專利名稱：：用交聯(lián)血紅蛋白血液代用品治療急性失血性貧血的方法用交聯(lián)血紅蛋白血液代用品治療急性失血性貧血的方法l.引言本發(fā)明涉及的新方法用于治療或預防急性失血，優(yōu)選急性失血性貧血，或者更優(yōu)選由下述原因引起的貧血(i)疾病引起的急性失血、(ii)外科手術期間發(fā)生的急性失血、或(iii)創(chuàng)傷引起的急性失血。本發(fā)明的方法包括向有需要的個體施用有效量的血液代用品，以提高血容量和對抗與急性失血相關的缺氧以及在常氧條件下誘導紅細胞生成。特別地，本發(fā)明的方法所用的血液代用品能夠(l)如在常氧條件下的細胞培養(yǎng)試驗所示，所述血液代用品能夠誘導促紅細胞生成素的表達，和/或(2)在常氧條件下，如通過(a)個體紅細胞壓積或血紅蛋白的倍增時間減少來檢測，和/或通過(b)個體促紅細胞生成素循環(huán)水平增加來檢測所示，所述血液代用品能夠誘導紅細胞生成。本發(fā)明還涉及新的藥物組合物，其包含在藥學可接受的載體中的治療或預防有效量或有效體積的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，其中在常氧條件下的細胞培養(yǎng)中檢測時，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品誘導促紅細胞生成素的表達。本發(fā)明進一步涉及新的藥物組合物，其包含在藥學可接受的載體中的治療或預防有效量或有效體積的交聯(lián)血紅蛋白，其中所述交聯(lián)血紅蛋白包含的血紅蛋白與高碘酸氧化的ATP分子內(nèi)交聯(lián)、與高碘酸氧化的腺苷分子間交聯(lián)和與還原型谷胱甘肽偶聯(lián)。在細胞培養(yǎng)中試驗時，本發(fā)明的藥物組合物中所用的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品和交聯(lián)血紅蛋白能夠(l)穩(wěn)定fflF-la的表達，和/或(2)下調(diào)NF-KB。2.
背景技術：
：雖然自從19世紀末以來就認為可以使用不含細胞的血紅蛋白(人和牛)作為紅細胞的替代品，但僅僅在最近幾十年集中嘗試進行了血液代用品的研究。近年來這種嘗試背后的主要推動力是對血源性傳染源的潛在傳播和世界范圍內(nèi)血液供者不足的考慮(Sellards等人(1916)JMedRes34:469;AmbersonWR(1934)JCellComparPhysiol5:359-382;AmbersonWR(1937)BiolRev12:48-86;WinslowRM(2002)CurrOpinHematol9(2):146-151;WinslowRM(2003)JInternMed253:508-517)。在美國，實施靈敏篩選實驗降低了輸血引起的傳染病傳播的風險，乙型肝炎傳播降低到1:63,000，HIV傳播降低到1:493,000，丙型肝炎和人T細胞白血病病毒的傳播降低到介于前二者之間(Schreiber等人(1996)NEnglJMed334(26):1685-1690)。雖然血液是否傳播克-雅病(Creutzfeldt-Jacob'sdisease)或其牛類變種的問題還不明確，在發(fā)達國家中血液安全性仍顯著地需要改善(Hoots等人(2001)TransflisMedRev15(2Suppl1):45-59)。另一方面，世界衛(wèi)生組織和國際科學團體應該迫切關注不發(fā)達國家中血液供應缺乏安全性的問題。在感染人群很大的發(fā)展中國家，估計6百萬單位的供血沒有檢測HIV、肝炎和梅毒(WorldHealthOrganizationWebPage(2005)www.who.int.Wake等人(l998)TropDoct28(1):4-8)。世界衛(wèi)生組織估計每年全世界需要1億單位的血液；每3.75秒就有一個美國公民需要輸血。同時，供血者的比例下降。因為供血比例很低，血庫經(jīng)常不能滿足需要。美國已經(jīng)從歐洲進口血液。在美國，每年使用約1.2千萬單位，預期到2030年每年有3-4百萬單位的不足。該預期的供血不足沒有考慮在自然災害、恐怖襲擊和戰(zhàn)爭中對血液的更多嚴重需要。當血液的需要以每年1%的速率增長時，美國的供血以1。/。的年速率降低(Surgenor等人(1990)NEnglJMed322(23):1646-1651;HawkinsD.(1999)USNewsWorldRep126(3):34;NationalBloodDataResourceCenterWebPage(2005)www.nbdrc.org:NorthCentralBloodServicesWebPage(2005)www.vourbloodcenter.org)。血液獲得和檢測的成本顯著地逐步升高。目前，采集、檢測和輸送一單位血液的成本為約$1，000,這沒有計算接受經(jīng)篩選，卻存在污染的血液的人員的訴訟費用因素(Blumberg等人(1996)AmJSurg171:324-330)。使用紅細胞輸血的另一個缺點是必須使它們保持冷凍，即使是封裝的細胞也僅僅具有42天的保存期限。而且，用紅細胞進行輸血需要檢定血型和交叉配型，這些都不能在事故現(xiàn)場或戰(zhàn)場上進行(Williams等人(1977)PreservationandClinicalUseofBloodandBloodComponents.Hematology.McGraw-HillBookCompany,NewYork)。2丄血液代用品由于輸血醫(yī)學中存在的這些和其它問題，需要尋找新的血液代用品。有效的血液代用品將消除輸血傳播疾病的風險，并且改變管理世界范圍內(nèi)血液供應的選擇。無病原體、普遍相容且不需要交叉配型的血液代用品將開啟重要的民用和軍用全球市場。攜帶活性氧的溶液具有廣泛含義，包括潛在的不含任何病原體的無限量血液代用品。通用的血液代用品可以改變出血性休克的患者的緊急治療操作；用于擇期外科手術期間圍手術期的血液稀釋；延長移植用捐贈器官的存活時間；改善血液的攜氧能力以治療生命受威脅的疾病例如心肌梗死和中風；用于腫瘤輻射致敏；和治療貧血及其它血液學疾病(Winslow誕(2002)CurrOpinH,tol9(2):146-151)。19在不到十年中，血液代用品的研究從科幻小說領域進入到現(xiàn)實中。然而，可用的血液代用品的商業(yè)化開發(fā)受到一定限制，還沒有成功。盡管研究了許多不同的基于游離血紅蛋白的血液代用品，但是由于存在不良副作用，在有限的人安全試驗中它們并不令人滿意。這些產(chǎn)品的主要問題是它們的血管收縮活性。其它被報道的問題是加重氧化應激和放大全身性炎癥反應(WorkshoponCriteriaforSafetyandEfficacyEvaluationofOxygenTherapeuticsasRedCellSubstitutes(1999)NIH,BethesdaMD;WinslowRM.(2000)VoxSang79(1):1-20)。實際上，HEMASSIST,BaxterHealthcareRoundLake,IL(授予Walder的美國專利4,598,064和4,600,531;授予Estep的美國專利4,831,012和5,281,579)的商業(yè)化開發(fā)已經(jīng)停止；同時，HEMOLINKTM，一種棉子糖聚合的人血紅蛋白溶液，Hemosol,Mississauga，Canada(授予Hsia的美國專利4,857,636)，的開發(fā)已經(jīng)暫停，因為其導致人的死亡率增高或心肌梗死增多。更早的，OPTROTM，一種重組血紅蛋白，Somatogen,Boulder,CO(授予Hoffman等人的美國專利5,028,588、5,563,254和5,661,124;授予Rosenthal等人的美國專利5,631,219)的商業(yè)開發(fā)被取消，因為在受試病人中觀察到嚴重的全身性炎癥反應。HEMOPURE,牛的戊二^聚合血紅蛋白溶液，BiopureInc.,Cambridge,MA(授予Rausch等人的美國專利5,084,558、5,296,465和5,753,616;授予Light等人的美國專利5，895，810)因其"安全考慮"而臨床試驗暫緩進行。在2002年，NorthfieldLaboratories,Evanston,IL(授予Sehgal等人的美國專利4,826,811、5，194，590、5,464,814、6,133,425、6,323,320和6,914,127)的POLYHEME⑧沒有得到美國管理部門的批準，POLYHEME⑧是戊二醛聚合的人血紅蛋白溶液，用于擇期外科手術患者?，F(xiàn)在，在同情使用(compassionateuse)的基礎上，POLYHEME⑧被臨床實驗用于治療汽車事故受害者的重度出血(WorkshoponCriteriaforSafetyandEfficacyEvaluationofOxygenTherapeuticsasRedCellSubstitutes.September27-29,1999.NIH,Bethesda,MD;SimoniJ.(2005)In:ArtificialOxygenCarrier.ItsFrontLine.K.Kobayashi等人(編輯).Springer畫Verlag,Tokyo2005,第75-126頁；MooreE.(2003)JAmCollSurgeons196:1-17)。要成為有效的載氧血漿擴容劑，血液代用品必須滿足一系列必要條件。除了是不含病原體、無毒、非免疫原性和非致熱性及具有延長的貯存期限之外，這些產(chǎn)品還應當具有接近于全血的令人滿意的攜氧能力，足夠進行有效的組織氧化和使循環(huán)保留時間為至少24小時。所述血液代用品產(chǎn)品的膠體滲透壓和津t度不應當超過血漿(WorkshoponCriteriaforSafetyandEfficacyEvaluationofOxygenTherapeuticsasRedCellSubstitutes(1999)NIH,Bethesda,MD;GuidanceforIndustry.CriteriaforSafetyandEfficacyEvaluationofOxygenTherapeuticsasRedCellSubstitutes(2004)U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,FoodandDrugAdministration,CenterforBiologiesEvaluationandResearch,Rockville,MD)。所述有效的血液代用品除了能立即使血流(血管舒張)和組織/器官灌注(氧化)達到最大外，這些產(chǎn)品也應當能刺激紅細胞生成。由于血液代用品的循環(huán)保留時間短(半衰期小于24小時)以及亞鐵血紅素自氧化速率高(每天超過30%)，這些產(chǎn)品的紅細胞生成活性是失血性貧血治療中的一個主要組成。氧化的亞鐵血紅素喪失了其轉運氧的能力，因此，刺激紅細胞生成成為用血液代用品治療的一種極為重要的因素。用內(nèi)源性紅細胞對失血進行迅速補給似乎是血液代用品最有吸引力的前景。換句話說，在治療急性貧血中，血液代用品應當充當臨時的"氧，，過渡，直到身體能夠產(chǎn)生足夠的紅細胞以維持適當?shù)慕M織氧化(WorkshoponCriteriaforSafetyandEfficacyEvaluationofOxygenTherapeuticsasRedCellSubstitutes(1999)NIH，Bethesd^MD)。紅細胞生成，造血的一個組成部分，是多能干細胞通過細胞分裂和分化的幾個步驟向紅細胞發(fā)展。多能干細胞產(chǎn)生骨髓干細胞(CFU-GEMM)，后者變成爆發(fā)形成單位類紅細胞(BFU-E)，然后，變成集落形成單位類紅細胞(CFU-E)和原紅細胞。當原紅細胞開始產(chǎn)生血紅蛋白時，其變成早幼紅細胞和中幼紅細胞。然后，當所述細胞質(zhì)更進一步變得嗜伊紅時，其變成正染性成紅細胞。在擠壓其核后，該細胞作為網(wǎng)織紅細胞進入循環(huán)，并且在幾天內(nèi)，在喪失其多核糖體后變成成熟的紅細胞。在正常條件下，整個紅細胞生成過程將需要不超過5天。成熟紅細胞的壽命為約90-120天，它們需要連續(xù)的補給(HillmanRS，F(xiàn)inchCA:RedCellManual.第7版，Philadelphia:RA.Davis,cl996,viii，第190頁)。紅細胞生成的調(diào)節(jié)是由高敏感度的反饋系統(tǒng)控制的復雜過程，該系統(tǒng)基于氧張力(濃度)和細胞的氧化還原狀態(tài)，該狀態(tài)涉及氧和氧化還原調(diào)節(jié)的轉錄因子及許多生長因子(促紅細胞生成素-EPO、IL-3、IL-9、SCF、GM-CSF)和礦物質(zhì)，特別是鐵(AdamsonJW(1991)Biotechnology19:351-361;SasakiR(2003)IntMed42(2):142-149;LacombeC等人(1998)Haematologica83(8:724-732)。雖然EPO不是負責紅細胞生成的唯一生長因子，但其是定向祖細胞增殖的最重要調(diào)節(jié)劑和抗細胞凋亡的保護劑。通過EPO受體(EpoR)實現(xiàn)的EPO的主要功能是保護定向紅系祖細胞不凋亡。EPO-依賴性的抗細胞凋亡蛋白BcI-(L)的上調(diào)允許細胞凋亡-保護的定向成紅細胞的"默認"終末分化，而與任何外源性信號無關(Socolovsky等人(1999)Cell98(2):181-91;Dolznig等人(2002)CurrBiol12(13):1076-1085)。紅細胞生成事件和因子的示意包括CFU-GEMM—(EPO，SCF，IL-9)—BFU-E—(EPO,SCF，GM-CST，IL-3)—CFU-E—(EPO，GM-CSF)—22ERYTHROBLAST(EPO)—RETICULOCYTE—RBC。貧血定義為血液載氧能力的病理性不足，導致缺氧。貧血的主要原因是急性失血、頑固性貧血繼發(fā)的慢性疾病、癌癥、血管內(nèi)溶血和紅細胞扣留增加或紅細胞生成減少。缺氧的固有應答是紅細胞生成反應增加(CampbellK.(2004)NursTimes100(47):40-43)。缺氧刺激腎臟(皮質(zhì))的小管周間質(zhì)細胞生成EPO。EPO也在肝臟和腦星形細胞中合成，其對抗缺氧期間神經(jīng)元的細胞凋亡和破壞。氧調(diào)節(jié)的轉錄因子；缺氧誘導的因子-la(fflF-la)和缺氧誘導的因子-ip(HIF-ip)調(diào)節(jié)在人的7號染色體上的單個基因控制下的該過程。特異性結合EPO編碼基因3'增強子的HIF-1也是其它對缺氧適應重要的基因中的啟動子(Semenza等人(1992)MoICellBiol12;5447-5454;Brines等人(2005)NatRevNeurosci6(6):484-494)。Semenza和Wang鑒定的HIF-1是由兩個堿性螺旋環(huán)-螺旋/PAS蛋白(HIF-la)和芳香烴核轉位fflF-lp組成的異源二聚體。HIF-ip不太受氧的影響，而HIF-la僅在低氧條件下存在。在含氧量正常下，HIF-la的降解取決于pyrol-4-幾化酶對其脯氨酸殘基的氧介導的羥基化。HIF-la的羥基化引發(fā)vonHippel-Lindau肝瘤抑制蛋白對其快速降解，所述vonHippel-Lindau胂瘤抑制蛋白結合羥基化域而不結合非幾基化域。所述vonHippel-Lindau腫瘤抑制蛋白是將HIF-la連接至泛素途徑的泛素連接酶的一部分(Wang等人(1995)JBiolChem270;1230-1237;Wang等人(1993)JBiolChem268;21513-21518;Kallio等人(1999)JBiolChem274(10):6519-6525。然而，在低氧條件下，氧的缺乏抑制HIF-la的降解，HIF-la從細胞質(zhì)快速易位至細胞核，并作為數(shù)十個氧-調(diào)節(jié)乾基因的主要調(diào)節(jié)劑起作用，這些耙基因參與1)氧轉運紅細胞生成(EPO);鐵轉運(轉鐵蛋白)；鐵攝取(轉鐵蛋白受體)，2)血管調(diào)節(jié)血管生成(VEGF、EG-VEGF、PAI-1);血管緊張度的控制(iNOS、alB-腎上腺素能受體、ET-1);血管重構(HO-l)，3)無氧供能葡萄糖攝取(葡萄糖運載體l);糖酵解的調(diào)節(jié)(PFKFB3);糖酵解(磷酸果糖激酶1、醛醇酶、GAPDH、磷酸甘油酸激酶1、烯醇酶1、乳酸脫氫酶A(WengerRH(2002)FASEBJ16;1151-1162;Gleadle等人(1997)Blood89(2):503-509;Gleadle等人(l998)MoIMedToday4(3):122-129)。HIF-la在含氧量正常下也可以是穩(wěn)定的。例如，在氧化應激下，通過改變激活NF-kB和誘導炎癥基因(即TNF-a、IL-1|3、IL-6)的細胞氧化還原平衡產(chǎn)生的活性氧分子(ROS)可以穩(wěn)定fflF-la。然而，這些炎癥細胞因子也可以抑制HIF-la結合EPO基因，同時促進VEGF基因誘導，從而抑制紅細胞生成和加速血管生成。在癌癥患者中，由于有效的血管生成，該現(xiàn)象可導致重度貧血和腫瘤過度生長。類似地，已知在常氧條件下其能穩(wěn)定fflF-la的其它炎癥介質(zhì)TGF-(3,能夠阻止紅系祖細胞的分化，同時降低EPO的紅細胞生成活性(Hellwing-Burgel等人(1999)AmSocHematol94:1561-1567;LinchDC(1989)SchweizMedWochenschr119(39):1327-1328)。在晚期腎病的患者中，炎癥也受到EPO抗性的發(fā)病機理影響?，F(xiàn)在認為TNF-a、IL-l(3和IL-6能抑制尿毒癥中的紅細胞生成。在動物模型和人中，施用IL-6可通過直接抑制紅系祖細胞而導致造血障礙性貧血(Trey等人(1995)CritRevOncolHematol21:1-8;Yuen等人(2005)ASAIOJ51(3):236陽241)。已知在常氧條件下穩(wěn)定HIF-la的其它因子包括NO、PDGF和oxLDL。在含氧量正常條件下控制HIF-la調(diào)節(jié)的分子途徑受ROS、PI3K、TOR和MAP激酶，特別是ERK1/2的介導(Haddad等人(2000)JBiolChem275(28):21130-21139;Haddad等人(2001)FEBSLett505(2):269-274;Lando等人(2000)JBiolChem275(7):4618-4627;Richard等人(1999)JBiolChem274(46):32631-32637)。1949年由Amberson首次觀察到游離血紅蛋白可能參與紅細胞生成反應，他觀察到在給予天然血紅蛋白溶液后人紅細胞生成指標(網(wǎng)織紅細胞計數(shù)和紅細胞壓積)增加。該試驗以患者由于腎衰竭死亡而悲劇性地結束(Amberson等人(1949)JApplPhysiol1:469-489)。30年后，Savitsky進行了向正常人志愿者灌注無紅細胞架構的血紅蛋白溶液的實驗，該臨床試驗導致類似的悲劇性結果。采用這種血紅蛋白治療的所有個體均顯示出系統(tǒng)性高血壓和腎衰竭，其中一人死亡(Savitsky等人(1978)ClinPharmacolTher23:73-80)。這些早期的臨床試驗證實未交聯(lián)的血紅蛋白是致命的，且不適于輸血。當時，那些作者們還不能解釋這些病理性事件的機理。運用目前的知識，有理由認為在Amberson和Savitsky的臨床試驗中觀察到的病理性反應，特別是血壓的快速升高是血紅蛋白的內(nèi)在毒性的結果?，F(xiàn)在，已經(jīng)了解基于血紅蛋白的血液代用品通過清除一氧化氮和影響其它血管緊張度控制機制，可以造成血壓嚴重升高，血壓的升高與心輸出量降低和總的血管外周阻力增加相關(SimoniJ.(2005)In:ArtificialOxygenCarrier.ItsFrontLine.K.Kobayashi等人(編輯).Springer-Verlag,Tokyo,2005第75-126頁)。血紅蛋白是一種升壓劑，并且目前所用的化學或重組體修飾技術不能解決這一問題。所有檢測的血液代用品產(chǎn)品，包括HEMASSIST、OPTROTM-rHbl.l、POLYHEME⑧、HEMOPURE⑧和HEMOLINK,都會引起血管收縮，這種副作用已成為血液代用品開發(fā)商面臨的主要困難。在注射25這些血液代用品之后觀察到的血壓升高是由血管收縮引起的外周血管阻力增力口引起的(WinslowRM(1994)TransfClinBiol1(1);9-14;Hess等人(1994)ArtifCellsBloodSubstitImmobilBiotechnol22(3):361-372;Kasper等人(1996)CardiovascAnesth83(5):921-927;Kasper等人(1998)AnesthAnal87(2):284-291;WinslowRM(2003)JInternMed253:508-517)。也有報道一些產(chǎn)品具有閉合毛細管流的傾向，這會降低組織/器官灌注率，并導致缺氧(Cheung等人(20(U)AnesthAnal93(4):832-838)。因為低氧環(huán)境穩(wěn)定HIF-la，理論上，促進血管收縮和產(chǎn)生缺氧的血液代用品有可能會誘導HIF-la調(diào)節(jié)基因。