專利名稱：：針對(duì)藍(lán)舌病毒的重組疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)(更具體而言，藍(lán)舌病毒(或BTV))的至少一種多核苷酸或者編碼至少一種BTV抗原、免疫原或表位的至少一種核酸分子的載體(vector)，例如可以包含并表達(dá)BTV的至少一種多核苷酸的體內(nèi)和體外表達(dá)載體，或者可以包含并表達(dá)至少一種BTV抗原、免疫原或表位的體內(nèi)和體外表達(dá)載體；以及針對(duì)藍(lán)舌病的免疫原性組合物和疫苗，例如這樣的組合物或疫苗，其可以包含所述載體中的一種或多種和/或所述載體的表達(dá)產(chǎn)物中的一種或多種。本發(fā)明還涉及使用所述載體、組合物和疫苗的方法，其包括針對(duì)該病毒進(jìn)行免疫接種和疫苗接種，表達(dá)出所述多核苷酸的表達(dá)產(chǎn)物，在測(cè)定法中使用所述表達(dá)產(chǎn)物或用于產(chǎn)生在測(cè)定法中可用的抗體；本發(fā)明還涉及制備尤其是所述多核苷酸、載體、組合物、疫苗、測(cè)定法的方法。
背景技術(shù)：
：藍(lán)舌病(BT)是反芻動(dòng)物的由節(jié)肢動(dòng)物傳播的傳染性病毒疾病。牛和山羊可容易被致病BTV感染，但是未呈現(xiàn)廣泛的血管損傷，因此這些物種通常不會(huì)顯示出明顯的臨床跡象。相反地，綿羊中的該疾病的特征在于口、鼻和前胃的粘膜的卡他性炎癥，以及蹄的冠狀帶和板(laminae)的炎癥。上皮發(fā)生脫落，并最終發(fā)生口腔粘膜壞死；腫脹且發(fā)炎的舌和口可以呈現(xiàn)藍(lán)色，該病由此而得名(Spreull1905)。據(jù)估計(jì)，綿羊中的死亡率為1_30%。BTV是環(huán)狀病毒屬(呼腸孤病毒科)的原型病毒，并且由至少24種不同的血清型構(gòu)成(Wilson和Mecham2000)。已經(jīng)在全球的熱帶和溫帶地區(qū)各處鑒定出BTV的不同毒株。在歐洲遠(yuǎn)至北諱45度、在亞洲和北美洲遠(yuǎn)至北諱50度以及南至南諱35度處都發(fā)生過(guò)BTV感染。在反芻動(dòng)物之間BTV并不是接觸傳染的，因此BTV的分布取決于庫(kù)蠓屬(Culicoidessp.)的節(jié)肢動(dòng)物媒介物(vector)物種(蠓)的存在，在世界不同地區(qū)存在不同的媒介物物種。近期的數(shù)據(jù)表明，遺傳漂變和建立者效應(yīng)有助于BTV野生株的個(gè)體基因區(qū)段的多樣化(Bonneau，Mullens等人2001)。已經(jīng)顯示，BTV血清陽(yáng)性的動(dòng)物對(duì)于同源BTV血清型的再感染具有抗性。反芻動(dòng)物的BTV感染是暫時(shí)的，而庫(kù)蠓屬昆蟲(chóng)媒介物的感染是持久的。病毒血癥的持續(xù)時(shí)間取決于動(dòng)物的種類和BTV的毒株。已經(jīng)報(bào)道，綿羊中的病毒血癥可以是非常短4暫的，在BTV感染的個(gè)體綿羊中病毒血癥可以持續(xù)至多41天，在山羊中病毒血癥可以持續(xù)至多42天，而在牛中病毒血癥可以持續(xù)至多100天。由于牛的BTV感染通常導(dǎo)致延長(zhǎng)的但并非持續(xù)的病毒血癥，因此牛起到了儲(chǔ)庫(kù)的作用，從中病毒可以被庫(kù)蠓屬媒介物攝取，然后傳播給其他反芻動(dòng)物(Anderson,Stott等人1985;MacLachlan1994;MacLachlan和Pearson2004)。人們對(duì)許多庫(kù)蠓屬媒介物物種的生態(tài)學(xué)了解得較少，它們的繁殖地點(diǎn)大部分沒(méi)有被表征，并且它們的散布速度也是未知的。在北美洲，Culicoidessonorensis是BTV的主要媒介物。雌性庫(kù)蠓屬昆蟲(chóng)持續(xù)地被BTV感染，并可以在至多14天的外潛伏期后傳播該病毒(Mullens，Tabachnick等人1995)。在溫帶，BTV可以通過(guò)垂直感染的昆蟲(chóng)媒介物而越冬，雖然近期的數(shù)據(jù)表明，在所述昆蟲(chóng)媒介物的幼蟲(chóng)階段中的持續(xù)BTV感染過(guò)程中，外部衣殼基因的表達(dá)降低(White,Wilson等人2005)。BTV病毒粒子的直徑為69nm，其具有雙殼層外殼(衣殼)，所述雙殼層外殼有時(shí)被來(lái)源于受感染細(xì)胞的細(xì)胞膜的脂蛋白"假包膜"所包圍。BTV基因組包含IO個(gè)不同的雙鏈RNA區(qū)段，它們共同編碼了7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1至VP7)和4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3a)(Roy1996);其中9個(gè)基因組區(qū)段為單順?lè)醋?，而區(qū)段10利用第二個(gè)框內(nèi)起始密碼子而編碼NS3和NS3A。在二十面體病毒粒子顆粒中，基因組RNA通過(guò)雙層蛋白質(zhì)衣殼而殼體化(Verwoerd，Els等人1972)。二十面體的核心由兩個(gè)主要蛋白質(zhì)(VP3和VP7)和三個(gè)次要蛋白質(zhì)(VP1、VP4、VP6)組成，并且被外部衣殼所包圍，所述外部衣殼由VP2和VP5(分別由基因組區(qū)段2和5編碼)組成(Roy1996)。VP2負(fù)責(zé)BTV的結(jié)合和進(jìn)入細(xì)胞、中和、血清型特異性以及血細(xì)胞凝集。多聚體形式的VP2(二聚體和三聚體)裝飾了位于病毒顆粒外表面上的VP5支架結(jié)構(gòu)的大部分表面(Hassan和Roy1999)。在24種BTV血清型中，VP2的變化最大，并且抗VP2抗體的水平與在體外和體內(nèi)的病毒中和有關(guān)(Huismans和Erasmus1981)。在BTV的不同血清型和毒株之間，VP5也顯著地變化(deMattos，deMattos等人1994;DeMaula，Bonneau等人2000)，并且雖然到目前為止還沒(méi)有鑒定出VP5特異性的中和性MAb，但是已經(jīng)有數(shù)據(jù)表明，該蛋白質(zhì)通過(guò)其對(duì)VP2的構(gòu)象影響而在中和和血清型決定中起著作用(Huismans禾PErasmus1981;Roy，Urakawa等人1990;DeMaula等人，2000)。將純化的VP2(其通過(guò)用BTV抗核心血清進(jìn)行免疫吸附而除去痕量的VP7)注射到綿羊中。50微克VP2的初始劑量足以誘導(dǎo)沉淀VP2的抗體以及中和性和抑制血細(xì)胞凝集的抗體。這些綿羊完全受到保護(hù)而能夠抵抗相同BTV血清型的強(qiáng)毒株的攻擊。即使在攻擊之前沒(méi)有檢測(cè)到中和抗體，較低劑量的VP2仍提供了顯著水平的保護(hù)(Huismans，vanderWalt等人1987)。進(jìn)來(lái)的數(shù)據(jù)顯示，VP2和NSl表現(xiàn)出被細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞(CTL)所識(shí)別的表位(Andrew,Whiteley等人1995)，而VP7和VP5不可能具有CTL表位。到目前為止，VP3、VP4、VP6、NS2和NS3沒(méi)有在綿羊中激發(fā)CTL應(yīng)答(Lobato，Coupar等人1997)。下表1(從(Wilson和Mecham2000)進(jìn)行了修正)概括了BTV的基因及其蛋白質(zhì)功能表l.藍(lán)舌病毒基因及所編碼的蛋白質(zhì)(其中包括蛋白質(zhì)的位置、性質(zhì)和功能)5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>Lobato和Coupar(Lobato，Coupar等人1997)研發(fā)出基于痘苗病毒的表達(dá)載體以用于體內(nèi)和體外研究，所述表達(dá)載體包含各種插入片段，這些插入片段相應(yīng)于編碼的BTV結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP5和VP7的核苷酸序列。將這些表達(dá)載體施用給兔和綿羊，以在ELISA和中和抗體滴度方面來(lái)評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答，并且在綿羊中測(cè)試VP2和VP5構(gòu)建體的保護(hù)效力。由痘苗病毒所表達(dá)的VP2、VP5和VP2+VP5具有保護(hù)作用，并且在使用VP2和VP5二者進(jìn)行免疫接種的動(dòng)物中產(chǎn)生了最大的、可重現(xiàn)的保護(hù)作用，但是即使使用這種構(gòu)建體，保護(hù)作用也是可變的。有利的是，提供針對(duì)BTV的經(jīng)改善的免疫原性和疫苗組合物，以及制備和使用此類組合物(包括用于不同的診斷方法、測(cè)定法和試劑盒的組合物)的方法。本申請(qǐng)中任何文獻(xiàn)的引用或確認(rèn)并不是承認(rèn)所述文獻(xiàn)可用作關(guān)于本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。本發(fā)明的目的和/或概述本發(fā)明提供了用于在對(duì)BTV或相關(guān)病毒易感的動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)環(huán)狀病毒(尤其是，藍(lán)舌病毒(BTV))的免疫應(yīng)答或保護(hù)性免疫應(yīng)答的免疫原性或疫苗組合物，該組合物包含或基本上由制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的運(yùn)載體(vehicle)或賦形劑以及載體(vector)組成，所述載體包含或基本上由異源核酸分子組成，并且在所述動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)環(huán)狀病毒-BTV蛋白、抗原、免疫原或其表位，例如但不限于BTVVP2(L2)和BTVVP5(M5)多肽。所述載體可以為重組DNA質(zhì)粒或重組病毒，例如重組腺病毒、皰疹病毒或痘病毒(例如禽痘病毒，如金絲雀痘病毒或雞痘病毒)。所述動(dòng)物可以選自由綿羊、牛、豬、山羊、羚羊、馬、駱駝等組成的有蹄類動(dòng)物組。有利地，所述核酸分子分別包含或基本上由編碼BTVVP2(L2)的核苷酸20-2887(SEQIDNO:3和1)和編碼BTV蛋白VP5(M5)的核苷酸30-1610(SEQIDNO:4和2)組成。優(yōu)選的實(shí)施方案包括或由經(jīng)哺乳動(dòng)物密碼子優(yōu)化的核酸分子組成。所述免疫原性或疫苗組合物可以進(jìn)一步包含佐劑(adjuvant)，例如卡波姆。所述免疫原性或疫苗組合物可以進(jìn)一步包含所述動(dòng)物的除了BTV之外的其他病原體的抗原或免疫原或其表位；或者載體，所述載體包含并在所述動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)編碼所述抗原、免疫原或其表位的核酸分子；或者滅活或減毒的除了BTV之外的其他病原體。本發(fā)明另外還涉及試劑盒，其包含或基本上由以下部分組成(a)所述免疫原性或疫苗組合物；和(b)所述動(dòng)物的除了BTV之外的其他病原體的抗原或免疫原或其表位，或者載體，所述載體包含并在所述動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)編碼所述抗原、免疫原或其表位的核酸分子，或者所述動(dòng)物的滅活或減毒的除了BTV之外的其他病原體，其中(a)和(b)在分開(kāi)的容器中，并且所述試劑盒可選地包含關(guān)于(a)和(b)的混合和/或施用的說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明還包括用于在動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)BTV的免疫學(xué)或保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，該方法可以包括向所述動(dòng)物施用包含編碼所述抗原、免疫原或其表位的核酸分子的所述免疫原性或疫苗組合物。本發(fā)明進(jìn)一步包括用于在動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)BTV的免疫學(xué)或保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，該方法可以包括向所述動(dòng)物施用(a)所述免疫原性或疫苗組合物，和(b)分離的BTV抗原、免疫原或其表位，其中在初激-加強(qiáng)方案(prime-boostregimen)中在(b)之前施用(a)，或者在初激-加強(qiáng)方案中在(a)之前施用(b)，或者將(a)和(b)順次地或以混合形式一起施用。本發(fā)明還涉及用于施行上述方法的試劑盒，其可以包含在分開(kāi)的容器中的(a)和(b);以及可選地，關(guān)于混合和/或施用的說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明更進(jìn)一步包括針對(duì)BTV的初激-加強(qiáng)免疫接種或疫苗接種，其中使用DNA疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物來(lái)進(jìn)行初激，所述DNA疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物包含或基本上由編碼BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子組成并且在體內(nèi)表達(dá)所述BTV免疫原、抗原或表位；以及使用疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物(其為BTV滅活、減毒或亞單位(抗原、免疫原和/或表位)制劑)和/或重組或修飾的病毒疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物(其包含或基本上由編碼BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子組成，并且在體內(nèi)表達(dá)所述BTV免疫原、抗原或表位)來(lái)進(jìn)行加強(qiáng)。因此，本發(fā)明提供了針對(duì)BTV的初激-加強(qiáng)免疫接種或疫苗接種的方法，例如這樣的初激-加強(qiáng)免疫接種或疫苗接種，其可以包括向目標(biāo)物種動(dòng)物施用本發(fā)明的DNA疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物(其包含或基本上由編碼BTV抗原、免疫原或表位的核酸分子組成，并且在體內(nèi)表達(dá)所述BTV抗原、免疫原或表位)(作為初激)，然后施用滅活的BTV和/或減毒的BTV或BTV亞單位(抗原、免疫原和/或表位)制劑和/或重組或修飾的病毒疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物(其可以包含編碼BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子，并且在體內(nèi)表達(dá)所述BTV免疫原、抗原或表位)(作為加強(qiáng))，有利的是，在體內(nèi)表達(dá)BTV免疫原、抗原或表位的重組疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物。有利地，可以將加強(qiáng)(boost)與初激(prime)相匹配，例如所述加強(qiáng)包括下列組分或基本上由下列組分組成或表達(dá)下列組分至少一種通過(guò)所述初激而表達(dá)出的抗原、表位或免疫原。根據(jù)本發(fā)明的初激-加強(qiáng)方案可以用于任何年齡的動(dòng)物，有利地年幼動(dòng)物(例如，具有可檢測(cè)的母源性抗體和/或正在吃奶或哺育或母乳喂養(yǎng)的動(dòng)物)、成年前的動(dòng)物(比年幼動(dòng)物年齡大但是還沒(méi)有達(dá)到成熟或成年或者交配或繁殖年齡的動(dòng)物)、成年動(dòng)物(例如達(dá)到交配或繁殖年齡、或者已經(jīng)超過(guò)一生中這一時(shí)期的動(dòng)物)，并且有利的是在懷孕的雌性動(dòng)物中或者在生產(chǎn)、產(chǎn)卵或授精之前的雌性動(dòng)物中采用所述初激_加強(qiáng)方案。本發(fā)明還涉及適合于在此類初激-加強(qiáng)方案中使用的此類免疫原性和疫苗組合物及其試劑盒，以及初激-加強(qiáng)方案。可以對(duì)其實(shí)施所述初激-加強(qiáng)方案的宿主或目標(biāo)物種可以包括易患由環(huán)狀病毒感染引起的疾病的任何動(dòng)物(目標(biāo)或宿主)物種，包括哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)類，特別是人、伴侶哺乳動(dòng)物或動(dòng)物(例如但不限于犬類動(dòng)物、貓類動(dòng)物、馬類動(dòng)物)、動(dòng)物園哺乳動(dòng)物或動(dòng)物(例如水棲哺乳動(dòng)物如海豹、貓類動(dòng)物、馬類動(dòng)物)、動(dòng)物園爬行動(dòng)物(例如蛇、鱷魚(yú)、短吻鱷)和鳥(niǎo)類物種。在年幼動(dòng)物中實(shí)施所述初激_加強(qiáng)方案是特別有利的，這是因?yàn)檫@允許在早期年齡時(shí)進(jìn)行疫苗接種或免疫接種，例如當(dāng)對(duì)年幼動(dòng)物進(jìn)行實(shí)施時(shí)，初激_加強(qiáng)方案中的第一次施用可以在年幼動(dòng)物具有母源性抗體時(shí)的年齡。所述方案的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，其可以向與所述年幼動(dòng)物或彼此處于同一場(chǎng)所或密切接近的懷孕雌性動(dòng)物提供一定程度的安全性。因此，本發(fā)明提供了針對(duì)BTV的初激_加強(qiáng)免疫接種或疫苗接種方法，并且該方法可以對(duì)年幼動(dòng)物(例如小羊羔、小狗或小貓)進(jìn)行實(shí)施，其中所述初激在年幼動(dòng)物具有針對(duì)BTV的母源性抗體之時(shí)進(jìn)行，而所述加強(qiáng)有利地在母源性抗體逐漸減少或降低或通常不存在之時(shí)(例如哺育、母乳喂養(yǎng)后的時(shí)期)進(jìn)行。因此，本發(fā)明還涉及用于實(shí)施初激-加強(qiáng)方案的試劑盒，其包含或基本上由下列組分組成在分開(kāi)的容器中的初激性疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物和加強(qiáng)性疫苗或免疫8學(xué)或免疫原性組合物；以及可任選地，關(guān)于混合和/或施用的說(shuō)明書(shū)。此外，本發(fā)明提供了鑒別診斷方法，其包括向動(dòng)物施用免疫原性或疫苗組合物和/或BTV抗原、免疫原或表位；以及就不由所述免疫原性或疫苗組合物所表達(dá)的和/或不存在于所述BTV抗原、免疫原或表位中的BTV蛋白或其抗體的存在或不存在來(lái)測(cè)試所述動(dòng)物。本發(fā)明還涉及用于施行該方法的試劑盒，其包含在分開(kāi)的容器中的所述免疫原性或疫苗組合物和/或所述BTV抗原、免疫原或表位，和用于就所述BTV蛋白的存在或不存在進(jìn)行測(cè)試的測(cè)定法；以及可選地，關(guān)于施用所述免疫原性或疫苗組合物和/或所述BTV抗原、免疫原或表位，和/或關(guān)于施行所述測(cè)定法的說(shuō)明書(shū)。應(yīng)當(dāng)注意，在本公開(kāi)內(nèi)容中，特別是在權(quán)利要求和/或段落中，諸如"包含"、"所包含的"、"包括"等的術(shù)語(yǔ)，和諸如"基本上由......組成"和"基本上由......構(gòu)成"的術(shù)語(yǔ)具有歸于美國(guó)專利法中這些術(shù)語(yǔ)的含義，例如，這些術(shù)語(yǔ)允許未確切敘述的要素，但是排除了在現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的或者影響本發(fā)明的基礎(chǔ)或新穎特征的要素。這些和其他的實(shí)施方案在以下的發(fā)明詳述中公開(kāi)或者從以下的發(fā)明詳述中而顯而易見(jiàn)，并且由以下的發(fā)明詳述所涵蓋。附圖簡(jiǎn)述通過(guò)實(shí)施例而給出但并不希望將本發(fā)明完全限定于具體實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述可以結(jié)合附圖而得到最好的理解。圖1顯示了BTV-17天然VP2的核酸序列(SEQIDNO:3)對(duì)合成的BTV17經(jīng)密碼子優(yōu)化的VP2的核酸序列(SEQIDNO:1)。圖2顯示了BTV-17天然VP5的核酸序列(SEQIDNO:4)對(duì)合成的BTV17經(jīng)密碼子優(yōu)化的VP5的核酸序列(SEQIDNO:2)。圖3為示意圖，其顯示了編碼經(jīng)優(yōu)化的合成的BTVVP2蛋白的質(zhì)粒043004pPCR-Script的構(gòu)建。圖4為示意圖，其顯示了pNVH6C5LSP-18供體質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶圖譜。圖5為示意圖，其顯示了pCXL148.2(ALVAC供體質(zhì)粒)的構(gòu)建。圖6提供了pCXL148.2供體質(zhì)粒的核酸序列(SEQIDNO:13)。圖7為示意圖，其顯示了pALVACC5H6p-合成的BTVVP2(pLH2030.2)(供體質(zhì)粒)的構(gòu)建。圖8為示意圖，其顯示了編碼經(jīng)優(yōu)化的合成的BTVVP5蛋白的質(zhì)粒043005pPCR-Script的構(gòu)建，以將昆蟲(chóng)痘病毒(桑紅緣燈蛾(Amsactamoorei))的42Kp合成啟動(dòng)子序列添加至BTV-VP5片段。圖9為示意圖，其顯示了在pCR2.1T0P0克隆/穿梭載體中42Kp啟動(dòng)子-驅(qū)動(dòng)的經(jīng)優(yōu)化的合成的BTVVP5的克隆流程(產(chǎn)生pCR2-42KpVP5)，以用于擴(kuò)增42KpVP5盒。圖10為示意圖，其顯示了最終供體同源性載體pC5朋pVP242KpVP5(pLH2078.15)的構(gòu)建，所述最終供體同源性載體包含由H6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的經(jīng)優(yōu)化的VP2和由42K啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的經(jīng)優(yōu)化的BTVVP5，與ALVAC的C5R區(qū)域具有載體同源性。圖11提供了關(guān)于pLH2078.15(pC5H6p合成的BTV-VP242Kp合成的BTV-VP5)(用于產(chǎn)生重組ALVAC+BTV的最終同源性載體)的核酸和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)。A以表觀次序分別公開(kāi)了SEQIDNO:20-21。B公開(kāi)了編碼SEQIDNO:20-21的SEQIDNO:19。C公開(kāi)了編9碼SEQIDNO:20-21的SEQIDNO:19的核苷酸1800-6293。D公開(kāi)了SEQIDNO:22。圖12顯示了流程圖，其圖解說(shuō)明了編碼BTV經(jīng)優(yōu)化的合成的VP2和VP5的重組ALVAC病毒載體(vCP2289)的構(gòu)建。圖13為從質(zhì)粒和ALVAC核酸序列產(chǎn)生的重組ALVAC-BTVvCP2289的理論RE消化圖譜，其由VectorNTI(Invitrogen，Carlsbad,CA)制作。