專利名稱：水解過敏素的制備方法
水解過敏素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然過敏素的提取液的制備方法、來自這些提取液的 肽以及可由新型方法獲得的過敏素提取液。
普通的過敏素為花粉、塵螨、霉菌、藥物、食物和動物毛發(fā)和皮屑。
最普通的過敏反應(yīng)疾病為鼻炎，哮喘和特應(yīng)性皮炎。過敏性哮喘為
慢性炎性紊亂。通過使用抗阻胺藥、(3-拮抗劑((3-antogonists)和皮質(zhì)
類固醇實現(xiàn)過敏性紊亂的癥狀治療。
此外，所謂的"特效"免疫療法基于脫敏作用。通常對患者實施 特效冒犯性(offending)過敏素的皮下注射。治療起始于小的過敏素劑 量并增加計量。通常治療保持幾年。此類治療遭受純的患者順應(yīng)性， 且因為患者經(jīng)受嚴重的過敏性反應(yīng)之苦，該類治療由于安全性原因而 被質(zhì)疑。
除了包含重復(fù)的皮下注射的方法之外，還有口腔脫敏作用的方法。 美國專利4,822,611公開了包含使用過敏素的口腔治療的治療過敏 的方法。美國專利4,822,611描述了顯示來自不同制造商的提取液的逐 批差異和不同的商購"散裝"致敏性提取液。未描述這些提取液的制 備。
GB 1 247 614公開了提取過敏素的方法。該方法的目的是通過包 括所有可提取的過敏素成分得到更完全和有效的致敏性提取液。
美國專利5,770,698公開了過敏性活性蛋白質(zhì)提取液的提純方法。 圖2的譜未顯示280nm的峰。這意味著所述提取液含有顯著含量的非蛋 白質(zhì)雜質(zhì)。WO 99/22762公開了類似的方法，因此，產(chǎn)物也包含大量 非蛋白質(zhì)雜質(zhì)。
在另一方面，有發(fā)展基于單表位的高特效制劑的趨勢。例如，WO
600/58349公開了分離并純化的包含兩個肽鍵遠離酪氨酸/精氨酸對的亮 氨酸的肽。能使用這些肽制備藥物組合物以完成治療或預(yù)防，在此情 況下尤其用于狗的犬過敏反應(yīng)。
在一方面，使用方法以純化特定識別的單個致敏性分子。在另一 方面，人們試圖制造盡可能完全的致敏性提取液。
根據(jù)第一選擇，過敏素制劑無相關(guān)的表位以在確定的患者內(nèi)引發(fā) 耐受性一直都有可能。第二選擇具有逐批差異的缺點和存在能夠引起 免疫反應(yīng)的化合物(如DNA分子、碳水化合物、它們的絡(luò)合物的脂) 的缺點。
本發(fā)明的一個目標是克服現(xiàn)有技術(shù)的至少一些缺點，特別是提供 來自天然過敏素的抗原，所述抗原相比于粗過敏素提取液具有顯著降 低的引起變應(yīng)原性反應(yīng)的能力，但也能夠剌激T-細胞。
通過提供過敏素提取液的制備方法解決了所述問題，該過敏素提 取液包含大多數(shù)蛋白質(zhì)(該蛋白質(zhì)含有部分過敏素提取液)但具有降 低的，優(yōu)選非常低含量非蛋白質(zhì)成分(如核酸、脂、糖等)。
本發(fā)明制備的提取液優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的提取液，特別是本發(fā)明制備 的提取液顯示可再生的蛋白質(zhì)組合物而不會被純化至單表位。
本發(fā)明的過敏素提取液的制備方法包含如下步驟
a) 提取包含致敏性蛋白質(zhì)的過敏素天然源以形成提取液，
b) 純化所述提取液以去除非蛋白質(zhì)成分以形成純化的提取液，
c) 將所述純化的提取液變性以形成純化的變性提取液， 所述純化的變性提取液包含蛋白質(zhì)，其中最豐富(w/w)的蛋白質(zhì)
(其一起形成所有蛋白質(zhì)的至少60% (w/w))為至少兩種蛋白質(zhì)，且 所有蛋白質(zhì)占純化的變性提取液干燥重量的至少60% (w/w)。 該方法稱為方法I。