然而，該機制與向迫切需要空氣的組織遞送足夠量的氧的血液代用品的主要作用相矛盾。向缺血器官適當?shù)毓┭跏枪芾聿块T批準血紅蛋白溶液作為血液代用品的基本要求。因此，這樣的"紅細胞生成作用"應當被認為是病理性的。無毒和有效的血液代用品產(chǎn)品應當使血流和組織灌注最大化，從而使氧合最大化(WorkshoponCriteriaforSafetyandEfficacyEvaluationofOxygenTherapeuticsasRedCellSubstitutes(1999)NIH,Bethesda,MD;GuidanceforIndustry.CriteriaforSafetyandEfficacyEvaluationofOxygenTherapeuticsasRedCellSubstitutes(2004)U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,FoodandDrugAdministration,CenterforBiologiesEvaluationandResearch,Rockville,MD)。理論上，當大劑量使用這樣的血液代用品時，其可以觸發(fā)炎癥反應，所述炎癥反應可抑制其初始的、含氧量低-驅(qū)動的紅細胞生成反應。在20世紀90年代，Simoni等人發(fā)現(xiàn)血紅蛋白是一種氧化還原調(diào)節(jié)的轉錄因子NF-kb的有效誘導物，NF-kB參與調(diào)節(jié)涉及炎癥的基因。他發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮NF-kB的活化可能取決于血紅蛋白的促氧化潛能和血紅蛋白-介導的細胞氧化應激的程度，所述血紅蛋白-介導的細胞氧化應激使GSH/GSSG變化成氧化平26衡。在該研究中，戊二醛聚合的牛血紅蛋白似乎是比未修飾的血紅蛋白更有效的NF-kB誘導物。Simoni等人認為該作用與戊二醛聚合的血紅蛋白產(chǎn)生最高的內(nèi)皮脂質(zhì)過氧化作用和最大的細胞內(nèi)GSH消耗的現(xiàn)象有關?；谶@些研究，Simoni等人提出NF-kB的活化可以被認為是血紅蛋白-誘導的氧化應激和血紅蛋白-介導的炎癥反應之間的"過渡"。此外，他的發(fā)現(xiàn)奠定了認為血紅蛋白是一種信號分子的基礎(Simoni等人(1997)ArtifCellsBloodSubstitImmobilBiotechnol25(1-2):193-210;Simoni等人(1997)ArtifCellsBloodSubstitImmobilBiotechnol25(1-2):211-225;Simoni等人(1998)ASAI0J44(5):M356-367;Simoni等人(1994)ArtifCellsBloodSubstitImmobilBiotechnol22(3):525-534;Simoni等人(2000)ASAI0J46(6):679-692;Simoni等人(1994)ArtifCellsBloodSubstitImmobilBiotechnol22(3):777-787;PahlHL(1999)Oncogene18:6853-6866;GilmoreTD(2005))。Simoni隨后的研究揭示觸發(fā)NF-KB的血紅蛋白溶液可抑制fflF-la調(diào)節(jié)基因，特別是EPO的證據(jù)(Simoni等人(2003)ArtificialBlood11(1):69;Simoni等人(2003)ASAIOJ49(2):181;SimoniJ.(2005)In:ArtificialOxygenCarrier.ItsFrontLine.K.Kobayashi等人(Eds.).Springer誦Verlag，Tokyo,2005，第75-126頁)。也有才艮道在最初紅系祖細胞中的高活性NF-kB途徑參與紅細胞系特異性基因的抑制(Liu等人(2003)JBiolChem278(21):19534-19540)。普遍認為炎癥有助于EPO抗性的發(fā)病，特別在貧血和癌癥中(Yuen等人(2005)ASAIOJ51(3):236-241;Hellwig國Burgel等人(1999)94(5):1561-1567)。因此，理論上，即使在含氧量正常的環(huán)境中，改變細胞的氧化還原態(tài)的血液代用品可能會觸發(fā)NF-KB調(diào)節(jié)基因(即細胞因子)和穩(wěn)定HIF-la。然而，27在這樣的條件下，HIF-la與EPO基因的有效結合受炎癥細胞因子的抑制。因為血紅蛋白與炎癥細胞因子的生成相關，而且炎癥細胞因子是強的抗紅細胞生成劑，有理由認為具有強促炎癥反應潛能的血液代用品可抑制紅細胞生成反應。實際上，有才艮道一些目前正在檢測的血液代用品不僅調(diào)節(jié)血管收縮事件，而且它們也能誘導炎癥反應。在劑量逐步增加的研究中(臨床試驗的后期)，那些反應更加明顯，并且已經(jīng)通過Baxter的HEMASSISTTM、Biopure的HEMOPURE、Somatogen的rHbl.l-OPTRO和Northfield的POLYHEME觀察到那些反應。血管收縮和缺血/炎癥反應被認為是更改、停止或中止這些血液代用品的臨床開發(fā)的主要原因(SimoniJ,(2005)In:ArtificialOxygenCarrier.ItsFrontLine.K.Kobayashi等人(編輯).Springer-Verlag,Tokyo,2005第75-126頁)。不利于目前檢測的血液代用品的可能的紅細胞生成活性的另一科學原理是血紅蛋白具有天然的促細胞凋亡潛能。這一觀察結果非常重要，因為EPO作為促紅細胞生成劑的主要功能是保護定向成紅細胞不發(fā)生細胞凋亡，從而使得紅細胞生成能夠發(fā)生(Socolovsky等人(1999)Ce1198(2):181-91;Dolznig等人(2002)CurreBiol12(13):1076-1085)。有報道未修飾的血紅蛋白對于人內(nèi)皮細胞具有促細胞凋亡潛能，半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9控制這一作用，其可通過消耗細胞內(nèi)GSH來促進(Meguro等人(2001)JNeurochem77(4):1128-1135;Simoni等人(2002)ASAK)J48(2):193)。琥珀酰水楊酸修飾的血紅蛋白(HEMASSISTTM)及其戊二醛-聚合的變型也誘導形態(tài)變化、G2/M阻滯和DNA片段化，其標志著凋亡性細胞死亡(Goldman等人(1998)AmJPhysiol275(3Pt2):Hl046-53);D'Agnillo等人(2001)Blood98(12):3315-3323)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Oxyglobin，一種在體外心臟灌流模型中所用的HEMOPURE(Biopure)的變型，可導致凋亡性內(nèi)皮細胞死亡(TUNEL測定)，其與冠狀動脈阻力的顯著增加有關(Mohara等人(2005)ASAI0J51(3):288-295)。事實證明與骨髓細胞直接接觸的具有促細胞凋亡潛能的任何試劑都具有抗紅細胞生成活性。這樣的試劑將與EPO的抗細胞凋亡作用相竟爭，阻止紅細J包生成。實際上，基于血紅蛋白的血液代用品部分地被骨髓細胞清除，因此，它們與成紅細胞直接接觸(Shum等人(1996)ArtifCellsBloodSubstitImmobilBiotechnol24(6):655-683)。認識到血紅蛋白具有促細胞凋亡潛能并可與骨髓直接接觸，有理由認為當以較高的濃度給予時，具有促細胞凋亡活性的任何血液代用品產(chǎn)物將抑制紅細力包生成。在科學文獻和專利文獻中，關于基于血紅蛋白的血液代用品的紅細胞生成潛能的信息非常有限。1997年，Rosenthal等人(美國專利5，631,219)要求保護用重組血紅蛋白(rHb1.1)通過增加包括紅系祖細胞的祖細胞/干細胞的生長或分化來刺激哺乳動物造血的方法。授予Hoffinan等人的美國專利5,028,588、5,563,254和5,661,124要求保護重組血紅蛋白rHbl.l(商品名為OPTROTM)。在美國專利5,631,219中，向小鼠靜脈內(nèi)給予劑量為0.5或1.0mg/kg體重的rHbl.l，每周三次，將引起骨髓中紅系細胞的早期前體一BFU-E的增加。在Rosenthal等人的美國專利5，631，219中報道了用rHbl.l治療正常小鼠(BDF-1)后紅細胞壓積增加。為了評價rHbl.l是否以不同于定向紅細胞系前體的水平起作用，Rosenthal評價了rHbl.l對非常早期、非定向祖細胞、脾集落生成單位(CFU-S)的影響。根據(jù)美國專利5,631,219，Rosenthal發(fā)現(xiàn)rHb.1.1以0.5mg/kg體重的濃度可增加CFU-S的量。在美國專利5,631,219中，0.5mg的血紅蛋白/kg體重的較低劑量水平似乎比較高劑量的rHM.1(5和10mg/kg)的效果更好，這表明以低劑量出人意料地獲得最大的效果。沒有提供任何理論性說明，Rosenthal等人得出低劑量(0.5mg/kg體重)的rHbl.l以直接作用于祖細胞或間接增加血細胞生成的方式作用，并起到促紅細胞生成因子的作用。Rosenthal等人所用的rHbl.l的濃度(0.5-10mg/kg體重)在臨床上與氧轉運無關，因此不能治療急性失血。為了獲得治療性效果，基于血紅蛋白的血液代用品應當以克而不是以毫克輸注。因此，美國專利5,631,219不能用于治療急性失血性貧血。此外，美國專利5,631,219的專利權利要求與提供的實施例不一致。Rosenthal要求保護血紅蛋白的治療有效的水平為0.001至10,000mg/kg體重。這些權利要求不能得到Rosenthal專利的實施例支持，所述實施例顯示出濃度僅為0.5mg/kg體重的rHbl.l具有造血作用。也許，Rosenthal受到我們發(fā)表的文章的影響，該文章中公開劑量為約1.75g(l，750mg)/kg體重的化學修飾的牛血紅蛋白溶液在人中顯示出有效的紅細胞生成反應。美國專利5,631,219依賴于該文獻(Feola等人(1992)SurgGynecolObstet174(5):379-386)。1997年，Moqattash等人比較了灌注的rHbl.l和EPO在正常小鼠和AIDS小鼠中從AZT的抑制作用下拯救造血活性的能力。結果表明使用更高濃度的rHbl.l(10-15mg/kg體重)不會引起大多數(shù)血液指數(shù)的更顯著增加。而且，5-mgrHbl.l/kg體重聯(lián)合2UEPO/小鼠/天的治療顯示出比單獨的5-mg/kg-體重的rHbl.l作用更好(Moqattash等人(1997)ActaHaematol98(2):76-82)。30兩年后，Lutton等人成功地挑戰(zhàn)了Rosenthal的研究。通過分析臨床相關劑量的交聯(lián)血紅蛋白和非交聯(lián)血紅蛋白在兔子中的造血效應，他得出結論兩種血紅蛋白溶液在高濃度下不會產(chǎn)生BFU-E和CFU-S生成的顯著變化，因此，它們不表現(xiàn)出任何造血活性(Lutton等人(1999)Pharmacology58:319-324)。在多個臨床前和臨床研究中，已經(jīng)廣泛檢測了重組血紅蛋白(即rHbl.l)、交聯(lián)的四聚體血紅蛋白(即HEMASSIST)和聚合血紅蛋白(即HEMOPURE⑧、POLYHEME⑧)。所有被檢測的血紅蛋白溶液都被證實是有毒'f生的(WorkshoponCriteriaforSafetyandEfficacyEvaluationofOxygenTherapeuticsasRedCellSubstitutes(1999)NIH5Bethesda,MD)。在rHbl.l的人臨床試驗中，48名健康男性志愿者隨機分配接受15-320mg/kg體重的5%rhbl.l,其產(chǎn)生了嚴重的副作用，比如胃腸不適、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、頭痛和背痛(Viele等人(1997)Anesthesiology86(4):848-858)。在另一個臨床研究中，患者接受手術并接受67-365mg/kg體重的rHbl.l,沒有出現(xiàn)嚴重的不良事件。然而，患者患有高血壓、炎癥癥狀和胰酶升高。在這些臨床試驗中，也沒有才艮道rhbl.l的紅細胞生成作用(Hayes等人(2001CardiothoracVaseAnesth15(5):593-602)。rHbl.l的高度不令人滿意的臨床經(jīng)驗終止了該重組血液代用品的商業(yè)化開發(fā)。在90年代后期，Somatogen/Baxter集中開發(fā)新的第二代重組產(chǎn)品(rHb2.0;授予Olson等人的美國專利6，022,849)來代替臨床不成功的rHbl.l。新產(chǎn)品被設計成具有與一氧化氮更低的反應速率。然而，在2年的臨床前試驗后，rHb2.0的商業(yè)化開發(fā)也停止了。rHbl.l的臨床經(jīng)驗可幫助理解為什么在美國專利5,631,219中較低劑量水平(0.5mg的血紅蛋白/kg體重)似乎比較高劑量(5和10mg/kg)的作用更好。也許，較高劑量的rHb丄l的強促炎癥反應和促細胞凋亡潛能抑制了EPO基因的誘導，使紅細胞生成不能發(fā)生。因此，有理由認為比幾mg/kg體重更高濃度的rHbl.l將抑制紅細胞生成，卻能促進促炎癥反應吞嗟細胞生成作為造血的-炎癥事件的一部分。其它基于血紅蛋白的血液代用品產(chǎn)品在臨床試驗后期也沒有成功。HEMASSISTTM的III期研究悲劇性地終止了。施用HEMASSIST的患者的死亡率顯著高于對照組患者。1998年6月，在FDA的建議下，由于安全問題，HEMASSIST的開發(fā)計劃被暫緩。在HEMASSIST臨床試驗中，沒有報道紅細胞生成作用或造血作用(Sloan等人(1999)JAMA282:1857-1864)。HEMOPURE⑧的臨床開發(fā)(授予Rausch等人的美國專利5,084,558、5,296,465和5,753,616;授予Light等人的美國專利5，895,810)由于"安全問題"而被歸入臨床限制。該產(chǎn)品的強血管收縮、促氧化、促炎癥反應和促細胞凋亡潛能不可避免地限制了其作為血液代用品的實用性(Kasper等人(1996)CardiovascAnesth83(5):921-927;Kasper等人(1998)AnesthAnal87(2):284-291)。單獨HEMOPURE的紅細胞生成作用從來沒有被證實(GawrylMS(2003)ArtifBlood11(1):46)。然而，試驗性地使用HEMOPURE(聯(lián)合EPO)治療Jehovah'sWitness胃腸出血后的重度貧血。給具有初始血紅蛋白為3.5g/dL的50歲的人注射HEMOPURE(7單位)和高劑量的重組EPO(500U/kg/天)。在rEPO治療的24天中，血紅蛋白水平最初保持不變，然后慢慢地增加到7.6g/dL的最大值。該實例證實在等待重組EPO對骨髓紅細胞生成產(chǎn)生最大作用時，HEMOPURE(半衰期小于24小時)可以起到初始治療的作用。該臨床研究表明單獨的HEMOPURE⑧不具有紅細胞生成潛能(Gannon等人(2002)CritCare32Med30(8):1893-1895)。在2002年，POLYHEME⑧(授予Sehgal等人的美國專利4,826,811、5,194,590、5,464,814、6，133,425、6,323,320和6,914,127)未能獲得美國管理部門批準用于擇期外科手術患者?，F(xiàn)在，在同情使用的基礎上，POLYHEME被臨床實驗用于治療汽車事故受害者的重度出血。過去，POLYHEME⑧被用于治療患有持續(xù)性結腸出血且血紅蛋白為2.9g/dL的危重貧血婦女。在該臨床研究中，POLYHEME與刺激紅細胞生成反應所需的高劑量的重組EPO—起使用。因此，很可能POLYHEME類似于HEMOPURE,其單獨的不具有任何紅細胞生成活性(Allison等人(2004)SouthernMedJ97(12):1257-1258)。因為受試患者的心肌梗死(基于炎癥)比例增加，HEMOLINK的臨床開發(fā)(授予Hsia的美國專利4，857，636)被停止。與天然血紅蛋白相比，HEMOLINKTM顯示出在自氧化、氧化修飾和血紅素基團的完整性方面，穩(wěn)定性更低。表現(xiàn)出高血管收縮、促氧化和促炎癥反應性質(zhì)的HEMOLINK從來沒有被表征為單獨刺激紅細胞生成的產(chǎn)品(AlayashAl(2004)Nature3:152-159;RiessJG(2001)ChemRev101(9):2797-2919)。過去，與其它血液代用品產(chǎn)品(HEMOPURE⑧、POLYHEME)類似，在患有重度貧血、血紅蛋白為3.2g/dL的53歲女性Jehovah'sWitness的同情治療中試驗HEMOLINK。也在該試驗中，HEMOLINK與高劑量的重組EPO和石克酸亞鐵一起施用。在14天后，患者的血紅蛋白水平僅增加至6.5g/dL，紅細胞壓積為23%。該試驗提供了進一步的證據(jù)，證明有毒的基于血紅蛋白的血液代用品單獨的不會刺激紅細胞生成(Lanzinger等人(2005)CanJAnaesth52(4):369-373)。33對血紅蛋白的紅細胞生成活性的基礎研究也非常有限。最近，有報道血紅蛋白在低氧條件下增加HIF-la的表達。使用牛主動脈內(nèi)皮細胞模型，用蛋白質(zhì)印跡法檢測HIF-la,結果表明在全部未修飾的血紅蛋白溶液中，HIF-la的高表達與亞鐵-Hb的損失和三價鐵-Hb的累積(血紅素的氧化)有關。在該研究中，作者使用類似于HEMASSISTTM的琥珀酰水楊酸交聯(lián)血紅蛋白(Yeh等人(2004)AntioxidRedoxSignal6:944-953)。該試驗除了對之前提出的長期暴露于三價鐵-(氧化的)血紅蛋白而不是亞鐵-(氧合的)血紅蛋白中的內(nèi)皮細胞會經(jīng)由HO-l和鐵蛋白的生成增加而導致這些細胞顯著地對抗繼發(fā)的氧化損傷提供更多分子機制外，還提示現(xiàn)在已知該現(xiàn)象是受HIF-la調(diào)節(jié)的(Balla等人(1995)AmJPhysiol268(2Pt1):L321-327)。因為有效的基于血紅蛋白的栽氧體必須能對抗與失血性貧血相關的低氧條件，上述發(fā)現(xiàn)僅可以應用于加重缺氧的那些產(chǎn)品，從而誘導HIF-la。實際上，目前臨床開發(fā)中的血液代用品產(chǎn)品具有良好的經(jīng)證實的血管收縮潛能和高自氧化速率。然而，在Yeh的研究中，得出血紅蛋白和紅細胞生成之間沒有聯(lián)系。一種目前開發(fā)中的血液代用品明顯缺少紅細胞生成活性，這可由來自theDepartmentofTransfusionMedicine,WarrenG.MagnusonClinicalCenter,NationalInstituteofHealth,Bethesda,MD的Dr.HarveyGKlein的聲明中得出。在他的2005年標題為"Bloodsubstitutes:howclosetoasolution"評論性文章中，他指出"…人、牛和重組來源的血紅蛋白-衍生的紅細胞代用品在III期試驗中都具有按小時計的半衰期，不可能代替刺激紅細胞生成的輸血或藥物用于慢性貧血，但是他們可起以下作用(l)當沒有立即可用的相容性血液時，作為輸血的過渡，(2)作為外科手術的自體血液稀釋治療的輔助物，或者甚至(3)用于放射治療或控制癌癥"(KleinHG(2005)DevBiol(Base1)120:45-52)。上述分析闡述了還沒有被開發(fā)出的理想的血液代用品。最佳血液代用品應當維持患者直到出血被控制。因為無細胞的血液代用品循環(huán)半衰期短，它們應具有刺激紅細胞生成的能力以補償失血。為了維持患者，血液代用品將使血流和組織灌注最大化，從而使氧合作用最大化。為了刺激紅細胞生成，血液代用品應當在低氧和常氧條件下穩(wěn)定HIF-la，通過控制促氧化和促炎癥反應，該血液代用品應促進HIF-la結合EPO-基因。所述血液代用品也應當不具有任何促細胞凋亡活性，因為EPO的主要功能是從凋亡中搶救定向的紅系祖細胞。這些事件是引發(fā)有效的紅細胞生成所必需的，所述紅細胞生成將用內(nèi)源性紅細胞不停地補償損失的血液。向缺血器官適當?shù)毓┭跏枪芾聿块T批準血紅蛋白溶液作為血液代用品的基本要求。因此，誘導血管收縮和具有強的促氧化、促炎癥反應和促細胞凋亡潛能的血液代用品可能對患者有害，是臨床不可接受的。目前在臨床試驗下的產(chǎn)品代表了第一代血液代用品，現(xiàn)在的研究致力于解決所有血紅蛋白內(nèi)在毒性問題的"新一代"血液代用品。相信第二代產(chǎn)品可用于所有臨床適應癥，包括治療急性失血性貧血和創(chuàng)傷。因為目前試驗的血液代用品不具有紅細胞生成活性，仍存在對改善的載氧溶液的需要，所述載氧溶液應當具有如下能力使組織灌注和氧合作用最大化和剌激紅細胞生成，從而用內(nèi)源性紅細胞代替損失的血液。這樣的血液代用品刺激紅細胞生成應當出現(xiàn)在低氧和常氧條件下。在生命受威脅的貧血情況下，這樣的血液代用品應通過穩(wěn)定HIF-1a和EPO生成來刺激患者的紅細胞生成反應，作為最初的治療以保持組織氧合作用，并作為繼續(xù)性治療以使紅細胞壓積正?；?。該治療應不再需要昂貴的重組EPO藥物。在專利文獻中，提示穩(wěn)定HIF-1a可以在治療缺氧相關的組織損傷中提供治療益處。