專利名稱：：馬杜拉放線菌屬(actinomadura)色蛋白及相關(guān)物質(zhì)的發(fā)酵及純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于產(chǎn)生及純化由馬杜拉放線菌屬04c^ioma^rasp)21G792所產(chǎn)生的活性色蛋白的方法。所述色蛋白可用于研制醫(yī)藥組合物及治療諸如癌癥或細(xì)菌感染等疾病。背景技水烯二炔是由放線菌目(A"i加m);c"dw)成員產(chǎn)生的有效細(xì)胞毒性聚酮種類，其已用于治療癌癥。烯二炔藥物的典型作用模式是通過(guò)單鏈及雙鏈DNA裂解。DNA裂解通過(guò)由自烯二炔環(huán)的伯格曼(Bergman)型環(huán)芳構(gòu)化產(chǎn)生的雙自由基自脫氧核糖糖骨架奪氫誘導(dǎo)。當(dāng)前已有兩種烯二炔經(jīng)批準(zhǔn)用于臨床治療癌癥與CD33單克隆抗體偶聯(lián)的卡奇霉素(calicheamicin)(麥羅塔(Mylotarg)⑧，美國(guó))及偶聯(lián)聚(苯乙烯-共-馬來(lái)酸)的新制癌菌素(neocarzinostatin)(日本)?？蓪⑾┒蔡烊划a(chǎn)物分成兩個(gè)亞類。第一亞類的特征在于二環(huán)[7，3，0]十二垸二炔(即，九元)烯二炔核心或其前體，且第二亞類的特征在于二環(huán)[7，3,1]十三烷二炔(即，十元)烯二炔核心。九元烯二炔的實(shí)例包括新制癌菌素、C-1027、可達(dá)菌素(kedarcidin)、大分子霉素(macromomycin)、N1999A2及馬杜拉霉素(madur叩eptin)。十元亞類的實(shí)例包括卡奇霉素、埃斯波霉素(esperamicin)、達(dá)內(nèi)霉素(dynemicin)及納美那霉素(namenamicin)。除N1999A2外，九元烯二炔不同于十元烯二炔的額外特征是所有九元烯二炔都以烯二炔-蛋白質(zhì)復(fù)合物形式產(chǎn)生，其中烯二炔生色團(tuán)通過(guò)非共價(jià)結(jié)合附接到無(wú)活性的脫輔基蛋白(ap叩rotein)上。為此，九元烯二炔通常被稱為色蛋白。我們認(rèn)為脫輔基蛋白起至關(guān)重要的作用，其穩(wěn)定不穩(wěn)定的九元烯二炔生色團(tuán)并使細(xì)胞毒性生色團(tuán)靶向遞送至染色質(zhì)。數(shù)種脫輔基蛋白的氨基酸序列已通過(guò)直接對(duì)脫輔基蛋白實(shí)施測(cè)序或通過(guò)自經(jīng)克隆DNA序列推導(dǎo)氨基酸來(lái)確定。到目前為止，經(jīng)識(shí)別的脫輔基蛋白是小的酸性蛋白(108-114個(gè)氨基酸，aa)，其通過(guò)移除32-34做氨基-末端前導(dǎo)肽自脫輔基蛋白前體產(chǎn)生。兩種色蛋白(新制癌菌素及C-1027)的生物合成途徑已經(jīng)克隆及測(cè)序。在這些4情況下，編碼脫輔基蛋白的基因與有關(guān)生色團(tuán)生物合成所需要的基因簇集在一起。色蛋白復(fù)合物的脫輔基蛋白組份為定向改變藥物特性提供了有吸引力的靶標(biāo)。例如，若發(fā)現(xiàn)脫輔基蛋白氨基酸或核酸序列，則可使用既定分子生物學(xué)技術(shù)(例如位點(diǎn)定向誘變)改變脫輔基蛋白的生色團(tuán)-結(jié)合基序以產(chǎn)生經(jīng)合理改變的脫輔基蛋白，所述脫輔基蛋白與其天然生色團(tuán)更強(qiáng)或更弱結(jié)合。而且，脫輔基蛋白的所述改變可能導(dǎo)致(例如)毒性降低的色蛋白或效能或穩(wěn)定性增加的生色團(tuán)。另外，對(duì)脫輔基蛋白實(shí)施大量處理可使脫輔基蛋白的結(jié)合特異性且因此作為與烯二炔生色團(tuán)極為不同的分子的靶向藥物遞送媒劑的能力大大改變。同樣，烯二炔生色團(tuán)是修飾的靶標(biāo)。一種改變生色團(tuán)的方式是對(duì)參與其生物合成的基因進(jìn)行處理。因此，需要新穎色蛋白及分離及定性參與其合成的基因及蛋白。此外，我們也期望有效產(chǎn)生及純化色蛋白的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是關(guān)于由陸生放線菌馬杜拉放線菌屬21G792(NRRL30778)產(chǎn)生的高效能抗癌色蛋白。馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白是包含九元烯二炔的脫輔基蛋白與生色團(tuán)的非共價(jià)復(fù)合物。本發(fā)明提供馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)的新穎異型體以及包含所述新穎異型體的色蛋白。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供包含具有以下結(jié)構(gòu)的生色團(tuán)的活性色蛋白及結(jié)構(gòu)[l]及[2]在本文中或被分別稱為生色團(tuán)-b及生色團(tuán)-C。在另一方面中，本發(fā)明提供可達(dá)成提高的色蛋白產(chǎn)量的發(fā)酵方法。所述發(fā)酵方法納入經(jīng)調(diào)配以使色蛋白產(chǎn)生最大化且使色蛋白不穩(wěn)定性及降解最小化的培養(yǎng)基。在另一方面中，本發(fā)明提供純化馬杜拉放線菌屬2〗G792色蛋白的方法。本發(fā)明揭示適于自大規(guī)模發(fā)酵獲得色蛋白的規(guī)?？勺兊募兓椒?。本發(fā)明也揭示分離色蛋白異型體的方法。本發(fā)明提供馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白及脫輔基蛋白的基本上純凈形式以及包含所述色蛋白的醫(yī)藥組合物及投與所述色蛋白的方法。已顯示色蛋白的某些異型體可用于治療癌細(xì)胞及腫瘤。本發(fā)明進(jìn)一步提供產(chǎn)生及純化生物活性經(jīng)改變的馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白(包括脫輔基蛋白及生色團(tuán)物質(zhì))的變體的方法。所述變體脫輔基蛋白可能具有經(jīng)改變的生色團(tuán)結(jié)合特性、經(jīng)改變的靶特異性、或其組合。應(yīng)了解，本發(fā)明提供產(chǎn)生大量脫輔基蛋白及色蛋白的方法。應(yīng)進(jìn)一步了解，本發(fā)明可達(dá)成識(shí)別能夠產(chǎn)生烯二炔相關(guān)化合物的其它生物體或在(例如)能夠產(chǎn)生烯二炔相關(guān)化合物(例如馬杜拉放線菌屬21G792)的生物體中識(shí)別參與色蛋白合成的基因。另外，應(yīng)了解，本發(fā)明提供脫輔基蛋白的經(jīng)修飾形式的產(chǎn)生，所述脫輔基蛋白的經(jīng)修飾形式(例如)毒性降低、效能增加、或穩(wěn)定性增加。也應(yīng)了解，對(duì)馬杜拉放線菌屬21G792脫輔基蛋白實(shí)施處理可使脫輔基蛋白的結(jié)合特異性且因此作為與21G792烯二炔生色團(tuán)不同的生色團(tuán)的靶向藥物遞送媒劑的能力得以改變。最后，應(yīng)了解，可研制包含馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白的醫(yī)藥組合物并將其投與給患有細(xì)菌感染或癌生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物(優(yōu)選為人類)。圖1是馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白的HPLC色譜圖。HPLC的分析條件如下。柱東曹哈斯(TosoHaas)DEAE5PW(10|im粒徑，尺寸為7.5mmx7.5cm)。緩沖劑0-0.5M線性梯度NaCl與恒定0.05MTris-HCl(25min'流速為0.8ml/min)。圖2是馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白的UV光譜。圖3是21G792脫輔基蛋白的HPLC色譜圖。HPLC的分析條件如下。柱VYDAC蛋白質(zhì)C4(300A，尺寸為3.0xl00mm)。溶劑存于H20中的10-30%乙腈與恒定0.05%TFA(6分鐘，2ml/min)。圖4是21G792脫輔基蛋白的UV光譜。圖5顯示脫輔基蛋白的分子量測(cè)定(12.92409kDa，通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)實(shí)施)。圖6繪示馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)物質(zhì)(生色團(tuán)-b、-c、及-d)的結(jié)構(gòu)。圖7提供21G792脫輔基蛋白前體及脫輔基蛋白的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。推定的核糖體結(jié)合位點(diǎn)加以邊框線，且前導(dǎo)肽加以下劃線。斜線標(biāo)記表示前導(dǎo)肽及脫輔基蛋白的裂解位點(diǎn)。圖8繪示馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白基因簇的開(kāi)放讀碼框。位于粘粒41417上的基因由^/箭頭上方的實(shí)線表示。位于粘粒21gD上的那些通過(guò)由小破折號(hào)構(gòu)成的虛線表示，且位于粘粒21gB上的那些通過(guò)由大破折號(hào)構(gòu)成的虛線表示。用于識(shí)別每一粘粒的探針的位置由黑色杠鈴表示。(P)及￡C0RI(E)限制位點(diǎn)經(jīng)標(biāo)記。圖9繪示馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)的酪氨酸衍生組份(3-[2-氯-3-羥基-4-甲氧基-苯基]-3-羥基-丙酸)的合成途徑。圖10繪示w/77基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)域?？s合(C)、腺苷?；?A)及肽-載體蛋白(PCP)結(jié)構(gòu)域的核心基序加以邊框線并予以標(biāo)記。構(gòu)成0《/7基因產(chǎn)物及C-1027生物合成途徑的SgcC4的A結(jié)構(gòu)域底物特異性密碼的殘基以粗體表示并加以下劃線。相同殘基用星號(hào)加以標(biāo)記，冒號(hào)表示保守殘基且分號(hào)表示半保守殘基。圖11繪示馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)的馬杜拉胺(madurosamine)(4-氨基-4-去氧-3-C-甲基-卩-吡喃核糖)組份的合成途徑。圖12繪示Orf38與dNDP-葡萄糖-4，6-脫水酶及UDP-葡萄糖醛酸脫羧酶的比對(duì)。包括于比對(duì)中的葡萄糖-4,6-脫水酶序列是來(lái)自寢屋川鏈霉菌(&r印tomyc"ne戸gawaensis)伴刀球霉素(concanamycin)A基因簇的Orf5(AAZ94396)、來(lái)自粘土鏈霉菌(&r印fomyce:yflrg"/acei^)光輝霉素(m池ramycin)基因簇的MtmE(CAA71847)、及來(lái)自壯觀鏈霉菌(Skeptomycw^e"aW"s)大觀霉素(spectinomycin)基因簇的SpcE(AAD31797)。包括于比對(duì)中的葡萄糖醛酸脫羧酶序列是來(lái)自豌豆(P"歸加!'v,)的Uxsl(BAB40967)、來(lái)自擬南芥(/lm&V/c7/w;y^/Z""fl)的Uxs3(AAK70882)、來(lái)自擬南芥的Uxsl(AAK70880)、來(lái)自擬南芥的Uxs2(AAK70881)、來(lái)自小家鼠(Miwmiwcwhw)的Uxsl(AAK85410)及來(lái)自新型隱球菌(D7pf0c0cc附neo/omra"s)的Uxsl(AAK59981)。相同殘基用星號(hào)加以標(biāo)記，冒號(hào)表示保守殘基且分號(hào)表示半保守殘基。圖13繪示馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)的2-羥基-3，6-二甲基苯甲酸組份的合成途徑。圖14繪示Orf31與十芳酸-AMP連接酶的A4及A5核心基序之間區(qū)域的比對(duì)。結(jié)構(gòu)錨標(biāo)以黑色陰影。提出的羧酸結(jié)合口袋的組成標(biāo)以灰色陰影。提出參與辨別DHBA與水楊酸間的激活的殘基用數(shù)字符號(hào)表示。相同殘基用星號(hào)加以標(biāo)記，冒號(hào)表示保守殘基且分號(hào)表示半保守殘基。圖15繪示產(chǎn)生馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)的烯二炔核心的生物合成途徑。圖16繪示Orf5與SgcE及NcsE烯二炔PKS的結(jié)構(gòu)域組織及比較。Aa，氨基酸；KS，酮合酶；AT，乙?；D(zhuǎn)移酶；ACP，?；d體蛋白；KR，酮還原酶；DH，脫水酶；TD，末端結(jié)構(gòu)域。圖17繪示馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)的四種組份的組裝途徑。圖18是顯示馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白在DEAE瓊脂糖凝膠陰離子交換柱上的洗脫特性曲線的色譜圖。圖19是顯示馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白在苯基瓊脂糖凝膠HP柱上的洗脫特性曲線的色譜圖。圖20是顯示馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白在超級(jí)葡聚糖(S叩erdex)75尺寸分級(jí)分離柱上的洗脫特性曲線的色譜圖。圖21顯示超級(jí)葡聚糖75流份6的苯基5PW色譜圖(在230nm處的吸光度)(圖A)及色蛋白及脫輔基蛋白峰的吸收光譜(200-400nm)(圖B)。圖22顯示超級(jí)葡聚糖75流份6的生物硅SEC125(BioSilSEC125)色譜圖(圖A)及共洗脫的色蛋白及脫輔基蛋白的吸收光譜(圖B)。圖23顯示來(lái)自各純化步驟的發(fā)酵液及相關(guān)柱流份的含色蛋白樣品的SDS-PAGE分析。在還原條件下分離蛋白質(zhì)并進(jìn)行染色(考馬斯(Coomassie))。在31與36.5kDa間移動(dòng)的主要帶確定為色蛋白。泳道1及18:MW標(biāo)準(zhǔn)物；泳道2:澄清發(fā)酵液(DEAE裝載)；泳道3:DEAE0.25M池；泳道4:DEAE流份D1;泳道5:DEAE流份D2;泳道6:DEAE流份D3;泳道7:苯基瓊脂糖凝膠池8;泳道8:苯基瓊脂糖凝膠流份P9(色蛋白)；泳道9:苯基瓊脂糖凝膠流份P10(色蛋白)；泳道10:苯基瓊脂糖凝膠流份P11;泳道ll:苯基瓊脂糖凝膠流份Pi4(脫輔基蛋白)；泳道12:苯基瓊脂糖凝膠流份P15(脫輔基蛋白)；泳道13:超級(jí)葡聚糖75裝載(2(^1);泳道14:超級(jí)葡聚糖流份S5;泳道15:超級(jí)葡聚糖流份S6;泳道16:超級(jí)葡聚糖流份S7;泳道17:超級(jí)葡聚糖流份S8。圖24顯示馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白(流份S6)的SDS-PAGE分析，所述馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白依序通過(guò)陰離子交換色譜法、疏水作用色譜法、及尺寸排除色譜法進(jìn)行純化。在37.0與28.9kDa間移動(dòng)的主要帶確定為色蛋白。泳道1及5:MW標(biāo)準(zhǔn)物；泳道2:色蛋白參考標(biāo)準(zhǔn)物；泳道3:超級(jí)葡聚糖75流份S6;泳道4:參考標(biāo)準(zhǔn)物與超級(jí)葡聚糖75流份S6的混合物。圖25顯示含有相關(guān)生色團(tuán)異型體的色蛋白的分離。使用苯基瓊脂糖凝膠HP來(lái)分離色蛋白制劑。峰B對(duì)應(yīng)于包含生色團(tuán)-b的色蛋白-b。峰A包括包含生色團(tuán)-c及-d的色蛋白-c及-d。脫輔基蛋白自色蛋白物質(zhì)單獨(dú)洗脫出來(lái)。圖26顯示苯基瓊脂糖凝膠池的烯二炔組成(圖25的峰A及B)。圖27是展示在大于100ng/ml色蛋白濃度下在p21-健全型及p21-缺陷型HCT116人類結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)生的21G792色蛋白誘導(dǎo)的劑量依賴性DNA鏈斷裂的圖。圖28是DNA裂解分析，其顯示21G792色蛋白誘導(dǎo)的單鏈斷裂及雙鏈斷裂，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行24小時(shí)，且DNA裂解不需要硫醇試劑。圖29繪示組蛋白Hl被馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白消化且DNA可抑制此消化。蛋白酶抑制劑是PMSF、亮抑蛋白酶肽、抑肽酶、及胃酶抑素A。脫輔基蛋白不具有活性。圖30繪示組蛋白Hl、H2A、H2B、H3、及H4對(duì)被馬杜拉放線菌屬21G792色8蛋白消化的相對(duì)靈敏性。諸如髓磷脂堿性蛋白等堿性蛋白也易于裂解，但中性/酸性蛋白并不如此。圖31繪示在經(jīng)馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白處理的細(xì)胞中組蛋白Hl減少，但在經(jīng)博來(lái)霉素或卡奇霉素處理的細(xì)胞中并不如此。圖32A是蛋白質(zhì)免疫印跡，其顯示將HCT116細(xì)胞暴露于多種濃度的色蛋白下導(dǎo)致p53/p21檢査點(diǎn)激活。圖32B繪示聚-ADP-核糖磷酸化酶(ParP)裂解時(shí)p53的絲氨酸-15氨基酸殘基磷酸化。圖33及34的一系列圖顯示在無(wú)胸腺(裸)小鼠中21G792色蛋白對(duì)抗經(jīng)皮下注射的LoVo(結(jié)腸癌)、HCT116(結(jié)腸)、HT29(結(jié)腸)、LOX(黑色素瘤)、HN5(頭及頸)、及PC-3(前列腺)細(xì)胞腫瘤的活體內(nèi)效能。圖35繪示HCT116細(xì)胞對(duì)經(jīng)FITC標(biāo)記的馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白的攝取。圖36繪示HCT116細(xì)胞對(duì)經(jīng)FITC標(biāo)記的馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白及脫輔基蛋白的攝取。圖37繪示經(jīng)標(biāo)記馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白在濃度為其10倍多的未經(jīng)標(biāo)記色蛋白存在下的攝取。圖38繪示能量偶合劑(疊氮化鈉)或微管蛋白破壞劑(諾考達(dá)唑(nocodazole))對(duì)HCT116細(xì)胞攝取馬杜拉放線菌屬21G792脫輔基蛋白的影響。圖39繪示單克隆抗體與馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)衍生物的連接。具體實(shí)施例方式烯二炔抗生素由通常屬于放線菌目的多種生物體產(chǎn)生，包括但不限于鏈霉菌屬(S的ptom;yce力、小單孢菌屬(M!'CTOmwuwpora)、及馬杜拉放線菌屬等屬。本發(fā)明是關(guān)于由保存于美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心(AgriculturaIResearchServiceCultureCollection)(NRRL，1815北方大學(xué)街(NorthUniversityStreet),皮奧里亞市(Peoria)，III.，61064)的馬杜拉放線菌屬21G792產(chǎn)生的新穎色蛋白。根據(jù)布達(dá)佩斯條約(BudapestTreaty)的條款實(shí)施保存。馬杜拉放線菌屬21G792的登記號(hào)為NRRL30778。在迄今為止已知的所述生物體中，馬杜拉放線菌屬21G792似乎與以ATCC39144保存的馬杜拉放線菌屬菌株最為相似(美國(guó)專利第4,546,084號(hào))。如通過(guò)16SrDNA序列所評(píng)價(jià)，所述菌株是相關(guān)種類或亞種。本發(fā)明提供新穎色蛋白及生色團(tuán)。已發(fā)現(xiàn)馬杜拉放線菌屬21G792產(chǎn)生多種相關(guān)生色團(tuán)。所述生色團(tuán)分別與脫輔基蛋白復(fù)合形成多種相關(guān)色蛋白。因此，本發(fā)明提供如圖6所繪示的生色團(tuán)-b、生色團(tuán)-c、及生色團(tuán)-d。至少生色團(tuán)-b及生色團(tuán)-c具有抗腫瘤及抗細(xì)菌活性。本發(fā)明提供發(fā)酵及培養(yǎng)馬杜拉放線菌屬21G792的方法。馬杜拉放線菌屬21G792的培養(yǎng)可在多種液體培養(yǎng)基中實(shí)施。可用于產(chǎn)生馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白的培9養(yǎng)基包括可同化的碳來(lái)源，例如糊精、蔗糖、糖蜜、甘油等；可同化的氮來(lái)源，例如蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)水解物、多肽、氨基酸、玉米漿等；及無(wú)機(jī)陰離子及陽(yáng)離子，例如鉀、鈉、鐵、鎂、銨、鈣、硫酸根、碳酸根、磷酸根、氯離子等。諸如硼、鉬、銅等痕量元素通常作為培養(yǎng)基其它組成的雜質(zhì)提供。例如，常見(jiàn)的氮來(lái)源馬頓J-l(MartoneJ-l)含有鐵、鎂、及其它痕量金屬。已發(fā)現(xiàn)，包括某些鹵化物鹽會(huì)達(dá)成生長(zhǎng)改良及色蛋白產(chǎn)生的顯著增加。先前，已觀察到包括碘化物鹽對(duì)于含碘生色團(tuán)的產(chǎn)生具有有益效果，但鹵化物對(duì)不含碘的馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)的產(chǎn)生的效果卻未預(yù)料到。包括溴化物鹽也達(dá)成生長(zhǎng)及色蛋白產(chǎn)量的改良。然而，氯離子量的變化無(wú)明顯影響。馬杜拉放線菌屬21G792的培養(yǎng)物可使用含有葡萄糖的復(fù)雜碳水化合物，例如糖蜜及水解淀粉。對(duì)于大規(guī)模發(fā)酵，為達(dá)成一致結(jié)果，我們期望使用包含確定碳來(lái)源的培養(yǎng)基。除葡萄糖之外，支持在管式發(fā)酵中生長(zhǎng)及產(chǎn)生色蛋白的可用碳來(lái)源也包括蔗糖及麥特靈(maltrin)。不支持良好色蛋白產(chǎn)量的碳來(lái)源包括麥芽糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、甘油、大豆油、及棉籽油。在大規(guī)模發(fā)酵中，葡萄糖是優(yōu)選碳來(lái)源。在包括葡萄糖、蔗糖、及果糖的大規(guī)模發(fā)酵中，在發(fā)酵期間僅使用葡萄糖(即使蔗糖在管式發(fā)酵中也可同化)。對(duì)于馬杜拉放線菌屬21G792,可用的氮來(lái)源是蛋白胨。然而，對(duì)于藥劑生產(chǎn)通常期望非動(dòng)物衍生的氮來(lái)源。己對(duì)多種非動(dòng)物氮來(lái)源進(jìn)行測(cè)試，其中馬可馬頓J-l(MarcorMartoneJ-l)提供尤佳結(jié)果(參見(jiàn)實(shí)例)。