專利名稱：：重組病毒疫苗的制作方法重組病毒疫苗本發(fā)明提供了新型重組病毒疫苗。具體地，本發(fā)明提供了組合產(chǎn)物，其包含重組的病毒載體和能夠改善由該重組的病毒載體產(chǎn)生的體內(nèi)免疫應(yīng)答的特定化合物。多年來涉及向動物系統(tǒng)導(dǎo)入抗原的傳統(tǒng)疫苗接種技術(shù)是已知的，其中所述的抗原可以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并且因而保護所述動物不受感染。這些技術(shù)包括開發(fā)活疫苗和滅活疫苗?；钜呙缤ǔＪ歉腥拘圆≡w的減毒非致病形式，其能夠啟動針對該感染性病原體的致病形式的免疫應(yīng)答。近年來，在開發(fā)其中由載體編碼并表達外來目的抗原的重組疫苗、尤其重組活疫苗方面上有進展。在重組活疫苗中，基于重組病毒的載體在新疫苗開發(fā)中顯出巨大前景并且起到重要作用。已經(jīng)研究了眾多病毒表達源自外來病原體或肺瘤組織的蛋白質(zhì)的能力以及在體內(nèi)誘導(dǎo)針對這些抗原的特異性免疫應(yīng)答的能力。一般而言，這些基于基因的疫苗能夠刺激強烈的體液及細胞免疫應(yīng)答，并且病毒載體可能是用于遞送抗原編碼基因以及促進并增強抗原呈遞的有效策略。為了用作疫苗載體，理想的病毒載體應(yīng)當是安全的并且能夠有效呈遞所需的病原體特異性抗原至免疫系統(tǒng)。它也應(yīng)當表現(xiàn)低的固有免疫原性以允許增強相關(guān)特異性免疫應(yīng)答的再施用。此外，載體系統(tǒng)必須符合能夠大規(guī)模生產(chǎn)它們的標準。迄今已經(jīng)出現(xiàn)幾種病毒疫苗栽體，它們都具有相對的優(yōu)勢和局限，這取決于所提出的用途，并且迄今它們均未證明是理想的疫苗載體。重組痘病毒載體是病毒疫苗載體的一個例子。已經(jīng)使用它們作為體液及細胞免疫應(yīng)答的裔導(dǎo)物，誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細胞，并且它們因此代表選擇的遞送系統(tǒng)，特別在癌癥和抗病毒免疫療法中(見Arlen等，2005，SeminOncol32，549-555或Essajee和Kaufman,2004，ExpertOpinBiolTher4，575-588)。盡管存在與痘病毒疫苗接種相聯(lián)系的相對于其它接種療法的優(yōu)勢(見例如Souza等，2005,BrazJMedBiolRes,38，509-522)，然而無疑需要開發(fā)適用于此種病毒載體的佐劑化合物，其中所述的佐劑化合物將起到增強由該疫苗所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的作用。近年來主要致力于發(fā)現(xiàn)通過刺激免疫系統(tǒng)中某些關(guān)鍵方面而發(fā)揮作用的新藥物化合物，并取得重大成功。稱作免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(immuneresponsemodifier,IRM)或佐劑的這些化合物似乎憑借基礎(chǔ)免疫系統(tǒng)機制通過Toll樣受體(TLR)起作用，以誘導(dǎo)各類重要細胞因子(例如干擾素、白細胞介素、腫瘤壞死因子等)的生物合成。已經(jīng)顯示此類化合物刺激單核/巨噬細胞衍生的細胞因子迅速釋放，并且也能夠刺激B細胞分泌在IRM化合物的抗病毒及抗腫瘤活性方面發(fā)揮重要作用的抗體。由IRM誘導(dǎo)的一個優(yōu)勢的免疫刺激性應(yīng)答是誘導(dǎo)干擾素IFN-a產(chǎn)生，據(jù)認為這在已見到的急性期抗病毒及抗腫瘤活性方面是極重要的。此外，上調(diào)其它細胞因子例如腫瘤壞死因子(TNF)、IL-l和IL-6也具有潛在的有益活性并且據(jù)認為對這些化合物的抗病毒及抗腫瘤特性有貢獻。已經(jīng)公開了免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(IRM)用于治療類型多樣的疾病和病癥，包括病毒病(例如人乳頭瘤病毒、病毒性肝炎、皰疹)、瘤形成(例如基底細胞癌、扁平細胞癌、光化性角化病、黑素瘤)和TH2-介導(dǎo)的疾病(例如哮喘、變應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性皮炎)。此類免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑的實例(IRM)包括CpG寡核苷酸(例如見US6,194,388;US2006094683;WO2004039829)、脂多糖、聚肌胞苷酸復(fù)合體(Kadowaki等2001，J.Immunol.166，2291-2295)、已知從樹突細胞和/或單核細胞/巨噬細胞誘導(dǎo)細胞因子產(chǎn)生的多肽和蛋白質(zhì)。此類免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(IRM)的其它實例是有機小分子，例如咪唑并唾啉胺、咪唑并吡咬胺、6，7-稠合的環(huán)烷基咪唑并吡啶胺、咪唑并萘咬胺、巧悉唑并會啉胺、噻唑并壹啉胺和1，2-橋接的咪唑并壹啉胺(參見例如US4,689,338;US5，389，640;US6,110,929和US6,331,539)。具體地，咪唑并會啉胺已經(jīng)作為a干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子-a(TNF)、白細胞介素IL-ip、IL-6、IL-la、IL-1受體拮抗劑、IL-10、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)及巨噬細胞炎癥蛋白-la的誘導(dǎo)物而展示了體外和體內(nèi)的強大潛能(Gibson等，1995，JInterferonCytokineRes.，15，537-545;Tomai等，1995,AntiviralRes.，28，253-264;Testerman等，1995,JLeukocBiol.，58,365-372),并證實引起多樣的生物學(xué)功能，包括抗病毒、抗增殖和抗腫瘤活性(綜述見Syed，2001，ExpertOpinPharmacother.2，877-882或Li等，2005，JDrugsDermatol.4，708-717)。更具體地，專利申請WO93/20847的發(fā)明人已經(jīng)證實咪唑并喹啉胺能夠增強針對某些抗原如活病毒及活細菌免疫原、腫瘤衍生的、原生動物性、生物衍生的、真菌性和細菌性免疫原、類毒素、毒素、多糖、蛋白質(zhì)、糖蛋白、肽等的免疫應(yīng)答，當共施用這些抗原與咪唑并壹啉胺這類化合物時。已經(jīng)進一步證實咪唑并喹啉胺化合物針對多種病毒、尤其痘病毒的抗病毒活性(Bikowski,2004，Cutis.，73，202-206;US20050048072)，并且已經(jīng)證實這些化合物針對生殖器疣(Scheinfeld和Lehman,2006，DermatolOnlineJ.，12，5)、生殖器皰滲(Miller等，2002，IntImmunopharmacol.，2,443-451)和上皮軟疾(Stulberg和GalbraithHutchinson,2003，Am.Fam.Physician,67,1233-1240)的臨床效力。在上世紀90年代早期，觀察到質(zhì)粒DNA載體可在體內(nèi)直接轉(zhuǎn)染動物細胞后，已經(jīng)開展大量研究工作以開發(fā)基于使用DNA質(zhì)粒來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的接種技術(shù)，所述接種技術(shù)是通過將編碼抗原肽的DNA直接導(dǎo)入動物而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。廣泛稱作DNA接種的此類技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)用來在大量疾病模型中激發(fā)保護性免疫應(yīng)答。近來，已經(jīng)提出咪唑并喹啉胺作為DNA接種中的佐劑(WO02/24225)、尤其在癌免疫療法中的佐劑(WO2006/042254;Smorlesi等，2005，GeneTherapy,12，1324-1332)。關(guān)于DNA疫苗的綜述，見Reyes-Sandoval和Er仏2001(CurrentMolecularMedicine,1，217-243)。本發(fā)明涉及對重組病毒疫苗的改善，所述的重組病毒疫苗在體內(nèi)表達至少一種異源核苦酸序列，尤其是編碼抗原的核苷酸序列。本發(fā)明特別涉及這樣的重組病毒疫苗，其包含表達至少一種抗原的至少一種重組病毒疫苗和至少一種佐劑，其中所述的佐劑能夠相對于不含佐劑的相同重組病毒疫苗而言，顯著地增加針對所述抗原的免疫性，并且優(yōu)選地適用于這種類型的疫苗。本發(fā)明還涉及與該疫苗相關(guān)的接種方法。本申請人現(xiàn)在驚奇地發(fā)現(xiàn)某些咪唑并喹啉胺化合物在呈現(xiàn)強烈的抗病毒潛能的同時，能夠改善由重組病毒疫苗產(chǎn)生的針對由該重組的病毒載體所編碼的抗原的免疫應(yīng)答，并且更具體地對于基于重組痘病毒載體的疫苗，并且這是出乎意料的。本發(fā)明的主題因而是重組病毒疫苗，包含(i)至少一種重組的病毒載體，其在體內(nèi)表達至少一種異源核苷酸序列，尤其是編碼抗原的異源核苷^列，和(ii)至少一種1H-咪唑并[4,5-c喹啉-4-胺衍生物。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，施用該重組病毒疫苗至患者時，所述的1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物將增強該患者針對所述抗原的免疫應(yīng)答。如本文在整篇申請中所用，術(shù)語"一"和"一個，，意指"至少一種"、"至少第一個"、"一個或多個，，或"多個"所提及的化合物或步驟，除非上下文另外規(guī)定。例如，術(shù)語"一個細胞，，包括多個細胞，包括其混合物。更具體地，"至少一個"和"一個或多個"意指一或大于一的數(shù)字，特別優(yōu)選l、2或3。術(shù)語"和/或"無論在本文何處使用，包括"和"、"或"以及"通過該術(shù)語連接的元素的所有全部或任何組合，，的意思。術(shù)語"約"或"大致"如本文中所用，意指在給定值或范圍的20%內(nèi)、優(yōu)選在10%內(nèi)并且更優(yōu)選在5%內(nèi)。如本文中所用，術(shù)語"包含"、"含有"當用來定義產(chǎn)物、組分和方法時，意指所述的產(chǎn)物、組分和方法包括所提及的化合物或步驟，但不排除其它化合物或步驟。術(shù)語"患者"指脊推動物、尤其指哺乳動物物種的成員，并包括但不僅限于家畜、竟纟支動物、靈長類動物(包括人)。術(shù)語"患者"無論如何不限于特定疾病狀態(tài)，它包括已經(jīng)發(fā)生目標疾病的患者和沒有患病的患者。如本文中所用，術(shù)語"治療，，或"治療著，，包括預(yù)防和/或治療。因此，本發(fā)明的重組病毒疫苗不限于治療性用途，并且可以用于預(yù)防性用途。根據(jù)更為優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的重組病毒載體是痘病毒載體(見例:i口Cox等，在"VirusesinHumanGeneTherapy"編者J.M.Hos，CarolinaAcademicPress中)。根據(jù)另一優(yōu)選實施方案，它選自痘苗病毒，而合適的痘苗病毒包括但不限于哥本哈才沐(Copenhagenstrain)(Goebel等，1990，Virol.179，247-266和517-563;Johnson等,1993，Virol.196，381-401)、魏斯林(Wyethstrain)和由其衍生的高度減毒病毒，包括MVA(綜述見Mayr,A.等，1975，Infection3，6-14)以及衍生林(如MVA痘苗病毒株575(ECACCV00120707-US6,913,752)、NYVAC(見WO92/15672-Tartaglia等，1992，Virology,188，217-232)。它也可以獲自痘病毒科(poxviridae)的其它任何成員，尤其禽痘病毒(例如TROVAC，見Paoletti等，1995，DevBiolStand.,84，159-163);金絲雀痘病毒(例如ALVAC，WO95/27780,Paoletti等，1995，DevBiolStand.,84，159-163);鴿痘病毒；豬痘病毒等。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考W09215672(通過引用的方式并入)，該文獻描述基于痘病毒的表達載體的產(chǎn)生，其中所述的表達載體能夠表達這樣的異源核苷酸序列、尤其是編碼抗原的核苷酸序列。如本文中所用，術(shù)語"抗原"指能夠成為免疫應(yīng)答靶標的任何物質(zhì)。例標。術(shù)語"抗原"包括例如病毒性抗原、腫瘤特異性或相關(guān)抗原、細菌性抗原、寄生蟲抗原、變應(yīng)原等。