授予Semenza的美國專利6,562,799提供了通過給個體施用治療有效量的穩(wěn)定的HIF-la蛋白來治療缺氧-或局部缺血-相關的組織損傷的方法。授予Gregory等人的美國專利6,432,927提供了用能夠轉錄活化的缺氧誘導蛋白因子的DNA結合域來減少局部缺血性組織損傷的方法。授予Kaelin等人的美國專利6,849,718提供了包含HIF-la突變體的藥物組合物和使用所述組合物治療缺氧和局部缺血相關的組織損傷的方法。授予Arbeit的美國專利6,838,430提供了穩(wěn)定的HIF-la變體促進傷口愈合的用途。然而，這些專利方法沒有涉及使用基于血紅蛋白的血液代用品促進HIF-la依賴性EPO誘導，從而促進紅細胞生成。使氧遞送至局部缺血的組織和器官最佳化和有效刺激紅細胞生成反應是管理部門批準這些試劑作為血液代用品的最重要因素。本發(fā)明的血液代用品解決了上述討論的問題。2.2.急性失血的治療在美國，目前沒有管理部門批準的血液代用品。因而，輸血是快速恢復急性失血個體的血容量的唯一可靠方法。然而，存在大量與輸血有關的風險。首先，需要檢測供體血液以確定其適于輸血并與接受者相容。相容性檢測通常包括(l)供體和接受者血液的ABO類型，以防止輸入不相容的紅細胞(RBC);和(2)Rh類型，以確定在是否在RBC中存在Rh因子RhO(D)(Rh-陽性)或不存在Rh因子(Rh-陰性)。所供血液也需要使用例如直接抗球蛋白試驗(直接Coombs試驗)和間接抗球蛋白試驗(直接Coombs試驗)來篩選，以鑒定不可預36期的抗-RBC抗體，其可引起溶血性疾病或嚴重的輸血反應。假定供體血與接受者匹配，輸血仍可導致許多并發(fā)癥。例如，在輸血期間或輸血之后供體或接受者RBC(通常是前者)的溶血可能由ABO/Rh不相容性、血漿不相容、發(fā)生溶血的RBC或脆弱的RBC(例如過度加熱貯藏的血液或與不適當?shù)腎V溶液接觸)、或注射非等滲的溶液引起。當不相容的供體RBC被接受者血漿中的抗體溶血時，反應是最嚴重的，可引起呼吸困難、發(fā)熱和寒戰(zhàn)、臉部發(fā)紅、極度疼痛(特別是在腰部)以及導致血壓下降、惡心和嘔吐的休克。對供體血液未知成分的過敏性反應也很常見，通常是由供體血漿中的變應原或較少情況下由來自過敏性供體的抗體引起。在輸血期間或輸血剛結束時，這些反應通常是輕度的，伴有蕁麻療、水胂、臨時性頭昏和頭痛，但是在少見情況下可出現(xiàn)過敏反應。更不常見的另一種并發(fā)癥是輸血相關的急性肺損傷，其由供體血漿中的抗白細胞(WBC)抗體使接受者肺內(nèi)的WBC聚集和脫顆粒引起。將大量空氣輸入靜務jc也可引起心臟中的血液起泡沫，隨后泵送效率低，導致心力衰竭。移植物抗宿主疾病，其甚至可以由輸注血液中的少量活性淋巴細胞或輸注的血液成分引起，也可以由輸血引起。還存在細菌污染的問題，其可能由于采集期間無菌操作不當或暫時未出現(xiàn)癥狀的供體而導致。最后和最重要地，輸血的接受者總是有病毒性疾病的傳染危險，包括但不限于肝炎、HIV、巨細胞病毒(CMV)和I型人T細胞親淋巴病毒(HTLV-I)傳染。3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及使用某些血液代用品來治療或預防有需要的個體的急性失血性貧血的方法，所述急性失血性貧血是由下述原因引起的貧血(i)疾病引起的急性失血，(ii)外科手術期間出現(xiàn)的急性失血，或(iii)由創(chuàng)傷引起的急性失血。本發(fā)明的方法涉及使用在既能恢復血容量和對抗缺氧，又能在常氧條件下誘導紅細胞生成的血液代用品。輸血是目前快速恢復個體失血的唯一可靠的方法，能有效地恢復血容量和對抗缺氧。然而，在急性失血引起的急癥期間輸血是不理想的，因為沒有時間檢測供體和接受者血液之間的相容性，而且總會存在觸發(fā)與存在于供體血液中的免疫成分相關的許多并發(fā)癥(例如RBC的溶血、過敏性反應、輸血相關的急性肺損傷、移植物抗宿主疾病、細菌污染、病毒性疾病的傳染等)的風險。而且，輸血暫時恢復了常氧條件，但損害了身體再補充自身紅細胞的能力。特別地，引起紅細胞生成的體內(nèi)促紅細胞生成素的生成增加是由低氧條件誘導的。因此，輸血雖然是缺氧的"快速修復"，但最終減慢了紅細胞生成，和因而減慢了將內(nèi)源性紅細胞再補充到循環(huán)中的機體能力。目前試驗用于人使用的血液代用品也有類似的原因。特別地，許多血液代用品的循環(huán)保留時間很短(半衰期小于24小時)，亞鐵血紅素自氧化速率#:高(每天超過30%)，因此不具有用內(nèi)源性紅細胞補充體循環(huán)所需的紅細胞生成活性。本發(fā)明解決了這一問題，因為本發(fā)明方法所用的血液代用品能夠在常氧條件下誘導紅細胞生成。在一些實施方案中，所述失血與疾病例如出血性疾病、潰瘍或血管破裂或動脈瘤等相關。在某些其它的實施方案，所述失血在外科手術比如擇期外科手術(例如矯形外科手術)期間出現(xiàn)。在某些其它的實施方案，所述失血是由創(chuàng)傷比如燒傷、槍傷或刺傷引起。在一些實施方案中，所述失血為重度的，個體的失血超過33%。在某些其它的實施方案，所述失血為中度的，個體的失血為約20%至33%。在某些其它的實施方案，所述失血為輕度的，個體的失血為小于20%。優(yōu)選地，所述個體為人?？梢杂欣厥褂帽景l(fā)明的方法治38療血紅蛋白低于7g/dL的人個體。本發(fā)明的方法包括向有需要的個體施用一定量的血液代用品，所述量能有效地提高血容量和對抗與急性失血相關的缺氧。本發(fā)明的方法所用的血液代用品能夠(l)如在常氧條件下的細胞培養(yǎng)中試驗所示，所述血液代用品能夠誘導促紅細胞生成素的表達，和/或(2)在常氧條件下，如通過(a)個體紅細胞壓積或血紅蛋白的倍增時間減少來檢測，和/或通過(b)個體促紅細胞生成素循環(huán)水平增加來檢測所示，所述血液代用品能夠誘導紅細胞生成。任選地，所述血液代用品也顯示在細胞培養(yǎng)中試驗時可以穩(wěn)定HIF-la的表達，和/或在細胞培養(yǎng)中試驗時下調(diào)NF-KB的表達。顯示出這些特征的任何血液代用品可以被用于本發(fā)明方法。例如，所述血液代用品可以是交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，或者更具體地，交聯(lián)血紅蛋白包含的血紅蛋白與高捵酸-氧化的ATP分子內(nèi)交聯(lián)、與高碘酸-氧化的腺普分子間交聯(lián)并且與還原型谷胱甘肽偶聯(lián)。在優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明方法所用的交聯(lián)血紅蛋白所包含的血紅蛋白與高缺酸-氧化的ATP的摩爾比為1:1至1:3;血紅蛋白與高碘酸-氧化的腺苷的摩爾比為1:1至1:10;和/或血紅蛋白與還原型谷胱甘肽的摩爾比為1:1至1:20。該產(chǎn)品的商標為HEMOTECH,其為一種包含與鄰-腺苷5，-三磷酸鹽(o-ATP)、鄰-腺苷和還原型谷胱甘肽(GSH)交聯(lián)的純牛Hb的交聯(lián)血紅蛋白。關于交聯(lián)血紅蛋白的更詳細描述可以在Feola等人的美國專利5,439,882中找到，將其全部內(nèi)容引入本發(fā)明作為參考。本發(fā)明還涉及新的藥物組合物，其包含一定濃度或體積的可用于本發(fā)明方法或用于其它治療的血液代用品。例如，這樣的新的組合物可以包含在藥學可接受載體中的(l)治療有效量的(a)7g至小于122.5g,或(b)大于122.5g至700g的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，或(2)小于0.6升的治療有效體積的交聯(lián)血39紅蛋白血液代用品，其中當在常氧條件下的細胞培養(yǎng)中試驗時，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品誘導促紅細胞生成素的表達。其它新的藥物組合物包含在藥學可接受的載體中的(l)治療有效量的(a)7g至小于122.5g，或(b)大于122.5g至700g的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，或(2)小于0.6升的治療有效體積的交聯(lián)血紅蛋白，其中所述交聯(lián)血紅蛋白為與高碘酸-氧化的ATP分子內(nèi)交聯(lián)、與高碘酸-氧化的腺苷分子間交聯(lián)和與還原型谷胱甘肽偶聯(lián)的血紅蛋白。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物所用的交聯(lián)血紅蛋白溶于非電解水溶液中。所述藥物組合物可以進一步包含甘露醇和/或電解質(zhì)。本發(fā)明的新的藥物組合物可用于本發(fā)明方法及任何其它方法中(例如治療慢性失血性貧血或由長期失血引起的貧血)。本發(fā)明的方法采用交聯(lián)血紅蛋白治療動物個體急性失血來闡述。3.1.定義如本發(fā)明中使用的術語"約"意味著包括標準實驗誤差(例如標準偏差)。關于標準偏差的定義、計算和說明的更多信息可以在統(tǒng)計學教科書中找到，所述統(tǒng)計學教科書例如，但不限于Statistics,W.W.Norton&Company;第3版(1997年9月1日)和TheBasicPrinciplesofStatistics,W.H.Freeman&Company;Bk&Cdr第3版(2003年6月1日)。如本發(fā)明中使用的術語"有效量"和"有效體積"分別指在施用一種或多種本發(fā)明的血液代用品和/或藥物組合物的個體中，足夠提高血容量、恢復血流、恢復組織的氧合水平、恢復血液動力學參數(shù)、對抗與急性失血相關的缺氧、增加循環(huán)EPO或EPO的合成、恢復紅細胞壓積水平、恢復血紅蛋白水平、穩(wěn)定HIF-la、下調(diào)NF-KB、減少原成紅細胞的細胞凋亡事件和/或減少抗紅細胞生成的炎癥細胞因子的生成的量和體積。如本發(fā)明中使用的術語"低氧"和"缺氧"指氧水平降低的狀態(tài)。缺氧可由氧分壓降低、氧轉運不足和/或組織使用氧的能力不足引起，其可引起身體功能損傷。例如，可以在濕潤的可變需氧的工作站獲得低氧條件(1.5%的02、93.5%的N2和5。/o的C02)。如本發(fā)明中使用的術語"病癥"與術語"疾病"可互換地使用。引起急性失血的疾病可涉及任何類型的細胞(例如體細胞、生殖細胞、胚細胞、干細胞)、組織(例如骨骼、肌肉、結締組織、血液)、和/或器官(例如腦、腎、肺、心臟、胰腺、前列腺、卯巢、子宮、胃腸道)。如本發(fā)明中使用的術語"含氧量正常"和"常氧"指氧水平正常的狀態(tài)。典型地，常氧條件指其中吸入氣體中氧分壓等于海平面上空氣中的氧分壓的情況，約150mmHg。常氧條件為95%的空氣和5%的C02。如本發(fā)明中對于急性失血所使用的術語"預防"(或語法上等同的術語)指延遲或防止急性失血或與急性失血相關的癥狀或組織病理變化。如本發(fā)明中使用的術語"預防有效量"和"預防有效體積"分別指足夠延遲或預防個體發(fā)生急性失血的量或體積。例如，預防有效量或預防有效體積可以指向個體施用的本發(fā)明血液代用品或藥物組合物的量或體積足夠提高血容量、恢復血流、恢復組織的氧合水平、恢復血液動力學參數(shù)、對抗與急性失血相關的缺氧、增加循環(huán)EPO或EPO的合成、恢復紅細胞壓積水平、恢復血紅蛋白水平、穩(wěn)定HIF-la、下調(diào)NF-KB、減少原紅細胞的細胞凋亡事件和/或減少抗紅細胞生成的炎癥細胞因子的生成。所述預防有效量或預防有效體積還可以指在治療或控制與急性失血相關的癥狀或組織病理變化中提供預防益處的本發(fā)明的血液代用品或藥物組合物的量或體積。進一步，本發(fā)明的血液代用品或藥物組合物的預防有效量或預防有效體積指單獨的所述血液代用品或藥物組合物或者與其它治療聯(lián)合的量或體積，其在治療、控制或改善急性失血或與急性失血相關的癥狀或組織病理變化中才是供預防益處。如本發(fā)明中使用的術語"個體"和"患者"可互換地使用。所述個體可以是動物，特別地，所述個體可以是哺乳動物，比如非靈長類例如母牛、豬、馬、貓、狗、大鼠和小鼠)或靈長類(例如猴子比如短尾猴、黑猩猩和人)。如本發(fā)明中使用的術語"夕卜科手術"與術語"手術"可互換地使用。引起急性失血的外科手術可涉及任何類型的細胞(例如體細胞、生殖細胞、胚細胞、干細胞)、組織(例如骨骼、肌肉、結締組織、血液)、和/或器官(例如腦、腎、肺、心臟、胰腺、前列腺、卵巢、子宮、胃腸道)。如本發(fā)明中使用的術i吾"治療有效量"和"治療有效體積"分別指足夠向患有急性失血的個體提供一些改善或益處的量或體積。例如，治療有效量或治療有效體積可以指向個體施用的本發(fā)明血液代用品或藥物組合物的量或體積足以提高其血容量、恢復血流、恢復組織的氧合水平、恢復血液動力學參數(shù)、對抗與急性失血相關的缺氧、增加循環(huán)EPO或EPO的合成、恢復紅細胞壓積水平、恢復血紅蛋白水平、穩(wěn)定HIF-la、下調(diào)NF-KB、減少原紅細胞的細胞凋亡事件和/或減少抗紅細胞生成的炎癥細胞因子的生成。所述治療有效量或治療有效體積也可以指在治療或控制與急性失血相關的癥狀或組織病理變化中提供治療治療益處的本發(fā)明的血液代用品或藥物組合物的量或體積。進一步，本發(fā)明的血液代用品或藥物組合物的治療有效量或治療有效體積指單獨的所述血液代用品或藥物組合物或者與其它治療聯(lián)合的量或體積，在治療、控制或改善急性失血或與急性失血相關的癥狀或il織病理變化中提供治療益處。如本發(fā)明中使用的術語"創(chuàng)傷"與術語"損傷"可互換地使用。引起急性失血的創(chuàng)傷可涉及任何類型的細胞(例如體細胞、生殖細胞、胚細胞、干細胞)、組織(例如骨骼、肌肉、結締組織、血液)、和/或器官(例如腦、腎、肺、心臟、胰腺、前列腺、卵巢、子宮、胃腸道)。如本發(fā)明中與急性失血一起使用的術語"治療"指減少或消除急性失血或與急性失血相關的癥狀或組織病理變化。4.圖1顯示了用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品和同源血漿治療的具有33和66%總失血的Coebus猴的紅細胞壓積(％)。圖2顯示了用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品治療的或沒有治療的具有66%總失血的兔子的紅細胞壓積(％)。圖3為用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品治療的具有40%總失血的大鼠的血壓和組織氧合(p02)的圖示。圖4顯示了用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品以約1.75g/kg體重(計算的總血容量的25%)治療鐮狀細胞貧血患者所獲得的匯總數(shù)據(jù)，包括總血紅蛋白(g/dL)、血漿血紅蛋白(g/dL)和網(wǎng)織紅細胞計數(shù)(％)。圖5顯示了用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品以約1.75g/kg體重(計算的總血容量的25%)治療的鐮狀貧血患者中EPO的血液水平。圖6顯示了在低氧和常氧條件下，濃度為O.l、1.0和1.75g/dL基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品和未修飾的血紅蛋白溶液對(A)fflF-1a穩(wěn)定性和(B)人星形細胞生成的EPO的影響。圖7顯示了在低氧和常氧條件下，濃度為O.l、1.0和1.75g/dL的基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品和未修飾的血紅蛋白溶液對人星形細胞中4元紅細胞生成NF-KB的影響。5.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于治療或預防急性失血的新方法，所述急性失血優(yōu)選急性失血性貧血，或更優(yōu)選由下述原因引起的貧血(i)由疾病引起的急性失血，(ii)外科手術期間出現(xiàn)的急性失血，或(iii)由創(chuàng)傷引起的急性失血。本發(fā)明的方法包括向有需要的個體施用一定量的血液代用品，所述量能有效地提高血容量和對抗與急性失血相關的缺氧，其中所述血液代用品在常氧條件下誘導紅細胞生成。更具體地，本發(fā)明的方法所用的血液代用品能夠(l)如在常氧條件下的細胞培養(yǎng)中試驗所示，所述血液代用品能夠誘導促紅細胞生成素的表達，和/或(2)在常氧條件下，如通過(a)個體紅細胞壓積或血紅蛋白的倍增時間減少來檢測，和/或通過(b)個體促紅細胞生成素循環(huán)水平增加來檢測所示，所述血液代用品能夠誘導紅細胞生成。本發(fā)明還涉及新的藥物組合物，其包含在藥學可接受的載體中的治療或預防有效量或有效體積的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，其中在常氧條件下細胞培養(yǎng)中測定時，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品誘導促紅細胞生成素的表達。本發(fā)明進一步涉及新的藥物組合物，其包含在藥學可接受的載體中的治療或預防有效量或體積的交聯(lián)血紅蛋白，其中所述交聯(lián)血紅蛋白包含與高跌酸-氧化的ATP分子內(nèi)交聯(lián)、與高碘酸-氧化的腺苷分子間交聯(lián)并且與還原型谷胱甘肽偶聯(lián)的血紅蛋白。在細胞培養(yǎng)中試驗時，本發(fā)明的藥物組合物所用的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品和交聯(lián)血紅蛋白能夠(l)穩(wěn)定HIF-la的表達，和/或(2)下調(diào)NF-KB。該產(chǎn)品的商標為HEMOTECHTM,其為包含與鄰-腺苷5，-三磷酸鹽(o-ATP)、鄰-腺苷和還原型谷胱甘肽(GSH)交聯(lián)的純牛Hb的交聯(lián)血紅蛋白。關于交聯(lián)血紅蛋白的更詳細描述可以在授予Feola等人的美國專利5,439,882中找到，將其全部內(nèi)容引入作為參考。本發(fā)明涉及用于需要治療急性失血的個體的方法、藥物組合物和試劑盒。特別地，本發(fā)明涉及用于患有急性失血性貧血的個體的方法、藥物組合物和試劑盒。下面部分更詳細地描述(a)可以根據(jù)本發(fā)明治療的患者人群(5.1節(jié)及其內(nèi)小節(jié))；(b)本發(fā)明所包括的用于急性失血治療的新方案(5.2節(jié))；和(c)可以在這些及其它治療中使用的新的藥物組合物(5.4節(jié))。5.1.需要治療急性失血的個體貧血為紅細胞的數(shù)量或血紅蛋白的含量低的病癥。重度貧血在臨床上定義為血紅蛋白7Jc平4氐于7g/dL(TheMerckManualofDiagnosisandTherapy.Section11:HematologyandOncology.Chapter127:Anemias,第849-850頁，JohnWiley&Sons;第17版(1999年3月1日))。急性失血性貧血也稱為急性出血后貧血，是由快速大出血(急性失血)引起的貧血。因為骨髓的儲備有限，大血管的自發(fā)性或外傷性破裂或切口(例如主動脈瘤)相關的大出血、損害(例如消化性潰瘍、新生物)引起的動脈糜爛或正常止血的失敗可以引起貧血。急性失血性貧血的即時效應取決于出血的持續(xù)時間和量。急性失血性貧血與慢性失血性貧血不同，慢性失血性貧血為由長期中度失血引起的小紅細胞性貧血。例如，慢性貧血可由胃腸道損傷(例如消化性潰瘍、痔瘡)或泌尿外科或婦科部位的慢性出血引起。慢性失血性貧血可由紅細胞生成缺陷或不足導致小紅細胞群，其中循環(huán)紅血球的平均粒徑小于正常值。紅細胞生成缺陷或不足可能是缺鐵癥、鐵轉運不足和/或鐵利用不當或異常的45結果。慢性失血性貧血也可以由維生素Bu、葉酸鹽或維生素C不足引起。慢性失血性貧血還可以由溶血過度引起，溶血過度可以是網(wǎng)狀內(nèi)皮組織的活性過強、免疫學異常、紅細胞膜改變、紅細胞代謝紊亂、或者血紅蛋白合成缺陷(例如鐮狀細胞貧血)引起。關于急性和慢性失血性貧血的差異的更多討論可以在TheMerckManualofDiagnosisandTherapy.Section11:HematologyandOncology.Chapter127:Anemias,第849-850頁，JohnWiley&Sons;第17版(1999年3月1日)中找到，將其全部內(nèi)容引入本發(fā)明作為參考。急性失血性貧血有許多原因。例如，急性失血性貧血可以由疾病、外科手術或創(chuàng)傷引起。因而，所述個體的急性失血可以由于如本發(fā)明在下述5.1.1節(jié)中討論的疾病引起；如本發(fā)明在下述5.1.2節(jié)討論的在外科手術期間出現(xiàn)；或由于如本發(fā)明在下述5.1.3節(jié)討論的創(chuàng)傷引起。在一些實施方案中，所述個體可表現(xiàn)出與急性失血相關的癥狀，包括但不限于衰弱、頭暈、口渴、出汗、虛弱和脈搏加快，以及快速呼吸。在某些其它的實施方案中，所述個體可以表現(xiàn)為似乎沒有與急性失血相關的臨床癥狀。在一些實施方案中，所述個體可表現(xiàn)出與急性失血相關的組織病理變化，包括但不限于缺氧和組織壞死。在某些其它的實施方案中，所述個體可以表現(xiàn)為似乎沒有與急性失血相關的臨床組織病理變化。