產(chǎn)生相當(dāng)產(chǎn)量的其它優(yōu)選非動(dòng)物氮來(lái)源包括馬可馬頓L-l、馬可(Marcor)豆類蛋白胨、安伯芳4415(Amberferm4415)、哈賽T(HySoyT)?？捎玫a(chǎn)生較低產(chǎn)量的非動(dòng)物氮來(lái)源的其它實(shí)例包括安伯芳4000、安伯芳4015、安美賽(Amisoy)、玉米水解物、小麥水解物(DMVInternational弁WGE80M)、及藥用培養(yǎng)基(Pharmamedia)。當(dāng)?shù)獊?lái)源是大豆水解物(DMVInternational弁SE50MAF)或75%大豆水解物與25%小麥水解物的混合物時(shí)，未檢測(cè)到產(chǎn)物。為獲得具有生物活性的含蛋白質(zhì)產(chǎn)物，避免可使隱藏或釋放到發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)降解的應(yīng)力極為重要。在通常涉及機(jī)械攪動(dòng)或混合及通過(guò)噴霧器引入空氣(或氧氣)的大規(guī)模發(fā)酵中，需要謹(jǐn)慎選擇防沫劑以提供優(yōu)良產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明，普朗尼克L-61、普朗克爾P2000(聚丙二醇)及安他羅克17-R2表面活性劑己經(jīng)確定可用于產(chǎn)生脫輔基蛋白與生物活性分子的復(fù)合物。所述表面活性劑尤其可用于諸如馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白、可達(dá)菌素、及C-1027等含有烯二炔的色蛋白。在所測(cè)試的表面活性劑中，普朗尼克L-61使馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白的產(chǎn)量最高。所述色蛋白也可用普朗克爾P2000(聚丙二醇)及安他羅克17-R2產(chǎn)生，但量降低。幾乎不產(chǎn)生色蛋白的表面活性劑是普朗尼克L-31、普朗尼克L-81、普朗尼克L-101、克勒勞爾(Clerol)FBA515B、克勒勞爾FBA265、克勒勞爾FBA975-US、克勒勞爾5074、及安他羅克BL-214。在本發(fā)明的特定實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基包含8.75g/L葡萄糖單水合物、0.01g/L10七水硫酸亞鐵、0.02g/L七水硫酸鎂、2.0g/L碳酸鈣(密西西比(Mississippi)TMUme)、4.0g/L馬可馬頓J-1、2g/L三水乙酸鈉、0.5g/L碘化鉀、及0.5g/L普朗尼克L-61。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基包含8.75g/L葡萄糖單水合物、0.01g/L七水硫酸亞鐵、0.02g/L七水硫酸鎂、2.0g/L碳酸鈣(密西西比TMLime)、4.0g/L馬可馬頓J-1、2g/L三水乙酸鈉、0.5g/L溴化鈉、及0.5g/L普朗尼克L-61。本發(fā)明也提供基本上純凈的蛋白質(zhì)及多肽。本文所用的關(guān)于給定多肽的術(shù)語(yǔ)"基本上純凈"意指多肽基本上不含其它生物大分子。例如，基本上純凈的多肽以干燥重量計(jì)至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約95%、或約99%純凈?？赏ㄟ^(guò)所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知的任何適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)測(cè)量純度，例如，通過(guò)柱色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳、或HPLC分析。應(yīng)了解，基本上純凈的蛋白質(zhì)包括基本上純凈的色蛋白，所述色蛋白是脫輔基蛋白與烯二炔生色團(tuán)的復(fù)合物。在本發(fā)明實(shí)施例中，通過(guò)陰離子交換色譜法自發(fā)酵培養(yǎng)基或馬杜拉放線菌屬21G792提取物中純化色蛋白。所述方法可提供色蛋白的有效濃縮并移除(連同其它雜質(zhì)一道)在發(fā)酵中產(chǎn)生的大多數(shù)不期望色素。在一個(gè)實(shí)施例中，陰離子交換樹(shù)脂是DEAE瓊脂糖凝膠FF。將含有色蛋白的色譜裝載調(diào)節(jié)至pH8.3并應(yīng)用到陰離子交換樹(shù)脂。通過(guò)增加流動(dòng)相的離子強(qiáng)度來(lái)洗脫色蛋白物質(zhì)。在特定實(shí)施例中，用0.25MNaCl階式梯度來(lái)洗脫色蛋白且在最初兩個(gè)柱體積中回收大多數(shù)活性物質(zhì)。視裝載體積及柱尺寸而定，當(dāng)自澄清發(fā)酵液中純化色蛋白時(shí)，濃度可大于10倍。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，通過(guò)疏水作用色譜法來(lái)純化馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白。所述純化方法將色蛋白與脫輔基蛋白分開(kāi)，移除其它蛋白質(zhì)及非蛋白質(zhì)組份，并使色蛋白有效濃縮。此固體載體可為任何有機(jī)、無(wú)機(jī)或復(fù)合材料，其為適合于色譜法的經(jīng)(例如)聚(烷二醇)(聚(丙二醇)、聚(乙二醇))、垸烴、烯烴、炔烴、芳基、1，4-丁二醇二縮水甘油醚或賦予載體疏水特征的其它分子衍生化的多孔、超多孔或無(wú)孔材料。在特定實(shí)例中，使用pH值約為8.2的苯基瓊脂糖凝膠HP并用最終為100mMNaCl的梯度來(lái)洗脫色蛋白。依賴色蛋白與基質(zhì)結(jié)合(例如，陰離子交換、疏水作用)的分級(jí)分離通常使用柱來(lái)實(shí)施，但或者可以分批過(guò)程實(shí)施。例如，作為離子交換柱色譜法的替代方案，可使用使色蛋白物質(zhì)與諸如葡聚糖凝膠(S印hadex)A50等適宜陰離子交換劑結(jié)合的分批過(guò)程。在分批過(guò)程中，在室溫?cái)嚢柘率购猩鞍椎娜芤?例如，通過(guò)添加1/50體積1MTrispH8.3實(shí)施緩沖以便于儲(chǔ)存的澄清發(fā)酵液)過(guò)夜分批吸收到于20mMTrispH8.3中平衡的葡聚糖凝膠A50漿液中。當(dāng)溶液是澄清發(fā)酵液時(shí)，葡聚糖凝膠A50與澄清發(fā)酵液的可用體積比是1:15。在測(cè)定完全結(jié)合時(shí)，通過(guò)過(guò)濾收獲葡聚糖凝膠并(例如)用12體積20mMTrispH8.3洗漆。在攪拌30min后用20mMTris，250mMNaClpH8.3以分批模式洗脫色蛋白物質(zhì)。隨后將濾液調(diào)節(jié)至適于下一純化步驟的結(jié)合條件。例如，當(dāng)下一步驟是結(jié)合苯基瓊脂糖凝膠HP時(shí)，如本文中所例示，苯基瓊脂糖凝膠HP的結(jié)合條件可通過(guò)添加固體硫酸鉸至1.5M濃度及0.45pm過(guò)濾獲得。在本發(fā)明的又一實(shí)施例中，馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白是通過(guò)可移除高及低分子量蛋白質(zhì)組份的尺寸排除色譜法來(lái)純化。例如，凝膠過(guò)濾色譜法使用尺寸排除樹(shù)脂以借助分子量分離各物質(zhì)。其它手段包括但不限于用適宜排除膜的超濾及疏水技術(shù)。適宜基質(zhì)包含丙烯葡聚糖凝膠(Sephacryl)S-200、超級(jí)瓊脂糖凝膠12(Superose12)、瓊脂糖凝膠S-300、超級(jí)葡聚糖、三羥甲基丙烯酸(Trisacryl)、丙烯酰胺、葡聚糖凝膠或所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知的能夠分級(jí)分離期望尺寸范圍內(nèi)樣品的類似樹(shù)脂。凝膠過(guò)濾可在約2'C至約25X:溫度下實(shí)施。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于色蛋白純化，色譜步驟在室溫下實(shí)施。適宜緩沖劑包含約0.1至約1.0M鹽，優(yōu)選為NaCl，pH值為約7至約8.5。在一個(gè)實(shí)施例中，色譜基質(zhì)分離范圍的下限為約3x103。在另一實(shí)施例中，色譜基質(zhì)分離范圍的上限為約106。在本發(fā)明的特定實(shí)施例中，尺寸排除基質(zhì)是超級(jí)葡聚糖75，其分離范圍為自約3x103至約7x105。當(dāng)分離基質(zhì)是超級(jí)葡聚糖75時(shí)，可使用20mMTris，100mMNaCipH8.2來(lái)分離色蛋白制劑。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員將能夠優(yōu)化與特定基質(zhì)一起使用的緩沖劑?？筛鶕?jù)需要匯集所收集的含有色蛋白的流份以(例如)使產(chǎn)量最大化或使雜質(zhì)最少化。在優(yōu)選實(shí)施例中，可依序使用兩種或更多種純化方法。視柱體積(CV)及所匯集的洗脫CV的數(shù)量而定，色蛋白的濃縮可在每一純化步驟中達(dá)成。另一選擇為或另外，可通過(guò)所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知的其它方法來(lái)濃縮色蛋白，例如硫酸銨沉淀、微濃縮、及諸如此類。根據(jù)本發(fā)明，可對(duì)一或多種色蛋白物質(zhì)實(shí)施分離或純化。在本發(fā)明實(shí)施例中，使用經(jīng)選擇利于色蛋白產(chǎn)量的發(fā)酵條件來(lái)生長(zhǎng)馬杜拉放線菌屬21G792。一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)如上文所描繪的三步驟過(guò)程來(lái)純化色蛋白物質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)疏水作用色譜法來(lái)分離色蛋白物質(zhì)。在所提供的實(shí)例中，苯基瓊脂糖凝膠色譜法產(chǎn)生兩個(gè)色蛋白峰(含有三種色蛋白物質(zhì))。此外，脫輔基蛋白的相對(duì)量降低。色蛋白及生色團(tuán)生物合成途徑的組份或所述組份的前體(即，脫輔基蛋白前體)由稱為色蛋白生物合成基因簇的一組鄰近開(kāi)放讀碼框(o^編碼。因此，本發(fā)明提供編碼馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白生物合成基因簇的o/;f(參見(jiàn)表1)或其表達(dá)(即，經(jīng)處理的)片段(例如，脫輔基蛋白；SEQIDNO:150)的經(jīng)分離核酸。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供具有編碼以下氨基酸序列的核苷酸序列的核酸SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO龍SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQ12IDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144、SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、或SEQIDNO:150。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述核酸包含以下核苷酸序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:lll、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDN0:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、或SEQIDNO:149。應(yīng)了解，本發(fā)明核酸包括互補(bǔ)序列。表121G792色蛋白基因簇的開(kāi)放讀碼框<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>Orf開(kāi)始/終止(堿基對(duì)(bp))SEQIDNO長(zhǎng)度(aa)SEQIDNOOrf開(kāi)始/終止(bp)SEQIDNO長(zhǎng)度(aa)SEQIDNOl承8971/747517498183762785/64128914479219268/1026319331203864131/651179332894210592/1149421300223965134/667539553996311498/1353423678244068054/668349740698413541/1453325330264168270/6929299340脂514530/20364271944284269375/70757101460102620369/2082729152304371889腦46103347104720824/2137531183324472452/72036105106821372/2276633464344572706/74379107557108923607/2285235251364675114/744221092301101024877/2386737336384775189/764001114031121125277/2593339218404877794/764601134441141225930/2758841552424978801/779681152771161327602/2869943365445078892/795331172131181428792/2957745261465180344/795441192661201529591/3028047229485280936/803461211%1221630631/303444995505381022/813511231091241730845/34207511120525481348/817761251421261834204/3581753537545582077/829551272921281935852/3749855548565682998/840111293371302037516/3889857460585784224/852821313521322139250/4057859442605885643/85434133691342240705/4228261525625987546/857681355921362343151/4265463165646087826/87647137591382443376/4476165461666187909/87832139251402544805/4603167408686288485/879821411671422646045/4719069381706388571/893501432591442747187/4841671409726489542/899761451441462849128/48430732327465結(jié)束[90573〗/89980147不完整148*-參與初級(jí)代謝14本發(fā)明提供在嚴(yán)格雜交條件下與以下序列特異性雜交(或特異性結(jié)合)的核酸SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDN0:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQlDNO:lll、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDN0:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDN(H45、SEQIDNO:147、或SEQIDNO:149。本發(fā)明也涵蓋與上述序列特異性結(jié)合以達(dá)到核酸密碼簡(jiǎn)并性的核酸。所述核酸可具有足夠長(zhǎng)度以編碼完整蛋白質(zhì)(例如，完整o咲)或其片段。本發(fā)明也包括編碼經(jīng)修飾蛋白質(zhì)的核酸。蛋白質(zhì)修飾的實(shí)例包括但不限于與諸如抗體、抗體片段、受體配體及諸如此類等靶分子融合。所述核酸進(jìn)一步包括探針及引物。在某些實(shí)施例中，探針或引物可為簡(jiǎn)并性的。此外，依照其使用，探針及引物可為單鏈或雙鏈。探針及引物包括(例如)長(zhǎng)度為至少約12個(gè)核苷酸、優(yōu)選長(zhǎng)度為至少約15個(gè)核苷酸、且最優(yōu)選長(zhǎng)度為至少約18個(gè)核苷酸的寡核苷酸，且進(jìn)一步包括可使用本發(fā)明引物產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。在嚴(yán)格條件下雜交是指在所述條件下探針優(yōu)先與其靶子序列雜交且以較低程度或根本不與其它序列雜交。也應(yīng)了解，在諸如南方及北方雜交等核酸雜交實(shí)驗(yàn)背景下的嚴(yán)格雜交及嚴(yán)格雜交洗滌條件是序列依賴性的，且在不同環(huán)境參數(shù)下有所不同。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員已熟知可調(diào)節(jié)雜交及洗滌溶液所含物及溫度來(lái)獲得嚴(yán)格雜交條件。嚴(yán)格性依賴于諸如所使用探針的尺寸及核苷酸含量等參數(shù)。參見(jiàn)薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989，分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloning-ALaboratoryManual)(第2版)第1-3巻，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(ColdSpringHarborLaboratory)，冷泉港出版社，NY及一般闡述及實(shí)例的其它來(lái)源。核酸雜交的另一指導(dǎo)可見(jiàn)于提杰森(Tijssen)，1993，生物化學(xué)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-用核酸探針雜交，第I部分，第2章，雜交原理及核酸探針?lè)治霾呗钥v覽(Overvievvofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays),愛(ài)思唯爾(Elsevier),N.Y。優(yōu)選嚴(yán)格條件是容許探針和與探針大于約90%互補(bǔ)的序列雜交且不和小于約70%互補(bǔ)的序列雜交的條件。一般來(lái)說(shuō)，高度嚴(yán)格雜交及洗滌條件經(jīng)選擇以在已確定15的離子強(qiáng)度及pH值下比特定序列的熱熔點(diǎn)(TJ低約5°C。Tm是50%的靶序列與完全匹配探針雜交的溫度(在己確定的離子強(qiáng)度及pH下)。對(duì)于特定探針來(lái)說(shuō)，非常嚴(yán)格條件經(jīng)選擇以等于Tm。用于在南方或北方印跡法中在過(guò)濾器上具有多于100個(gè)互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸雜交的嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例是50%甲酰胺加1mg肝素、在42'C下并實(shí)施雜交過(guò)夜。高度嚴(yán)格洗滌條件的實(shí)例是0.15MNaCl、在72。C下、約15分鐘。嚴(yán)格洗滌條件的實(shí)例是在65'C下實(shí)施0.2X標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽(SSC)洗滌15分鐘(參見(jiàn)，薩姆布魯克等人，1989)。通常，高嚴(yán)格性洗滌之前為低嚴(yán)格性洗滌以除去背景探針信號(hào)。對(duì)于雙鏈體(例如，具有多于100個(gè)核苷酸)來(lái)說(shuō)，中度嚴(yán)格性洗滌的實(shí)例是在45'C下實(shí)施1XSSC洗滌15分鐘。對(duì)于雙鏈體(例如，具有多于100個(gè)核苷酸)來(lái)說(shuō)，低嚴(yán)格性洗滌的實(shí)例是在40'C下實(shí)施4-6XSSC洗滌15分鐘。通常來(lái)說(shuō)，在特定雜交分析中信噪比是對(duì)于無(wú)關(guān)探針?biāo)^察到者的兩倍(或更高)表明檢測(cè)到特異性雜交。如果在嚴(yán)格條件下彼此不雜交的核酸所編碼的多肽基本上一致，則這些核酸仍然基本上一致。當(dāng)(例如)核酸的拷貝是利用遺傳密碼所允許的最大密碼簡(jiǎn)并性產(chǎn)生時(shí)，可出現(xiàn)此種情況。因此，本發(fā)明的核苷酸序列包括與以下序列至少約70%、優(yōu)選至少約80%、且更優(yōu)選至少約90%—致的核苷酸序列SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:H、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:lll、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、或SEQIDNO:149或其長(zhǎng)度為至少約50個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少約100個(gè)核苷酸的片段。本發(fā)明也是關(guān)于產(chǎn)生由生色團(tuán)基因簇所編碼的一或多種蛋白質(zhì)的方法。所述蛋白質(zhì)可通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)一或多種包含以下序列的核酸來(lái)產(chǎn)生SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:lll、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、或SEQIDNO:149。例如，可將一或多種上述核酸與調(diào)節(jié)控制核酸可操作連接以影響表達(dá)并納入到宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，產(chǎn)生脫輔基蛋白或脫輔基蛋白前體?？捎糜诒景l(fā)明的控制元件包括啟動(dòng)子，其視情況含有啟動(dòng)子序列及核糖體結(jié)合位點(diǎn)。也期望其它調(diào)節(jié)序列，例如那些容許調(diào)節(jié)與宿主細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的脫輔基蛋白或脫輔基蛋白前體的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列己為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知，且實(shí)例包括使基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激開(kāi)啟或關(guān)閉者，包括存在調(diào)節(jié)化合物。其它類型的調(diào)節(jié)元件也可存在于載體中，例如，增強(qiáng)子序列。多種表達(dá)載體已為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知，例如，粘粒、PI、YAC、BAC、PAC、HAC?？