-病毒性抗原例如包括來自曱型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒和戊型肝炎病毒、HIV、皰疹病毒、巨細胞病毒、水痘帶狀皰滲病毒、乳頭瘤病毒、埃巴病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、柯薩奇病毒、微RNA病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞體病毒、痘病毒、鼻病毒、風滲病毒、乳多空病毒、流行性腮腺炎病毒、麻滲病毒的抗原；已知病毒性抗原的一些非限制性實例包括衍生自HIV-1的抗原如tat、nef、gpl20或gp160、gp40、p24、gag、env、vif、vpr、vpu、rev或其部分和/或組合；衍生自人皰疹病毒的抗原如gH、gL、gM、gB、gC、gK、gE或gD或其部分和/或組合，或者來自HSV1或HSV2的立即早期蛋白，如ICP27、ICP47、ICP4、ICP36;衍生自巨細胞病毒、尤其人巨細胞病毒的抗原，如gB或其衍生物；衍生自埃巴病毒的抗原，如gp350或其衍生物；衍生自水痘帶狀皰滲病毒的抗原如gpl、11、111和IE63;衍生自肝炎病毒如乙型肝炎病毒、丙型肝炎或戊型肝炎病毒的抗原(如HCV的包膜蛋白E1或E2基因、核心蛋白、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b、p7或其部分和/或組合)；衍生自人乳頭瘤病毒的抗原(如HPV6、11、16、18、如L1、L2、El、E2、E3、E4、E5、E6、E7或部分和/或其組合)；衍生自其它病毒性病原體如呼吸道合胞體病毒(例如F和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻滲病毒、膽、腺炎病毒、黃病毒(如黃熱病病毒、登革熱病毒、蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病毒)或流感病毒細胞(如HA、NP、NA或M蛋白或其部分和/或組合)的抗原；-肺瘤特異性或相關(guān)性抗原例如包括來自乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、頭頸癌、腎癌、惡性黑素瘤、喉癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌的抗原。癌抗原是可以潛在刺激明顯的腫瘤特異性免疫應(yīng)答的抗原。這些抗原中的一些抗原由正常細胞編碼，盡管實際上不必由正常細胞表達。這些抗原可以表征為正常細胞中通常沉默(即不表達)的那些抗原及僅在分化的特定階段表達的那些抗原以及短暫表達的那些抗原如胚抗原和胎抗原。其它癌抗原由突變的細胞基因如癌基因(如活化的ras癌基因)、抑制基因(例如突變的p53)編碼、因內(nèi)部缺失或染色體易位產(chǎn)生的融合蛋白。其它的癌抗原可以由病毒基因(如在RNA和DNA腫瘤病毒上攜帶的那些基因)編碼。腫瘤特異性或相關(guān)性抗原的一些非限制性實例包括MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脫氨酶結(jié)合蛋白(ADAbp)、親環(huán)蛋白b、直結(jié)腸癌相關(guān)抗原(CRC)-CO17-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-l和CAP-2、etv6、amll、前列腺特異性抗原(PSA)及其免疫原性表位(PSA-1、PSA-2和PSA-3)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、T細胞受體/CD3-;鏈、瘤抗原MAGE家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE陽A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、瘤抗原GAGE家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE國3、GAGE誦4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE畫8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-I、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族(例如MUC-1)、HER2/neu、p21ras基因、RCAS1、曱胎蛋白、E-鈣黏著蛋白、a-聯(lián)蛋白、p-聯(lián)蛋白、Y-聯(lián)蛋白、pl20ctn、gplOO.sup.Pme1117、PRAME、NY國ESO-l、cdc27、腺瘤性結(jié)腸息肉蛋白(APC)、胞襯蛋白、連接蛋白37、Ig-獨特型、p15、gp75、GM2和GD2神經(jīng)節(jié)苷酯、病毒產(chǎn)物如人乳頭瘤病毒蛋白、肺瘤抗原的Smad家族、lmp-l、P1A、EBV編碼的核抗原(EBNA)-1、腦糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM畫MEL-40)、SSX國1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、和c-erbB誦2;-細菌性抗原例如包括來自可導(dǎo)致TB和麻風病的分枝桿菌屬(Mycobacteria)的抗原、肺炎球菌(pneumocci)、需氧革蘭氏陰性芽孢桿菌、支原體(mycoplasma)、葡萄球菌感染、鏈球菌性感染、沙門氏菌(salmonellae)、衣原體(chlamydiae)、奈瑟氏菌(neisseriae);-其它的抗原例如包括來自瘧疾、利什曼病、錐蟲病、弓形體病、血吸蟲病、絲蟲病的抗原；-變應(yīng)原指可以在易感受試者中誘導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)或哮喘反應(yīng)的物質(zhì)。變應(yīng)原的名單是眾多的并且可以包括花粉、昆蟲毒液、動物毛發(fā)粉塵、真菌孢子和藥物(如青霉素)。天然的動物及植物變應(yīng)原的實例包括但不限于對下列種屬為特異的蛋白質(zhì)犬屬(Canine)(家犬(Canisfamiliaris));塵螨屬(Dermatophagoides)(例如粉塵竭(Dermatophagoidesfa,rinae));貓屬(Fdis)(家貓(Felisdomesticus));豚草屬(Ambrosia)(美洲豚草(Ambrosiaartemiisfolia));黑麥草屬(Lolium)(如黑麥草(Loliumperenne)或多花黑麥草(Loliummultiflorum));柳杉(Cryptomeria)(日本柳杉(Cryptomeriajaponica));鏈格孢屬(Alternaria)(鏈格孢菌(Alternariaalternata));Aider;14Alnus(Alnusgultinoasa);樺木屬(Betula)(瘤樺(Betulaverrucosa));櫟屬(Quercus)(白橡(Quercusalba));木犀欖屬(Olea)(橄欖樹(Oleaeuropa));Artemisia(Artemisiavulgaris);車前屬(Plantago)(i口長葉車前(Plantagolanceolata));墻草屬(Parietaria)(如弱墻草(Parietariaofficinalis)或Parietariajudaica);Blattella(如Blattellagermanicd);Apis(如Apismultiflorum);柏木屬(Cupressus)(如地中海柏(Cupressussempervirens)、,錄干柏(Cupressusarizonica)和大果才6(Cupressusmacrocarpa));刺柏屬(Juniperus)(如Juniperussabinoides，弗吉尼亞檢(Juniperusvirginiana)、歐洲刺柏(Juniperuscommunis)和Juniperusashd);金鐘柏(Thuya)(如側(cè)柏(Thuyaorientalis));扁柏屬(Chamaecyparis)(長口日本扁柏(Chamaecyparisobtusa));大嫌屬(Periplaneta)(如美國大嫌(Periplanetaamericana));冰草屬(Agropyron)(如冰草(Agropyronrepens));黑麥屬(Secale)(如黑麥(Secalecereale));小麥屬(Triticum)(如小麥(Triticumaestivum));鴨茅屬(Dactylis)(如鴨茅(Dactylisglomerata));狐茅屬(Festuca)(如高狐茅(Festucaelatior));早熟禾屬(Poa)(如早熟禾(Poapratensis)或力口拿大早熟禾(Poacompressa));東麥屬(Avena)(:i口燕麥(Avenasativa));絨毛草屬(Holcus)(如絨毛草(Holcuslanatus));黃花茅屬(Anthoxanthum)(如曰本黃花茅(Anthoxanthumodoratum));燕麥草屬(Arrhenatherum)(如燕麥草(Arrhenatherumelatius));剪股潁屬(Agrostis)(如小糠草(Agrostisalba));貓尾草屬(Phleum)(如梯牧草(Phleumpratense));萌草屬(Phalaris)(如草蘆(Phalarisarundinacea));雀稗屬(Paspalum)(如百喜草(Paspalumnotatum));高粱屬(Sorghum)(如假高粱(Sorghumhalepensis));和雀麥屬(Bronms)(如無芒雀麥(Bromusinermis)。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的異源核苷酸序列編碼一種或多種的完整或部分的下列抗原HBV-PreSlPreS2抗原以;Mw面env蛋白、核心以及polHIV-gpl20gp40、gpl60、p24、gag、pol、env、vif、vpr、vpu、tat、rev、nef;HPV-E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、Ll、L2(例如見WO卯/10459、WO98/04705、WO99/03885);HCVenv蛋白El或E2、核心蛋白、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b、p7;Muc-l(例如見US5,861,381;US6，054，438;WO98/04727;WO98/37095)。編碼抗原的核酸有效地連接至指導(dǎo)所述抗原核酸在真核細胞中表達的基因表達序列。該基因表達序列是任何調(diào)節(jié)性核苷酸序列，如啟動子序列或啟動子-增強子組合，所述的序列促進高效地轉(zhuǎn)錄并翻譯與該序列有效連接的抗原核酸。此基因表達序列例如可以是哺乳動物或病毒啟動子(如組成型或誘導(dǎo)型啟動子)。組成型哺乳動物啟動子包括但不限于下列基因的啟動子次黃噤呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)、腺苷脫氨酶、丙酮酸激酶、b-肌動蛋白啟動子和其它組成型啟動子。在真核細胞中組成型地發(fā)揮作用的示例性病毒啟動子例如包括來自巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒(例如SV40)、乳頭瘤病毒、腺病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、勞斯肉瘤病毒、巨細胞病毒的啟動子、莫洛尼白血病病毒及其它逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)序列(LTR)以及單純皰滲病毒的胸苷激酶啟動子。其它組成型啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。用作本發(fā)明的基因表達序列的啟動子也包括誘導(dǎo)型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子在誘導(dǎo)物存在時表達。例如，金屬硫蛋白啟動子在特定的金屬離子存在時受到誘導(dǎo)以促進轉(zhuǎn)錄和翻譯。通常，基因表達序列應(yīng)當根據(jù)需要包括分別參與啟動轉(zhuǎn)錄和翻譯的5'非轉(zhuǎn)錄序列及5'非翻譯序列，如TATA盒子，加帽序列，CAAT序列等。尤其，此類5'非轉(zhuǎn)錄序列包括啟動子區(qū)，所述啟動子區(qū)包括用以調(diào)控有效連接的抗原核酸轉(zhuǎn)錄的啟動子序列。所述基因表達序列任選地包括如所述的增強子序列或上游激活因子序列。用在痘病毒載體(見下文)中的優(yōu)選啟動子包括但不限于痘苗病毒啟動子7,5K、H5R、TK、p28、pll和K1L、早期及晚期痘病毒啟動子之間的嵌合啟動子及合成啟動子，如在Chakrabarti等(1997，Biotechniques23,1094-1097)、Hammond等(1997，J.VirologicalMethods66，135-138)以及Kumar和Boyle(1990，Virology179，151-158)中描述的那些啟動子。