在一些實施方案中，所述個體可將要接受或已經(jīng)接受一種或多種類型的抗急性失血治療，其包括，但不限于輸血、輸注生理鹽水或葡萄糖、注射促紅細胞生成素。在一些實施方案中，所述個體患有重度失血或者失血超過33%血容量或血容量的三分之一。在某些其它的實施方案中，所述個體患有中度失血或者失血量為20%至33%的血容量。在某些其它的實施方案中，所述個體患有輕度失血或者失血量低于20%血容量。對于人個體，正常血容量為體重的約8%或約5升。在一些實施方案中，所述個體的血紅蛋白低于10g/dL、9g/dL、8g/dL、7g/dL、5g/dL、4g/dL、3g/dL、2g/dL或更少。在一實施方案中，所述個體的血紅蛋白低于7g/dL。如本發(fā)明中使用的術語"個體"和"患者"可互換地使用。所述個體可以是動物。特別地，所述個體可以是哺乳動物，比如非靈長類例如母牛、豬、馬、貓、狗、大鼠和小鼠)或靈長類(例如猴子比如短尾猴、黑猩猩和人)。優(yōu)選地，所述個體是人。在一實施方案中，所述個體是人類嬰兒或早產(chǎn)的人類嬰兒。在另一個實施方案中，所述個體是人類兒童。在另一個實施方案中，所述個體是成年人。在另一個實施方案中，所述個體是老年人。如本發(fā)明中使用的術語"人類嬰兒"指年齡小于24個月、優(yōu)選小于16個月、小于6個月、小于3個月、小于2個月或小于1個月的人。如本發(fā)明中使用的術語"人類兒童"指年齡為24個月至18歲的人。如本發(fā)明中使用的術語"成年人，，指年齡為18歲或更年長的人。如本發(fā)明中使用的術語"老年人"指年齡為55歲或更年長的人。在某些情況下，所述個體具有免疫缺陷或免疫抑制。例如，所述個體可以是fflV-陽性或AIDS患者。5.1.1由疾病引起的急性失血所述個體可以是患有由疾病引起的急性失血。在一實施方案中，所述個體可以患有或診斷患有引起急性失血的疾病。在另一個實施方案中，所述個體可以易感染或具有發(fā)展成為下述疾病的危險由遺傳因素(例如家族史)和/或環(huán)境因素(例如飲食)導致的可引起急性失血的疾病。如本發(fā)明中使用的術語"病癥"與術語"疾病"可互換地使用。引起急性失血的疾病可涉及任何類型的細胞(例如體細胞、生殖細胞、胚細胞、干細胞)、組織(例如骨骼、肌肉、結締組織、血液)、和/或器官(例如腦、腎、肺、心臟、胰腺、前列腺、卵巢、子宮、胃腸道)。可引起急性失血的疾病實例包括但不限于出血性疾病、潰瘍、損傷、血管破裂和動樂^瘤石皮裂。一些出血性疾病在出生時就存在，由罕見的遺傳疾病引起。例如，所述個體可以是缺少凝血蛋白因子vm(血友病A)或因子IX(血友病B)的血友病患者，因而血液凝固差和/或連續(xù)的、不可控制的出血。所述個體可以是已經(jīng)具有月經(jīng)并在每次月經(jīng)期間出血不可控制的女性血友病人(參見，例如Quick等人,Hemophilicconditioninagirl.AMAAmJDisChild.1953Jun;85(6):698-705)。出血性疾病也可以在某些疾病(例如維生素K不足、嚴重的肝病、vonWillebrand疾病、白血病、骨髓病癥、彌漫性血管內(nèi)凝血、feft^-伴有子癇、暴露于蛇毒)或治療(例如，使用抗凝血藥比如阿司匹林、肝素或華法林或長期使用抗生素)期間形成。所述個體可以是維生素K不足的新生兒(TheMerckManualofDiagnosisandTherapy.Section1:NutritionalDisorders.第3章VitaminDeficiency,Dependency,AndToxicity,第42頁.JohnWiley&Sons;第17版(March1，1999)。可以在患病之前、期間和/或之后向所述個體施用本發(fā)明的血液代用品和藥物組合物?？梢杂捎薪?jīng)驗的醫(yī)師使用常規(guī)技術根據(jù)例如個體失血的程度選擇施用血液代用品和藥物組合物的時間和量/體積。5丄2.外科手術期間出現(xiàn)的急性失血所述個體可以是在外科手術期間出現(xiàn)急性失血。在一實施方案中，所述48個體可能正在進行可引起急性失血的外科手術。在另一個實施方案中，所述個體可計劃要進行可引起急性失血的外科手術。在另一個實施方案中，由于遺傳因素(例如家族史)和/或環(huán)境因素(例如飲食)，所述個體可能容易需要進行可引起急性失血的外科手術或處于需要進行可引起急性失血的外科手術的高風險中。如本發(fā)明中使用的術語"外科手術"與術語"手術"可互換地使用。引起急性失血的外科手術可涉及任何類型的細胞(例如體細胞、生殖細胞、胚細胞、干細胞)、組織(例如骨骼、肌肉、結締組織、血液)、和/或器官(例如腦、腎、肺、心臟、胰腺、前列腺、卵巢、子宮、胃腸道)。可引起急性失血的外科手術的實例包括但不限于擇期外科手術。存在許多不同類型的外科手術，包括但不限于任選的或擇期外科手術、必需的外科手術和緊急或急救外科手術。任選的或擇期外科手術是一種選擇性進行的操作，其對于繼續(xù)良好的生活質(zhì)量可以是非必需的。一種實例是矯形外科手術，該手術涉及肌肉骨胳系統(tǒng)的急性、慢性、外傷性和復發(fā)性損傷及肌肉骨胳系統(tǒng)疾病的其它損傷。另一個實例是要除去難看的痣或疣。必需的外科手術是需要進行以保證未來的生活質(zhì)量的操作。與急救外科手術不同，必需的外科手術未必是必須立即進行的。一個實例是當其它形式的藥物和治療不能起效時通過手術除去腎結石。緊急的或急救外科手術是針對緊急的醫(yī)學病癥比如急性闌尾炎反應而進行的操作。已經(jīng)有"J艮道，許多外科手術操作都伴有出血或失血的高風險。例如，腦淀并分樣血管病(參見，例如Matkovic等人，Surgicalriskofhemorrhageincerebralamyloidangiopathy.Stroke.1991Apr;22(4):456-61);腦動脈瘤的修復(參見，例如Mayberg等人，Guidelinesforthemanagementofaneurysmalsubarachnoidhemorrhage.AstatementforhealthcareprofessionalsfromaspecialwritinggroupoftheStrokeCouncil,AmericanHeartAssociation.Stroke.1994Nov;25(11):2315-28;Tsutsumi等人，Riskofsubarachnoidhemorrhageaftersurgicaltreatmentofunrupturedcerebralaneurysms.Stroke.1999Jun;30(6):1181-4;和WirthFP.Surgicaltreatmentofincidentalintracranialaneurysms.ClinNeurosurg.1986;33:125-35);用于動靜樂jc畸形的放射外科手術(參見，例如Friedman等人，Theriskofhemorrhageafterradiosurgeryforarteriovenousmalformations.JNeurosurg.1996Jun;84(6):912-9;Hunt等人，Surgicalriskasrelatedtotimeofinterventionintherepairofintracranialaneurysms.JNeurosurg.1968Jan;28(1):14-20);用于后循環(huán)動樂K瘤的血管內(nèi)治療(參見，例如Guglielmi等人，Endovasculartreatmentofposteriorcirculationaneurysmsbyelectrothrombosisusingelectricallydetachablecoils.JNeurosurg.1992Oct;77(4):515-24);增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(參見，例如Bonnet等人，Surgicalriskfactorsforseverepostoperativeproliferativevitreoretinopathy(PVR)inretinaldetachmentwithgradeBPVR.GraefesArchClinExpOphthalmol.1995Dec;233(12):789-91);脂肪瘤切除(參見，例如Rodriguez等人，Coloniclipomaasasourceofmassivehemorrhage.Reportofacase.DisColonRectum.1990Nov;33(11):977-9);和竇手術(參見，例如Schnipper等人,Managementofintracranialcomplicationsofsinussurgery.OtolaryngolClinNorthAm.2004Apr;37(2):453-72，ix)。因而，戶斤述個體可以是正在進行、計劃要進行或已經(jīng)進行腦淀粉樣血管病手術；腦動脈瘤修復；治療動靜脈畸形的放射外科手術；后循環(huán)動脈瘤的血管內(nèi)治療；增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變手術；脂肪瘤切除；或竇外科手術?？梢栽谕饪剖中g之前、期間和/或之后向個體施用本發(fā)明的血液代用品和藥物組合物?？梢杂捎薪?jīng)驗的醫(yī)師使用常規(guī)技術根據(jù)例如個體失血的程度來選擇施用所述血液代用品和藥物組合物的時間和量/體積。5.1.3.由創(chuàng)傷引起的急性失血所述個體可以由創(chuàng)傷引起急性失血。在一實施方案中，所述個體患有或診斷患有可引起急性失血的創(chuàng)傷。在另一個實施方案中，由遺傳因素(例如三X染色體綜合征)和/或環(huán)境因素(例如生活在高犯罪附近地區(qū))，所述個體可能容易遭受引起急性失血的創(chuàng)傷或處于遭受該創(chuàng)傷的高風險中。如本發(fā)明中使用的術語"創(chuàng)傷"與術語"損傷"可互換地使用。引起急性失血的創(chuàng)傷可涉及任何類型的細胞(例如體細胞、生殖細胞、胚細胞、干細胞)、組織(例如骨骼、肌肉、結締組織、血液)、和/或器官(例如腦、腎、肺、心臟、胰腺、前列腺、卵巢、子宮、胃腸道)?？梢鸺毙允а膭?chuàng)傷的實例包括但不限于燒傷、槍傷和刺傷。存在許多不同類型的創(chuàng)傷，包括但不限于意外傷害和/或犯罪性損傷。意外傷害是在任何類型的事故中承受的損傷(例如意外死亡、車禍損傷、頸部扭傷、溺水、跌倒、運動損傷、燒傷、機械事故、窒息、自然事故、意外的眼損傷、工傷、玩具相關的損傷)。犯罪性損傷是由犯罪活動(例如虐待孩子、殺人、襲擊)引起的損傷。特別是槍傷和刺傷。可以在創(chuàng)傷之前、期間和/或之后向個體施用本發(fā)明的血液代用品和藥物組合物?？梢杂捎薪?jīng)驗的醫(yī)師使用常規(guī)技術才艮據(jù)例如個體失血的程度選擇施用血液代用品和藥物組合物的時間和量/體積。5.2.急性失血的治療本發(fā)明的方法包括向有需要的個體施用一種或多種一定量的血液代用品和/或藥物組合物，所述量能有效地提高血容量并對抗與急性失血相關的缺氧?？梢愿鶕?jù)常氧條件下在細胞培養(yǎng)中誘導促紅細胞生成素表達的能力來選擇所用的血液代用品。當用于個體時，當通過(a)個體的紅細胞壓積或血紅蛋白的倍增時間減少，或(b)個體的促紅細胞生成素循環(huán)水平增加來測定時，所述血液代用品在常氧條件下可以顯示出增加紅細胞生成。特別地，本發(fā)明的方法包括給有需要的個體施用治療或預防有效量或體積的一種或多種分別在下文5.3節(jié)(及內(nèi)小節(jié))和5.4節(jié)中討論的血液代用品和/或藥物組合物。本發(fā)明提供用于治療或預防急性失血性貧血的方法。例如，本發(fā)明提供用于治療或預防由于疾病引起的(參見上文5.2.1)或外科手術期間出現(xiàn)的(參見上文5丄2)或由創(chuàng)傷引起的(參見上文5丄3)急性失血的方法。本發(fā)明的血液代用品特別地可用于多種原因的急性失血的治療。首先和最重要的，本發(fā)明的血液代用品不僅提高患者的血容量以補償急性失血期間可引起休克的液體丟失和對抗缺氧，而且在常氧條件下刺激紅細胞生成。這對于治療急性失血的患者非常有利，因為這樣的個體有時需要多次輸血以補充失血事件期間或之后損失的血液以及改善和/或保持紅細胞壓積水平。本發(fā)明的血液代用品可以以比其它血液代用品和供體血液以更快和更高的速率誘導紅細胞生成，因而減少了施用次數(shù)。第二，本發(fā)明的血液代用品適于和易于進行急性失血的治療，因為它不需要測試是否適合輸入和接受者的相容性。而且，本發(fā)明的血液代用品不會觸發(fā)與供體血液中存在的免疫組分相關的許多并發(fā)癥(例如RBC的溶血、過敏性反應、輸血相關的急性肺損傷、移植物抗宿主疾病、細菌污染、病毒性疾病的傳染等)。本發(fā)明&的許多方面。更特別地，本發(fā)明的方法所用的血液代用品和藥物組合物的物理存在可改善個體的血液動力學。例如，本發(fā)明的治療和預防方法提高了個體的血容量。在具體的實施方案中，血容量提高了5%、10%、20%、50%、100%、200%、500%或更多。在具體的實施方案中，血容量提高了0.1升、0.5升、1.0升、1.5升、2.0升或更多?？梢允褂帽绢I域技術人員公知的方法來測定血容量。例如，可以使用與一次性、小體積血壓傳感器(Ohmeda,Pte,Ltd,Singapore)相連的導管來測定血容量。本發(fā)明的治療和預防方法也可以恢復個體的血流量。對于人而言，正常血流量為250至300ml/分鐘。在具體的實施方案中，血流量的5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%被恢復?？梢允褂帽绢I域技術人員公知的方法來測定血流量。例如，可以使用與一次性、小體積血壓傳感器(Ohmed^Pte，Ltd,Singapore)相連的導管來測定血流量。本發(fā)明的治療和預防方法也可以恢復個體的組織氧合水平。組織的氧合水平在整個體內(nèi)是不均勻的?？梢酝ㄟ^使組織/器官灌注最大化來改善組織的氧合水平。在具體的實施方案中，組織氧合水平的5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%被恢復。可以使用本領域技術人員公知的方法來測定組織的氧合水平。例如，可以通過將DO-166探針的界面與微型計算機(pH-版本6071，LazarResearchLaboratories)和圖表記錄器(CardiomaxCirculatorySystemComputer)連接來連續(xù)紀錄組織的氧合水平。本發(fā)明的治療和預防方法也可以恢復個體的血液動力學參數(shù)。血液動力學參數(shù)包括，但不限于心輸出量(CO;ml/min);心臟指數(shù)(CI，ml/min/100g體重)、心搏量(SV;ml/搏動/100g體重)、平均動脈壓(MAP;mmHg)、脈壓(PP;mrnHg)、心率(HR;搏動/分鐘)、總外周圍阻力(TPR;(dyn/min/cm力xlO"和血液溫度。對于人而言，正常心輸出量為每分鐘5至6升；正常心臟指數(shù)為2.5至4升/分種；正常心搏量為60至130ml/搏動；正常平均動脈壓為70至90mmHg;正常樂K壓為20至60mmHg;正常心率為60至100次搏動/分鐘；正?？偼庵車枇?70至1500dyn/min/cnf5;和正常血液溫度為37°C。在具體的實施方案中，一種或多種血液動力學參數(shù)的5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%被恢復?？梢允褂帽绢I域技術人員公知的方法來測定血液動力學參數(shù)。例如，^吏用全自動的CardiomaxCirculatorySystemComputer(ColumbusInstruments,Columbus,OH)來測定血液動力學參數(shù)。本發(fā)明的治療和預防方法也對抗個體的與急性失血相關的缺氧。在具體的實施方案中，缺氧被減少了5%、10%、20%、50%、100%、200%、500%、1000%或更多?？梢允褂帽绢I域技術人員公知的方法來測定缺氧。例如，可以使用組織氧合水平作為指標來測定缺氧。本發(fā)明的治療和預防方法也可以逆轉個體的出血性休克。出血性休克的特征在于心臟指數(shù)降低66%、平均動脈壓降低約67%、TPR顯著性增加、和組織的氧合作用減少78%。本發(fā)明的治療和預防方法也可以改善個體促紅細胞生成素的內(nèi)源性生成，所述促紅細胞生成素負責個體紅細胞生成(即紅細胞產(chǎn)生)。例如，本發(fā)明的治療和預防方法可以增加個體的EPO或EPO的合成。促紅細胞生成素(EPO)是一種由腎臟中的特定細胞生成的糖蛋白(46kD)激素，其調(diào)節(jié)骨髓中紅細胞的生成。在具體的實施方案中，循環(huán)EPO或EPO的合成增加了5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、500%、1000%或更多。在具體的實施方案中，所述循環(huán)EPO水平增加了5mU/ml、10mU/ml、20mU/ml、50mU/ml、100mU/ml、150mU/ml、200mU/ml或更多?？梢允褂帽绢I域技術人員公知的方法測定循環(huán)EPO水平和EPO的合成。例如，可以4吏用高度特異性QuantikineInVitroDiagnosticHumanErythropoietinELISA(R&PSystemsInc.,Minneapolis,MN)或EPO隱Trac125IRIA試劑盒(INCSTARCorp.nowDiaSorinS.p.A.,Sallugi,Italy)在細胞培養(yǎng)上清液中測定循環(huán)EPO水平和EPO的合成。本發(fā)明的治療和預防方法也可以恢復個體的紅細胞壓積水平。紅細胞壓積為以百分數(shù)表示的紅細胞體積與全血體積的比例，其對包含血漿游離血紅蛋白的血液樣品中紅細胞生成是有效指征。對于成年男性，正常紅細胞壓積為47±5%,對于成年女性，其為42±5%(TheMerckManualofDiagnosisandTherapy.Section11:HematologyandOncology.Chapter127:Anemias,第854頁.JohnWiley&Sons;第17版(March1,1999))。在具體的實施方案中，紅細胞壓積水平的5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%#:恢復?？梢允褂帽绢I域技術人員公知的方法來測定紅細胞壓積。例如，可以使用肝素化的微紅細胞壓積毛細管(FisherScientific,Houston,TX)和微紅細胞壓積離心機(DamonICEDivision,Needham,MA)來測定紅細胞壓積。本發(fā)明的治療和預防方法也可以恢復個體的血紅蛋白水平。血紅蛋白為紅細胞(RBC)中含鐵的氧轉運金屬蛋白。對成年男性，正常血紅蛋白為16±2g/dL，對于成年女性，其為14±2g/dL(TheMerckManualofDiagnosisandTherapy.Section11:HematologyandOncology.Chapter127:Anemias,第854頁.JohnWiley&Sons;第17版(March1,1999))。在具體的實施方案中，血紅蛋白水平的5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%被恢復?？梢允褂帽绢I域技術人員公知的方法來測定血紅蛋白。例如，可以4吏用HemoCueB-HemoglobinPhotometer(HemoCueCorp.,Angelholm，Sweden)來測定血紅蛋白。本發(fā)明的治療和預防方法也可以穩(wěn)定個體的HIF-la的表達。在具體的實施方案中，fflF-la的50/。、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、5590°/?；?00%被穩(wěn)定?？梢允褂帽绢I域技術人員公知的方法來測定HIF-la的穩(wěn)定?？梢允褂没诟咄縏ransAMELISA的檢測(ActiveMotif,Carlsbad,CA)來測定HIF-la的穩(wěn)定。本發(fā)明的治療和預防方法也可以下調(diào)個體的NF-kB的表達。在具體的實施方案中，NF-kb表達的50/。、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%被下調(diào)?？梢允褂帽绢I域技術人員公知的方法來測定NF-kB的活化。例如，可以使用TransAMNF-KBp65轉錄因子分析試劑盒(ActiveMotif,Carlsbad，CA)來測定NF-kB的活化。本發(fā)明的治療和預防方法也可以減少個體的原成紅細胞的細胞凋亡。在具體的實施方案中，原紅細胞的細胞凋亡減少了5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%?？梢允褂帽绢I域技術人員公知的方法來測定細胞凋亡事件。例如，可以分別使用AnnexinV-FITC和碘化丙啶熒光探針(SigmaChemical)來評價早期和晚期的凋亡事件。本發(fā)明的治療和預防方法也可以減少個體的抗紅細胞生成的炎癥細胞因子的生成?？辜t細胞生成的炎癥細胞因子包括但不限于TNF-a、TGF-(31、IL-1、IL-6等。在具體的實施方案中，一種或多種抗紅細胞生成的炎癥細胞因子的因子的生成。例如，可以使用TNF-a人EIA試劑盒(CaymanChemical,AnnArbor,MI)來測定TNF畫a，可以寸吏用人TGF-p1QuantikineImmunoassay(R&DSystems)來測定TGF-p1。