蛇x標(biāo)記也可包括于重組表達(dá)載體中。我們已知可用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的多種標(biāo)記且通常包含當(dāng)在適當(dāng)選擇培養(yǎng)基中培育細(xì)胞時(shí)其表達(dá)賦予經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞可選表型的基因。所述標(biāo)記包括(例如)賦予質(zhì)粒抗生素抗性或靈敏性的基因?？蓪⑸鲜鲚d體插入適于蛋白質(zhì)表達(dá)的任何原核或真核細(xì)胞中。宿主細(xì)胞包括但不限于馬杜拉放線菌屬、鏈霉菌屬、小單孢菌屬、放線菌屬、野野村菌屬(Nonomurea)、假單胞菌屬(&e"必mo朋s)、及諸如此類。優(yōu)選宿主細(xì)胞是諸如馬杜拉放線菌屬、鏈霉菌屬、及小單孢菌屬等天然表達(dá)烯二炔的那些物種或菌株(例如細(xì)菌菌株)。(參見(jiàn)，例如，菲佛(Pfeifer)等人，2001，科學(xué)(Science)291，1790-2;馬丁內(nèi)斯(Martinez)等人，2004，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)70，2452-63)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)是在大腸桿菌(五.coh')中表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物的回收可按照所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)施。因此，例如，可使蛋白質(zhì)與合適標(biāo)簽一起表達(dá)以有助于分離(例如，HiS6標(biāo)簽)。其它標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)也適宜且已為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知(參見(jiàn)，例如，夸德里(Quadri)等人，1998，生物化學(xué)(Biochemistry)37，1585-95;中野(Nakano)等人，1992,分子及普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)232，313-21)。當(dāng)全部色蛋白基因簇經(jīng)表達(dá)時(shí)，則回收色蛋白。通過(guò)選擇某些or/來(lái)表達(dá)，可產(chǎn)生色蛋白相關(guān)化合物。例如，脫輔基蛋白前體可通過(guò)表達(dá)or/23來(lái)產(chǎn)生。我們也可使用包含以下序列的核酸分子或其片段作為探針SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDN0:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:4、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:紙SEQIDNO:lll、SEQIDNO:U3、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143、SEQIDNO:145、SEQIDNO:147、或SEQIDNO:149。所述探針可用于識(shí)別本發(fā)明核酸。我們可通過(guò)任何適宜方法來(lái)使用核苷酸序列作為探針，包括與在下文實(shí)例中所闡述的方法類似者。如本文所述，使用dNDP-葡萄糖-4,6-脫水酶(DH)探針來(lái)識(shí)別可能含有編碼脫輔基蛋白或其它生色團(tuán)相關(guān)蛋白的基因或基因簇的馬杜拉放線菌屬21G792基因組DNA的粘粒純系。同樣，可在其它生物體中使用本發(fā)明核酸來(lái)識(shí)別編碼脫輔基蛋白及生色團(tuán)相關(guān)蛋白(尤其九元環(huán)烯二炔生色團(tuán))的^/。所述生物體通常包括產(chǎn)生二級(jí)代謝物的生物體，例如，真菌、桿狀菌、假單胞菌、粘細(xì)菌及藍(lán)細(xì)菌。優(yōu)選地，所述核酸可用于識(shí)別放線菌目(原核屬分類學(xué)概要伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)⑧(TaxonomicOutlineoftheProcaryoticGenera:Bergey'sManualofSystematicBacteriology),第2版)生物體的基因，所述放線菌目生物體包括但不限于放線菌屬、鏈霉菌屬或小單孢菌屬等屬的生物體。更優(yōu)選地，核酸可用于識(shí)別馬杜拉放線菌屬種類及亞種的基因。本發(fā)明也提供基本上純凈的蛋白質(zhì)及多肽。本文所用的關(guān)于給定多肽的術(shù)語(yǔ)"基本上純凈"意指多肽基本上不含其它生物大分子。例如，基本上純凈的多肽以干燥重量計(jì)至少75%、80%、85%、95%、或99%純凈?？赏ㄟ^(guò)所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所習(xí)知的任何適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)測(cè)量純度，例如，通過(guò)柱色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳、或HPLC分析。應(yīng)了解，基本上純凈的蛋白質(zhì)包括其中脫輔基蛋白與烯二炔分子復(fù)合的色蛋白。所述附接可通過(guò)(例如)共價(jià)或非共價(jià)鍵(例如，氫鍵)達(dá)成。本發(fā)明蛋白質(zhì)及多肽包括由馬杜拉放線菌屬21G792的色蛋白基因簇的o咲所編碼者。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)及多肽是包含以下序列者SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQ18IDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:l16、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144、SEQIDNO:l46、SEQIDNO:148、或SEQIDNO:150。在特定優(yōu)選實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)是21G792脫輔基蛋白前體(SEQIDNO:64)或脫輔基蛋白(SEQIDNO:150)(圖7)。表2中提供21G792脫輔基蛋白前體及脫輔基蛋白的氨基酸組成。表2馬杜拉放線菌屬21G792脫輔基蛋白的氨基酸組成氨基酸數(shù)量組成(％)Asp86.02Asn43.01Thr2317.29Ser96.77Glu53.76Gin64.51Pro86.02Gly1612.03Ala1712.78Val2115.79Cys21.50Met21.50lie3.76Leu21.50Tyr21.50Phe32.26也應(yīng)了解，本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)一步包括那些具有與上述優(yōu)選蛋白質(zhì)及多肽基19本上相同的氨基酸序列者。在本文中將基本上相同的氨基酸序列定義為按照皮爾森(Pearson)及李普曼(Lipman)，1988，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)S5,2444-8通過(guò)FASTA搜索方法測(cè)定具有至少約70%、優(yōu)選至少約80%、且最優(yōu)選至少約90%同源性的序列，包括與以下序列至少約70%、優(yōu)選至少約80%、且更優(yōu)選至少約90%—致的序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48、SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144、SEQIDNO:146、SEQIDNO:148、或SEQIDNO:150。所述蛋白質(zhì)與馬杜拉放線菌屬21G792蛋白質(zhì)具有類似活性，尤其在存在保守氨基酸取代的情況下。保守氨基酸取代定義為憑借改變肽、多肽或蛋白質(zhì)、或其片段的一或多個(gè)氨基酸而實(shí)施的氨基酸組成的改變。取代是關(guān)于具有一般相似特性(例如，酸性、堿性、芳香性、尺寸、帶正電荷或負(fù)電荷、極性、非極性)的氨基酸，由此所述取代不會(huì)實(shí)質(zhì)上改變相關(guān)肽、多肽或蛋白質(zhì)的特征(例如，電荷、等電點(diǎn)、親和性、親合力、構(gòu)象、溶解性)或活性。在包括但不限于以下的氨基酸群組內(nèi)選擇典型保守取代(1)疏水性..甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I);(2)親水性半胱氨酸(C)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)-,(3)酸性天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);(4)堿性組氨酸(H)、賴氨酸(K)、精氨酸(R);(5)芳香性苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)及色氨酸(W);(6)影響鏈定向的殘基gly、pro。因此，本發(fā)明也包含與21G792脫輔基蛋白具有相似氨基酸組成的脫輔基蛋白及多肽，其中氨基酸序列與SEQIDNO:64或SEQIDNO:150基本上相同，尤其在氨基酸取代為保守取代的情況下。本發(fā)明通過(guò)(例如)引入一或多種隨機(jī)或靶向突變、缺失、或插入來(lái)改變馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白基因簇的一或多個(gè)o《。如此，可對(duì)生色團(tuán)、脫輔基蛋白或二者實(shí)施修飾以產(chǎn)生展示(例如)降低的毒性、增加的效能或增加的穩(wěn)定性的色蛋白。已認(rèn)識(shí)到某些烯二炔生色團(tuán)在對(duì)所述生色團(tuán)具有特異性的位點(diǎn)處裂解DNA。此外，多種色蛋白對(duì)組蛋白具有獨(dú)特的蛋白水解活性。因此，對(duì)馬杜拉放線菌屬21G792脫輔基蛋白及/或生色團(tuán)實(shí)施處理也可提供具有經(jīng)改變特異性的色蛋白。或者，可對(duì)脫輔基蛋白實(shí)施修飾以用作精選活性分子的載體或遞送媒劑。本發(fā)明也提供可與另一生物分子連接的經(jīng)修飾的馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)或脫輔基蛋白/生色團(tuán)復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施例中，所述生物分子提供生色團(tuán)或色蛋白的特異性靶標(biāo)。所述生物分子可為(例如)抗體或細(xì)胞表面分子或受體的其它配體。例如，可將編碼經(jīng)改變馬杜拉放線菌屬21G792脫輔基蛋白的核酸插入到表達(dá)載體中及宿主細(xì)胞中，在適于表達(dá)脫輔基蛋白的條件下對(duì)宿主細(xì)胞實(shí)施培養(yǎng)，并自宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基回收脫輔基蛋白。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞能夠產(chǎn)生烯二炔生色團(tuán)或可與經(jīng)改變脫輔基蛋白形成復(fù)合物的其它分子。所述細(xì)胞的實(shí)例包括多種產(chǎn)生抗生素的放線菌目生物體，尤其產(chǎn)生烯二炔的諸如馬杜拉放線菌屬及鏈霉菌屬等生物體。宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括諸如大腸桿菌及酵母等常見(jiàn)宿主。當(dāng)然，經(jīng)改變的脫輔基蛋白可在馬杜拉放線菌屬21G792中得以表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施例中，經(jīng)改變的脫輔基蛋白會(huì)在宿主細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。若在宿主細(xì)胞中存在任何其它內(nèi)源性脫輔基蛋白，則經(jīng)改變的脫輔基蛋白將以較高水平表達(dá)，其它脫輔基蛋白將低表達(dá)，或?qū)⒔?jīng)改變的脫輔基蛋白與標(biāo)簽一起表達(dá)以有助于所述純化。在優(yōu)選實(shí)施例中，通過(guò)同源重組使編碼經(jīng)改變脫輔基蛋白的核酸代替內(nèi)源性脫輔基蛋白基因。如此，可隨后將呈與烯二炔或其它分子(例如，活性劑)的復(fù)合物形式的經(jīng)改變的脫輔基蛋白分離出來(lái)，并隨后在(例如)癌細(xì)胞系下對(duì)所述復(fù)合物實(shí)施篩選以測(cè)定生物活性。在再一實(shí)施例中，a)在宿主細(xì)胞中表達(dá)經(jīng)改變的脫輔基蛋白并在不與烯二炔或其它分子復(fù)合下回收，b)隨后將經(jīng)改變的脫輔基蛋白置于多種烯二炔或其它分子的影響下，c)利用可接受的技術(shù)來(lái)測(cè)定脫輔基蛋白是否與烯二炔或其它分子形成復(fù)合物，且視情況d)針對(duì)生物活性對(duì)復(fù)合物實(shí)施篩選。在再一實(shí)施例中，在宿主細(xì)胞中表達(dá)經(jīng)改變的脫輔基蛋白并在不與烯二炔或其它分子復(fù)合下回收，隨后將經(jīng)改變的脫輔基蛋白置于多種烯二炔或其它分子的影響下，并針對(duì)生物活性對(duì)復(fù)合物實(shí)施篩選。在另一實(shí)例中，對(duì)編碼經(jīng)修飾生色團(tuán)生物合成途徑的核酸施表達(dá)。自馬杜拉放線菌屬21G792生物合成簇表達(dá)的多肽的功能可通過(guò)將ORF序列與已知蛋白質(zhì)及序列基序進(jìn)行比較來(lái)推導(dǎo)。(表3)表321G792色蛋白基因簇的ORF的推導(dǎo)功能ORF尺寸類似蛋白質(zhì)登記號(hào)、(％—致14/%相似性)提出的功能<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>ORF尺寸類似蛋白質(zhì)登記號(hào)、(％—致^/%相似性)提出的功能OrflO336轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，KasT，小金色鏈霉菌(streptomycesfa3SMgae"&)BAC53615,49/63StrR類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子Orfll218推定的調(diào)節(jié)蛋白，SgcRl，球孢鏈霉菌(streptomycesg/o^/w贈(zèng))AAL06694，58/72未知Orfl2552氧化還原酶，NcsE9，制癌菌素鏈霉菌AAM78005,79/87氧化還原酶Orfl3365未知，SgcM，球孢鏈霉菌AAL06686，46/52未知Orfl4261未知，NcsEll，制癌菌素鏈霉菌AAM78004,61/73未知Orfl5229O-甲基轉(zhuǎn)移酶，弗蘭克菌屬(Fra"^j)EANlpecZP—0573484,49/67o-甲基轉(zhuǎn)移酶Orfl695NRPSPCP-結(jié)構(gòu)域，NRPS7-5,阿維鏈霉菌MA-4680BAB69396，41/53芳基載體蛋白Orfl71120II型NRPSA結(jié)構(gòu)域，SgcCl,球孢鏈霉菌AAL06681,41/49NRPS:C、A、PCPOrfl8537氨基變位酶，SgcC4，球孢鏈霉菌AAL06680，73/84氨基變位酶Orfl9548推定的鹵化酶，弗蘭克菌屬Cc13ZP_00548729，62〃5鹵化酶Orf20460II型NRPSC結(jié)構(gòu)域，SgcC5，球孢鏈霉菌AAL06678,46/59II型NRPSC結(jié)構(gòu)域Orf21442角鯊烯單加氧酶類蛋白，SgcD2，球孢鏈霉菌AAL06669,50/56單加氧酶Orf22525跨膜流出蛋白，SgcB，球孢鏈霉菌AAF13999,48/67跨膜流出蛋白Orf23165假定蛋白，阿維鏈霉菌MA-4680BAC71199，33/44脫輔基蛋白前體Orf24461腺苷甲硫氨酸-8-氨基-7-氧壬酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶，嗜熱共生小桿菌BAD39928,43/58氨基轉(zhuǎn)移酶Orf25408P450羥化酶，Cyp28，阿維鏈霉菌MA-4680BAC75180，45/59P450羥化酶Orf26381假定蛋白，天藍(lán)色鏈霉菌(streptomycescoelicolor)A3(2)CAC22728,33/46未知Orf27409推定的細(xì)胞色素P450氧化還原酶，變鉛青鏈霉菌(streptomyceslividans)1326AAC25766,45/60P450氧化還原酶Orf28232保守的假定蛋白，克勞氏芽孢桿菌(5ac"toc/attwY)KSM-KI6AD63964,51/71未知Orf29466糖基轉(zhuǎn)移酶，SgcA6，球孢鏈霉菌AAL06670，43/57糖基轉(zhuǎn)移酶23<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>ORF尺寸類似蛋白質(zhì)登記號(hào)e，(％—致掛％相似性)提出的功能Orf49277保守的假定蛋白，嗜熱子囊菌(77lemio&,a加ca)YXAAZ55273,51/64dNDP-糖差向異構(gòu)酶Orf50213轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，慢生性大豆根瘤菌BAC49474，45/60TetR家族，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子Orf51266推定的膜蛋白，天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)CAB61706,52/66未知Orf52196推定的TetR-家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)CAB71239,30/47TetR家族，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子Orf53109轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，百脈根中慢生根瘤菌BAB53793,50/70ArsR家族，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子Orf54142保守的假定蛋白，茄科雷爾氏菌CAD17332，49/58未知Orf55292LysR家族調(diào)節(jié)蛋白，弗蘭克菌屬EANlpecZP—00571435，43/54LysR家族，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子Orf56337A類P-內(nèi)酰胺酶，Bla，星形諾卡菌AAG44836,46/58未知Orf57352假定蛋白，互營(yíng)桿菌(Syn"o/;/zo/"c^rZP一00667098,26/40未知Orf5869無(wú)-未知Orf59592RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，弗蘭克菌屬EANlpecZP—00570947，70/80未知Orf6059無(wú)-未知Orf6125無(wú)-未知Orf62167推定的調(diào)節(jié)蛋白，天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)CAC44216,40/47調(diào)節(jié)子Orf63259保守的假定蛋白，天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)CAB62713，32/50未知Orf64144NUDIX水解酶，弗蘭克菌屬EANlpecZP一00572338,38/56DNA修復(fù)Orf65197b推定的結(jié)合蛋白依賴性膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，白喉?xiàng)U菌(CoJ7nefoacfriwmdi/她eriae)CAE50656,n/aABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白a數(shù)量以氨基酸計(jì)bOrf不完整e給出最接近同系物的NCBI登記號(hào)*參與初級(jí)代謝與所述功能一致，提供會(huì)聚性生物合成途徑來(lái)合成馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔。分別產(chǎn)生復(fù)合物的四種主要組份(烯二炔核心、馬杜拉胺、2-羥基-3，6-二甲基苯25甲酸、及3-(2-氯-3-羥基-4-甲氧基苯基)-3-羥基-丙酸)并隨后組裝以形成最終生物活性產(chǎn)物。J-。-禽-3-秀碁4伊髯碁求萄-3-萄募尿度,#教仝教會(huì)成。為產(chǎn)生烯二炔的3-(2-氯-3-羥基-4-甲氧基-苯基)-3-羥基丙酸-衍生部分(圖9)，首先借助or/7S基因產(chǎn)物將酪氨酸轉(zhuǎn)化成p-酪氨酸。Orfl8顯示與數(shù)種組氨酸及苯丙氨酸解氨酶具有高相似性，但與C-1027生物合成途徑的SgcC4最為相似(73%—致性，84%相似性)，所述SgcC4催化卩-酪氨酸轉(zhuǎn)化成(3-酪氨酸。(劉(Liu)等人，2002，科學(xué)，297，1170-73;范拉奈(VanLanen)等人，2005，美國(guó)化學(xué)會(huì)志(丄Am.C/iem.Soc)，127，11594-5)。然后，借助o/^7基因產(chǎn)物的腺苷?；?A)結(jié)構(gòu)域?qū)-酪氨酸激活成氨酰腺苷酸，并轉(zhuǎn)移至鄰近肽載體蛋白(PCP)的磷酸泛酰巰基乙胺基輔基的巰基上，形成p-酪氨?；?S-Orfl7。Orfl7與一系列非核糖體肽合成酶(NRPS)相似?；谒茖?dǎo)氨基酸序列的序列分析，Orfl7包含三種功能結(jié)構(gòu)域縮合(C)結(jié)構(gòu)域、A結(jié)構(gòu)域及PCP結(jié)構(gòu)域(圖10)。參見(jiàn)，康茲(Konz)及馬哈耳(Marahiel)，1999，化學(xué)及生物學(xué)(C/iem.5!W.)，6，R39-R47。A結(jié)構(gòu)域的底物特異性密碼是自介于A4與A5A結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)基序之間的區(qū)域選取，顯示特異性密碼DPCQVMVIAK(表4)。表4也繪示來(lái)自C1027生物合成簇的SgcCl(查理斯(Challis)等人，2000，化學(xué)及生物學(xué)7，211-24)及來(lái)自短桿菌肽生物合成簇的GrsA(史塔克豪斯(Stachelhaus)等人，1999，化學(xué)及生物學(xué)，6，493-505)的底物及底物特異性密碼。表4腺苷?