、美國專利申請US20010018414、US2004220106、US200131005、美國專利US6762286和US6693075(明尼蘇達大學(xué))公開的可使該多肽具有被修飾的Gla-結(jié)構(gòu)域并顯示出更強的膜結(jié)合力的FVIIa多肽中的置換；以及WO01/58935、美國專利US6806063、美國專利申請20030096338(MaxygenApS)、WO03/93465(MaxygenApS)、WO04/029091(MaxygenApS)、WO04/083361(MaxygenApS)和WO04/111242(MaxygenApS)以及WOWO04/108763(CanadianBloodServices)中^>開的FVIIa多肽中的置換。可使FVIIa多肽與野生型FVIIa相比生物學(xué)活性增加的其它置換10的非限制性實例包括WO01/83725、WO02/22776、WO02/077218、WO03/027147、WO04/029090、WO03/027147、WO02/38162(ScrippsResearchInstitute)中公開的置換；和如JP2001061479(Chemo-Sero-TherapeuticResInst)中公開的活性增強的FVIIa多肽。本發(fā)明FVIIa多肽的其它置換實例包括但不限于L305V、L305V/M306D/D309S、L305I、L305T、F374P、V158T/M298Q、V158D/E296V/M298Q、K337A、M298Q、V158D/M298Q、L305V/K337A、V158D/E296V/M298Q/L305V、V158D/E296V/M298Q/K337A、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A、K157A、E296V、E296V/M298Q、V158D/E296V、V158D/M298K、andS336G、L305V/K337A、L305V/V158D、L305V/E296V、L305V/M298Q、L305V/V158T、L305V/K337A/V158T、L305V/K337A/M298Q、L305V/K337A/E296V、L305V/K337A/V158D、L305V/V158D/M298Q、L305V/V158D/E296V、L305V/V158T/M298Q、L305V/V158T/E296V、L305V/E296V/M298Q、L305V/V158D/E296V/M298Q、L305V/V158T/E296V/M298Q、L305V/V158T/K337A/M298Q、L305V/V158T/E296V/K337A、L305V/V158D/K337A/M298Q、L305V/V158D/E296V/K337A、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、S314E/K316H、S314E/K316Q、S314E/L305V、S314E/K337A、S314E/V158D、S314E/E296V、S314E/M298Q、S314E/V158T、K316H/L305V、K316H/K337A、K316H/V158D、K316H/E296V、K316H/M298Q、K316H/V158T、K316Q/L305V、K316Q/K337A、K316Q/V158D、K316Q/E296V、K316Q/M298Q、K316Q/V158T、S314E/L305V/K337A、S314E/L305V/V158D、S314E/L305V/E296V、S314E/L305V/M298Q、S314E/L305V/V158T、S314E/L305V/K337A/V158T、S314E/L305V/K337A/M298Q、S314E/L305V/K337A/E296V、iiS314E/L305V/K337A/V158D、S314E/L305V/V158D/M298Q、S314E/L305V/V158D/E296V、S314E/L305V/V158T/M298Q、S314E/L305V/V158T/E296V、S314E/L305V/E296V級98Q、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A、S314E/L305V/V158D/K337A/M298G、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、K316H/L305V/K337A、K316H/L305V/V158D、K316H7L305V/E296V、K316H/L305V/M298Q、K316H/L305V/V158T、K316H/L305V/K337A/V158T、K316H/L305V/K337A/M298Q、K316H/L305V/K337A/E296V、K316H/L305V/K337A/V158D、K316H/L305V/V158D/M298Q、K316H/L305V/V158D/E296V、K316H/L305V/V158T/M298Q、K316H/L305V/V158T/E296V、K316H/L305V/E296V/M298Q、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、K316Q/L305V/K337A、K316Q/L305V/V158D、K316Q/L305V/E296V、K316Q/L305V/M298Q、K316Q/L305V/V158T、K316Q/L305V/K337A/V158T、K316Q/L305V/K337A/M298Q、K316Q/L305V/K337A/E296V、12K316Q/L305V/K337A/V158D、K316Q/L305V/V158D緒98Q、K316Q/L305V/V158D/E296V、K316Q/L305V/V158T/M298Q、K316Q/L305V/V158T/E296V、K316Q/L305V/E296V/M298Q、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、F374Y/K337A、F374Y/V158D、F374Y/E296V、F374Y/M298Q、F374Y/V158T、F374Y/S314E、F374Y/L305V、F374Y/L305V/K337A、F374Y/L305V/V158D、F374Y/L305V/E296V、F374Y/L305V/M298Q、F374Y/L305V/V158T、F374Y/L305V/S314E、F374Y/K337A/S314E、F374Y/K337A/V158T、F374Y/K337A/M298Q、F374Y/K337A/E296V、F374Y/K337A/V158D、F374Y/V158D/S314E、F374Y/V158D/M298Q、F374Y/V158D/E296V、F374Y/V158T/S314E、F374Y/V158T/M298Q、F374Y/V158T/E296V、F374Y/E296V/S314E、F374Y/S314E/M298Q、F374Y/E296V/M298Q、，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/V158D、F374Y/L305V/K337A/E296V、F374Y/L305V/K337A/M298Q、F374Y/L305V/K337A/V158T、F374Y/L305V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V、F374Y/L305V/V158D/M298Q、F374Y/L305V/V158D/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q、F374Y/L305V/E296V/V158T、F374Y/L305V/E296V/S314E、F374Y/L305V/M298Q/V158T、F374Y/L305V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158T/S314E、F374Y/K337A/S314E/V158T、F374Y/K337A/S314E/M298Q、F374Y/K337A/S314E/E296V、13F374Y/K337A/S314E/V158D、F374Y/K337A/V158T/M298Q、F374Y/K337A/V158T/E296V、F374Y/K337A/M298Q/E296V、F374Y/K337A/M298Q/V158D、F374Y/K337A/E296V/V158D、F374Y/V158D/S314E/M298Q、F374Y/V158D/S314E/E296V、F374Y/V158D/M298Q/E296V、F374Y/V158T/S314E/E296V、F374Y/V158T/S314E/M298Q、F374Y/V158T/M298Q/E296V、F374Y/E296V/S314E/M298Q、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V級98Q、F374Y/L305曹158D/M298Q/K337A、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A、14F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E、S52A、S60A;R152E、S344A、T106N、K143N/N145T、V253N、R290N/A292T、G291N、R315N/V317T、K143N/N145T/R315N/V317T;及從233THr至240Asn的氨基酸序列的置換、添加或刪除；從304Arg至329Cys的氨基酸序列的置換、添加或刪除；和從153Ile至223Arg的氨基酸序列的置換、添加或刪除。