如本發(fā)明中使用的術語"有效量，，和"有效體積"分別指在對于施用一種或多種本發(fā)明的血液代用品和/或藥物組合物的個體而言，所述量或體積足夠提高血容量、恢復血流、恢復組織的氧合水平、恢復血液動力學參數(shù)、對抗與急性失血相關的缺氧、增加循環(huán)EPO或EPO的合成、恢復紅細胞壓積水平、恢復血紅蛋白水平、穩(wěn)定HIF-la、下調(diào)NF-KB、減少原成紅細胞的細胞凋亡事件和/或減少抗紅細胞生成的炎癥細胞因子的生成。如本發(fā)明中使用的術語"治療有效量"和"治療有效體積"分別指能夠給患有急性失血的個體提供一些改善或益處的量和體積。例如，治療有效量或治療有效體積可以指對于施用一種或多種本發(fā)明的血液代用品和/或藥物組合物的個體而言，所述本發(fā)明的血液代用品和/或藥物組合物的量和體積足夠提高血容量、恢復血流、恢復組織的氧合水平、恢復血液動力學參數(shù)、對抗與急性失血相關的缺氧、增加循環(huán)EPO或EPO的合成、恢復紅細胞壓積水平、恢復血紅蛋白水平、穩(wěn)定HIF-la、下調(diào)NF-KB、減少原成紅細胞的細胞凋亡事件和/或減少抗紅細胞生成的炎癥細胞因子的生成。所述治療有效量或治療有效體積也可以指在治療或控制與急性失血相關的癥狀或組織病理變化中能夠提供治療益處的本發(fā)明的血液代用品或藥物組合物的量或體積。進一步，本發(fā)明的血液代用品或藥物組合物的治療有效量或治療有效體積指在治療、控制或改善急性失血或與急性失血相關的癥狀或組織病理變化中提供治療益處的單獨的或與其它治療聯(lián)合的所述血液代用品或藥物組合物的量或體積。如本發(fā)明中使用的術語"預防有效量"和"預防有效體積"分別指有效延遲或防止個體出現(xiàn)急性失血的量和體積。例如，預防有效量或預防有效體積可以指對于施用本發(fā)明的血液代用品或藥物組合物的個體而言，所述量或體積足夠提高血容量、恢復血流、恢復組織的氧合水平、恢復血液動力學參數(shù)、對抗與急性失血相關的缺氧、增加循環(huán)EPO或EPO的合成、恢復紅細胞壓積水平、恢復血紅蛋白水平、穩(wěn)定HIF-la、下調(diào)NF-KB、減少原成紅細胞的細胞凋亡事件和/或減少抗紅細胞生成的炎癥細胞因子的生成。所述預防有效量或預防有效體積也可以指在預防或處理與急性失血相關的癥狀或組織病理變化中提供預防益處的本發(fā)明的血液代用品或藥物組合物的量或體積。進一步，本發(fā)明的血液代用品或藥物組合物的預防有效量或預防有效體積指在治療、控制或改善急性失血或與急性失血相關的癥狀或組織病理變化中4是供預防益處的單獨的或與其它治療聯(lián)合的所述血液代用品或藥物組合物的量或體積。如本發(fā)明對于急性失血所使用的術語"治療"(或語法上等同的術語)指減少或消除急性失血或與急性失血相關的癥狀或組織病理變化。如本發(fā)明對于急性失血所使用的術語"預防"(或語法上等同的術語)指延遲或預防急性失血或與急性失血相關的癥狀或組織病理變化。治療或預防有效量或體積以及給藥頻率將隨急性失血的類型和嚴重性或與急性失血相關的癥狀或組織病理變化而改變。所述治療或預防有效量或體積及給藥頻率也將隨要治療的個體而改變。例如，所述治療或預防有效量或體積及給藥頻率將根據(jù)個體的年齡、性別、體重和反應而改變。在具體的實施方案中，向患有急性失血的個體施用的本發(fā)明血液代用品或藥物組合物的總日用量為lg、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、20g、50g、100g、200g、500g、1000g或更多。在一個優(yōu)選的實施方案中，向患有急性失血的個體施用的本發(fā)明血液代用品或藥物組合物的總日用量為7g至700g，優(yōu)選7g至低于122.5g，或大于122.5g至700g,以單劑量或分劑量給藥。在具體的實施方案中，向患有急性失血的個體施用的本發(fā)明血液代用品或藥物組合物的總日用體積為0.01升、0.05升、0.1升、0.2升、0.5升、1.0升1.5升、2.0升或更多。在一個優(yōu)選的實施方案中，向患有急性失血的個體施用的本發(fā)明血液代用品或藥物組合物的總日用量為0.1升至1升，優(yōu)選0,6升，以單劑量或分劑量給藥。將對本領域技術人員顯而易見的是，在一些情況中使用這些數(shù)字或范圍之外的量和體積可能是必需的。治療過程的持續(xù)時間可以是至少6小時、至少12小時、至少24小時、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少7周、至少10周、至少13周、至少15周、至少20周、至少6個月或至少1年。在一些實施方案中，本發(fā)明的血液代用品或藥物組合物可以施用一段時期直到急性失血停止或被控制或者當急性失血的癥狀部分或完全消失。本發(fā)明的血液代用品和藥物組合物可以作為食品補充劑施用6個月或者規(guī)定推薦的使用期。進一步，人們注意到營養(yǎng)學家、飲食學專家、臨床醫(yī)師或治療醫(yī)師將懂得如何和何時結合個體患者的反應中斷、調(diào)節(jié)或停止使用本發(fā)明的血液代用品和藥物組合物作為藥物或食品補充劑。本發(fā)明的血液代用品和藥物組合物可以與任何其它常規(guī)治療模式一起使用，所述治療模式比如但不限于輸血、輸注生理鹽水或葡萄糖、注射促紅細胞生成素。在一些實施方案中，順序施用一種或多種本發(fā)明的血液代用品和/或藥物組合物。在某些其它的實施方案中，同時施用一種或多種本發(fā)明的血液代用品和/或藥物組合物?？梢酝ㄟ^本領域技術人員公知的任何方法定期監(jiān)測本發(fā)明方法的治療和預防效果。例如，可以在治療后l周、2周、3周或4周測定治療后個體的血容量、與急性失血相關的缺氧、紅細胞壓積水平、血紅蛋白水平、血液動力學參數(shù)、血流量、組織氧合水平、循環(huán)EPO水平、EPO的合成、HIF-la的表達、NF-kB的表達、原紅細胞的細胞凋亡事件、抗紅細胞生成的炎癥細胞因子水平和/或一般性的健康、身體健康和/或情感健康。可以在治療過程之前、期間和/或之后，每天、每周、每兩周、每月或每年進行醫(yī)生隨訪。5.3.血液代用品本發(fā)明的血液代用品優(yōu)選無病原體、無毒性、非免疫原性、非致熱的和具有長期的貯存期限。特別地，本發(fā)明的方法和藥物組合物所用的血液代用品能夠(l)如在常氧條件下的細胞培養(yǎng)中試驗所示，所述血液代用品能夠誘導促紅細胞生成素的表達，和/或(2)在常氧條件下，如通過(a)個體紅細胞壓積或血紅蛋白的倍增時間減少來檢測，和/或通過(b)個體促紅細胞生成素循環(huán)水平增加來檢測所示，所述血液代用品能夠誘導紅細胞生成。顯示出這些特征的任何血液代用品都可以用于本發(fā)明的方法和藥物組合物。顯示出上述特征的任何血液代用品，包括已知的和/或市售獲得的血液代用品都可以用于本發(fā)明的方法和藥物組合物。例如，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所用的良好的血液代用品為交聯(lián)血紅蛋白，其包含與鄰-腺苷5，-三磷酸鹽(o-ATP)、鄰-腺苷和還原型谷胱甘肽(GSH)交聯(lián)的純牛Hb(例如HEMOTECH,其可提高血容量和對抗與急性失血相關的缺氧，以及(l)在常氧條件下在細胞培養(yǎng)中試驗，誘導促紅細胞生成素的表達，和/或(2)通過(a)個體的紅細胞壓積或血紅蛋白的倍增時間減少，或(b)個體的促紅細胞生成素循環(huán)水平增加來測定，在常氧條件下誘導紅細胞生成。已知其它的血液代用品，比如如上討論的HEMASSISTTM(BaxterHealthcare,RoundLake,IL),HEMOLINKTM(Hemosol，Inc.,Toronto,Canada),OPTROTM(Somatogen,Boulder,CO),HEMOPURE(BiopureInc.,Cambridge,MA)，POLYHEME(NorthfieldLaboratoriesInc.,Evanston，IL)禾口HEMOSPAN(Sangart,Inc.,SanDiego，CA)(其從過期的人血液中采集，并與聚乙二醇(PEG)結合以除去游離血紅蛋白的毒性)和HEMOZYME⑧(SynZymeTechnologies,LLC,Irvine,CA)(其由血紅蛋白載體和CNO復合物組成)在常氧條件下不能誘導紅細胞生成。然而，預期它們適于誘導生成內(nèi)源性促紅細胞生成素，促紅細胞生成素在個體中刺激紅細胞生成。在一些實施方案中，在常氧條件下在細胞培養(yǎng)中測定，本發(fā)明的方法和藥物組合物所用的血液代用品能夠誘導促紅細胞生成素的表達。在具體的實施方案中，促紅細胞生成素被誘導表達其基準水平的5%或更少、10%、20%、50%、100%、200%、500%或更多?？梢酝ㄟ^本領域技術人員眾所周知的任何方法來測定促紅細胞生成素的表達。在一些實施方案中，通過個體的紅細胞壓積的倍增時間減少測定，本發(fā)明的方法和藥物組合物所用的血液代用品能夠在常氧條件下誘導紅細胞生成。在具體的實施方案中，個體的紅細胞壓積的倍增時間被減少了5%或更少、10%、20%、50%、100%、200%、500%或更多。在具體的實施方案中，個體的紅細胞壓積的倍增時間減少了6小時、12小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、20天或更長。在具體的實施方案中，個體的紅細胞壓積的倍增時間少于30天、20天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小時或6小時。在一個優(yōu)選的實施方案中，個體的紅細胞壓積的倍增時間少于3天?？梢酝ㄟ^本領域技術人員眾所周知的任何方法來測定個體的紅細胞壓積的倍增時間。在一些實施方案中，通過個體的血紅蛋白的倍增時間減少測定，本發(fā)明的方法和藥物組合物所用的血液代用品能夠在常氧條件下誘導紅細胞生成。在具體的實施方案中，個體的血紅蛋白的倍增時間減少了5%或更少、10%、20%、50%、100%、200%、500%或更多。在具體的實施方案中，個體的血紅蛋白的倍增時間減少了6小時、12小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、20天或更長。在具體的實施方案中，個體的血紅蛋白的倍增時間為少于30天、20天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小時或6小時。在一個優(yōu)選的實施方案中，個體的血紅蛋白的倍增時間為7天?？梢酝ㄟ^本領域技術人員眾所周知的任何方法來測定個體的血紅蛋白的倍增時間。在一些實施方案中，通過個體的促紅細胞生成素循環(huán)水平的增加來測定，本發(fā)明的方法和藥物組合物所用的血液代用品能夠在常氧條件下誘導紅細胞生成。在具體的實施方案中，個體的促紅細胞生成素循環(huán)水平增加了5%或更少、10%、20%、50%、100%、200%、500%或更多。在具體的實施方案中，個體的促紅細胞生成素循環(huán)水平增加了5mU/ml、10mU/ml、20mU/ml或更多。在具體的實施方案中，個體的促紅細胞生成素循環(huán)水平為20mU/ml、50mU/ml、100mU/ml、200mU/ml、500mU/ml、1000mU/ml或更多。在一個優(yōu)選的實施方案中，個體的促紅細胞生成素循環(huán)水平為15+5mU/ml。可以通根據(jù)本發(fā)明的一個方面，所述血液代用品為在下述5.3.1節(jié)中討論的交聯(lián)血紅蛋白或在下述5.4節(jié)中討論的新的組合物。5.3.1.交聯(lián)血紅蛋白本發(fā)明的交聯(lián)血紅蛋白包括，但不限于在授予Feola等人的美國專利5,439,882中描述的那些，將其全部內(nèi)容引入本發(fā)明作為參考。特別地，本發(fā)62明的交聯(lián)血紅蛋白包括HEMOTECH1M。所述交聯(lián)血紅蛋白包含與高碘酸氧化的ATP(o-ATP)分子內(nèi)交聯(lián)和與高碘酸氧化的腺普(鄰-腺普)分子間交聯(lián)形成多聚血紅蛋白的血紅蛋白。在本發(fā)明的交聯(lián)血紅蛋白中的血紅蛋白和高碘酸氧化的ATP的摩爾比可以為1:1至1:3，或其中的任何范圍。在本發(fā)明的交聯(lián)血紅蛋白中的血紅蛋白和高碘酸氧化的腺苷的摩爾比可以為1:1至1:10，或其中的任何范圍。在本發(fā)明的交聯(lián)血紅蛋白中的血紅蛋白和高碘酸氧化的ATP的摩爾比可以為1:1至1:3，或其中的任何范圍，并且血紅蛋白和高碘酸氧化的腺苷的摩爾比為1:1至1:10，或其中的任何范圍。在本發(fā)明的交聯(lián)血紅蛋白中的血紅蛋白進一步與還原型谷胱甘肽偶聯(lián)。加入還原型谷胱甘肽終止了血紅蛋白與高珙酸-氧化的腺普的交聯(lián)反應。在具體的實施方案中，在本發(fā)明的交聯(lián)血紅蛋白中的血紅蛋白和還原型谷胱甘肽的摩爾比為1:1至1:20,或其中的任何范圍?？梢酝ㄟ^本領域技術人員公知的任何方法(參見，例如授予Feola等人的美國專利5,439,882)將高碘酸-氧化的ATP、高碘酸-氧化的腺苷交聯(lián)到血紅蛋白上。優(yōu)選地，所述血紅蛋白為牛血紅蛋白。然而，在本發(fā)明中也可以4吏用其它來源的血紅蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明的交聯(lián)血紅蛋白包括少于約50%、30%、20%、10%、5%、1%或更少或不包括高鐵血紅蛋白。本發(fā)明的交聯(lián)血紅蛋白優(yōu)選地具有約130至390千道爾頓的分子量，更優(yōu)選約190至260千道爾頓的分子量，最大超過1000千道爾頓的分子量。所述血紅蛋白、高碘酸-氧化的ATP、高碘酸-氧化的腺苷和還原型谷胱甘肽可以從商業(yè)來源(SigmaChemicalCo.,St.Louis,Mo.)獲得，或者根據(jù)在授予Feola等人的美國專利5，439，882中描述的方法制備，將其全部內(nèi)容引入本發(fā)明作為參考。本發(fā)明的交聯(lián)血紅蛋白可以溶于非電解的水溶液中。可以加入到本發(fā)明交聯(lián)血紅蛋白的水溶液中的非電解質(zhì)的實例為人白蛋白、不同的血漿部分和血漿。然而，也可以使用藥學可接受的且不會干擾本發(fā)明交聯(lián)血紅蛋白的載氧功能的任何非電解質(zhì)，比如葡聚糖和羥乙基淀粉。本發(fā)明的交聯(lián)血紅蛋白可以通過包括但不限于在授予Feola等人的美國專利5,439,882中描述的那些方法來制備，將其全部內(nèi)容引入本發(fā)明作為參考。例如，通過包括下述步驟的方法制備本發(fā)明的交聯(lián)血紅蛋白(a)將全血分離成白細胞-紅細胞混合物、血小板和血漿，將如此獲得的混合物懸浮在水溶液中；(b)冷卻包含白細胞-紅細胞混合物的水溶液以凝聚白細胞和除去白細胞聚集體，獲得基本上不含白細胞的溶液；溶液中的紅細胞提取血紅蛋白，在流體靜力壓增加下超濾，從基本上不含白細胞溶液中的萃取血紅蛋白中分離紅細胞，獲得提萃取的血紅蛋白溶液；(d)將提取的血紅蛋白溶液中的提取血紅蛋白轉化成羧基-血紅蛋白，得到羧基-血紅蛋白溶液；(e)對該羧基-血紅蛋白溶液進行巴氏殺菌，使非血紅素蛋白變性并沉淀出來；(f)從羧基-血紅蛋白溶液中除去磷脂和沉淀的非血紅素蛋白；(g)通過親合層析從羧基-血紅蛋白溶液中除去內(nèi)毒素；(h)濃縮在羧基-血紅蛋白溶液中的羧基-血紅蛋白至濃度為約10g/dL，得到濃縮的羧基-血紅蛋白溶液；(i)使?jié)饪s的羧基-血紅蛋白溶液中的羧基-血紅蛋白與o-ATP反應，主要形成羧基-血紅蛋白分子內(nèi)交聯(lián)，從而獲得分子內(nèi)交聯(lián)的羧基-血紅蛋白溶液；(j)使o-ATP羧基-血紅蛋白與一定量的鄰-腺苦反應，所述量有效地引起羧基-血紅蛋白分子間交聯(lián)，從而獲得分子間和分子內(nèi)交聯(lián)的羧基-血紅蛋白溶液，向該分子間和分子內(nèi)交聯(lián)的羧基-血紅蛋白溶液中加入谷胱甘肽以終止鄰-腺苷交聯(lián)反應；和(k)將分子間和分子內(nèi)交聯(lián)的羧基-血紅蛋白溶液中的交聯(lián)的羧基-血紅蛋白轉化成交聯(lián)的氧-血紅蛋白。在一個具體的實施方案中，在步驟(a)中，通過離心全血從血小板和血漿中分離出白細胞-紅細胞混合物。在另一個具體的實施方案中，在步驟(b)中，通過過濾除去白細胞的聚集。在另一個具體的實施方案中，在步驟(f)中，通過溶劑萃取從羧基-血紅蛋白溶液中除去磷脂和沉淀的非血紅素蛋白。在另一個具體的實施方案中，在步驟(h)中，通過用大致張力正常的溶液透析來濃縮濃的羧基-血紅蛋白溶液。5.4.藥物組合物和試劑盒本發(fā)明還涉及新的藥物組合物，其包含一定濃度或體積的可在本發(fā)明的方法中或其它治療方法中使用的血液代用品。例如，這樣的新的組合物可以包含在藥學可接受的載體中的7g至低于122.5g的治療有效量的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，其中在常氧條件下在細胞培養(yǎng)中測定，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品誘導促紅細胞生成素的表達?？蛇x地，所述組合物可以包含在藥學可接受的載體中的治療有效量的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，所述治療有效量為從大于122.5g至700g,其中在常氧條件下在細胞培養(yǎng)中測定，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品誘導促紅細胞生成素的表達。另一方面，所述組合物可以包含在藥學可接受的載體中的治療有效體積的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，所述治療有效體積為少于0.6升，其中在常氧條件下在細胞培養(yǎng)中試驗，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品誘導促紅細胞生成素的表達。其它新的藥物組合物包含在藥學可接受的載體中的治療有效量的交聯(lián)血紅蛋白，所述治療有效量為7g至低于122.5g，其中所述交聯(lián)血紅蛋白為與高碘酸-氧化的ATP分子內(nèi)交聯(lián)、與高碘酸-氧化的腺苷分子間交聯(lián)和與還原型谷胱甘肽偶聯(lián)的血紅蛋白?？蛇x地，所述組合物可以包含在藥學可接受的載體中的治療有效量的交聯(lián)血紅蛋白，其中所述治療有效量為大于122.5g至700g,其中所述交聯(lián)血紅蛋白為與高碘酸-氧化的ATP分子內(nèi)交聯(lián)、與高碘酸-氧化的腺苷分子間交聯(lián)和與還原型谷胱甘肽偶聯(lián)的血紅蛋白。在另一個實施方案中，所述組合物可包含在藥學可接受的載體中的治療有效體積的交聯(lián)血紅蛋白，所述治療有效體積為少于0.6升，其中所述交聯(lián)血紅蛋白為與高碘酸-氧化的ATP分子內(nèi)交聯(lián)、與高碟酸-氧化的腺苷分子間交聯(lián)和與還原型谷胱甘肽偶聯(lián)的血紅蛋白。在一些實施方案中，當在細胞培養(yǎng)中測定時，本發(fā)明的藥物組合物中所用的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品和交聯(lián)血紅蛋白穩(wěn)定了HIF-la的表達。在具體的實施方案中，當在細胞培養(yǎng)中測定時，本發(fā)明的藥物組合物中所用的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品和交聯(lián)血紅蛋白穩(wěn)定5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的HIF-la的表達。在某些其它的實施方案中，當在細胞培養(yǎng)中試驗時，本發(fā)明的藥物組合物中所用的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品和交聯(lián)血紅蛋白下調(diào)NF-kB的表達。在具體的實施方案中，當在細胞培養(yǎng)中測定時，本發(fā)明的藥物組合物中所用的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品和交聯(lián)血紅蛋白下調(diào)5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的NF-kB表達。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物中所用的交聯(lián)血紅蛋白包含摩爾比為1:1至1:3的血紅蛋白和高碘酸氧化的ATP。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物中所用的交聯(lián)血紅蛋白包含摩爾比為1:1至1:10的血紅蛋白和高碘酸氧化的腺苷。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物中所用的交聯(lián)血紅蛋白包含摩爾比為1:1至1:20的血紅蛋白和還原型谷胱甘肽。