與現(xiàn)有技術(shù)的方法相反，本發(fā)明的方法制備主要包含蛋白質(zhì)的過 敏素提取液而不會將所述提取液純化至單肽或蛋白質(zhì)。
與現(xiàn)有技術(shù)的產(chǎn)物相反，本發(fā)明的產(chǎn)物具有如下優(yōu)點 -基本上去除了除蛋白質(zhì)之外的免疫物質(zhì)_天然過敏素提取液能夠刺激T-細胞而具有降低的引起迅速過敏 性反應(yīng)(嗜堿性粒細胞活化、肥大細胞脫顆粒)的能力
能使用不同的天然過敏素作為起始原料。典型的天然起始原料為 牛奶、毒液、蛋、雜草、草、樹、灌木、花、蔬菜、谷物、菌類、水果、 漿果、堅果、種子、豆類、魚類、貝類、海產(chǎn)、肉類、香料、昆蟲、螨 類、霉菌、動物、鴿子扁虱、蠕蟲、海雞冠、動物皮屑、線蟲、巴西橡 膠樹，以及它們的混合物。
在材料提取之后，純化提取液以去除非蛋白質(zhì)成分，如糖、脂、核 酸等。典型的幾個不同的蛋白質(zhì)以純化的提取液的蛋白餾分存在。
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)， 一種蛋白質(zhì)被純化而其他剩余蛋白質(zhì)為"雜質(zhì)"。
相反，本發(fā)明的目的是一起純化蛋白質(zhì)。使用如SDS-PAGE的方
法并接著通過密度測量法能輕易地測量純化的提取液中的蛋白質(zhì)的相 對含量。
對于蛋白質(zhì)總重量的60%，需要結(jié)合至少兩種最主要的蛋白質(zhì)， 即，沒有單個蛋白質(zhì)占所有蛋白質(zhì)的60% (w/w)或更多。更優(yōu)選地， 所有蛋白質(zhì)的60%由至少3種主要的蛋白質(zhì)形成，優(yōu)選由至少4種主 要的蛋白質(zhì)且更優(yōu)選由至少5、 6、 7、 8、 9或10種蛋白質(zhì)形成。
例如，有如下蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)l: 27%
蛋白質(zhì)2: 13%
蛋白質(zhì)3: 34%
蛋白質(zhì)4: 19% 蛋白質(zhì)5: 17%
一起形成至少60% (-60%或更多)的最主要的蛋白質(zhì)為蛋白質(zhì)3+1 (34+27=61%)。
此外，純化的提取液的蛋白質(zhì)總含量為純化的提取液的至少60重 量％，所述含量優(yōu)選為純化的提取液的至少70重量％或80重量％，更 優(yōu)選為90重量％。
優(yōu)選用水溶液進行提取。合適的鹽為但不限制于如碳酸鹽、碳酸 氫鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、TRIS和HEPES。
也與許多其他提取方法不同，優(yōu)選提取介質(zhì)的量相對較大，即至少為過敏素天然源重量的20倍，優(yōu)選為所述重量的IOO倍或更多。
可通過如下的 一種或多種進行提取液的純化
_離子交換色譜法步驟(包括陰離子交換色譜法和陽離子交換色 譜法)，
-體積排阻色譜法步驟(也稱為凝膠過濾)， -沉淀步驟，
-疏水相互作用色譜法步驟， _假親合和親合色譜法和/或 -滲濾
在優(yōu)選的具體實施方案中使用離子交換色譜法，其中在陽離子交
換劑的情況下負載溶液的pH介于陽離子交換劑的酸性官能pKa和具 有提取液中的蛋白質(zhì)的最低pKa的蛋白質(zhì)的pKa之間。在陰離子交換 劑的情況下所述pH介于陰離子交換劑的堿性官能pKa和具有組成提 取液的蛋白質(zhì)的最高pKa的蛋白質(zhì)的pKa之間。
通過該方法，所有的蛋白質(zhì)結(jié)合于離子交換劑上，而中性雜質(zhì)以 及與離子交換樹脂具有相同電荷的雜質(zhì)將被去除。