圖14為經(jīng)染色的瓊脂糖凝膠，其顯示了從ALVAC+BTV重組病毒vCP2289制得的基因組DNA的限制性核酸內(nèi)切酶消化(與在上述圖13中所示的理論上的預(yù)期帶型相比較)。圖15顯示了使用BTV特異性DNA探針來(lái)探測(cè)的經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化的vCP2289基因組DNA的Southern印跡分析。圖16顯示了在使用vCP22S9的兩種不同分離物進(jìn)行感染后制備的CEF裂解物和上清液級(jí)分的Western印跡，其中就從ALVAC重組病毒的VP5表達(dá)進(jìn)行探測(cè)。一抗探針為處于l:2000稀釋度的兔抗BTV-17VP5特異性多克隆血清。圖17為在用強(qiáng)毒野生型BTV-17攻擊后，與WNV-CP對(duì)照疫苗相比較而言，使用vCP2289進(jìn)行免疫接種的綿羊的平均體溫的圖。圖18為顯示了在用強(qiáng)毒野生型BTV-17攻擊后，與WNV-CP對(duì)照疫苗相比較而言，使用vCP2289進(jìn)行免疫接種的綿羊的平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)的圖。圖19為顯示了在用強(qiáng)毒野生型BTV-17攻擊后，與WNV-CP對(duì)照疫苗相比較而言，使用vCP22S9進(jìn)行免疫接種的綿羊的平均淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的圖。圖20為顯示了在用強(qiáng)毒野生型BTV-17攻擊后，與WNV-CP對(duì)照疫苗相比較而言，使用vCP22S9進(jìn)行免疫接種的綿羊的平均血小板計(jì)數(shù)的圖。發(fā)明詳述如本文所討論的，本發(fā)明涉及包含BTV的至少一種多核苷酸或者編碼至少一種BTV抗原、免疫原或表位的至少一種核酸分子的載體，例如包含BTV的至少一種多核苷酸的體內(nèi)和體外表達(dá)載體，或者包含并表達(dá)至少一種BTV抗原、免疫原或表位的體內(nèi)和體外表達(dá)載體；以及針對(duì)藍(lán)舌病的免疫原性組合物和疫苗，例如這樣的組合物或疫苗，其包含所述載體中的一種或多種和/或所述載體的表達(dá)產(chǎn)物中的一種或多種。有利地，所述免疫原、抗原包含外部衣殼蛋白VP2(L2)或外部衣殼蛋白VP5(M5)，或者其表位或組合，例如VP2和VP5;VP2;和VP5，或它們的片段。所述組合可以為分開(kāi)的蛋白質(zhì)或多蛋白。因此，所述組合物或疫苗可以包含表達(dá)超過(guò)一種所述蛋白質(zhì)(例如不同的蛋白質(zhì))的一種或多種載體。所述組合物或疫苗可以包含來(lái)自BTV的不同毒株或分離物的蛋白質(zhì)，或者表達(dá)所述蛋白質(zhì)的載體。因此，所述組合物或疫苗可以包含VP2、VP5或其組合，或者表達(dá)VP2、VP5或其組合的載體，其中所述VP2和VP5來(lái)自不同的毒株或分離物。在此方面，應(yīng)當(dāng)注意，存在血清型17BTV分離物或毒株，例如野生分離物(作為區(qū)段保存在GenBank中(deMattos，deMattos等人1994)[VP2]分離物17B81,SEQIDNo.S72158;(Mecham禾PJohnson2005)[VP5]分離物FL99，SEQIDNo:AY855281);和/或美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)VR_875(作為BTV血清型17進(jìn)行保藏；來(lái)自患有典型藍(lán)舌病的綿羊的血液，Wyoming,1962)。由于BTV基因組的分節(jié)段性質(zhì)，對(duì)于每個(gè)血清型區(qū)段獨(dú)個(gè)地測(cè)定每個(gè)區(qū)段的基因組核苷酸序列。表2列出了對(duì)于BTV血清型17可獲得的序列。表2.BTV-17——對(duì)于BTV血清型17可獲得的RNA序列的數(shù)目。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>此外，應(yīng)當(dāng)注意，在血清型內(nèi)的VP2序列的比較系統(tǒng)發(fā)生分析表明了一定程度的同源性，但存在足夠的固有變異性，從而允許在單種血清型內(nèi)區(qū)別病毒譜系。BTV血清型主要受由基因組區(qū)段2所編碼的病毒外部衣殼蛋白VP2控制?？梢栽O(shè)想，區(qū)段2的序列分析不僅可以用于鑒定病毒血清型，而且還可以用于通過(guò)與參照毒株的序列進(jìn)行比較來(lái)鑒定各個(gè)病毒毒株的起源。有利地，在涉及在本發(fā)明組合物或疫苗中存在的或者由本發(fā)明組合物或疫苗中的載體所表達(dá)的至少一種表位的實(shí)施方案中，所述表位來(lái)自VP2、VP5或其組合，并且所述表位可以來(lái)自不同的毒株或分離物。在這方面，應(yīng)當(dāng)注意，人們可以在BTV抗原或免疫原，例如VP5蛋白，例如參見(jiàn)(Martinez—Torrecuadrada，Langeveld等人1999)禾口(Wang，DuPlessis等人1995);VP2蛋白(Heidner，Rossitto等人1990;Rossitto和MacLachlan1992;DeMaula，Bonneau等人2000);以及VP1蛋白(Huang，Hwang等人1995))中對(duì)表位進(jìn)行定位或作圖。此外，如本文所討論的，本發(fā)明涉及使用所述載體、免疫學(xué)組合物和疫苗的方法，其包括針對(duì)該病毒進(jìn)行免疫接種和疫苗接種，表達(dá)出由所述多核苷酸編碼的多肽；和在測(cè)定法中使用所述表達(dá)產(chǎn)物或產(chǎn)生在測(cè)定法中可用的抗體的方法；以及涉及制備尤其是所述多核苷酸、載體、組合物、疫苗、測(cè)定法的方法。因此，本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或抗擊由BTV引起的疾病的手段，從而減輕或消除臨床跡象和/或病毒血癥和/或損傷。本發(fā)明涉及適合于在易患由BTV引起的疾病的不同動(dòng)物(目標(biāo)或宿主)物種中使用的此類免疫原性和疫苗組合物，其中所述動(dòng)物物種包括但不限于哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)類，特別是人、伴侶哺乳動(dòng)物或動(dòng)物(例如犬類動(dòng)物、貓類動(dòng)物、馬類動(dòng)物)、動(dòng)物園哺乳動(dòng)物或動(dòng)物(例如水棲哺乳動(dòng)物、貓類動(dòng)物、馬類動(dòng)物)、動(dòng)物園爬行動(dòng)物和鳥(niǎo)類物種。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于目標(biāo)或宿主物種的免疫接種和疫苗接種方法，其包括所述免疫原性和疫苗組合物。在本發(fā)明的這一方面，可以提及，關(guān)于野生或非馴養(yǎng)的動(dòng)物，例如但不限于野生或非馴養(yǎng)的鳥(niǎo)類或哺乳動(dòng)物，包含一種或多種表達(dá)一種或多種BTV表位或抗原或免疫原的載體的組合物可以通過(guò)食物遞送，例如誘餌滴狀物，或者哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類食物，其被留下用于供野生或非馴養(yǎng)的鳥(niǎo)類或哺乳動(dòng)物消耗，它們包含或含有一種或多種載體，從而能夠通過(guò)消耗所述食物的哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類來(lái)進(jìn)行口服施用。當(dāng)所述一種或多種載體為一種或多種痘病毒，例如，禽痘病毒，例如減毒的金絲雀痘病毒如ALVAC，或減毒的雞痘病毒如TR0VAC;或者痘苗病毒，例如減毒的痘苗病毒如NYVAC時(shí)，這種施用途徑可能是有利的。因此，本發(fā)明設(shè)想了口服或粘膜施用，以及包含一種或多種本發(fā)明載體的可食用的組合物，類似于MERIAL狂犬病產(chǎn)品RAB0RA1"。根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容以及本領(lǐng)域知識(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以配制用于鳥(niǎo)類或哺乳動(dòng)物的可食用的動(dòng)物飼料，其包含合適劑量的一種或多種本發(fā)明載體。此外，本發(fā)明包括含有載體的組合物的局部施用(關(guān)于載體組合物的局部施用，參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)6，348，450)，以及用于向野生或非馴養(yǎng)的動(dòng)物局部施用組合物的裝置(關(guān)于用于嚙齒動(dòng)物和鳥(niǎo)類的此類裝置，參見(jiàn)例如W001/95715，美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)10/374，627，于2003年2月26日提交)，這些文獻(xiàn)中的每一篇文獻(xiàn)，與那里所引用或參考的每一篇文獻(xiàn)一起，以及本文所引用的每一篇文獻(xiàn)和每一篇本文所引用的文獻(xiàn)中所參考或引用的每一篇文獻(xiàn)均通過(guò)提及而合并入本文。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使得能夠進(jìn)行鑒別診斷的手段和方法，例如使得能夠進(jìn)行或允許區(qū)別被致病性BTV感染的動(dòng)物和施用了根據(jù)本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物的動(dòng)物的方法。除了編碼VP2和VP5的多核苷酸以外，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體可以包含編碼BTV的其他蛋白質(zhì)(優(yōu)選地，BTV的結(jié)構(gòu)蛋白)的一種或多種其他多核苷酸，并且所述序列優(yōu)選地選自編碼結(jié)構(gòu)病毒蛋白質(zhì)的那些序列。所述載體優(yōu)選地包含編碼例如相應(yīng)于VP2，VP5，或有利地VP2和VP5，或其表位的區(qū)域的多核苷酸；即，認(rèn)為表達(dá)多種蛋白質(zhì)或其表位是有利的。包含幾種編碼不同蛋白質(zhì)(例如，VP2和/或VP5或其表位)的分開(kāi)的多核苷酸的載體也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。載體，尤其是用于體內(nèi)表達(dá)的載體，還可以包含相應(yīng)于超過(guò)一種BTV血清型、毒株或分離物的多核苷酸，例如兩種或更多種編碼VP2或VP5或其表位的不同毒株的多核苷酸。來(lái)自所有不同的血清型，例如但不限于血清型1、2、4、9、10、11、13、16和17。同樣地，免疫原性或疫苗組合物可以包含一種或多種載體，其用于表達(dá)相應(yīng)于超過(guò)一種BTV血清型、毒株或分離物的多核苷酸，例如兩種或更多種編碼VP2或VP5或其表位的不同毒株的多核苷酸。載體，尤其是用于體內(nèi)表達(dá)的載體，另外還可以包含一種或多種編碼其他致病因子的免疫原和/或細(xì)胞因子的核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)"編碼BTV蛋白的多核苷酸"主要是指編碼所述蛋白質(zhì)的DNA片段或分離的DNA分子，或其互補(bǔ)鏈；但是不排除RNA，這是因?yàn)楸绢I(lǐng)中了解，DNA序列中的胸苷(T)被認(rèn)為相當(dāng)于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，用于在本發(fā)明中使用(例如，用于在RNA載體中使用)的RNA序列可以通過(guò)將DNA序列中的胸苷(T)認(rèn)為相當(dāng)于RNA序列中的尿嘧啶(U)而來(lái)源于DNA序列。術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"包括肽和多肽。如果一旦施用給宿主，就能夠激發(fā)針對(duì)該蛋白質(zhì)的體液和/或細(xì)胞類型的免疫應(yīng)答，那么在這種意義上而言，所述蛋白質(zhì)片段是免疫學(xué)活性的。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)片段是這樣地，即其具有與整體蛋白質(zhì)基本上相同的免疫學(xué)活性。因此，根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)片段包括或基本上由或由至少一個(gè)表位或抗原決定簇組成。術(shù)語(yǔ)"表位"是指能夠誘導(dǎo)體液類型(B細(xì)胞)和/或細(xì)胞類型(T細(xì)胞)的免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)位點(diǎn)。因此，所述多核苷酸的最小結(jié)構(gòu)是這樣的，即其包含或基本上由或由編碼BTV蛋白的表位或抗原決定簇的核苷酸組成。編碼整體蛋白質(zhì)的片段的多核苷酸更有利地包含下列核苷酸或基本上由下列核苷酸組成或由下列核苷酸組成編碼所述整體蛋白質(zhì)或多蛋白的序列的最少21個(gè)核苷酸，有利地至少42個(gè)核苷酸，和優(yōu)選地至少57、87或150個(gè)連續(xù)或鄰接的核苷酸。如之前所提及的，表位確定過(guò)程，例如產(chǎn)生重疊肽文庫(kù)(Hemmer，Pinilla等人1998)，P印scan(Geysen，Meloen等人1984);(Geysen，Barteling等人1985);(VanderZee，VanEden等人1989);(Geysen1990);Mil11ipinP印tideSynthesisKitsdeChiron)以及算法(DeGroot和Rothman1999)可用于實(shí)施本發(fā)明，而無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。關(guān)于確定免疫原或抗原的表位并由此確定編碼此類表位的核酸分子的方法，還可以參考本文所引用和合并入本文的其他文獻(xiàn)。用于表達(dá)所述多核苷酸的元件有利地存在于本發(fā)明的載體中。以最低限度的方式，這包括下列元件或基本上由下列元件組成或由下列元件組成起始密碼子(ATG)、終止密碼子和啟動(dòng)子，以及可選地還有用于某些載體例如質(zhì)粒和某些病毒載體(例如除了痘病毒之外的其他病毒載體)的聚腺苷酸化序列。當(dāng)所述多核苷酸編碼蛋白質(zhì)片段(例如，有利地在載體中)時(shí)，ATG位于閱讀框的5'端，而終止密碼子位于3'端?？梢源嬖谟糜谡{(diào)控表達(dá)的其他元件，例如增強(qiáng)子序列、穩(wěn)定化序列和允許蛋白質(zhì)分泌的信號(hào)序列。用于制備和/或施用用于在體內(nèi)或體外表達(dá)本發(fā)明基因的基因產(chǎn)物的載體或重組體或質(zhì)粒的方法可以是任何所需的方法，例如在下列文獻(xiàn)中公開(kāi)的方法，或者類似于在下列文獻(xiàn)中公開(kāi)的方法的方法，或者在下列文獻(xiàn)所引用的文獻(xiàn)中公開(kāi)的方法美國(guó)專利號(hào)6，130，066;5，494，807;5，514，375;5，744，140;5，744，141;5，756，103;5，762，938;5，766，599;5，990，091;6，004，777;6，130，066;6，497，883;6，464，984;6，451，770;6，391，314;6，387，376;6，376，473;6，368，603;6，348，196;6，306，400;6，228，846;6，221，362;6，217，883;6，207，166;6，207，165;6，159，477;6，153，199;6，090，393;6，074，649;6，045，803;6，033，670;6，485，729;6，103，526;6，224，882;6，312，682;6，312，683;6，348，450;4，603，112;4，769，330;5，174，993;5，505，941;5，338，683;5，494，807;4，394，448;4，722，848;4，745，051;4，769，331;5，591，639;5，589，466;4，945，050;5，677，178;5，591，439;5，552，143;和5，580，859;于1986年10月16日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)920，197;W094/16716;W096/39491;W091/11525;W098/33510;W090/01543;EP0370573;EP265785;(Paoletti1996);(Moss1996);Richardson(Ed)(1995)MethodsinMolecularBiology39，"BaculovirusExpressionProtocols,"HumanaPressInc.;(Smith,Summers等人1983);(Pe皿ock，Shoemaker等人1984);(Roizman1996);(Andreansky，He等人1996);(Robertson,Ooka等人1996);(Frolov，Hoffman等人1996);(Kitson，Burke等人1991);(Ballay，Levrero等人1985);(Graham1990);(Prevec，Schneider等人1989);(Feigner,Kumar等人1994);(Ulmer，Donnelly等人1993);(McClements，Armstrong等人1996);(Ju，Edelstein等人1998);禾口(Robinson和Torres1997)。因此，本發(fā)明中的載體可以為任何合適的重組病毒或病毒載體，例如痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、雞痘病毒、淙熊痘病毒、豬痘病毒等)，腺病毒(例如犬腺病毒)，皰疹病毒，桿狀病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒等(如在通過(guò)提及而合并入文本中的文獻(xiàn)中所述的)；或者所述載體可以為質(zhì)粒。在本文所引用的和通過(guò)提及而合并入文本中的文獻(xiàn)中，除了提供可用于實(shí)施本發(fā)明的載體的實(shí)例之外，還可以提供非BTV蛋白或其表位，例如非BTV免疫原或其表位，細(xì)胞因子等的來(lái)源，它們由在本發(fā)明的多價(jià)或雞尾酒免疫原性組合物或疫苗中的載體所表達(dá)或者包含于本發(fā)明的多價(jià)或混合式(cocktail)免疫原性組合物或疫苗中。本發(fā)明還涉及包含載體例如表達(dá)載體的制劑，例如疫苗或免疫原性組合物。所述制劑可以在制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體(carrier)、賦形劑或運(yùn)載體中包含、基本上由或由一種或多種載體(例如表達(dá)載體，如體內(nèi)表達(dá)載體)組成，所述載體包含、基本上由或由一種或多種BTV多核苷酸組成(和有利地表達(dá)一種或多種BTV多核苷酸)，所述BTV多核苷酸編碼VP2、VP5或其組合或多蛋白，尤其是如上文所提及的(例如，VP2，VP5，VP2和VP5，或者至少其表位)；并且，有利地，所述載體包含并表達(dá)這樣的多核苷酸，所述多核苷酸包含、基本上由或由編碼BTVVP2和/或VP5的編碼區(qū)組成。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，在所述制劑中的其他載體包含、基本上由或由編碼BTV的一種或多種其他蛋白質(zhì)(例如VP2、VP5或其表位)的多核苷酸組成，并且在合適的情況下所述載體表達(dá)BTV的一種或多種其他蛋白質(zhì)(例如VP2、VP5或其表位)。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，在所述制劑中的載體包含或基本上由或由編碼一種或多種BTV蛋白或其表位(例如一種或多種BTV血清型、毒株或分離物的一種或多種BTV蛋白或其表位)的多核苷酸組成；并且，有利地，在合適的宿主細(xì)胞中或者在合適的條件下，所述載體表達(dá)由所述多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明的制劑有利地包含、基本上由或由至少兩種載體組成，其中所述載體包含、基本上由或由經(jīng)來(lái)自不同BTV血清型、毒株或分離物的多核苷酸(其編碼相同蛋白質(zhì)和/或不同蛋白質(zhì)，但優(yōu)選編碼相同蛋白質(zhì))編碼的多肽組成，并且有利地還表達(dá)所述多肽，優(yōu)選地在適宜的條件或合適的條件下或者在合適的宿主細(xì)胞中在體內(nèi)表達(dá)所述多肽。關(guān)于包含一種或多種載體的制劑，其中所述載體包含、基本上由或由編碼BTVVP2或VP5或其表位的多核苷酸組成并且優(yōu)選地表達(dá)(有利地在體內(nèi))所述BTVVP2或VP5或其表位，優(yōu)選的是所述表達(dá)產(chǎn)物來(lái)自兩種、三種或更多種不同的BTV血清型、毒株或分離物，有利地毒株。本發(fā)明還涉及載體的混合物，所述載體包含、基本上由或由不同毒株的VP2或VP5的編碼序列組成，并且表達(dá)不同毒株的VP2或VP5。優(yōu)選的是，在這樣的混合物中，至少一種載體包含、基本上由或由VP2的編碼序列組成，并且表達(dá)VP2。根據(jù)另外一個(gè)實(shí)施方案以及如下文將更詳細(xì)地顯示的，在所述制劑中的其他載體包含并且表達(dá)一種或多種細(xì)胞因子和/或一種或多種其他致病因子的一種或多種免疫原。細(xì)胞因子、其他致病因子的免疫原或其表位、以及編碼它們的核酸分子的來(lái)源可以在本文所引用的文獻(xiàn)中，以及在W002096349，W00208162，W00020025，W000152888，W00145735，W000127097，W00116330，W00077210，W00077188，W00077043，W09842743，W09833928，W09749826，W09749825，美國(guó)專利號(hào)6，387，376、6，306，400、6，159，477、6，156，567、6，153，199、6，090，393、6，074，649、6，033，670中找到。本發(fā)明還涉及本文所公開(kāi)的不同實(shí)施方案的各種組合，例如包含各種不同載體的組合物或疫苗，包含載體和蛋白質(zhì)(BTV和/或非BTV)和/或細(xì)胞因子的組合物或疫苗，等等。包含體外或體內(nèi)表達(dá)載體的制劑構(gòu)成了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述表達(dá)載體包含并且表達(dá)編碼VP2和VP5的多核苷酸。根據(jù)另一個(gè)有利的實(shí)施方案，另外的結(jié)構(gòu)蛋白VP7和/或VP3中的一種或多種與根據(jù)本發(fā)明的VP2和VP5結(jié)構(gòu)蛋白共同表達(dá)，通過(guò)同一個(gè)表達(dá)載體或者通過(guò)它們自己的表達(dá)載體。優(yōu)選地，它們基于單個(gè)多核苷酸而一起表達(dá)(例如，作為多蛋白)。也就是說(shuō)，在某些實(shí)施方案中，所述載體進(jìn)一步包含、基本上由或由編碼VP7和/或VP3的一種或多種核苷酸組成，或者組合物或疫苗進(jìn)一步包含、基本上由或由一種或多種另外的載體組成，其中所述載體包含、基本上由或由編碼VP7和/或VP3的一種或多種核苷酸組成；該載體或這些載體有利地表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白；并且，VP7和VP3有利地共同表達(dá)，并且更有利地表達(dá)為多蛋白。