如本文中使用，術(shù)語"一個變異體"或"多個變異體"指具有美國專利4,784,950中公開的氨基酸序列的凝血因子VII，其中母體蛋白質(zhì)的一個或多個氨基酸被另一種氨基酸置換和/或母體蛋白質(zhì)的一個或多個氨基酸被刪除和/或在蛋白質(zhì)中插入了一個或多個M酸和/或在母體蛋白質(zhì)中添加了一個或多個氨基酸。這些添加可發(fā)生在母體蛋白質(zhì)的N-端和/或C-端。這一定義下的"一個變異體"或"多個變異體"的活性形式仍然具有FVII活性。在一個實施方案中變體與美國專利4，784，950公開的氨基酸序列70%相同。在一個實施方案中，變體與15美國專利4,784,950公開的氨基酸序列80%相同在一個實施方案中，變體與美國專利4，784，950公開的氨基酸序列95%相同。在本文中術(shù)語"組織因子多肽"指包含組織因子可溶性外結(jié)構(gòu)域即氨基酸1-219(下文中被稱作sTF或sTF(l-219))或其功能變體或截短形式的多肽。該組織因子多肽優(yōu)選至少包含與組織因子6-209氨基酸序列相應(yīng)的片段。其實例具體為sTF(6-209)、sTF(l-209)和sTF(l-219)。成熟人組織因子(1-263)的氨基S交序列見SEQIDNO:2并公開于Spicer爭.(1987)戶raciVa".^c^/.L^4，84,5148-5152。Ser'-Gly-Thr-Thr-Asn-Thr-Val-Ala-Ala-Tyi^-Asn-Leu-Thr-Trp-Lys-Ser-Thr-Asn-Phe-Lys20-Thr-Ile-Leu-Glu-Trp-Glu-Pro-Lys-Pro-Val30-Asn-Gln-Val-Tyr-Thr-Val-Gln-Ile-Ser-Thr40-Lys-Ser-Gly-Asp-Trp-Lys-Ser-Lys-Cys-Phe50-Tyr-Thr-Thr-Asp-Thr-Glu-Cys-Asp-Leu-Thr60-Asp-Glu-Ile-Val-Lys-Asp-Val-Lys-Gln-Thr70-Tyr-Leu-Ala-Arg-Val-Phe-Ser-Tyr-Pro-Ala80-Gly-Asn-Val-Glu-Ser-Thr-Gly-Ser-Ala-Gly90-Glu-Pro-Leu-Tyr-Glu-Asn-Ser-Pro-Glu-Phe勵-Thr-Pro畫Tyr-Leu-Glu-Thr-Asn-Leu-Gly-Gln110-Pro-Thr-Ile-Gln-Ser-Phe-Glu-Gln-Val-Gly120-Thr-Lys-Val-Asn-Val-Thr-Val-Glu-Asp-Glu130-Arg-Thr-Leu-Val-Arg-Arg-Asn-Asn-Thr-Phe14()-Leu-Ser-Leu-Arg-Asp-Val-Phe-Gly-Lys-Asp150-Leu-Ile-Tyr-Thr-Leu-Tyr-Tyr-Trp-Lys-Ser160-Ser-Ser-Ser-Gly-Lys-Lys-Thr-Ala-Lys-Thr17。-Asn-Thr-Asn-Glu-Phe-Leu-Ile-Asp-Val-Asp咖-Lys畫Gly-Glu-Asn-Tyr陽Cys-Phe-Ser畫Val-Gln19o畫Ala-Val-Ile-Pro-Ser畫Arg-Thr-Val-Asn-Arg，-Lys-Ser-Thr隱Asp-Ser-Pro-Val-Glu-Cys-Met210-Gly-Gln-Glu-Lys-Gly-Glu-Phe-Arg-Glu-Ile220-Phe-Tyr-Ile-Ile-Gly-Ala-Val-Val-Phe-Val230-Val-Ile-Ile-Leu-Val-Ile-Ile-Leu-Ala-Ile240-Ser-Leu-His-Lys-Cys-Arg-Lys-Ala-Gly-Val250-Gly-Gln-Ser-Trp-Lys-Glu-Asn-Ser-Pro-Leu260-Asn-Val-Ser263(SEQIDNO:2)。在本文中，術(shù)語"一個指定連接，，或"多個指定連接，，指該凝血因子VII多肽和該組織因子多肽通過一組或多組共價連接的氨基酸側(cè)鏈(可能通過接頭部分)的方式共價連接，其中至少90%復(fù)合物種類的組就整個復(fù)合物種類群中各組內(nèi)兩個氨基酸的至少一個的位置和類型而言是相同的。該類連接可以是氨基酸側(cè)鏈之間建立的直接連鍵例如半胱氨酸氨基酸側(cè)鏈之間的S-S橋形式，或通過連接氨基酸側(cè)鏈的接頭部分的方式。優(yōu)選至少95%或甚至至少98%或甚至全部復(fù)合物種類(的組)就整個復(fù)合物種類群中各組內(nèi)兩個氨基酸的至少一個的位置和類型而言是相同的。共價連接的氨基酸側(cè)鏈組的數(shù)量并不非常關(guān)鍵，但是鑒于本實驗結(jié)果，我們認為只有一個組是必需的。由于連接是"指定的"，即每一組內(nèi)兩個氨基酸的至少一個的位置和類型是預(yù)先確定的，需要理解的是可以保持甚至增強相關(guān)多肽的功能性和蛋白水解活性，與使用普通(同基)雙功能交聯(lián)劑的"散彈(shotgun)"法相反。由于這一點，我們認為共價連接氨基酸側(cè)鏈組的數(shù)量通常在1-10的范圍內(nèi)，例如1-5,如1_4,或1-3、1-2，或2-4，或2-3,或1或2個連接，尤其是1或2個連接，優(yōu)選僅一個連接?？赏ㄟ^在一個或兩個多肽(均可與另一多肽的氨基酸反應(yīng))中引入一個或多個氨基酸，或通過加入可與一個或多個特異氨基酸(優(yōu)選1-10個氨基酸)反應(yīng)的交聯(lián)劑(最優(yōu)選異基雙功能交聯(lián)劑)形成一個或多個指定連接。在一個重要的實施方案中，各凝血因子VII多肽和組織因子多肽包括一個或多個半胱氨酸氨基酸，其并未被指定建立分子間的二硫鍵但是其可在該凝血因子VII多肽和該組織因子多肽之間形成分子間二硫鍵，即共價連接。為了保持凝血因子VII多肽的蛋白水解活性，如果該半胱氨酸位于相應(yīng)的非共價連接復(fù)合物中凝血因子VII多肽和組織因子多肽之間的天然界面中是有利的，如圖l所示。如果成功設(shè)計的話，該分子間二硫4定可穩(wěn)定該化合物并促進凝血因子Vila具有催化活性構(gòu)象的形17成。通過應(yīng)用該凝血因子VIIa/組織因子復(fù)合物的X-射線結(jié)構(gòu)(尤其是PDB登記號為1DAN的結(jié)構(gòu)(Banner等.(1996)Nature,380,41-46))進行該二硫鍵設(shè)計。在兩個引入的半胱氨酸氨基酸之間建立二硫鍵的一個重要標準是它們Ca原子之間的距離應(yīng)小于7A(Petersen等.(1999)ProteinEng.,12，535-548)。對凝血因子VIIa-組織因子復(fù)合物中凝血因子VIIa和組織因子的Ca原子之間距離的計算得到17個潛在的半胱氨酸對。通過建模該二硫化物(使用CHARMMpackage,Accelrys:SanDiego)然后視覺檢查進行這些氨基酸之間形成二硫鍵可行性的進一步評價。然后將滿足Petersen等(1999)ProteinEng.,12,535-548設(shè)立的條件的二硫化物作為生化評價的候選。在另一個實施方案中，凝血因子VII多肽和/或組織因子多肽包括一個或多個反應(yīng)性氨基酸，尤其是光-反應(yīng)性氨基酸，其在光活化后可在凝血因子VII多肽和組織因子多肽之間形成相應(yīng)的分子間連鍵，即共價連接。