在優(yōu)選地具體實施方案中，用包含一種或多種表面活性劑和/或變 性劑的溶液進行至少一個純化步驟。所述表面活性劑可為非離子型、 陰離子型、陽離子型或兩性的。合適的變性劑為離液劑、還原劑和它 們的混合物。合適的變性劑為例如尿素、鹽酸胍、乙二醇、異丙醇。 尿素的合適濃度為3M或更高，優(yōu)選4M或更高。胍鹽的合適的濃度 優(yōu)選為2 M，優(yōu)選為3 M或更高。乙二醇和/或異丙醇的合適濃度為5 重量％或更高，更優(yōu)選為10重量％或更高，不超過20重量％。
在一些情況中，根據(jù)本發(fā)明的方法I制備純化的提取液是足夠的。 此類提取液可用于制備活體外/活體內(nèi)以及試管內(nèi)診斷、過敏性疾病的 預(yù)防和治療。本發(fā)明的進一步的具體實施方案為由方法I的提取液或者 由任何其他來源制備過敏素水解產(chǎn)物的方法。若所述提取液來自任何 其他純化的過敏素源而非來自方法I，需要一個變性的初步步驟以改進 消化性。
所述方法(方法II)包含如下步驟
a)水解變性過敏素以形成過敏素水解產(chǎn)物，
9b)純化所述過敏素水解產(chǎn)物以去除分子量超過IO，OOO Da和低于 1,000 Da的肽，從而獲得純化的水解產(chǎn)物，其中70%，更優(yōu)選80%的 肽介于10,000 Da和1,000 Da之間。
由此獲得的產(chǎn)物的優(yōu)點是所述肽為變性蛋白質(zhì)的消化結(jié)果。由于 特定的大小標定，所述肽具有降低的誘導(dǎo)快速扭敏性反應(yīng)以及促炎癥 反應(yīng)的能力。
如需要，優(yōu)選在離液劑、還原劑或它們的混合物的存在下進行變 性。合適的離液劑為例如尿素和鹽酸胍。典型的還原劑為例如二硫蘇 糖醇(dithiotriethol)、 P-巰基乙醇、硫代甘油和它們的混合物。
通常用酶進行水解步驟。合適的酶為例如胃蛋白酶、胰島素、糜 蛋白酶。也能在離液劑，優(yōu)選尿素或鹽酸胍的存在下進行該水解歩驟。 在水解過程中尿素和鹽酸胍的濃度應(yīng)低于4 M，優(yōu)選低于3 M。
在方法II的步驟b)中，分子量大于10,000 Da或小于l，OOO Da 的肽被去除。
因此，純化的水解產(chǎn)物的肽包含分子量介于1,000至10,000 Da的 肽。去除大或小的肽的合適方法為超濾和體積排阻色譜法。該體積排 阻色譜法也可在離液劑，例如尿素、鹽酸胍、乙二醇、異丙醇和它們 的混合物的存在下進行。
本發(fā)明的進一步的具體實施方案為可由本發(fā)明的方法I獲得的過 敏素提取液。通常在該提取液中，以重量計最主要的蛋白質(zhì)(其一起 形成所有蛋白質(zhì)的至少60重量％)為至少2種蛋白質(zhì)，優(yōu)選至少3或 4種蛋白質(zhì)或更優(yōu)選至少5、 6、 7、 8、 9或10種蛋白質(zhì)。通過光密度 260^見到純度光密度280nm-比率〈1,優(yōu)選< 0.9，更優(yōu)選介于0.75 禾口 0.9之間。
進一步的具體實施方案為可由方法II獲得的過敏素水解產(chǎn)物。所 述過敏素水解產(chǎn)物能用于
-過敏性疾病的活體內(nèi)診斷點剌試驗、皮內(nèi)注射、結(jié)膜、吸氣
和吸入試驗
-過敏性疾病的活體外和試管內(nèi)診斷試驗中所用的ELISA試劑 盒或標準樣品
-過敏性疾病的預(yù)防和治療用于脫敏/脫敏作用治療以及結(jié)合/不結(jié)合佐劑的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)。
本發(fā)明的過敏素提取液能用于藥物組合物和/或食物組合物的制備 以誘導(dǎo)耐受性。耐受性的誘導(dǎo)能用于治療和防止過敏性反應(yīng)。
本發(fā)明的進一步的具體實施方案為包含完整形式或水解形式的本 發(fā)明的過敏素提取液的藥物組合物。此外，藥物組合物可包含一種或 多種如下物質(zhì)三磷酸核苷、二磷酸核苷、單磷酸核苷、核酸、肽核酸、 核苷或它們的類似物、免疫抑制細胞因子、誘導(dǎo)免疫蛋白酶體、1，25-二 羥基維生素D3或它們的類似物的表達的化合物、脂多糖、內(nèi)毒素、熱