；Y(jié)構(gòu)域底物特異性密碼的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>Orfl7與來(lái)自C-1027生物合成簇的SgcCl最為相似(41%—致性，49%相似性)。SgcCl編碼由單獨(dú)A結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的II型非核糖體肽合成酶(NRPS)。此酶的活體外定性已顯示，其在將P-酪氨酸裝載于SgcC2上之前將)3-酪氨酸特異性激活，SgcC2是由單個(gè)PGP結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的II型NRPS。(范拉奈等人，2005)。SgcCl與Orfl7的底物特異性密碼的比較顯示所述密碼非常相似(Orfl7的DPCQVMVIAK相對(duì)于SgcCl的DPAQLMLIAK)。因?yàn)閮煞N酶均激活相同底物，故此相似性并不令人驚奇。有趣的是，m/77的終止密碼子與o/y7S的起始密碼子重疊3bp，此表明這兩種基因的表達(dá)可能經(jīng)轉(zhuǎn)譯偶合。使所述基因的表達(dá)協(xié)調(diào)是所期望的，因?yàn)樵诒磉_(dá)但不同時(shí)表達(dá)可提供P-酪氨酸的or/M時(shí)會(huì)導(dǎo)致在不提供其預(yù)期底物下即產(chǎn)生基因產(chǎn)物。在經(jīng)由硫酯鍵裝載于Orfl7的PCP上后，由Orfl5對(duì)P-酪氨?；?S-Orf17實(shí)施甲基化以得到3-氨基-3-(4-甲氧基-苯基)-丙基-S-Orf17。Orfl5顯示與許多S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依賴性O(shè)-甲基轉(zhuǎn)移酶具有強(qiáng)相似性且具有與SAM依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶所共有的三種序列基序(基序l-WDVGTFTG，SEQIDNO:166;基序2-PAADLVFL，SEQIDNO:167;基序3-LLRPGGLLVA，SEQIDNO:168)。喀甘(Kagan)及克拉克(Clarke),(1994)生物化學(xué)與生物物理學(xué)檔案04m祝oc/^m.fi/op/i}^.)，310，417-427。因?yàn)轳R杜拉放線菌屬21G792烯二炔具有單個(gè)O-甲基，故Orfl5是最有可能催化此反應(yīng)的酶。隨后使此酶限定的中間體經(jīng)由Orf39羥化產(chǎn)生3-氨基-3-(3-羥基-4-甲氧基-苯基)-丙基-S-Orfl7。普拉斯特(BlastP)分析表明Orf39是與造成酚類底物羥化的許多羥化酶相似的羥化酶。其與C-1027生物合成簇的SgcC突出地相似(73%—致性，82%相似性)，已在活體外顯示其羥化經(jīng)氯化的(3-酪氨?；?S-PCP中間體。(劉等人，2002;范拉奈等人，2005)。羥化后，0///9基因產(chǎn)物使芳香環(huán)的<:-2位置氯化以產(chǎn)生3-氨基-3-(2-氯-3-羥基-4-甲氧基-苯基)-丙基-S-Orf17。Orfl9與數(shù)種參與二級(jí)代謝的烷基鹵化酶同源，最顯著地與來(lái)自C-1027生物合成簇的SgcC3同源(58%—致性，70%相似性)，已顯示SgcC3對(duì)PCP結(jié)合的(3-酪氨酸實(shí)施氯化。(劉等人，2002;范拉奈等人，2005)。由于納入到馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔中的J3-酪氨酸衍生物具有羥基而非氨基，我們可預(yù)見(jiàn)3-氨基-3-(2-氯-3-羥基-4-甲氧基-苯基)-丙基-S-Orf17中間體的氨基經(jīng)由氧化脫氨作用而被Orf21代替。普拉斯特(BlastP)分析揭示，Orf21顯示與數(shù)種推定的FAD及NADPH依賴性單加氧酶/羥化酶具有相似性且結(jié)構(gòu)域分析顯示其含有與許多單加氧酶所共有的FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此結(jié)構(gòu)域?yàn)榘被嵫趸杆灿?，其中氧化脫氨作用已有許多記載，因此Orf21是實(shí)施所述轉(zhuǎn)化的可能候選者。然而，注意到存在數(shù)種其它可潛在催化此反應(yīng)的候選者甚為重要，所述其它候選者包括Orf42，其也與FAD及NADPH依賴性單加氧酶/羥化酶相似。另外，與P450羥化酶相似的兩種Orf(Orf25及Orf27)存在于生物合成簇中且因?yàn)镻450羥化酶也參與氧化脫氨反應(yīng)，所以這些酶中的一種也可能催化此步驟。(李(Li)等人，2000，細(xì)菌學(xué)雜志G/,5""er/0/.)182，4087-95)氧化脫氨作用后，可能發(fā)生可能由Orf21或一種其它候選酶引入的酮的還原。能夠催化此反應(yīng)的最明顯的酶是酮還原酶，其與那些用于聚酮生物合成的酶相似。對(duì)馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔生物合成簇實(shí)施檢查未識(shí)別出任何顯示與酮還原酶類酶具有相似性的酶。所述簇中存在數(shù)種功能未知的可能催化所需還原的酶，或能夠催化氧化脫氨作用的酶也可能催化此還原反應(yīng)?；蛘?，在當(dāng)前生物合成途徑外編碼的酶可能催化此預(yù)期還原。在酮還原后，酪氨酸衍生物3-(2-氯-3-羥基-4-甲氧基-苯基)-3-羥基-丙基-S-Orf17準(zhǔn)備納入到馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔復(fù)合物中。將馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔的此組份納入到最終產(chǎn)物中將在下文中予以論述。此合成途徑并不視為限制性的，而是僅為闡釋性的。使用此作為模型，所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)出產(chǎn)生馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)的3-(2-氯-3-羥基-4-甲氧基-苯基)-3-羥基-丙基組份或此組份的衍生物的許多其它合成方案。與控i^^^r^^全^r會(huì)成。對(duì)馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔生物合成途徑進(jìn)行27分析識(shí)別出五種可能參與馬杜拉胺(4-氨基-4-去氧-3-C-甲基-(3-吡喃核糖)生物合成的基因(圖ll)。馬杜拉胺(MDA)生物合成的第一步驟(所有脫氧糖也如此)是由葡萄糖-dNDP合酶激活D-葡萄糖-l-磷酸鹽(G-l-P)。特瑞澤(Trefzer)等人，1999,天然產(chǎn)物報(bào)告(Ato.Prod16,283-99。與數(shù)種葡萄糖-dNDP合酶同源的Orf43使G-l-P激活?；贠rf43與基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)數(shù)據(jù)庫(kù)中其它蛋白質(zhì)的序列同源性，Orf43可能催化形成dTDP或dUDP-葡萄糖。然后，與dNDP-糖脫氫酶高度同源的酶Orf37將伯醇氧化成酸，產(chǎn)生dNDP-D-葡萄糖醛酸酯。隨后，可能的dNDP-葡萄糖醛酸脫羧酶Orf38將dNDP-D-葡萄糖醛酸酯轉(zhuǎn)化成dNDP-木糖。基于馬杜拉胺生物合成可能與包括4,6-脫氧葡萄糖中間體的dNDP-葡萄糖-4,6-脫水酶有關(guān)的預(yù)測(cè)使用自擴(kuò)增的片段作為探針來(lái)識(shí)別含有馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔生物合成簇的第一粘粒(參見(jiàn)實(shí)例)。然而，將UDP-葡萄糖醛酸脫羧酶及TDP-葡萄糖-4,6-脫水酶氨基酸序列與Orf38的序列進(jìn)行比較顯示戴克(Decker)等人用以設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增葡萄糖-4，6-脫水酶基因的PCR引物的保守氨基酸基序也存在于Orf38及葡萄糖醛酸脫羧酶序列中(圖12)。(戴克等人，1994，F(xiàn)EMS微生物學(xué)快報(bào)(FEMSM!'cra.L饑)，141,195-201)。因此，使用這些引物來(lái)擴(kuò)增葡萄糖醛酸脫羧酶并不令人驚奇。另外，應(yīng)注意0;^7的終止密碼子與o/^S的起始密碼子重疊，此表明所述w/可能經(jīng)轉(zhuǎn)譯偶合。在dNDP-葡萄糖醛酸脫羧后，由Orf49對(duì)dNDP-D-木糖的C-3羥基實(shí)施差向異構(gòu)化，產(chǎn)生dNDP-L-木糖。Orf49與來(lái)自嗜熱子囊菌(登記號(hào)AAZ55273.1)的未經(jīng)定性的蛋白質(zhì)最為相似且其第二最密切相關(guān)的同系物是ovmX(409b—致性，53%相似性)，ovmX是推定的參與歐維德霉素(oviedomycin)生物合成的來(lái)自抗生鏈霉菌ATCC11891的NDP-糖差向異構(gòu)酶。(龍目(Lombo)等人，2004，化學(xué)與生物化學(xué)(C/iemWodiem)5，1181-7)在差向異構(gòu)化后，0^0基因產(chǎn)物使dNDP-L-木糖的3-碳甲基化。Orf40顯示與多種NDP-己糖C-甲基轉(zhuǎn)移酶具有顯著相似性且具有多種SAM依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶所共有的三種序列基序(基序l-IVEIGCNDG，SEQIDNO:169;基序2-GPADVLYG，SEQIDNO:170;基序3-LLKPDGIFVF,SEQIDNO:171)。(喀甘及克拉克，1994生物化學(xué)與生物物理學(xué)檔案，310，417-27)。因此，預(yù)期Orf40將實(shí)施此甲基化。盡管預(yù)期在馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔的2-羥基-3，6-二甲基-苯甲酸(HDBA)部分的生物合成中將發(fā)生另一C-甲基化，但預(yù)期催化所述甲基化的C-甲基轉(zhuǎn)移酶(Orf33)似乎與造成HDBA碳骨架產(chǎn)生的聚酮合酶形成小操縱子，因此，預(yù)計(jì)Orf40不會(huì)參與所述轉(zhuǎn)化。經(jīng)甲基化的dNTP-糖隨后經(jīng)歷C-4氨基交換以形成dNTP-馬杜拉胺。此反應(yīng)可能是由與來(lái)自賜諾殺(spinosyn)生物合成簇的SpnR高度同源(559b—致性，68%相似性)的Orf36催化，已顯示其在D-二磷酸核甘(D-forosamine)形成中實(shí)施脫氧糖中間體的C-4氨基交換。(趙(Zhao)等人，2005,美國(guó)化學(xué)會(huì)會(huì)志(JACS)，127，7692-3)將馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔的馬杜拉胺組份納入到最終產(chǎn)物中將在下文中予以論述。28此合成途徑并不視為限制性的，而是僅為闡釋性的。使用此作為模型，所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)出產(chǎn)生馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔的MDA組份或此組份的衍生物的許多其它合成方案。2-秀募3，6-二伊募苯伊度教#浙豸餘會(huì)成。馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔的2-羥基-3，6-二甲基苯甲酸(HDBA)組份最有可能由兩種基因產(chǎn)物合成Orf32及Orf33，Orf32是迭代I型聚酮合酶(PKS)，Orf33是SAM依賴性C-甲基轉(zhuǎn)移酶(圖13)。直至最近，用于芳香族聚酮生物合成的細(xì)菌范例仍要求迭代II型PKS。(沈(Shen)等人，2003，化學(xué)生物學(xué)新觀點(diǎn)(Ozn".C7zem說(shuō)'oZ.)7,285-95)。對(duì)馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔生物合成簇實(shí)施檢查未揭示存在任何與II型PKS同源的基因。然而，Orf32顯示與NcsB(47%—致性，59%相似性)及與數(shù)種真菌來(lái)源的6-甲基水楊酸合酶具有顯著相似性，NcsB是造成產(chǎn)生新制癌菌素的萘甲酸部分的迭代I型PKS。(劉等人,2005，化學(xué)及生物學(xué)，293-302)Orf32由I型PKS所共有的5種結(jié)構(gòu)域組成，包括酮合酶(KS)、?；D(zhuǎn)移酶(AT)、脫水酶(DH)、酮還原酶(KR)及酰基載體蛋白(ACP)。其通過(guò)迭代脫羧縮合繼而在C-4處選擇性酮還原及脫水及在C-2處酮還原自一個(gè)乙?；?輔酶(coA)及三個(gè)丙二酰基coA催化形成線性丁烯酮(tetraketide)。隨后初生的丁烯酮中間體經(jīng)歷非酶促分子內(nèi)羥醛縮合以形成環(huán)化6-甲基水楊酸(6MSA)中間體。隨后，o《B基因產(chǎn)物使6MSA中間體的C-3位置甲基化以形成HDBA。Orf33與包括N-、C-及O-甲基轉(zhuǎn)移酶在內(nèi)的多種SAM依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶相似。與其分類一致，Orf33具有多種SAM依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶所共有的三種序列基序(基序1-VLDLGGGDG，SEQIDNO:172;基序2-DGCDAILY,SEQIDNO:173;基序3-ALPEGGVCW，SEQIDNO:174)。(喀甘及克拉克，1994)。盡管存在于生物合成簇中的其它甲基轉(zhuǎn)移酶可能催化此反應(yīng)，但Orf33是Orf32的直接上游且似乎是致力于產(chǎn)生HDBA的小操縱子的一部分且因此是最有可能實(shí)施此反應(yīng)的酶。自PKS釋放環(huán)化聚酮不需要硫酯酶，大多數(shù)聚酮也是如此。更確切地，其經(jīng)由烯酮途徑釋放，此與所報(bào)道的6-甲基水楊酸生物合成類似。斯賓塞(Spencer)及約旦(Jordan),(1992)生物化學(xué)期刊(5/oc/iem./.)，288，839-846。在自O(shè)rf32釋放后，HDBA由or/7基因產(chǎn)物激活為芳基腺苷酸。Orf31與多種芳酸AMP-連接酶相似。此等類型酶經(jīng)充分研究的實(shí)例來(lái)自于對(duì)含鐵細(xì)胞生物合成的研究。在許多含鐵細(xì)胞情況下，諸如水楊酸鹽或2'，3'-二羥基苯甲酸鹽等芳酸在含鐵細(xì)胞非核糖體肽核心的組裝中作為第一步驟經(jīng)腺苷?；?綜述參見(jiàn)克羅薩(Crosa)及沃爾什(Walsh)，2002,微生物學(xué)及分子生物學(xué)評(píng)論(M!'craWo/iev.)，66，223-49)。除將芳酸激活成腺苷酸外，這些酶也將芳酸轉(zhuǎn)移到所謂芳基載體蛋白(ArCP)的磷酸泛酰巰基乙胺基輔基的巰基上。參與含鐵細(xì)胞細(xì)菌素(bacillibactin)生物合成的2'，3'-二羥基苯甲酸鹽-AMP連接酶(DhbE)的晶體結(jié)構(gòu)與其它腺苷?；?包括NRPSGrsA腺苷酰化結(jié)構(gòu)域及螢火蟲(chóng)螢光酶)晶體結(jié)構(gòu)的比較揭示芳酸-激活結(jié)構(gòu)域含有氨基酸激活結(jié)構(gòu)域中不存在的特征序列。(梅(May)等人，2002，PAWS99,12120-5)。在DhbE中，通常存在于氨基酸-激活結(jié)構(gòu)域中的所謂核心A4基序(YxFDxS)經(jīng)序列基序HNYPLSSPG代替。在氨基酸-激活結(jié)構(gòu)域中，無(wú)變化的Asp殘基使氨基酸底物的p-氨基穩(wěn)定，而在芳酸-激活結(jié)構(gòu)域中，Asp殘基經(jīng)保守中性Asn代替，氫與DHBA或水楊酸的2'-羥基鍵合。(梅等人，2002)。因?yàn)镠DBA具有2'-羥基，因此我們預(yù)期Orf31具有芳酸-激活A(yù)4基序。對(duì)Orf31序列實(shí)施檢查揭示基序HNFPLASPG(SEQIDNO:175)與激活芳酸的酶一致(圖14)。與NRPS的氨基酸-激活結(jié)構(gòu)域一樣(史塔克豪斯等人，1999，化學(xué)及生物學(xué)，6，493-505;査理斯等人，2000，化學(xué)及生物學(xué)7，211-24)，芳酸-激活結(jié)構(gòu)域的底物特異性密碼可自介于A4與A5核心基序之間的區(qū)域選取。(梅等人，2002)。表5顯示Orf31底物特異性密碼與其它芳酸-激活結(jié)構(gòu)域的底物特異性密碼的比較，所述其它芳酸-激活結(jié)構(gòu)域參與以下二級(jí)代謝物的生物合成維吉霉素(virginiamycin)(VisB，登i己號(hào)BAB83672)、普那霉素(pristinamycin)(SnbA,登記號(hào)CAA67140)、分枝菌素(mycobactin)(MbtA，登記號(hào)CAB03759)、耶爾辛菌素(yersiniabactin)(YbtE，登記號(hào)AAC69591)、綠膿桿菌螯鐵蛋白(pyochelin)(PchD，登記號(hào)AAD55799)、新制癌菌素(NcsB2，登記號(hào)AAM77987)、維瑞菌素(vibriobactin)(VibE，登記號(hào)007899)、烏尼菌素(vulnibactin)(Vval301，登記號(hào)BAC97327)、細(xì)菌素(DhbE，登記號(hào)AAC44632)、及粘球菌素(myxochdin)(MxcE,登記號(hào)AF299336)。按照GrsA苯丙氨酸-激活腺苷?；Y(jié)構(gòu)域?qū)ξ恢眠M(jìn)行編號(hào)(史塔克豪斯等人，1999)。提出參與辨別2',3'-二羥基苯甲酸(DHBA)與水楊酸間的激活的殘基標(biāo)記以星號(hào)。每一位置上與Orf31中所見(jiàn)殘基匹配的殘基加以灰色陰影。HPA,3-羥基2-吡啶甲酸。Orf31底物特異性密碼與其它芳酸-激活酶及激活3-羥基2-吡啶甲酸的兩種酶的密碼的比較表明Orf31激活水楊酸或HDBA。(表5)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>在激活水楊酸或HDBA后，Orf31催化經(jīng)激活的芳酸轉(zhuǎn)移到與ArCP附接的磷酸泛酰巰基乙胺基輔基的巰基上，ArCP由ozy76編碼。Orfl6是小蛋白(95aa)，其與參與二級(jí)代謝的許多PCP及ArCP相似(約30-40%—致)且其具有特征性4'-磷酸泛酰巰基乙胺附接基序，包括無(wú)變化的絲氨酸殘基(GTFFQLRGQSI;SEQIDNO:176)。如下文所論述，在附接到ArCP后，水楊酸鹽衍生物準(zhǔn)備納入到馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔復(fù)合物中。此合成途徑并不視為限制性的，而是僅為闡釋性的。使用此作為模型，所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)出產(chǎn)生馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)的2-羥基-3,6-二甲基苯甲酸組份或此組份的衍生物的許多其它合成方案。;^T炎^V/:,^r主^^^成。已在馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔生物合成簇中識(shí)別出至少十四種基因，其推導(dǎo)功能支持其在于圖15中所描繪的馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔核心生物合成中的作用。OW5編碼迭代I型PKS，所述迭代I型PKS顯示與烯二炔PKS具有端對(duì)端序列同源性，烯二炔PKS參與新制癌菌素(NcsE)、C-1027(SgcE)及卡奇霉素(CalE8)的生物合成。(劉等人，2005;劉等人，2002;阿勒特(Ahlert)等人，2002，科學(xué)，297，1173-76)。與先前所識(shí)別的烯二炔PKS—樣，Orf5由6個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成KS、AT、ACP、KR、DH、及所謂"末端結(jié)構(gòu)域"(TD)(圖16)。TD顯示與4'-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶同源。因此，己提出TD通過(guò)用4'-磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)譯后修飾ACP激活位點(diǎn)絲氨酸來(lái)催化烯二炔PKS自體激活。(雜坡勒斯(Zaz叩olous)等人，2003，自然生物技術(shù)(WamM歷o^/0，21，187-90)。預(yù)期Orf5會(huì)自一個(gè)乙酰基輔酶A及7個(gè)丙二?；o酶A以迭代方式產(chǎn)生初生線性聚不飽和聚酮中間體。所述線性中間體可能自O(shè)rf5釋放及/或由Orf6環(huán)化，其顯示與在所有烯二炔生物合成簇中發(fā)現(xiàn)的一組硫酯酶蛋白具有相似性。同上?；谄渑c假單胞菌屬菌株CBS-3的4-羥基苯甲酰基-輔酶A硫酯酶同源，預(yù)測(cè)此組蛋白質(zhì)起硫酯酶作用。同上。借助數(shù)種基因產(chǎn)物(Orf1-4、7、8、11、12、14)對(duì)聚酮中間體實(shí)施進(jìn)一步處理以提供烯二炔核心(圖15)。此等基因產(chǎn)物在烯二炔生物合成簇中高度保守。除Orf5及6外，Orfl-4的同系物可見(jiàn)于迄今所研究的所有烯二炔生物合成途徑中(同上)，而Orf7、8、11、12及14的同系物為9-元烯二炔C-1027及新制癌菌素生物合成簇所共有。(劉等人，2005;劉等人，2002)。Orf1-4、11及14與已知功能的任何蛋白質(zhì)都不同源，而Orf7、8及12與多種氧化還原酶類似。有趣地，大多數(shù)這些基因的表達(dá)可能是共調(diào)節(jié)的，因?yàn)榕cor/77及0//72—樣o^-S似乎經(jīng)轉(zhuǎn)譯偶合(例如o/^2的終止密碼子與orf3的起始密碼子重疊，且的終止密碼子與w/4的起始密碼子重疊等)。借助最少數(shù)量的可能參與自烯二炔核心的C13-C14環(huán)氧化物產(chǎn)生末端酰胺的三種基因產(chǎn)物Orf30、Orf41及Orf24對(duì)烯二炔核心(圖15)進(jìn)一步實(shí)施修飾。。^0編碼可能的環(huán)氧化物水解酶，o;/47編碼醇脫氫酶且o;:/24編碼氨基轉(zhuǎn)移酶。隨后用其它生色團(tuán)組份對(duì)經(jīng)充分修飾的烯二炔核心部分實(shí)施裝飾以產(chǎn)生活性代謝物。此合成途徑并不視為限制性的，而是僅為闡釋性的。使用此作為模型，所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)出產(chǎn)生馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)的烯二炔核心或此組份的衍生物的許多其它合成方案。與控:fe^遂^^27G792主經(jīng)虔鄉(xiāng)遂發(fā)。馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔的生物合成仿效當(dāng)前烯二炔生物合成的范例，其要求使用會(huì)聚性策略來(lái)組裝分子復(fù)合物的各組份。(劉等人，2005;劉等人，2002;阿勒特等人，2002)。在產(chǎn)生各組份后，將它們系統(tǒng)地附接到烯二炔核心上以最終提供如圖17中所描繪的最終分子。烯二炔核心與3-(2-氯-3-羥基-4-甲氧基-苯基)-3-羥基-丙基-部分的附接可能由Orfl7的縮合結(jié)構(gòu)域催化。此反應(yīng)由Orfl7催化與通常歸因于NRPS縮合結(jié)構(gòu)域的一般肽鍵形成活性一致。用于經(jīng)由醚鍵形成將3-(2-氯-3-羥基-4-甲氧基苯基)-3-羥基-丙基-部分的芳香環(huán)附接到烯二炔核心的機(jī)制尚不清楚，然而，其可能與C5-C6環(huán)氧化物的打開(kāi)同時(shí)發(fā)生及/或與編碼馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔生物合成簇中所含有的or/的一或多種P450或單加氧酶有關(guān)。經(jīng)由O-配糖鍵將馬杜拉胺部分與烯二炔核心偶合。or/29基因產(chǎn)物催化此轉(zhuǎn)移，已顯示o^29與多種參與天然產(chǎn)物生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶具有強(qiáng)序列相似性。Orf29與來(lái)自C-1027生物合成途徑的SgcA6最為相似(43%—致性，57%相似性)，已提出SgcA6催化C-1027烯二炔核心糖基化。(劉等人，2002)。最后，Orf20(I型NRPS縮合結(jié)構(gòu)域)以與非核糖體肽生物合成中的肽鍵形成類似的反應(yīng)將來(lái)自O(shè)rfl6的磷酸泛酰巰基乙胺臂的HDBA-部分轉(zhuǎn)移到馬杜拉胺的氨基上。使用此作為模型，所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)出產(chǎn)生馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)(尤其生色團(tuán)-b及生色團(tuán)-c)以及生色團(tuán)衍生物的許多其它合成方案。本發(fā)明提供包含馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)的生物合成組份的新穎生物合成途徑，其中一或多種組份已突變、或經(jīng)來(lái)自不同烯二炔生色團(tuán)生物合成途徑的組份取代或補(bǔ)充，由此產(chǎn)生馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)的變體。利用標(biāo)準(zhǔn)分子遺傳學(xué)技術(shù)，可將上文提供的各c^f或or/組合進(jìn)行處理以產(chǎn)生馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)及/或色蛋白的新穎生物活性類似物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，將新穎生色團(tuán)與馬杜拉放線菌屬21G792脫輔基蛋白共表達(dá)。在另一實(shí)施例中，將馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)與馬杜拉放線菌屬21G792脫輔基蛋白的變體共表達(dá)。在再一實(shí)施例中，將新穎生色團(tuán)與馬杜拉放線菌屬21G792脫輔基蛋白的變體共表達(dá)。在本發(fā)明實(shí)施例中，使馬杜拉放線菌屬21G792中的0^/5失活可產(chǎn)生缺少O-甲基的類似物，所述O-甲基通?？梢?jiàn)于分子的p-酪氨?；糠稚?。(參見(jiàn)，例如，圖10)此改變留下羥基而非O-甲基(參見(jiàn)下文R1)。提供羥基取代的一個(gè)原因是可使用其作為用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成化學(xué)技術(shù)對(duì)類似物實(shí)施進(jìn)一步化學(xué)衍生化的化學(xué)把手。同樣，32由編碼的鹵化酶失活防止與PCP結(jié)合的(3-酪氨酸氯化，結(jié)果Cl不存在于馬杜拉放線菌屬21G79類似物中(參見(jiàn)下文R2)。下文所示的RS基團(tuán)通常為CH3且可通過(guò)使o/^O產(chǎn)物失活將其改變成H，所述產(chǎn)物使dNDP-L-木糖的3-碳甲基化。馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)的W基團(tuán)是CH.(指定R5)，其中W在酰胺氮處與糖部分連接。導(dǎo)致產(chǎn)生缺少HDBA部分的烯二炔類似物的or"2失活(參見(jiàn)，例如，圖13、17)或失活導(dǎo)致R5由NH2取代。此外，可對(duì)R"部分實(shí)施修飾。例如，通過(guò)使w/l失活獲得(指定R6)。在另一實(shí)施例中，如上文使w/2失活，并使用突變體來(lái)產(chǎn)生馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔類似物文庫(kù)，其中HDBA部分經(jīng)其它芳酸代替。通過(guò)向o/^2突變體中加入存于發(fā)酵液中的多種天然方酸、N-乙?；腚装愤B接芳酸、或與諸如巰基乙酸甲33酯等其它硫酯載體連接的芳酸來(lái)引入芳酸。(參見(jiàn)，例如，雅克布森(Jacobsen)等人，(1997)科學(xué)277，367-9)?？墒古c向馬杜拉放線菌屬21G792分子復(fù)合物中添加組份有關(guān)的每一o"各自及與其它o;/組合經(jīng)突變以產(chǎn)生用于生物測(cè)試的馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔類似物的大文庫(kù)。因此，本發(fā)明提供具有下式的化合物.-其中Ri是OH或OCH3;R2是C1或H;R3是CH3或H;且R4選自NH2、R5、及R6。此外，通過(guò)在補(bǔ)充有特定天然方酸、N-乙酰基半胱胺連接芳酸、或與諸如巰基乙酸甲酯等其它硫酯載體連接的芳酸的發(fā)酵液中對(duì)or/32突變體進(jìn)行培養(yǎng)可產(chǎn)生烯二炔類似物，其中R4是其中R"是H、CH3、OH、OCH3、Cl、C3H7、或N02;112'是H、CH2、NH2、OH、F、OCH3、F、Cl、N02、OC2H5、或NC2H6;113'是H、CH3、Cl、CH3、NH2、OH、F、COH、OCH3、Cl、OC2H5、或N02;且r4'是OH或OCH3。在其它實(shí)施例中，可將來(lái)自不同二級(jí)代謝途徑的一或多種oz/引入到馬杜拉放線菌屬21G792中?？赏ㄟ^(guò)同源重組或通過(guò)位點(diǎn)特異性整合將選出的or/引入到宿主染色體中，所述位點(diǎn)特異性整合由(例如)噬菌體!'m/加P功能體(例如pSET152或類似載體)介導(dǎo)?；蛘?，可將選出的oW引入到自復(fù)制載體中。表達(dá)后，基因產(chǎn)物可繼續(xù)修飾馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)。例如，可將來(lái)自C-1027生物合成基因簇的紹cA、化o47、紹c42、"cA3、化cA4、化cA5及紹c46引入到一或多種馬杜拉胺生物合成o//已經(jīng)失活的馬杜拉放線菌屬21G792菌株中以產(chǎn)生包含C-1027脫氧氨基糖或其衍生物而非馬杜拉胺的馬杜拉放線菌屬21G792烯二炔類似物。本發(fā)明也提供將來(lái)自馬杜拉放線菌屬21G792的色蛋白生物合成簇的基因引入到其它產(chǎn)生二級(jí)代謝物的微生物中以對(duì)所述生物體產(chǎn)生的同種二級(jí)代謝物實(shí)施修飾。例如，通過(guò)提供表達(dá)所述生色團(tuán)生物合成途徑的宿主可產(chǎn)生不同烯二炔生色團(tuán)(例如，C-1027生色團(tuán))的類似物，且宿主中一或多種組份已經(jīng)由馬杜拉放線菌屬21G792的色蛋白生物合成途徑替代或補(bǔ)充。除制造馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白的類似物外，我們也可通過(guò)使負(fù)調(diào)節(jié)子失活以及通過(guò)增加表達(dá)水平或正調(diào)節(jié)子的基因復(fù)制數(shù)目來(lái)提高發(fā)酵效價(jià)。馬杜拉放線菌屬21G792生物合成簇含有至少八個(gè)o^(0《9、/0、46、50、52、55、62及d)，其基于與基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)數(shù)據(jù)庫(kù)中所含有序列同源識(shí)別為推定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子?？梢韵到y(tǒng)方式對(duì)這些調(diào)節(jié)子的功能進(jìn)行測(cè)試以確定哪些調(diào)節(jié)子是正調(diào)節(jié)子及哪些是負(fù)調(diào)節(jié)子。基于所述發(fā)現(xiàn)，我們可對(duì)一或多種這些基因進(jìn)行合理改變以提高馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白的發(fā)酵效價(jià)。一般來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生毒性二級(jí)代謝物的生物體具有一或多種賦予產(chǎn)生生物體自身抗性的基因。這些基因的產(chǎn)物通常通過(guò)化學(xué)修飾、隔絕或轉(zhuǎn)運(yùn)毒性代謝物賦予抗性。在一些情況下，代謝物的靶標(biāo)天生對(duì)代謝物不靈敏，或靶標(biāo)經(jīng)修飾以使其對(duì)代謝物不靈敏。馬杜拉放線菌屬21G792生物合成簇含有至少兩個(gè)基因產(chǎn)物可能與自身抗性有關(guān)的35or/。據(jù)推測(cè)，編碼馬杜拉放線菌屬21G792復(fù)合物的脫輔基蛋白組份的與隔絕活性生色團(tuán)由此遮蔽產(chǎn)生生物體的DNA以不被生色團(tuán)裂解有關(guān)。^y22基因產(chǎn)物編碼與許多跨膜流出蛋白相似的蛋白質(zhì)，且與來(lái)自C-1027生物合成途徑的SgcB最為相似，已提出SgcB在C-1027生色團(tuán)-脫輔基蛋白復(fù)合物中作為流出泵(劉等人，(2005)化學(xué)及生物學(xué)，293-302)。利用or/22及or/2丄我們可潛在地賦予馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白抗性。在一個(gè)實(shí)施例中，可將這些or/引入到經(jīng)選擇以異源方式表達(dá)馬杜拉放線菌屬21G792生物合成途徑的細(xì)胞中，由此使所述細(xì)胞產(chǎn)生大量馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白，同時(shí)對(duì)其毒性效應(yīng)具有免疫性。在另一實(shí)施例中，可將這些or/引入到經(jīng)選擇用于馬杜拉放線菌屬21G792生物轉(zhuǎn)化的供體細(xì)胞中。否則在生物轉(zhuǎn)化發(fā)生之前所述細(xì)胞可能被馬杜拉放線菌屬21G792的極度毒性殺死。全部馬杜拉放線菌屬21G792生物合成簇或所選部分可在諸如細(xì)菌等異源性宿主中表達(dá)?？捎眉?xì)菌的實(shí)例包括(例如)鏈霉菌屬、馬杜拉放線菌屬、野野村菌屬(Nonomurea)、小單孢菌屬、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、及假單胞菌屬等屬的成員。(參見(jiàn)，例如，菲佛等人，2001;馬丁內(nèi)斯等人，2004)生物合成簇也可在諸如酵母等真核宿主中以異源方式表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施例中，馬杜拉放線菌屬21G792生物合成簇較佳在己經(jīng)修飾以產(chǎn)生大量二級(jí)代謝物由此使得與使用馬杜拉放線菌屬21G792通常所達(dá)成的馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白產(chǎn)生量相比量增加的生物體中表達(dá)。(參見(jiàn)，例如，羅德里格斯(Rodriguez)等人，2003,工業(yè)微生物學(xué)及生物技術(shù)期刊(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)30，480-8)。在另一實(shí)施例中，馬杜拉放線菌屬21G792生物合成簇較佳在尤其易受遺傳操作影響的生物體中表達(dá)以加快馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白類似物產(chǎn)生。(參見(jiàn)，例如，賓特利(Bentley)等人，2002，自然(Nature)417，141-7;比尼(Binnie)等人，1997，生物技術(shù)動(dòng)向(TrendsBiotechnol.)15，315_20)。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員已知多種可用于轉(zhuǎn)移編碼全部或部分馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白生物合成途徑的重組DNA的方法?？衫枚喾N可用于在多種宿主中轉(zhuǎn)移及表達(dá)所述DNA的宿主質(zhì)粒(例如，鏈霉菌屬的plJlOl(基爾瑟(Kieser)等人'1982，分子及普通遺傳學(xué)185:223-8)、放線菌屬的pJRD215(楊(Yeung)等人，1994，細(xì)菌學(xué)雜志176:4173-6)。用于轉(zhuǎn)移所述載體的方法包括偶聯(lián)、電穿孔及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。也可使用能夠在大腸桿菌中復(fù)制并自大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移到諸如鏈霉菌屬等革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌物種的穿梭載體。(參見(jiàn)，例如，馬澤迪爾(Mazodier)等人，1989,細(xì)菌學(xué)雜志171:3583-5;基爾瑟等人，2000，實(shí)用鏈霉菌屬遺傳學(xué)(PracticalStreptomycesgenetics.)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。約翰英納斯基金會(huì)(JohnlnnesFoundation),諾維奇(Norwich)，大不列顛聯(lián)合王國(guó)(UnitedKingdom))。我們期望制備包含色蛋白的醫(yī)藥組合物，其中所述色蛋白包含本發(fā)明脫輔基蛋白與生色團(tuán)(優(yōu)選為由馬杜拉放線菌屬21G792產(chǎn)生的生色團(tuán))的復(fù)合物。優(yōu)選地，多肽經(jīng)由非共價(jià)鍵附接到生色團(tuán)上。通常來(lái)說(shuō)，制備醫(yī)藥組合物需要制備基本上不含致熱原以及可能對(duì)人類或動(dòng)物產(chǎn)生危害的任何其它雜質(zhì)的醫(yī)藥組合物。我們也期望使用36適當(dāng)緩沖劑來(lái)使復(fù)合物穩(wěn)定并使其被靶細(xì)胞攝取。本發(fā)明水性組合物包括有效量色蛋白，其進(jìn)一步分散于醫(yī)藥上可接受的載劑或水性介質(zhì)中。所述組合物也稱為接種物。視情況而定，短語(yǔ)"醫(yī)藥上或藥理學(xué)上可接受的"是指在投與給動(dòng)物或人類時(shí)不會(huì)產(chǎn)生有害、過(guò)敏性或其它不利反應(yīng)的組合物。本文所用的"醫(yī)藥上可接受的載劑"包括任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑及諸如此類。將所述介質(zhì)和藥劑用于醫(yī)藥上具有活性的物質(zhì)己為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知。除任何常用介質(zhì)或藥劑與所述色蛋白不相容的情況以外，本發(fā)明涵蓋所述介質(zhì)和藥劑在治療性組合物中的用途。也可將包括抗細(xì)菌劑或抗腫瘤劑在內(nèi)的補(bǔ)充性活性成份納入到組合物中。在本發(fā)明實(shí)施例中，本發(fā)明生色團(tuán)是通過(guò)(例如)胞飲作用被細(xì)胞吸收。在另一實(shí)施例中，對(duì)生色團(tuán)實(shí)施修飾以使其靶向于特定細(xì)胞或細(xì)胞類型。在一個(gè)所述實(shí)施例中，可使用單克隆抗體或其它蛋白質(zhì)性質(zhì)的載體作為尋耙單元將色蛋白以聚合物或偶聯(lián)物形式遞送到靶組織。已知多種基于聚合物的遞送系統(tǒng)及抗體偶聯(lián)物遞送系統(tǒng)且當(dāng)前已用于與天然存在C-1027烯二炔有關(guān)的化學(xué)療法策略中。在本發(fā)明中，色蛋白可經(jīng)(例如)化學(xué)修飾以形成可用作療法(尤其化學(xué)療法)的偶聯(lián)聚(苯乙烯-共-馬來(lái)酸)的色蛋白。(參見(jiàn)，例如，前田(MflWfl)及紺野(Konno)，1997，新制癌菌素抗癌癥藥物的過(guò)去、現(xiàn)在及將來(lái)(Neocarzinostatin:thePast,Present,andFutureofanAnticancerDrug),前田(H.Maeda)，江戶(K.Edo)，石田(N.Ishida)編輯，施普林格(Springer-Verlag)，紐約(NewYork)，第227-267頁(yè))。含有疏水性及親水性片段二者的聚合微膠粒是最近研制的以提高化學(xué)治療劑的治療指數(shù)的新型藥物遞送系統(tǒng)(橫山等人，1990，癌癥研究(CancerRes.)50:1693-700;卡巴諾夫(Kabanov)等人，1989，歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)(FEBSLett.)258:343-5)?？煽刂莆⒛z粒的尺寸以使微膠粒顆粒較正常組織更能透過(guò)腫瘤組織中的血管，此是提高滲透及潴留(EPF)效應(yīng)的緣故(前田，2001，酶調(diào)節(jié)進(jìn)展(AdvEnzymeRegul.)41:189-207)。此有利于藥物在腫瘤組織中分布且因此預(yù)期會(huì)提高活體內(nèi)功效?？赏ㄟ^(guò)與嵌段共聚物溶液混合將21G792色蛋白以非共價(jià)方式納入到經(jīng)專門(mén)設(shè)計(jì)的微膠粒中。所得藥物的代謝穩(wěn)定性可顯著提高(橫山等人，1991，癌癥研究(CancerRes.)51:3229-36)，此潛在地有利于在癌癥化學(xué)療法中遞送21G792色蛋白?？赏ㄟ^(guò)使用化學(xué)交聯(lián)劑或其它有關(guān)方法使色蛋白(即，脫輔基蛋白或生色團(tuán))與蛋白質(zhì)偶聯(lián)以遞送到細(xì)胞或病原體。已使21G792色蛋白中的生色團(tuán)與疊氮化鈉及仲胺反應(yīng)以得到一系列衍生物。此等衍生物在C-5上含有疊氮或仲氨基以代替天然生色團(tuán)中的羥基?？衫迷谝粋€(gè)末端具有氨基且另一末端具有羧基的交聯(lián)劑來(lái)連接單克隆抗體及生色團(tuán)以形成用于靶向藥物遞送的生色團(tuán)-抗體偶聯(lián)物。擬代替C-5羥基的交聯(lián)劑的氨基經(jīng)設(shè)計(jì)以使所述偶聯(lián)物可在腫瘤組織中于更酸性條件下水解回生色團(tuán)。實(shí)例性連接繪示于圖30中。另外，可使色蛋白與單克隆抗體偶聯(lián)以形成單克隆抗體(MAb)-色蛋白偶聯(lián)物。對(duì)抗原具有高親和性、優(yōu)選對(duì)惡性細(xì)胞表面上的抗原決定簇具有特異性的抗體是耙向部分的自然選擇。預(yù)期色蛋白到腫瘤細(xì)胞的抗體介導(dǎo)的特異性遞送不僅提高其抗腫瘤功效，而且也防止由正常組織非靶向攝取，由此提高其治療指數(shù)。可用于本發(fā)明的所述抗體載體的實(shí)例包括單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、其生物活性片段及其基因或酶促工程對(duì)應(yīng)物。優(yōu)選地，在諸如癌癥等增生性病癥中，所述抗體對(duì)準(zhǔn)在靶細(xì)胞及/或組織上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原?？?CD33單克隆抗體是用于此方法的有用Mab的例證且可在多種背景下實(shí)現(xiàn)色蛋白到癌組織的靶向，包括在患有急性髓樣白血病的患者中。(參見(jiàn)，例如，西弗斯(Sievers)等人，1999,血液(Blood)93，3678-84)可用單克隆抗體偶聯(lián)物的另一實(shí)例闡述于PCT公開(kāi)案第WO03/029623號(hào)中，其中，例如，抗-CD22單克隆蛋白與烯二炔偶聯(lián)以靶向遞送到B-淋巴細(xì)胞。如先前所述，數(shù)種MAb-C-1027偶聯(lián)物作為有希望的抗癌藥物正在評(píng)估中。(布魯克納(Brukner),2000,腫瘤學(xué)新觀點(diǎn)(Curr.OpinionOncologic),內(nèi)分泌及藥物代謝研究(Endocrine&Met.Invest.Drugs)2，344)。除抗體載體外，其它蛋白質(zhì)性質(zhì)的載體包括激素、生長(zhǎng)因子、抗體模擬物、及其基因或酶促工程對(duì)應(yīng)物，其在下文中很少提及或以"載體"群組提及。載體的本質(zhì)特性是其識(shí)別與不期望細(xì)胞有關(guān)的抗原或受體并與其結(jié)合并隨后被內(nèi)在化的能力。可應(yīng)用于本發(fā)明中的載體的實(shí)例揭示于美國(guó)專利第5,053,394號(hào)及第5,773,001號(hào)中，其全文并入本文中。可用于本發(fā)明的優(yōu)選載體是抗體及抗體模擬物。多種非免疫球蛋白蛋白支架己用于產(chǎn)生與具有抗體特異性的抗原表位結(jié)合的抗體模擬物(PCT公開(kāi)案第WO00/34784號(hào))。例如，"微抗體"支架與免疫球蛋白折疊有關(guān)，已通過(guò)從單克隆抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域中刪去三股P鏈對(duì)其實(shí)施設(shè)計(jì)(特拉蒙塔諾等人，1994,分子識(shí)別期刊(J.Mol.Recognit.)7:9-24)。此蛋白包括61個(gè)殘基且可用于提供兩個(gè)高變環(huán)。使此兩個(gè)環(huán)隨機(jī)化并針對(duì)抗原結(jié)合實(shí)施產(chǎn)物選擇，但由于溶解性問(wèn)題迄今此框架的功用似乎有點(diǎn)受限。用于展示環(huán)的另一框架是淀粉酶抑肽，此蛋白質(zhì)特異性抑制哺乳動(dòng)物(x-淀粉酶且為通過(guò)兩個(gè)二硫鍵結(jié)合在一起的74殘基六鏈(3-折疊三明治結(jié)構(gòu)(麥康奈爾(McConnell)及胡斯(Hoess)，1995，分子生物學(xué)期刊(J.Mol.Biol.)250:460-70)。