該光-反應(yīng)性氨基酸的實例包括Suchanek等(Suchaneketal.2005;seeSchemel)研發(fā)的光-異亮氨酸(photo-Ile)、光-曱硫氨酸(photo-Met)和光-亮氨酸(photo-Leu),以及對-苯甲酰基-L-苯丙氨酸。Suchanek等.(2005)Ato"w2，261-267描述了在蛋白質(zhì)中摻入photo-Ile、photo-Met和photo-Leu之后進行光誘導(dǎo)交聯(lián)?；蛘呖赏ㄟ^一個或多個凝血因子VII多肽氨基酸和組織因子多肽氨基酸的組的氨基酸側(cè)鏈之間的接頭部分建立一個或多個指定連接。方案118該接頭部分的實例來自異基雙功能試劑，當凝血因子VII多肽與組織因子多肽形成非共價連接復(fù)合物時其可與特異氨基酸側(cè)鏈例如多肽之一的半胱氨酸側(cè)鏈反應(yīng)并接著可與該特異氨基酸側(cè)鏈空間接近的另一氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)。尤其適用的異基雙功能試劑實例為可首先與半胱氨酸氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)并接著(優(yōu)選活化后，如光活化或銠催化)可與空間接近的另一個氨基酸側(cè)鏈反應(yīng)的試劑。具體實例公開于Zhang等.(Biochem.Biophys.Res.Comm.,Vol.217,3，1995，1177-1184),例如對-疊氮碘乙酰苯胺、對-疊氮溴苯乙酮和對-疊氮溴乙酰苯胺，和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>N-(4-疊氮-2,3,5,6-四氟節(jié)基)-3-馬來酰亞胺基丙酰胺，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>硫曱磺酸4-疊氮-2，3，5，6-四氟苯曱酰氨基半胱氨酸酯，N-((2-吡啶基二硫基)乙基)-4-疊氮水楊酰胺,11+等。鑒于以上內(nèi)容，很明顯在通過反應(yīng)性側(cè)鏈或異基雙功能試劑的方式建立共價連接的實施方案中可能導(dǎo)致產(chǎn)生并不是所有的種類都相同的復(fù)合物種類群。這是由于反應(yīng)性側(cè)鏈(如光反應(yīng)性側(cè)鏈)和異基雙功能試劑(甚至在與氨基酸側(cè)鏈特異反應(yīng)之后)可能在進一步反應(yīng)>1-(2-((2-(((4-疊氮-2,3,5，6-四氟)苯曱酰基)氨基)乙基)二硫基)乙基)馬來酰亞胺，二硫基)丙酰胺，'N'基匕,，M基\=勤氨楊氮疊-20中遇到不止一個潛在的"反應(yīng)配偶體"，盡管隨著側(cè)鏈/試劑的大小(長度)的降低"反應(yīng)配偶體"的數(shù)量會大大降低。然而在一些實施方案中，可以通過僅存在一種可能的"反應(yīng)配偶體"的方式篩選相關(guān)的氨基酸側(cè)鏈(或雙功能試劑)。當連接形式為二硫鍵時更是如此，因為可能的"反應(yīng)配偶體"(即另一個半胱氨酸)的數(shù)量非常有限。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了以上定義的復(fù)合物，其中凝血因子多肽和組織因子多肽通過(i)凝血因子VII多肽的氨基酸和(ii)組織因子多肽的氨基酸的組的氨基酸側(cè)鏈之間的一個或多個特異連接的方式共價連接。在本文中，術(shù)語"一個特定連接，，和"多個特定連接，，指凝血因子VII多肽和組織因子多肽通過一組或多組共價連接氨基酸側(cè)鏈(可能通過接頭部分)的方式共價連接，其中至少90%復(fù)合物種類的組就整個復(fù)合物種類群中各組內(nèi)兩個氨基酸的至少一個的位置和類型而言是相同的。優(yōu)選至少95%或甚至至少98%或甚至全部復(fù)合物種類(的組)就整個復(fù)合物種類群中各組內(nèi)兩個氨基酸的至少一個的位置和類型而言是相同的。更優(yōu)選將一個或多個特異連接建立為一個或多個凝血因子VII多肽氨基酸和組織因子多肽氨基酸的組的氨基酸側(cè)鏈之間的一個或多個直接連鍵。因此本發(fā)明進一步提供了上文定義的復(fù)合物，其中凝血因子VII多肽和組織因子多肽通過一個或多個(i)凝血因子VII多肽氨基酸和(ii)組織因子多肽氨基酸的組的氨基酸側(cè)鏈之間的一個或多個直接連鍵的方式共價連接。在本文中術(shù)語"一個直接連鍵，，和"多個直接連鍵"指凝血因子VII多肽氨基酸側(cè)鏈和組織因子多肽氨基酸側(cè)鏈之間至少一個共價連接不包含來自交聯(lián)劑、試劑等的殘基，而是由來自于各自氨基酸側(cè)鏈的21原子形成，例如以半胱氨酸氨基酸側(cè)鏈之間S-S橋的形式，然而考慮到該類氨基酸不必為天然氨基酸所以也可能是例如光-反應(yīng)性側(cè)鏈。因此，直接連鍵的形成不包括雙功能試劑及類似試劑?；谏鲜鰞?nèi)容，優(yōu)選包含一個或多個半胱氨酸氨基酸的氨基酸組。在一個變體中，各組包含一個半胱氨酸氨基酸，例如用于和異基雙功能試劑偶聯(lián)。在另一個變體中，各組包含兩個半胱氨酸氨基酸。在該變體中建立了二硫鍵。研究發(fā)現(xiàn)蛋白水解活性被大部分保留或者甚至被增強。因此在優(yōu)選的實施方案中經(jīng)本文定義的體外蛋白水解檢測測定，凝血因子Vila多肽的蛋白水解活性是游離天然(野生型)凝血因子VIIa的至少2倍，例如至少50倍，如至少100倍，例如至少200倍或至少250倍。因此，本文也涉及凝血因子Vila多肽與組織因子多肽的共價復(fù)合物，其中該凝血因子VIIa多肽和該組織因子多肽通過(i)凝血因子Vila多肽氨基酸和(ii)組織因子多肽氨基酸的組的氨基酸側(cè)鏈之間一個或多個連接的方式共價連接，其中經(jīng)本文定義的體外蛋白水解試驗測定，凝血因子Vila多肽的蛋白水解活性是游離天然(野生型)凝血因子VIIa的至少2倍，例如至少50倍，如至少100倍，例如至少200倍或至少250倍。如上所述，該組織因子多肽為組織因子的可溶性外結(jié)構(gòu)域(1-219)或其功能變體或截短形式。在一些重要的實施方案中，該可溶性組織因子多肽的Thrl7、Lys20、Ile22、Ser42、Gly43、Asp44、Trp45、Lys46、Ser47、Phe50、Cys57、Asp58、Asp61、Glyl09、GlnllO、Leul33、Ser205、Pro206和Val207,尤其是該可溶性組織因子多肽的Trp45、Asp58、Glyl09、Pro206和Val207位上的至少一個氨基酸被含有可生成指定連接如特異連接尤其是直接連鍵的反應(yīng)性側(cè)鏈的氨基酸置換。在優(yōu)選的變體22中，該至少一個氨基酸為半胱氨酸。在其他重要的實施方案中，優(yōu)選與之前所述結(jié)合，該凝血因子VII多肽的Leu39、Phe40、Ile42、Ser43、Tyr44、Gln64、Leu65、Ile69、Glu77、Gly78、Arg79、Val92、Phe275、Val276、Arg277、Met306、Thr307和Glu325,尤其是該凝血因子VII多肽的Phe40、Ser43、Gln64、Glu77和Phe275位上的至少一個氨基酸被含有可生成指定連接如特異連接尤其是直接連鍵的反應(yīng)性側(cè)鏈的氨基酸置換。在優(yōu)選的變體中，該至少一個M酸為半胱氨酸。更具體而言，以下氨基酸組中至少一組FVII-Ile69—sTF-Thr17,FVII畫Ile69-sTF-Lys20，F(xiàn)VII-Arg79—sTF-Ile22，F(xiàn)VII-Va192-sTF-Ser47，F(xiàn)VII-Va192-sTF-Phe50,FVII-Gly78—sTF-Cys57,FVII畫Glu77-sTF畫Asp58,FVII-Gly78-sTF-Asp58,FVII-Arg79-sTF-Asp58,FVII-Arg277-sTF-Ser42，F(xiàn)VII-Va1276—sTF-Gly43,FVII-Arg277—sTF-Gly43,FVII-Phe275—sTF-Asp44，F(xiàn)VII-Va1276—sTF-Asp44,FVII-Arg277—sTF-Asp44,FVII-Phe275—sTF-Trp45，F(xiàn)VII-Va1276-sTF-Trp45,FVII畫Arg134—sTF-Trp45,FVII-Phe275-sTF-Lys46,FVII-Gln64—sTF-Gly109,FVII-Gln64—sTF-Glnl10，F(xiàn)VII-Leu65-sTF-Gln110，F(xiàn)VII-Phe71-sTF畫Leu133，F(xiàn)VII-Ser43-sTF-Ser205,FVII-Leu39—sTF-Pro206,FVII-Phe40—sTF-Pro206，F(xiàn)VII-Ile42-sTF-Pro206,FVII-Ser43—sTF-Pro206，F(xiàn)VII匿Tyr44-sTF-Pro206，F(xiàn)VII-Leu39-sTF-Val207,FVII-Phe40—sTF陽Val207和FVII-Ser43—sTF-Val207，尤其是以下氨基酸組中至少一組FVII-Phe40-sTF-Val207,FVII陽Ser43-sTF-Pro206,FVII-Gln64-sTF-Gly109,FVII-Glu77-sTF畫Asp58,和FVII隱Phe275—sTF陽Trp45的一個或兩個氨基酸被含有可生成指定連接如特異連接尤其是直接連鍵的反應(yīng)性側(cè)鏈的氨基酸置換。