根據(jù)另一個(gè)有利的實(shí)施方案，非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2和NS3和/或VP1、VP4中的一種或多種與根據(jù)本發(fā)明的VP2和VP5結(jié)構(gòu)蛋白共同表達(dá)，通過(guò)同一個(gè)表達(dá)載體或者通過(guò)它們自己的表達(dá)載體。也就是說(shuō)，在某些實(shí)施方案中，所述載體進(jìn)一步包含、基本上由或由編碼VP1、VP4、NS1、NS2和/或NS3的一種或多種核苷酸組成，或者組合物或疫苗進(jìn)一步包含、基本上由或由一種或多種另外的載體組成，其中所述載體包含、基本上由或由編碼VP1、VP4、NS1、NS2和/或NS3的一種或多種核苷酸組成；該載體或這些載體有利地表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白；并且，有利地表達(dá)VP1、VP4、NS1、NS2和/或NS3。因此，本發(fā)明還涉及載體，例如體內(nèi)或體外表達(dá)載體，所述載體包含、基本上由或由編碼VP1、VP4、NS1、NS2和NS3以及它們的組合(包括它們的多蛋白)的多核苷酸組成。所述載體可以為包含、基本上由或由編碼一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白(例如，VP2、VP5、VP7和/或VP3組合及其多蛋白)的多核苷酸組成的上述載體之一，例如包含或基本上由編碼結(jié)構(gòu)蛋白或其表位的多核苷酸組成的此類載體還可以包含或基本上由編碼一種或多種非結(jié)構(gòu)蛋白、其組合、其多蛋白質(zhì)或其表位的多核苷酸組成。作為備選方案，本發(fā)明涉及如上文所描述的制劑，其還引入了至少一種包含編碼并且有利地表達(dá)非結(jié)構(gòu)蛋白的多核苷酸的載體，以及可選地制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體、運(yùn)載體或賦形劑。關(guān)于制備根據(jù)本發(fā)明的載體例如表達(dá)載體，本領(lǐng)域技術(shù)人員具有可得的各種BTV血清型、毒株和分離物，以及它們的基因組核苷酸序列的描述，例如參見(jiàn)本文中的討論，還可以提到其中核酸序列信息可得的24種BTV血清型(Wilson和Mecham2000)。例如，可提及毒株BTV-17。對(duì)于每種蛋白質(zhì)，提供了相應(yīng)的核苷酸序列(deMattos，deMattos等人1994;Huang，Hwang等人1995;Bernard，Israel等人1997)。通過(guò)這些序列的比較和對(duì)比，可以容易地確定在另一種BTV血清型或毒株中編碼這種蛋白質(zhì)的多核苷酸。如本文所討論的，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"被理解為是指編碼對(duì)特定BTV毒株特異的蛋白質(zhì)或其片段或其表位的核酸序列；并且，等價(jià)地，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"被理解為包括不同BTV毒株的相應(yīng)的核苷酸序列以及由于密碼子簡(jiǎn)并性而不同的核苷酸序列。因此，編碼BTVVP2的多核苷酸被理解為包含、基本上由或由下列序列組成(a)BTV-17的nt20-2887(SEQIDNO:3);(b)不同BTV毒株的相應(yīng)的序列；和(c)編碼BTVVP2但由于密碼子簡(jiǎn)并性而不同于(a)和(b)的核苷酸序列。編碼外部衣殼蛋白VP2的BTV的L2基因在全世界的BTV毒株之間具有最大程度的遺傳變異性。這并不另人驚訝，因?yàn)樵摰鞍踪|(zhì)負(fù)責(zé)病毒中和以及血清型特異性(Mecham，Dean等人1986;Roy1992)并且可能受到遺傳漂變和建立者效應(yīng)選擇的影響。遺傳漂變和建立者效應(yīng)可以導(dǎo)致具有增強(qiáng)的毒力的變體(Bernard,Israel等人1997)。已經(jīng)鑒定出多種中和決定子(Ghiasi，F(xiàn)ukusho等人1987;DeMaula，Heidner等人1993;Jewell和Mecham1994)。已顯示，VP2為主要負(fù)責(zé)附著和進(jìn)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)(Hassan和Roy1999)。當(dāng)采用系統(tǒng)發(fā)生分析時(shí)，血清型之間的變異通常導(dǎo)致基于血清型的病毒的隔離，而與分離的地理學(xué)起源無(wú)關(guān)(Pritchard和Gould1995;Bonneau，Zhang等人1999)。BTV的M5基因編碼內(nèi)部外部衣殼蛋白VP5，并且具有在BTV基因中第二大程度的遺傳變異性，其在給定的血清群中顯示出51-71%的同一性。VP5能夠引起外部衣殼結(jié)構(gòu)的構(gòu)象改變，以及中和特征的變化(Cowley和Gorman1989;DeMaula，Bonneau等人2000)。VP5還可以有助于15宿主細(xì)胞識(shí)別(Roy1992)。由于在血清型之內(nèi)和之外的固有遺傳變異性，本發(fā)明涵蓋了編碼這樣的蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)具有這樣的氨基酸序列，該氨基酸序列與所述蛋白質(zhì)的共有BTV氨基酸序列的序列同一性或同源性展現(xiàn)出功能等價(jià)性。例如，所表達(dá)的VP2衣殼蛋白可以與從下列序列表達(dá)的多肽的相應(yīng)的衣殼序列具有大于20%的同一性(a)BTV-17區(qū)段2的核苷酸20-2887(SEQIDNO:3);(b)不同BTV毒株的相應(yīng)的序列；和/或(c)編碼BTVVP2但由于密碼子簡(jiǎn)并性而不同于(a)和(b)、以及由于毒株、血清型和血清群遺傳變異性而來(lái)自(a)和(b)的核苷酸序列。盡管這種變異性，但是從功能上而言，所述多核苷酸編碼VP2衣殼多肽。因此，本發(fā)明包括表達(dá)此類在功能上同源的多肽的多核苷酸；以及那些多核苷酸與編碼多肽(同源多肽與所述多肽具有同源性或同一性)的多核苷酸的相應(yīng)程度的同源性或同一性。同源多肽有利地包含與之存在同一性或同源性的多肽的一種或多種表位，從而使得同源多肽展現(xiàn)出和與之存在同一性或同源性的多肽的免疫學(xué)相似性或同一性，例如，所述同源多肽引發(fā)和與之存在同一性或同源性的多肽相似的或比其更好的免疫應(yīng)答(對(duì)于熟悉技能的免疫學(xué)者而言)，和/或所述同源多肽結(jié)合由與之存在同一性或同源性的多肽所引發(fā)的和/或所結(jié)合的抗體，并且有利地不結(jié)合其他抗體。因此，設(shè)想了使同源多肽和與之存在同一性或同源性的多肽的片段，有利地那些對(duì)于同源多肽或與之存在同一性或同源性的多肽展現(xiàn)出免疫學(xué)相似性或同一性的片段進(jìn)行表達(dá)，并因而本發(fā)明還設(shè)想了并且在本發(fā)明中可使用代表了同源多肽和與之存在同一性或同源性的多肽的多核苷酸片段的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)"序列同一性"表示兩個(gè)相等長(zhǎng)度的氨基酸序列之間或者兩個(gè)相等長(zhǎng)度的核苷酸序列之間的同源性程度的定量量度。如果待比較的兩個(gè)序列不具有相等的長(zhǎng)度，則它們必須盡可能合適地進(jìn)行比對(duì)，其中可能插入缺口或者備選地在蛋白質(zhì)序列的末端截短?？梢詫⑿蛄型恍杂?jì)算為((N^-Ndif)/Xef)X100，其中Ndif為當(dāng)進(jìn)行比對(duì)時(shí)這兩個(gè)序列中非同一的殘基的總數(shù)目，并且其中NMf為所述序列之一中殘基的數(shù)目。因此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC將具有75%的序列同一性(Ndif=2和Nref=8)。缺口被計(jì)為特定殘基的非同一性，即，DNA序列AGTGTC與DNA序列AGTCAGTC將具有75%的序列同一性(Ndif=2和Nref=8)。備選地，序列同一性可以通過(guò)BLAST程序例如BLASTP程序(Pearson和Lipman1988)(www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)來(lái)計(jì)算。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，如(Thompson,Higgins等人1994)所描述的，使用在http:〃www2.ebi.ac.uk/clustalw/處可獲得的序列比對(duì)方法ClustalW(采用缺省參數(shù))來(lái)進(jìn)行比對(duì)。因此，多核苷酸可以為任何核酸分子，包括DNA、RNA、LNA(鎖定核酸)、PNA、RNA、dsRNA、RNA_DNA-雜合物以及非天然存在的核苷。根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，有利地，由本發(fā)明的載體所表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽為免疫學(xué)活性肽和多肽，例如，相對(duì)于BTV-17的多肽或蛋白質(zhì)而言，由本發(fā)明的載體所表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽可以為a)相應(yīng)于一種或多種不同BTV血清型、毒株或分離物的蛋白質(zhì)或多肽；b)不同于BTV-17和/或a)，但與天然BTV蛋白保持等于或大于20%的同一性的蛋白質(zhì)。因此，當(dāng)提及BTV蛋白時(shí)，可以包括本文所討論的另外的蛋白質(zhì)。16不同的BTV血清型和毒株可以在保藏中心處獲得，特別是在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，例如以登錄號(hào)VR-875、VR_1231、VR_187、VR_873、VR_983、VR-1231AF或VR-1231CAF，并且另外如本文中所討論的，還可以化學(xué)合成全基因。在本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述多核苷酸還包含編碼信號(hào)肽的核苷酸序列(位于所表達(dá)的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)的上游)，從而有助于蛋白質(zhì)的分泌；因此，本發(fā)明包括表達(dá)具有前導(dǎo)序列或信號(hào)序列的BTV多肽，例如BTV抗原、免疫原或其片段如表位。前導(dǎo)序列或信號(hào)序列可以為內(nèi)源序列，例如BTV多肽的天然信號(hào)序列。前導(dǎo)序列或信號(hào)序列還可以為異源序列，因而其由對(duì)于BTV而言異源的核苷酸序列編碼。例如，前導(dǎo)序列或外源序列可以對(duì)于所述載體而言是內(nèi)源的，或者是對(duì)于所述載體和BTV而言異源的前導(dǎo)序列或信號(hào)序列，例如組織纖溶酶原激活物(tPA)例如人tPA的信號(hào)肽，因此所述載體或其中的多核苷酸可以包含編碼前導(dǎo)肽或信號(hào)肽的序列，例如人組織纖溶酶原激活物(tPA)的前導(dǎo)肽或信號(hào)肽(Hartikka，Sawdey等人1996)。有利地，將編碼信號(hào)肽的核苷酸序列按閱讀框插入，并且插入在編碼BTV多肽(例如，VP2、VP5或組合，如VP2和VP5)的序列的上游。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述載體，例如體內(nèi)表達(dá)載體，為病毒載體。病毒載體(例如病毒表達(dá)載體)有利地為痘病毒，例如痘苗病毒或減毒的痘苗病毒(例如，MVA，其為Ankara牛痘毒株在雞胚胎成纖維細(xì)胞上傳代超過(guò)570代后獲得的經(jīng)修飾的Ankara毒株；參見(jiàn)(Stickl和Hochstein-Mintzel1971;Sutter和Moss1992);可以ATCCVR-1508而獲得；或者NYVAC，參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5，494，807，例如美國(guó)專利號(hào)5，494，807的實(shí)施例1至6等等，其討論了NYVAC的構(gòu)建，以及通過(guò)從Copenhagen毒株痘苗病毒基因組中刪除額外的ORF，及將異源編碼核酸分子插入該重組體的位點(diǎn)中，和還使用匹配的啟動(dòng)子而得到的NYVAC的變化形式；還可參見(jiàn)W096/40241)、禽痘病毒或減毒的禽痘病毒(例如，金絲雀痘病毒、雞痘病毒、鵒痘病毒(dov印ox)、家鵒痘病毒(pigeonpox)、鵪勢(shì)痘病毒、ALVAC或TROVAC;參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5，505，941、5，494，807)、豬痘病毒、淙熊痘病毒、駱駝痘病毒或粘液瘤病病毒；腺病毒，例如禽腺病毒、犬腺病毒、豬腺病毒、牛腺病毒、人腺病毒；或皰疹病毒，例如綿羊皰疹病毒(OHVl和2)、馬皰疹病毒(EHV血清型1和4)、犬皰疹病毒(CHV)、貓皰疹病毒(FHV)、牛皰疹病毒(BHV血清型1和4)、豬皰疹病毒(PRV)、馬立克氏病病毒(MDV血清型1和2)、火雞皰疹病毒(HVT或MDV血清型3)或鴨皰疹病毒。當(dāng)使用皰疹病毒時(shí)，對(duì)于鳥(niǎo)類物種的疫苗接種而言載體HVT是優(yōu)選的，對(duì)于牛的疫苗接種而言牛載體是優(yōu)選的，對(duì)于綿羊的疫苗接種而言羊載體是優(yōu)選的，和對(duì)于馬的疫苗接種而言載體EHV是優(yōu)選的。更一般地，在某些實(shí)施方案中，可能有利的是，將載體與宿主相匹配，例如將馬病毒(例如EHV)用于馬中，或者將為鳥(niǎo)類病原體(例如雞痘病毒、HVT、MDV或鴨皰疹病毒)的載體用于鳥(niǎo)類(例如家禽或雞)中，或者將為羊病原體(例如0HV)、牛病原體(例如BHV)的載體用于牛(例如奶牛)中，或者將為豬病原體(例如豬皰疹病毒)的載體用于豬中，或者將為犬病原體(例如犬腺病毒或犬皰疹病毒)的載體用于犬類(例如狗)中，或者將為貓病原體(例如FHV)的載體用于貓類中，因?yàn)檫@可以允許產(chǎn)生針對(duì)所述載體的免疫應(yīng)答，并因而除了針對(duì)環(huán)狀病毒的免疫應(yīng)答之外，還提供了針對(duì)宿主或目標(biāo)物種的病原體的免疫應(yīng)答。然而，還應(yīng)當(dāng)注意，可能有利的是，所述載體不是宿主的天然病原體，例如，從而使得所述載體可以具有外源序列例如BTV編碼序列的表達(dá)，但只有有限的復(fù)制或沒(méi)有復(fù)制；例如，在哺乳動(dòng)物宿主中使用禽痘病毒載體，如美國(guó)專利號(hào)5，174,993中所述。還應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明包括疫苗、免疫學(xué)和免疫原性組合物，其中這些術(shù)語(yǔ)以它們?cè)诒绢I(lǐng)域中的意義來(lái)使用；參見(jiàn)例如本文所引用的文獻(xiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)6，497，883。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述痘病毒載體(例如表達(dá)載體)為金絲雀痘病毒或雞痘病毒載體，有利地為減毒的金絲雀痘病毒或雞痘病毒。在這方面，需提及可以以登錄號(hào)VR-111從ATCC獲得的金絲雀痘病毒。減毒的金絲雀痘病毒描述于美國(guó)專利號(hào)5，756，103(ALVAC)和W001/05934中。許多雞痘病毒疫苗接種毒株也是可獲得的，例如由MERIAL出售的DIFTOSECCT毒株，和由Intervet出售的NOBILISVARIOLE疫苗；并且，還可以參考美國(guó)專利號(hào)5，766，599，其涉及減毒的雞痘病毒毒株TR0VAC。對(duì)于關(guān)于痘病毒和如何產(chǎn)生其重組體和如何施用其重組體的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考文本所引用的文獻(xiàn)以及W090/12882，例如關(guān)于痘苗病毒，尤其可提及美國(guó)專利號(hào)4，769，330、4，722，848、4，603，112、5，110，587、5，494，807和5，762，938;關(guān)于雞痘病毒，尤其可提及美國(guó)專利號(hào)5，174，993、5，505,941和US_5，766，599;關(guān)于金絲雀痘病毒，尤其可提及美國(guó)專利號(hào)5，756，103;關(guān)于豬痘病毒，尤其可提及美國(guó)專利號(hào)5，382，425;關(guān)于浣熊痘病毒，尤其可提及W000/03030。當(dāng)所述表達(dá)載體為痘苗病毒時(shí)，用于待表達(dá)的多核苷酸的插入位點(diǎn)有利地在胸苷激酶(TK)基因或插入位點(diǎn)、血凝素(HA)基因或插入位點(diǎn)、編碼A型內(nèi)含體(ATI)的區(qū)域處；還可參見(jiàn)本文所引用的文獻(xiàn)，特別是涉及痘苗病毒的那些文獻(xiàn)。在金絲雀痘病毒的情況下，插入位點(diǎn)有利地為ORFC3、C5和/或C6;還可參見(jiàn)本文所引用的文獻(xiàn)，特別是涉及金絲雀痘病毒的那些文獻(xiàn)。在雞痘病毒的情況下，插入位點(diǎn)有利地為ORFF7和/或F8;還可參見(jiàn)本文所引用的文獻(xiàn)，特別是涉及雞痘病毒的那些文獻(xiàn)。關(guān)于MVA病毒的插入位點(diǎn)有利地如在各種出版物中所述，包括(Carroll,Overwijk等人1997)，(Stittelaar，Wyatt等人2000)，(Sutter，Wyatt等人1994);并且，在這方面，還應(yīng)當(dāng)注意，完整的MVA基因組描述在(Antoine，Scheiflinger等人1998)中，這使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用其他插入位點(diǎn)或其他啟動(dòng)子。優(yōu)選地，當(dāng)所述表達(dá)載體為痘病毒時(shí)，將待表達(dá)的多核苷酸插入在特異性的痘病毒啟動(dòng)子的控制下，例如痘苗病毒啟動(dòng)子7.5kDa(Cochran，Puckett等人1985)，痘苗病毒啟動(dòng)子13L(Riviere，Tartaglia等人1992)，痘苗病毒啟動(dòng)子HA(Shida1986)，牛痘病毒啟動(dòng)子ATI(Funahashi，Sato等人1988)，痘苗病毒啟動(dòng)子H6(Taylor,Weinberg等人1988)，(Guo，Goebel等人1989)，(Perkus，Limbach等人1989)等等。優(yōu)選地，對(duì)于哺乳動(dòng)物的疫苗接種，所述表達(dá)載體為金絲雀痘病毒或雞痘病毒。這樣，可以表達(dá)異源蛋白質(zhì)，例如BTV蛋白，只有有限的生產(chǎn)性復(fù)制或沒(méi)有生產(chǎn)性復(fù)制。優(yōu)選地，對(duì)于鳥(niǎo)類(例如雞、鴨、火雞和鵝)的疫苗接種，所述表達(dá)載體為金絲雀痘病毒或雞痘病毒。當(dāng)所述表達(dá)載體為火雞皰疹病毒或HVT時(shí)，有利的插入位點(diǎn)位于HVT的BamHII片段或BamHIM片段中。HVTBamHII限制性片段包含幾個(gè)開(kāi)放閱讀框(0RF)和三個(gè)基因間區(qū)域，并且包含幾個(gè)優(yōu)選的插入?yún)^(qū)，例如三個(gè)基因間區(qū)域1、2和3(其為優(yōu)選的區(qū)域)以及0RFUL55(參見(jiàn)例如FR-A-2728795，美國(guó)專利號(hào)5，980，906)。HVTBamHIM限制性片段包18含0RFUL43，其也是優(yōu)選的插入位點(diǎn)(參見(jiàn)例如FR-A-2728794，美國(guó)專利號(hào)5，733，554)。當(dāng)所述表達(dá)載體為EHV-1或EHV-4皰疹病毒時(shí)，有利的插入位點(diǎn)包括TK、UL43和UL45(參見(jiàn)例如EP-A-668355)。優(yōu)選地，當(dāng)所述表達(dá)載體為皰疹病毒時(shí)，將待表達(dá)的多核苷酸插入在真核啟動(dòng)子的控制之下，例如強(qiáng)的真核生物啟動(dòng)子，優(yōu)選為CMV-IE(鼠或人)啟動(dòng)子；也就是說(shuō)，在此處的實(shí)施方案中，將待表達(dá)的多核苷酸可操作地與啟動(dòng)子相連接，并且在皰疹病毒實(shí)施方案中，有利地將待表達(dá)的多核苷酸可操作地與強(qiáng)的真核啟動(dòng)子例如mCMV-IE或hCMV-IE啟動(dòng)子相連接。本文在涉及作為載體的質(zhì)粒時(shí)也討論了強(qiáng)啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施方案，所述載體，例如體內(nèi)表達(dá)載體，為質(zhì)粒載體或DNA質(zhì)粒載體，例如在已知為DNA疫苗的疫苗中使用的質(zhì)粒載體的類型(與在同源重組中使用以形成重組病毒的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒不同，所述轉(zhuǎn)染質(zhì)粒不用于DNA疫苗中)。術(shù)語(yǔ)"質(zhì)粒"涵蓋了以多核苷酸序列形式的任何DNA轉(zhuǎn)錄單元，其包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸以及對(duì)于在所希望的宿主或目標(biāo)的細(xì)胞中體內(nèi)表達(dá)由所述多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)所必需的元件；并且，在這方面，應(yīng)當(dāng)注意，存在超螺旋和非超螺旋的環(huán)狀質(zhì)粒，以及線性和多聚體形式，所有這些都將包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。除了編碼病原體(例如BTV(或者BTV和另一種病原體))的抗原或表位的多核苷酸之外，每種質(zhì)粒包含或含有或基本上由用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)該多核苷酸的啟動(dòng)子組成；并且，使所述多核苷酸可操作地與啟動(dòng)子連接，或者處于啟動(dòng)子的控制之下，或者依賴于啟動(dòng)子。一般地，有利的是使用真核啟動(dòng)子，例如強(qiáng)的真核啟動(dòng)子。優(yōu)選的強(qiáng)真核生物啟動(dòng)子為人源或鼠源(或者可選地具有其他來(lái)源，例如大鼠或豚鼠)的即時(shí)早期巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV-IE)。CMV-IE啟動(dòng)子可以包含實(shí)際的啟動(dòng)子部分，該部分可以與增強(qiáng)子部分相關(guān)聯(lián)或者不相關(guān)聯(lián)。可以參考EP-A-260148，EP-A-323597，美國(guó)專利號(hào)5，168，062、5，385，839和4，968，615，以及PCTWO87/03905。CMV-IE啟動(dòng)子優(yōu)選地為人CMV-IE(Boshart，Weber等人1985)或鼠CMV-IE。更一般地，啟動(dòng)子可以具有病毒或細(xì)胞來(lái)源。除了CMV-IE之外的其他可有用地用于實(shí)施本發(fā)明的強(qiáng)病毒啟動(dòng)子為SV40病毒的早期/晚期啟動(dòng)子或勞斯肉瘤病毒的LTR啟動(dòng)子?？