休克蛋白、具有NADPH或NADP-硫氧還蛋白還原酶的硫氧還蛋白、二 硫蘇糖醇、如舒喘靈的腎上腺素能受體、如丁氧胺的腎上腺素能受體、 調(diào)節(jié)粘連分子ICAM-1、 N-乙酰基-L-半胱氨酸、y-L-谷氨?；?L-半胱氨 酰-甘氨酸(還原的L-谷胱甘肽)、a-2-巨球蛋白的表達的化合物、Fo鄧3 基因表達的誘導(dǎo)物、黃酮類、異黃酮類、紫檀堿(pterocarpanoids)、如 白藜蘆醇的二苯乙烯、速激肽受體拮抗劑、糜酶抑制劑、類似CpG或 MPL的疫苗佐劑或類似酵母多糖、P-l，3-葡聚糖的致耐受性佐劑、調(diào)節(jié) T-細胞誘導(dǎo)物、將粒子粘合至腸粘膜的粘膜-粘連劑(如植物凝集素、鋅、 鋅鹽、多糖、維生素和細菌溶菌產(chǎn)物)。
基于組合物中的天然過敏素源，可包含選自花粉過敏素、牛乳過敏 素、毒液過敏素、蛋過敏素、雜草過敏素、草過敏素、樹過敏素、灌木 過敏素、花過敏素、蔬菜過敏素、谷物過敏素、菌類過敏素、水果過敏 素、漿果過敏素、堅果過敏素、種子過敏素、豆類過敏素、魚類過敏素、 貝類過敏素、海產(chǎn)過敏素、肉類過敏素、香料過敏素、昆蟲過敏素、螨 類過敏素、霉齒過敏素、動物過敏素、鴿子扁虱過敏素、蠕蟲過敏素、 海雞冠過敏素、動物皮屑過敏素、線蟲過敏素、巴西橡膠樹過敏素的過 敏素。
在優(yōu)選的具體實施方案中，制備藥物組合物用于口腔施用、用于舌 下藥物傳遞、用于腸道藥物傳遞。


圖1:通過IgG免疫印記確定的免疫反應(yīng)性。帶1:分子量標記，
帶2:粗蛋白質(zhì)提取液，帶3:純化的過敏素變性提取液。由BSA5M 和牛乳3%封閉膜?；颊哐逑♂屩?/250。 IgG結(jié)合通過稀釋至1/2,500 的羊抗人IgG HRP檢測并通過TMB載體揭示。過敏素1: ± 61-54 kDa，過敏素2: 士 36-31 kDa。
圖2:通過IgE免疫印記確定的免疫反應(yīng)性。帶1:分子量標記，
帶2:粗蛋白質(zhì)提取液，帶3:純化的蛋白質(zhì)。由BSA5。/。和牛乳3n/。封 閉膜。患者血清稀釋至1/5。 IgE結(jié)合通過稀釋至1/10,000的羊抗人IgE HRP檢測并通過TMB載體揭示。過敏素h ± 61-54 kDa，過敏素2: 土 36陽31 kDa。
圖3: SEC G25洗脫曲線的排阻峰。柱體積/樣品體積的比率為12。 使用三HC1 25 mM、尿素1.5 M， pH 8.0以9毫升/分鐘的流速平衡樹 脂。通過280 nm的吸光度跟蹤洗脫。
圖4:通過SDS-PAGE確定的蛋白質(zhì)曲線。4-12%雙-三凝膠。帶1: 分子量標記，帶2:純化的過敏素變性提取液。使用考馬斯亮藍R-250 進行染色。
圖5:通過SDS-PAGE確定的蛋白質(zhì)和肽曲線。4-12%雙-三凝膠。
帶l:分子量標記，帶2:純化的過敏素變性提取液(13微克)，帶3:
水解產(chǎn)物(13微克)。使用考馬斯亮藍R-250進行染色。
圖6: G50SEC洗脫曲線。使用尿素2M、 NaC1100mM， pH 3.0
平衡柱子。流速為15毫升/分鐘。柱體積/樣品體積的比率為10。通過
280 nm的吸光度跟蹤洗脫。
圖7: HPLC分析的標定曲線。將10微升如下標準樣品(1毫克/
毫升)注射至BioSep-SECS2000柱1.牛血清白蛋白(66kDa)， 2.(3-
乳球蛋白(18.5kDa)，3.細胞色素C(12kDa)，4.高血糖素(3.5 kDa)，
5. 1 kDa合成肽。
圖8 : 體積排阻HPLC曲線。柱BioSep-SEC S2000 (PHENOMENEX)。洗脫緩沖液Na2HP04 50 mM—SDS 0.5% (w/v) pH6.8。流速為l毫升/分鐘。在214nm檢測。注射10微升樣品。使 用介于10kDa和1 kDa界限之間的曲線下面積計算感興趣的肽的百分 率。