在優(yōu)選的變體中，至少一個直接連鍵為二硫鍵，即兩個半胱氨酸氨基酸之間的鍵。更優(yōu)選所有的共價連接為二硫鍵形式的直接連鍵。具體而言，該鍵的數(shù)量為1-5，尤其是1個鍵。在另一個變體中，至少一個直接連鍵是通過光-反應(yīng)性氨基酸形成的，尤其是選自photo-Ile、photo-Leu和photo-Met的光-反應(yīng)性氨基酸。在又一個實施方案中該凝血因子VII多肽和該組織因子多肽通過(i)凝血因子Vila多肽氨基酸和(ii)組織因子多肽氨基酸的組的氨基酸側(cè)鏈之間的接頭部分的方式共價連接。具體而言，該接頭部分來自異基雙功能試劑。復(fù)合物的制備使用異基雙功能試劑交聯(lián)組織因子和凝血因子VII在一個有趣的變體中，制備該復(fù)合物的方法涉及生產(chǎn)可溶性組織因子的半胱氨酸變體，接著用異基雙功能試劑(其中一個官能團為半胱氨酸反應(yīng)性)標記可溶性組織因子的半胱氨酸，最后通過該試劑的第二個官能團與凝血因子Vila交聯(lián)。在大腸桿菌中克隆和表達組織因子半胱氨酸突變體以及之后用半胱氨酸特異性試劑標記的方法之前已描述于(Stone等.(1995)Biochem.J.,310,605-614;Freskgard等.(1996)ProteinSci.，5，1521-1540;Owenius等.(1999)Biophys.J"77,2237-2250;Osterlund等.(2001)Biochemistry,40,9324-9328)。使用包含一個半胱氨酸特異性和一個光可激活官能團的異基雙功能試劑光交聯(lián)連接蛋白質(zhì)已描述于Zhang等.(l995)Biochem.Bi叩hys.Res.Commun.,217,1177-1184。凝血因子VII多肽和組織因子多肽的共表達在一個尤其有趣的變體中，制備該復(fù)合物的方法涉及共表達凝血因子VII多肽和組織因子多肽，籍此可輕松建立兩個多肽之間的共價連接。更具體而言，本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本文定義的凝血因子VII多肽和組織因子多肽復(fù)合物的方法，該方法包括a)用(i)包含編碼凝血因子VII多肽的核酸和與其操作性連接的表達控制區(qū)域的表達載體和(ii)包含編碼組織因子多肽的核酸和與其操作性連接的表達控制區(qū)域的表達載體轉(zhuǎn)染細胞，b)在表達凝血因子VII多肽和組織因子多肽的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染細胞，及c)通過適當方法分離表達的復(fù)合物。在本文一個特別有趣的實施方案中，這兩個多肽通過特異連接的方式連接，更具體而言是通過直接連鍵，如凝血因子VII多肽和組織25因子多肽之間的一個或多個二硫4建。蛋白質(zhì)生產(chǎn)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知蛋白質(zhì)在細胞中的表達。在實施本發(fā)明方法時，所使用細胞通常為真核細胞，更優(yōu)選已建立的真核細胞系，包括但不限于CHO(例如，ATCCCCL61)、COS-l(例如，ATCCCRL1650)、幼倉鼠腎(BHK)和HEK293(例如，ATCCCRL1573;Graham等，《/Wra/.36:59-72,1977)細胞系。優(yōu)選的BHK細胞系為tk-tsl3BHK細月包系(Waechter和Baserga,尸rac.iV^/.爿cadSc/.L/SJ79:1106-1110,1982)，下文中稱作BHK570細胞系。該BHK570細胞系可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(12301ParklawnDr.，Rockville，MD20852)獲得，ATCC登錄號為CRL10314。tk-tsl3BHK細胞系也從ATCC獲得，登錄號為CRL1632。優(yōu)選的CHO細胞系為ATCC登錄號為CCI61的CH0K1細胞系。其它適合的細胞系包括但不限于RatHepI(Rathepatoma;ATCCCRL1600)、RatHepII(Rathepatoma;ATCCCRL1548)、TCMK(ATCCCCL139)、人肺細胞(ATCCHB8065)、NCTC1469(ATCCCCL9.1);DUKX細胞(CHO細胞系)(Urlaub和Chasin,Prac.A^f/.^cad5W.L/iM77:4216-4220，1980)(DUKX細胞也被稱作DXB11細胞)和DG44(CHO細胞系)(Ce〃,33:405,1983，體細胞和分子遺傳學(xué)(5bma"cCe〃<^cA/o/ecw/arGewe"cs)12:555,1986)。其它可用的纟田胞為3T3細胞、Namalwa細胞、骨髓瘤及骨髓瘤和其它細胞的融合體。在一些實施方案中該細胞可為突變或重組細胞，例如與它們的來源細胞類型表達數(shù)量或性質(zhì)不同的可催化蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾(如糖基化酶例如羰基轉(zhuǎn)移酶和/或糖苷酶，或加工酶例如前肽)的酶的細胞。適當?shù)睦ハx細胞系包括但不限于鱗翅目細胞系，例如草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)纟田月包或斗分纟丈4支蛾(Trichoplusiani)細月包(例如見US5077214)。在一些實施方案中，用于實施本發(fā)明的細胞可在懸浮培養(yǎng)基中生長。如本文所使用，具有懸浮能力的細胞為可在懸浮液中生長而不會26形成大塊、堅實凝聚物的細胞，即單分散或形成杠\散凝聚物且每個聚集物中僅包含數(shù)個細胞的細胞。具有懸浮能力的細胞包括但不限于不需要適應(yīng)或處理就可懸浮生長的細胞(例如造血細胞或淋巴樣細胞)和通過貼壁細胞的逐漸適應(yīng)變得可懸浮生長的細胞(例如上皮細胞或成纖維細胞)。用于實施本發(fā)明的細胞可為粘附細胞(也被稱作錨著依賴細胞或貼壁細胞)。如本文所使用，粘附細胞為需要將自身粘附或錨定至適當表面以繁殖和生長的細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，所使用細胞為粘附細胞。在這些實施方案中，繁殖階段和生產(chǎn)階段包括使用微載體。所使用的粘附細胞在繁殖階段應(yīng)可遷移至載體之上(如果使用大孔載體還應(yīng)進入該載體的內(nèi)部結(jié)構(gòu))并在被轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)生物反應(yīng)器時遷移至新的載體。如果粘附細胞自身遷移至新載體的能力不足，可通過將含有細胞的微載體與蛋白質(zhì)水解酶或EDTA接觸將其從載體釋放。所使用的培養(yǎng)基(尤其當不含有來自動物的組分時)應(yīng)進一步包含適于支持粘附細胞的組分；適用于培養(yǎng)粘附細胞的培養(yǎng)基可從供應(yīng)廠商購得，例如Sigma。該細胞也可為懸浮適應(yīng)性或具有懸浮能力的細胞。如果使用了這類細胞，細胞繁殖可在混懸液中進行，因此微載體只用于其生產(chǎn)培養(yǎng)器中的終繁殖階^歐和生產(chǎn)階段。在使用懸浮適應(yīng)性細胞的情況下，所使用的微載體通常為大孔載體，其中細胞通過物理包埋的方式附于載體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)內(nèi)。在該類實施方案中，真核細胞通常選自CHO、BHK、HEK293和骨髓瘤細胞等。也可在大腸桿菌或細菌或轉(zhuǎn)基因動物中共表達凝血因子VII多肽和組織因子多肽，例如如國際專利申請WO05/075635所公開。實施例用于下列實施例的氨基酸置換的命名法如下。第一個字母表示天然存在于SEQIDNO:l或SEQIDNO:2位置上的氨基酸。