捎杏玫赜糜趯?shí)施本發(fā)明的強(qiáng)細(xì)胞啟動(dòng)子為細(xì)胞骨架基因的啟動(dòng)子，例如結(jié)蛋白啟動(dòng)子(Kwissa，vanKampen等人2000)或肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Miyazaki，Takaki等人1989)。這些啟動(dòng)子的功能性亞片段，即保持了足夠的啟動(dòng)活性的這些啟動(dòng)子的部分，被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如根據(jù)W098/00166或美國(guó)專利號(hào)6，156，567所描述的截短的CMV-IE啟動(dòng)子可用于實(shí)施本發(fā)明。因此，實(shí)施本發(fā)明所用的啟動(dòng)子包括全長(zhǎng)啟動(dòng)子的衍生物和亞片段，其保持了足夠的啟動(dòng)活性并因此發(fā)揮啟動(dòng)子的功能，優(yōu)選地與從中衍生出所述衍生物或亞片段的實(shí)際或全長(zhǎng)啟動(dòng)子實(shí)質(zhì)上類似的啟動(dòng)活性，例如類似于相比于全長(zhǎng)CMV-IE啟動(dòng)子的活性的美國(guó)專利號(hào)6，156，567的截短的CMV-IE啟動(dòng)子的活性。因此，在實(shí)施本發(fā)明中使用的CMV-IE啟動(dòng)子可以包含或基本上由或由全長(zhǎng)啟動(dòng)子的啟動(dòng)子部分和/或全長(zhǎng)啟動(dòng)子的增強(qiáng)子部分、以及衍生物或亞片段組成。優(yōu)選地，所述質(zhì)粒包含或基本上由其他表達(dá)調(diào)控元件組成。特別有利的是，引入穩(wěn)定化序列，例如內(nèi)含子序列，優(yōu)選兔P-珠蛋白基因的內(nèi)含子II(vanOoyen，vandenBerg等人1979)。19關(guān)于用于質(zhì)粒和病毒載體(除了痘病毒之外)的聚腺苷酸化信號(hào)(polyA)，可以更多地使用牛生長(zhǎng)激素(bGH)基因的polyA信號(hào)(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5，122，458)，或者兔P-珠蛋白基因的poly(A)信號(hào)，或者SV40病毒的poly(A)信號(hào)。關(guān)于質(zhì)粒中可用的其他表達(dá)調(diào)控元件，可以考慮可用于皰疹病毒表達(dá)載體的表達(dá)調(diào)控元件。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述表達(dá)載體為用于在合適的細(xì)胞體系中體外表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)載體?？梢栽诜置谥蠡虿辉诜置谥笤谂囵B(yǎng)物上清液中或者從培養(yǎng)物上清液中收獲經(jīng)表達(dá)的蛋白質(zhì)(如果沒(méi)有分泌，則通常發(fā)生或進(jìn)行細(xì)胞裂解)，可選地通過(guò)濃縮方法例如超濾進(jìn)行濃縮和/或通過(guò)純化手段例如親和、離子交換或凝膠過(guò)濾型層析方法進(jìn)行純化。蛋白質(zhì)的生產(chǎn)可以通過(guò)下列方式來(lái)進(jìn)行通過(guò)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通過(guò)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或鳥(niǎo)類細(xì)胞中使病毒載體進(jìn)行復(fù)制或表達(dá)(非生產(chǎn)性復(fù)制)，或者通過(guò)桿狀病毒復(fù)制(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)4，745，051;(Vialard，Lalumiere等人1990);Luckow(Luckow禾口Summers1988)，例如首菅丫紋夜娥(Autographacalifornica)核型多角體病毒AcNPV，對(duì)于昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如Sf9草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞，ATCCCRL1711;還可參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6，228，846、6，103，526)?？梢允褂玫牟溉閯?dòng)物細(xì)胞有利地為倉(cāng)鼠細(xì)胞(例如CH0或BHK-21)或猴細(xì)胞(例如COS或VER0)。因此，本發(fā)明相應(yīng)地包括摻入了根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體，以及通過(guò)體外表達(dá)而如此產(chǎn)生的或表達(dá)的BTV蛋白或其片段，和包含它們的制劑。因此，本發(fā)明還涉及BTV蛋白得到濃縮和/或純化的制劑。當(dāng)所述多核苷酸編碼幾種蛋白質(zhì)時(shí)，這些蛋白質(zhì)被切割，那么此時(shí)前述制劑包含經(jīng)切割的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及針對(duì)BTV的免疫原性組合物和疫苗，其包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的體內(nèi)表達(dá)載體以及制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑或載體或運(yùn)載體，和可選地佐劑。免疫原性組合物涵蓋了一旦施用給目標(biāo)物種后便誘導(dǎo)針對(duì)BTV的免疫應(yīng)答的任何組合物。術(shù)語(yǔ)"疫苗"被理解為表示能夠誘導(dǎo)有效保護(hù)的組合物。所述目標(biāo)物種包括哺乳動(dòng)物，例如馬類動(dòng)物(equine)、犬類動(dòng)物(canine)、貓類動(dòng)物(feline)、牛類動(dòng)物(bovine)、羊類動(dòng)物(ovine)、豬類動(dòng)物和人類；爬行動(dòng)物；以及鳥(niǎo)類或禽類。這一列表意在包括繁殖動(dòng)物、產(chǎn)卵動(dòng)物、生產(chǎn)動(dòng)物和伴侶動(dòng)物。所述制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或運(yùn)載體或賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或運(yùn)載體或賦形劑可以為0.9%的NaCl鹽水溶液或磷酸鹽緩沖液。所述制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或運(yùn)載體或賦形劑可以為有助于施用所述載體(或在體外從本發(fā)明載體表達(dá)的蛋白質(zhì))的任何化合物或化合物的組合；有利地，所述載體、運(yùn)載體或賦形劑可以有助于轉(zhuǎn)染和/或改善所述載體(或蛋白質(zhì))的保存。在本文中，劑量和給藥體積以免疫接種和疫苗接種方法的一般描述來(lái)進(jìn)行討論，并且還可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)閱讀本公開(kāi)內(nèi)容并結(jié)合本領(lǐng)域知識(shí)來(lái)確定，而無(wú)需經(jīng)過(guò)過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗優(yōu)選地包含或基本上由一種或多種佐劑組成。用于實(shí)施本發(fā)明的特別合適的佐劑為(l)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，馬來(lái)酸酐與烯基衍生物的聚合物，(2)免疫剌激序列(ISS)，例如具有一個(gè)或多個(gè)非甲基化的20CpG單元的寡脫氧核糖核苷酸序列(Kli麗n，Yi等人1996;W098/16247)，(3)水包油乳齊U，例如在由M.Powell,M.Newman出版的"VaccineDesign,TheSub皿itandAdjuvantA卯roach"(Powell和Newman1995)的第147頁(yè)中所描述的SPT乳劑，和在相同著作的第183頁(yè)中所描述的乳劑MF59，(4)含有季銨鹽的陽(yáng)離子脂質(zhì)，(5)細(xì)胞因子，(6)氫氧化鋁或磷酸鋁，或(7)在本申請(qǐng)中所引用的和通過(guò)提及而合并入本申請(qǐng)中的任何文獻(xiàn)之中所討論的其他佐劑，或者(8)它們的任何組合或混合物。特別適合于病毒載體的水包油乳劑(3)可以基于-輕質(zhì)液體石蠟(歐洲藥典類型)，-類異戊二烯油，例如角鯊?fù)椤⒔酋徬?由烯烴例如異丁烯或癸烯的寡聚化而產(chǎn)生的油，-具有直鏈烷基的酸或醇的酯，例如植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或-分支的脂肪醇或酸的酯，特別是異硬脂酸酯。將油與乳化劑組合使用以形成乳劑。乳化劑可以是非離子型表面活性劑，例如_—方面是山梨聚糖、二縮甘露醇(例如脫水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油或丙二醇與另一方面是油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸的酯，所述酯可選地被乙氧基化，-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，例如？1111~011^，例如1^21。在類型(1)佐劑聚合物中，交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，特別是通過(guò)糖或多元醇的聚烯基醚交聯(lián)的聚合物是優(yōu)選的。這些化合物稱為卡波姆(Pharmeuropa，第8巻，no.2，June1996)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可參考美國(guó)專利號(hào)2，909，462，其提供了通過(guò)多羥基化合物交聯(lián)的此類丙烯酸類聚合物，所述多羥基化合物具有至少3個(gè)羥基，優(yōu)選不超過(guò)8個(gè)此類基團(tuán)，至少3個(gè)羥基的氫原子被具有至少2個(gè)碳原子的不飽和脂族基替代。優(yōu)選的基團(tuán)是包含2至4個(gè)碳原子的基團(tuán)，例如乙烯基、烯丙基和其他烯鍵式不飽和基團(tuán)。不飽和基團(tuán)也可包含其他取代基例如甲基。以Carbopol這一名稱進(jìn)行銷售的產(chǎn)品(BFGoodrich,Ohio,USA)是特別合適的。它們通過(guò)烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交聯(lián)。其中，可提及Carbopol974P、934P和971P。關(guān)于馬來(lái)酸酐-烯基衍生物共聚物，EMA(Monsanto)是優(yōu)選的，其為直鏈或交聯(lián)的乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物，它們例如通過(guò)二乙烯醚交聯(lián)。還可以參考(Regelson，Kuhar等人1960)。關(guān)于結(jié)構(gòu)，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA優(yōu)選由具有下式的基本單元形成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>其中-1^和12(其可以是相同或不同的)代表H或CHs-x=0或l，優(yōu)選地x=1-y=1或2，同時(shí)x+y=2。對(duì)于EMA，x=0且y=2，和對(duì)于卡波姆，x=y=1。這些聚合物可溶于水或生理鹽水溶液(20g/lNaCl)，并且可例如用苛性鈉(NaOH)將pH調(diào)節(jié)至7.3至7.4，從而提供其中可摻入表達(dá)載體的佐劑溶液。在最終的疫苗組合物中聚合物濃度可在O.01至1.5%w/v，有利地0.05至1%w/v和優(yōu)選地O.1至0.4%w/v的范圍內(nèi)。有利地但非專一地適用于質(zhì)粒的包含季銨鹽的陽(yáng)離子脂質(zhì)(4)優(yōu)選地是具有下式的脂質(zhì)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>其中&是具有12至18個(gè)碳原子的飽和或不飽和直鏈脂族基，R2是包含2或3個(gè)碳原子的另一種脂族基，和X是胺或羥基基團(tuán)。在這些陽(yáng)離子脂質(zhì)中，DMRIE(N-(2-羥基乙基)-N，N-二甲基-2，3-雙(十四烷氧基)-l-丙烷銨；W096/34109)是優(yōu)選的，優(yōu)選地，其與中性脂質(zhì)，優(yōu)選地與DOPE(二油酰基-磷脂?；?乙醇胺；BehrJ.P.，1994，BioconjugateChemistry,5，382-389)相結(jié)合，從而形成DMRIE-DOPE。優(yōu)選地，臨時(shí)形成質(zhì)粒與佐劑的混合物，并且優(yōu)選地在與施用制劑同時(shí)或在即將施用制劑之前形成；例如在即將施用前或施用前，形成質(zhì)粒-佐劑混合物，有利地以便在施用前為混合物形成復(fù)合物提供足夠的時(shí)間，例如施用前大約10至大約60分鐘，例如施用前大約30分鐘。當(dāng)D0PE存在時(shí)，DMRIE:DOPE的摩爾比優(yōu)選地是大約95:大約5至大約5:大約95，更優(yōu)選地大約i:大約i，例如i:i。DMRIE或DMRIE-DOPE佐劑質(zhì)粒重量比可在大約50:大約1和大約1:大約10之間，例如大約io:大約i和大約i:大約5之間，和優(yōu)選地大約i:大約i和大約i:大約2之間，例如i:i禾pi:2之間。細(xì)胞因子(5)可以以蛋白質(zhì)的形式存在于免疫原性或疫苗組合物中，或者可以在宿主中與免疫原或其表位共表達(dá)。通過(guò)與表達(dá)免疫原或其表位的載體相同的載體來(lái)共表達(dá)細(xì)胞因子或者為此通過(guò)分開(kāi)的載體來(lái)共表達(dá)細(xì)胞因子是優(yōu)選的。所述細(xì)胞因子可以選自白細(xì)胞介素18(IL-18)、白細(xì)胞介素12(IL-12)、白細(xì)胞介素15(IL_15)、MIP-1a(巨噬細(xì)胞炎性蛋白la(Marshall,Woolford等人1997)、GM-CSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子)。特別可提及鳥(niǎo)類細(xì)胞因子，例如雞的細(xì)胞因子，如cIL-18(Schneider,Puehler等人2000)、cIL-15(Xin，Hamajima等人1999));和馬細(xì)胞因子，例如馬GM-CSF(W000/77210)。優(yōu)選地，使用待進(jìn)行疫苗接種的物種的細(xì)胞因子；也就是說(shuō)，有利地，將細(xì)胞因子與目標(biāo)或宿主物種相匹配，并且可提及例如犬GM-CSF(W000/77043的實(shí)施例8)、貓GM-CSF(W000/77043的實(shí)施例9)。W000/77210提供了相應(yīng)于馬GM-CSF的核苷酸序列和氨基酸序列，體外GM-CSF產(chǎn)生，以及允許體內(nèi)馬GM-CSF表達(dá)的載體(例如質(zhì)粒和病毒載體)的構(gòu)建。這些蛋白質(zhì)、質(zhì)粒和病毒載體可以用于根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物和馬類動(dòng)物疫苗。例如，可以使用在W000/77210的實(shí)施例3中所描述的質(zhì)粒pJP097，或者可以使用W000/77210的教導(dǎo)，以便產(chǎn)生其他載體或者在體外產(chǎn)生馬GM-CSF，并將所述載體或馬GM-CSF摻入根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或馬類動(dòng)物疫苗中。本發(fā)明還涉及免疫原性組合物和所謂的亞單位疫苗，其摻入或包含或基本上由蛋白VP2和可選地一種或多種本文所述的其他BTV蛋白(例如VP5或VP7)以及制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或運(yùn)載體或賦形劑組成，有利地所述蛋白質(zhì)以本文所述方式通過(guò)體外表達(dá)來(lái)產(chǎn)生。所述制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或運(yùn)載體或賦形劑可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本文公開(kāi)內(nèi)容和本領(lǐng)域知識(shí)(例如通過(guò)參考本文所引用和合并入本文的文獻(xiàn)，或者在本文所引用的文獻(xiàn)中所參考和通過(guò)提及而合并入的文獻(xiàn))來(lái)確定，而無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)；并且，所述制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或運(yùn)載體或賦形劑可以例如為0.9%NaCl鹽水溶液或磷酸鹽緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物和亞單位疫苗優(yōu)選地包含或基本上由一種或多種佐劑組成。特別適合于在本發(fā)明中使用的為(l)丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，或馬來(lái)酸酐與烯基衍生物的聚合物，(2)免疫剌激序列(ISS)，例如具有一個(gè)或多個(gè)非甲基化的CpG單元的寡脫氧核糖核苷酸序列(Klinman，Yi等人1996)，(3)水包油乳劑，例如在由M.Powell,M.Newma皿出片反的"VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach"(Powell禾口Newman1995)的第147頁(yè)中所描述的乳劑SPT，和在相同著作的第183頁(yè)中所描述的乳劑MF59，(4)油包水乳劑(EP-A-639071)，(5)皂苷，例如Quil-A，或者(6)氫氧化鋁或等價(jià)物。(1)、(2)和(3)中所定義的不同類型的佐劑已經(jīng)在本文中在涉及基于表達(dá)載體的疫苗和免疫原性組合物時(shí)進(jìn)行了更詳細(xì)的描述。在本文中，劑量和給藥體積以與免疫接種和疫苗接種方法的一般描述相聯(lián)系的方式來(lái)進(jìn)行討論。使用根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗進(jìn)行免疫接種的動(dòng)物形成針對(duì)BTV的特異性免疫，相比于未進(jìn)行疫苗接種的對(duì)照動(dòng)物而言，所述特異性免疫在BTV感染過(guò)程中涉及減輕病毒血癥，并且實(shí)際上能夠完全阻斷病毒。本發(fā)明的這一有利的方面可以用于阻止BTV的傳播從而限制哺乳動(dòng)物病毒儲(chǔ)庫(kù)的存在，并防止藍(lán)舌病的爆發(fā)。本發(fā)明的另一個(gè)有利的方面為，保護(hù)性免疫可以從經(jīng)疫苗接種的受試者傳遞給后代。根據(jù)本發(fā)明，在疫苗接種程序的框架內(nèi)，針對(duì)BTV的疫苗接種可以與其他疫苗接種相結(jié)合，以免疫接種或疫苗接種試劑盒或方法的形式，或者以多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗(即，包含或基本上由至少一種針對(duì)BTV的疫苗組分和至少一種針對(duì)至少一種其他致病因子的疫苗組分組成)的形式。此外，這還包括通過(guò)相同的表達(dá)載體來(lái)表達(dá)至少兩種致病因子(包括BTV)的基因。因此，本發(fā)明還涉及針對(duì)BTV和針對(duì)目標(biāo)物種的至少一種其他病原體的多價(jià)或"混合式"免疫原性組合物或者多價(jià)或"混合式"疫苗，其中使用包含并表達(dá)至少一種根據(jù)本發(fā)明的BTV多核苷酸和至少一種表達(dá)另一種病原體的免疫原的多核苷酸的相同的體內(nèi)表達(dá)載體。關(guān)于組合的或多價(jià)的或"混合式"的免疫原性組合物或疫苗，以及存在于此類組合物或疫苗中的或由此類組合物或疫苗表達(dá)的免疫原或抗原或其表位，可以關(guān)注本文所引用的和通過(guò)提及而合并入本文的文獻(xiàn)，以及美國(guó)專利號(hào)5，843，456和6，368，603。由本發(fā)明載體所表達(dá)的或者在多價(jià)或"混合式"組合物或疫苗中所使用的"免疫原"被理解為表示蛋白質(zhì)、糖蛋白、多肽、肽、表位或衍生物，例如融合蛋白，其誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，優(yōu)選為具有保護(hù)性質(zhì)的免疫應(yīng)答。如本文所討論的，這些多價(jià)組合物或疫苗還可以包含或基本上由制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或運(yùn)載體或賦形劑以及可選地佐劑組成。本發(fā)明還涉及包含至少一種體內(nèi)表達(dá)載體和至少一種第二表達(dá)載體的多價(jià)免疫原性組合物或多價(jià)疫苗，其中在所述體內(nèi)表達(dá)載體中插入(并在體內(nèi)表達(dá))藍(lán)舌病毒的至少一種多核苷酸，和在所述第二表達(dá)載體中插入(并在體內(nèi)表達(dá))編碼另一種致病因子的免疫原的多核苷酸。此類多價(jià)組合物或疫苗還包含或基本上由制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或運(yùn)載體或賦形劑以及可選地佐劑組成。關(guān)于被包含在多價(jià)免疫原性組合物或疫苗中或者由多價(jià)免疫原性組合物或疫苗表達(dá)的抗原或免疫原或表位(除了BTV抗原、免疫原或表位之外的)，包括關(guān)于確定或查明表位，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考本文所引用的文獻(xiàn)以及在本文所引用的文獻(xiàn)中所引用的文獻(xiàn)，所有這些文獻(xiàn)均通過(guò)提及而合并入本申請(qǐng)中。對(duì)于羊類動(dòng)物多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗，另外的羊類動(dòng)物病原體(關(guān)于此，另外的羊類動(dòng)物抗原或免疫原或其表位被包含在所述多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗中和/或由所述多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗所表達(dá))有利地選自綿羊皰疹病毒1型(0HV-1)、綿羊皰疹病毒2型(0HV-2)、邊界病病毒(BDV)、博爾納病病毒、小反芻獸疫病毒、內(nèi)羅皮綿羊病病毒(NSDV)、深膿皰病病毒(綿羊副痘病毒)、狂犬病病毒(彈狀病毒)、貓細(xì)小病毒(FPV)、綿羊輪狀病毒、綿羊瘟病毒、綿羊腺病毒、口蹄疫病毒(FMDV)、雷付脫谷熱病毒以及它們的混合物。適合于在本發(fā)明組合物中使用的另外的抗原包括來(lái)源于綿羊的細(xì)菌和病毒病原體的抗原。