才艮據(jù)另一個具體實施方案，所述的本發(fā)明異源核苷酸序列編碼了HPV抗原的全部或部分，其中所述的HPV抗原選自HPV的E6早期編碼區(qū)、16HPV的E7早期編碼區(qū)及其衍生物或組合。由本發(fā)明的重組病毒載體編碼的HPV抗原選自HPVE6多肽、HPVE7多肽或者HPVE6多肽及HPVE7多肽這兩者。本發(fā)明包括使用與p53的結(jié)合作用受到改變或至少明顯降低的任何HPVE6多肽，和/或使用與Rb的結(jié)合作用受到改變或至少明顯降低的任何HPVE7多肽(Munger等，1989，EMBOJ.8,4099-4105;Crook等，1991,Cell67，547-556;Heck等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89，4442-4446;Phelps等，1992，J.Virol.66，2148-2427)。適用于本發(fā)明目的的非致癌性HPV-16E6變體缺失了位于約第118位置-約第122位置的一個或多個氨基酸殘基(+l代表天然HPV-16E6多肽的第1個曱硫氨酸殘基)，特別優(yōu)選完全缺失第118畫第122位殘基(CPEEK)。適用于本發(fā)明目的的非致癌性HPV-16E7變體缺失了位于約第21位置-約第26位置的一個或多個氨基酸殘基(+l代表天然HPV-16E7多肽的笫1個氨基酸)，特別優(yōu)選完全缺失第21-第26位殘基(DLYCYE)。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，進一步修飾用在本發(fā)明中的一種或多種HPV-16早期多肽，從而改善MHCI型和/或MHCII型呈遞，和/或從而刺激抗HPV的免疫性。HPVE6和E7多肽是核蛋白并且在先前已經(jīng)證明了膜呈遞作用允許了改善其治療效果(例如見WO99/03885)。因此，可以建議修飾至少一種HPV早期多肽，從而使其錨定至細胞膜?？梢酝ㄟ^如此方式輕易地實現(xiàn)膜錨定，即通過在所述HPV早期多肽中摻入膜錨定序列和摻入(若此天然多肽缺少的話)分泌序列即信號肽序列。膜錨定序列和分泌序列是本領(lǐng)域已知的。簡而言之，分泌序列出現(xiàn)在膜呈遞或分泌的多肽的N端處并且啟動所述多肽進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。分泌序列通常包含15至35個實質(zhì)上疏水的氨基酸，其中所迷的疏水性氨基酸由位于ER的特異性內(nèi)肽酶切除以產(chǎn)生成熟多肽。膜錨定序列通常在本質(zhì)上高度疏水并且起到孑吏多肽錨定于細胞膜內(nèi)的作用(例如見Branden和Tooze，1991，在IntroductiontoProteinStructure第202-214頁，NYGarland)。對本發(fā)明上下文中可以使用的膜錨定序列和分泌序列的選擇是廣泛的。它們可以取自包含該序列的任何膜錨定多肽和/或分泌多肽(如細胞多肽或病毒多肽)，如狂犬病毒糖蛋白，HIV病毒包膜糖蛋白多肽或麻滲病毒F蛋白質(zhì)多肽或者可以是合成性多肽。在根據(jù)本發(fā)明所用的每種早期HPV-16多肽中插入的膜錨定和/或分泌序列可以具有共同或不同起源。插入分泌序列的優(yōu)選位點是用于啟動翻譯的密碼子下游區(qū)的氨基端并且插入膜錨定序列的優(yōu)選位點是羧基端，例如緊靠終止密碼子上游。用在本發(fā)明中的HPVE6多肽優(yōu)選地通過插入麻瘆病毒F蛋白的分泌及膜錨定信號加以修飾。任選地或組合地，用在本發(fā)明中的HPVE7多肽優(yōu)選地通過插入狂犬病毒糖蛋白的分泌及膜錨定信號加以^f飾。重組病毒載體的治療效果也可以通過使用編碼免疫增強多肽的一種或多種核酸改善。例如，有利的是將HPV早期多肽連接至多肽如鈣網(wǎng)蛋白(Cheng等，2001，丄Clin.Invest.108，669-678)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)熱休克蛋白70(HSP70)(Chen等，2000，CancerRes.,1035-1042)、遍在蛋白(Rodriguez等1997,J.Virol.71，8497-8503)或連接至細菌毒素(如綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素a的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(eta(dIII))(Hung等2001CancerRes.61,3698-3703)。根據(jù)另一個且優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的重組病毒載體包含這樣的核酸，其編碼如上所定義的一種或多種早期多肽，并且更具體地是HPV-16和/或HPV-18早期E6多肽和/或E7多肽。根據(jù)另一具體實施方案，本發(fā)明所述異源核苷酸序列編碼MUC1抗原或其衍生物的全部或部分。根據(jù)需要，可以優(yōu)化用在本發(fā)明中的核酸分子以使得所述抗原(如HPV早期多肽)在特定宿主細胞或生物(如人類宿主細胞或生物)中高水平地表達。通常，密碼子優(yōu)化通過如此方式進行，即替換與哺乳動物宿主細胞中不常用密碼子相對應(yīng)的一個或多個"天然"(如HPV)密碼子為編碼相同氨基酸的更頻繁使用的一個或多個密碼子。這可以通過常規(guī)誘變法或通過化學(xué)合成技術(shù)(如產(chǎn)生合成性核酸)實現(xiàn)。不需要替換與不常用密碼子相對應(yīng)的全部天然密碼子，因為即便部分替換也可以實現(xiàn)增加的表達。此外，可以18某種程度地不嚴格遵循優(yōu)化密碼子使用頻率以容許導(dǎo)入限制性位點。如上所迷，痘病毒載體是優(yōu)選的，并且更具體地是高度減毒的痘苗病毒林。對MVA基因組全序列的測定以及與哥本哈根痘苗病毒基因組的比較已經(jīng)允許精確地確定MVA基因組中出現(xiàn)的7處缺失(I-VII)(Antoine等.1998，Virology244，365-396)，其中任意一個缺失可以用于插入編碼所述抗原(如HPV早期多肽或MUC1)的核酸。相關(guān)調(diào)控元件的基本技術(shù)，其中所述的相關(guān)調(diào)控元件是對于痘病毒基因組中的表達所必需的(Paul等，2002，CancergeneTher.9，470-477;Piccini等，1987，MethodsofEnzymology153，545-563;US4,769,330;US4,772,848;US4,603,112;US5,100,587和US5,179,993)。通常，一項技術(shù)通過在病毒基因組及攜帶待插入核酸的質(zhì)粒中均存在的重疊序列之間(即所預(yù)期插入位點間)的同源重組而進行。編碼本發(fā)明抗原的核酸優(yōu)選地插入痘病毒基因組的非必需基因座，以便重組痘病毒仍保持活力和感染性。非必需區(qū)是非編碼性基因間區(qū)或使其失活或缺失不顯著地損害病毒生長、復(fù)制或感染的任何基因。也可以構(gòu)思在病毒必需基因座內(nèi)的插入，條件是在病毒粒子產(chǎn)生期間反式地提供了缺損的功能，例如通過使用攜帶與痘病毒基因組中所缺失的那些序列相對應(yīng)的互補性序列的輔助細胞系而做到這一點。當使用哥本哈根痘苗病毒林時，編碼抗原的核酸優(yōu)選地插入胸苷激酶基因(tk)(Hruby等，Proc.Natl.Acad.SciUSA80，3411-3415;Weir等1983，1983,J.Virol.46，530-537)。然而，其它插入位點也是合適的，如血凝素基因中(Guo等，1989，J.Virol.63，4189-4198)、在KIL基因座中、在u基因中(Zhou等1990，J.Gen.Virol.71，2185-2190)或在痘苗病毒林基因組的左側(cè)末端處，其中文獻中已經(jīng)報道了在所述左側(cè)末端處的多種自發(fā)性或工程化缺失(Altenburger等1989，ArchivesVirol.105,15-27;Moss等1981，J.Virol.40，387-395;Panicali等1981，J.Virol.37，1000-1010;Perkus等，1989，J.Virol.63,3829-3836;Perkus等，1990，Virol.179,276-286;Perkus等，1991，Virol.180，406-410).當使用MVA時，編碼抗原的核酸可以在已鑒定的缺失I至VII的任一處以及在D4R基因座中插入，然而優(yōu)選在缺失II或III中插入(Meyer等，1991，J.Gen.Virol.72，1031-1038;Sutter等，1994，Vaccine12，1032-1040)。當使用禽痘病毒時，雖然可以考慮在胸苷激酶基因中的插入，然而編碼抗原的核酸優(yōu)選地導(dǎo)入位于ORF7-9之間的基因間區(qū)域(例如見EP314569和US5,180,675)。優(yōu)選地，用在本發(fā)明中的編碼抗原的核酸處于合適于該核酸在宿主細胞或生物中表達的形式，這意指編碼所述抗原(如E6多肽和/或核酸序列編碼的E7多肽)的核酸序列置于對宿主細胞或生物中的表達所必需的一種或多種調(diào)控序列控制下。如本文中所用，術(shù)語"調(diào)控序列"指任何序列，其允許、有助于或調(diào)節(jié)一種核酸在特定宿主細胞中表達，包括復(fù)制、重復(fù)、轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯、穩(wěn)定化所述核酸或其衍生物之一(即mRNA)和/或使其轉(zhuǎn)運至宿主細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解選擇調(diào)控序列可以取決于一些因素，例如宿主細胞、載體以及所希望的表達水平。啟動子是特別重要的并且本發(fā)明包括指導(dǎo)核酸在眾多類型宿主細胞中表達的組成型啟動子以及指導(dǎo)核酸僅在特定宿主細胞中或僅在應(yīng)答特定事件或外源因素(如溫度、營養(yǎng)添加物、激素或其它配體)時表達的那些組成型啟動子的用途。在文獻中廣泛地描述了適宜啟動子并且可以更具體提及病毒啟動子(例如RSV、SV40、CMV和MLP啟動子)。在痘病毒載體(見下文)中的優(yōu)選啟動子包括但不限于痘苗病毒啟動子7.5K、H5R、TK、p28、pll和K1L、早期及晚期痘病毒啟動子之間的嵌合啟動子及合成啟動子，如在Chakrabarti等(1997，Biotechniques23，1094-1097)、Hammond等(1997，J.VirologicalMethods66,135-138)以及Kumar和Boyle(l990'Virology179，151-158)中描述的那些啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解控制本發(fā)明核酸分子表達的調(diào)控元件也可以包含用于在宿主細胞或生物中正確啟動、調(diào)控和/或終止轉(zhuǎn)錄(如聚腺苷酸化終止序列)、mRNA運輸(如核定位信號序列)、加工(如剪接信號)及穩(wěn)定性(如內(nèi)含子和非編碼性5'和3'序列)、翻譯(如肽信號、前肽、三聯(lián)前導(dǎo)序列、核糖體結(jié)合位點、SD序列等)的其它元件。備選地，用在本發(fā)明中的重組病毒載體也可包含編碼至少一種細胞因子的至少一種核酸。合適的細胞因子包括但不限于IL-2，IL-7，IL-15，IL-18,IL-21和IFNg，特別優(yōu)選IL-2。當本發(fā)明的重組病毒疫苗包含表達細胞因子的核酸時，所述的核酸可以由編碼一種或多種HPV早期多肽的重組病毒載體攜帶或由相同或不同來源的獨立重組載體攜帶。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案涉及包含MVA載體的重組病毒疫苗的用途，其中所述的MVA載體編碼置于7.5K啟動子控制下的HPVE6多肽、置于7.5K啟動子控制下的HPVE7多肽和置于H5R啟動子控制下的人IL-2基因。優(yōu)選地，編碼HPVE6多肽、HPVE7多肽和人IL-2的核酸插入MVA基因組的缺失III區(qū)。本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案涉及包含MVA載體的重組病毒疫苗的用途，其中所述的MVA栽體編碼置于7.5K啟動子控制下的MUC1多肽和置于H5R啟動子控制下的人IL-2基因。包含上述重組病毒載體的感染性病毒粒子可以通過常規(guī)方法產(chǎn)生。示例性方法包括下列步驟。a.將所述病毒載體導(dǎo)入合適的細胞林，b.在適宜的條件下培養(yǎng)該細胞林以便允許產(chǎn)生所述的感染性病毒粒子，c.從所述細胞系的培養(yǎng)物中回收產(chǎn)生的感染性病毒粒子，并且d.任選地純化所述回收的感染性病毒粒子。適用于增殖痘病毒載體的細胞是禽細胞，并且最為優(yōu)選是從受精卵獲得的雞胚中制備的原代雞胚成纖維細胞(CEF)。