接下來的數(shù)字表示在SEQIDNO:l或SEQIDNO:2中的位置。第二個字母表27示置換天然氨基酸的不同氨基酸。例如凝血因子VilaF40C，其中SEQIDNo:l40位的苯丙氨酸被半胱氨酸置換。在另一個例子sTF(l-219)V207C中，SEQIDN0:2207位的丙氨酸被半胱氨酸置換。實施例1#存-D-Phe-Phe-Arg-氯曱基酮購自Bachem。生色的Z畫D-Arg-Gly-Arg-p-硝基苯胺(S-2765)和H-D-Ile-Pro-Arg-p-硝基苯胺(S-2288)底物購自Chromogenix(Sweden)。人血漿衍生的凝血因子X(hFX)、凝血因子Xa(hFXa)和凝血因子IXa(hFIXa)購自EnzymeResearchLaboratoriesLtd.(SouthBend,IN)。人全月齒Marathon-readycDNA文庫購自CIontech(MountainView,CA)。根據(jù)已公開文獻(Freskg&rd等(1996)ProteinSci.，5,1531-1540)制備在大腸桿菌中表達的可溶性組織因子1-219(sTF(l-219))。根據(jù)之前所述(Thim等.(1988)Biochemistry,27，7785-7793;Persson等.(1996)FEBSLett"385，241-243)表達和純化重組凝血因子VIIa。其它試劑均為分析純或更高等級。森碼凝j/fe西fF7/々凝j&西fF7/i^K^^r雄^Z)A^使用引物oHOJ104-f及oHOJ104-r,并根據(jù)操作說明使用ExpandHighFidelityPCR體系(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN)擴增包括其前(信號序列)和后-區(qū)的凝血因子VII的DNA編碼序列，引入限制性酶切位點Mzel和Wort(引物序列見表1)。用于PCR反應(yīng)的DNA模板為公開于國際專利申請WO02/077218的pLN174。用Nhel和Notl剪切已純化的PCR產(chǎn)物，然后連接進pCI-neo(Promega,Madison,WI)的相應(yīng)位點得到pHOJ300。天然(野生型)凝血因子VII的氨基酸見SEQIDNO:l。包括其前(信號序列)和后-區(qū)的天然(野生型)凝血因子VII的DNA序列見SEQIDNO:3。根據(jù)操作說明通過QuickChange定點突變(Stratagene，LaJolla,CA)使用引物oHOJ143-f、oHOJ143-r和pHOJ300作為才莫板構(gòu)建編碼凝血因子F40C的質(zhì)粒pHOJ344。通過DNA測序驗證所有克隆序列28的正確性。引物oHOJ152-f和oHOJ152-r，以及根據(jù)操作說明使用ExpandHighFidelityPCR體系(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN)通過PCR從人全腦cDNA文庫(Marathon-readycDNA;ClontechLaboratoriesInc.,MountainView,CA)中擴增包括其信號序歹'J的sTF(l-219)DNA編碼序列，引入側(cè)翼A^el和io1限制性酶切位點(引物序列見表1)。用Nhel和Xhol剪切已純化的PCR產(chǎn)物然后連接至pCI-neo(Promega,Madison,WI)的相應(yīng)位點得到pHOJ356。表1-用于構(gòu)建質(zhì)粒的寡聚DNA引物質(zhì)粒序列(5，—3')oHOJ104-fpHOJ300GGCGGCGGCTAGCATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCoHOJ104-rpHOJ300CCGCCGCCGCGGCCGCCTAGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGGoHOJ143-fp腦344GCGGAGAGGACGAAGCTGTGCTGGATTTCTTACAGTGATGoHOJ143-rpHOJ344CATCACTGTAAGAAATCCAGCACAGC丁丁CGTCCTCTCCGCoHOJ152-fpHOJ356GGCGGCGGGCTAGCATGGAGACCCCTGCCTGGCCCCGGoHOJ152-rpHOJ356CCGCCGCCCTCGAGTTATTCTCTGAATTCCCCTTTCTCCTGGo歸144-fpHOJ357GAGTACAGACAGCCCGTGCGAGTGTATGGGCCAGo簡144-rpHOJ357CTGGCCCATACACTCGCACGGGCTGTCTGTACTCsTF(l-219)的氨基酸見SEQIDNO:4。包括其信號序列的29sTF(l-219)DNA序列見SEQIDNO:5。根據(jù)操作說明通過QuickChange定點突變(Stratagene,LaJolla,CA)使用引物oHOJ144-f、oHOJ144-r和pHOJ356作為模板構(gòu)建編碼sTF(l-219)V207C的質(zhì)粒pHOJ357。通過DNA測序-瞼證所有克隆序列的正確性。凝j&竭fFJ7*s7T(7-2/力K207CW:^4這隱根據(jù)操作說明在Freestyle293表達體系(Invitrogen，Carlsbad,CA)中通過瞬時表達共表達凝血因子VIIaF40C和sTF(l-219)V207C。簡略而言，首先在FreeStyle293表達培養(yǎng)基中(Invitrogen,Carlsbad，CA)建立1.5xl0個細胞的72-ml搖瓶培養(yǎng)物從冷藏保存的培養(yǎng)物繁殖HEK293F細胞(Invitrogen，Carlsbad,CA)。然后在12天的時間內(nèi)將該培養(yǎng)物擴增至2000ml2.2乂109個細胞。細胞于37°C、8%(302的條件下在轉(zhuǎn)速為100-125rpm的定軌搖床培養(yǎng)箱(MultitronII，Infors,Switzerland)中在具有擋板且蓋子松散的圓錐形PEGT搖瓶(Nunc,Denmark)中生長。在擴增培養(yǎng)物之前細胞密度不得超過1.4xl06細胞/ml，并且搖瓶培養(yǎng)物體積保持在約3:1。除起始的72ml培養(yǎng)物外，在所提供的生長培養(yǎng)基中加入維生素Kl至5ppm(Sigma)用于凝血因子的翻譯后Y-羧化作用。然后使已擴增的HEK293F培養(yǎng)物(2000ml,2.2xl09細胞)轉(zhuǎn)染含有800嗎質(zhì)粒pHOJ344(l一l)和1500嗎質(zhì)粒DNApHOJ357(lng/iil)的混合物。向Opti-MEMI溶液(Invitrogen,Carlsbad,CA)中加入質(zhì)粒DNA和239fectinTM(InvitrogenCarlsbad,CA)并將其混合，然后根據(jù)操作說明邊輕微攪拌所得溶液邊向該細胞培養(yǎng)物中逐滴加入已形成的脂質(zhì)DNA復(fù)合物。將已轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物于37°C、8%C02和100rpm溫育96小時后通過離心回收含有凝血因子VilaF40C-sTF(l-219)V207C復(fù)合物的條件生長培養(yǎng)基并保存于-80。C直至進一步加工。凝j^^子FWC-s7T(7-27力K207C《合#^趟化-將加入了CaCb至10mM的條件培養(yǎng)基上樣至含有與CNBr-活化Sepharose4B(AmershamBiosciences,GEHealthcare)偶聯(lián)的單克隆抗體F1A2(NovoNordiskA/S,Bagsvasrd，Denmark)的25-ml柱中。用50mMHEPES、100mMNaCl、10mMCaCl2,pH7.5平衡柱子。用平衡緩沖液和含有2MNaCl的平衡緩沖液沖洗后用含有10mMEDTA而不是CaCl2的平衡緩沖液洗脫已結(jié)合物質(zhì)。然后在所收集的峰組份中加入氯化鈣至終濃度為20mM。為了去除少量的凝血因子VIIaF40C，將該制劑通過l-mlHiTrapNHS柱(GEHealthcare),根據(jù)操作說明將后者與4mgsTF(l-219)偶聯(lián)。在上樣之前用50mMHEPES、100mMNaCl、10mMCaCl2，pH7.5平衡柱子。收集含有凝血因子VIIF40C-sTF(l-219)V207C復(fù)合物但不含可檢測的游離凝血因子VIIF40C和sTF(l-219)V207C的流通物。為了促進對凝血因子VIIF40C-sTF(l-219)V207C復(fù)合物的活化，加入人凝血因子Ixa至終濃度為0.1mg/ml。