優(yōu)選的細(xì)菌和寄生蟲(chóng)抗原包括小球隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidiumparvum)、衣原體屬(Chlamydia)、伯氏考克斯氏體(Coxiellaburnetti)、梭菌屬物禾中(Clostridiumsp.)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahaemolytica)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、布魯氏菌數(shù)(Brucella)、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)(Haemonchuscontortis)、奧其jf脫線蟲(chóng)(0stertagia)、5求蟲(chóng)亞纟岡(Coccidia)禾口大腸木干菌(Escherichiacoli)。對(duì)于牛類動(dòng)物多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗，另外的牛類動(dòng)物病原體(關(guān)于此，另外的牛類動(dòng)物抗原或免疫原或其表位被包含在所述多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗中和/或由所述多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗所表達(dá))有利地選自牛皰疹病毒l型(BHV-1)(也稱為傳染性牛鼻氣管炎病毒(IBR))、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、粘膜病病毒(牛病毒性腹瀉病毒或者BVDV-1和BVDV-2)(也稱為牛瘟病毒1型或2型)、和副流感病毒3型，以及對(duì)于每個(gè)價(jià)，一種或多種選自下列的基因牛皰疹病毒的gB和gD，牛呼吸道合胞病毒的F和G，粘膜病病毒的E2、C+E1+E2和El+E2，以及副流感病毒3型的HN和F。適合于在本發(fā)明的組合物中使用的另外的抗原包括來(lái)源于牛的細(xì)菌和病毒病原體的抗原。優(yōu)選的細(xì)菌抗原包括梭菌抗原，例如肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)C和D，產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)A、B、C禾PD型，敗毒梭菌(Clostridiums印ticum)，石皮傷風(fēng)24梭菌(Clostridiumtetani)，肖氏梭菌(Clostridiumchauvoei)，諾氏梭菌(Clostridiumnovyi)B型，索氏梭菌(Clostridiumsordellii)，溶血梭菌(Clostridiumhaemolyticum);鉤端螺旋體抗原，例如，問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體(L印tospirainterrogans)，例如哈德焦鉤端螺旋體(L印tospirahardjo)，波摩那鉤端螺旋體(L印tospiraPomona)，哥本哈根鉤端螺方定體(Leptospiracopenhageni)，扎諾尼鉤端螺方定體(X印tospirazanoni)，塔拉索夫鉤端螺旋體(L印tospiratarassovi);巴斯德氏菌抗原，例如多殺巴斯德氏菌和溶血巴斯德氏菌；棒桿菌抗原，例如假結(jié)核棒桿菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)、牛腎盂炎棒桿菌(Corynebacteriumrenale)、膀胱炎棒桿菌(Corynebacteriumcystitis)、多毛棒木干菌(Corynebacteriurnpilosum)禾口牛棒木干菌(Corynebacteriumbovis);禾口嗜血菌抗原，例如睡眠嗜血菌(Haemophilussom皿s)和大葉性肺炎嗜血菌(Haemophiluspleuropneumoniae);纖毛節(jié)瘤偶蹄形菌(Dichelobacternodosuspilus);支原體抗原，例如無(wú)乳支原體(Mycoplasmaagalactiae)、牛支原體(Mycoplasmabovis)和羊月市炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae)。優(yōu)選的病毒抗原包括牛病毒性腹瀉(BVD)病毒抗原、傳染性牛鼻氣管炎病毒(IBR)抗原、副流感病毒-3抗原、呼吸道合胞病毒(RSV)抗原和牛暫時(shí)熱(BEF)病毒抗原。因此，本發(fā)明包括使用編碼此類免疫原的免疫學(xué)活性片段或表位的多核苷酸。對(duì)于馬類動(dòng)物多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗，另外的馬類動(dòng)物病原體(關(guān)于此，另外的馬類動(dòng)物抗原或免疫原或其表位被包含在所述多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗中和/或由所述多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗所表達(dá))有利地選自馬流感(EI)病毒、非洲馬瘟病毒([AHSV]，優(yōu)選地與免疫原VP2和VP5相組合)、馬器質(zhì)性腦病病毒([EEV]，也與VP2和VP5相組合)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、西尼羅河病毒(WNV)、破傷風(fēng)梭菌(破傷風(fēng))以及它們的混合物。優(yōu)選地，對(duì)于AHSV，免疫原為VP2和/或VP5;對(duì)于EIV，免疫原有利地為HA、NP和/或N;對(duì)于腦炎病毒，免疫原有利地為C和/或E2;對(duì)于破傷風(fēng)梭菌，免疫原為破傷風(fēng)毒素的亞基C的全部或部分。因此，本發(fā)明包括使用編碼此類免疫原的免疫學(xué)活性片段或表位的多核苷酸。對(duì)于犬類動(dòng)物多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗，另外的犬類動(dòng)物病原體(關(guān)于此，另外的犬類動(dòng)物抗原或免疫原或其表位被包含在所述多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗中和/或由所述多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗所表達(dá))有利地選自麻疹病毒、犬腺病毒1(CAV-1)、犬腺病毒2(CAV-2)、犬瘟熱病毒(CDV)、犬副流感病毒2型(CPI-2)、犬皰疹病毒1型(CHV-1)、狂犬病病毒(棒狀病毒)、犬細(xì)小病毒(CPV)、犬冠狀病毒(CCV)、犬腺病毒、布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)、鉤端螺旋體屬(L印tospira)以及它們的混合物。優(yōu)選地，對(duì)于CDV，免疫原有利地為F和/或HA(關(guān)于CDV免疫原和構(gòu)建體，還可參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6，309，647、5，756，102);對(duì)于CPV，免疫原有利地為VP2;對(duì)于CCV，免疫原有利地為S和/或M;對(duì)于CHV-1，免疫原有利地為gB和/或gC和/或gD(關(guān)于CHV免疫原和構(gòu)建體，還可參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5，688，920、5，529，780);對(duì)于狂犬病病毒，免疫原有利地為G(關(guān)于狂犬病聯(lián)合組合物，還可參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5，843，456);對(duì)于布氏疏螺旋體，免疫原有利地為0spA(關(guān)于0spA聯(lián)合組合物，還可參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6，368，603)。因此，本發(fā)明包括使用編碼此類免疫原的免疫學(xué)活性片段或表位的多核苷酸。對(duì)于貓類動(dòng)物多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗，另外的貓類動(dòng)物病原體(關(guān)于25此，另外的貓類動(dòng)物抗原或免疫原或其表位被包含在所述多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗中和/或由所述多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗所表達(dá))有利地選自貓皰疹病毒l型(FHV-1)、貓杯狀病毒(FCV)、狂犬病病毒(棒狀病毒)、貓細(xì)小病毒(FPV)、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)、貓白血病病毒(FeLV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、衣原體屬以及它們的混合物。優(yōu)選地，對(duì)于FeLV，免疫原有利地為A和/或B和/或gag和/或pol，例如gag/pol;對(duì)于FPV，免疫原有利地為VP2;對(duì)于FIPV，免疫原有利地為S禾P/或M禾P/或N，例如S禾PM禾口/或N(還可參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6，348，196和5，858，373，以及免疫原及其構(gòu)建體)；對(duì)于FHV，免疫原有利地為gB和/或gC和/或gD，例如gB和gC和/或gD(還可參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5，338，683、6，183，750;關(guān)于皰疹免疫原以及表達(dá)該免疫原的構(gòu)建體)；對(duì)于FCV，免疫原有利地為C;對(duì)于FIV，免疫原有利地為env和/或gag和/或pro,例如gag/pro、env、或者env和gag/pro(還可參見(jiàn)于1996年11月14日提交的Tartaglia等人的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)08/746，668中所討論的免疫原和構(gòu)建體)；對(duì)于狂犬病病毒，免疫原有利地為G。因此，本發(fā)明包括使用編碼所述免疫原的免疫學(xué)活性片段或表位的多核苷酸。對(duì)于禽類多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗，另外的禽類病原體(關(guān)于此，另外的禽類抗原或免疫原或其表位被包含在所述多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗中和/或由所述多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗所表達(dá))有利地選自馬立克氏病病毒(MDV)(例如，血清型1和2，優(yōu)選血清型1)、新城疫病毒(NDV)、甘保羅病病毒(Gumborodiseasevirus)或傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性貧血病毒或雞貧血病毒(CAV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、腦脊髓炎病毒或禽腦脊髓炎病毒(AEV，或禽造白細(xì)胞組織增生病毒ALV)、火雞出血性腸炎病毒(HEV)、肺病毒病病毒(TRTV)、禽瘟疫病毒(禽流感病毒)、雞積水性心包炎病毒、禽呼腸孤病毒、大腸桿菌、雞支原體(Mycoplasmagallinarum)、雞敗血支原體(Mycoplasmagallis印ticum)、鳥(niǎo)嗜血菌(Haemophilusavium)、雞巴斯德氏菌(Pasteurellagallinarum)、雞殺多殺巴斯德氏菌(Pasteurellamultocidagallicida)以及它們的混合物。優(yōu)選地，對(duì)于MDV，免疫原有利地為gB和/或gD，例如gB和gD;對(duì)于NDV，免疫原有利地為HN和/或F，例如HN和F;對(duì)于IBDV，免疫原有利地為VP2;對(duì)于IBV，免疫原有利地為S(更有利地，Sl)和/或M和/或N，例如S(或Sl)和M和/或N;對(duì)于CAV，免疫原有利地為VP1和/或VP2;對(duì)于ILTV，免疫原有利地為gB和/或gD;對(duì)于AEV，免疫原有利地為env和/或gag/pro，例如env和gag/pro或者gag/pro;對(duì)于HEV，免疫原有利地為100K蛋白和/或六鄰體；對(duì)于TRTV，免疫原有利地為F和/或G;以及對(duì)于禽瘟疫病毒，免疫原有利地為HA和/或N和/或NP，例如HA和N和/或NP。因此，本發(fā)明包括使用編碼所述免疫原的免疫學(xué)活性片段或表位的多核苷酸。例如，在根據(jù)本發(fā)明的多價(jià)免疫原性組合物或多價(jià)疫苗(如本文所討論的，已經(jīng)向其中可選地添加了一種或多種佐劑(因此，所述組合物包含或基本上由或由一種或多種佐劑組成)，并且其打算用于馬類物種)中，可以摻入一種或多種在W098/03198中所描述的質(zhì)粒(有利地，在該專利的實(shí)施例8至25中所討論的那些)，和/或在W000/77043中所描述的且涉及馬類物種的質(zhì)粒(有利地，在該專利的實(shí)施例6和7中所描述的那些)，因此所述組合物或疫苗可以包含或基本上由或由一種或多種所述質(zhì)粒組成。對(duì)于犬類物種而言，多價(jià)組合物或疫苗可以包含或基本上由或由一種或多種在W098/03199中所描述的質(zhì)粒(有利地，在該專利的實(shí)施例8至16中所討論的那些)，和/或在W000/77043中所描述的且涉及犬類物種的質(zhì)粒(有利地，在該專利的實(shí)施例2、3和4中所描述的那些)組成；并且，此類組合物或疫苗可以包含、基本上由或由一種或多種佐劑組成。對(duì)于貓類物種而言，多價(jià)組合物或疫苗可以包含或基本上由或由一種或多種在W098/03660中所描述的質(zhì)粒(有利地，在該專利的實(shí)施例8至19中所描述的那些)，和/或在W000/77043中所描述的且涉及貓類物種的質(zhì)粒(有利地，在該專利的實(shí)施例5中所描述的那些)組成；并且，此類組合物或疫苗可以包含、基本上由或由一種或多種佐劑組成。對(duì)于鳥(niǎo)類物種而言，多價(jià)組合物或疫苗可以包含或基本上由或由一種或多種在W098/03659中所描述的質(zhì)粒(有利地，在該專利的實(shí)施例7至27中所描述的那些)組成；并且，此類組合物或疫苗可以包含、基本上由或由一種或多種佐劑組成。本文所討論的免疫原性組合物或疫苗還可以與至少一種常規(guī)疫苗(例如滅活疫苗、活的減毒疫苗或亞單位疫苗)相組合，其中所述常規(guī)疫苗針對(duì)所述組合物或疫苗所指向的物種的相同病原體或者至少一種其他病原體。本文所討論的免疫原性組合物或疫苗可以在所述常規(guī)疫苗之前或之后進(jìn)行施用，例如在"初激_加強(qiáng)"方案中。本發(fā)明進(jìn)一步包括使用了根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物和亞單位疫苗的聯(lián)合疫苗接種。因此，本發(fā)明還涉及多價(jià)免疫原性組合物和多價(jià)疫苗，其包含一種或多種根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)，以及至少一種其他致病因子(有利地，來(lái)自在本文中所描述的以及在本文中所引用和通過(guò)提及而合并入本文的文獻(xiàn)中所描述的那些)的一種或多種免疫原(如本文所討論的術(shù)語(yǔ)"免疫原")，和/或以滅活或減毒形式的或作為亞單位的另一種致病因子。按照上文所述方式，這些多價(jià)疫苗或組合物還包含、基本上由或由制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的運(yùn)載體或賦形劑以及可選地一種或多種佐劑組成。本發(fā)明還涉及對(duì)目標(biāo)物種進(jìn)行免疫接種和疫苗接種的方法，例如如本文所討論的。本發(fā)明還涉及采用初激_加強(qiáng)方案來(lái)對(duì)目標(biāo)物種進(jìn)行免疫接種和/或疫苗接種的方法。術(shù)語(yǔ)"初激_加強(qiáng)"是指順次施用共同具有至少一種免疫原的兩種不同的疫苗類型或者免疫原性或免疫學(xué)組合物類型。初激性施用(初激)是施用第一種疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物類型，并且可以包括一次、兩次或更多次施用。加強(qiáng)性施用是施用第二種疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物類型，并且可以包括一次、兩次或更多次施用，例如可以包括或基本上由每年施用一次組成。根據(jù)本發(fā)明的針對(duì)BTV的初激_加強(qiáng)免疫接種或疫苗接種的實(shí)施方案為這樣的初激_加強(qiáng)免疫接種或疫苗接種，其中給動(dòng)物第一次施用(初激)DNA疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物，其包含或基本上由BTV的至少一種免疫原、抗原或表位組成，并且在體內(nèi)表達(dá)BTV的至少一種免疫原、抗原或表位；然后，給動(dòng)物施用(加強(qiáng))第二種類型的疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物，其包含或基本上由至少一種與所述初激性疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物共同具有的免疫原、抗原或表位組成，或者表達(dá)所述免疫原、抗原或表位。這種第二種類型的疫苗可以是滅活的或減毒的或亞單位的疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物或者載體，例如具有體內(nèi)表達(dá)的重組或修飾的病毒疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物(例如痘病毒、皰疹病毒、腺病毒)?？梢杂欣厥褂枚徊《荆鐪p毒的痘苗病毒(如MVA或NYVAC)和禽痘病毒(如金絲雀痘病毒和雞痘病毒)。有利地，希望所述DNA疫苗誘導(dǎo)對(duì)于所表達(dá)的免疫原、抗原或表位特異的初激免疫應(yīng)答，或者"DNA誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答"(例如，對(duì)于所表達(dá)的免疫原、抗原或表位特異的Y-干擾素+(IFNY+)T細(xì)胞記憶應(yīng)答)，其能夠通過(guò)隨后施用(加強(qiáng))滅活的疫苗或免疫學(xué)組合物或活的重組疫苗(其包含或基本上由病毒載體例如活的重組痘病毒組成)而得到加強(qiáng)(可以被加強(qiáng))，其中所述滅活的疫苗或免疫學(xué)組合物或活的重組疫苗至少包含或基本上由經(jīng)所述DNA疫苗所表達(dá)的相同的免疫原或抗原或表位組成，并且在體內(nèi)表達(dá)所述免疫原或抗原或表位?？梢栽谑褂猛庵苎獑魏思?xì)胞(PBMC)的定量酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(enzyme-linkedimmunespot,ELISP0T)測(cè)定法中顯示對(duì)于所表達(dá)的BTV免疫原特異的IFNy+T細(xì)胞記憶應(yīng)答(Laval，Paillot等人2002)。可以在"初激"后大約2周至大約6個(gè)月，例如在初激后大約3周至大約8周，有利地在初激后大約3周至大約6周，更有利地在初激后大約4周時(shí)進(jìn)行"加強(qiáng)"。對(duì)于羊類動(dòng)物、牛類動(dòng)物或馬類動(dòng)物而言，可以使用根據(jù)本發(fā)明的DNA疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物來(lái)進(jìn)行初激，其中所述DNA疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物包含或基本上由編碼BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子組成，并且在體內(nèi)表達(dá)所述核酸分子；和有利地，使用這樣的疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物來(lái)進(jìn)行加強(qiáng)，其中所述疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物包含重組活病毒載體(例如痘病毒、皰疹病毒、腺病毒)，例如重組雞痘病毒或重組金絲雀痘病毒，重組體0HV-1或0HV-2，BHV-1或BHV_2，EHV-1或EHV_4，所述重組活病毒載體包含下述核酸分子或基本上由下述核酸分子組成編碼并且在體內(nèi)表達(dá)至少一種與所述DNA疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物所表達(dá)的相同的BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些初激性和加強(qiáng)性疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物可以例如被佐以DMRIE-DOPE(用于初激性DNA疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物)和佐以Carbopol(用于加強(qiáng)性重組疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物)?？梢詫?duì)可具有針對(duì)BTV(針對(duì)其進(jìn)行免疫接種或疫苗接種)的母源性抗體的年幼綿羊、小?；蝰R駒進(jìn)行初激。有利地，向從出生直至約16周齡(包括16周齡)，例如從出生直至約8周齡(包括8周齡)，例如從出生直至約6周齡(包括6周齡)，例如從出生直至約4周齡(包括4周齡)的年幼動(dòng)物施用所述DNA疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物。對(duì)于貓類動(dòng)物而言，可以使用根據(jù)本發(fā)明的DNA疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物來(lái)進(jìn)行初激，其中所述DNA疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物包含或基本上由編碼BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子組成，并且在體內(nèi)表達(dá)所述核酸分子；和有利地，使用這樣的疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物來(lái)進(jìn)行加強(qiáng)，其中所述疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物包含或基本上由重組活病毒載體(例如痘病毒、皰疹病毒、腺病毒，有利地重組雞痘病毒或重組金絲雀痘病毒、重組FHV、重組犬腺病毒)組成，所述重組活病毒載體包含下述核酸分子或基本上由下述核酸分子組成編碼并且在體內(nèi)表達(dá)至少一種與所述DNA疫苗所表達(dá)的相同的BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些初激性和加強(qiáng)性疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物可以例如被佐以DMRIE-D0PE(用于初激性DNA疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物)和佐以Carbopo1⑧(用于加強(qiáng)性重組疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物)?？