感染性病毒粒子可以從培養(yǎng)上清液或從裂解(如通過化學(xué)方法、凍/融法、滲壓休克、機械性休克、超聲法等)后的細胞回收。病毒粒子可以通過連續(xù)多輪的噬斑純化法分離并且隨后使用本領(lǐng)域技術(shù)(色譜法、在氯化銫或21蔗糖梯度上超速離心法)純化。根據(jù)另一實施方案，本發(fā)明的lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物是由下列通式I-V定義的化合物之一或其類似物、溶劑化物或鹽，其中Ru選自直鏈或支鏈烷基、輕烷基、酰氧基烷基、千基、(苯基)乙基和苯基，所述的芐基、(苯基)乙基或苯基取代基任選在苯環(huán)上由彼此獨立地選自d—4烷基部分、d-4烷氧基部分和卣素的一個或兩個部分取代，條件是如果所述苯環(huán)由所述部分中的兩個取代，則所述的部分合起來含有不多于6個碳原子；Ru選自氬、d—8烷基部分、節(jié)基、(苯基)乙基和苯基，所述芐基、(苯基)乙基或苯基取代基任選在苯環(huán)上由彼此獨立地選自d-4烷基部分、C!-4烷氧基部分和卣素的一個或兩個部分取代，條件是當苯環(huán)由所述部分中的兩個取代時，則所述部分合起來含有不多于6個碳原子；并且每一Ri彼此獨立地選自氫、Cw烷氧基部分、卣素和Cr4烷基部分，并且n是0-2的整數(shù)，條件是如果n是2、則所述&基團合起來包含不多于6個碳原子；或其類似物、溶劑化物或鹽，其中Ru選自直鏈或支鏈Cw。鏈烯基和取代的直鏈或支鏈Cwe鏈烯基，其中所述取代基選自直鏈或支鏈CL4烷基部分和C^環(huán)烷基部分；和由直鏈或支鏈Cw烷基部分取代的C3—6環(huán)烷基部分；并且R22選自氬、直鏈或支鏈d-s烷基部分、芐基、(苯基)乙基和苯基、所述千基、(苯基)乙基或苯基取代基任選地在苯環(huán)上由彼此獨立地選自直鏈或支鏈Ci—4烷基部分、直鏈或支鏈C"烷氧基部分和囟素的一個或兩個部分取代，條件是當苯環(huán)由兩個這樣的部分取代時，則所述部分合起來含有不多于6個碳原子；并且每一R2彼此獨立地選自直鏈或支鏈Q-4烷氧基部分、卣素和直鏈或支鏈Cw烷基部分，并且n是0-2的整數(shù)，條件是如果n是2，則所述R2基團合起來含有不多于6個碳原子；)或其類似物、溶劑化物或鹽，其中R23選自氬、直鏈或支鏈d.s烷基部分、節(jié)基、(苯基)乙基和苯基，所述芐基、(苯基)乙基或苯基取代基任選地在苯環(huán)上由彼此獨立地選自直鏈或支鏈CM烷基部分、直鏈或支鏈C"烷氧基部分和卣素的一個或兩個部分取代，條件是當苯環(huán)由兩個這樣的部分取代時，則所述部分合起來含有不多于6個碳原子；并且每一R3彼此獨立地選自直鏈或支鏈C^4烷氧基部分、卣素和直鏈或支鏈d-4烷基部分，并且n是0-2的整數(shù)，條件是如果n是2，則所述R3基團合起來含有不多于6個碳原子。IV-或其類似物、溶劑化物或鹽，其中R"是-CHR34R44,其中R"是氫或碳-碳鍵，^f牛是當R"是氫時，則R34是C!-4烷氧基部分、Cw羥基烷氧基部分、Cw。l-炔基部分、四氫吡喃基、其中烷氧基部分含有1-4個碳原子和烷基部分含有1-4個碳原子的垸氧基烷基、2-、3-或4-吡咬基，并且進一步的條件是當R"是碳-碳鍵時，則R44與R34共同形成了任選地用彼此獨立地選自羥基和C!—4羥烷基部分的一個或多個取代基取代的四氫呋喃基；R24選自氫、C,-4烷基、苯基，其中所述的苯基任選地由彼此獨立地選自直鏈或支鏈Cw烷基部分、直鏈或支鏈Cw烷氧基部分和卣素的一個或兩個部分取代；并且R4選自氫、直鏈或支鏈Cw烷氧基部分、卣素和直鏈或支鏈C烷基部分；或其類似物、溶劑化物或鹽，其中Rjs選自氬；直鏈或支鏈Cwo烷基部分和取代的直鏈或支鏈Cwo烷基部分，其中所述的取代基選自C3.6環(huán)烷基和由直鏈或支鏈d-4烷基部分取代的<:3-6環(huán)烷基；直鏈或支鏈Cwo鏈烯基和取代的直鏈或支鏈Cwo鏈烯基部分，其中所述的取代基選自C^環(huán)烷基和由直鏈或支鏈d-4烷基部分取代的(:3.6環(huán)烷基；C^羥烷基；其中烷氧基部分含有1個至約4個碳原子和烷基部分含有1個至約6個碳原子的烷氧基烷基；酰氧基烷基，其中酰氧基部分是2個至約4個碳原子的烷酰氧基或苯曱酰氧基，并且烷基部分含有1個至約6個碳原子；節(jié)基；(苯基)乙基和苯基；所述的芐基、(苯基)乙基或苯基取代基任選在苯環(huán)上由彼此獨立地選自d-4烷基部分、Cw烷氧基部分和卣素的一個或兩個部分取代，條件是當所述苯環(huán)由所述部分中的兩個取代時，則所述部分合起來含有不多于6個碳原子；R25是其中R35選自Cw烷氧基部分、其中烷氧基部分含有1個至約4個碳原子和烷基部分含有1個至約4個碳原子的烷氧基烷基；d-4卣代烷基部分；其中烷基含有1個至約4個碳原子的烷基酰胺基；氨基；用d—4烷基或羥烷基取代的氨基；疊氮基；Cw烷硫基；Rss和R4s彼此獨立地選自氫、d—4烷基部分、苯基，其中所述的苯基任選由彼此獨立地選自直鏈或支鏈d，4烷基部分、直鏈或支鏈C"烷氧基部分和卣素的一個或兩個部分取代；并且Rs選自氫、直鏈或支鏈C^烷氧基部分、卣素和含有直鏈或支鏈Cw烷基的部分。根據(jù)具體實施方案，4烷基部分例如是曱基、乙基、丙基、2-曱基丙基和丁基。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，C,—4烷基部分選自曱基、乙基和2-甲基丙基。根據(jù)具體實施方案，烷氧基部分選自甲氧基、乙氧基和乙氧甲基。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，n是O或l。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，RrRs基團是氫。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，R『Ri5基團選自2-甲基丙基和2-羥基-2-甲基丙基。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，1121-1125基團選自氫、Cw烷基部分、其中烷氧基部分含有i個至約4個碳原子和烷基部分含有1個至約4個碳原子的烷氧基烷基。最優(yōu)選的R2,-R25基團選自氫、甲基或乙氧曱基。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的1H-咪唑并[4，5-cl喹啉-4-胺衍生物是由下列通式VI定義的化合物或其類似物、溶劑化物或鹽，其中Rt選自氬、直鏈或支鏈C,，4烷氧基部分、卣素和直鏈或支鏈d，4烷基；Ru是2-甲基丙基或2-羥基-2-曱基丙基；并且Rv是氫、Q—6烷基、或其中烷氧基部分含有1個至約4個碳原子和烷基部分含有l(wèi)個至約4個碳原子的烷氧基烷基。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，在式VI中，Rt是氫，議11是2-曱基丙基或2-羥基-2-甲基丙基，并且Rv是氫、甲基或乙氧甲基。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的lH-咪唑并4，5-cj喹啉-4-胺衍生物是選自以下的化合物l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-cj查啉-4-胺(式VI化合物，其中Rt是氫，Ru是2-甲基丙基并且Rv是氫)；l-(2-羥基-2-曱基丙基)-2-甲基-lH-咪唑并4，5-c喹啉-4-胺(式VI化合物，其中Rt是氫，Ru是2-羥基-2-甲基丙基并且Rv是甲基)；l-(2-羥基-2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c喹啉-4-胺(式VI化合物，其中Rt是氫，Ru是2-羥基-2-甲基丙基并且Rv是氫)；1-(2-羥基-2-甲基丙基)-2-乙氧曱基-lH-咪唑并[4，5-c喹啉-4-胺(式VI化合物，其中Rt是氫，Ru是2-羥基-2-甲基丙基并且Rv是乙氧曱基)；或其類似物、溶劑化物或鹽。本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考如US4.689.338，US4.929.624,EP0385630或WO94/17043(在此并入?yún)⒖?，其中所述的文獻描述了上述化合物及用于其制備的方法。更具體地，已經(jīng)廣泛公開了l-(2-曱基丙基)-lH-咪唑并4，5-c]喹啉-4-胺(又稱作術(shù)語咪壹莫特(imiquimod)或艾達樂(Aldara))，可以參考Buck，1998,Infect.Dis.Obstet.Gynecol.,6，49-51;Dockrell和Kinghorn,2001，J.Antimicrob.Chemother.,48，751-755或Garland,2003，Curr.Opin,Infect.Dis.，16，85-89;l-(2-羥基-2-甲基丙基)-2-曱基-lH-咪唑并[4，5-cj喹啉-4-胺和l-(2-羥基-2-曱基丙基)-lH-咪唑并4，5-c]喹啉-4-胺已經(jīng)在US2004/0076633中公開，并且l-(2-羥基-2-甲基丙基)-2-乙氧甲基-l-H-咪唑并[4,5-c喹啉-4-胺(又稱作術(shù)語瑞喹莫特(resiquimod))在Dockrell和Kinghorn,2001，J,Antimicrob.Chemother.48，751-755或Jones,Curr.Opin.lnvestig.Drugs.,2003，4，214-218中公開。除非另外說明，對1H-咪唑并[4，5-c喹啉-4-胺衍生物的指稱可以包括處于任何可藥用形式下的化合物，包括任何異構(gòu)體(例如非對映體或?qū)τ钞悩?gòu)體)、鹽、溶劑化物、多晶型物等尤其，若化合物有光學(xué)活性，則對該化合物的指稱包括該化合物的每一種對映體以及所述對映體的消旋混合物。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，重組病毒疫苗并且尤其重組的病毒載體不包含本身誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫刺激性基序或主鏈，尤其不包含具備免疫刺激性基序或主鏈的核苷^列，如CpG、polyG、polyT、TG、曱基化CpG、Cpl以及T豐富基序或硫代磷酸酯骨架(見US2003/0139364、US6,207,646或WO01/22972，所述專利的內(nèi)容通過引用的方式并入本文中)。根據(jù)一個實施方案，在最終重組病毒疫苗中的111-咪唑并[4，5《喹啉-4-胺衍生物濃度將是約0.0001%-約10%(除非另外說明，本文所提供的百分比是相對總制劑的重量/重量比值)，約0.01%-約2%,更具體地約0.06-約1%,優(yōu)選約0.1-約0.6%。根據(jù)另一個實施方案，重組病毒載體的適宜劑量可以根據(jù)各種參數(shù)而變化，所述參數(shù)尤其是施用模式；所使用的組合物；宿主生物的年齡、健康狀況及重量；癥狀的本質(zhì)和程度；并行治療的類型；治療頻率和/或?qū)︻A(yù)防或治療的需求。對計算的進一步改進由開業(yè)醫(yī)生根據(jù)相關(guān)情況例行地進行，其中所迷的改進是確定用于治療的適宜劑量所必需的。就一般指導(dǎo)而言，用于含有MVA的組合物的適宜劑量是約104-10"pfu(蝕斑形成單位)，希望地是約105-108pfu，而包含腺病毒的組合物是約105-10"iu(感染單位)，希望地是約107-1012iu。基于載體質(zhì)粒的組合物可以按10照-20mg、有利地100ng-2mg劑量施用。優(yōu)選地，所述組合物可以以包含5xl()5pfu至5xl07pfuMVA痘苗病毒載體的劑量施用。給藥方案可以至少部分地取決于本領(lǐng)域已知的眾多因素，所述因素包括但不限于所用咪唑并[4，5-c全啉-4-胺衍生物和重組病毒載體(vector)的性質(zhì)、載體(carrier)的性質(zhì)、施用的咪唑并[4，5-c全啉-4-胺衍生物和重組病毒栽體的量、受試者的免疫系統(tǒng)狀態(tài)(例如受抑制的、受損的、受刺激的)以及施用咪唑并[4，5-c]會啉-4-胺衍生物和/或重組病毒載體組合物的方法。因而，一般地描述有效增強重組病毒疫苗效力的針對全部可能應(yīng)用的給藥方案是不現(xiàn)實的。然而，在適當考慮這類因素時，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以輕易地確定適宜的給藥方案。在本發(fā)明的一些實施方案中，咪唑并[4，5-c喹啉-4-胺衍生物和/或重組的病毒載體化合物例如可以按照約一日一次至約一次施用，盡管咪唑并[4，5-c會啉-4-胺衍生物和/或重組的病毒載體化合物在一些實施方案中的施用可以按照這一范圍之外的頻率施用。在某些特定實施方案中，咪唑并[4，5-cl查啉-4-胺衍生物和/或重組的病毒載體化合物可以按照每周約一次至每天約一次施用。在一個具體實施方案中，咪唑并4，5-c喹啉-4-胺衍生物和/或重組的病毒載體化合物按每隔一周一次施用。希望咪唑并[4,5-c壹啉-4-胺衍生物和重組的病毒載體以周間隔方式施用1-10次。優(yōu)選地，咪唑并[4，5-c會啉-4-胺衍生物和重組的病毒載體，或包含它們的任何組合物通過皮下途徑以周間隔方式施用3次。