圖9:花粉衍生產(chǎn)物的變應(yīng)原性性質(zhì)。用增加濃度(0、 1、 10、 100 和1000納克/毫升)的花粉粗提取液，花粉純化的蛋白質(zhì)和花粉純化的 肽孵育來自花粉過敏志愿者的血樣。通過具有在IgE-陽性白細胞上的 門控的流式細胞術(shù)測定gp53蛋白質(zhì)表達。結(jié)果表述為活化細胞中的
12gP53陽性細胞百分數(shù)(2次測量的平均±偏差)。
圖10:通過花粉蛋白質(zhì)和花粉肽進行的人類PBMC增殖性的剌激。 在增加濃度(10 30和90微克/毫升)的花粉蛋白質(zhì)或花粉肽存在下在 37°C孵育由花粉過敏志愿者純化的人類PBMC 5天。將^H]-胸腺嘧啶 核苷加入細胞培養(yǎng)基16小時，并使用液體閃爍原理利用P計數(shù)器測定 所述[SH]-胸腺嘧啶核苷的摻入。結(jié)果表述為5次測量 白勺fi勻。 本發(fā) 明 的方法進一步通過如下非限制性的實施例示例。
實施例
敘譜7,'微
將1% (w/v)花粉(來自ALLERGON的丄o/ZMw;^"""e)加入碳 酸氫鈉(12.5mM)并在攪拌下孵育2小時。然后通過加入2% (w/v) 的硅藻土 (ACROS)并通過0.2微米的過濾器使所述溶液澄清并過濾。 該樣品構(gòu)成粗提取液。
使用花粉過敏患者的血清通過免疫印跡分析提取液中過敏素的存 在。用抗人IgG或IgE抗體使IgG和IgE表位顯影。
如圖1和2所示，在提取液中有兩種主要的過敏素。
將所述粗提取液酸化至pH3.0并加入Tween20 (0.1%， v/v)。該 樣品構(gòu)成酸化的提取液。
敘總2,遊素節(jié)鄉(xiāng)艦
所述過敏素提取液通過如下進行純化
-陽離子交換色譜法
用28x床體積(Bv)的碳酸氫鈉12.5 mM、檸檬酸鹽30 mM，pH3.0、 Tween 20 0.1% ( v/v )平衡微孔離子交換膜(sartobind ) S-膜 (SARTORIUS)。將所述酸化的提取液加載至所述平衡膜。最初用35x Bv的碳酸氫鈉12.5 mM、檸檬酸鹽30 mM，pH 3.0、Tween 20 0.1%(v/v) 沖洗柱子，然后用42x Bv的碳酸氫鈉12.5 mM、擰檬酸鹽30 mM， pH 3.0沖洗柱子。用碳酸鹽0.1M、氯化鈉0.5M， pH9.15洗脫蛋白質(zhì)。 通過280 nm的OD跟蹤蛋白質(zhì)的存在。集中感興趣的餾分。
-硫酸銨沉淀
該步驟在0-4。C下進行。
將達到90%飽和的一定數(shù)量的硫酸銨在攪拌下加入產(chǎn)物。在鹽全部溶解之后停止攪拌。所述懸浮液孵育過夜并在15分鐘期間以10,000
g離心2次。每次仔細丟棄上清液。 -變性
將微粒以9毫克/毫升再懸浮于尿素6 M、 DTT 10 mM、三HC1 0.1 丄v丄，pri o.u， 義「1工J廠L l"Pf冃丄勺、口、J 。
-在G25樹脂(來自AMERSHAM的細Sephadex)上的體積排阻 色譜法
將所述變性樣品加載至柱子并用三HCl 25 mM、尿素1.5 M，pH 8.0
洗脫蛋白質(zhì)。
通過在280nm的OD測量跟蹤蛋白質(zhì)的存在。集中感興趣的餾分 以構(gòu)成純化的變性過敏素提取液。
進一步分析所述純化的過敏素提取液。測定蛋白質(zhì)含量(BCA測 定)和干燥重量以評估蛋白質(zhì)純度。通過去除碳水化合物(苔黑酚試 驗)并也通過OD刑/ OD28()的降低跟蹤純化效率。
表l:去除非蛋白質(zhì)組分以形成純化的提取液
蛋白質(zhì)/干燥重量 比率OD260/OD，比率碳水化合物/蛋白質(zhì) 比率
粗提取液16%1.3400%
純化的提取液85%0.7517%
如表1所示，所述純化方法允許
-提取液中蛋白質(zhì)百分率由~15%增加至80%