梢詫?duì)可具有針對(duì)BTV(針對(duì)其進(jìn)行免疫接種或疫苗接種)的母源性抗體的年幼小貓進(jìn)行初激?？梢韵驈某錾敝良s12周齡(包括12周齡)，例如從出生直至約8周齡(包括8周齡)，有利地從出生直至約6周齡(包括6周齡)，例如從出生直至約4周齡(包28括4周齡)的年幼小貓施用所述DNA疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物。對(duì)于犬類動(dòng)物而言，可以使用根據(jù)本發(fā)明的DNA疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物來(lái)進(jìn)行初激，其中所述DNA疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物包含或基本上由編碼BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子組成，并且在體內(nèi)表達(dá)所述核酸分子；和有利地，使用這樣的疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物來(lái)進(jìn)行加強(qiáng)，其中所述疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物包含或基本上由重組活病毒載體(例如痘病毒、皰疹病毒、腺病毒，有利地重組雞痘病毒或重組金絲雀痘病毒、重組CHV、重組犬腺病毒)組成，所述重組活病毒載體包含下述核酸分子或基本上由下述核酸分子組成編碼并且在體內(nèi)表達(dá)至少一種與所述DNA疫苗所表達(dá)的相同的BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些初激性和加強(qiáng)性疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物可以例如被佐以DMRIE-DOPE(用于初激性DNA疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物)和佐以Carbopo1⑧(用于加強(qiáng)性重組疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物)。可以對(duì)可具有針對(duì)BTV(針對(duì)其進(jìn)行免疫接種或疫苗接種)的母源性抗體的年幼小狗進(jìn)行初激。可以向從出生直至約12周齡(包括12周齡)，例如從出生直至約8周齡(包括8周齡)，有利地從出生直至約6周齡(包括6周齡)，例如從出生直至約4周齡(包括4周齡)的年幼小狗施用所述DNA疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物。對(duì)于鳥(niǎo)類而言，可以使用根據(jù)本發(fā)明的DNA疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物來(lái)進(jìn)行初激，其中所述DNA疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物包含或基本上由編碼BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子組成，并且在體內(nèi)表達(dá)所述核酸分子；和有利地，使用這樣的疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物來(lái)進(jìn)行加強(qiáng)，其中所述疫苗或免疫原性或免疫學(xué)組合物包含或基本上由重組活病毒載體(例如痘病毒、皰疹病毒、腺病毒，有利地重組雞痘病毒或重組金絲雀痘病毒、重組HVT、重組MDV、重組禽腺病毒)組成，所述重組活病毒載體包含下述核酸分子或基本上由下述核酸分子組成編碼并且在體內(nèi)表達(dá)至少一種與所述DNA疫苗所表達(dá)的相同的BTV免疫原、抗原或表位的核酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些初激性和加強(qiáng)性疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物可以例如被佐以DMRIE-DOPE(用于初激性DNA疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物)和佐以Carbopo1⑧(用于加強(qiáng)性重組疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述初激性DNA疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物包含或基本上由編碼并表達(dá)VP2、VP5、或者VP2和VP5多肽的質(zhì)粒組成，例如質(zhì)粒pLH2078.15(圖10)，在該質(zhì)粒中已經(jīng)引入了遍在真核啟動(dòng)子，即人巨細(xì)胞病毒即時(shí)早期(CMV-IE)啟動(dòng)子，以便獲得VP2和VP5蛋白的高效表達(dá)；并且用于加強(qiáng)免疫的重組疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物包含或基本上由痘病毒(例如金絲雀痘病毒，如重組金絲雀痘病毒vCP2289(實(shí)施例9))組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些初激性和加強(qiáng)性疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物可以加有佐劑包含質(zhì)粒pLH2078.15(圖10)(所述質(zhì)粒包含但不限于CMV-IE啟動(dòng)子)的DNA疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物可以佐以DMRIE-DOPE，如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0050255127所描述的；以及，包含vCP2289的重組疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物可以佐以Carbopo1⑧，如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0050255127所描述的。本發(fā)明還涉及用于施行初激-加強(qiáng)方法的試劑盒，其在包含下列組分或基本上由下列組分組成在分開(kāi)的容器中的初激性疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物和加強(qiáng)性疫苗或免疫學(xué)或免疫原性組合物；以及可選地，關(guān)于混合和/或施用的說(shuō)明書(shū)。在初激和加強(qiáng)中所施用的量(劑量)以及用于初激和加強(qiáng)的施用途徑可以如本文所討論的，這樣根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容和本領(lǐng)域知識(shí)，可以實(shí)施初激-加強(qiáng)方案而無(wú)需過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。此外，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容和本領(lǐng)域知識(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以針對(duì)任何本文所提及的目標(biāo)物種來(lái)實(shí)施所述方法、試劑盒等。這些方法可以包括下列步驟、基本上由下列步驟組成或由下列步驟組成施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗。該施用可以通過(guò)腸胃外途徑，例如通過(guò)皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi)施用，和/或通過(guò)口服和/或鼻途徑來(lái)進(jìn)行。有利地，該施用為肌內(nèi)或皮下施用?？梢赃M(jìn)行一次或多次施用，例如2次施用。疫苗或免疫原性組合物可以通過(guò)無(wú)針的液體噴射注射器或粉末噴射注射器來(lái)進(jìn)行注射。對(duì)于質(zhì)粒而言，還可以使用用質(zhì)粒進(jìn)行包被的金顆粒，并將金顆粒以可以滲透到待免疫接種的受試者的皮膚細(xì)胞中的方式進(jìn)行噴射(Tang，DeVit等人1992)。關(guān)于本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物的施用方法和裝置，可以參考本文所引用的和通過(guò)提及而合并入本文的其他文獻(xiàn)。所述無(wú)針注射器還可以例如為Biojector2000(BiojectInc.，Portland0R，USA)。有利地，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗包含或基本上由或由有效量的本文所討論的一種或多種表達(dá)載體和/或多肽組成，所述有效量足以引發(fā)免疫學(xué)應(yīng)答，例如但不限于，中和抗體和/或保護(hù)性免疫學(xué)應(yīng)答；并且，有效量可以根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容(包括合并入本文的文獻(xiàn))和本領(lǐng)域知識(shí)來(lái)確定，而無(wú)需進(jìn)行過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。有利地，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗包含或基本上由或由有效量的本文所討論的一種或多種表達(dá)載體和/或多肽組成，所述有效量足以產(chǎn)生保護(hù)性應(yīng)答，例如但不限于，減輕或消除臨床癥狀(例如但不限于，高熱、白細(xì)胞減少、淋巴細(xì)胞減少、血小板減少)和/或減輕或消除病毒血癥。在基于質(zhì)粒載體的免疫原性組合物或疫苗的情況下，劑量可以包含下述量、基本上由下述量組成或由下述量組成一般地，約10iig至約2000iig，有利地約50iig至約1000iig。給藥體積可以為約0.1至約2ml，優(yōu)選地約0.2至約lml。這些劑量和給藥體積適合于馬類和其他目標(biāo)物種(其為哺乳動(dòng)物，例如羊類動(dòng)物、牛類動(dòng)物、犬類動(dòng)物、貓類動(dòng)物)的疫苗接種。對(duì)于鳥(niǎo)類的疫苗接種或免疫接種而言，劑量有利地為約10iig至約500iig，和優(yōu)選地約50iig至約200iig。給藥體積可以為約0.1至約lml，優(yōu)選地約0.2至約0.5ml。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容和本領(lǐng)域知識(shí)來(lái)確定用于每種免疫接種或疫苗接種方案和物種的有效質(zhì)粒劑量。在基于痘病毒的免疫原性組合物或疫苗的情況下，劑量可以為約1(fpfu至約109pfu。對(duì)于羊類動(dòng)物、牛類動(dòng)物、馬類動(dòng)物和其他目標(biāo)物種(其為哺乳動(dòng)物，例如貓類動(dòng)物和犬類動(dòng)物)而言，當(dāng)所述載體為痘苗病毒時(shí)，劑量更有利地為約1(^pfu至約1(fpfu，優(yōu)選地約1(fpfu至約108pfu;和當(dāng)所述載體為金絲雀痘病毒時(shí)，劑量更有利地為約1()Spfu至約1()9pfu，優(yōu)選地約1055pfu或約106pfu至約108pfu。對(duì)于鳥(niǎo)類而言，當(dāng)所述載體為諸如金絲雀痘病毒的痘病毒時(shí)，劑量更有利地為約103pfu至約1Q7pfu，優(yōu)選地約104pfu至約106pfu;和當(dāng)所述載體為諸如雞痘病毒的痘病毒時(shí)，劑量更有利地為約102pfu至約1()Spfu，優(yōu)選地約103pfu至約105pfu。根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容和本領(lǐng)域知識(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定當(dāng)所述載體為諸如鴿痘病毒、家鴿痘病毒等的其他禽痘病毒時(shí)的合適劑量。在用于哺乳動(dòng)物目標(biāo)物種的、基于除了痘病毒之外的其他病毒載體(例如皰疹病毒或腺病毒)的免疫原性組合物或疫苗的情況下，劑量通常為約1(fpfu至約108pfu;并且，在用于鳥(niǎo)類物種的此類基于非痘病毒病毒載體的免疫原性組合物或鳥(niǎo)類疫苗的情況下，劑量通常為約1(fpfu至約106pfu。對(duì)于用于大型目標(biāo)哺乳動(dòng)物物種例如大型貓類(例如飼養(yǎng)在動(dòng)物園中的)或馬類的此類基于非痘病毒病毒載體的免疫原性或疫苗組合物而言，例如在馬類動(dòng)物免疫原性或疫苗組合物的情況下，劑量有利地為約106pfu至約108pfu。用于哺乳動(dòng)物目標(biāo)物種的基于病毒載體的免疫原性和疫苗組合物(例如基于非痘病毒病毒載體的免疫原性或疫苗組合物)的給藥體積，例如馬類動(dòng)物免疫原性或疫苗組合物的給藥體積，通常為約0.5至約2.5ml，例如約0.5至約2.Oml，優(yōu)選地約1.0至約2.0ml，優(yōu)選地約l.Oml。用于鳥(niǎo)類的、基于病毒載體的免疫原性或疫苗組合物的給藥體積，例如基于非痘病毒病毒載體的鳥(niǎo)類免疫原性或疫苗組合物的給藥體積，通常為約0.1至約1.Oml，優(yōu)選地約0.1至約0.5ml，更有利地約0.2至約0.3ml。此外，與此類疫苗或免疫原性組合物相關(guān)，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容和本領(lǐng)域知識(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于每種免疫接種或疫苗接種方案的施用次數(shù)、施用途徑和劑量，而無(wú)需進(jìn)行過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。例如，對(duì)于綿羊、?；蝰R可以進(jìn)行兩次施用，兩次施用間隔例如35天。在亞單位免疫原性組合物或亞單位疫苗的情況下，關(guān)于活性成分例如亞單位(抗原、免疫原、表位)的量，劑量包含下述量、基本上由下述量組成或由下述量組成一般地，約10iig至約2000iig，有利地約50iig至約1000iig。用于哺乳動(dòng)物目標(biāo)物種(例如用于馬)的此類免疫原性或疫苗組合物的給藥體積通常為約1.0至約2.0ml，優(yōu)選地約0.5至約2.0ml，更有利地約1.0ml。用于鳥(niǎo)類的此類免疫原性或疫苗組合物的給藥體積通常為約0.1至約1.0ml，優(yōu)選地約0.1至約0.5ml，和更有利地0.2至0.3ml。此外，對(duì)于此類疫苗或免疫原性組合物，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容和本領(lǐng)域知識(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于每種免疫接種或疫苗接種方案的施用次數(shù)、施用途徑和劑量，而無(wú)需進(jìn)行過(guò)多的實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的體內(nèi)表達(dá)載體或載體和/或多肽的制劑在配制免疫原性組合物或疫苗中的用途，所述免疫原性組合物或疫苗旨在保護(hù)目標(biāo)物種或者在目標(biāo)物種引發(fā)針對(duì)BTV，和(在某些實(shí)施方案中)針對(duì)至少一種其他致病因子的免疫學(xué)應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明的基于質(zhì)粒的疫苗或者表達(dá)一種或多種BTV蛋白的病毒疫苗或者BTV亞單位疫苗不會(huì)在經(jīng)免疫接種或疫苗接種的動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)該病毒的其他蛋白質(zhì)的抗體，所述其他蛋白質(zhì)并不存在于所述免疫原性組合物或疫苗中或者并不由所述免疫原性組合物或疫苗來(lái)提供(例如并不存在于所述免疫原性組合物或疫苗中和/或并不由所述免疫原性組合物或疫苗所表達(dá))。通過(guò)這一特征，本發(fā)明提供了鑒別診斷方法。本發(fā)明使得能夠區(qū)分被BTV的致病性野生毒株感染的動(dòng)物與用根據(jù)本發(fā)明的疫苗或組合物進(jìn)行疫苗接種或免疫接種的動(dòng)物。在前者中，存在蛋白質(zhì)和/或針對(duì)其的抗體，并且所述蛋白質(zhì)和/或針對(duì)其的抗體可以通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。在后者(根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行疫苗接種或免疫接種的動(dòng)物)中，并非如上述情況那樣，動(dòng)物在關(guān)于不存在于所述免疫原性或疫苗組合物中或不由所述免疫原性或疫苗組合物來(lái)提供的蛋白質(zhì)或者其抗體的抗原-抗體反應(yīng)中保持31陰性。為了實(shí)現(xiàn)這種區(qū)分，所述診斷方法采用了不呈現(xiàn)在所述疫苗或免疫原性組合物中或者不由所述疫苗或免疫原性組合物來(lái)提供(不存在和/或不被表達(dá))的蛋白質(zhì)，例如蛋白VP7、NS1、NS2或NS3，當(dāng)其不呈現(xiàn)在所述疫苗或免疫原性組合物中時(shí)。因此，本發(fā)明包括了診斷測(cè)定法或試劑盒，所述診斷測(cè)定法或試劑盒使用了不存在于本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物中或者不由本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物來(lái)提供的蛋白質(zhì)或其抗體；以及，包含此類診斷測(cè)定法或試劑盒以及此類疫苗或免疫原性組合物的試劑套盒，由此，用戶可以對(duì)動(dòng)物進(jìn)行接種和/或疫苗接種，然后對(duì)該動(dòng)物進(jìn)行測(cè)試，以確定已暴露于BTV的那些動(dòng)物與僅針對(duì)BTV進(jìn)行了免疫接種和/或疫苗接種的那些動(dòng)物。因此，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的載體、制劑和多肽在制備免疫原性組合物和疫苗中的用途，所述免疫原性組合物和疫苗使得能夠區(qū)分經(jīng)疫苗接種或免疫接種的動(dòng)物與被感染的動(dòng)物。本發(fā)明還涉及與允許進(jìn)行此類區(qū)分的診斷方法相關(guān)的免疫接種和疫苗接種方法。被選擇用于所述診斷的蛋白質(zhì)或者其片段或表位之一在所述診斷測(cè)試中用作抗原，和/或用于產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有足夠的實(shí)踐知識(shí)來(lái)產(chǎn)生這些抗體以及在常規(guī)診斷方法(例如ELISA測(cè)試)中使用抗原和/或抗體，并由此實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的鑒別診斷測(cè)試?，F(xiàn)在，通過(guò)下列非限定性實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述和舉例說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例所有構(gòu)建都是采用SambrookJ等人(SambrookandRussell2001)所描述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法(克隆，使用限制酶進(jìn)行消化，互補(bǔ)單鏈DNA的合成，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通過(guò)DNA聚合物來(lái)延伸寡核苷酸，等等)來(lái)進(jìn)行的。用于本發(fā)明這些實(shí)施例的所有限制性片段，以及各種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物都是采用Qiagen凝膠提取或PCR純化試劑盒來(lái)分離和純化的。實(shí)施例1:藍(lán)舌(BTV)攻擊病毒的培養(yǎng)由始至終都使用BTV血清型17，其為最初從來(lái)自TulareCounty,CA(USA)的、死于藍(lán)舌病的綿羊血液中分離出的毒株。使該病毒在血清陰性的牛中傳代兩次，然后在初級(jí)牛肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中分離該病毒。為了進(jìn)行擴(kuò)增，將BTV血清型17的該毒株(Bonneau，DeMaula等人2002;DeMaula，Leutenegger等人2002)在可以以登錄號(hào)CCL-10獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的BHK-21細(xì)胞(幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)中進(jìn)行培養(yǎng)。將BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)充有10%胎牛血清(HycloneLaboratories)、10%胰蛋白月示磷酸鹽肉湯以及1%青霉素和鏈霉素的Eagle培養(yǎng)基(EMEM)中。將所述細(xì)胞于+37°C在5%(A氣氛下進(jìn)行培養(yǎng)。3天內(nèi)，細(xì)胞單層匯合。然后，將該培養(yǎng)基替換為補(bǔ)充有10%FBS以及BTV(以大約5pfu/細(xì)胞的比例加入)的新鮮EMEM培養(yǎng)。當(dāng)致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)完成時(shí)(通常在培養(yǎng)開(kāi)始后48至72小時(shí))，收獲病毒懸浮液，然后通過(guò)離心進(jìn)行澄清，并冷凍于-70°C。對(duì)于產(chǎn)生貯存于_701:下的病毒批料需要一次或兩次連續(xù)傳代。實(shí)施例2:經(jīng)優(yōu)化的BTVVP2和VP5的合成不同物種中的密碼子偏好可以是顯著不同的。為了增強(qiáng)利用金絲雀痘病毒表達(dá)體系(ALVAC)的外源蛋白質(zhì)(即，BTVVP2和VP5)在羊類/牛類/馬類哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)水平，極為重要的是調(diào)整外源蛋白質(zhì)的密碼子頻率，以使其與宿主表達(dá)體系相匹配(Kim，0h等人1997)。關(guān)于密碼子優(yōu)化，生物信息學(xué)家考慮了許多其他因素，例如二級(jí)結(jié)構(gòu)、GC含量、重復(fù)密碼子、限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)等等，并開(kāi)發(fā)出擁有專利權(quán)的算法。