在又一方面，本發(fā)明提供了增加患者中針對抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括順次或同時施用(i)重組的病毒載體，所述重組的病毒載體在體內(nèi)至少表達一種異源核苷酸序列，尤其是編碼抗原的異源核苷酸序列，和(ii)咪唑并[4，5-cl奮啉-4-胺衍生物。在另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防患者中癌癥發(fā)生和/或治療癌癥的方法，所述的方法包括順次或同時施用(i)重組的病毒載體，所述重組的病毒載體在體內(nèi)至少表達一種異源核苷酸序列，尤其是編碼抗原的異源核苷酸序列，和(ii)咪唑并4，5-c喹啉-4-胺衍生物。在另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防患者中傳染病發(fā)生和/或治療該傳染病的方法，所述方法包括順次或同時施用(i)重組的病毒載體，所述重組的病毒栽體在體內(nèi)至少表達一種異源核苷酸序列，尤其是編碼抗原的異源核苷酸序列，和(ii)咪唑并[4，5-cl喹啉-4-胺衍生物。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，所述的傳染病是病毒誘導(dǎo)的疾病，例如由HIV、HCV、HBV、HPV等誘導(dǎo)的疾病。在又一實施方案中，提供了咪唑并[4，5-c]喹啉-胺衍生物的用途，用于制造重組病毒疫苗以增強針對由該重組的病毒載體編碼的抗原的免疫應(yīng)答，所述的重組的病毒載體與所述衍生物順次或同時地施用。"順次施用"意指相互獨立地施用本發(fā)明的重組病毒疫苗[化合物(i)]和咪唑并[4，5-cl壹啉-胺衍生物[化合物(ii)；例如，所述化合物之一的第一施用和在于施用所述第二化合物的獨立的第二施用。根據(jù)本發(fā)明，笫一施用可以在第二施用之前、同時或之后進行，并且反之亦然。治療性組合物施用和第二施用可以通過不同或相同的遞送途徑進行(例如全身遞送和靶向性遞送，或靶向性遞送)。在優(yōu)選的實施方案中，每種遞送途徑應(yīng)當遞送至相同的靶組織并且最優(yōu)選地通過腸胃外途徑。在優(yōu)選的實施方案中，重組的病毒載體和咪唑并[4，5-cl喹啉-4-胺衍生物的施用基本上是同時的。并且更為優(yōu)選地，兩種化合物進行共施用。在另一實施方案中，咪唑并[4，5-cl會啉-4-胺衍生物在所述重組病毒載體的施用之前施用。在這個具體實施方案中，"之前"意指約5分鐘-約2周、更具體地是約1小時-約1周，具體地是約6小時-約48小時。本發(fā)明的重組病毒疫苗作為可藥用的溶液施用至患者，所述溶液可以例行地含有可藥用濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、可相容性載體、佐劑(如明礬、BCG、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑)和任選地其它治療性成分。術(shù)語"可藥用的載體，，意指合適的施用至人或其他脊推動物的一種或多種可相容性固體或液體填充劑、稀釋劑或包嚢物質(zhì)(encapsulatingsubstance)。術(shù)語"載體(carrier)"表示其中活性成分與之結(jié)合以促進該活性成分應(yīng)用的天然或合成性有機或無機成分。本發(fā)明藥物組合物的成分也能夠與本發(fā)明的化合物以這樣的方式相互混合，以至于不存在將明顯損害所期望藥用效率的相互作用。所述重組病毒疫苗可以通過施用藥物的任何常規(guī)途徑施用。多種施用30途徑是可用的。當然，所選的特定模式將取決于具體的重組病毒疫苗含量、正在治療的具體病癥和治療效果所需要的劑量。一般而言，本發(fā)明的方法可以通過使用醫(yī)學(xué)上可接受的任何施用模式(意指產(chǎn)生有效水平的免疫應(yīng)答而不造成臨床不接受的副作用的任何模式)實施。本文中討論了優(yōu)選的施用方式。對于治療中的用途，可以通過遞送1H-咪唑并[4，5-cl喹啉-4-胺衍生物至目的表面的任何模式(例如粘膜、全身模式)并以任何形式(如乳膏劑、溶液劑)施用lH-咪唑并[4，5-c會啉-4-胺衍生物的有效量至受試者。根據(jù)本發(fā)明，重組病毒疫苗或其獨立的化合物(i)和(ii)可以通過多種施用方式使用，包括全身、局部和局限化施用。注射可以通過多種方法進行，例如通過皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、瘤內(nèi)、血管內(nèi)、動樂k內(nèi)的注射，或者通過直接注射入某一動脈(如通過肝動脈輸注)或肝滋養(yǎng)靜脈(如注射入門靜脈)。可以用常規(guī)注射器和針或本領(lǐng)域可利用的任何其它適宜設(shè)備進行注射。備選地，活性組合物或者包含該活性組合物的任何組合物可以通過粘膜途徑如口腔/消化道、鼻、氣管內(nèi)、肺內(nèi)、陰道內(nèi)或直腸內(nèi)粘膜途徑施用。局部施用也可以使用經(jīng)皮方式(如貼劑、乳膏劑等)進行。在本發(fā)明的上下文中，肌內(nèi)及皮下施用構(gòu)成優(yōu)選的途徑。對于口服施用的重組病毒疫苗，重組病毒疫苗可以通過組合活性組合物與本領(lǐng)域熟知的可藥用載體而輕易配制。此類載體能夠使本發(fā)明的化合物配制為片劑、丸劑、糖衣丸劑(dragee)、膠嚢劑、液體劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑(shirry)、混懸劑等用以待治療的受試者口服攝入。用于口服的藥物制品可以作為固體賦形劑獲得，任選地研磨所得混合物，并根據(jù)需要在添加適當?shù)妮o料后，加工顆粒的混合物以獲得片劑或糖衣丸劑核。合適的賦形劑特別是填充物，如糖、包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制備物，如玉米淀粉、小麥淀粉、稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、鞋丙基甲基纖維素、羧曱基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。根據(jù)需要，可以添加崩解劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或者藻酸或其鹽(如藻酸鈉)。任選地，口服制劑也可以配制為用于中和內(nèi)部酸性條件的鹽水或緩沖液或可以不帶任何載體而施用?？梢钥诜褂玫闹亟M病毒疫苗包括由明膠制成的推入式(push-fit)膠嚢劑以及由明膠和增塑劑(如甘油或山梨醇)制成的軟質(zhì)密封膠嚢劑。推入式膠嚢劑可以含有與填充物(如乳糖)、粘合劑(如淀粉)和/或潤滑劑(如滑石粉或硬脂酸鎂)摻和的活性成分并任選地含有穩(wěn)定劑。在軟質(zhì)膠嚢劑中，所述活性組合物可以溶解或懸浮于合適的液體(如脂肪油、液體石蠟或者液體聚乙二醇)中。此外，可以添加穩(wěn)定劑。也可以使用為口服施用所配制的微球劑。此類微球劑在本領(lǐng)域中已充分定義。用于口服施用的全部制劑應(yīng)當處在適用于所述施用的合適劑量。當想要全身地遞送重組病毒疫苗時，可以將所述重組病毒疫苗配用于通過注射例如大丸劑注射或連續(xù)輸注射的腸胃外施用。用于注射的制劑可以單位劑型形式存在，例如在安瓿或在多劑量容器中，含有添加的防腐劑。重組病毒疫苗可以采用這樣的形式，如混懸劑、溶液劑或在油質(zhì)或水質(zhì)栽體中的乳劑，并且可以含有配方劑，如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或崩解劑。用于腸胃外施用的重組病毒疫苗包括處于水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物(i)和/或(ii)的混懸劑可以制備為合適的油質(zhì)注射混懸劑。合適的親脂溶劑或載體包括脂肪油(如芝麻油)、或合成的脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酉旨)或脂質(zhì)體。含水注射混懸劑可以含有增加該混懸劑粘性的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地，混懸劑也可以包含合適的穩(wěn)定劑或能增加所述化合物溶解度以允許制備高濃度溶液的試劑。備選地，活性化合物(i)和/或(ii)可以處于粉末形式以便在使用前用合適載體(如滅菌無熱原水)重構(gòu)。重組病毒疫苗可以配制成直腸或陰道型組合物如栓劑或保留灌腸劑，例如，含有常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可脂或其它甘油酯的栓劑或保留灌腸劑。此外，重組病毒疫苗也可以配制為儲庫制劑(Depotpreparation)。這種長效制劑可以與合適的聚合物材料或疏水材料(例如作為可接受油中的乳劑)或離子交換樹脂配制，或配制為微溶性衍生物，例如配制為^:溶性鹽。重組病毒疫苗也可以包含合適的固相或凝膠相載體或賦形劑。此類載體或賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、多種糖、32淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物如聚乙二醇。合適的液態(tài)或固態(tài)重組病毒疫苗形式例如是用于吸入的水溶液或鹽溶液、微嚢化、螺旋狀(encochleated)的、涂覆在微小金粒子上、含于脂質(zhì)體中、霧化、氣溶膠、用以植入皮膚內(nèi)的丸狀、干燥到待劃入皮膚的銳器上。藥物組合物也包括顆粒劑、散劑、片劑、包衣片劑、(微)膠嚢劑、栓劑、糖漿劑、乳劑、混懸劑、乳膏劑、滴劑或活性化合物延長釋放的制劑，在這些制品中如上所述慣常地使用賦形劑和添加劑和/或輔料，如崩解劑、粘合劑、包衣劑、溶脹劑、潤滑劑、增香劑、甜味劑或增溶劑。1H-咪唑并4，5-c喹啉-4-胺衍生物可以按其原本形式或以可藥用鹽形式施用。當在藥品中使用時，所述鹽應(yīng)當是可藥用的，但不可藥用的鹽可以方便地用來制備其可藥用鹽。此類鹽包括但不限于從下列酸制備的鹽鹽酸、氬溴酸、疏酸、硝酸、磷酸、順丁烯二酸、乙酸、水楊酸、對甲苯磺酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、曱酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。同樣，此類鹽可以制備為堿金屬鹽或堿土金屬鹽，例如，羧酸基的鈉、鉀或釣鹽。合適的緩沖劑包括乙酸及其鹽(l-2。/。w/v);檸檬酸及其鹽(1-3%w/v);硼酸及其鹽(0.5-2.5。/。w/v)和磷酸及其鹽(0.8-2。/。w/v)。合適的防腐劑包括苯扎氯銨(0.003-0.03%w/v);氯代丁醇(0.3-0.9%w/v);對羥基苯甲酸酯(0.01-0,25%\￥)和石充柳汞(0.004-0.02%w/v)。所述重組病毒疫苗可以方便地以單位劑型形式存在，并可以通過藥學(xué)領(lǐng)域熟知的任何方法制備。全部方法包括使化合物(i)和(ii)與構(gòu)成一種或多種附屬成分的載體相結(jié)合的步驟。通常，通過如此方式制備組合物，即通過使所述化合物與液態(tài)載體、細研的固態(tài)載體或這兩者均勻而緊密地結(jié)合，并且隨后根據(jù)需要使產(chǎn)物成形。液體劑量單位是小瓶(vial)或安瓿。固體劑量單位是片劑、膠嚢劑和栓劑。對于治療患者而言，根據(jù)化合物的活性、施用方式、免疫目的(即預(yù)防性或治療性)、病癥的本質(zhì)和嚴重性、患者年齡和體重，不同的劑量可能是必需的。給定劑量的施用可以通過以單個的劑量單位形式單次施用或以幾個更小的劑量單位來實施。在相隔特定的周或月間隔上多次施用劑量用于增強抗原特異性應(yīng)答。其它遞送系統(tǒng)可以包括即時釋放、延遲釋放或持續(xù)釋放的遞送系統(tǒng)。此類系統(tǒng)可以避免重復(fù)施用重組病毒疫苗的化合物，增加對受試者和內(nèi)科醫(yī)生的方便性。眾多類型的釋放遞送系統(tǒng)是可獲得的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。它們包括基于聚合物的系統(tǒng)，如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯(copolyoxalate)、聚己內(nèi)酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羥丁酸和聚酐。在例如US5,075,109中描述了含有前述聚合物的藥物的微膠嚢劑。遞送系統(tǒng)也包括非聚合物系統(tǒng)，所述非聚合物系統(tǒng)是類脂，包括固醇如膽固醇、膽固醇酯和脂肪酸或中性脂肪(例如單、二和三甘油酯；水凝膠釋放系統(tǒng)；硅橡膠(Sylastic)系統(tǒng)；基于肽的系統(tǒng)；蠟涂覆；使用常規(guī)粘合劑和賦形劑的壓制片劑；部分融合的植入物等。具體實例包括但不限于(a)侵蝕性系統(tǒng)，其中本發(fā)明的藥劑以一定形式包含于如US4，452，775、4,675,189和5,736,152中描述的基質(zhì)中，和(b)擴散性系統(tǒng)，其中活性成分以受控速率從如US3,854,480、5,133,974和5,407,686中描述的聚合物滲入。