- OD260/OD280比率趨于0.5 (其表示純蛋白質(zhì))
-碳水化合物的顯著去除(剩余含量代表蛋白質(zhì)的碳水化合物部分)。
圖4表示對于純化的變性過敏素提取液得到的典型的SDS-PAGE 曲線。由圖可見，6種蛋白質(zhì)占純化的提取液中的蛋白質(zhì)總重量的至少 60%。
實，/丄'體逝素微艦，
使用如下規(guī)程水解所述提取液
將所述純化的過敏素提取液酸化至pH2.0。以2.5毫克/毫升的花
14粉蛋白質(zhì)和1Eu.Ph.U的胃蛋白酶(MERCK)(對于337毫克蛋白質(zhì)) 在37°C和2小時期間進行消化。
圖5顯示了純化的提取液(帶2)和水解的提取液(帶3)之間的 比較。由圖可見，在用胃蛋白酶孵育之后，對應(yīng)于變性未消化蛋白質(zhì) 的高分子量蛋白質(zhì)消失。
敘譜('錄眾
為了去除MW》10,000 Da和MW S l，OOO Da的肽，通過如下方式 純化所述水解產(chǎn)物
-在G50樹脂(來自AMERSHAM的細Sephadex)上的體積排阻 色譜法
將16.5% (v/v)的異丙醇和0.1MNaCl加入所述水解產(chǎn)物。迅速 將該樣品加載至G50柱。洗脫所述肽并集中含有肽(MWSlOkDa) 的餾分，如圖6所示。
-在lkDa膜上的滲濾(來自PALL的超濾卡Omega PES)
將所述肽濃縮10x，用10體積的三HC150mMpH7.4滲濾，并最 終濃縮2.5x。該樣品構(gòu)成純化的過敏素水解產(chǎn)物。
通過體積排阻HPLC控制純化的效率。用Na2HP04 50 mM - SDS 0.5% (w/v) pH 6.8以1毫升/分鐘的流速平衡BioSep-SEC S2000柱 (PHENOMENEX )。在214 nm處檢測肽。
如圖7所示例由標定曲線計算10 kDa和1 kDa界限。
如圖8所示，分子量介于1,000 Da禾n 10，000Da之間的肽占純化的 水解產(chǎn)物中所有肽的約75%。
實雄5,資座微辦爍
通過測量其誘導(dǎo)嗜堿性細胞脫粒的能力評定花粉粗提取液(根據(jù) 實施例1)、純化的花粉蛋白質(zhì)(根據(jù)實施例2)和純化的花粉肽(根 據(jù)實施例4)的變應(yīng)原性性質(zhì)。
在試管內(nèi)對用增加濃度的花粉粗提取液、純化的蛋白質(zhì)和純化的 肽孵育的來自花粉過敏志愿者的新鮮人類血樣進行試驗。通過測量、 通過流式細胞法、在活化細胞(即IgE陽性細胞)的細胞膜上的gp53 蛋白質(zhì)標記的表達評定嗜堿性細胞脫粒。該蛋白質(zhì)通常在剩余細胞內(nèi) 的顆粒的膜中存在，且一旦細胞活化會出現(xiàn)在細胞表面(由于顆粒的膜與細胞質(zhì)膜的融合)。因此通過標記的特定抗-gp53抗體，該蛋白質(zhì) 變得可檢測。如圖9所示，相比于純化的蛋白質(zhì)，純化的肽為約30x 較不致敏，且相比于花粉粗提取液，純化的肽為100x較不致敏。
實蕭6..鄉(xiāng)激靡絲漏激贈
通過測量其激發(fā)人類外周血單核細胞(PBMC)的增殖性研究過敏 素蛋白質(zhì)和肽的致免疫性。
將通過密度梯度離心純化的PBMC (其來自"花粉-致敏性"志愿 者的血樣)在增加濃度的花粉蛋白質(zhì)和花粉肽存在下在96-孔板中培養(yǎng) 5天。在第5天，將[3司-胸腺嘧啶核苷加入細胞培養(yǎng)基并進一步在37°C 下孵育所述板16小時。使用液體閃爍原理利用(3計數(shù)器測定[3司-胸腺 嘧啶核苷的摻入。
花粉蛋白質(zhì)(根據(jù)實施例2)和花粉肽(根據(jù)實施例4)以劑量濃 度依賴性的方式激發(fā)人類PBMC的增殖。由過敏素肽誘導(dǎo)的增殖略微 低于在應(yīng)答蛋白質(zhì)中所觀察到的增殖。這些結(jié)果顯示肽的制備方法保 持了大多數(shù)在T細胞活化中牽涉的過敏素的表位。
1權(quán)利要求