GeneartGmbH(Regensburg，Germany)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出擁有專利權(quán)的GeneOptimizer軟件(專利未決)，該軟件在一個(gè)單一操作中實(shí)施多參數(shù)優(yōu)化。通過(guò)平行地考慮最重要的參數(shù)，所述軟件在進(jìn)化方法中產(chǎn)生目標(biāo)序列的總計(jì)高達(dá)500，000個(gè)經(jīng)優(yōu)化的變體，并且選擇出最合適的一個(gè)。已經(jīng)報(bào)道，與原始基因序列相比，此類經(jīng)優(yōu)化的基因的表達(dá)產(chǎn)量可增加高達(dá)100倍(Bradel-Tretheway，Zhen等人2003;Disbrow，S皿itha等人2003)。將關(guān)于BTV-17VP2的核酸序列信息(SEQIDNO:3)(deMattos，deMattos等人1994)和關(guān)于BTV-17VP5的核酸序列信息(SEQIDNO:4)提交給Geneart以用作"天然"BTV-17序列。將該序列信息應(yīng)用到Geneart的GeneOptimizer軟件中，并衍生出經(jīng)優(yōu)化的關(guān)于VP2和VP5的合成序列。圖1提供了VP2天然核酸序列(SEQIDNO:3)與經(jīng)優(yōu)化的(通過(guò)Geneart)VP2合成核酸序列(SEQIDNO:1)的比較/比對(duì)。圖2提供了VP5天然核酸序列(SEQIDNO:4)與經(jīng)優(yōu)化的VP5合成核酸序列(SEQIDNO:2)的比較/比對(duì)。所述經(jīng)優(yōu)化的VP2和VP5序列被Geneart用作用于化學(xué)合成高度精確的寡核苷酸的陣列的基礎(chǔ)，其中所述寡核苷酸在一起包括了關(guān)于每個(gè)基因的完整的合成編碼序列。然后，基于產(chǎn)生完整的合成VP2和VP5編碼序列的策略，通過(guò)采用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來(lái)裝配關(guān)于每個(gè)基因的寡核苷酸。實(shí)施例3:經(jīng)優(yōu)化的BTV-17合成VP2和合成VP5的pPCR-Script克隆合成的VP2。通過(guò)使用限制性核酸內(nèi)切酶(RE)SacI和KpnI在其多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)域處進(jìn)行切害lj，來(lái)使可獲自Stratagene(SanDiego，CA，USA)的克隆載體pPCR-ScriptAmpSK(+)線性化。然后，使用T4DNA連接酶，將具有2，913個(gè)核苷酸的、線性的、完全裝配好的合成VP2編碼序列連接到所述質(zhì)粒載體中，其中所述合成VP2編碼序列包含緊鄰ATG起始密碼子上游的H6啟動(dòng)子的3'末端。將經(jīng)連接的DNA用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞。選擇具有氨芐青霉素抗性(攜帶有質(zhì)粒載體)以及含有VP2合成基因序列(依據(jù)其在XGai指示劑平板上的"白色"表型(由于在pPCR-Scri口1@的MCS中插入了VP2而破壞了P-半乳糖苷酶基因))的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體，以用于進(jìn)一步的表征。分離出一個(gè)克隆，043004pPCR-Script(5，779bp)，并通過(guò)DNA序列分析來(lái)確定其是否正確。圖3圖解說(shuō)明了上述克隆策略。將043004克隆用于隨后的克隆操作中。合成的VP5。通過(guò)使用RESacI和KpnI在其MCS區(qū)域中進(jìn)行切割，來(lái)使可獲自Stratagene(SanDiego，CA，USA)的克隆載體pPCR-ScriptAmpSK(+)線性化。然后，使用T4DNA連接酶，將具有1，638個(gè)核苷酸的、線性的、完全裝配好的合成VP5編碼序列連接到所述質(zhì)粒載體中。將經(jīng)連接的DNA用于轉(zhuǎn)化超感受態(tài)(ultracompetent)大腸桿菌細(xì)胞。選擇具有氨芐青霉素抗性(攜帶有質(zhì)粒載體)以及含有VP5合成基因序列(依據(jù)其在XGal指示劑平板上的"白色"表型(由于在。0-3(^11@的105中插入了VP2而破壞了P-半乳糖苷酶基因))的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體，以用于進(jìn)一步的表征。分離出一個(gè)克隆，043005pPCR-Script(4，492bp)，并通過(guò)DNA序列分析來(lái)確定其是否正確。圖8圖解說(shuō)明了上述克隆方案。將該克隆用于隨后的克隆策略中。實(shí)施例4:pNVQH6C5LSP-18ALVAC供體質(zhì)粒描述了ALVAC供體質(zhì)粒pNVQ朋C5LSP-18的構(gòu)建(美國(guó)專利申請(qǐng)20050255127)。鑒定出了金絲雀痘病毒DNA的編碼稱為C5的0RF的5kb基因座，其起始于該病毒基因組的位置1864處和終止于位置2187處。下文描述了通過(guò)下述方式來(lái)構(gòu)建的C5插入質(zhì)粒刪除C50RF的大部分，并用H6啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)(MCS)以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止序列(在所有閱讀框中)來(lái)替代之。使用引物C5A1和C5B1，從基因組金絲雀痘病毒DNA中擴(kuò)增出包含上游C5R臂的1590bpPCR片段(SEQIDNO:5)C5A:-5'GGCCGAATTCTGAATGTTAAATGTTATACTTT3'(SEQIDNO:6)C5B1:A3'。擴(kuò)增出的片段包含在5'-末端處的EcoRI位點(diǎn)，終止序列，和在3'-末端處的含有BamHI、ClaI禾PXmaI位點(diǎn)的MCS。使用引物C5C1和C5D1，從基因組金絲雀痘病毒DNA中擴(kuò)增出包含上游C5L臂的458bpPCR片段(SEQIDNO:7)C5C1:CAT3'(SEQIDNO:8)C5D1:-5'GGCTGCAGGTATTCTAAACTAGGAATAGAT3'。擴(kuò)增出的片段包含5'BamH1、ClaI和XmaI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，終止序列，和在3'-末端處的PstI位點(diǎn)。通過(guò)使用引物C5A和C5D(如上)進(jìn)行再次擴(kuò)增而將上述PCR片段融合在一起，從而產(chǎn)生2，030bpEcoRI-PstI片段，將該片段克隆到pUC8質(zhì)粒載體中，從而產(chǎn)生pUC/C5L/BCiaXm/C5R。使用下列寡核苷酸，通過(guò)將寡核苷酸插入到EcoRI位點(diǎn)中來(lái)在C5R臂的5'-末端處引入唯一的NotI序列，從而產(chǎn)生pUC/NotI/C5R/MCS/C5L:用于引入NotI的寡核苷酸為5'AATTGCGGCCGC3'(SEQIDNO:18)。痘苗H6啟動(dòng)子包含于質(zhì)粒pBS朋-l中。使用引物H6A1和H6B1，擴(kuò)增出包含H6啟動(dòng)子和用于多克隆位點(diǎn)(包含Asp718I、Xho1、Xba1、ClaI和SmaI)的識(shí)別序列的176bp片段(H6片段):(SEQIDNO:9)朋A1:-5'TCGTTAATTAATTAGAGCTTCTTTAT-TCTATACTTAAAAAG3'(SEQIDNO:10)H6B1:將編碼H6的片段(如上)匯集起來(lái)，并使用和H6B1再次擴(kuò)增，從而產(chǎn)生232bpH6p/MCS片段，然后將該片段在BamHI禾PXmaI位點(diǎn)之間插入到pUC/C5L/BClaXm/C5R中。圖4顯示了所得的質(zhì)粒pN朋C5LSP-18，其為包含H6啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子(在所有閱讀框中有功能的)和MCS的C5插入質(zhì)粒。實(shí)施例5:pCXL148.2ALVAC供體質(zhì)粒的構(gòu)建pNVQH6C5LSP-18供體質(zhì)粒的核苷酸序列分析表明，相對(duì)于ALVAC病毒載體(序列未提供)，在ALVAC供體質(zhì)粒pNVQ朋C5LSP-18(如美國(guó)申請(qǐng)20050255127中所述)的C5R區(qū)域中存在單個(gè)堿基突變。因此，如下創(chuàng)建pCXL148以修飾供體質(zhì)粒序列，以便使其與經(jīng)克隆的(經(jīng)噬斑純化的)ALVAC的序列精確匹配，從而使得在創(chuàng)建源自重組體的藍(lán)舌ALVAC病毒構(gòu)建體的過(guò)程中可能出現(xiàn)的任何序列差異最小化。圖5圖解說(shuō)明了該構(gòu)建策略。使用限制性核酸內(nèi)切酶SnaBI+BsrGI對(duì)質(zhì)粒pNVQH6C5LSP-18(美國(guó)申請(qǐng)20050255127)進(jìn)行消化，從而產(chǎn)生3，923bp片段和962bp片段。將所述RE消化產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行解析，并從凝膠中切出3，923bp片段。根據(jù)制造商所述，使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QiagenInc.，USA;Cat.#28704)來(lái)純化所述片段DNA。然后，將ALVAC基因組DNA用作模板，以用于使用引物組7634CXL和7521CXL(參見(jiàn)下文)的PCR反應(yīng)，從而產(chǎn)生跨越病毒的C5R區(qū)域的1.89kbPCR片段。(SEQIDNO:11)7521CXL(正向)-5'TTATTTAGAAATTATGCATTTTAGA(SEQIDNO:12)7634CXL(反向):-5，GTTCTCGTAGGAGAGAACTATTGAC。使用SnaBI+BsrGI對(duì)1.89kb的經(jīng)PCR擴(kuò)增出的片段進(jìn)行消化，從而產(chǎn)生三個(gè)片段361bp、569bp和962bp。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)呈現(xiàn)該RE消化產(chǎn)物，和從凝膠中切出962bp片段，并根據(jù)制造商所述，使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QiagenInc.，USA;Cat.#28704)來(lái)純化該DNA。通過(guò)按照下列方式組合RE片段來(lái)重新構(gòu)建ALVAC供體質(zhì)粒pNVQH6C5LSP-18，其中在供體質(zhì)粒的C5R編碼區(qū)中的經(jīng)突變的"T"核苷酸被相應(yīng)的ALVAC野生型核苷酸"C"替代，從而創(chuàng)建出pCXL148.2:a.使用T4DNA連接酶，將通過(guò)pNVQH6C5LSP-18的RE(SnaBI+BsrGI)消化而得到的經(jīng)純化的3，923bp片段有方向性地連接至源自ALVAC的經(jīng)PCR擴(kuò)增的C5R區(qū)域的962bpSnaBI+BsrGI片段。b.將連接反應(yīng)產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，并使轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物在氨芐青霉素選擇下進(jìn)行生長(zhǎng)。選擇轉(zhuǎn)化體，并通過(guò)RE消化來(lái)表征它們的質(zhì)粒DNA。發(fā)現(xiàn)一個(gè)候選克隆pCXL148.2的核苷酸序列在所述C5R區(qū)域中具有正確的"C"核苷酸。該新的C5供體質(zhì)粒pCXL148.2與在ALVAC病毒載體中的相應(yīng)序列具有準(zhǔn)確的同源性。圖6提供了pCXL148.2供體質(zhì)粒的核酸序列(SEQIDNO:13)。實(shí)施例6:pC5H6pVP2的構(gòu)建使用EcoRV+XhoI對(duì)質(zhì)粒VP2BTV17(043004，圖3)進(jìn)行RE消化，從而產(chǎn)生獨(dú)特的2，913bp片段，其包含5'EcoRV位點(diǎn)，隨后是全長(zhǎng)的、合成的、經(jīng)密碼子優(yōu)化的BTV-VP2，隨后是3'XhoI位點(diǎn)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)呈現(xiàn)該RE消化產(chǎn)物，和從凝膠中切出2，913bp片段，并根據(jù)制造商所述，使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QiagenInc.，USA;Cat.#28704)來(lái)純化該DNA。35使用EcoRV和XhoI來(lái)消化pCXL148.2(pC5供體質(zhì)粒，參見(jiàn)圖5)，從而產(chǎn)生線性化的4879bp同源性載體，其包含C5右臂、H6啟動(dòng)子和C5左臂。使用T4DNA連接酶，將通過(guò)043004pVP2BTV17的RE(EcoRV+Xho1)消化而得到的經(jīng)純化的2，913bp片段有方向性地連接至4879bp的、經(jīng)EcoRV+XhoI消化的且線性化的pCXL-148.2供體ALVAC質(zhì)粒。使用所述連接反應(yīng)產(chǎn)物來(lái)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，并使轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物在氨芐青霉素選擇下進(jìn)行生長(zhǎng)。選擇轉(zhuǎn)化體，使其生長(zhǎng)，并通過(guò)RE消化來(lái)表征它們的質(zhì)粒DNA。在使用VP2特異性核酸寡核苷酸的Southern印跡上探測(cè)具有正確的RE圖譜的克隆。選擇出一個(gè)陽(yáng)性克隆，pALVACC5H6p-合成的BTVVP2，用于隨后的克隆操作。圖7提供了前述克隆策略。實(shí)施例7:摻入了42K啟動(dòng)子的VP5的PCR擴(kuò)增選擇昆蟲(chóng)痘病毒(桑紅緣燈蛾)42K啟動(dòng)子(Barcena，Lorenzo等人2000)來(lái)調(diào)控經(jīng)優(yōu)化的合成VP5基因的表達(dá)。采用基于PCR的策略(其中，將42K啟動(dòng)子嵌入正向合成引物的5'末端中)，將42K啟動(dòng)子的核酸序列(參見(jiàn)下文啟動(dòng)子序列為斜體和加下劃線的)放置于鄰近所述合成VP5基因的5'ATG起始密碼子。與反相引物相結(jié)合地使用這種引物，使得能夠直接從質(zhì)粒VP5BTV17(043005)(其用作模板)中進(jìn)行擴(kuò)增(參見(jiàn)圖8)。在PCR反應(yīng)中使用引物對(duì)13247.JY/13248.JY(參見(jiàn)下文和圖21)來(lái)擴(kuò)增DNA片段，該DNA片段包含側(cè)翼為XhoI位點(diǎn)的42Kp-VP5表達(dá)盒。用于擴(kuò)增42Kp-BTVVP5表達(dá)盒的引物為(SEQIDNO:14)13247.JY正向AGCCTG(SEQIDNO:15)13247.JY反向-5'ATCTCGAGATAAAAATCATCAGGCGTTCCTCAGGAACAGGGGCACGTC。使用上述引物來(lái)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR反應(yīng))，并根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA，USA)，將所得的PCR產(chǎn)物克隆到pCR⑧2.1-T0P0克隆載體的Xhol位點(diǎn)中，從而形成pLH2033.1(pCR2.142Kp合成的BTV-VP5)。經(jīng)證實(shí)，該構(gòu)建體包含正確的序列。圖9中圖解說(shuō)明了該克隆策略。擴(kuò)展pLH2033.l克隆，以便如隨后克隆活性中所需要的來(lái)擴(kuò)大質(zhì)粒產(chǎn)量。實(shí)施例8:供體同源性載體pLH2078.15(pC5H6VP242KpVP5)的構(gòu)建用XhoI切割含有42Kp_合成的BTVVP5序列的pLH2033.1，這釋放出編碼BTVVP5的l，647bp片段。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)呈現(xiàn)該XhoI消化產(chǎn)物，和從凝膠中切出l，647bpVP2片段，并根據(jù)制造商所述，使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QiagenInc.，USA;Cat.#28704)來(lái)純化該DNA。使用XhoI來(lái)消化pLH2030.2(pALVACC5H6p-合成的BTVVP2，pC5供體質(zhì)粒，參見(jiàn)圖7)，從而產(chǎn)生線性化的7，744bp同源性載體，其包含C5右臂、H6啟動(dòng)子、合成的BTVVP2和C5左臂。使用T4DNA連接酶，將通過(guò)pLH2033.1的XhoI消化而得到的經(jīng)純化的1，647bp片段連接至7，744bp的經(jīng)XhoI線性化的pLH2030.2供體ALVAC質(zhì)粒。使用所述連接反應(yīng)產(chǎn)物來(lái)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，并使轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物在氨芐青霉素選擇下進(jìn)行生長(zhǎng)。選擇36轉(zhuǎn)化體，使其生長(zhǎng)，并通過(guò)RE消化來(lái)表征它們的質(zhì)粒DNA。由于所述連接是非方向性的，所以克隆選擇的基本組成部分需要在供體質(zhì)粒中42Kp-合成的VP5插入片段相對(duì)于H6pVP2具有合適的方向，在這種實(shí)施方案中，優(yōu)選的方向?yàn)轭^至尾，例如在所述質(zhì)粒上VP2和VP5以相同的5'至3'方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。選擇具有正確的RE圖式的克隆用于進(jìn)一步的表征。選擇出一個(gè)陽(yáng)性克隆，pLH2978.15，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。圖10中提供了用于構(gòu)建最終的ALVAC-BTV供體質(zhì)粒的所描述的克隆策略。圖11中提供了pLH2978.15的經(jīng)注釋的核苷酸序列。實(shí)施例9:ALVACBTV(vCP2289)的產(chǎn)生和表征為了產(chǎn)生基于ALVAC的BTV重組體，使用與FuGENE-6轉(zhuǎn)染試劑(Roche)相混合的15iigNotI-線性化的pLH2078.15供體質(zhì)粒DNA(pC5H6p-BTVVP2-42Kp-BTVVP5)來(lái)轉(zhuǎn)染原代雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)。然后以10的MOI使用ALVAC(6.3X109pfu/mlHM1372)作為拯救病毒(rescuevirus)來(lái)感染經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。24小時(shí)后，收獲經(jīng)轉(zhuǎn)染的-經(jīng)感染的細(xì)胞，進(jìn)行超聲處理，并用于噬斑純化和重組病毒篩選。鋪板在新鮮的CEF上后24-48小時(shí)，將重組噬斑轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，并根據(jù)制造商的方案(AmershamCat#RPM3001)，標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶的BTV特異性DNA探針進(jìn)行雜交。在連續(xù)4輪的噬斑純化后，擴(kuò)增單個(gè)噬斑，從而產(chǎn)生原種(stock)，其被指定為vCP2289.1.2.1.1和vCP2289.2.1.1.1。通過(guò)雜交證實(shí)，重組病毒對(duì)于BTV插入片段而言是100X陽(yáng)性的，和對(duì)于空的C5位點(diǎn)而言是100X陰性的。由最后一輪的噬斑純化中選擇出單個(gè)噬斑，并進(jìn)行擴(kuò)展，以獲得PI(T-25燒瓶)、P2(T-75燒瓶)和P3(滾瓶)原種，從而擴(kuò)增vCP2289.1.2.1.1和vCP2289.1.1.1。在P2水平上通過(guò)雜交再次證實(shí)和發(fā)現(xiàn)，所述重組體對(duì)于插入片段而言是100%陽(yáng)性的，和對(duì)于空的C5位點(diǎn)而言是100%陰性的。從滾瓶中收獲經(jīng)感染的細(xì)胞培養(yǎng)液并進(jìn)行濃縮，從而產(chǎn)生病毒原種(1.8ml1.25Xl(Tpfu/ml的vCP2289.1.2.1.l，和1.9ml1.0X101Qpfu/ml的vCP2289.2.1.1.1)。圖12顯示了用于構(gòu)建重組體ALVAC+BTVVP2和VP5(vCP2289)的流程圖。實(shí)施例10:ALVACBTV(vCP2289)的表征1.遺傳純度的證實(shí)。通過(guò)雜交再次證實(shí)，P3原種對(duì)于BTV插入片段而言是100%陽(yáng)性的，和對(duì)于空的C5位點(diǎn)而言是100%陰性的。2.基因組分析a.限制性酶切圖譜i.在VectorNTI(Invitrogen，USA)中產(chǎn)生關(guān)于基因組DNA的理論上的限制性核酸內(nèi)切酶(RE)凝膠電泳片段分析，并且顯示在圖13中。ii.從vCP2289.1.2.1.1和vCP2289.2.1.1.1中提取基因組DNA，用BamHI、HindIII或Pst1進(jìn)行消化，并通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。結(jié)果揭示了外源基因序列的正確插入(參見(jiàn)圖14)。b.Southern印跡將經(jīng)BamHI、HindIII或PstI消化的基因組DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，并通過(guò)用BTV探針進(jìn)行探測(cè)來(lái)進(jìn)行Southern印跡分析。在預(yù)期的大小處觀察到BTV-特異性的9508bpBamHIU4974bpHindIII和2901bpPstI條帶。結(jié)果表明，BTV插入片段正確地插入到C5基因座中。圖15提供了Southern印跡的結(jié)果。3.表達(dá)分析37a.Western印跡。以10的MOI用vCP2289.1.2.1.1和vCP2289.2.1.1.1的P3原種來(lái)感染1°CEF細(xì)胞，并在37t:下溫育24小時(shí)。然后，收獲細(xì)胞和培養(yǎng)物上清液。在10%SDS-PAGE凝膠上分離樣品蛋白質(zhì)，將電印跡轉(zhuǎn)移至Immobilon尼龍膜上，并用稀釋度為l:2000的兔抗BTV17VP5的經(jīng)親和純化的IgG(UniversityofCalifornia，Davis，USA)來(lái)進(jìn)行探測(cè)。將綴合有過(guò)氧化物酶的山羊抗兔抗血清用作二抗，并用Amersham檢測(cè)試劑來(lái)顯現(xiàn)條帶。