此外，可以使用基于泵的硬式遞送系統(tǒng)，其中某些系統(tǒng)適用于植入。重組的病毒載體化合物(i)j和1H-咪唑并[4，5-c喹啉-4-胺衍生物[化合物(ii)的施用形式可以對于本發(fā)明的一種所述重組病毒疫苗而言是相同或不同的(如化合物(i)作為溶液施用和化合物(ii)作為乳膏劑施用)。在其它方面，本發(fā)明涉及試劑盒。本發(fā)明的一種試劑盒包括含有(i)本發(fā)明的至少一種重組病毒載體的容器和含有(ii)至少一種1H-咪唑并[4,5-cI全啉_4-胺衍生物的容器以及用于對施用所述組合物時間安排的說明書。所述的容器可以是同時容納(i)至少一種重組病毒疫苗和(ii)至少一種1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的單個容器，或者該容器可以是容納化合物(i)和(ii)的單個劑量的多個容器或腔室，如泡罩包裝。該試劑盒也具有用于對施用所述組合物時間安排的說明書。該說明書將指導(dǎo)受試者在適宜時間接受重組病毒疫苗。例如，用于遞送重組病毒疫苗的適宜時間可以是當癥狀出現(xiàn)時。備選地，用于遞送重組病毒疫苗的適宜時間可以基于例行方案如按月或按年。化合物(i)和(ii)可以同時或分別地施用，只要是它們在足夠接近的時間上施用以產(chǎn)生協(xié)同性免疫應(yīng)答。根據(jù)需要，本發(fā)明的方法或用途可以與一種或多種常規(guī)治療模式(例如放射療法、化學(xué)療法和/或外科手術(shù))組合來實施。多種治療方法的使用為患者提供了基礎(chǔ)更廣泛的介入療法。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法可以在外科介入療法之前或之后進行。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法可以在放射療法(如y照射法)之前或之后進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕易地i更置可4吏用的適宜》文射療法方法和參數(shù)(例如見Perez和Brady，1992，PrinciplesandPracticeofRadiationOncology,第二版.JBLippincottCo;使用本領(lǐng)域技術(shù)人員易于明白的適度調(diào)整和修改)。仍在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法或用途與具有一種或多種藥物(如常規(guī)用于治療或預(yù)防HPV感染、HPV相關(guān)性病理疾病的藥物)的化學(xué)療法組合。本發(fā)明還涉及用于改善對用化療劑進行化療療法的癌癥患者治療的方法，所述方法包括用如上文公開的重組病毒疫苗對所述患者的共同治療。本發(fā)明也涉及提高http:〃www.microDat.com/Derl/di/t)srecord.plticket=037405101546&listid=114934200603310卯5&containerid=763883&patnum=US6015827A細胞毒性藥的細胞毒有效性或提高放射療法的方法，所述方法包括使用如上文公開的重組病毒疫苗對需要所述治療的患者共同治療。在另一實施方案中，本發(fā)明的方法或用途才艮據(jù)激發(fā)加強治療性模式來實施，其包括順次施用一種或多種激發(fā)用組合物和一種或多種加強用組合物。一般地，激發(fā)用及加強用組合物使用不同載體(vehicle)，其包含或編碼共有的至少一種抗原結(jié)構(gòu)域。首先施用激發(fā)用組合物至宿主生物并且在一日-12個月不等的時間后順次施用加強用組合物至相同宿主生物。本發(fā)明的方法可以包括順次施用亂t用組合物1-10次并且隨后順次施用加強用組合物1-10次。理想地，注射間隔期是約一周-六個月。此外，激發(fā)用和加強用組合物可以通過相同途徑或不同途徑施用在相同部位或備選部位處。例如，基于HPV早期多肽的組合物可以通過粘膜途徑施用而優(yōu)選地注射重組病毒疫苗，例如，對于MVA栽體用皮下注射。35動物或人中誘導(dǎo)或刺激抗HPV免疫應(yīng)答的能力。對于可用于評價免疫應(yīng)答啟動和激活的纟支術(shù)的一般描述，參見例如Coligan等(1992和1994,CurrentProtocolsinImmunology;編者JWiley&SonsInc，NationalInstituteofHealth)?？梢酝ㄟ^如此方式測量細力包免疫，即通過測量由活化的效應(yīng)細胞(包括衍生自CD4+和CD8+T-細胞的那些細胞)分泌的細胞因子i普來進行(例如通過ELIspot量化產(chǎn)生IL-10或IFNy的細胞)；通過確定免疫效應(yīng)細胞的激活狀態(tài)(例如通過經(jīng)典的[3司胸苦攝取的T細胞增殖測定法)；或通測定敏感受試者中的抗原特異性T淋巴細胞的測試法(如在細胞毒性測定法中的肽特異性裂解)。刺激體液反應(yīng)的能力可以通過結(jié)合法中的抗體結(jié)合和/或竟爭性來確定(參見例如Harlow，1989，Antibodies,ColdSpringHarborPress)。本發(fā)明的方法也可以在動物模型中確認，其中用適宜的腫瘤"^秀導(dǎo)劑(如表達HPV-E6和E7的TCI細月包)攻擊所述的動物才莫型以確定其抗胂瘤活性，該活性反映抗HPV免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)或增強。尤其可以根才居本發(fā)明加以治療的疾病狀況例如是子宮頸癌或這種惡性瘤的癌前病變，后者稱作宮頸上皮內(nèi)瘤(CIN)或鱗狀上皮內(nèi)瘤(SIL)。本發(fā)明的重組病毒疫苗也可以用于在DNA診斷所確認的患者中治療子宮頸的無癥狀感染、或在手術(shù)治療子宮頸癌、CIN或SIL后推定仍存在的無癥狀感染，或在流行病學(xué)分析后推定存在的無癥狀感染。待治療的疾病狀況還包括生殖器疣、普通疣和跖疣。全部這些病癥也由眾多其它類型的HPV引起，并且本發(fā)明的藥劑、化合物和方法也可以用于針對這些病毒。全部這些損害推定源自往往檢測不到的無癥狀感染。本發(fā)明還可以實用地靶向全部這些無癥狀感染。本發(fā)明已經(jīng)以闡述性方式進行了描述，并且應(yīng)當理解已經(jīng)使用的術(shù)語意在對詞匯的屬性描述而非限制。顯而易見，在以上教授內(nèi)容影響下本發(fā)明的眾多修改和變化是可能的。因此應(yīng)當理解在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以按照不同于本文中具體描述的方式實施。以上提及的專利公開內(nèi)容、出版物和數(shù)據(jù)庫條目均具體地通過引用的方式完整地并入本文，如同具體及單獨地說明通過引用方式并入每種單獨的專利、出版物和條目。圖la/b/c/d:局部施用咪喹莫特與皮下注射MVATG8042組合的治療效果。圖lb:實驗l:2xl05TCI皮下注射，用5xl06pfu進行3次皮下注射，每組15小鼠；圖lc:實驗2:2xl05TCI皮下注射，用5><106或5><105pfu進行3次皮下注射，每組15小鼠；圖ld:實驗3:2x1()StCI皮下注射，用5xl(^pfu進行3次皮下注射，每組15小鼠。圖2a/2b:對分泌E7/E6特異性IFNy的淋巴細胞頻率的測量；圖2b:E6/E7特異性INFy/ElispotThl反應(yīng)。圖3:IL-4ELISPOT測定法。E7特異性IL-4/ElispotTh2反應(yīng)圖4a/4b:R9F特異性CD8+t細胞的流式細胞分析。對Tet—R9F+E7特異性CD8+T細胞頻率的測量。圖5a/5b:E7-特異性體液免疫應(yīng)答。Thl/Th2同種型IgG轉(zhuǎn)換的測量。圖6:MVA特異性中和抗體滴度(NAT50)。圖7:在RenCa-MUCl腫瘤模型中艾達樂+MVATG9931組合的治療效果。圖8:咪喹莫特對于針對短表位或長表位的MUC1特異性Thl型T細胞反應(yīng)的影響。圖9:IL-4elispot測定法咪喹莫特對于MUC-1特異性Th2型T細胞反應(yīng)的影響。圖10:MUC1特異性體液免疫應(yīng)答(同種型轉(zhuǎn)換)咪喹莫特對MUC1特異性體液應(yīng)答的影響。實施例A-表達HPV抗原的重組病毒載體1.材料和方法371.1.實驗物品對每種重組載體構(gòu)建體(基于MVA)的命名和筒述<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>貯存條件:病毒維持在-80。C直至注射當日。病毒混懸液緊接在稀釋和施用前迅速解凍。將病毒稀釋于緩沖液Tris/HCl10mM，蔗糖5%(w/v),10mMNaGlu，50mMNaCl，pH8.0中，以便獲得在lOOjil體積中的所需劑量。1.2.動物模型物種/林系/供應(yīng)商SPF健康雌性C57B1/6小鼠從CharlesRiver(LesOncins,法國)獲得。所述動物在抵達時是6周齡。在實驗開始時，它們是7周齡。動物住在單獨的、隔離的室內(nèi)，其中給予該室空氣調(diào)節(jié)以提供每小時最少11次空氣交換。溫度和相對濕度范圍分別是在20。C和M。C之間和40-70%。自動控制照明以提供12小時光照和12小時黑暗的周期光照。通過定期控制警哨動物(sentinelanimal)檢查無特異病原體狀態(tài)。在整個研究期間，動物可以隨意接近RM1型滅菌食物(DietexFrance,SaintGratien)。通過瓶子隨意提供無菌水。全部動物在實驗開始前適應(yīng)一個星期。1.3.對細胞的描述從C57B16小鼠肺獲得的TC1腫瘤細胞已經(jīng)用兩個逆轉(zhuǎn)錄病毒(表達來自HPV16的E6和E7的LXSN16E6E7和表達ras基因的pVEJB)轉(zhuǎn)導(dǎo)。所述細胞在含有0.5mg/mlG418和0.2mg/ml潮霉素的DMEM中培養(yǎng)。貼壁細胞通過胰蛋白酶處理取下并且在3次洗滌后，用2xl(^個TC1活細胞以皮下方式進行腫瘤攻擊。1.4.艾達樂TM(3MPharmaceuticals)艾達樂TM是咪喹莫特的商標名稱。每克的5%乳膏劑含有在米色水包油型消散乳膏劑基質(zhì)中的50rag咪喹莫特，其中所述的基質(zhì)由異硬脂酸、鯨蠟醇、硬脂醇、白凡士林、失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚硬脂酸酯、失水山梨醇單硬脂酸酯、甘油、黃原膠、純化水、爺醇、對羥基苯甲酸曱酯和對幾基苯甲酸丙酯組成。1.5.操作方法免疫方案對于免疫治療實驗，將15只C57B16雌性小鼠在第1日用2xl05TC1細胞在右側(cè)以皮下方式進行攻擊。小鼠在第8日、第15日和第22日用5xl06pfu或5xl05pfu的痘苗病毒在3個彼此之間有距離的部位處理三次。咪喹莫特(艾達樂5%乳膏劑；3MPharmaceuticals)僅在每次免疫之前在注射部位上局部施加至小鼠剃毛的皮膚處(約1cm"。每只小鼠每次免疫接受約0.8mg或1.6mg/小鼠的活性咪喹莫特。在80日期間每周兩次用測徑器監(jiān)測肺瘤生長。出于倫理原因，當小鼠的肺瘤大小超過直徑25mm或當小鼠表現(xiàn)痛苦，即使腫瘤較小，也將其無痛處死。對于免疫原性研究，在第1日、第8日和笫15日用5xl()7pfu或5xl06pfu的痘苗病毒在3個彼此之間有距離的部位處皮下接種3只無腫瘤的C57B16雌性小鼠。該劑量用來優(yōu)化檢測針對HPV特異性抗原的細胞免疫。咪喹莫特僅在每次免疫之前在注射部位上局部施加至小鼠剃毛的皮膚處(約1cm2)。每只小鼠每次免疫接受約0.8mg或1.6mg/小鼠的活性咪喹莫特。在笫22天取脾和血清用于免疫學(xué)分析。監(jiān)測參數(shù)*通過Elispot法測量分泌IFNy的細胞(Thl)或IL-4的細胞(Th2)的數(shù)目或頻率使用CellStrainer(BDFalcon)制備新鮮脾細胞。全部肽由Neosystem以免疫級水平(IOmg)合成。每種肽以10mg/ml溶解在DMSO并貯藏在4。C。使用MabtechAB小鼠IFNyELISPOTPLUS試劑盒或小鼠IL-439ELISPOTPLUs試劑盒(Mabtech，法國)，根據(jù)制造商說明書實施Elispot。96孔硝化纖維素平板用碳酸鈉緩沖液中的3ng/ml單克隆大鼠抗小鼠IFNy抗體(克隆R4-6A2;Pharmingen，產(chǎn)品目錄號551216,批次M072862;100jO/孔)包被。該平板在4°C孵育過夜或在37°C賻育1小時。平板用DMEM10%FCS洗滌3次并且在37。C用100^1DMEM10%FCS/孔飽和2小時。脾細胞以濃度106個細胞/10(^1鋪板。將白細胞介素2以6U/50fi1/孔(R&DSystems)10ng/ml)濃度添加至全部孔。伴刀豆球蛋白A用作陽性對照(5ng/ml)。HPV特異性肽以5(ig/ml濃度使用。該平板在37。C,5%C02孵育48小時。平板用PBSIX洗滌1次并且用PBS-吐溫0.05%洗滌5次。生物素化的抗小鼠IFNy(克隆XMG1.2，Pharmingen)以0.3fig/100fd/孔的濃度添加并在室溫緩慢攪動下孵育2小時。該平板用PBS-吐溫0.05%洗滌5次。還添加1/5000稀釋于PBS-吐溫0.05%-FCS1%中的ExtravidinAKP(Sigma，St.Louis，MO)至各孔(100pl/孔)。