此支架包括三個(gè)環(huán)，但迄今這些環(huán)中僅兩個(gè)環(huán)已實(shí)施隨機(jī)化潛力檢査。其它蛋白質(zhì)已經(jīng)測(cè)試作為框架且已用于展示a螺旋表面上的隨機(jī)化殘基(諾德等人，1997，天然生物技術(shù)(Nat.Biotechnol.)15，772-7;諾德等人，1995，蛋白質(zhì)工程(ProteinEng.)8，601-8)、介于a螺旋束中的a螺旋之間的環(huán)(顧(Ku)及舒爾茨(Schultz)，1995，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院干iJ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92，6552-6)、及受二硫鍵束縛的環(huán)，例如小蛋白酶抑制劑上的環(huán)(馬克蘭德(Markland)等人，1996,生物化學(xué)(Biochemistry)35，8045-57;馬克蘭德等人，1996,生物化學(xué)35，8058-67;勒特根(Rottgen)及柯林斯(Collins)，1995，基因(Gene)164，243-50;王(Wang)等人，1995，生物化學(xué)期刊(J.Biol.Chem.)270，12250-6)?？赏ㄟ^(guò)化學(xué)交聯(lián)或借助諸如應(yīng)用重組DNA技術(shù)等基因融合使靶向分子與色蛋白共價(jià)結(jié)合。在后一種方法中，可使脫輔基蛋白的C-末端或N-末端與細(xì)胞耙向蛋白質(zhì)分子的N-末端或C-末端融合。當(dāng)細(xì)胞靶向分子是抗體時(shí)，脫輔基蛋白的N-末端優(yōu)選與抗體輕鏈及/或重鏈的c-末端融合。對(duì)于化學(xué)交聯(lián)，一些常見(jiàn)蛋白質(zhì)-抗體交聯(lián)劑是琥珀酸酯及其它二羧酸、戊二醛及其它二醛。其它所述交聯(lián)劑已為所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知。治療性組合物溶液可在適宜與表面活性劑(例如，羥丙基纖維素)混合的水中制備。分散液也可在甘油、液體聚乙二醇、其混合物及油中制備。在普通儲(chǔ)存及使用條件下，此等制劑含有防腐劑以防止微生物生長(zhǎng)。本發(fā)明治療性組合物較佳以呈液體溶液或懸浮液形式的可注射組合物形式投與；也可制備適于在注射之前存于液體中形成溶液或懸浮液的固體形式。也可對(duì)所述制劑實(shí)施乳化。用于所述目的的典型組合物包含醫(yī)藥上可接受的載劑。例如，所述組合物可含有10mg、25mg、50mg或至多約100mg人類血清白蛋白/毫升磷酸鹽緩沖鹽水。其它醫(yī)藥上可接受的載劑包括水性溶液、無(wú)毒性賦形劑，包括鹽、防腐劑、緩沖劑及諸如此類。非水性溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油及可注射有機(jī)酯(例如油酸乙酯)。水性載劑包括水、醇性/水性溶液、鹽水溶液、諸如氯化鈉等非經(jīng)腸媒劑、林格氏(Ringer's)右旋糖等。靜脈內(nèi)媒劑包括流體及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體。按照熟知參數(shù)對(duì)醫(yī)藥組合物的各種組份的pH值及準(zhǔn)確濃度實(shí)施調(diào)節(jié)。其它調(diào)配物也適于經(jīng)口投與。經(jīng)口調(diào)配物包括諸如醫(yī)藥級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂及諸如此類等典型賦形劑。所述組合物可釆取溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋調(diào)配物或粉劑形式。當(dāng)途徑是局部途徑時(shí)，可呈乳霜、軟膏、油膏或噴霧劑形式。本發(fā)明治療性組合物可包括經(jīng)典醫(yī)藥制劑。本發(fā)明治療性組合物的投與可經(jīng)由任何常見(jiàn)途徑達(dá)成，只要可經(jīng)由此途徑達(dá)到靶組織即可。此途徑包括經(jīng)口、鼻、口腔、直腸、陰道、或局部投與。局部投與尤其有利于治療皮膚癌以防止化學(xué)療法引起的脫發(fā)或其它真皮過(guò)增生性病癥。或者，可通過(guò)正位、真皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜腔內(nèi)或靜脈注射進(jìn)行投與。所述組合物通常以包括生理學(xué)上可接受的載劑、緩沖劑或其它賦形劑的醫(yī)藥上可接受的組合物形式投與。對(duì)于治療肺部病狀來(lái)說(shuō)，優(yōu)選途徑是以氣溶膠遞送到肺中。氣溶膠的體積介于約0.01ml與0.5ml之間。同樣，對(duì)于治療結(jié)腸有關(guān)疾病來(lái)說(shuō)，優(yōu)選方法是經(jīng)由灌腸劑。灌腸劑的體積介于約1ml與100ml之間?；陬A(yù)定目標(biāo)來(lái)確定治療性組合物的有效量。術(shù)語(yǔ)"單位劑量"或"劑量"是指適用于個(gè)體的物理分散單元，每一單元含有經(jīng)計(jì)算可與其投與(即，適當(dāng)途徑及治療方案)一起產(chǎn)生上文所述期望反應(yīng)的預(yù)定量治療性組合物。擬投與的量(根據(jù)治療次數(shù)及單位劑量來(lái)說(shuō))視所期望的保護(hù)而定。治療性組合物的準(zhǔn)確量也取決于執(zhí)業(yè)醫(yī)師的判斷且為各個(gè)體所特有。影響劑量的39因素包括患者的身體及臨床狀態(tài)、投與途徑、治療的預(yù)期目標(biāo)(癥狀減輕對(duì)治愈)及特定治療性物質(zhì)的效能、穩(wěn)定性及毒性。在本申請(qǐng)案全文中，參考了多個(gè)公開(kāi)案，其以名稱或數(shù)字方式置于圓括號(hào)中。這些公開(kāi)案的全部揭示內(nèi)容皆以引用方式并入本申請(qǐng)案中以更完整地闡述本發(fā)明所涉及技術(shù)的發(fā)展水平。實(shí)例應(yīng)了解并預(yù)料到，所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可對(duì)本發(fā)明原理實(shí)施改變且所述修改意欲包括于本發(fā)明范圍內(nèi)。闡述以下本發(fā)明實(shí)例以進(jìn)一步闡釋本發(fā)明且不應(yīng)理解為以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)例1色蛋白及脫輔基蛋白的分離及定性實(shí)例1-種子培養(yǎng)馬杜拉放線菌屬21G792以自在ATCC培養(yǎng)基172中培育72小時(shí)的細(xì)胞制備的冷凍全細(xì)胞(冷凍營(yíng)養(yǎng)菌絲體，F(xiàn)VM)形式保存(右旋糖1%、可溶性淀粉2%、酵母提取物0.5%、及N-Z胺A型0.5呢、CaCO30.1%pH7.3)。添加甘油至20%并將細(xì)胞在-150。C下冷凍。制備pH值為6.9的含有以下的種子培養(yǎng)基1.0%右旋糖、2.0%可溶性淀粉、0.5%酵母提取物、0.5%N-Z胺A型(謝菲爾德(Sheffield))、及0.1%CaC03。在25mmx150mm玻璃培養(yǎng)管中，用在ATCC瓊脂培養(yǎng)基#172(ATCC培養(yǎng)基手冊(cè)，第1版，1984)中培養(yǎng)的馬杜拉放線菌屬21G792細(xì)胞來(lái)接種7ml種子培養(yǎng)基及兩種玻璃珠粒。在培育72小時(shí)后使用來(lái)自瓊脂培養(yǎng)物的足量接種物來(lái)提供混雜種子。將初級(jí)種子管在28°C、250rpm下使用偏心距離為2英寸的陀螺旋轉(zhuǎn)搖瓶培育72小時(shí)。隨后使用初級(jí)種子(約14%接種物)來(lái)接種含有50ml培養(yǎng)基#172的250ml埃倫邁爾燒瓶(Erlenmeyerflask)。將這些二級(jí)種子燒瓶在28。C、250卬m下使用陀螺旋轉(zhuǎn)搖瓶(2"偏心距離)培育48小時(shí)。實(shí)例2實(shí)例2-發(fā)酵制備pH值為6.9的含有以下的發(fā)酵物產(chǎn)生培養(yǎng)基2.0%蔗糖、0.5%糖蜜、0.5%CaC03、0.2%蛋白胨、0.002%硫酸鎂-71120、0.001%硫酸亞鐵-71120、0.05%溴化鈉、及0.2%乙酸鈉。使六十個(gè)250ml埃倫邁爾燒瓶的每一個(gè)具有50ml發(fā)酵物產(chǎn)生培養(yǎng)基并用2ml(4.0呢)二級(jí)種子發(fā)酵物接種并在28。C、250rpm下使用陀螺旋轉(zhuǎn)搖瓶(2"偏心距離)進(jìn)行培育。隨后使所述發(fā)酵繼續(xù)進(jìn)行約72至96小時(shí)并收獲以用于進(jìn)一步處理。將組合全發(fā)酵液(60x50ml)在3800rpm下離心30分鐘。隨后將上清液凍干并將殘留粉末懸浮于少量體積(例如，300ml)H20中。離心后，隨后在4'C下于黑暗中將褐色溶液裝載到含有存于H20中的6L葡聚糖凝膠G75的玻璃柱上。所收集流份均40為40ml并在生物化學(xué)誘導(dǎo)分析(BIA)中予以測(cè)試。隨后合并最具效能的流份(15份，總共600ml)并凍干。隨后將淺灰色粉末溶解于H20(4ml)中并通過(guò)HPLC分析含有兩種主要峰，一種峰對(duì)應(yīng)于脫輔基蛋白且另一種峰對(duì)應(yīng)于色蛋白。使上文溶液在具有流速為4ml/min的緩沖系統(tǒng)(0-0.5M線性梯度NaCl加0.05MTris-HCl，30min)的東曹哈斯(TosoHaas)DEAE5PW柱(13nm粒徑，尺寸為21.5mmxl5cm)上經(jīng)受制備型HPLC色譜法。采集脫輔基蛋白與色蛋白的各自峰，用皮爾斯透析卡(PierceDialysisCassette)(7000MWCO)脫鹽，并凍干。隨后借助相同制備型HPLC條件再次純化所得脫輔基蛋白及色蛋白粉末、脫鹽并凍干。通過(guò)分析型HPLC來(lái)分析色蛋白(淺灰色粉末，10.5mg)及脫輔基蛋白(白色粉末，19.8mg)的最終產(chǎn)物(分別為圖1及3)。色蛋白及脫輔基蛋白的紫外吸收(UV)光譜顯示于圖2及4中。經(jīng)MALDI-MS測(cè)定脫輔基蛋白的分子量為12.92409kDa。MALDI譜顯示于圖5中。實(shí)例3實(shí)例3-接種物使用以下組份來(lái)制備1公升用于試驗(yàn)規(guī)模發(fā)酵的無(wú)菌接種物培養(yǎng)基5.0g/L植物蛋白胨(BBL)、5.0g/L酵母提取物(細(xì)菌用(Bacto))、40g/L可溶性淀粉、20g/L葡萄糖、1.28g/L七水硫酸鎂、0.025MMOPS。在將約1mL種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到無(wú)菌燒瓶中之后，將其置于搖瓶上并在30。C及200rpm下培育。在培育48至72小時(shí)后將燒瓶的全部所含物以無(wú)菌方式轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中。實(shí)例4實(shí)例4-試驗(yàn)規(guī)模發(fā)酵使用馬杜拉放線菌屬菌株21G792作為產(chǎn)生微生物在100L試驗(yàn)型發(fā)酵罐中實(shí)施色蛋白發(fā)酵。用至多65L純凈水制備以下培養(yǎng)基葡萄糖單水合物，2.75g/L;七水硫酸亞鐵，0.01g/L;七水硫酸鎂，0.02g/L;碳酸鈣(密西西比TMLime)，2.0g/L;馬可馬頓J-1，4.0g/L;三水乙酸鈉，2g/L;碘化鉀，0.5g/L;普朗尼克L-61，0.5g/L。用硫酸將培養(yǎng)基溶液的pH值調(diào)節(jié)至7.0。隨后對(duì)培養(yǎng)基實(shí)施滅菌并冷卻至發(fā)酵溫度，然后將額外量的葡萄糖單水合物(約6g/L)及l(fā)公升接種物轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中。將發(fā)酵溫度控制在合適值(30。C)上以支持細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)生并在合適攪動(dòng)、壓力、及通風(fēng)下實(shí)施以使溶解氧保持在飽和值的20%以上。在此實(shí)例中，控制在250rpm、5psig、及301pm下發(fā)酵。在第4天收獲批料。收獲時(shí)色蛋白的濃度為152mg/L。通過(guò)在容納1L離心瓶的離心機(jī)中離心使所收獲的醪液澄清。所用離心條件是7000rpm、2(TC、及每循環(huán)20分鐘。收集上清液以用于進(jìn)一步產(chǎn)物回收。實(shí)例5實(shí)例5-試驗(yàn)規(guī)模發(fā)酵在以下培養(yǎng)基中實(shí)施使用馬杜拉放線菌屬菌株21G792的色蛋白發(fā)酵葡萄糖單41水合物，8.75g/L;七水硫酸亞鐵，0.01g/L;七水硫酸鎂，0.02g/L;碳酸l^(密西西比TMLime)，2.0g/L;馬可馬頓J-1，4.0g/L;三水乙酸鈉'2g/L;溴化鈉，0.5g/L;普朗尼克L-61，0.5g/L。在第70小時(shí)收獲批料且產(chǎn)生約60mg/L色蛋白。實(shí)例6實(shí)例6-色蛋白分析此分析方法使色蛋白與發(fā)酵液的UV吸收組份分開(kāi)并解析成色蛋白及脫輔基蛋白形式。儀器是裝備有2996PDA檢測(cè)器、千年(Millennium)色譜控制及分析軟件的沃特斯聯(lián)盟2695(WatersAlliance2695)。柱是由東曹(TOSOH)生物科學(xué)或色譜科(SUPELCO)提供的TSK苯基5PW(10pm直徑顆粒，7.5x75mm)。流動(dòng)相為A:1.5M硫酸銨、20mMTrispH7.8-8.3，B:20mMTris100mMNaClpH7.8-8.3。運(yùn)行時(shí)間為30min，流速為lmL/min。在230nm處檢測(cè)，收集200-400nm范圍的譜，帶寬為4.8nm。梯度洗脫規(guī)劃如下0-3min保持100%A、3-23min線性變化到100%B、23-24線性變化到100%A、24-30保持100%A。注射體積為100(aL或更小。除0.45pm過(guò)濾外，過(guò)程中的樣品不實(shí)施進(jìn)一步凈化而應(yīng)用。通過(guò)與參考標(biāo)準(zhǔn)物保留時(shí)間及譜進(jìn)行比較識(shí)別色蛋白及脫輔基蛋白峰。色蛋白的典型保留時(shí)間為18min且脫輔基蛋白的典型保留時(shí)間為20min。如下實(shí)施完整色蛋白峰的定量mg/mL色蛋白=稀釋系數(shù)(Dilfactor)*(組份面積j^V*secx7.55xl0—6ng/pV*sec)/注射體積(pl)實(shí)例7實(shí)例7-色蛋白分析此分析方法基于分子尺寸使色蛋白與發(fā)酵液的其它UV吸收組份及其它雜質(zhì)蛋白質(zhì)分開(kāi)。色蛋白與脫輔基蛋白形成共洗脫物。儀器是具有2996PDA檢測(cè)器及千年(Millennium)色譜控制及分析軟件的沃特斯聯(lián)盟2695(WatersAlliance2695)。柱是由巴拉德(BioRad)提供的生物硅SEC125(BioSilSEC125)，7.8x300mm。流動(dòng)相是A:20mMTris100mMNaClpH7.8-8.3。在230nm處檢測(cè)，在200-400nm范圍收集譜，帶寬為4.8nm。運(yùn)行時(shí)間為20min，流速為1mL/min。洗脫為等度洗脫。注射體積為100pL或更小。除0.45pm過(guò)濾外，過(guò)程中的樣品不實(shí)施進(jìn)一步凈化而應(yīng)用。通過(guò)與參考標(biāo)準(zhǔn)物保留時(shí)間及譜進(jìn)行比較識(shí)別色蛋白峰。色蛋白的典型保留時(shí)間是7.8min。如下實(shí)施完整色蛋白峰的定量mg/mL色蛋白=稀釋系數(shù)*(組份面積^V*secx7.55x10-6ng/^V*sec)/注射體積(nl)實(shí)例8實(shí)例8-生物化學(xué)誘導(dǎo)分析生物化學(xué)誘導(dǎo)分析識(shí)別在大腸桿菌BR513-80中誘導(dǎo)SOS反應(yīng)的DNA損傷劑。BR513-80含有XPL啟動(dòng)子與tocZ基因的轉(zhuǎn)譯融合物。在暴露于DNA損傷劑后作為SOS反應(yīng)的一部分被激活的人PL啟動(dòng)子促使卩-半乳糖苷酶合成。通過(guò)使與固藍(lán)RR鹽反應(yīng)產(chǎn)生紅/紫色的6-溴-2-萘基-(3-D-吡喃半乳糖苷(BNG)裂解來(lái)檢測(cè)(3-半乳糖苷酶活性。使用LBE(細(xì)菌用胰蛋白胨(BactoTryptone)10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、1MTris堿5mL/L)或含有15g/L瓊脂、0.2%葡萄糖及經(jīng)1/125稀釋的"E"溶液的等效物來(lái)制備固體培養(yǎng)基的基底層。("E"溶液含有5g七水硫酸鎂、50g擰檬酸單水合物、250g磷酸氫二鉀、及87.5g磷酸銨鈉，按照順序?qū)⑵湎♂尩?L去離子H20中)每塊丹麥能肯(Nunc)生物分析板使用約170ml基底層培養(yǎng)基或每150mm陪替氏培養(yǎng)皿(petridish)使用約50mL基底層培養(yǎng)基。將BR513-80過(guò)夜培養(yǎng)物以1:20稀釋于LBE發(fā)酵液或等效物中，并在600nm處測(cè)量經(jīng)稀釋培養(yǎng)物的吸光度。計(jì)算未經(jīng)稀釋培養(yǎng)物的吸光度，并用此值除5.7以獲得培養(yǎng)物體積(以mL計(jì))以用作接種物/40mL軟瓊脂。一般來(lái)說(shuō)，此體積為約0.9-1.3mL。將所計(jì)算的培養(yǎng)物體積在軟瓊脂中打旋，均勻傾倒在基底層上(每塊丹麥能肯生物分析板40ml或每150mm陪替氏培養(yǎng)皿20mL)，并使其固化至少10-15分鐘。將所分析的樣品及標(biāo)準(zhǔn)物以10pL分液直接施加到軟瓊脂上覆層的表面上?？捎脴?biāo)準(zhǔn)物包括10、5、2.5、及0.31pg/mL的博來(lái)霉素、及1000、100、10、1及O.lng/mL的卡奇霉素Y'i。將分析板在約37'C下培育約3h以誘導(dǎo)SOS反應(yīng)。通過(guò)將87mg固藍(lán)RR鹽及13mgBNG溶解于2mLDMSO中并與40mL熔化的1%軟瓊脂混合制備染料/底物上覆層。在培育階段后，將40mL染料/底物混合物(20mL用于150mm表面皿)均勻傾倒在BIA板的表面上，并使其固化。在于室溫下15-20分鐘后或在約37'C下10min后評(píng)分誘導(dǎo)反應(yīng)。以下例示評(píng)分等級(jí)20-25mm紅/紫誘導(dǎo)區(qū)，有或無(wú)透明中心區(qū)域；3+圓形15-20mm紅/紫誘導(dǎo)區(qū)，有或無(wú)透明中心區(qū)域；2+圓形10-15mm紅/紫誘導(dǎo)區(qū)，有或無(wú)透明中心區(qū)域；7+淡紅色區(qū)，有或無(wú)透明中心區(qū)域；+/-小泛紅區(qū)，有或無(wú)透明中心區(qū)域；r毒性區(qū)(透明區(qū)域，其中細(xì)菌已殺死或無(wú)顏色改變)；AW無(wú)紅/紫誘導(dǎo)區(qū)；無(wú)透明毒性區(qū)。實(shí)例9實(shí)例9-色蛋白純化此實(shí)例提供用于分離約90%純凈8"活性色蛋白的規(guī)?？勺兗兓椒?。通過(guò)505-凝膠電泳遷移率、UV光譜及HPLC保留時(shí)間使用尺寸排除及疏水作用分析柱二者對(duì)通過(guò)此方法分離的化合物進(jìn)行分析。未針對(duì)色蛋白產(chǎn)生對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。使用由DEAE瓊脂糖凝膠FF離子交換色譜法、苯基瓊脂糖凝膠HP疏水作用色譜法及超級(jí)葡聚糖75尺寸排除色譜法組成的規(guī)?？勺?-步驟程序來(lái)純化來(lái)自350ml澄清發(fā)酵液的色蛋白。步驟產(chǎn)率分別為約61%、69%及82%，導(dǎo)致約90%純凈的色蛋白的總過(guò)程回收率為30%，其余材料為無(wú)活性脫輔基蛋白。DEAE瓊脂糖凝膠FF陰離子交換色譜法-通過(guò)將7mL1MTrispH8.3添加到350mL澄清發(fā)酵液中制備色譜裝載。隨后將裝載施加到用流速為10mL/min的5柱體積43(CV)20mMTrispH8.3平衡的5mL哈特拉(HiTrap)DEAE瓊脂糖凝膠FF柱中。在230、280及310nm處檢測(cè)吸光度。收集單一流份的柱流出物。用20mMTrispH8.3洗漆柱直至吸光度達(dá)到基線。通過(guò)使在10CV流份中流動(dòng)相變到0.25MNaCl,20mMTrispH8.3來(lái)洗脫色蛋白物質(zhì)(以2CV的5種流份收集；參見(jiàn)表6，流份D1-D5)。使用1MNaCl，20mMTrispH8.3洗滌柱實(shí)施第二洗脫步驟。圖18顯示洗脫特性曲線。苯基瓊脂糖凝膠HP色譜法-通過(guò)將10.6g硫酸銨添加到47.5mL來(lái)自第一步驟的保存的洗脫物中以使硫酸銨濃度為1.5M來(lái)制備色譜裝載。經(jīng)計(jì)算裝載體積(在添加硫酸銨后)為53.7ml。在添加硫酸銨后使用1mL1MTrispH8.3將裝載的pH值自7.8升到8.06。借助0.45jam尼龍注射器式過(guò)濾器(直徑為2.3cm)容易地對(duì)澄清褐色溶液實(shí)施過(guò)濾并以5mL/min將52.7mL施加到5mL哈特拉(HiTrap)苯基瓊脂糖凝膠HP柱上。所述柱先前已用5CV1.5M硫酸銨，20mMTrispH8.2平衡。在230、280及310nm處檢測(cè)吸光度。在20CV線性梯度洗脫到100mMNaCl，20mMTrispH8.2時(shí)發(fā)生色蛋白與脫輔基蛋白的分離。在整個(gè)梯度期間收集單一CV流份并將通過(guò)UV吸光度選擇為色蛋白峰的兩種流份匯集(在表6中表示為P9-P10)。色蛋白在脫輔基蛋白之前洗脫出來(lái)且兩個(gè)峰間隔2CV。圖19顯示洗脫特性曲線。超級(jí)葡聚糖75色譜法-將硫酸銨添加到9.5ml苯基瓊脂糖凝膠池中以達(dá)到80%濃度(560g固體/L苯基瓊脂糖凝膠池)。將添加硫酸銨后所形成的沉淀俘獲于直徑為1英寸的0.45nm尼龍注射器式過(guò)濾器上并通過(guò)用1mL20mMTris，100mMNaClpH8.2反復(fù)萃取固體來(lái)回收。將0.8mL萃取物部分施加到已用2CV40mMTris200mMNaCl平衡的超級(jí)葡聚糖75柱上并用1mL所收集流份在1.5CV中洗脫。在0.5mL/min流速下在230、280及310nm處檢測(cè)吸光度。色蛋白池(3ml)選擇為表示為表6中S6-S8的三種流份。圖20顯示洗脫特性曲線。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表7色蛋白的過(guò)程中回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>對(duì)過(guò)程中取樣的回收率實(shí)施校正。使用超級(jí)葡聚糖流份S6、S7及S8的池計(jì)算總產(chǎn)率。每一純化步驟中及總過(guò)程的所回收色蛋白的量顯示于表7中。通過(guò)兩種HPLC技術(shù)(苯基5PW及生物硅SEC125(BioSilSEC125))在流份S6上分析最終純度(圖20)。含有10%脫輔基蛋白的色蛋白制劑的結(jié)果顯示于圖21及22中。