在還原SDS-PAGE驗證完全活化之后，通過如上所述的FlA2Sepharose4B親和色譜法純化凝血因子VIIaF40C-sTF(l-219)V207C復(fù)合物，只是使用5-ml柱和平衡緩沖液為10mMMES、100mMNaC、10mMCaCl2,pH6.0。將終蛋白制劑等分保存于-80。C?；钚晕稽c滴定檢測-如其它文獻所述(BockP.E.(1992)J.Biol.Chem.:267,14963-14973)在用亞化學(xué)計量水平的D-Phe-Phe-Arg-氯化曱基酮(FFR-cmk)滴定時通過酰胺分解活性的不可逆減少測定天然(野生型)凝血因子Vila和凝血VilaF40C-sTF(l-219)V207C的活性位點的濃度。簡略而言，用50mMHEPES、100mMNaCl、10mMCaCl2、0.01%吐溫80，pH7.0緩沖液將各蛋白質(zhì)稀釋至約300nM的濃度。然后將已稀釋蛋白(20jul)與游離凝血因子Vila情況中的20pi1.5sTF和凝血因子VilaF40C-sTF(l-219)V207C情況中的20pi緩沖液混合，最后與0-1.2|nMFFR-cmk(用緩沖液從溶解于DMSO的FFR-cmk儲備液新鮮制備并保存于-80。C)混合。在室溫下溫育過夜后測定殘余酰31胺分解活性。在聚苯乙烯微量滴定板(Nunc,Denmark)中，在含有約10nM凝血因子Vila或凝血因子VIIa-sTF復(fù)合物終體積為200|al的檢測緩沖液中(50mMHEPES、100mMNaCl、5mMCaCl2、0.01%Tween80,pH7.4)進行活性檢測，相當于將樣品稀釋10倍。室溫下預(yù)溫育15分鐘后加入lmM生色底物S-2288,在安裝有SOFTmaxPRO軟件(v2.2;MolecularDevicesCorp.,Sunnyvale,CA)的SpectraMax340微板分光光度計中于405nm處持續(xù)監(jiān)測吸光庋10分鐘。酰胺分解活性表示為減去空白后線性回歸曲線的斜率。通過外推法至活性為0測定活性位點的濃度，相對于可完全去除酰胺分解活性的最小FFR-cmk濃度。#斧蛋^#水>^檢浙-平行測定天然(野生型)凝血因子Vila和凝血因子VIIaF40C-sTF(l-219)V207C以直接比較他們的特異活性。在微量滴定板(Nunc,Denmark)中進行該檢測。將凝血因子VIIa(300nM)或凝血因子VilaF40C-sTF(l-219)V207C(15nM)和人凝血因子X(0.2pM)在100|il50mMHEPES、lOOmMNaCl、5mMCaCl2、0.01%吐溫80,pH7.4的緩沖液中于室溫下溫育20分鐘。然后加入5050mMHEPES、100mMNaCl、40mMEDTA、0.01%Tween80,pH7.4并含有0.5夂iM阻斷TF上FX結(jié)合位點的TF8-5G9抗體(Ruf等.(1991)Thromb.Haemost.,66,529-533)的緩沖液停止凝血因子X活化。通過加入50pi生色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-p-硝基苯胺(S-2765)至終濃度0.5mM測定FXa的產(chǎn)生量。在安裝有SOFTmaxPRO軟件(v2.2;MolecularDevicesCorp.,Sunnyvale,CA)的SpectraMaxTM340微板分光光度計中于405nm處持續(xù)監(jiān)測吸光度。特異酰胺分解活性表示為減去空白后線性回歸曲線的斜率除以檢測中蛋白質(zhì)的濃度，將其用于計算凝血因子VIIa-sTF復(fù)合物和野生型凝血因子Vila特異蛋白水解活性間的比值比值=((A405nm凝血因子VIIa-sTF復(fù)合物)/[凝血因子VIIa-sTF復(fù)合物])/((八405師凝血因子VIIa野生型)/[凝血因子VIIa野生型])結(jié)果見表2。表2-體外蛋白質(zhì)水解檢測所述的相對蛋白質(zhì)水解活性<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>5i)S-7MG^^^f-根據(jù)操作說明通過非還原和還原SDS-PAGE在4-12%Bis畫TrisNuPAGE㊣凝膠上(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)于200V在MES緩沖液中(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)跑膠35分鐘分析凝血因子Vila和凝血因子VilaF40C-sTF(l-219)V207C(各約1.5pg)。根據(jù)操作說明用水沖洗凝膠并用SimplyBlueSafeStain(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)染色。凝膠見圖2。5Sg/DA^9../-天然(野生型)人凝血因子VII的氨基酸序列(1-406)。三字母標記"GLA"指4-羧基谷氨酸(Y-羧基谷氨酸)。Ala)-Asn-Ala-Phe陽Leu畫GLA-GLA-Leu-Arg-Pro'0-Gly-Ser-Leu-GLA-Arg-GLA-Cys-Lys-GLA-GLA20-Gln-Cys-Ser-Phe-GLA-GLA-Ala-Arg-GLA-Ile30-Phe-Lys-Asp-Ala-GLA-Arg-Thr-Lys-Leu-Phe40-Trp-Ile-Ser-Tyr-Ser-Asp-Gly-Asp-Gln-Cys50-Ala-Ser-Ser-Pro-Cys-Gln-Asn-Gly-Gly-Ser60-Cys-Lys-Asp-Gln-Leu-Gln-Ser-Tyr-Ile-Cys70-Phe-Cys-Leu-Pro-Ala-Phe-Glu-Gly-Arg-Asn8。-Cys-Glu-Thr-His-Lys-Asp-Asp-Gln-Leu-Ile9()-Cys-Val-Asn-Glu-Asn-Gly-Gly-Cys-Glu-Gln100-Tyr-Cys-Ser-Asp-His-Thr-Gly-Thr-Lys-Argll0-Ser-Cys-Arg-Cys-His-Glu-Gly-Tyr-Ser-Leu120-Leu-Ala-Asp-Gly-Val-Ser-Cys陽Thr-Pro畫Thr'30-Val-Glu-Tyr-Pro-Cys-Gly-Lys畫Ile-Pro-Ile140-Leu-Glu-Lys-Arg-Asn-Ala-Ser-Lys-Pro-Gln150-Gly-Arg-Ile-Val-Gly-Gly-Lys-Val-Cys-Pro160-Lys-Gly-Glu-Cys-Pro-Trp-Gln-Val-Leu-Leu170-Leu-Val-Asn-Gly-Ala-Gln-Leu-Cys-Gly-Gly180-Thr-Leu-Ile-Asn-Thr-Ile-Trp-Val-Val-Ser190-Ala-Ala-His-Cys-Phe-Asp-Lys-Ile-Lys-Asn200-Trp-Arg-Asn-Leu-Ile-Ala-Val-Leu-Gly-Glu210-His-Asp-Leu-Ser-Glu-His-Asp-G<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>CAAGGCCGAATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCCCCAAAGGGGAGTGTCCATGGCAGGTCCTGTTGTTGGTGAATGGAGCTCAGTTGTGTGGGGGGACCCTGATCAACACCATCTGGGTGGTCTCCGCGGCCCACTGTTTCGACAAAATCAAGAACTGGAGGAACCTGATCGCGGTGCTGGGCGAGCACGACCTCAGCGAGCACGACGGGGATGAGCAGAGCCGGCGGGTGGCGCAGGTCATCATCCCCAGCACGTACGTCCCGGGCACCACCAACCACGACATCGCGCTGCTCCGCCTGCACCGAACGGACGTTCTCTGAGAGGACGCTGGCCTTCGTGCGCTTCTCATTGGTCAGCGGCTGGGGCCAGCTGCTGGACCGTGGCGCCACGGCCCTGGAGCTCATGGTCCTCAACGTGCCCCGGCTGATGACCCAGGACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTGGGAGACTCCCCAAATATCACGGAGTACATGTTCTGTGCCGGCTACTCGGATGGCAGCAAGGACTCCTGCAAGGGGGACAGTGGAGGCCCACATGCCACCCACTACCGGGGCACGTGGTACCTGACGGGCATCGTCAGCTGGGGCCAGGGCTGCGCAACCGTGGGCCACTTTGGGGTGTACACCAGGGTCTCCCAGTACATCGAGTGGCTGCAAAAGCTCATGCGCTCAGAGCCACGCCCAGGAGTCCTCCTGCGAGCCCCATTTCCCTA//>iVa'4—sTF(l-219)的氨基酸序列Ser'-Gly-Thr-Thr-Asn-Thr-Val-Ala-Ala-Tyi^-Asn-Leu-Thr-Trp-Lys-Ser-Thr-Asn-Phe-Lys20-Thr-Ile-Leu-Glu-Trp-Glu-Pro-Lys-Pro-Val30-Asn-Gln-Val-Tyr-Thr-Val-Gln-Ile-Ser-Thr40-Lys-Ser-Gly-Asp-Trp-Lys-Ser-Lys-Cys-Phe50-Tyr-Thr-Thr-Asp-Thr-Glu-Cys-Asp-Leu-Thr6()-Asp-Glu-Ile-Val-Lys-Asp-Val-Lys-Gln-Thr70-Tyr-Leu-Ala-Arg-Val-Phe-Ser-Tyr-Pro-Ala80-Gly-Asn-Val-Glu-Ser-Thr-Gly-Ser-Ala-Gly90-Glu-Pro-Leu-Tyr-Glu-Asn-Ser-Pro-Glu-Phe100-Thr-Pro-Tyr-Leu-Glu-Thr-Asn-Leu-Gly-Gln110-Pro-Thr-Ile-Gln-Ser-Phe-Glu-Gln-Val-Gly120-Thr-Lys-Val-Asn-Val-Thr-Val-Glu-Asp-Glu130-Arg-Thr-Leu-Val-Arg-Arg-Asn-Asn-Thr-Phe140-Leu-Ser-Le35u-Arg-Asp-Val-Phe-Gly-Lys-Aspl50-Leu-Ile-Tyr-Thr-Leu-Tyr-Tyr-Trp-Lys-Ser160-Ser-Ser-Ser-Gly-Lys-Lys-Thr-Ala-Lys-Thr170-Asn-Thr-Asn-Glu-Phe-Leu-Ile-Asp-Val-Asp湖-Lys-Gly-Glu畫Asn-Tyr-Cys-Phe-Ser-Val-Gln190-Ala畫Val-Ile畫Pro-Ser-Arg-Thr-Val陽Asn-Arg，-Lys-Ser-Thr-Asp-Ser-Pro-Val-Glu-Cys-Met210-Gly-Gln-Glu-Lys-Gly-Glu-Phe-Arg-Glu2195^g/DiVa*5-包括其信號序列(下劃線部分)的sTF(l-219)DNA序列ATGGAGACCCCTGCCTGGCCCCGGGTCCCGCGCCCCGAGACCGCCGTCGCTCGGACGCTCCTGCTCGGCTGGGTCTTCGCCCAGGTGGCCGGCGCTTCAGGCACTACAAATACTGTGGCAGCATATAATTTAACTTGGAAATCAACTAATTTCAAGACAATTTTGGAGTGGGAAGTCAGGAGATTGGAAAAGCAAATGCTTTTACACAACAGACACAGAGTGTGACCTCACCGACGAGATTGTGAAGGATGTGAAGCAGACGTACTTGGCACGGGTCTTCTCCTACCCGGCAGGGAATGTGGAGAGCACCGGTTCTGCTGGGGAGCCTCTGTATGAGAACTCCCCATTCAGAGTTTTGAACAGGTGGGAACAAAAGTGAATGTGACCGTAGAAGATGAACGGACTTTAGTCAGAAGGAACAACACTTTCCTAAGCCTCCGGGATGTTTTTGGCAAGGACTTAATTTATACACTTTATTATTGGAAATCTTCAAGTTCAGGAAAGAAAACAGCCAAAACAAACACTAATGAGTTTTTGATTGATGTGGATAAAGGAGAAAACTACTGTTTCAGTGTTCAAGCAGTGATTCCCTCCCGAACAGTTAACCGGAAGAGTACAGACAGCCCGGTAGAGTGTATGGGCCAGGAGAAAGGGGAATTCAGAGAATAA實施例2G/WC々srF(7-W"尸M6C^Z)AC4-通過QuickChange⑧定點突變根據(jù)操作說明(Stratagene,LaJolla,CA)使用表3列出的引物對(正向和反向)和pHOJ356作為模板構(gòu)建sTF(l-219)突變體。通過DNA測序驗證所有被克隆序列的正確性。表3-用于TFcDNA定點突變的正向和反向(寡聚)引物引物突變序列(5，~>3，)o蘭172-fW45CCACTAAGTCAGGAGATTGCAAAAGCAAATGCTTTTACo腦172-rW45CGTAAAAGCATTTGCTTTTGCAATCTCCTGACTTAGTGo腦173-fD58CCAACAGACACAGAGTGTTGCCTCACCGACGAGATTGoHOJ173-rD58CCAATCTCGTCGGTGAGGCAACACTCTGTGTCTGTTGoHOJ174-fG109CCCTGGAGACAAACCTCTGCCAGCCAACAATTCAGAGoHOJ174-rG109CCTCTGAATTGTTGGCTGGCAGAGGTTTGTCTCCAGGo歸175-fP206CGAAGAGTACAGACAGCTGCGTAGAGTGTATGGGCoHOJ175-rP206CGCCCATACACTCTACGCAGCTGTCTGTACTCTTC^^^薦4凝j&萄^f7/swc.凝j6^子凝a^^f//五77c和凝j&街子f275c^i)AC4-通過(^^1^1^1^6@定點突變根據(jù)操作說明(Stratagene,LaJolla,CA)使用表4列出的引物對(正向和反向)和pHOJ300作為模板構(gòu)建凝血因子VII突變體。通過DNA測序驗證所有被克隆序列的正確性。表4-用于凝血因子VIIcDNA定點突變的正向和反向(寡聚)引物引物突變序列(5，~>3，)oHOJ23-fS43CGGACGAAGCTGTTCTGGATTTGCTACAGTGATGGGGACo歸23-rS43CGTCCCCATCACTGTAGCAAATCCAGAACAGCTTCGTCCoHOJ20-fQ64CGGGCTCCTGCAAGGACTGCCTCCAGTCCTATATCTGoHOJ20-rQ64CCAGATATAGGACTGGAGGCAGTCCTTGCAGGAGCCCo歸176-fE77CCTGCCTCCCTGCCTTCTGCGGCCGGAACTGTGAGoHOJ176陽rE77CCTCACAGTTCCGGCCGCAGAAGGCAGGGAGGCAGo蘭177-fF275CGAGAGGACGCTGGCCTGCGTGCGCTTCTCATTG37<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>A西f/^75C-sr尸(7-Z^『45CW^或^-根據(jù)操作說明在Freestyle293表達體系(Invitrogen,Carlsbad,CA)中通過瞬時表達共表達凝血因子Vila和sTF(l-219)的半胱氨酸突變體，詳細內(nèi)容見實施例1。^^伊^跡趁承y凝j&^子K//e"C-srF(7-27力a/卯c-根據(jù)操作說明通過非還原SDS-PAGE在4-12%Bis-TrisNuPAGE凝膠(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)上于200V在MES緩沖液(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)中跑膠35分鐘分析凝血因子VIIQ64C和sTF(l-219)G109C的瞬時共表達條件培養(yǎng)基。然后通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的免疫印跡法使用單克隆鼠抗-人FVIIa和抗-人TF第一抗體和與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的兔抗-鼠第二抗體的混合物檢測復(fù)合物。使用SuperSignalWestPicoChemiluminescent檢測盒(Pierce)和LAS-3000ImageReader(FUJIFILMCorporation)^:測免疫復(fù)合物。結(jié)果見圖3。實施例3游建濕竭s7T，(7畫2^)^s77Y7-20力"07^CZ)A64-使用ExpandHighFidelityPCR體系(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN)并使用引物oHOJ152-f(序列見表1)和oHOJ178-r(序列見表5)根據(jù)操作說明通過PCR從人全腦cDNA文庫(Marathon-readycDNA;ClontechLaboratoriesInc.,MountainView,CA)中擴增包括其信號肽序列的TF(1-219)的DNA編碼序列，引入側(cè)翼M2el和lol限制性酶切位點。