該平板在室溫孵育45分鐘并隨后用PBS-吐溫0.05%洗滌5次。用Biorad試劑盒顯示IFNy分泌。每孔添加100pl底物(NBT+BCIP)并將平板置于室溫持續(xù)1/2小時。該平板用水洗滌并置于室溫以干燥過夜。用解剖顯孩i鏡對斑點計數(shù)。使用Elispot讀數(shù)儀Bioreader4000Pro-X(BIOSYS-Gmbh;Serlabo法國)對斑點計數(shù)。所測試肽的名單SCVYCKKEL(E6;Db):S9L肽RCIICQRPL(E6;Db):R9L肽SEYRHYQYS(E6;Kb)S9S肽ECVYCKQQL(E6;Db)E9L肽TDLHCYEQL(E7;Kb):T9L肽RAHYNIVTF(E7;Db)R9F肽無關(guān)的肽(MUC1特異性)D38L(E7;Db)是38個氨基酸長的E7特異性肽。也在不同的Elispot測定法中使用重組的純化E7蛋白。*測量R9F四聚體特異性CD8+T細胞的頻率使用一種BD特殊篩網(wǎng)(CellStrainer)收獲并制備新鮮脾細胞。將脾細胞在5日期間用R9F肽(5嗎/ml)在24孔平板中進行刺激或直接用于特異性標記。lxl(^個細胞用lfd的APC偶聯(lián)的小鼠CD8特異性抗體(BDPharmingen553035;克隆53-6.7;批號32567)和10pl的R9F特異性H-2Db四聚體(BeckmanCoulterT20071;H-2Db/PE;肽RAHYNIVTF;批號C507117;C602110)在4。C經(jīng)30分鐘染色。將細胞洗涂，隨后稀釋于PBS/0.5%PFA中。*測量針對E7抗原的Thl/Th2相關(guān)的IgG同種型轉(zhuǎn)換將96孔平板在4°C用3ng/ml的E7純化蛋白(P#2101cahierPC00001;第157頁；2002年10月)包被過夜。該蛋白質(zhì)稀釋于包被緩沖液(200mMNaHC03，80mMNa2CO3，pH9.5)中并將每孔添加lOOjil該溶液。*各孔用洗板機洗滌5次(PBS，0.1%吐溫20，10mMEDTA)并在室溫用300^1PBS+3%BSA飽和1小時。*將各孔洗滌5次并與1/2系列稀釋(在PBS+1%BSA中1/25-1/1600)的小鼠血清在室溫孵育2小時。*將平板洗滌5次。添加(100(il/孔)以1/1000稀釋于PBS+1%BSA中的過氧化物酶綴合的大鼠抗小鼠IgG2a(BDPharmingen553391)或大鼠抗小鼠IgGl(BDPharmingen559626)和并在室溫孵育1小時。*將各孔洗滌5次并且用100^1底物溶液(0.05M檸檬酸，0.05M乙酸鈉，1%四曱基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine)，0.015%11202)/孔顯色。TMB溶液(IOml)=140nlTMB+2plH202+5ml乙酸鈉(0.1M)+5ml檸檬酸鹽(0.1M)。*反應(yīng)通過添加100^1的0.8M112804/孔終止。在450nm處測量吸光度(Genesyssystem)。*分析由接種i秀導(dǎo)的MVA中和抗體細胞BHK-21(倉鼠成纖維細胞，參考ATCC:CCL-10)MVA-GFP(MVATG15938):報道分子綠色熒光蛋白插在MVA缺失III區(qū)中處于pllK7.5啟動子的控制下。41步驟l:中和性血清全部血清通過用前在56。C加熱30分鐘進行去補體作用.陽性對照來自用痘病毒(WR抹)(參見AcWRIMVQC34)免疫的兔的血清。步驟2:血清中和作用測定(SOP測定中和性抗MVA抗體滴度)-血漿系列稀釋于培養(yǎng)基(稀釋范圍50x至3200x)并且在96孔微量平板中與MVA-GFP(5xl03pfu/孔)在37°C孵育1小時(中和步驟)。隨后接種BHK-21細胞(105個細胞/孔)并在37。C,5%(:02孵育另外16-18小時。-次日，在用焚光微量平板讀數(shù)儀(VICTORTMPerkinElme,)讀取熒光強度之前，將96孔孩t量平板用250nLPBS洗滌并且將100jiLPBS加至各孔。中和抗體滴度是抑制50%病毒活性的滴度。使用Spearman-Karber法計算中和抗體滴度(NATso)。2-結(jié)果按照材料和方法中所述的模式進行3次獨立的治療實驗。在全部實驗中，我們一致地觀察到在接種部位局部施加艾達樂TM乳膏劑(5。/o)顯著地增加MVATG8042的治療效力(見圖la、b、c和d)。在這種情況下，用5xl06pfuMVATG8042的接種在每個實驗結(jié)束時平均誘導(dǎo)45%無腫瘤小鼠，而在MVATG8042分別與0.8mg或1.6mg咪會莫特聯(lián)合使用時，見到75%和95%的無腫瘤動物。在一個實驗系列(見圖lc)中，我們還觀察到添加艾達樂TM允許用l個log的較低劑量(5xl05pfu)的病毒達到相同治療效力。使用Kaplan-Meier存活曲線的LogRank應(yīng)用(Statistica5.1軟件，StatsoftInc.)評估體內(nèi)存活實驗中不同組之間的統(tǒng)計學(xué)差異。P《0.05視為統(tǒng)計學(xué)顯著。平行地，進行兩個獨立的研究以評價針對E6和E7HPV抗原的細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。小鼠如操作方法部分所述進行接種。在兩個實驗中，使用Elispot測定法計數(shù)分泌E6或E7特異性IFNy的細胞的數(shù)目。這些結(jié)果顯示相對于僅用MVATG8042獲得的結(jié)果，局部施用艾達樂TM導(dǎo)42200780023231.2說明書第35/41頁步驟l:中和性血清200780023231.2說明書第35/41頁步驟l:中和性血清全部血清通過用前在56。C加熱30分鐘進行去補體作用.陽性對照來自用痘病毒(WR抹)(參見AcWRIMVQC34)免疫的兔的血清。步驟2:血清中和作用測定(SOP測定中和性抗MVA抗體滴度)-血漿系列稀釋于培養(yǎng)基(稀釋范圍50x至3200x)并且在96孔微量平板中與MVA-GFP(5xl03pfu/孔)在37°C孵育1小時(中和步驟)。隨后接種BHK-21細胞(105個細胞/孔)并在37。C,5%(:02孵育另外16-18小時。-次日，在用焚光微量平板讀數(shù)儀(VICTORTMPerkinElme,)讀取熒光強度之前，將96孔孩t量平板用250nLPBS洗滌并且將100jiLPBS加至各孔。中和抗體滴度是抑制50%病毒活性的滴度。使用Spearman-Karber法計算中和抗體滴度(NATso)。2-結(jié)果按照材料和方法中所述的模式進行3次獨立的治療實驗。在全部實驗中，我們一致地觀察到在接種部位局部施加艾達樂TM乳膏劑(5。/o)顯著地增加MVATG8042的治療效力(見圖la、b、c和d)。在這種情況下，用5xl06pfuMVATG8042的接種在每個實驗結(jié)束時平均誘導(dǎo)45%無腫瘤小鼠，而在MVATG8042分別與0.8mg或1.6mg咪會莫特聯(lián)合使用時，見到75%和95%的無腫瘤動物。在一個實驗系列(見圖lc)致MHCI類限制性CD8+T細胞的數(shù)目顯著增加(圖2a和b)。對更廣范圍的表位的低應(yīng)答存在于艾達樂TM+MVATG8042組(肽S9S和T9L)中。平行地，在獨立的實驗中，分泌E7特異性IL-4的細胞的數(shù)目在MVATG8042+艾達樂TM組低于僅用MVA組(圖3)。總而言之，這些數(shù)據(jù)表明MVATG8042+艾達樂TM的聯(lián)合改善了基于Thl的針對E6和E7抗原的細胞免疫應(yīng)答。CD8+/R9F四聚物+脾細胞的頻率在用E7特異性免疫優(yōu)勢表位R9F體外刺激之前和之后通過流式細胞術(shù)進一步分析(圖4a)。這些結(jié)果表明對R9F免疫優(yōu)勢表位的識別明顯地由CD8+特異性T細胞介導(dǎo)。R9F-Db-限制性CD8+群體的頻率在脾臟中低下并且該群體在用所述肽體外刺激之后更好地得到檢測。用艾達樂TM的預(yù)處理顯著改善R9F-Db-特異性CD8+T細胞在圖4b所示實驗中的數(shù)目。最后通過ELISA方法測量針對E7抗原的體液免疫應(yīng)答。為更好表征由艾達樂TM+MVATG8042組合誘導(dǎo)的應(yīng)答類型，分析了IgG同種型轉(zhuǎn)換。檢測到E7特異性IgGl和IgG2a。凄t據(jù)(圖5)顯示局部應(yīng)用艾達樂TM"^秀導(dǎo)出典型Thl譜(比IgGl更高的IgG2a滴度，圖5a)，其中典型Thl譜可能在聯(lián)合療法的效力中有意義。這些結(jié)果在第二個實驗中(圖5b)證實。最后，測量MVA特異性中和抗體的水平以分析艾達樂聯(lián)合MVATG8042的影響(圖6)。結(jié)果表明當與類似地僅注射MVA比較時，MVATG8042和艾達樂TM的聯(lián)合降低所獲得的MVA特異性中和抗體的滴度。這可以由局部施用艾達樂TM乳膏劑創(chuàng)造的環(huán)境進行解釋，其中所述的艾達樂TM乳膏劑可以保護免受由特異性抗體所致的中和作用。B-表達腫瘤抗原MUC1的重組病毒載體2.1.實驗物品對每種重組載體構(gòu)建體(基于MVA)的命名和簡述<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>貯存條件病毒從分子免疫學(xué)系(MolecularImmunologyDepartment)獲得并隨后維持在-80。C直至注射當日。病毒混懸液緊接在稀釋和施用前迅速解凍。用前稀釋的條件將病毒稀釋于TG0008緩沖液(Tris/HCl10mM，蔗糖5%(w/v)，10mMNaGlu，50mMNaCl，pH8.0)中，以便獲得在100^1體積中的所需劑量。2.2.動物模型物種/林系/供應(yīng)商SPF健康雌性B6D2和C57B1/6小鼠從CharlesRiver(LesOncins，法國)獲得。所述動物在抵達時是6周齡。在實驗開始時，它們是7周齡。動物住在單獨的、隔離的室內(nèi)，其中給予該室空氣調(diào)以提供每小時最少11次空氣交換。溫度和相對濕度范圍分別是在20°C至24°C之間和40-70%。自動控制照明以提供12小時光照和12小時黑暗的周期光照。在整個研究期間，動物可以隨意接近RM1型滅菌食物(DietexFrance,SaintGratien)。通過瓶子隨意提供無菌水。2.3.對細胞的描述RenCa-MUCl腫瘤細月包RenCa是實驗性鼠腎癌模型。使用經(jīng)典磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，以pHMG-ETAtm(MUC-l)和pY3(潮霉素B抗性)轉(zhuǎn)染RenCa細胞。在補充有10。/。滅活胎牛血清、L-谷胺酰胺(2mM),慶大霉素(0.04g/l)和潮霉素(600pg/ml，RocheDiagnostic)的DMEM(Dulbecco改良)中稀釋克隆后進行克隆選擇。通過用H23單克隆抗體的細胞流式分析(使用FACScan,BectonDickinson)分析MUC-1表達。貼壁細胞通過PBS/EDTA處理取下并且在3次洗滌后，用3><105個RenCa-MUCl(克隆4)活細胞以皮下方式進行腫瘤攻擊。2.4.操作方法44免疫方案對于免疫治療實驗，將15只B6D2雌性小鼠在第1日用3xl()5個RenCa-MUCl細胞在右側(cè)以皮下方式進行攻擊。小鼠在第4日、第11日和第8日用5xl07pfu的痘病毒(MVA林)在3個彼此之間有距離的部位處理三次。咪喹莫特僅在每次免疫之前在注射部位上局部施加至小鼠剃毛的皮膚處(約1cm2)。每只小鼠每次免疫接受約1mg/小鼠的活性咪喹莫特。在80日期間每周兩次用測徑器監(jiān)測肺瘤生長。出于倫理原因，當小鼠的肺瘤大小超過直徑25mm或當小鼠表現(xiàn)痛苦，即使腫瘤較小，也將其無痛處死。對于免疫原性研究，在第1日、第8日和第15日用5xl07pfu的痘病毒(MVA林)在3個彼此之間有距離的部位處皮下接種3只C57B16雌性小鼠。該劑量用來優(yōu)化檢測針對MUC1特異性抗原的細胞免疫。咪喹莫特僅在每次免疫之前在注射部位上局部施加至小鼠剃毛的皮膚處(約1cm2)。每只小鼠每次免疫接受約1mg/小鼠的活性咪喹莫特。在第22日取出脾臟和血清用于免疫學(xué)分析。監(jiān)測參數(shù)*通過Elispot法測量分泌IFNy的細胞的數(shù)目/頻率使用淋巴細胞純化緩沖液制備新鮮脾細胞。全部肽由Neosystem以免疫級水平(IOmg)合成。每種肽以10mg/rnl溶解在DMSO并貯藏在4°C。96孔硝化纖維素平板用碳酸鈉緩沖液中的3叫/ml單克隆大鼠抗小鼠IFNy抗體(克隆R4-6A2;Pharmingen，產(chǎn)品目錄號551216，批次M072862;100nI/孔)包被。該平板在4°C孵育過夜或在37°C孵育1小時。平板用DMEM10%FCS洗滌3次并且在37。C用lOOfilDMEM10%FCS/孔飽和2小時。脾細胞以濃度l(^個細胞/100fil鋪板。將白細胞介素2以6U/50fi1/孔(R&DSystems)10ng/ml)濃度添加至全部孔。伴刀豆球蛋白A用作陽性對照(5ng/ml)。MUCl特異性肽以5ng/ml濃度使用。該平板在37。C，5。/。C02孵育48小時。平板用PBSIX洗滌1次并且用PBS-吐溫0.05%洗滌5次。