也通過(guò)考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE證實(shí)每一階段的純度。(圖23及24)。對(duì)于最終池觀察到單條帶(圖24，泳道3)。實(shí)例10實(shí)例10-生色團(tuán)物質(zhì)的分離及結(jié)構(gòu)說(shuō)明。制備含有鹵化物的馬杜拉放線菌屬21G792的發(fā)酵培養(yǎng)物。通過(guò)依序應(yīng)用DEAE瓊脂糖凝膠FF、苯基瓊脂糖凝膠FF、及超級(jí)葡聚糖75色譜柱并自其收集活性流份來(lái)自澄清發(fā)酵液獲得色蛋白。在苯基瓊脂糖凝膠步驟期間使用由1.5M硫酸銨及經(jīng)安排的終止于O.lMNaCl的20CV梯度構(gòu)成的結(jié)合緩沖劑來(lái)將色蛋白分成活性流份峰A及B及無(wú)活性脫輔基蛋白峰(圖25)。在色譜法中識(shí)別出三種峰(圖25)并匯集對(duì)應(yīng)于每種峰的流份。通過(guò)反相色譜法使用杰普特(Jupiter)C4300A4.6x250mm柱(菲羅門(mén)(Phenomenex))來(lái)分析存在于每一種流份中的烯二炔生色團(tuán)。此方法依賴于使用乙腈有機(jī)改性劑自色蛋白溶液的脫輔基蛋白載體組份在線萃取烯二炔(圖26)。峰A產(chǎn)生兩種生色團(tuán)物質(zhì)(生色團(tuán)-c及生色團(tuán)-d)，而峰B產(chǎn)生單一生色團(tuán)物質(zhì)(生色團(tuán)-b)。分離出所有三種生色團(tuán)物質(zhì)并收集其HRMS及NMR數(shù)據(jù)。所提出的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步通過(guò)高分辨率MS/MS碎片數(shù)據(jù)加以證實(shí)。(圖6)。生色團(tuán)-c及-d是由雙自由基環(huán)芳構(gòu)化隨后質(zhì)子化及脫水(失去水)而產(chǎn)生的生色團(tuán)-b的潛在降解產(chǎn)物。為證實(shí)生色團(tuán)-c及-d不是分離期間產(chǎn)生的人造物，也對(duì)粗活性流份混合物實(shí)施LC-NMR。來(lái)自LC-NMR的NMR數(shù)據(jù)與所提出的結(jié)構(gòu)符合。實(shí)例11馬杜拉放線菌屬21G792基因簇實(shí)例11-馬杜拉放線菌屬21G792脫輔基蛋白的DNA分離及測(cè)序?；趯?duì)闡述于霍普伍德(Hopwood)等人，(1985)，鏈霉菌屬的遺傳操作(Ge""/cmam'戸to!'o似o/^wptomycw.).實(shí)驗(yàn)室手冊(cè).諾維奇約翰英納斯基金會(huì)中的程序進(jìn)行改進(jìn)自馬杜拉放線菌屬21G792中分離出基因組DNA。將約1ml冷凍菌絲體甘油原液接種到含有10mlMYM培養(yǎng)基(4g/l麥芽糖、4g/l酵母提取物、10g/l麥芽提取物、pH7.0)及2-6mm玻璃珠粒的25mmx150mm種子管中。使培養(yǎng)物在28。C及200卬m下生長(zhǎng)5天。隨后通過(guò)在3000xg下離心10min將細(xì)胞制成團(tuán)粒。棄除上清液并將團(tuán)粒懸浮于300pl含有5mg/ml溶菌酶及0.1mg/ml核糖核酸酶的T5(rE2C)(Tris50mM-EDTA-20mM)中并在37。C下同時(shí)每隔15min輕輕加以混合培育1hr。隨后添加50|al10%SDS并使樣品充分混合。然后，添加85pl5mMNaCI并再次充分混合樣品。隨后用400nl苯酚/氯仿/異戊醇(50/49/l)萃取樣品。在使樣品充分形成漩渦后，在室溫下于10,000xg下離心20min。在離心后，移除水性相并將其置于新微量離心管中。向樣品中添加等體積室溫異丙醇并通過(guò)顛倒充分混合。使樣品在室溫下靜置5min。隨后在4。C下于12,000xg下離心30min。小心地傾倒出管中的異丙醇并用1ml冷70%乙醇沖洗DNA團(tuán)粒。在于冰中靜置5min后，傾倒出管中的70%乙醇并將DNA空氣干燥IO分鐘。將DNA溶解于0.3ml無(wú)菌水中。通過(guò)瓊脂糖凝膠凝膠電泳來(lái)評(píng)價(jià)DNA的完整性及濃度。X"^^/f朦，質(zhì)粒及小規(guī)模粘粒DNA制備使用質(zhì)粒少量制備試劑盒(QiaprepSpinMiniPrepKit)(凱杰(Qiagen)公司，瓦倫西亞(Valencia)，加利福尼亞州(CA)，美國(guó))按照制造商說(shuō)明書(shū)來(lái)實(shí)施質(zhì)粒DNA及小規(guī)模粘粒DNA的制備。粘粒使用凱杰大構(gòu)建試劑盒(QiagenLargeConstructKit)(凱杰公司，瓦倫西亞，加利福尼亞州，美國(guó))按照制造商說(shuō)明書(shū)來(lái)分離粘粒DNA。使用pWEB粘粒克隆試劑盒(震中技術(shù)公司(EpicentreTechnologies),麥迪遜46(Madison),威斯康星州(WI)，美國(guó))按照制造商說(shuō)明書(shū)來(lái)構(gòu)建馬杜拉放線菌屬21G792基因組文庫(kù)。大致文庫(kù)構(gòu)建方案如下。通過(guò)使基因組DNA通過(guò)漢密爾頓(Hamilton)HPLC/GC注射器將10昭基因組DNA隨意剪切成30-45kb片段。剪切后，使用試劑盒中所含有的末端修復(fù)酶混合物對(duì)片段DNA實(shí)施末端修復(fù)以產(chǎn)生鈍端片段。隨后將經(jīng)剪切及末端修復(fù)的DNA分離在1%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠凝膠上，使用線性T7DNA(約40Kb)作為分子量標(biāo)記。自凝膠上切割下與T7DNA尺寸近似相等的基因組DNA并自瓊脂糖凝膠洗脫DNA。隨后將經(jīng)純化的DNA連接到pWEB載體上。連接后，使用pWEB粘?？寺≡噭┖刑峁┑拿房似绽筙包裝提取物(MaxPlaxLambdaPackagingExtracts)將所連接的插入DNA包裝到X噬菌體顆粒中。隨后對(duì)噬菌體提取物實(shí)施滴定以測(cè)定菌落形成單位/毫升。在測(cè)定噬菌體提取物的效價(jià)后，使用適當(dāng)量提取物來(lái)感染大腸桿菌EPI100宿主細(xì)胞并將受感染的細(xì)胞鋪板于含有50|ig/ml卡那霉素(kanamycin)的笛?？侣度?DifcoLuria)瓊脂板上以使細(xì)胞密度為約200個(gè)菌落/板。JT庫(kù),選嚴(yán)夠及方法，抓Z)P-薪薪夢(mèng)-《6-厲/大艨嚴(yán)^游產(chǎn)主。通常來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生特定抗生素所需要的基因簇集在產(chǎn)生生物體基因組中。此外，脫輔基蛋白基因具有與編碼參與對(duì)應(yīng)生色團(tuán)的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的基因簇集的優(yōu)先權(quán)(劉等人，2002，科學(xué)297:1170-3)。馬杜拉放線菌屬21G792產(chǎn)生的生色團(tuán)含有與烯二炔核心附接的氨基糖4-氨基-4-去氧-3-C-甲基-3-吡喃核糖。因?yàn)轭A(yù)計(jì)dNDP-D-葡萄糖-4，6-脫水酶(DH)催化此糖生物合成中的步驟，所以使用DH探針來(lái)分離生物合成簇。為產(chǎn)生DH探針，使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來(lái)自馬杜拉放線菌屬21G792的基因組DNA擴(kuò)增DH基因片段。用于預(yù)計(jì)約500bpDH基因片段的引物(脫水l:5'-CSGGSGSSGCSGGSTTCATSGG(SEQIDNO:152)及脫水2:5'-GGGWRCTGGYRSGGSCCGTAGTTG(SEQIDNO:153))與闡述于戴克等人，1996，F(xiàn)EMS微生物學(xué)快報(bào)141，195-201中的那些引物相同。使用起跳(JumpStart)REDTaq預(yù)混合PCR反應(yīng)混合物(西格瑪-阿德里奇(Sigma-Aldrich)公司，圣路易斯(St.Louis)，密蘇里州(MO))按照制造商說(shuō)明書(shū)來(lái)實(shí)施PCR。所用引物的最終濃度為0.5。在巴美特梯度溫控循環(huán)器(BiometraTgradientthermocycler)上實(shí)施PCR。起始變性溫度為96。C，持續(xù)4min。隨后實(shí)施如下30個(gè)循環(huán)變性溫度96°C(45sec)、退火溫度66°C(45sec)、延展溫度72。C(3min)。最后，最終延展溫度為72°C，持續(xù)10min。使用TOPOTA克隆試劑盒(英杰(Iiwitrogen)公司，卡爾斯班(Carlsbad)，加利福尼亞州)遵照制造商建議將約500bp擴(kuò)增子克隆到pCR2.1中。使用一部分(2.5pl)克隆反應(yīng)物來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10細(xì)胞(英杰公司，卡爾斯班，加利福尼亞州)，隨后將其鋪板于含有50ng/ml卡那霉素、40ng/mlX-gal及0.2mMIPTG的笛?？侣度?DifcoLuria)瓊脂板上以便實(shí)施重組純系的藍(lán)/白篩選。挑選二十個(gè)白色菌落并分離其質(zhì)粒DNA。對(duì)這些純系進(jìn)行測(cè)序揭示已克隆兩種不同DH基因片段。推導(dǎo)氨基酸序列的比較揭示一種DH片段(質(zhì)粒p34598中所含有的)和與卡奇霉素生物合成有關(guān)的DH最為相似。因?yàn)榭ㄆ婷顾亟Y(jié)構(gòu)含有2種氨基糖，所以預(yù)測(cè)p34598中所含有的DH片段也可能與氨基糖產(chǎn)生有關(guān)，且因此將其選作用于色蛋白基因簇的探針。^";T^"^V使用p34598DH片段通過(guò)菌落雜交對(duì)馬杜拉放線菌屬21G792基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選。如薩姆布魯克及拉塞爾(Russell)(2001)，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloning,ALaboratoryManual),冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(第3版)所述將重組菌落DNA轉(zhuǎn)移到尼坦超電荷(NytranSuPerCharge)尼龍膜圓盤(pán)(施萊西爾及舒爾氏生物科學(xué)(Schleicher&SchuellBioScience)公司，基恩(Keene)，新罕布什爾州(NH))上。使用PCR及引物脫水1及脫水2來(lái)制備DH探針以擴(kuò)增p34598插入片段。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分離所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物并自瓊脂糖凝膠分離530bp片段。隨后用[a-32P]dCTP(3000Ci/mmol阿莫仙生物科學(xué)(AmershamBioscience),皮斯卡塔韋(Piscataway)，新澤西州(NJ))使用麥加引物DNA標(biāo)記試劑盒(MegaprimeDNALabelingkit)按照制造商說(shuō)明書(shū)(阿莫仙生物科學(xué)，皮斯卡塔韋，新澤西州)對(duì)此片段進(jìn)行標(biāo)記。將其上固定DNA樣品的尼龍膜在6XSSC中洗滌，隨后置于含有預(yù)加熱(65t:)預(yù)雜交溶液(6XSSC/5X丹哈德(Denhardt's)試劑/0.5呢(w/v)SDS及100昭/ml經(jīng)變性剪切的鯡魚(yú)精DNA)的雜交瓶中并"預(yù)雜交"2h。隨后添加經(jīng)變性探針，并在65'C下繼續(xù)雜交過(guò)夜。第二天，用預(yù)加熱的(65'C)2XSSC/0.1呢SDS(洗滌溶液1)洗滌一次，持續(xù)lh并用預(yù)加熱的(65。C)lXSSC/0.1呢SDS(洗滌溶液2)洗滌一次，持續(xù)1h。隨后將尼龍膜包裹于保鮮膜(Saranwrap)中并暴露于柯達(dá)髙速X射線膠片洗片器AR膜(KodakX-omatARfilm)中4h。使用柯達(dá)高速X射線膠片洗片器2000A處理器來(lái)使所暴露的膜顯像。二十二個(gè)菌落似乎與探針雜交。挑選出這些菌落并使其在含有50嗎/ml卡那霉素的笛?？侣度?DifcoLuria)發(fā)酵液中生長(zhǎng)。自培養(yǎng)物中純化粘粒DNA并用A^I切割。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離限制酶切消化物并將DNA轉(zhuǎn)移到如薩姆布魯克及拉塞爾(2001)所述的尼坦超電荷(NytranSuPerCharge)尼龍膜上。使用與用于菌落雜交的條件相同的條件再次使用p34598插入片段作為探針來(lái)用探針探測(cè)此膜。九種粘粒與探針陽(yáng)性雜交。與探針雜交的粘粒及片段的大致尺寸為21gB:15-20kb，21gC:15-20kb，21gD:8-12kb,21gF:15-20kb，21gG:3-4kb，21gl:1.2-2.5kb，21gK:15-20kb，21gL:2.5-3kb，21gV:2-2.5kb。^f弄;^^"貧^^;^^^z夯^V利用艾德曼(Edman)蛋白質(zhì)測(cè)序來(lái)測(cè)定脫輔基蛋白的最初38個(gè)氨基酸殘基N-末端DTVTVNYDDVGYPSDIAVTIDAPATAGVGDTATFEVSV(SEQIDNO:154)。為最后確定哪些粘粒含有脫輔基蛋白基因序列，使用基于脫輔基蛋白N-末端的38個(gè)氨基酸(aa)序列的4-12殘基的簡(jiǎn)并寡核苷酸作為探針來(lái)實(shí)施雜交實(shí)驗(yàn)。具體來(lái)說(shuō)，寡核苷酸序列為5'-ACSGTSAACTACGACGACGTSGGNTAC(SEQIDNO:155)。將與DH探針雜交的粘粒用I消化并轉(zhuǎn)移到尼坦超電荷(NytranSuPerCharge)尼龍膜上。使用激酶最大5'末端標(biāo)記試劑盒(KinaseMax5'End-LabelingKit)按照制造商建議(安彼翁(Ambion)公司，奧斯汀(Austin)，德克薩斯州(TX))用[，"P]dATP(6000Ci/mmol;阿莫仙生物科學(xué)，皮斯卡塔韋，新澤西州)對(duì)寡核苷酸實(shí)施末端標(biāo)記。使用48努科威旋轉(zhuǎn)柱(NucAwaySpinColumn)試劑盒按照制造商指示(安彼翁公司，奧斯汀，德克薩斯州)移除未納入的放射性核苷酸。將攜帶DNA的尼龍膜在5(TC下于含有6XSSC、5X丹哈德試劑、0.05%焦磷酸鈉、0.5%SDS及100pg/ml經(jīng)剪切及變性的鮭魚(yú)精DNA的溶液中"預(yù)雜交"3h。在此步驟后，用7ml含有6XSSC、0.5%磷酸鈉、IX丹哈德試劑及100|ig/ml酵母tRNA的預(yù)加熱(5(TC)雜交溶液代替預(yù)雜交溶液。將經(jīng)標(biāo)記的探針添加到此溶液中并將雜交物在5(TC下培育22h。然后，棄除雜交溶液并用20ml室溫TMACL洗滌緩沖劑(3MTMACL，50mMTris，0.2%SDS)短暫沖洗所述膜。隨后用額外50ml預(yù)加熱(67。C)TMACL洗滌緩沖劑在67'C下將其洗滌55min。對(duì)于最后洗滌，用50ml預(yù)加熱(5(TC)洗滌溶液1在5(TC下將所述膜洗滌10min。隨后將所述膜包裹于保鮮膜中并暴露于柯達(dá)高速X射線膠片洗片器AR膜中24h。粘粒21gD、21gG及21gK與探針雜交。在含有21gD及21gKDNA的泳道中觀察到約4.5kb信號(hào)，而在含有21gGDNA的泳道中則觀察到約5.2kb信號(hào)。為證實(shí)此雜交結(jié)果，使用21gD粘粒DNA作為模板及所設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并PCR引物來(lái)實(shí)施PCR以自脫輔基蛋白擴(kuò)增98bp片段。使用自脫輔基蛋白的36aa序列推導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)譯DNA序列來(lái)設(shè)計(jì)PCR引物CP-FWD3(5'陽(yáng)ACSGTSAAYTAYGAYGAYGT;SEQIDNO:156)及CP-REV4(5'-ACYTCRAASGTSGCSGTRTC;SEQIDNO:157)。使用起跳(JumpStart)REDTaq預(yù)混合PCR反應(yīng)混合物(西格瑪-阿德里奇公司，圣路易斯，密蘇里州)按照制造商說(shuō)明書(shū)來(lái)實(shí)施PCR。所用引物的最終濃度為2.0(iM。在巴美特梯度溫控循環(huán)器上實(shí)施PCR。起始變性溫度為96。C，持續(xù)4min。隨后實(shí)施如下5個(gè)循環(huán)變性溫度96°C(45sec)、退火溫度4(TC(45sec)、延展溫度72°C(2min)。接下來(lái)的30個(gè)循環(huán)如下變性溫度96。C(30sec)、退火溫度55.7-72.0。C(45sec;在此范圍內(nèi)測(cè)試8個(gè)溫度)、延展溫度72。C(2min)。最后，最終延展溫度為72。C，持續(xù)10min。由所述條件可產(chǎn)生數(shù)條帶；然而，使用退火溫度55.7。C、58.6。C及61.4。C可產(chǎn)生約100bp的強(qiáng)烈?guī)?。使用TOPOTA克隆試劑盒(英杰公司，卡爾斯班，加利福尼亞州)遵照制造商建議將約100bp擴(kuò)增子克隆到pCR2.1中。使用一部分(2.5pl)克隆反應(yīng)物來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10細(xì)胞(英杰公司，卡爾斯班，加利福尼亞州)，隨后將其鋪板于含有50|ng/ml卡那霉素、40ng/mlX-gal及0.2mMIPTG的笛?？侣度?DifcoLuria)瓊脂板上以便實(shí)施重組純系的藍(lán)/白篩選。挑選十個(gè)白色菌落并分離其質(zhì)粒DNA。對(duì)這些純系進(jìn)行測(cè)序揭示4種純系(p35546、p35547、p35550、p35554)所含有的DNA的推導(dǎo)氨基酸序列與36朋脫輔基蛋白片段的氨基酸序列準(zhǔn)確匹配，由此證實(shí)粘粒21gD中含有編碼脫輔基蛋白的基因。搭教2"Z)0完,應(yīng)薪著歪AZW/4^^效說(shuō)欽。為測(cè)定編碼脫輔基蛋白的基因的全序列，自上文所擴(kuò)增98bpPCR產(chǎn)物的DNA序列設(shè)計(jì)測(cè)序引物。使用粘粒21gD作為模板使用以下引物來(lái)實(shí)施起始輪測(cè)序ApoSeqCodel:5'-GGCTACCCGTCGGACATCG(SEQIDNO:158);ApoSeqCode2:5'-GGACATCGCCGTGACCATCG(SEQIDNO:159);ApoSeqCompl:5'-CCGGCGCGTCGATGGTCAC(SEQIDNO:160);ApoS叫Comp2:5'-CTCGAAGGTGGCGGTGTC(SEQIDNO:161)。第一輪測(cè)序產(chǎn)生約1440bp序列。使用密碼優(yōu)先性程序，識(shí)別出小的498bp開(kāi)放讀碼框(ORF)。將此0《的推導(dǎo)氨基酸序列與馬杜拉放線菌屬21G792脫輔基蛋白的部分氨基酸序列(由艾德曼蛋白質(zhì)測(cè)序測(cè)定)進(jìn)行比較證實(shí)ORF確實(shí)編碼脫輔基蛋白，因?yàn)閮蓷l氨基酸序列相同。另外，推導(dǎo)氨基酸序列的分子量12926Da與通過(guò)高分辨率MALDIMS所測(cè)定的脫輔基蛋白的分子量12924.09良好吻合。而且，脫輔基蛋白的DNA序列通過(guò)使用編碼脫輔基蛋白的orf側(cè)翼的引物對(duì)兩條DNA鏈實(shí)施擴(kuò)展測(cè)序而進(jìn)一步證實(shí)(指定aseA)。含有前導(dǎo)肽及脫輔基蛋白的脫輔基蛋白前體的推導(dǎo)氨基酸序列提供于SEQIDNO:64中。編碼脫輔基蛋白前體的核苷酸序列提供于SEQIDNO:63中。脫輔基蛋白的推導(dǎo)氨基酸序列提供于SEQIDNO:150中。編碼脫輔基蛋白的核苷酸序列提供于SEQIDNO:149中。最后，圖7中所提供的圖闡述脫輔基蛋白前體的DNA序列、對(duì)應(yīng)氨基酸序列、推定的上游核糖體結(jié)合位點(diǎn)、及前導(dǎo)肽及脫輔基蛋白之間的分裂位點(diǎn)。實(shí)例12實(shí)例12-馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白生物合成簇的剩余部分的DNA分離及測(cè)序與控投威錄朦虜27G792潔薪基歪A基房嚴(yán)游遠(yuǎn)^^^游磁定。如下所述確定與存在于粘粒21gD中的馬杜拉放線菌屬21G792脫輔基蛋白基因簇部分鄰近的序列。我們認(rèn)為這些序列與粘粒21gD—起基本上組成馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白的全部生物合成簇-即所述基因負(fù)責(zé)色蛋白組裝。開(kāi)放讀碼框的位置標(biāo)示于表1中。所編碼蛋白質(zhì)的功能通過(guò)與基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)保存序列進(jìn)行比較來(lái)推導(dǎo)(表3)。開(kāi)放讀碼框的排列描述于圖8中。首先，通過(guò)使用引物21gDprlFWD(5'-GCTCGTCGGGTTCTTCTAC;SEQIDNO:162)及21gDprlREV(5'-GACTTCGCGATAGCTCTC;SEQIDNO:163)自含有部分II型肽合成酶縮合結(jié)構(gòu)域(oW仏圖7)的粘粒的末端擴(kuò)增904bp片段自粘粒21gD產(chǎn)生探針。使用KOD聚合酶(諾瓦杰(Novagen))與5%DMSO按照制造商建議實(shí)施PCR擴(kuò)增。所用引物的濃度為0.5mM。使用粘粒21gD作為模板DNA。循環(huán)條件如下96°C2min1個(gè)循環(huán)，隨后96°C1min、61.2°C1min、及72°C2min30個(gè)循環(huán)，隨后72。C10minl個(gè)循環(huán)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR反應(yīng)并如先前所述自瓊脂糖凝膠洗脫出904bp帶。如先前對(duì)于4，6-脫水酶探針?biāo)鍪褂?04bp擴(kuò)增子來(lái)用探針探測(cè)馬杜拉放線菌屬21G792基因組粘粒文庫(kù)。對(duì)與探針雜交的38個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)(5ml含有50昭/ml卡那霉素的笛?？侣度?DifcoLuria)發(fā)酵液)并純化粘粒DNA。使用pWEB載體中所含有的測(cè)序引物位點(diǎn)對(duì)所純化的粘粒進(jìn)行末端測(cè)序。DNA序列分析表明一種粘粒(41417)與粘粒21gD重疊1184bp。隨后對(duì)整個(gè)粘粒41417進(jìn)行測(cè)序，確定開(kāi)放讀碼框，并推導(dǎo)所編碼蛋白質(zhì)的功能。通過(guò)對(duì)先前確定為與在p34598中所克隆的推定的dNDP-D-葡萄糖-4，6-脫水酶片段(用于識(shí)別粘粒21gD)雜交的粘粒進(jìn)行篩選確定粘粒21gD另一末端遠(yuǎn)側(cè)的生物合成簇部分。