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物中所用的交聯(lián)血紅蛋白包含摩爾比為1:1至1:3的血紅蛋白和高碘酸氧化的ATP;摩爾比為1:1至1:10的血紅蛋白和高碘酸-氧化的腺苷；和摩爾比為1:1至1:20的血紅蛋白和還原型谷胱甘肽。本發(fā)明的藥物組合物中可以使用表現(xiàn)出這些特征的上述5.3節(jié)中的任何交聯(lián)血紅蛋白血液代用品和交聯(lián)血紅蛋白。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物中所用的交聯(lián)血紅蛋白溶于非電解的水溶液中。所述藥物組合物可以進一步包含甘露醇和/或電解質(zhì)。本發(fā)明的藥物組合物中可使用的電解質(zhì)包含但不限于鈉、鉀、釣和鎂陽離子、和氯酸根、碳酸氫根、葡糖酸根和疏酸根陰離子。在具體的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含約lg或更少、5g、10g、15g、20g、25g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g、150g、200g、300g、500g、1000g、2000g或更多的血液代用品。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含約7g至低于約122.5g的血液代用品。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含約122.5g至約700g的血液代用品。在具體的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含約O.l升或更少、0.2升、0.3升、0.4升、0.5升、0.6升、0.7升、0.8升、0.9升、1.0升、2.0升、5.0升、10.0升或更多的血液代用品。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含約少于0.6升的血液代用品。述其它的方法包括但不限于治療慢性失血性貧血(例如鐮狀細胞貧血)。物。施用本發(fā)明的藥物組合物的方法包括但不限于胃腸外(例如皮下、肌內(nèi)、眶內(nèi)、囊內(nèi)、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)、靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、門靜l^內(nèi))、石更膜外和粘膜(例如鼻內(nèi))給藥。在一些實施方案中，腸胃外施用所述藥物組合物。當腸胃外施用藥物組合物時，可以提供無菌水或生理鹽水的安瓿劑以便施用前可以混合各成分。在具體的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物通過輸注施用。在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物通過注射、優(yōu)選通過靜脈注射施用。本發(fā)明的藥物組合物可以被配制成單元劑型，包括但不限于固體劑、膠嚢劑、片劑、凝膠劑等。本發(fā)明的藥物組合物也可以被配制成在密閉容器比如安瓿或小袋(sachette)中的無水凍干粉劑或無水濃縮物。本發(fā)明的藥物組合物可以在包括一個或多個容器的試劑盒中提供。每個容器可以包含相同的或不同的藥物組合物。所述試劑盒可以進一步包括用于注射藥物組合物的針或注射器，優(yōu)選以無菌形式包裝，和/或包裝的酒精墊。任選地包括用于臨床醫(yī)師或患者給藥本發(fā)明的惡血液代用品和藥物組合物的說明。雖然前述說明書和附圖僅僅闡述了本發(fā)明的原理，應當理解可以對其進行多種添加、修飾和取代。特別地，對本領域技術人員明然的是，在不背離本發(fā)明的精神或基本特征下，本發(fā)明可以表現(xiàn)為其它的具體形式、結構、方案、比例和含有其它的元素、原料和組分。另外，本發(fā)明描述的特征可以單獨或與其它的特征組合使用。因此，本發(fā)明公開的實施方案被認為在各方面都是說明性而非限制性的，本發(fā)明的范圍通過附加的權利要求來表明而不限于前述"i兌明書。6.實施例提供下述實施例以描述本發(fā)明的具體實施方案，并不意味著以任何方式限制本發(fā)明的范圍。6丄實施例l-用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品治療處于生命受威脅的貧血中的靈長類，增加了其體內(nèi)的紅細胞壓積6丄1.方法根據(jù)以前在科學文獻(Feola等人(1988)CirculatoryShock25:275-290)中報道的方法，在四組Coebus猴(每組六只)中進行試驗，每只猴被抽出等于計算血容量的三分之一(33%)和三分之二(66%)的血液，接著輸注同容量的10g/dL血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH血液代用品。在該試驗中，使用同源的血漿代替血液代用品作為對照。肌內(nèi)注射12,5mg/kg的鹽酸氯胺酮使重量為4至5kg的健康雄性猴子鎮(zhèn)靜。將無菌16-gauge聚四氟乙烯導管皮下插入股動脈和一個股靜脈。沒有施用肝素。允許動物自然呼吸室內(nèi)空氣。在制劑穩(wěn)定后，將猴子分配到下述處理組之一(I)從股動脈抽出三分之一(33%)的理論總血容量，通過靜脈管灌注來用等體積的基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH血液代用品(約2.3g/kg體重)代替；(II)從股動脈抽出三分之二(66%)的理論總血容量，通過靜脈管灌注用等體積的基于血紅蛋白69-ATP-腺苷-GSH血液代用品(約4.6g/kg體重)代替；(III)從股動脈抽出三分之一(33。/o)的理論總血容量，并通過靜脈管灌注用等體積的同源血漿代替；和(IV)從股動脈抽出三分之二的(66%)的理論總血容量，并通過靜脈管灌注用等體積的同源血漿代替。在基線、除去血液后和在輸注基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品和同源血漿后1、2、4、5、7、9、11、14、16、18、20、22和24天采集血樣，檢測紅細胞壓積，其為包含血漿游離血紅蛋白的血樣中紅細胞生成的最有效的指征。紅細胞壓積為壓縮紅細胞的體積與全血體積之比，以百分數(shù)表示。使用肝素化的微紅細胞壓積毛細管(FisherScientific,Houston，TX)和微紅細胞壓積離心機(DamonICEDivision,Needham,MA)來測定紅細胞壓積。6.1.2.結果組I、II和III的所有動物都從處理中存活下來，而組IV中一只動物在24小時內(nèi)死亡。如圖1所示，在抽出三分之一和三分之二的理論總血容量后，紅細胞壓積分別下降至約30%(Hb為約9g/dL)和13%(血紅蛋白為約4.5g/dL)。在補充三分之一的理論總血容量(組I)后約3.5天和補充三分之二的理論總血容量(組II)后約8.5天，施用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品使紅細胞壓積回到基準值。相反，用同源血漿處理的動物不能快速使紅細胞壓積正常化。在接受33%的補充輸注血漿的組111中，紅細胞壓積在約IO天后回到正常值，在接受66%的補給輸血的組IV中，紅細胞壓積在約24天后達到基準值。然而在接受66%替代治療的血液代用品組(11)中，紅細胞壓積在不到3天就翻倍，在用同源血漿處理的組IV中，存活的動物的紅細胞壓積在約10天翻倍。6.1.3.結論甚至在生命受威脅的失血(66%)情況下，施用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品也使紅細胞量非常快地恢復至正常值。該血液代用品〗吏對急性失血性貧血的自然的紅細胞生成反應加快超過兩倍。假定該血液代用品的循環(huán)半衰期為約24小時，該產(chǎn)品不僅在初始復蘇期作為載氧體，而且也是紅細胞生成反應的有效激活劑。用其它血液代用品試驗性處理患有生命受威脅性貧血的住院病人的報道中，甚至在用大劑量的重組體EPO同時治療的情況下，紅細胞壓積的倍增時間為10至24天(Lanzinger等人(2005)CanJAnaesth52(4):69-373;Gannon等人(2002)30(8):1893-1895;Allison等人(2004)97(12):1257-1258)。因為在正常情況下，紅細胞生成(從多能干細胞到RBC)在5天內(nèi)發(fā)生，用目前檢測的血液代用品產(chǎn)品(由EPO支持)得到的結果是臨床上不可接受的，表明這些血紅蛋白對骨髓細胞有直接毒性作用。相反，單獨用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品處理后，紅細胞壓積的倍增時間少于3天，表明該血液代用品產(chǎn)品具有真實、唯一和直接的紅細胞生成潛能。6.2.實施例2-用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品治療處于生命受威脅的貧血的兔子，增加了其體內(nèi)的紅細胞壓積6.2.1.方法根據(jù)以前在科學文獻(Feola等人(1988)SurgGynecolObstet166:211-222;Simoni等人(1990)BiomatArtCellsArtOrg18(2)189-202)中報道的方法，在用1%的利多卡因的局部麻醉下，將無菌插管插入十二只4.0kg體重的新西蘭兔子的一只耳朵的中央動樂jc和另一只耳朵的marglobal靜樂jc中。在固定后，抽出兔子的三分之一(33%)理論總血容量，15分鐘后，接著再抽出三分之一(33%)。所述試驗兔子(n=6)接受輸注與總失血(約4.6g/kg體重)相同體積的基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品。另6只動物在出血后沒有接受處理，一小時內(nèi)，所有的這些動物都死亡。所有接受輸注血液代用品的實驗組動物都存活下來。在基線、抽血后和輸注基于血紅蛋白-ATP-腺普-GSH的血液代用品1、2、4、7、9和14天后采集血樣。如實施例1檢測血樣。6.2.2.結果-結論如圖2所示，在抽出三分之二的理論總血容量后，紅細胞壓積降至約9.5%(血紅蛋白為約4.0g/dL)。施用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品在約8.5天恢復了其基準紅細胞壓積。在兔子中，甚至在生命受威脅(66%)的失血后，施用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品還使紅細胞量非?？斓鼗謴椭琳Ｖ?。紅細胞壓積的倍增時間為約3天。在兔子中，這些血液代用品產(chǎn)品不僅僅在初始復蘇期充當載氧體，還是紅細胞生成的有效激活劑。6.3.實施例3-用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品使患有生命受威脅的貧血的正常血壓的大鼠復蘇后，大鼠血液動力學和組織氧合6.3丄方法根據(jù)以前文獻Simoni等人(1996)ASMOJ42(5):M773-782)中報道的注射戊巴比妥鈉和進行無菌顯微手術操作的方法，將350-450gm重的十只雄性正常血壓的Sprague-Dawley大鼠(CharlesRiver,Kingston,NY)腹膜內(nèi)施用30mg/kg體重的戊巴比妥鈉麻醉，并進行無菌顯微手術操作。為了獲取血液動力學值和采集參照樣本，外科手術暴露左和右股動脈、左股靜脈和外頸靜脈，并插入聚乙烯導管(模型PE-50,BectonDickinsonandCo.,Parsippany，NJ)。通過位于右股動脈且與一次性、小體積血壓傳感器(Ohmeda,Pte,Ltd,Singapore)相連的的導管進行動JI^血壓的連續(xù)測定。為了測定心輸出量(CO)，將thermostatmicroprobe(模型IF，O.D.為1/3mm;ColumbusInstruments,Columbus,OH)推進穿過頸動脈進入升主動脈，同時在室溫下，經(jīng)由置于外頸靜脈中的導管將100nl的鹽溶液注射到右心房。為了測定組織氧合(tp02)，通過外科手術將DO-166氧顯孩t探針(LazarResearchLaboratories,LosAngeles，CA)插入股二頭肌(bicepsfemorimuscle)(右腿)中。在整個試驗中，用加熱板使血液溫度維持在37士0.rC下。所有的動物自然的呼吸。通過4吏用全自動的CardiomaxCirculatorySystemComputer(ColumbusInstruments,Columbus,OH)記錄血液動力學參數(shù)，包括心輸出量(CO;ml/min);心臟指數(shù)(CI;ml/min/100g體重)、心搏量(SV;ml/搏動/100g體重)、平均動脈壓(MAP;mmHg)、脈壓(PP;mmHg)、心率(HR;搏動/分鐘)、總外周阻力(TPR;(dyn/sec/cm,xio3)和血液溫度。通過將DO-166探針的界面與Microcomputer(pH-版6071，LazarResearchLaboratories)和CardiomaxCirculatorySystemComputer的圖表記錄器連接獲得組織氧合的連續(xù)記錄。用血紅蛋白的量(克)乘以已知的氧飽和度和1.36(—克完全飽和的血紅蛋白的載氧量)計算動脈血的氧含量(在100ml血液中的02(ml))。用CO(L/min)乘以動脈血的氧轉運(ml/100ml血液)和校正因子10來計算血液的氧轉運(ml02/min)。在完成外科手術準備和校準Cardiomax系統(tǒng)后，指定30分鐘用于穩(wěn)定血液動力學和組織氧含量參數(shù)。按體積相當于40%總血容量(經(jīng)計算，對每只大鼠而言等于按千克計體重的70/0)或2.8g/kg體重抽出動脈血誘導出血性休克。在5分鐘內(nèi)完成血液的抽出。出血性休克持續(xù)30分鐘。然后，用與總失血相同體積的基于血紅蛋白-ATP-腺普-GSH的血液代用品處理這些大鼠。在約10分鐘內(nèi)完成處理。然后，在處理后卯分鐘期間研究所有的大鼠。在試驗結束時，通過靜脈內(nèi)給予戊巴比妥鈉殺死大鼠。6.3.2.結果總結在下面(表1)和圖3中的結果顯示出在抽血后，TPR增加，CI、MAP和組織p02降低，然后TPR立即還原成正常值，CI、MAP和組織p02快速正?；?。而且，在整個處理后期間可觀察到血管舒張和較好的組織氧合。表l用基于血紅蛋白-atp-腺苷-gsh的血液代用品處理后的血液動力學特征基線出血處理后處理后30分鐘90分鐘ci-心臟指數(shù)34±312±234±333±4(ml/min/100gBW)(p〈0適)N.S.N.S.搏出量指數(shù)O細土O.Ol0.040±0.010.121±0.01O扁土O.Ol(ml/搏動/100gBW)(p<0.001)(p<0.001)N.S.Map-平均動脈壓118±1240±5U6±3119±7(mmHg)(p<0.001)N.S.N.S.PP-脈壓28±222±338±330±3(mmHg)(p<0.01)(p<o.ooi;>(p<0.05)tpr84±1290±1277±778±10(dyn/sec/cm力x103(p<0.05)(p<0.05)(p<0.1)組織p。280±920±372±493±12(ml(VmirO(p<0.001)N.S.(p<0.05)數(shù)值平均值±SD顯著性(P)與基線的差異6.3.3.結論該試驗表明可以用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品成功地治療特征為心臟指數(shù)降低約66%、平均動脈壓降低約67%、TPR顯著性增加、和組織氧合降低約78%的出血性休克。出血后血管擴張活性和血管收縮的降低主要與腺苷相關，其具有血管擴張和抗炎性質(zhì)，在我們的技術(授予Feola、Simoni和Canizaro的美國專利5,439,882)中用作分子間交聯(lián)劑和血紅蛋白表面修飾劑。該試驗也證實用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品治療，通過使組織/器官灌注最大化而改善了組織氧合。向局部缺血的器官遞送適當?shù)难跏枪芾聿块T批準這些試劑作為血液代用品的主要原因。在體內(nèi)向局部缺血的組織和器官遞送氧最大化不會阻斷紅細胞生成反應，如在圖1、圖2、圖3、圖4、圖5和圖6A&B中所示。6.4.實施例四-用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品處理鐮狀細胞貧血患者的紅細胞生成作用6.4.1.方法如以前在科學文獻(Feola等人(1992)SurgGynecolObstet174(5):379-386)中凈良道的，在人中檢測基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品。在Kinshasa的CenterforSickleCellAnemia治療一組九名患者。5名男性和4名女性，4-13歲。五名孩子存在重度貧血，血液的血紅蛋白水平為5g/dL或更少。四名孩子具有較輕程度的貧血，血紅蛋白水平為約8g/dL,但具有"鐮狀細胞危象"，即手部和足部(2名患者)、左肺(l名患者)和脾(l名患者)存在急性微血管堵塞。所述患者存在疼痛、發(fā)熱和全身不適及虛弱。靜脈注射體積相當于總血容量25%(經(jīng)計算對每名患者而言為以千克計體重的7%)、約1.75g/kg體重的基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品。一名患有重度貧血和初始血紅蛋白為3.5g/dL的患者在連續(xù)兩天接受兩次輸注。在施用血液代用品期間和之后2小時，每15分鐘測定生命特征、溫度、脈搏、呼吸和血壓。在施用血液代用品兩小時前和兩小后的期間測定尿排出量。檢測尿中存在的血紅蛋白。在施用血液代用品之前、之后立即、施用后兩小時和施用后5天中的每天采集血樣。檢測患者血液中的血漿游離血紅蛋白、總血紅蛋白和網(wǎng)織紅細胞。將小體積的EDTA血漿保存在-20'C下，之后進行促紅細胞生成素水平的測定。用EPO-Trac1251RIA試劑盒(INCSTARCorp.nowDiaSorinS.p.A"Sallugi,Italy)檢測EPO。所述INCSTAREPO-Trac125IRIA過程是竟爭性結合放射免疫分析，其利用重組體人促紅細胞生成素作為示蹤劑和標準品。在該分析中，EPO的最小可檢測濃度為5.5mU/mL。由Company進行的干擾研究證實嚴重的溶血(血紅蛋白為約4g/dL)似乎不受EPO-Trac-RIA的千擾。結果用血漿的mU/ml表示。6.4.2.結果沒有一個患者出現(xiàn)過敏性反應，所有患者的健康都得到改善。發(fā)熱減弱、脈搏變快、血壓保持穩(wěn)定和脈壓增加，表現(xiàn)出血管舒張(表2)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>如圖4所示，基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品在5天期間逐漸將總血紅蛋白從全組平均值約6.3士2.0提高至約10.9±1.3g/dL(pO.001)，倍增時間為約7天。如圖4所示，總血紅蛋白的增加與網(wǎng)織紅細胞從約3.7±3.1顯著增加至44.2±7.2%&<0.001)相關。如圖5所示，用基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH血液代用品進行治療顯著地增加了EPO循環(huán)水平。在1天后，EPO水平上升約1.6倍，在第3天，達到最大濃度約210mU/ml。在第5天，EPO的水平仍稍高于基線值。用基于血紅蛋白-ATP-腺普-GSH的血液代用品進行治療使得總血紅蛋白最終恢復正常值。該血液代用品加速了EPO的合成，導致網(wǎng)織紅細胞的大量生成。這表明基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品不僅提供了對RBC的即刻補充，而且刺激EPO的合成，加速了新的RBC的生成。該刺激僅被記錄了5天。6.4.3.結論總之，向患有生命受威脅的貧血的人施用顯著體積的血紅蛋白-ATP-腺苷-谷胱甘肽-基血液代用品不產(chǎn)生毒性或過敏性反應，改善了其一般狀態(tài)和刺激患者的紅細胞生成反應。6.5.實施例5-使用人星形細胞作為模型，在常氧和缺氧下，基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品對促進紅細胞生成的因子、HIF-la穩(wěn)定和EPO的生成的影響6.5.1.方法為了評價基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品是否具有HIF-1a(已知其為EPO基因的誘導物)穩(wěn)定劑的作用，我們評價了該血液代用品對能夠生成EPO的人星形細胞的作用。特征性地，EPO,—種紅細胞生成的主要激活劑是由胎兒的肝和成年人腎產(chǎn)生的。最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了新的產(chǎn)生EPO的部位中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形細胞是應答缺氧/局部缺血的EPO的主要產(chǎn)生者(SirenAL，77KnerlichF,PoserW，GleiterCH,BruckW,EhrenreichH:Erythropoietinanderythropoietinreceptorinhumanischemic/hypoxicbrain.ActaNeuropathol(Berl)101(3):271-276,2001;SasakiR:Pleiotropicflinctionsoferythropoietin.IntMed42(2):142-149,2003)。在星形細胞中，HIF-la調(diào)節(jié)EPO的表達。EPO似乎起保護神經(jīng)元免受低氧/局部缺血應激的神經(jīng)保護作用。EPO誘導的神經(jīng)保護是基于促凋亡(proap叩totic)Bel家族成員Bad的磷酸化作用。因為EPO受體在神經(jīng)元中表達，EPO通過激活神經(jīng)元的EPO受體可抑制神經(jīng)元中缺氧-誘導的細胞凋亡(VarianoM，DelloRussoC，PozzoliGBattagiaA,ScambiaGTringaliQAloe-SpiritiMA,PreziosiP,NavarraP:Erythropoietinexertsanti-apoptoticeffectsonratmicroglialcellsinvitro.EurJNeurosci16(4):684-692,2002)。因為EPO在紅細胞生成中的主要功能是拯救紅細胞的祖細胞避免細胞凋亡(Socolovsky等人(1999)Ce1198(2):181-91;Dolznig等人(2002)CurrBiol12(13):1076-1085)，我們認為星形細胞模型是研究血液代用品對HIF-la命運和EPO合成的影響的最好的人細胞體系。常氧第2代正常人星形細胞的初始培養(yǎng)物從Clonetics(Bio-Wittaker，ACambrexCo,SanDiego,CA)獲得。在濕潤的5%C02的氣氛和37。C的溫度下，將細胞培養(yǎng)在75cm2的裝有BulletKit培養(yǎng)基(Clonetics)的組織培養(yǎng)瓶(ComingGlassWorks,Coming,NY)中，直到它們發(fā)生融合(約50,000細胞/cm2)。然后，將星形細胞傳代培養(yǎng)在6孔細胞培養(yǎng)板(Coming)和蓋玻片中。使用胰蛋白酶試劑包(Clonetics)進行細胞傳代。在轉移過程中，星形細胞受胰蛋白酶作用不超過5分鐘。使用第四至第六代細胞進行所有的試驗。所述星形細胞之前已被檢測HIV、肝炎、支原體、細菌、酵母菌、真菌陰性；和檢測GFAP陽性以及CD68和CNPase染色陰性(CloneticsCertificateofAnalysis)。然后，用培養(yǎng)基孵育融合的星形細胞約18小時，所述培養(yǎng)基添加有最終濃度為0.1、1.0和1.75g/dL的基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品。用培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性對照星形細胞，所述培養(yǎng)基添加有最終濃度為0.1、1.0和1.75g/dL的未修飾的血紅蛋白。在不存在血紅蛋白溶液下，用FBS代替其培養(yǎng)陰性對照星形細胞。所有試驗都在95%空氣的氣氛(代表常氧條件)下進行。處理后，用多種生化和分子生物學方法進行細胞的評價。使用高通量基于TransAMELISA的分析(ActiveMotif,Carlsbad,CA),在細胞核提取物中測定在常氧條件下基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品對HIF-la穩(wěn)定的影響及其誘導人EPO基因的能力。在該試驗中，用包含來自人EPO基因的缺氧效應元件(5，-TACGTGCT-3，)的寡核苷酸孵育96-孔板。使用NonidentP-40和補充有DTT和蛋白酶抑制劑混合物(ActiveMotif)的細胞溶解緩沖液從活的星形細胞獲得核提取物。進行核提取物中HIF-la的檢測。HIF-la存在于結合人EPO基因的核提取物中，并且可以結合第一抗體。然后，HRP-結合的第二抗體識別第一抗體，提供靈敏的比色分析讀數(shù)。使用3550-UV微板讀數(shù)器(BioRad)在450nm讀取反應。用每2.5嗎的核提取物在450nm的OD表示結果。使用制造商提供的COS-7核提取物作為HIF-la活化和結合EPO基因的陽性對照。4吏用高對爭異寸生QuantikinelnVitroDiagnosticHumanErythropoietinELISA(RScDSystemsInc.,Minneapolis,MN)在細胞培養(yǎng)上清液中評價所述血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH-基-血液代用品對EPO合成的影響。該試驗是基于雙-抗體夾層法。用對人EPO特異性的單克隆抗體預包被^f鼓板孔，然后用細胞培養(yǎng)上清液或人EPO標準品孵育。在孵育和洗滌后，用HRP連接的抗-EPO多克隆抗體孵育各小孔。在第二次孵育期間，所述抗體-酶連接物結合已固定的EPO。在洗滌后，加入色素原形成藍色絡合物。產(chǎn)生的顏色的量與樣品或標準品中EPO的含量成正比。結果用mU/mL表示。該檢測方法的最低可檢測的EPO劑量可低于0.6mU/ml。缺氧在濕潤可變的有氧工作站獲得低氧條件(1.5%的02、93.5%的N2和5%的C02)。在試驗前，在1.5%的氧水平預平衡培養(yǎng)基過夜。在預平衡的培養(yǎng)基存在下，將如上培養(yǎng)的融合的星形細胞暴露于缺氧(1.5%的02)下約18小時，其中所述培養(yǎng)基補充有最終濃度為O.l、1.0和1.75g/dL的基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品。用預平衡的培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性對照星形細胞，其中所述培養(yǎng)基補充有最終濃度為0.1、1.0和1.75g/dL的未修飾的血紅蛋白。在不存在血紅蛋白溶液下，用FBS代替培養(yǎng)陰性對照星形細胞。所有的步驟都在1.5%的02、95.5%的1^2和5%的C02的氣氛(代表低氧條件)下于黑暗中進行。在暴露后，如下評價細胞1)如上所述，用TransAMELISA方法，評價基于血紅蛋白-ATP-腺普-GSH的血液代用品對HIF-la穩(wěn)定的作用及其誘導人EPO基因的能力，和2)如上所述，用QuantikineIVDhumanEPOELISA評價在缺氧下所述基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品對EPO合成的影響。6.5.2.結果基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品和未修飾的血紅蛋白溶液對促進紅細胞生成的因子、HIF-la和EPO的作用顯示在表3和4及圖6和7中。表3給出了在低氧和常氧條件下，所述血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH-基-血液代用品和未修飾的血紅蛋白溶液對HIF-la的穩(wěn)定性及其結合EPO基因的影響。表3低氧常氧HIF-la(O.D.450nm/2.5ng的核提取物/孔)M±SD對照與試驗組比較的顯著性試驗組之間比較的顯著性M±SD對照與試驗組比較的顯著性試驗組之間比較的顯著性低氧與常氧之間比較的顯著性對照0.233±0.05—0.063±0.01P<0.01未修飾Hb0.1g/dL0.198±0.04N.S.—0.094±0.02P<0.01---P<0.01未修飾Hb1.0g/dL0.154±0.03P<0.01—-0.071±0.01N.S.---P<0.01未修飾Hbl,75g/dL0.149±0.02P<0.01—O扁土O.01N.S.---P<0.01血液代用品l.Og/dL0.226±0.02N.S.N.S.0.139±0.02P<0.01P<0.01P<0.01血液代用品l.Og/dL0.264±0.04P<0.01P<0.010.146±0.03P<0.01P<0.01P<0.01血液代用品1.75g/dL0.391±0.07P<0.01P<0.010.234±0.03P<0.01P<0.01P<0.01測試的對照0.787±0.020.679±0.02N.S.表4給出了在低氧和常氧條件下，所述血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH-基-血液代用品和未修飾的血紅蛋白溶液對EPO生成的影響。表4低j艮常氧EPO(mU/mLM±SD對照與試驗組比較的顯著性試驗組之間比較的顯著性M±SD對照與實驗組比較的顯著性試驗組之間比較的顯著性低氧與常氧比較的顯著性對照0.233±0.56—0.29±0,50P<0.001未修飾的HbO.lg/dL3.05±2.56N.S.—2.63±1.33P<0.01---N.S.未修飾的Hbl.Og/dL2.35±1.62N.S.—3.88±1.41P<0.01---N.S.未修飾的Hb1.75g/dL1.02±0.26P<0.001—1.96±1.53N.S.---N.S.<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>6.5.3.結論該研究表明HIF-la可以在低氧和常氧條件下的星形細胞的核提取物中找到。而且，該研究表明在低氧和常氧的環(huán)境中，檢測的血紅蛋白溶液對HIF-la的穩(wěn)定、核轉運和結合EPO基因具有不同的影響。如在圖6A和表3中所示，未修飾的血紅蛋白溶液增加了HIF-la的細胞質(zhì)的降解，并顯著地降低了(在較高的劑量)其結合EPO基因的活性，特別是在低氧下。在含氧量正常的或低氧條件下，未修飾的血紅蛋白溶液沒有穩(wěn)定HIF-la。相反，在兩種氧氣的條件下，所述基于血紅蛋白-ATP-腺苦-GSH的血液代用品增加了HIF-la的誘導。該血液代用品以劑量依賴性方式穩(wěn)定HIF-la和加速其結合EPO基因。在常氧和低氧下，任何試驗濃度的該血液代用品都能穩(wěn)定HIF-la。該產(chǎn)品在1.0-1.75g/dL的劑量下最有效。這樣的轉錄作用表明加速了紅細胞生成反應。實際上，如圖6B和表4所示，在常氧的和低氧條件下，該血液代用品有效地增加了EPO的生成。所述紅細胞生成作用可在任何試驗濃度下觀察到。所述基于血紅蛋白-ATP-腺脊-GSH的血液代用品作為有效的促紅細胞生成因子起作用。所述未修飾的血紅蛋白阻斷EPO的合成，表明抑制紅細胞生成?？捎^察到該作用在較高的血紅蛋白濃度下更有效。6.6.實施例6-使用人星形細胞作為模型，在常氧和缺氧下，基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品對抗-促紅細胞生成的因子、NF-kB、TNF-a和TGF-pi及細胞凋亡的作用6.6.1.方法因為已知人星形細胞可生成炎癥細胞因子，比如TNF、IL-l、IL-6、TGF-pl，它們起抗-紅細胞生成劑的作用(Hellwing-Burgel等人(1999)AmSocHematol94:1561-1567;LinchDC(1989)SchweizMedWochenschr119(39):1327-1328;Trey等人(1995)CritRevOncolHematol21:1-8;Yuen等人(2005)ASAIOJ51(3):236-241)，所以我們選擇人細胞模型來研究血液代用品的抗炎功效及其對HIF-la的穩(wěn)定性和EPO誘導的影響(VanWagoner等人(1999)JNeurosci19(13):5236-5244;Oh等人(1999)JNeurovirol5(1):82-94;Flanders等人(1998)ProgNeurobiol54(1):71-85)。如
背景技術：
部分所述，未修飾的和修飾的血紅蛋白溶液具有強的促細胞凋亡作用(Meguro等人(2001)JNeurochem77(4):1128-1135;Simoni等人(2002)ASAIOJ48(2):193;Goldman等人(1998)AmJPhysiol275(3Pt2):H1046-53);D'Agnillo等人(2001)Blood98(12):3315-3323;Mohara等人(2005)ASAIOJ51(3):288-295)。由于EPO的主要功能是保護原成紅細胞免于細胞凋亡(Socolovsky等人(1999)Cell98(2):181-91;Dolznig等人(2002)CurreBiol12(13):1076-1085)，已有記錄輸注的血紅蛋白直接接觸骨髓細胞成紅細胞(Shum等人(1996)ArtifCellsBloodSubstitI醒obilBiotechnol24(6):655-683)，因此，我們i人為重要的是評價血液代用品的促細胞凋亡和抗-紅細胞生成作用。常氧如實施例5所述，使用人星形細胞模型進行這些試驗。所有試驗都在代表常氧條件的95%空氣和5%(:02的氣氛下進行。簡單地說，在培養(yǎng)基中孵育融合的星形細胞約18小時，所述培養(yǎng)基添加有最終濃度為0.1、1.0和1.75g/dL的基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品。用培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性對照星形細胞，所述培養(yǎng)基添加有最終濃度為0.1、1.0和1.75g/dL的未修飾的血紅蛋白。在不存在血紅蛋白溶液下，用FBS代替其培養(yǎng)陰性對照星形細胞。處理后，用多種生化和分子生物學方法進行細胞評價。4吏用TransAMTMNF-kbp65transcriptionFactorAssay試劑盒(ActiveMotif,Carlsbad,CA)在細胞核提取物中檢測NF-kB的核活化和NF-kB的DNA結合。該方式是檢測和定量NF-kb活化的第一種基于ELIS的方法，其包含96-孔板，在其上存在含有NF-kB共有位點(5'-GGGACTTTCC-3，)的固定的寡核苷酸。在該研究中，用該寡核苷酸與存在于核提取物中的NF-kB的活化形式，一種p65異源二聚體，一起培養(yǎng)。使用制造商提供的全溶解緩沖液從活細胞獲得核提取物，所述全溶解緩沖液包含DTT和蛋白酶抑制劑混合物。向該完全結合緩沖液中補充DTT和鯡魚精液DNA。在培養(yǎng)后，形成的DNA-蛋白質(zhì)復合物結合第一抗體，該抗體識別p65上的表位。僅僅當NF-kB被激活和結合DNA時，所述DNA-蛋白質(zhì)復合物才能結合該第一抗體。然后，用抗？65的1110>-結合的第二抗體識別該反應，并使用聯(lián)苯胺衍生物和過氧化氫進行顯色。使用微板讀數(shù)器，Bio-RadModel3550-UV在450nrn讀取該反應。結果以每2.5嗎的全細胞提取物在450nm的OD表示。將制造商提供的HeLa全細胞提耳又物作為NF-kB活化和DNA結合的陽性對照。用市售獲得的ELISA試劑盒檢測具有抗-紅細胞生成活性的促炎細胞因子(TNF-a和TGF-pl)的生成。使用TNF-a人EIA試劑盒(CaymanChemical,AnnArbor,MI)檢測TNF-a。該檢測是基于使用人TNF-a的單克隆抗體的雙-抗體"夾心"技術。用該抗體包被微滴定孔，抗體與加入孔中的任何人TNF-a結合。然后，將乙酰膽堿酯酶(AchE):Fab，連接物加入到所述孔中，所述孔選擇性結合人TNF-a分子的表位。將所述"夾心"固定在板上，洗除過量的試劑。通過用Ellman's試劑測定AchE的酶活性和用微板讀數(shù)器(Bio-RadModel3550-UV)進行分光光度測量來確定分析物的濃度。結果用pg/mL表示。用HumanTGF-plQuantikineImmunoassay測定TGF-卩1以確定活化的人TGF-P1在細胞培養(yǎng)的上清液、血清和血漿中的濃度(R&DSystems)。在該研究中，通過酸活化和中和，將在細胞培養(yǎng)上清液中無活性的TGF-pi轉變成免疫活性形式。然后，使用具有固定的TGF-(3可溶性受體的微板分析TGF-pi。在培養(yǎng)和洗滌后，加入第二抗體-酶試劑，其與底物產(chǎn)生顏色，該顏色與最初步驟中結合的TGF-pi的量成正比。TGF-pi的濃度用pg/mL表示。細胞凋亡。在該研究中，星形細胞生長在蓋玻片上并暴露于所述基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品中，分別使用AnnexinV-FITC和碘化丙啶熒光探針(SigmaChemical)評價星形細胞初期和晚期的細胞凋亡事件。AnnexinV-FITC是一種結合磷脂酰絲氨酸的探針，作為綠色熒光被檢測。碘化丙啶結合細胞的DNA，并產(chǎn)生紅色焚光。在細胞凋亡的初期階段，磷脂不對稱損失導致通常在膜內(nèi)部才能發(fā)現(xiàn)的磷脂酰絲氨酸易位至膜的外部。因此，如果在膜外可獲得磷脂酰絲氨酸，則Annexin與之結合，標志細胞凋亡過程開始。相反，用碘化丙啶檢測導致細胞DNA片段化的細胞凋亡的進展。用熒光顯微鏡評價結果。低氧在實施例6中，在濕潤可變的需氧工作站獲得低氧條件(1.5°/。的02、93.5%85的N2和5Q/。的C02)。在添加有最終濃度為0.1、1.0和1.75g/dL基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品的預平衡的培養(yǎng)基的存在下，將如上培養(yǎng)的融合的星形細胞暴露于低氧(1.5%的02)下約18小時。用添加有最終濃度為0.1、1.0和1.75g/dL的未修飾的血紅蛋白的預平衡的培養(yǎng)基，培養(yǎng)陽性對照星形細胞。在不存在血紅蛋白溶液中，用FBS代替其培養(yǎng)陰性對照星形細胞。如上，所有的步驟都在1.5%的02、93.5%的N2和5%的C02的氣氛(表示低氧條件)下于黑暗中進行。在暴露后，如上所述對細胞進行評價1)如上所述，使用TransAMNF-icBp65轉錄因子分析試劑盒(ActiveMotif)，在核細胞提取物中分析NF-kB的核的活化和DNA結合，2)如上所述，使用市售獲得的ELISA試劑盒分析具有抗紅細胞生成活性的促炎細胞因子(TNF-a和TGF-Pl)的生成，和3)如上所述，分析初期和晚期的細胞凋亡。6.6.2.抗炎作用-結^/結論表5<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>品1.0g/dL血液代用品1.75g/dL201.36±54.0N.S.P<0.001182.9±65.9N.S.P<0.001N.S.表6缺氧含氧量正常tgf-a(pg/mL)M±SD對照組對試驗組的顯著性試驗組織間的顯著性M±SD對照組對實驗組的顯箸性試驗組織間的顯著性缺氧對含氧量正常的顯著性對照6.35±3.66—_5.47±3.31—N.S.未修飾的Hb0.1g/dL4.87±2.82N.S.—6.46±3.51N.S.—N.S.未修飾的Hb1.0g/dL5.42±3.13N.S.—5.65±3.26N.S.—_N.S.未修飾的Hb1.75g/dL27.04±5.06P<0.01—14.92±2.69P<0.05—P<0.05血液代用品O.lg/dL5.61±3.24N.S.N.S.5.55±3.20N.S.N.S.N.S.血液代用品l.Og/dL4.72±2.74N.S.N.S.5.30±3.06N.S.N.S.N.S.血液代用品1.75g/dL5.39±3.12N.S.P<0.015.27±3.04N.S.P<0.05N.S.如圖7所示，在所有試驗濃度和氧含量下，所述基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品都抑制了NF-kB的活化。相反，未修飾的血紅蛋白以劑量依賴性方式活化NF-kb誘導。在常氧條件下更趨向于該效果。如表5和6所示，在兩種檢測的氧氣條件下，所述基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品以劑量依賴性方式抑制TGF-pl的形成，并且不會增加TNF-a的生成，TNF-a是最強的抗紅細胞生成劑。這一作用可能與該血液代用品不誘導NF-KB相關。然而，所述未修飾的血紅蛋白溶液，特別是當以較高的濃度(l和1.75g/dL)給予時，增加了兩種抗紅細胞生成劑TGF-pi和TNF-a的生成。實施例6中描述的試驗表明所述基于血紅蛋白-ATP-腺普-GSH的血液代用品具有抗炎潛能，而未修飾的血紅蛋白具有促炎癥反應的性質(zhì)。因為高活性的NF-KB途徑參與抑制紅系細胞-特異的基因，TGF-(31阻斷紅系祖細胞的分化，TNF-a抑制HIF-la結合EPO基因，有理由認為所述基于血紅蛋白-ATP-腺苦-GSH的血液代用品的抗炎性質(zhì)起到促紅細胞生成因子的作用。6.6.3.抗細胞凋亡作用-結勤結論在常氧條件下的對照星形細胞沒有顯示出任何促細胞凋亡反應。熒光分析顯示出沒有Annexin的表面結合，也沒有碘化丙啶的核聚積，這可以解釋為不存在初期和晚期的細胞凋亡事件。缺氧導致AnnexinV-FITC在星形細胞的表面上累積。該結果是磷脂酰絲氨酸易位至膜的外部的指標，其出現(xiàn)在細胞凋亡的初期。用未修飾的血紅蛋白處理星形細胞，在常氧條件下導致初期細胞凋亡，而在缺氧條件下導致進展的細胞凋亡。在暴露于未修飾的血紅蛋白溶液的低氧星形細胞中的捵化丙啶累積是質(zhì)膜受損和DNA片段化的結果。