在vCP2289.1.2.1.1和vCP2289.2.1.1.1的細(xì)胞粒狀沉淀中檢測(cè)出位于47KDa和60KDa之間的兩個(gè)蛋白質(zhì)條帶，這表明表達(dá)出了BTV-17VP5蛋白(參見(jiàn)圖16)。經(jīng)表達(dá)的BTV-17VP5蛋白沒(méi)有被分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。b.免疫熒光。使用四種小鼠抗BTV-17VP2抗體(ABXIgG17.81a-BTV17;PAIgG17.815a-BTV17;PAIgG17.85a-BTV17;PAIgG17.813a-BTV-17,得自UniversityofCalifornia,Davis，USA)的混合物，就VP2表達(dá)而進(jìn)行的Western印跡和免疫噬斑測(cè)定法均是陰性的，這可能是由于所述試劑的構(gòu)象敏感度以及由轉(zhuǎn)移和雜交所施加的"變性樣"環(huán)境。因此，以0.1的MOI用vCP2289.1.2.1.1和vCP2289.2.1.1.1的P3原種來(lái)感染1°CEF細(xì)胞，并在37t:下溫育24小時(shí)。然后，將所述細(xì)胞用3%低聚甲醛固定，并用O.5%TritohX-100進(jìn)行透化。以l:100稀釋度使用四種小鼠抗BTV17VP2抗體(ABXIgG17.81抗BTV17，PAIgG17.815抗BTV17，PAIgG17.85抗BTV17，PAIgG17.813抗BTV-17,得自UniversityofCalifornia,USA)的混合物作為一抗，并使用綴合有FITC的山羊抗小鼠抗體作為二抗。在NikonEclipseTE300熒光顯微鏡下顯現(xiàn)出發(fā)強(qiáng)綠色熒光的細(xì)胞，這表明表達(dá)出了BTVVP2蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。4.序列分析。通過(guò)C5基因座的側(cè)翼臂和BTV插入片段的PCR擴(kuò)增和序列分析來(lái)對(duì)P3原種基因組DNA進(jìn)行更詳細(xì)的分析。使用位于C5基因座的臂之外的引物7931.DC和7932.DC來(lái)擴(kuò)增完整的C5R-BTV插入片段_C5L片段。用于PCR擴(kuò)增vCP2289C5臂+插入片段的引物(SEQIDNO:16)7931.DC:-5GAATCTGTTAGTTAGTTACTTGGAT(SEQIDNO:17)7932.DC:-5TGATTATAGCTATTATCACAGACTC。結(jié)果表明，在VCP2289.1.2.1.1和vCP2289.2.1.1.1中，BTV插入片段的序列以及在BTV插入片段附近的C5左臂和右臂的序列是正確的。實(shí)施例11:重組疫苗的生產(chǎn)為了制備羊類動(dòng)物、牛類動(dòng)物或馬類動(dòng)物疫苗，將所述重組金絲雀痘病毒vCP2289病毒(實(shí)施例9)佐以卡波姆溶液，即由BFGoodrich,Ohio,USA生產(chǎn)的CarbopolTM974P(分子量為約3，000，000)。首先，在含有l(wèi)g/1氯化鈉的蒸餾水中制備1.5%CarbopolTM974P母液。然后，將該母液用于在生理鹽水中制備4mg/mlCarbopolTM974P溶液。在單個(gè)步驟中或者在幾個(gè)連續(xù)的步驟中將所述母液與適當(dāng)體積的生理鹽水相混合，在每個(gè)步驟中用1N(或者更加濃的)氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值，以便獲得7.3至7.4的最終pH值。將以這種方式獲得的即用型Carb0polTM974P溶液用于吸收凍干的重組病毒或者用于稀釋濃縮的重組病毒母液。例如，為了獲得包含1Q8pfu/lml劑量的病毒懸浮液，稀釋病毒母液以獲得1083pfu/ml的滴度，隨后用所述即用型4mg/mlCarb0p0lTM974P溶液以相等的份額進(jìn)行稀釋。實(shí)施例12:用于羊類動(dòng)物、牛類動(dòng)物或馬類動(dòng)物的DNA疫苗的生產(chǎn)對(duì)于DNA免疫接種，要構(gòu)建質(zhì)粒，其中經(jīng)密碼子優(yōu)化的BTVVP2核苷酸序列(圖1，SEQIDN0:1)位于其中一種質(zhì)粒上，而B(niǎo)TVVP5核苷酸序列(SEQIDNO:2)位于分開(kāi)的質(zhì)粒上。BTV序列從每種質(zhì)粒上的表達(dá)可以由(但不限于)CMV-IE啟動(dòng)子(人CMV或鼠CMV)來(lái)驅(qū)動(dòng)。在每種質(zhì)粒中，將聚腺嘌呤(polyA)序列信號(hào)(得自牛生長(zhǎng)激素基因或者兔13珠蛋白基因，但是不限于這些基因)引入至BTV編碼序列的3'末端。可以希望從同一質(zhì)粒表達(dá)BTVVP2和VP5，以確保BTV蛋白在同一細(xì)胞中的共表達(dá)。在這種情況下，構(gòu)建類似于pLH2078.15(實(shí)施例8，圖10)的質(zhì)粒，其中痘病毒啟動(dòng)子已經(jīng)被(但不限于)遍在真核啟動(dòng)子(例如人CMV-IE啟動(dòng)子)所替代。BTVVP2和VP5的表達(dá)需要由不同的啟動(dòng)子調(diào)控。將PolyA信號(hào)序列包含在每個(gè)BTV核苷酸序列的3'末端。以Sambrook等人(1989)所描述的方式，通過(guò)乙醇沉淀來(lái)濃縮包含上文所述質(zhì)粒的DNA溶液。用0.9%NaCl溶液來(lái)吸收所述DNA粒狀沉淀，從而獲得lmg/ml的濃度。通過(guò)用合適的無(wú)菌H20體積來(lái)吸收匿RIE-DOPE凍干物，從而制備0.75mM匿RIE-D0PE溶液。通過(guò)用在0.9%NaCl中的lmg/mlDNA溶液以相等份額地稀釋所述0.75mMDMRIE-D0PE溶液(1:l)，從而形成質(zhì)粒-脂質(zhì)DNA復(fù)合物。借助于26G巻曲的針(crimpedneedle)，沿著裝有陽(yáng)離子脂質(zhì)溶液的燒瓶的壁，逐步地引入所述DNA溶液，從而防止泡沫形成。一旦兩種溶液相混合，就開(kāi)始進(jìn)行溫和的攪拌。最后，獲得包含O.375mMDMRIE-D0PE和500iig/ml質(zhì)粒的組合物。對(duì)于本文所描述的所有操作而言，希望所有溶液均在環(huán)境溫度下使用。在對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種之前，DNA/DMRIE-D0PE復(fù)合過(guò)程在環(huán)境溫度下進(jìn)行30分鐘。實(shí)施例13:使用重組金絲雀痘病毒來(lái)對(duì)綿羊進(jìn)行疫苗接種由位于CA西北部(無(wú)BTV感染的地區(qū))的供應(yīng)商處購(gòu)得11只無(wú)角陶賽特(Dorset)羊羔(9只雄性，2只雌性)。在進(jìn)行所述研究的整個(gè)過(guò)程中，這些動(dòng)物都被飼養(yǎng)在不受昆蟲(chóng)侵?jǐn)_的隔離設(shè)施中，并且在疫苗接種之前，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA證實(shí)，這些動(dòng)物都不具有針對(duì)BTV的抗體。在大約13個(gè)月大的時(shí)候(11/22/05)，將其中6只羊羔各自用在PBS中稀釋的大約lmlBTV-CP以SQ/IM方式進(jìn)行接種(0.2ml未稀釋的[1095TCID5。/ml]vCP2289/綿羊=6.3X1()8病毒顆粒)，而5只羊羔用表達(dá)西尼羅河病毒的preM和E蛋白的重組金絲雀痘病毒(vCP/WNV;Recombitek)來(lái)進(jìn)行疫苗接種，其中所述重組金絲雀痘病毒是重構(gòu)的，并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行施用。在22天后(12/14/05)，所有綿羊都用與初次免疫接種相同劑量的各自的疫苗構(gòu)建體進(jìn)行再次疫苗接種。將所述動(dòng)物共同飼養(yǎng)，而不管疫苗類型。實(shí)施例14:滴定抗BTV中和抗體在細(xì)胞培養(yǎng)型96孔平板中，在添加有10X胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，以3的比例對(duì)于每種血清制備系列稀釋。向0.05ml經(jīng)稀釋的血清中加入0.05ml包含大約100CCIP5。/mlBTV的培養(yǎng)基。將該混合物在包含5%C02的氣氛中在烘箱中于37。C溫育2小時(shí)。然后，向每種混合物中加入0.15ml含有大約100，000個(gè)細(xì)胞/ml的BHK-21細(xì)胞懸浮液。在包含5%C02的氣氛中于37t:培養(yǎng)4至5天之后，通過(guò)相差顯微鏡觀察致細(xì)胞39病變效應(yīng)(CPE)。采用KSrber方法來(lái)計(jì)算每種血清的中和滴度。該滴度以抑制50%的孔中的致細(xì)胞病變效應(yīng)的最大稀釋度的形式給出。所述滴度以log10VNs。表示。對(duì)于每種血清滴定至少2次，優(yōu)選4次。實(shí)施例15:綿羊的BTV感染以及樣品收集在第二次疫苗接種之后34天，通過(guò)皮下接種1055TCID5。的BTV-17來(lái)對(duì)所有11只羊羔進(jìn)行攻擊。在接種后的3個(gè)星期中，每天都就藍(lán)舌病的表現(xiàn)來(lái)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)價(jià)。在接種前以及在接種后3、6、9、13和16天(dayspost-inoculation，DPI)收集用于血液學(xué)的血液(收集在EDTA中)，以用于全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(CBC)。在0、1、3、5、7、9、11、14和21DPI時(shí)，收集血液樣品(檸檬酸葡萄糖)，以用于病毒分離。在即將進(jìn)行疫苗接種之前，每周一次從所有綿羊中收集血清("TigerTop"，血清分離器)。在攻擊暴露于BTV后25天，將所有綿羊以人道方式安樂(lè)死。實(shí)施例16:BTV病毒的分離如先前所述的(Bon固u，Mullens等人2001;Bon固u，DeMaula等人2002;DeMaula，Leutenegger等人2002)，從綿羊全血中分離病毒。簡(jiǎn)而言之，在4。C下，將Vacutainer管以2，500G離心10分鐘。傾析出血清并丟棄。將紅/白細(xì)胞用5ml的無(wú)菌PBS(lx)洗滌l次，再次離心，并將細(xì)胞粒狀沉淀重懸浮于等體積的無(wú)菌雙蒸水(ddH20)中。將經(jīng)洗滌/裂解的血細(xì)胞超聲處理1-2分鐘，然后在EMEM中進(jìn)行稀釋(10—1至10—4)，并將其接種(0.25ml/孔)至在24孔平板中的匯合的BHK-21單層上。當(dāng)添加維持培養(yǎng)基時(shí)，將培養(yǎng)物在37t:下溫育1小時(shí)。每天對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)并持續(xù)10天，以及通過(guò)Reed和Milnch的方法來(lái)測(cè)定病毒滴度。實(shí)施例17:BTV-vCP2289重組ALVAC在綿羊中的免疫原性在疫苗接種之前，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA和BTV-17微量中和測(cè)定法，所有綿羊?qū)τ贐TV均是血清反應(yīng)陰性的(數(shù)據(jù)未顯示)。使用vCP/BTV表達(dá)載體進(jìn)行疫苗接種的綿羊產(chǎn)生出針對(duì)BTV-17的中和抗體，而使用vCP/WNV進(jìn)行免疫接種的那些綿羊則沒(méi)有產(chǎn)生出所述抗體(參見(jiàn)下表3)。所有綿羊在疫苗接種后均保持健康并且未表現(xiàn)出副作用。表3.BTV17中和抗體的滴度40<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>*表示沒(méi)有從50ul經(jīng)洗滌和經(jīng)裂解的血細(xì)胞中分離出病毒結(jié)果(上表4)顯示，對(duì)照綿羊(WNV-CP)在攻擊后3天被BTV攻擊主動(dòng)感染。對(duì)照綿羊直至在攻擊后21天(在此時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束)時(shí)仍持續(xù)表現(xiàn)出病毒血癥。由于在所述研究的21天的持續(xù)時(shí)間中，在經(jīng)免疫接種的綿羊血液中不能檢測(cè)出BTV，所以用BTV-CP疫苗進(jìn)行免疫接種的綿羊在實(shí)驗(yàn)性攻擊感染之后表現(xiàn)出強(qiáng)烈的對(duì)抗病毒血癥的保護(hù)作用。所有6只經(jīng)BTV-CP免疫接種的綿羊都對(duì)于烈性病毒攻擊具有完全的抵抗力，這表明了所述疫苗的有效性。實(shí)施例19:被BTV感染的綿羊的臨床應(yīng)答下文提供了在用BTV-17進(jìn)行攻擊后使用BTV-CP(經(jīng)疫苗接種者)和WNV-CP(對(duì)照)進(jìn)行疫苗接種的綿羊的臨床應(yīng)答的比較1.體溫(BT)。在攻擊后的14天中，每天對(duì)所有6只用BTV-CP進(jìn)行疫苗接種的綿羊和所有5只對(duì)照(用WNV-CP進(jìn)行免疫接種的)綿羊的體溫進(jìn)行監(jiān)測(cè)。得自受攻擊的綿羊的體溫?cái)?shù)據(jù)顯示在下表5和圖17中。所述數(shù)據(jù)顯示，在對(duì)照中在攻擊后第3天時(shí)平均BT升高rC，而在用BTV-CP進(jìn)行疫苗接種的綿羊中平均BT沒(méi)有變化。在第6天時(shí)，在對(duì)照動(dòng)物中觀察到fC溫度尖峰(105°C)。這是受BTV感染的病毒血癥動(dòng)物的典型應(yīng)答。經(jīng)BTV-CP免疫接種的動(dòng)物展現(xiàn)出與攻擊前的動(dòng)物沒(méi)有顯著偏離的正常溫度。這些結(jié)果確證了疫苗(BTV-CP)的功效。表5.BTV17攻擊溫度數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>3.淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。在攻擊后的16天中，在第0天并且以大約3天的間隔直至第16天，監(jiān)測(cè)所有6只用BTV-CP進(jìn)行疫苗接種的綿羊和所有5只對(duì)照(用WNV-CP進(jìn)行免疫接種的)綿羊的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。得自受攻擊的綿羊的淋巴細(xì)胞數(shù)據(jù)顯示在下表7和圖19中。所述數(shù)據(jù)顯示，在對(duì)照中，在直到攻擊后第8天平均淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)最初略微降低，和在攻擊后第9-16天平均淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)持續(xù)升高；而在用BTV-CP進(jìn)行疫苗接種的綿羊中，平均淋巴細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有變化。在攻擊后延遲的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)升高是受BTV感染的病毒血癥動(dòng)物的典型應(yīng)答。經(jīng)BTV-CP免疫接種的動(dòng)物展現(xiàn)出與攻擊前的動(dòng)物沒(méi)有顯著偏離的正常淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。這些結(jié)果確證了疫苗(BTV-CP)的功效。表7.BTV17攻擊研究——淋巴細(xì)胞數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>4.血小板計(jì)數(shù)。在攻擊后的16天中，在第0天并且以大約3天的間隔直至第16天，監(jiān)測(cè)所有6只用BTV-CP進(jìn)行疫苗接種的綿羊和所有5只對(duì)照(用WNV-CP進(jìn)行免疫接種的)綿羊的血小板計(jì)數(shù)。得自受攻擊的綿羊的血小板數(shù)據(jù)顯示在下表8和圖20中。所述數(shù)據(jù)顯示，在對(duì)照中，在直到攻擊后第8天血小板計(jì)數(shù)最初降低，和在攻擊后第9-16天平均血小板計(jì)數(shù)持續(xù)升高。在用BTV-CP進(jìn)行疫苗接種的綿羊中，在所述研究的整個(gè)過(guò)程中血小板逐漸升高。在用BTV-CP進(jìn)行疫苗接種的綿羊中，在所述研究的整個(gè)過(guò)程中血小板計(jì)數(shù)均比對(duì)照高。在攻擊后血小板計(jì)數(shù)降低是受BTV感染的病毒血癥動(dòng)物的典型應(yīng)答。經(jīng)BTV-CP免疫接種的動(dòng)物展現(xiàn)出正常的血小板計(jì)數(shù)。這些結(jié)果確證了疫苗(BTV-CP)的功效。表8.BTV血小板計(jì)數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>參考文獻(xiàn)Anderson,G.A.，J丄Stott等人(1985).〃Subclinicalandclinicalbluetonguediseaseincattle:clinical，pathologicalandpathogenicconsiderations.〃ProgClinBiolRes178:103-7.Andreansky，S.S.，B.He等人(1996).〃Theapplicationofgeneticallyengineeredherpessimplexvirusestothetreatmentofexperimentalbraintumors."ProcNatlAcadSciUSA93(21):11313-8.Andrew,M.，P.Whiteley等人(1995).〃AntigenspecificityoftheovinecytotoxicTlymphocyteresponsetobluetonguevirus.〃VetImmunolImm皿opathol47(3-4):311-22.Antoine，G.，F(xiàn).Scheiflinger等人(1998).〃ThecompletegenomicsequenceofthemodifiedvacciniaAnkarastrain-comparisonwithotherorthopoxviruses.〃Virology244(2):365-96.Ballay，A.，M丄evrero等人(1985).〃InvitroandinvivosynthesisofthehepatitisBvirussurfaceantigenandofthereceptorforpolymerizedhumanserumalbuminfromrecombinanthumanadenoviruses.〃Embo.T4(13B):3861-5.Barcena，J.，M.M.Lorenzo等人(2000).〃SequenceandanalysisofaswinepoxvirushomologueofthevacciniavirusmajorenvelopeproteinP37(F13L).〃JGenVirol81(Pt4):1073-85.Bernard,K.A.，B.A.Israel等人(1997).〃Sequenceandcognitiveanalysesoftwovirulence—associatedmarkersofbluetonguevirusserotype17."Intervirology40(4):226-31.Bon固u，K.R.，C.D.DeMaula等人(2002).〃DurationofviraemiainfectioustoCulicoidessonorensisinbluetonguevirus-infectedcattleandsheep.〃VetMicrobiol88(2):115-25.Bo騰au，K.R.，B.A.Mullens等人(2001).〃OccurrenceofgeneticdriftandfoundereffectduringquasispeciesevolutionoftheVP2andNS3/NS3Agenesofbluetonguevirusuponpassagebetweenshe印，cattle,andCulicoidessonorensis.〃TVirol75(17):8298-305.Bo匿au，K.R.，N.Zhang等人(1999).〃SequencecomparisonoftheL2andS10genesofbluetonguevirusesfromtheUnitedStatesandthePeople'sRepublicofChina."VirusRes61(2):153-60.Boshart，M.，F(xiàn).Weber等人(1985).〃Averystrongenhancerislocatedupstreamofanimmediateearlygeneofhumancytomegalovirus.〃Cell41(2):521-30.Bradel-Tretheway，B.G.，Z.Zhen等人(2003).〃Effectsofcodon-optimizationonproteinexpressionbythe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ō)明書(shū)。28.試劑盒，其包含(a)權(quán)利要求1的免疫原性組合物；和(b)所述動(dòng)物的除了BTV之外的其他病原體的抗原或免疫原或其表位，或者載體，所述載體包含并在所述動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)編碼所述抗原、免疫原或其表位的核酸分子，或者所述動(dòng)物的滅活或減毒的除了BTV之外的其他病原體，其中(a)和(b)在分開(kāi)的容器中，并且所述試劑盒可選地包含關(guān)于(a)和(b)的混合和/或施用的說(shuō)明書(shū)。29.權(quán)利要求26或28的試劑盒，其中所述動(dòng)物為貓類動(dòng)物或馬類動(dòng)物。30.質(zhì)粒，其編碼并在對(duì)藍(lán)舌病毒易感的動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)BTVVP2;BTVVP5;BTVVP2和VP5;BTVVP3，BTVVP7，BTVVP2禾卩VP5禾卩VP3，BTVVP2禾卩VP5禾卩VP7。全文摘要本發(fā)明涉及免疫原性或疫苗組合物，其用于在對(duì)BTV感染易感的動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)環(huán)狀病毒(更具體地，藍(lán)舌病毒(BTV))的免疫應(yīng)答或保護(hù)性免疫應(yīng)答。所述組合物可以包含制藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上可接受的運(yùn)載體或賦形劑以及載體。所述載體可以包含異源核酸分子，并在所述動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)BTV抗原、免疫原或其表位，例如BTVVP2；BTVVP2和VP5；BTVVP2和VP5和VP3和/或VP7。所述組合物可以包含佐劑，例如卡波姆。本發(fā)明還考慮了用于制備和使用此類組合物的方法，其包括初激-加強(qiáng)方案以及包括鑒別診斷。文檔編號(hào)A61K39/42GK101754975SQ200780027011公開(kāi)日2010年6月23日申請(qǐng)日期2007年5月30日優(yōu)先權(quán)日2006年6月1日發(fā)明者J·C·F·奧多內(nèi),J·姚,K·卡拉卡,N·J·麥克拉克倫申請(qǐng)人:梅瑞爾有限公司;加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)