使用經(jīng)設(shè)計(jì)以自粘粒21gD的5'末端擴(kuò)增1043bp產(chǎn)物(產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于完整生物合成簇的核苷酸70,572至71,614)的PCR引物對(duì)所述粘粒進(jìn)行篩選。使用引物21gDendFWD(5'-GCGACGAAGGACCCGAAGG;SEQIDNO:164)及21gDendREV(5'-CACGCTGGCCCGCCCCTTC;SEQIDNO:165)使用10-100ng每種粘粒作為模板在標(biāo)準(zhǔn)25^PCR反應(yīng)物(KOD熱啟動(dòng)(KODHotStart)聚合酶；諾瓦杰，圣迭戈(SanDiego)，加利福尼亞州，美國(guó))與0.5pM每種引物中篩選每種粘粒。支持預(yù)期1043bpDNA片段擴(kuò)增的唯一粘粒是21gB及21gC。對(duì)這些粘粒進(jìn)行末端測(cè)序揭示粘粒21gB與粘粒21gD重疊17,411個(gè)核苷酸，而粘粒21gC與粘粒21gD重疊22,7%個(gè)核苷酸。由于粘粒21gB與己知簇序列重疊較少，且由此表示其具有較大潛力產(chǎn)生相比粘粒21gC來(lái)說(shuō)較長(zhǎng)的序列擴(kuò)展，因此選擇其來(lái)測(cè)序。測(cè)序揭示粘粒21gB含有33,133bp插入片段，表示18,442bp序列擴(kuò)展，此使所測(cè)序堿基對(duì)的總數(shù)量達(dá)到90,573(圖8)。如先前，對(duì)粘粒進(jìn)行測(cè)序，確定開(kāi)放讀碼框，并推導(dǎo)所編碼蛋白質(zhì)的功能。實(shí)例1321G792色蛋白的生物特性實(shí)例13-活體外抗腫瘤活性。p53/p21檢查點(diǎn)檢查基因組的完整性并在DNA損傷事件中阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程。由p21基因缺失引起的檢查點(diǎn)破壞不能達(dá)成響應(yīng)DNA損傷的阻滯，最終導(dǎo)致經(jīng)由凋亡而使細(xì)胞死亡。由于丟失此檢查點(diǎn)是癌細(xì)胞的標(biāo)志，所以可以使用其中一對(duì)細(xì)胞系(p21十/十)具有完整p21基因且一個(gè)成員(p21-/-)缺失p21基因的等基因?qū)?xì)胞系通過(guò)識(shí)別優(yōu)先誘導(dǎo)p21-缺陷型細(xì)胞凋亡的分子來(lái)篩選潛在的抗腫瘤化合物。將馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白添加到等基因?qū)?xì)胞系(p21+Z+及p21-A)中。如表8中所示，色蛋白對(duì)于p21-A細(xì)胞具有高選擇性，因?yàn)槠銲C5o值為p21+/+細(xì)胞IC5o值的13倍多。而且，如表9中所示，色蛋白在人類腫瘤細(xì)胞系組中顯示極佳效能，因?yàn)槠銲Cso值介于l至47ng/ml范圍內(nèi)。然而，單獨(dú)脫輔基蛋白沒(méi)有活性。表821-/-細(xì)胞對(duì)馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白的靈敏性等基因細(xì)胞系p21+/+p21-/-選擇性比IC50(嗎/ml)90+327+213平均值+SD，n=3表9馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白對(duì)抗人類腫瘤細(xì)胞系的效能腫瘤細(xì)胞系組織IC50(ng/ml)DUM結(jié)腸8HCT116結(jié)腸1HT29結(jié)腸851<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>實(shí)例14實(shí)例14-由色蛋白誘導(dǎo)的DNA損傷。使用自特威杰(Trevigen)公司獲得的COMET分析來(lái)檢測(cè)DNA損傷。將HCT116p21+/+及-/-細(xì)胞置于多種量210792色蛋白及米托蒽醌(11^(3加01^)的影響下。如圖27中所示，在大于100ng/ml濃度下色蛋白誘導(dǎo)的劑量依賴性DNA鏈斷裂發(fā)生在p21-健全型及p21-缺陷型細(xì)胞二者中。實(shí)例15實(shí)例15-由色蛋白誘導(dǎo)的DNA裂解。將超螺旋結(jié)構(gòu)0X174DNA與多種濃度的21G792色蛋白一起培育并通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分析。觀察到，色蛋白誘導(dǎo)單鏈斷裂及雙鏈斷裂，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行超過(guò)24小時(shí)，且與卡奇霉素不同DNA裂解不需要還原劑(二硫蘇糖醇，DTT)。凝膠電泳顯示于圖28中。帶缺口的是指DNA中的單鏈斷裂且線性是指雙鏈斷裂。實(shí)例16實(shí)例16-色蛋白消化組蛋白Hl。先前已顯示色蛋白烯二炔能裂解組蛋白(澤因(Zein)等人，1993，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊90，8009-12;澤因等人，1995，化學(xué)及生物學(xué)(Chem&Biol)2，451-5;澤因等人，1995，生物化學(xué)34，11591-7)，但此活性具有爭(zhēng)議(何伊都(Heyd)等人，2000，細(xì)菌學(xué)雜志182，1812-8)，推測(cè)是由于脫輔基蛋白的蛋白水解活性所致。在50mMTris-Cl,pH7.5中于37。C下將組蛋白Hl與多種濃度的色蛋白一起培育過(guò)夜。(圖29)通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)隨后用吉爾扣德(GdCode)藍(lán)(皮爾斯生物技術(shù)(PierceBiotechnology)公司，羅克福德(Rockford)，伊利諾斯州(IL))對(duì)凝膠進(jìn)行染色來(lái)評(píng)價(jià)組蛋白消化。添加DNA可抑制組蛋白H1消化，表明DNA裂解所需要的相同機(jī)制(例如，基于自由基的機(jī)制)也與蛋白質(zhì)消化有關(guān)。與此一致，添加自由基清除劑、30mM谷胱甘肽或N-乙酰基半胱氨酸(未顯示)可抑制組蛋白消化，但蛋白酶抑制劑不能抑制?？ㄆ婷顾厥呛邢┒驳姆堑鞍踪|(zhì)，其不能裂解組蛋白Hl,表明此活性需要完整生色團(tuán)-蛋白質(zhì)復(fù)合物。實(shí)例17實(shí)例17-色蛋白消化的特異性。色蛋白消化組蛋白的優(yōu)先順序是H1〉H2A〉H2B〉H3〉H4(圖30)。色蛋白也可裂解諸如髓磷脂堿性蛋白等堿性蛋白，但不能裂解中性/酸性蛋白(例如牛血清白蛋白)。此可解釋組蛋白裂解活性需要生色團(tuán)的脫輔基蛋白組份酸性脫輔基蛋白可通過(guò)靜電作用將生色團(tuán)遞送到組蛋白及其它堿性蛋白，此使得生色團(tuán)能夠通過(guò)基于自由基的機(jī)制裂解堿性蛋白。實(shí)例18實(shí)例18-在HeLa細(xì)胞中由色蛋白消化組蛋白Hl。為研究色蛋白能否在完整細(xì)胞中消化組蛋白，將HeLa細(xì)胞與化合物在37T:下一起培育過(guò)夜。通過(guò)SDS-PAGE及使用抗-組蛋白Hl抗體的蛋白質(zhì)免疫印跡(圣克魯斯(SantaCruz)生物技術(shù))對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行分析。與色蛋白一起培育細(xì)胞使得細(xì)胞中的組蛋白HI減少(圖31)。用博來(lái)霉素(另一種DNA損傷劑)或用卡奇霉素均未觀察到效果。此表明色蛋白能夠在完整細(xì)胞內(nèi)消化組蛋白。此活性可通過(guò)消化染色質(zhì)中的組蛋白使DNA更易裂解而促進(jìn)抗腫瘤效果。此似乎是色蛋白烯二炔的特有活性。實(shí)例19實(shí)例19-Gl/S檢査點(diǎn)的色蛋白誘導(dǎo)。使HCT116(p21十/十及p21-A)細(xì)胞暴露于多種濃度的色蛋白中。如圖32A中所示，對(duì)于所測(cè)試的所有濃度，暴露于色蛋白中導(dǎo)致p53檢查點(diǎn)激活。僅在？21+/+細(xì)胞中觀察到p21蛋白質(zhì)誘導(dǎo)。馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白激活DNA損傷檢查點(diǎn)可通過(guò)論證p53中絲氨酸-15氨基酸殘基的磷酸化予以證實(shí)，已知其對(duì)于p53蛋白的轉(zhuǎn)錄激活甚為重要(圖32B)。而且，裂解聚ADP核糖磷酸化酶(PARP)顯示(圖23B)'當(dāng)用馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白處理時(shí)，與？21+/+細(xì)胞相比優(yōu)先在p21-A細(xì)胞中觀察到凋亡誘導(dǎo)。此與在p21-/-細(xì)胞中IC50值較低一致。實(shí)例20實(shí)例20-色蛋白物質(zhì)的活性。在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞及80S14細(xì)胞(HCT116的p21-A變體)中測(cè)定峰"A"(包含生色團(tuán)-c及-d的色蛋白)、峰"B"(包含生色團(tuán)-b的色蛋白)及包含所有生色團(tuán)異型體的色蛋白制劑的活性。色蛋白c的效能(色蛋白-d不具有顯著活性)始終為色蛋白b效能的約三分之一。對(duì)于色蛋白-b及-c二者來(lái)說(shuō)，與p21+"細(xì)胞相比優(yōu)先在？21-/-細(xì)胞中觀察到凋亡誘導(dǎo)；參見(jiàn)表10。53表10色蛋白制劑的活性實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)2IC50(ng/ml)比IC50(!^g/ml)比生色團(tuán)制劑HCTU6p21+/+80S14p21-/-HCT116p21+/+80S14p21-A未分離的0.0590.01440.0440駕9b0.1720駕40.2100.0336c0.0640掘40遍0.0116未分離的l細(xì)0.02443未分離的0.0970細(xì)12實(shí)例21實(shí)例21-活體內(nèi)抗腫瘤活性將人類腫瘤細(xì)胞系或片段LoVo(結(jié)腸癌)、HCT116(結(jié)腸)、HT29(結(jié)腸)、LOX(黑色素瘤)、HN5(頭及頸)、及PC-3(前列腺)移植到無(wú)胸腺(裸)小鼠的皮膚下并使其形成腫瘤塊。當(dāng)腫瘤尺寸達(dá)到90-200mg時(shí)，將鹽水對(duì)照媒劑或在鹽水中調(diào)配的多種濃度馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白經(jīng)靜脈內(nèi)投與給小鼠。小鼠在第5及9天接受隨后劑量并觀察相對(duì)腫瘤生長(zhǎng)。結(jié)果顯示于圖33及圖34中的曲線圖中。觀察到接受色蛋白的小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制可高達(dá)80%。實(shí)例22實(shí)例22-色蛋白的毒性。毒理學(xué)研究表明，除骨髓抑制外，馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白在裸小鼠中耐受性良好。具體來(lái)說(shuō)，在第l、5、及9天將鹽水對(duì)照媒劑或多種劑量的色蛋白經(jīng)靜脈內(nèi)投與給六只裸小鼠。小鼠的顯微鏡研究顯示接受色蛋白的所有小鼠皆展示骨髓壞死，接受色蛋白最多的小鼠展示最嚴(yán)重?fù)p傷。臨床病理學(xué)實(shí)驗(yàn)揭示接受色蛋白最多的小鼠展示白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞數(shù)量最少。然而，在腸、神經(jīng)、脊髓、肝或注射位點(diǎn)處皆未觀察到有害效果。顯微鏡檢査發(fā)現(xiàn)及臨床病理學(xué)概述提供于表11及12中。表11顯微鏡檢査發(fā)現(xiàn)概述組治療劑量(mg/kg)骨髓壞死31媒劑00/6221G79236/6(1,7)321G79266/6(3)a:具有損傷的數(shù)量/所檢査的總數(shù)量(X):平均損傷嚴(yán)重性，其中0=WNL、1=輕微、2=弱、3=中度、4=明顯、5=嚴(yán)重54表12臨床病理學(xué)<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>實(shí)例23實(shí)例23-由P-GP(MDR-1)轉(zhuǎn)運(yùn)色蛋白人類PGP(MDR1)是能夠?qū)⒃S多藥物轉(zhuǎn)運(yùn)跨過(guò)細(xì)胞膜的ATP依賴性流出泵。己將此蛋白質(zhì)的高水平表達(dá)與腫瘤的多藥耐藥性聯(lián)系起來(lái)。如表13中所示，馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白是較差的MDR1底物，且表達(dá)臨床相關(guān)水平MDR1的細(xì)胞(KB-8-5細(xì)胞)對(duì)所述復(fù)合物仍具有靈敏性。明顯地，不具有蛋白質(zhì)組份的卡奇霉素是MDR1的良好底物。色蛋白的蛋白質(zhì)組份可能保護(hù)生色團(tuán)免于由MDR1介導(dǎo)的藥物流出，且可能造成在通常表達(dá)MDR1的結(jié)腸細(xì)胞系中具有有益的抗腫瘤效果。表13馬杜拉放線菌屬21G792生色團(tuán)及卡奇霉素対-抗P-GP表達(dá)細(xì)胞的IC5o值IC50(ng/ml)a細(xì)胞系P-GP水平21G792卡奇霉素KB-103KB-8-5+621KB-V-1+++142>謂0:兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值實(shí)例24實(shí)例24-在HCT116細(xì)胞中攝取經(jīng)FITC標(biāo)記的色蛋白為確定色蛋白以何種機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮其生物活性，使用EZ-標(biāo)記螢光標(biāo)記試劑盒(皮爾斯生物技術(shù))按照制造商建議用螢光標(biāo)簽(FITC)來(lái)標(biāo)記色蛋白。標(biāo)記時(shí)未觀察到生物活性失去。通過(guò)熒光顯微術(shù)來(lái)研究HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)的攝取。與細(xì)胞的最佳培育時(shí)間是3-6小時(shí)。大多數(shù)標(biāo)記出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，盡管在細(xì)胞核中也觀察到弱染色(圖35)。盡管核蓄積量較低，但考慮到復(fù)合物效能，此量很可能足以提供生物活性。實(shí)例25實(shí)例25-在HCT116細(xì)胞中攝取經(jīng)FITC標(biāo)記的脫輔基蛋白及色蛋白為確定生色團(tuán)與脫輔基蛋白的完整復(fù)合物是否為細(xì)胞及核進(jìn)入所需，用FITC標(biāo)記色蛋白及脫輔基蛋白。通過(guò)熒光顯微術(shù)來(lái)研究經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)的攝取。脫輔基蛋白及色蛋白二者的攝取相似。(圖36)表明細(xì)胞進(jìn)入并不依賴于完整生色團(tuán)-蛋白質(zhì)復(fù)合物。實(shí)例26實(shí)例26-經(jīng)FITC標(biāo)記的色蛋白的攝取與未經(jīng)標(biāo)記復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)為確定色蛋白進(jìn)入到細(xì)胞中是否受可飽和(例如細(xì)胞表面受體依賴性)過(guò)程介導(dǎo)，在不存在或存在IO倍過(guò)量未經(jīng)標(biāo)記試劑(分別為未經(jīng)標(biāo)記的色蛋白或脫輔基蛋白)下一起培育HCT116細(xì)胞與經(jīng)FITC標(biāo)記的色蛋白(圖37，右圖)或脫輔基蛋白(圖37，左圖)。通過(guò)熒光顯微術(shù)(左)或流式細(xì)胞術(shù)(右)分析細(xì)胞。未觀察到標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)，此表明經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)的攝取不是受體介導(dǎo)的過(guò)程。而且，在流式細(xì)胞術(shù)直方圖中觀察到單一峰，表明所有細(xì)胞皆相同攝取經(jīng)標(biāo)記試劑。直方圖中的數(shù)字是平均通道數(shù)量(FITC熒光)。實(shí)例27實(shí)例27-能量耗竭及微管破壞對(duì)HCT116細(xì)胞攝取經(jīng)FITC標(biāo)記的脫輔基蛋白的影響。上文實(shí)驗(yàn)表明色蛋白進(jìn)入到細(xì)胞不是受體介導(dǎo)的過(guò)程。蛋白質(zhì)復(fù)合物可借以進(jìn)入細(xì)胞的其它手段是胞飲作用，其中細(xì)胞表面上的細(xì)胞質(zhì)膜小凹陷箍起以形成在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離的胞飲泡。由于胞飲作用是需要功能性微管蛋白細(xì)胞支架網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的能量依賴性過(guò)程，因此我們可以解釋疊氮化鈉(能量偶合劑)及諾考達(dá)唑(破壞微管蛋白細(xì)胞支架的試劑)對(duì)細(xì)胞攝取的影響。在不存在或存在疊氮化鈉或諾考達(dá)唑下用經(jīng)FITC標(biāo)記的脫輔基蛋白處理HCT116細(xì)胞。兩種處理均抑制標(biāo)記攝取(圖38)。顯示諾考達(dá)唑的濃度(100nM)足以破壞微管(右圖)。這些數(shù)據(jù)表明脫輔基蛋白的攝取是使用微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的能量依賴性過(guò)程。由于所述數(shù)據(jù)似乎排除受體介導(dǎo)的過(guò)程的可能性，所以最有可能涉及胞飲作用。本申請(qǐng)案與2006年6月21日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)案第60/815,697號(hào)有關(guān)，出于各種目的將其全文以引用方式并入本文中。5權(quán)利要求1、一種發(fā)酵培養(yǎng)物，其包含產(chǎn)生色蛋白的放線菌(actinomycete)、選自溴化物及碘化物的鹵化物、及選自普朗尼克L-61(PluronicL-61)、普朗克爾P2000(PluracolP2000)(聚丙二醇)及安他羅克17-R2(Antarox17-R2)的表面活性劑。2、如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)物，其中所述放線菌是馬杜拉放線菌屬(AcZ/omadMrasp.)21G792。3、如權(quán)利要求l所述的發(fā)酵培養(yǎng)物，其中所述表面活性劑是普朗尼克L-61。4、如權(quán)利要求l所述的發(fā)酵培養(yǎng)物，其中所述放線菌是馬杜拉放線菌屬21G792且所述表面活性劑是普朗尼克L-61。5、如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求所述的發(fā)酵培養(yǎng)物，其中普朗尼克L-61以約0.1至10gm/L的量存在。6、如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求所述的發(fā)酵培養(yǎng)物，其中普朗尼克L-61以約5gm/L存在。7、如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求所述的發(fā)酵培養(yǎng)物，其中所述鹵化物以約1-15mM的濃度存在。8、如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求所述的發(fā)酵培養(yǎng)物，其中所述鹵化物以約3-5mM的濃度存在。9、一種產(chǎn)生色蛋白的方法，其包含在包含鹵化物及表面活性劑的培養(yǎng)基中使馬杜拉放線菌屬21G792發(fā)酵，所述鹵化物選自溴化物及碘化物，所述表面活性劑選自普朗尼克L-61、普朗克爾P2000(聚丙二醇)及安他羅克17-R2。10、一種純化馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白的方法，其包含獲得包含所述馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白的流體，及使所述流體與下述中的一或多種接觸(a)陰離子交換色譜基質(zhì)、(b)疏水作用色譜基質(zhì)、或(c)尺寸排除色譜基質(zhì)，及回收所述經(jīng)純化色蛋白。11、一種純化馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白的方法，其包含(a)獲得包含所述馬杜拉放線菌屬21G792色蛋白的流體，(b)使所述流體與陰離子交換色譜基質(zhì)接觸，(c)使所述流體與疏水作用色譜基質(zhì)接觸，(d)使所述流體與尺寸排除色譜基質(zhì)接觸，及(e)回收所述經(jīng)純化色蛋白。12、如權(quán)利要求10或11所述的方法，其中所回收的所述色蛋白純度以總蛋白質(zhì)計(jì)是約80%或更髙。13、如權(quán)利要求10或11所述的方法，其中所回收的所述色蛋白純度以總蛋白質(zhì)計(jì)是約卯％或更高。14、如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述陰離子交換色譜基質(zhì)是DEAE瓊脂糖凝膠。15、如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述疏水作用色譜基質(zhì)是苯基瓊脂糖凝膠。如權(quán)利要求ll、12、或13所述的方法，其中所述尺寸排除色譜基質(zhì)的分離范圍是自約3xl()3至約7x105。16、一種經(jīng)純化生色團(tuán)，其具有下式17、一種經(jīng)純化色蛋白，其包含如權(quán)利要求16所述的生色團(tuán)。18、一種醫(yī)藥組合物，其包含如權(quán)利要求16所述的經(jīng)純化生色團(tuán)。19、一種醫(yī)藥組合物，其包含如權(quán)利要求n所述的經(jīng)純化色蛋白。20、一種醫(yī)藥組合物，其包含可通過(guò)如權(quán)利要求9、10或11所述的方法獲得的經(jīng)純化色蛋白。全文摘要本發(fā)明提供產(chǎn)生及純化由馬杜拉放線菌屬(Actinomadurasp.)21G792所產(chǎn)生的活性色蛋白的方法。所述色蛋白可用于研制醫(yī)藥組合物及治療諸如癌癥或細(xì)菌感染等疾病。文檔編號(hào)A61K47/48GK101484189SQ200780022758公開(kāi)日2009年7月15日申請(qǐng)日期2007年6月21日優(yōu)先權(quán)日2006年6月21日發(fā)明者尤金·約瑟夫·維杜納斯,帕梅拉·休·芬克·沙博諾,洛德斯·珍妮特·戈登,平蔡,蔡國(guó)真,賈斯廷·基思·莫蘭申請(qǐng)人:惠氏公司