用Nhel和Xhol剪切已純化PCR產(chǎn)物然后連接至pCI-neo(Promega,Madison,WI)的相應(yīng)位點。才艮據(jù)4喿作"i兌明(Stratagene，LaJolla，CA)使用QuickChange定點突變和引物oHOJ179-f和oHOJ179-r(序列見表5),所得質(zhì)粒作為模板構(gòu)建sTF(l-209)V207C。通過DNA測序驗證所有被克隆序列的正確性。表5-構(gòu)建TF(l-209)和TF(1-209)V207CDNA的引物引物序列(5，—3，)oHOJ177-rCCGCCGCCCTCGAGTTAACACTCTACCGGGCTGTCTGTACTCoHOJ179-fGAGTACAGACAGCCCGTGCGAGTGTTAACTCGAGoHOJ179-rCTCGAGTTAACACTCGCACGGGCTGTCTGTACTC39權(quán)利要求1.凝血因子VII多肽和組織因子多肽的共價復(fù)合物，其中凝血因子VII多肽和組織因子多肽通過(i)凝血因子VII多肽的氨基酸和(ii)組織因子多肽的氨基酸的組的氨基酸側(cè)鏈之間的一個或多個指定連接方式共價連接。2.根據(jù)權(quán)利要求1的復(fù)合物，其中所述凝血因子VII多肽和所述組織因子多肽通過(i)凝血因子VII多肽的氨基酸和(ii)組織因子多肽的氨基酸的組的氨基酸側(cè)鏈之間的一個或多個特異連接方式共價連接。3.根據(jù)權(quán)利要求2的復(fù)合物，其中所述凝血因子VII多肽和所述組織因子多肽通過(i)凝血因子vn多肽的氨基酸和(ii)組織因子多肽的氨基酸的組的氨基酸側(cè)鏈之間的一個或多個直接連鍵方式共價連接。4.根據(jù)之前權(quán)利要求中任一項的復(fù)合物，其中所述凝血因子vn多肽為功能活性凝血因子vn多肽。5.根據(jù)權(quán)利要求4的復(fù)合物，其中經(jīng)本文定義的體外蛋白水解檢測測定，凝血因子Vila多肽的蛋白水解活性是游離天然(野生型)凝血因子VIIa的至少2倍，例如至少50倍，如至少100倍，例如至少200倍或至少250倍。6.凝血因子Vila多肽與組織因子多肽的共價復(fù)合物，其中所述凝血因子Vila多肽和所述組織因子多肽通過(i)凝血因子Vila多肽的氨基酸和(ii)組織因子多肽的氨基酸的組的氨基酸側(cè)鏈之間一個或多個連接的方式共價連接，其中經(jīng)本文定義的體外蛋白水解^^測測定，凝血因子Vila多肽的蛋白水解活性是游離天然(野生型)凝血因子VIIa的至少2倍，例如至少50倍，如至少100倍，例如至少200倍或至少250倍。7.根據(jù)之前權(quán)利要求中任一項的復(fù)合物，其中所述氨基酸的組包含一個或多個半胱氨酸氨基酸。8.根據(jù)權(quán)利要求7的復(fù)合物，其中各組包含一個半胱氨酸氨基酸。9.根據(jù)權(quán)利要求7的復(fù)合物，其中各組包含兩個半胱氨酸氨基酸。10.根據(jù)之前權(quán)利要求中任一項的復(fù)合物，其中所述可溶性組織因子多肽的Thrl7、Lys20、Ile22、Ser42、Gly43、Asp44、Trp45、Lys46、Ser47、Phe50、Cys57、Asp58、Asp61、Glyl09、GlnllO、Leul33、Ser205、Pro206和Val207位，尤其是所述可溶性組織因子多肽的Trp45、Asp58、Glyl09、Pro206和Val207位上的至少一個氨基酸祐:具有可生成指定連接如特異連接尤其是直接連鍵的反應(yīng)性側(cè)鏈的氨基酸置換。11.根據(jù)之前權(quán)利要求中任一項的復(fù)合物，其中所述凝血因子VII多肽的Leu39、Phe40、Ile42、Ser43、Tyr44、Gln64、Leu65、Ile69、Glu77、Gly78、Arg79、Val92、Phe275、Val276、Arg277、Met306、Thr307和Glu325位，尤其是所述凝血因子VII多肽的Phe40、SeM3、Gln64、Glu77和Phe275位上的至少一個氨基酸被具有可生成指定連接如特異連接尤其是直接連鍵的反應(yīng)性側(cè)鏈的氨基酸置換。12.根據(jù)之前權(quán)利要求中任一項的復(fù)合物，其中以下氨基酸組中的至少一組FVII-Ile69—sTF-Thr17,FVII-Ile69—sTF-Lys20,FVII-Arg79—sTF-Ile22，F(xiàn)VII-Va192-sTF-Ser47,FVII-Va192-sTF畫Phe50,FVII畫Gly78-sTF-Cys57，F(xiàn)VII-Glu77—sTF-Asp58,FVII-Gly78-sTF-Asp58，F(xiàn)VII-Arg79—sTF-Asp58,FVII-Arg277-sTF誦Ser42,FVII-Va1276-sTF-Gly43，F(xiàn)VII陽Arg277—sTF-Gly43,FVII-Phe275-sTF-Asp44,FVII-Va1276—sTF-Asp44，F(xiàn)VII-Arg277—sTF-Asp44,FW畫Phe275—sTF畫Trp45,FVII-Va1276—sTF-Trp45,FVII-Arg134-sTF-Trp45，F(xiàn)VII-Phe275—sTF-Lys46,FVII-Gln64-sTF-Gly109,FVII-Gln64-sTF-Glnl10，F(xiàn)VII-Leu65-sTF-Glnl10，F(xiàn)VII-Phe71-sTF-Leu133,FVII-Ser43—sTF-Ser205,FVII-Leu39—sTF-Pro206,FVII-Phe40—sTF-Pro206，F(xiàn)VII-Ile42—sTF-Pro206,FVII-Ser43—sTF-Pro206,FVII-Tyr44—sTF-Pro206,FVII-Leu39-sTF-Val207，F(xiàn)VII-Phe40-sTF-Val207和FVII-Ser43_sTF-Val207，尤其是以下氨基酸組中的至少一組:FVII-Phe40—sTF-Val207，F(xiàn)VII-Ser43-sTF-Pro206，F(xiàn)VII佳64_sTF-Gly109,FVII-Glu77—sTF-Asp58，和FVII-Phe275—sTF-Trp45的一個或兩個氨基酸被具有可生成指定連接如特異連接尤其是直接連鍵的反應(yīng)性側(cè)鏈的氨基酸置換。13.根據(jù)之前權(quán)利要求中任一項的復(fù)合物，其中至少一個直接連鍵在兩個半胱氨酸氨基酸之間。14.根據(jù)之前權(quán)利要求中任一項的復(fù)合物，其中至少一個直接連鍵通過光-反應(yīng)性氨基酸形成。15.根據(jù)權(quán)利要求14的復(fù)合物，其中所述光-反應(yīng)性氨基酸選自photo-Ile、photo-Leu和photo-Met。16.根據(jù)之前權(quán)利要求中任一項的復(fù)合物，其中所述凝血因子VII多肽和所述組織因子多肽通過(i)凝血因子VII多肽的氨基酸和(ii)組織因子多肽的氨基酸的一個或多個組的氨基酸側(cè)鏈之間的接頭部分的方式共價連接。17.權(quán)利要求16的復(fù)合物，其中所述接頭部分來自異基雙功能試劑。18.生產(chǎn)如權(quán)利要求1-17中任一項定義的凝血因子VII多肽和組織因子多肽復(fù)合物的方法，該方法包括a)用(i)含編碼凝血因子VII多肽的核酸分子和與其操作性連接的表達控制區(qū)域的表達載體和(ii)含編碼組織因子多肽的核酸分子和與其操作性連接的表達控制區(qū)域的表達載體轉(zhuǎn)染細胞，b)在表達凝血因子VII多肽和組織因子多肽的條件下培養(yǎng)已轉(zhuǎn)染細胞，及c)通過適當方法分離已表達的復(fù)合物。全文摘要本發(fā)明涉及凝血因子VII多肽和組織因子多肽的新穎共價復(fù)合物，尤其涉及該類具有功能活性并且與相應(yīng)的游離凝血因子VII多肽相比對凝血因子X具有增強的蛋白水解活性的復(fù)合物以及生產(chǎn)這些新穎復(fù)合物的方法。文檔編號A61K38/48GK101466400SQ200780021114公開日2009年6月24日申請日期2007年3月30日優(yōu)先權(quán)日2006年4月7日發(fā)明者A·K·彼得森,H·R·斯滕尼克,H·奧斯特加爾德,O·H·奧爾森申請人:諾沃-諾迪斯克保健股份有限公司