生物素化的抗小鼠IFNy(克隆XMG1.2,Pharmingen)以0.3ng/100nl/孔的濃度添加并在室溫緩慢攪動下孵育2小時。該平板用PBS-吐溫0.05%洗滌5次。還添加1/5000稀釋于PBS-吐溫0.05%-FCS1%中的ExtravidinAKP(Sigma，St.Louis，MO)至各孔(100nl/孔)。將平板在室溫孵育45分鐘，然后用PBS-吐溫0,05。/。洗滌5次。用BioradKit顯示IFNy分泌。每孔添加100nl底物(NBT+BCIP)并將平板置于室溫持續(xù)1/2小時。該平板用水洗滌并置于室溫以干燥過夜。用解剖顯樣i鏡對斑點計數(shù)。*通過Elispot法測量分泌IL-4的細胞的數(shù)目/頻率使用淋巴細胞純化緩沖液制備新鮮脾細胞。全部肽由Neosystem以免疫級水平(IOmg)合成。每種肽以10mg/ml溶解在DMSO并貯藏在4。C。96孔硝化纖維素平板用碳酸鈉緩沖液中的3ng/ml單克隆大鼠抗小鼠IL-4抗體(Pharmingen，產(chǎn)品目錄號551878，批次27401;100nl/孔)包被。該平板在4°C孵育過夜或在37°C孵育1小時。平板用DMEM10%FCS洗滌3次并且在37。C用lOOjilDMEM10%FCS/孔飽和2小時。脾細胞以濃度106個細胞/100nl鋪板。將白細胞介素2以6U/50fil/孑L(R&DSystems)10ng/ml)濃度添加至全部孔。伴刀豆球蛋白A用作陽性對照(5jig/ml)。MUC1特異性肽以5照/ml濃度使用。該平板在37。C，5。/。C02孵育48小時。平板用PBS1X洗滌1次并且用PBS-吐溫0.05。/。洗滌5次。生物素化的抗小鼠IL-4以0.2ng/100jU/孔的濃度添加并在室溫緩慢攪動下孵育2小時。該平板用PBS-吐溫0.05%洗滌5次。還添加1/5000稀釋于PBS-吐溫0.05%-FCS1%中的ExtravidinAKP(Sigma，St.Louis,MO)至各孔(100nl/孔)。該平板在室溫賻育45分鐘并隨后用PBS-吐溫0.05%洗滌5次。用BioradKit顯示IFNy分泌。每孔添加lOOjil底物(NBT+BCIP)并將平板置于室溫持續(xù)1/2小時。該平板用水洗滌并置于室溫以干燥過夜。用解剖顯樣i鏡對斑點計數(shù)。所測試肽的名單46F9LFLSF.HISNL(H-2K"Heuka叩，2001)A狄APGSTAPPA(H-2Db>T24PTAPP腦VTSAPD"TRPAPGSTAPPG23DGQDVTLAPATEPASGSAATWGQDV23SVTGSGHASSTPGGEKETSATQRS不相關(guān)的肽/R9FRAHY證TF(E7;Db)*測量針對MUC1抗原的Thl/Th2相關(guān)的IgG同種型轉(zhuǎn)換*將96孔平板用3jig/ml的T24PMUC1特異性肽在4。C包被過夜。該肽稀釋于包被緩沖液(200mMNaHCO3,80mMNa2CO3，pH9.5)中并將每孑L添力口lOOfdi亥溶'液。*各孔用洗板機洗滌5次(PBS，0.1%吐溫20，lOmMEDTA)并在溫用300nlPBS+3%BSA飽和1小時。*將各孔洗滌5次并與l/2系列稀釋(在PBS+l。/oBSA中1/25-1/1600)的小鼠血清在室溫孵育2小時。*將平板洗滌5次。添加(100pl/孔)以1/1000稀釋于PBS+1%BSA中的過氧化物酶綴合的大鼠抗小鼠IgG2a(BDPharmingen553391)或大鼠抗小鼠IgGl(BDPharmingen559626)并在室溫孵育1小時。*將各孔洗滌5次并且用100jil底物溶液(0.05M檸檬酸，0.05M乙酸鈉，1V。四曱基聯(lián)苯胺，0.015%11202)/孔顯色。TMB溶液(IOml)=TMB+2plH202+5ml乙酸鈉(0.1M)+5ml檸檬酸鹽(0.1M)*反應(yīng)通過添加100^1的0.8MH2S(V孔終止。在450nm處測量吸光度(Genesyssystem)。3-結(jié)果如操作方法中所述在RenCa-MUCl皮下模型中進行治療實驗。我們觀察到通過局部施用艾達樂TM乳膏劑5%的預(yù)處理在每個實驗結(jié)束時顯著地增加MVATG9931的治療效力，增加了5%-35%無腫瘤小鼠。在本實驗中，無小鼠僅以局部應(yīng)用艾達樂TM進行處理。然而，根據(jù)在不同癌癥模型(表47達OVA的腫瘤)上的已公開信息，據(jù)描述在相隔開的部位處局部應(yīng)用艾達樂頂沒有治療效果(Craft等，2005)。使用Kaplan-Meier存活曲線的LogRank應(yīng)用(Statistics5.1軟件，StatsoftInc.)評估體內(nèi)存活實驗中不同組之間的統(tǒng)計學(xué)差異。P《0.05視為統(tǒng)計學(xué)顯著。圖7說明在renCa-MUCl腫瘤模型中艾達樂+MVATG9931組合的治療效果。也平4亍地進行免疫原性研究以觀察誘導(dǎo)針對MUC1抗原的細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。小鼠如操作方法部分所述進行接種。在第一組試^驗中，使用Elispot測定法計數(shù)分泌MUC1特異性IFNy的細胞的數(shù)目。使用MUClH-2Db,H-2Kb和長的限制性肽來監(jiān)測免疫后的CD4T細胞反應(yīng)和CD8T細胞反應(yīng)。我們觀察到局部施用艾達樂的預(yù)處理未顯著提高僅用MVATG9931處理所獲得的MHCI類和II類限制性CD4和CD8T細胞的數(shù)目(圖8),在另一組試驗中，使用Elispot測定法計數(shù)分泌MUC1特異性IL-4的細胞的數(shù)目。使用MUC1限制性肽來監(jiān)測免疫后的CD4T細胞反應(yīng)和CD8T細胞反應(yīng)。我們觀察到局部施用艾達樂的預(yù)處理顯著減少僅用MVATG9931處理所獲得的基于Th2的T細胞反應(yīng)數(shù)目(圖9)。最后通過ELISA測量針對MUC1抗原的體液免疫應(yīng)答。為更好表征由艾達樂TM+MVATG9931組合誘導(dǎo)的應(yīng)答類型，分析了IgG同種型轉(zhuǎn)換。檢測了MUC1特異性IgGl和IgG2a(圖10)。我們觀察到局部施用艾達樂的預(yù)處理誘導(dǎo)了典型Thl型應(yīng)答(比IgGl更高的IgG2a滴度)，其中所述的典型Thl型應(yīng)答能夠暗示在治療中的功效。C-結(jié)論和討論這些實驗首次證實局部應(yīng)用艾達樂TM可以改善基于MVA的疫苗針對抗原的治療效力(改善免疫應(yīng)答)。48權(quán)利要求1.重組病毒疫苗，所述重組病毒疫苗含有(i)至少一種重組病毒載體，其在體內(nèi)表達至少一種異源核苷酸序列，尤其是編碼抗原的異源核苷酸序列，和(ii)至少一種1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物。2.權(quán)利要求l所述的重組病毒疫苗，其中所述的病毒載體是痘病毒。3.權(quán)利要求1或2所述的重組病毒疫苗，其中所述的1H-咪唑并[4，5-c]喹啉_4-胺衍生物是由下列通式I-V之一定義的化合物或其類似物、溶劑化物或鹽，其中Rn選自直鏈或支鏈烷基、羥烷基、酰氧基烷基、芐基、(苯基)乙基和苯基，所述的節(jié)基、(苯基)乙基或苯基取代基任選地在苯環(huán)上由彼此獨立地選自Cw烷基部分、d-4烷氧基部分和卣素的一個或兩個部分取代，條件是如果所述苯環(huán)由所述部分中的兩個取代，則所述的部分合起來含有不多于6個碳原子；Ru選自氬、d-s烷基部分、芐基、(苯基)乙基和苯基，所述芐基、(苯基)乙基或苯基取代基任選地在苯環(huán)上由彼此獨立地選自C"烷基部分、d-4烷氧基部分和卣素的一個或兩個部分取代，條件是當苯環(huán)由所述部分中的兩個取代時，則所述部分合起來含有不多于6個碳原子；并且每一R!彼此獨立地選自氫、Cw烷氧基部分、卣素和C!-4烷基部分，并且n是0-2的整數(shù)，條件是如果n是2，則所述R!基團合起來含有不多于6個碳原子；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>或其類似物、溶劑化物或鹽，其中Ru選自直鏈或支鏈Qj.K)鏈烯基和取代的直鏈或支鏈C^。鏈烯基，其中所述取代基選自直鏈或支鏈d-4烷基部分和C3_6環(huán)烷基部分；和由直鏈或支鏈d-4烷基部分取代的C3_6環(huán)烷基部分；并且R22選自氫、直鏈或支鏈d-s烷基部分、千基、(苯基)乙基和苯基，所述千基、(苯基)乙基或苯基取代基任選地在苯環(huán)上由彼此獨立地選自直鏈或支鏈d-4烷基部分、直鏈或支鏈Cw烷氧基部分和卣素的一個或兩個部分取代，條件是當苯環(huán)由兩個這樣的部分取代時，則所述部分合起來含有不多于6個碳原子；并且每一R2彼此獨立地選自直鏈或支鏈Cw烷氧基部分、閨素和直鏈或支鏈d-4烷基部分，并且n是0-2的整數(shù)，條件是如果n是2，則所述R2基團合起來含有不多于6個碳原子；III-<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>或其類似物、溶劑化物或鹽，其中R23選自氫、直鏈或支鏈d.s烷基部分、爺基、(苯基)乙基和苯基，所述芐基、(苯基)乙基或苯基取代基任選地在苯環(huán)上由彼此獨立地選自直鏈或支鏈Cw烷基部分、直鏈或支鏈CM烷氧基部分和鹵素的一個或兩個部分取代，條件是當苯環(huán)由兩個這樣的部分取代時，則所述部分合起來含有不多于6個碳原子；并且每一R3彼此獨立地選自直鏈或支鏈C^烷氧基部分、卣素和直鏈或支鏈CL4烷基部分，并且n是0-2的整數(shù)，條件是如果n是2，則所述R3基團合起來含有不多于6個碳原子；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>或其類似物、溶劑化物或鹽，其中R,4是-CHR34R"，其中R44是氫或碳-碳鍵，條件是當R44是氫時，則R34是d—4烷氧基部分、Cw羥基烷氧基部分、C2_1Gl-炔基部分、四氫吡喃基、其中烷氧基部分含有1-4個碳原子和烷基部分含有1-4個碳原子的烷氧基烷基、2-、3-或4-p比1^^，并且進一步的條件是當R"是碳-碳鍵時，則R"與R34共同形成了任選地用彼此獨立地選自羥基和Cw羥烷基部分的一個或多個取代基取代的四氫呋喃基；R24選自氫、Cw烷基、苯基，其中所述的苯基任選地由彼此獨立地選自直鏈或支鏈d—4烷基部分、直鏈或支鏈d-4烷氧基部分和卣素的一個或兩個部分取代；并且R4選自氫、直鏈或支鏈d—4烷氧基部分、卣素和直鏈或支鏈C，.4烷基部分；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>或其類似物、溶劑化物或鹽，其中R5選自氫；直鏈或支鏈Cw。烷基部分和取代的直鏈或支鏈Cwo烷基部分，其中所述的取代基選自Cw環(huán)烷基和由直鏈或支鏈C"烷基部分取代的<:3_6環(huán)烷基；直鏈或支鏈Cwo鏈烯基和取代的直鏈或支鏈Cwo鏈烯基部分，其中所述的取代基選自C^6環(huán)烷基和由直鏈或支鏈C"烷基部分取代的<:3.6環(huán)烷基；Cw羥烷基；其中烷氧基部分含有1個至約4個碳原子和烷基部分含有1個至約6個碳原子的烷氧基烷基；酰氧基烷基，其中酰氧基部分是2個至約4個碳原子的烷酰氧基或苯曱酰氧基，并且烷基部分含有1個至約6個碳原子；千基；(苯基)乙基和苯基；所述的千基、(苯基)乙基或苯基取代基任選地在苯環(huán)上由彼此獨立地選自d-4烷基部分、d_4烷氧基部分和卣素的一個或兩個部分取代，條件是當所述苯環(huán)由所述部分中的兩個取代時，則所述部分合起來含有不多于6個碳原子；R25是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中R35選自d，4烷氧基部分、其中烷氧基部分含有1個至約4個碳原子和烷基部分含有1個至約4個碳原子的烷氧基烷基；d_4鹵代烷基部分；其中烷基含有1個至約4個碳原子的烷基酰胺基；氨基；用Cw烷基或d-4羥烷基取代的氨基；疊氮基；Cw烷硫基；R55和R45彼此獨立地選自氫、C"烷基部分、苯基，其中所述的苯基任選地由彼此獨立地選自直鏈或支鏈Cw烷基部分、直鏈或支鏈Cw烷氧基部分和卣素的一個或兩個部分取代；并且Rs選自氫、直鏈或支鏈d，4烷氧基部分、鹵素和含有直鏈或支鏈Cw烷基的部分。4.權(quán)利要求1或2所述的重組病毒疫苗，其中所述的1H-咪唑并[4，5-c奮淋_4-胺衍生物是由下列通式VI定義的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>或其類似物、溶劑化物或鹽，其中Rt選自氫、直鏈或支鏈CL4烷氧基部分、卣素和直鏈或支鏈Cw烷基；Ru是2-甲基丙基或2-羥基-2-甲基丙基；并且Rv是氫、C^烷基、或其中烷氧基部分含有1個至約4個碳原子和烷基部分含有l(wèi)個至約4個碳原子的烷氧基烷基。全文摘要本發(fā)明涉及新的重組病毒疫苗。具體地，本發(fā)明提供了組合產(chǎn)物，其包含重組的病毒載體和能夠改善由該重組的病毒載體產(chǎn)生的體內(nèi)免疫應(yīng)答的特定化合物。文檔編號A61K39/39GK101472610SQ200780023231公開日2009年7月1日申請日期2007年6月15日優(yōu)先權(quán)日2006年6月20日發(fā)明者J-Y·博納富瓦,S·保羅申請人:特朗斯吉有限公司