1、一種天然過敏素的純化的提取液的制備方法，該制備方法包含如下步驟a)提取包含致敏性蛋白質(zhì)的過敏素天然源以形成提取液，b)純化所述提取液以去除非蛋白質(zhì)成分以形成純化的提取液，c)將所述純化的提取液變性以形成純化的變性提取液，所述純化的變性提取液包含蛋白質(zhì)，其中一起形成所有蛋白質(zhì)的至少60％(w/w)的最豐富(w/w)的蛋白質(zhì)為至少兩種蛋白質(zhì)，且所有蛋白質(zhì)占純化的變性提取液干燥重量的至少60％(w/w)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在不含鹽或包含選自碳酸鹽、 碳酸氫鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、TRIS或HEPES的鹽的溶液中進行所述 提取。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中用提取介質(zhì)進行所述提 取，其中提取介質(zhì)的重量為過敏素天然源重量的至少20倍，優(yōu)選為100 倍。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其中所述純化包含一 個或多個離子交換色譜法步驟、凝膠過濾或體積排阻色譜法步驟、沉 淀步驟、疏水相互作用色譜法步驟、假親合或親合色譜法步驟或滲濾 步驟。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其中使用包含表面活 性劑和/或變性劑的溶液進行至少一個純化歩驟。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中使用選自離液劑、還原劑或 它們的混合物，優(yōu)選選自尿素、鹽酸胍、二硫蘇糖醇、硫代甘油、P-巰基乙醇或它們的混合物的變性劑進行變性。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中尿素的濃度高于4M，優(yōu)選 高于5M和/或鹽酸胍的濃度超過3M，優(yōu)選超過4M。
8、 一種天然過敏素的純化的提取液的制備方法，該制備方法包含 如下步驟a) 水解變性過敏素以形成過敏素水解產(chǎn)物，b) 純化所述過敏素水解產(chǎn)物以去除分子量超過10,000 Da和低于 l，OOO Da的肽，從而獲得純化的水解產(chǎn)物，其中70%，更優(yōu)選80%的 肽介于IO，OOO Da和1,000 Da之間。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中使用酶，優(yōu)選胃蛋白酶、胰 島素或糜蛋白酶進行水解。
10、 根據(jù)權(quán)利要求8至9任一項所述的方法，其中在離液劑的存 在下進行水解，所述離液劑優(yōu)選選自尿素或鹽酸胍。
11、 根據(jù)權(quán)利要求8至IO任一項所述的方法，其中通過體積排阻 色譜法和/或通過超濾進行肽的去除。
12、 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中在優(yōu)選選自尿素、鹽酸胍、 乙二醇、異丙醇或它們的混合物的離液劑存在下進行體積排阻色譜法 步驟。
13、 根據(jù)權(quán)利要求8至12任一項所述的方法，其中在水解之前， 將未變性的過敏素變性以形成變性過敏素。
14、 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中在離液劑、還原劑和它們 的混合物存在下進行變性。
15、 一種可通過權(quán)利要求1至7的任一項所述的方法獲得的天然 過敏素的純化的變性提取液。
16、 一種可通過權(quán)利要求8至14的任一項所述的方法獲得的純化的過敏素水解產(chǎn)物。
17、 權(quán)利要求15的過敏素提取液或權(quán)利要求16的過敏素水解產(chǎn) 物用于藥物組合物和/或食物組合物的制備以誘導(dǎo)耐受性的用途。
18、 根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中耐受性的誘導(dǎo)用于治療或 防止過敏性反應(yīng)。
19、 一種包含權(quán)利要求15的過敏素提取液或權(quán)利要求16的過敏 素水解產(chǎn)物的藥物組合物。
20、 根據(jù)權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其另外包含至少一種選 自如下化合物的物質(zhì)三磷酸核苷、二磷酸核苷、單磷酸核苷、核酸、 肽核酸、核苷或它們的類似物、免疫抑制細胞因子、誘導(dǎo)免疫蛋白酶體、 1,25-二羥基維生素D3或它們的類似物的表達的化合物、脂多糖、內(nèi)毒 素、熱休克蛋白、具有NADPH或NADP-硫氧還蛋白還原酶的硫氧還蛋 白、二硫蘇糖醇、如舒喘靈的腎上腺素能受體、如丁氧胺的腎上腺素能 受體、調(diào)節(jié)粘連分子ICAM-1、 N-乙?；?L-半胱氨酸、y-L-谷氨?；?L-半胱氨酰-甘氨酸(還原的L-谷胱甘肽)、a-2-巨球蛋白的表達的化合物、 Foxp3基因表達的誘導(dǎo)物、黃酮類、異黃酮類、紫檀堿、如白藜戸醇的 二苯乙烯、速激肽受體拮抗劑、糜酶抑制劑、類似CpG或MPL的疫苗 佐劑或類似酵母多糖、P-l,3-葡聚糖的致耐受性佐劑、調(diào)節(jié)T-細胞誘導(dǎo) 物、如植物凝集素、鋅、鋅鹽、多糖、維生素和細菌溶菌產(chǎn)物的將粒子 粘合至腸粘膜的粘膜-粘連劑。
21、 根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的藥物組合物，其中所述過敏素選 自花粉過敏素、牛乳過敏素、毒液過敏素、蛋過敏素、雜草過敏素、草 過敏素、樹過敏素、灌木過敏素、花過敏素、蔬菜過敏素、谷物過敏素、 菌類過敏素、水果過敏素、漿果過敏素、堅果過敏素、種子過敏素、豆 類過敏素、魚類過敏素、貝類過敏素、海產(chǎn)過敏素、肉類過敏素、香料過敏素、昆蟲過敏素、螨類過敏素、霉菌過敏素、動物過敏素、鵒子蜱 過敏素、蠕蟲過敏素、海雞冠過敏素、動物皮屑過敏素、線蟲過敏素、 巴西橡膠樹的過敏素。
22、根據(jù)權(quán)利要求19至21任一項所述的藥物組合物用于口腔施用、 用于舌下藥物傳遞、用于腸道藥物傳遞。
全文摘要
本發(fā)明涉及天然過敏素的純化的提取液的制備方法，該制備方法包含如下步驟a)提取包含致敏性蛋白質(zhì)的過敏素天然源以形成提取液，b)純化所述提取液以去除非蛋白質(zhì)成分以形成純化的提取液，c)將所述純化的提取液變性以形成純化的變性提取液，所述純化的變性提取液包含蛋白質(zhì)，其中一起形成所有蛋白質(zhì)的至少60％(w/w)的最豐富(w/w)的蛋白質(zhì)為至少兩種蛋白質(zhì)，且所有蛋白質(zhì)占純化的變性提取液干燥重量的至少60％(w/w)，以及天然過敏素的純化的提取液的制備方法，該制備方法包含如下步驟a)水解變性過敏素以形成過敏素水解產(chǎn)物，b)純化所述過敏素水解產(chǎn)物以去除分子量超過10,000Da和低于1,000Da的肽，從而獲得純化的水解產(chǎn)物，其中70％，更優(yōu)選80％的肽介于10,000Da和1,000Da之間。
文檔編號A61K39/35GK101478986SQ200780023913
公開日2009年7月8日 申請日期2007年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月29日
發(fā)明者G·凱爾戈阿, G·普拉希爾, S·皮羅頓, T·萊貢 申請人:生物技術(shù)工具公司