較高濃度的未修飾的血紅蛋白引起更嚴重的毀壞性作用。所述基于血紅蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品在任何試驗濃度或氧含量下都沒有誘導細胞凋亡反應。由于EPO作為促紅細胞生成劑的主要功能是保護原紅細胞不發(fā)生細胞凋亡，基于血紅蛋白-ATP-腺普-GSH的血液代用品加快HIF-la介導的EPO生成，所以該血液代用品不會干擾EPO的功能。相反，具有高促細胞凋亡潛能的未修飾的血紅蛋白溶液，特別是在較大的濃度下，可以起到抗紅細胞生成劑的作用。6.6.4.結論如在美國專利5,439,882中描述的，用ATP、腺脊和GSH化學/藥理學修飾血紅蛋白得到改進的血液代用品產(chǎn)品，其通過穩(wěn)定HIF-1a和隨后的EPO誘導而具有血管擴張活性和良好的組織氧合能力及紅細胞生成活性。該血液代用品產(chǎn)品的抗炎和抗細胞凋亡潛能加速了紅細胞生成反應。這一在高濃度(克/kg體重)下表現(xiàn)出促紅細胞生成潛能的血液代用品產(chǎn)品可以作為初始治療以保持組織氧合，并作為再治療通過刺激患者的紅細胞生成反應使紅細胞壓積正?；；谘t蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品治療不需要昂貴的重組EPO的支持。6.7.(預言性)實施例7-治療個體的急性失血6.7.1.試驗設計l將診斷患有急性失血性貧血的人個體分成A組和B組，各組的男性和女性、成年人和兒童的數(shù)量相等。在一定時期內(nèi)用本發(fā)明的血液代用品處理A組的個體，在相同的時期內(nèi)給予B組的個體安慰劑血液代用品。在治療期間和治療后，測定并比較個體的紅細胞壓積水平、血紅蛋白水平、促紅細胞生成素循環(huán)水平和血液動力學參數(shù)。6.7.2.試驗設計2給予在外科手術期間失血超過33%血容量的第一組人個體本發(fā)明的血液代用品。給予在外科手術期間失血超過33%血容量的第二組人個體常規(guī)輸血。兩組具有相等數(shù)量的男性和女性，成年人和兒童。在外科手術期間和外科手術后，測定并比較個體的紅細胞壓積水平、血紅蛋白水平、促紅細胞生成素循環(huán)水平和血液動力學參數(shù)。6.7.3.試驗設計389給予由于創(chuàng)傷(例如槍傷、車禍)引起失血超過33%血容量的第一組人個體本發(fā)明的血液代用品。給予由于相同類型的創(chuàng)傷導致失血超過33%血容量的第二組人個體常規(guī)輸血。兩組具有相等數(shù)量的男性和女性，成年人和兒童。隨后，測定并比較個體的紅細胞壓積水平、血紅蛋白水平、促紅細胞生成素循環(huán)水平和血液動力學參數(shù)。本發(fā)明的范圍不受本發(fā)明描述的具體實施方案的限制。事實上，根據(jù)上述說明和附圖，除了本發(fā)明中描述的之外，本發(fā)明的多種改變對本領域技術人員是顯而易見的。這樣的改變應被認為落入所附權利要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明引用了多種出版物，將其公開的全部內(nèi)容引入本發(fā)明作為參考。權利要求1.用于治療個體急性失血性貧血的方法，包括給有需要的個體施用有效量的血液代用品，以提高所述個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中在常氧條件下的細胞培養(yǎng)中試驗時，所述血液代用品誘導促紅細胞生成素的表達。2.用于治療個體急性失血性貧血的方法，包括給有需要的個體施用有效量的血液代用品，以提高所述個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中通過所述個體的紅細胞壓積或血紅蛋白的倍增時間減少來檢測，所述血液代用品在常氧條件下誘導紅細胞生成。3.用于治療個體急性失血性貧血的方法，包括給有需要的個體施用有效量的血液代用品，以提高所述個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中通過所述個體的促紅細胞生成素循環(huán)水平的增加來檢測，所述血液代用品在常氧條件下誘導紅細胞生成。4.權利要求l-3中任一項的方法，其中所述急性失血為重度。5.權利要求4的方法，其中所述個體的失血超過33%。6.權利要求l-3中任一項的方法，其中所述急性失血為中度。7.權利要求6的方法，其中所述個體的失血為20%至33%。8.權利要求l-3中任一項的方法，其中所述急性失血為輕度。9.權利要求8的方法，其中所述個體的失血少于20%。10.權利要求l-3中任一項的方法，其中所述個體為人。11.權利要求10的方法，其中所述個體的血紅蛋白低于7g/dL。12.用于治療個體中急性失血性貧血的方法，包括給有需要的個體施用有效量的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，以提高所述個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中在常氧條件下的細胞培養(yǎng)中試驗時，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品誘導促紅細胞生成素的表達。13.用于治療個體的急性失血性貧血的方法，包括給有需要的個體施用有效量的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，以提高個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中通過所述個體的紅細胞壓積或血紅蛋白的倍增時間減少來檢測，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品在常氧條件下誘導紅細胞生成。14.用于治療個體的急性失血性貧血的方法，包括給有需要的個體施用有效量的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，以提高所述個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中通過所述個體的促紅細胞生成素循環(huán)水平增加來檢測，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品在常氧條件下誘導紅細胞生成。15.權利要求12-14中任一項的方法，其中所述急性失血為重度。16.權利要求15的方法，其中所述個體的失血超過33%。17.權利要求12-14中任一項的方法，其中所述急性失血為中度。18.權利要求17的方法，其中所述個體的失血為20%至33%。19.權利要求12-14中任一項的方法，其中所述急性失血為輕度。20.權利要求19的方法，其中所述個體的失血少于20%。21.權利要求12-14中任一項的方法，其中所述個體為人。22.權利要求21的方法，其中所述個體的血紅蛋白低于7g/dL。23.用于治療個體急性失血性貧血的方法，包括給有需要的個體施用治療有效量的交聯(lián)血紅蛋白，其中所述交聯(lián)血紅蛋白包含的血紅蛋白(a)與高碘酸氧化的ATP分子內(nèi)交聯(lián)；(b)與高碘酸氧化的腺苷分子間交聯(lián)；和(c)與還原型谷胱甘肽偶聯(lián)。24.權利要求23的方法，其中所述急性失血為重度。25.權利要求24的方法，其中所述個體的失血超過33%。26.權利要求23的方法，其中所述急性失血為中度。27.權利要求26的方法，其中所述個體的失血為20%至33%。28.權利要求23的方法，其中所述急性失血為輕度。29.權利要求28的方法，其中所述個體的失血少于20%。30.權利要求23的方法，其中所述個體為人。31.權利要求30的方法，其中所述個體的血紅蛋白低于7g/dL。32.權利要求23的方法，其中所述交聯(lián)血紅蛋白中血紅蛋白和高碘酸氧化的ATP的摩爾比為1:1至1:3。33.權利要求23的方法，其中在所述交聯(lián)血紅蛋白中血紅蛋白和高碘酸氧化的腺苷的摩爾比為1:1至1:10。34.權利要求23的方法，其中在所述交聯(lián)血紅蛋白中血紅蛋白和還原型谷胱甘肽的摩爾比為1:1至1:20。35.用于治療個體在外科手術期間發(fā)生的失血的方法，該方法包括給有需要的個體施用有效量的血液代用品，以提高所述個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中在常氧條件下的細胞培養(yǎng)中試驗時，所述血液代用品誘導促紅細胞生成素的表達。36.用于治療個體在外科手術期間發(fā)生的失血的方法，該方法包括給有需要的個體施用有效量的血液代用品，以提高所述個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中通過所述個體的紅細胞壓積或血紅蛋白的倍增時間減少來檢測，所述血液代用品在常氧條件下誘導紅細胞生成。37.用于治療個體在外科手術期間發(fā)生的失血的方法，該方法包括給有需要的個體施用有效量的血液代用品，以提高所述個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中通過所述個體的促紅細胞生成素循環(huán)水平增加來檢測，所述血液代用品在常氧條件下誘導紅細胞生成。38.權利要求35-37中任一項的方法，其中所述急性失血為重度的。39.權利要求38的方法，其中所述個體的失血超過33%。40.權利要求35-37中任一項的方法，其中所述急性失血為中度。41.權利要求40的方法，其中所述個體的失血為20%至33%。42.權利要求35-37中任一項的方法，其中所述急性失血為輕度。43.權利要求42的方法，其中所述個體的失血少于20%。44.權利要求35-37中任一項的方法，其中所述個體為人。45.權利要求44的方法，其中所述個體的血紅蛋白低于7g/dL。46.權利要求35-37中任一項的方法，其中所述外科手術為擇期外科手術。47.用于治療個體在外科手術期間發(fā)生的失血的方法，該方法包括給有需要的個體施用有效量的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，以提高所述個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中在常氧條件下的細胞培養(yǎng)中試驗時，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品誘導促紅細胞生成素的表達。48.用于治療個體在外科手術期間發(fā)生的失血的方法，該方法包括給有需要的個體施用有效量的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，以提高所迷個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中通過個體的紅細胞壓積或血紅蛋白的倍增時間減少來檢測，所述交聯(lián)血紅蛋白述血液代用品在常氧條件下誘導紅細胞生成。49.用于治療個體在外科手術期間發(fā)生的失血的方法，該方法包括給有需要的個體施用有效量的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，以提高所述個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中通過所述個體的促紅細胞生成素循環(huán)水平增加來檢測，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品在常氧條件下誘導紅細胞生成。50.權利要求47-49中任一項的方法，其中所述急性失血為重度。51.權利要求50的方法，其中所述個體的失血超過33%。52.權利要求47-49中任一項的方法，其中所述急性失血為中度。53.權利要求52的方法，其中所述個體的失血為20%至33%。54.權利要求47-49中任一項的方法，其中所述急性失血為輕度。55.權利要求54的方法，其中所述個體的失血少于20%。56.權利要求47-49中任一項的方法，其中所述個體為人。57.權利要求56的方法，其中所述個體的血紅蛋白低于7g/dL。58.權利要求47"49中任一項的方法，其中所述外科手術為擇期外科手術。59.治療個體在外科手術期間發(fā)生的失血的方法，該方法包括給有需要的個體施用治療有效量的交聯(lián)血紅蛋白，其中所述交聯(lián)血紅蛋白包含的血紅蛋白(a)與高碘酸氧化的ATP分子內(nèi)交聯(lián)；(b)與高碘酸氧化的腺苷分子間交聯(lián)；和(c)與還原型谷胱甘肽偶聯(lián)。60.權利要求59的方法，其中所述急性失血為重度。61.權利要求60的方法，其中所述個體的失血超過33%。62.權利要求59的方法，其中所述急性失血為中度。63.權利要求62的方法，其中所述個體的失血為20%至33%。64.權利要求59的方法，其中所述急性失血為輕度。65.權利要求64的方法，其中所述個體的失血少于20%。66.權利要求59的方法，其中所述個體為人。67.權利要求66的方法，其中所述個體的血紅蛋白低于7g/dL。68.權利要求59的方法，其中所述交聯(lián)血紅蛋白中血紅蛋白和高碘酸氧化的ATP的摩爾比為1:1至1:3。69.權利要求59的方法，其中所述交聯(lián)血紅蛋白中血紅蛋白和高碘酸氧化的腺苷的摩爾比為1:1至1:10。70.權利要求59的方法，其中所述交聯(lián)血紅蛋白中血紅蛋白和還原型谷胱甘肽的摩爾比為1:1至1:20。71.權利要求59的方法，其中所述外科手術為擇期外科手術。72.用于治療個體由創(chuàng)傷引起的失血的方法，該方法包括給有需要的個體施用有效量的血液代用品，以提該高個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中在常氧條件下的細胞培養(yǎng)中試驗時，所迷血液代用品誘導促紅細胞生成素的表達。73.用于治療個體由創(chuàng)傷引起的失血的方法，該方法包括給有需要的個體施用有效量的血液代用品，以提高所述個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中通過所述個體的紅細胞壓積或血紅蛋白的倍增時間減少來檢測，所述血液代用品在常氧條件下誘導紅細胞生成。74.用于治療個體由創(chuàng)傷引起的失血的方法，該方法包括給有需要的個體施用有效量的血液代用品，以提高所述個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中通過所述個體的促紅細胞生成素循環(huán)水平增加來檢測，所述血液代用品在常氧條件下誘導紅細胞生成。75.權利要求72-74中任一項的方法，其中所述急性失血為重度。76.權利要求75的方法，其中所述個體的失血超過33%。77.權利要求12-14中任一項的方法，其中所述急性失血為中度。78.權利要求77的方法，其中所述個體的失血為20%至33%。79.權利要求72-74中任一項的方法，其中所述急性失血為輕度。80.權利要求79的方法，其中所述個體的失血少于20%。81.權利要求72-74中任一項的方法，其中所述個體是人。82.權利要求81的方法，其中所述個體的血紅蛋白低于7g/dL。83.用于治療個體由創(chuàng)傷引起的失血的方法，該方法包括給有需要的個體施用有效量的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，以^是高所述個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中在常氧條件下的細胞培養(yǎng)中試驗時，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品誘導促紅細胞生成素的表達。84.用于治療個體由創(chuàng)傷引起的失血的方法，該方法包括給有需要的個體施用有效量的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，以提高所述個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中通過所述個體的紅細胞壓積或血紅蛋白的倍增時間減少來檢測，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品在常氧條件下誘導紅細胞生成。85.用于治療個體由創(chuàng)傷引起的失血的方法，該方法包括給有需要的個體施用有效量的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，以提高所述個體的血容量和對抗與急性失血性貧血相關的缺氧，其中通過所述個體的促紅細胞生成素循環(huán)水平增加來檢測，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品在常氧條件下誘導紅細胞生成。86.權利要求83-85中任一項的方法，其中所述急性失血為重度。87.權利要求86的方法，其中所述個體的失血超過33%。88.權利要求83-85中任一項的方法，其中所述急性失血為中度。89.權利要求88的方法，其中所述個體的失血為20%至33%。90.權利要求83-85中任一項的方法，其中所述急性失血為輕度。91.權利要求90的方法，其中所述個體的失血少于20%。92.權利要求83-85中任一項的方法，其中所述個體為人。93.權利要求92的方法，其中所述個體的血紅蛋白低于7g/dL。94.用于治療個體由創(chuàng)傷引起的失血的方法，該方法包括給有需要的個體施用治療有效量交聯(lián)血紅蛋白，其中所述交聯(lián)血紅蛋白包含的血紅蛋白(a)與高碘酸氧化的ATP分子內(nèi)交聯(lián)；(b)與高碘酸氧化的腺苷分子間交聯(lián)；和(c)與還原型谷胱甘肽偶聯(lián)。95.權利要求94的方法，其中所述急性失血為重度。96.權利要求95的方法，其中所述個體的失血超過33%。97.權利要求94的方法，其中所述急性失血為中度。98.權利要求97的方法，其中所述個體的失血為20%至33%。99.權利要求94的方法，其中所述急性失血為輕度。100.權利要求99的方法，其中所述個體的失血少于20%。101.權利要求94的方法，其中所述個體為人。102.權利要求101的方法，其中所述個體的血紅蛋白低于7g/dL。103.權利要求94的方法，其中所述交聯(lián)血紅蛋白中血紅蛋白和高碘酸氧化的ATP的摩爾比為1:1至1:3。104.權利要求94的方法，其中所述交聯(lián)血紅蛋白中血紅蛋白和高碘酸氧化的腺苷的摩爾比為1:1至1:10。105.權利要求94的方法，其中所述交聯(lián)血紅蛋白中血紅蛋白和還原型谷胱甘肽的摩爾比為1:1至1:20。106.藥物組合物，其包含在藥學可接受的載體中的治療有效量的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，其中所述治療有效量為7g至小于122.5g，其中在常氧條件下的細胞培養(yǎng)中試驗時，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品誘導促紅細胞生成素的表達。107.藥物組合物，其包含在藥學可接受的載體中的治療有效量的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，其中所述治療有效量為大于122.5g至700g,其中在常氧條件下的細胞培養(yǎng)中試驗時，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品誘導促紅細胞生成素的表達。108.藥物組合物，其包括在藥學可接受的載體中的治療有效體積的交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，其中所述治療有效體積為小于0.6升，其中在常氧條件下的細胞培養(yǎng)中試驗時，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品誘導促紅細胞生成素的表達。109.權利要求106-108中任一項的藥物組合物，其中在細胞培養(yǎng)中試驗時，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品穩(wěn)定HIF-1a的表達。110.權利要求106-108中任一項的藥物組合物，其中在細胞培養(yǎng)中試驗時，所述交聯(lián)血紅蛋白血液代用品下調(diào)NF-KB。111.藥物組合物，其包含在藥學可接受的栽體中的治療有效量的交聯(lián)血紅蛋白，其中所述治療有效量為7g至小于122.5g，其中所述交聯(lián)血紅蛋白包含的血紅蛋白(a)與高碘酸氧化的ATP分子內(nèi)交聯(lián)；(b)與高碘酸氧化的腺苷分子間交聯(lián)；和(c)與還原型谷胱甘肽偶聯(lián)。112.藥物組合物，其包含在藥學可接受的載體中的治療有效量的交聯(lián)血紅蛋白，其中所述治療有效量為大于122.5g至700g，其中所述交聯(lián)血紅蛋白包含的血紅蛋白(a)與高碘酸氧化的ATP分子內(nèi)交聯(lián)；(b)與高碘酸氧化的腺苷分子間交聯(lián)；和(C)與還原型谷胱甘肽偶聯(lián)。113.藥物組合物，其包含在藥學可接受的栽體中的治療有效體積的交聯(lián)血紅蛋白，其中所述治療有效體積為小于0.6升，其中所述交聯(lián)血紅蛋白包含的血紅蛋白(a)與高碘酸氧化的ATP分子內(nèi)交聯(lián)；(b)與高碘酸氧化的腺苷分子間交聯(lián)；和(c)與還原型谷胱甘肽偶聯(lián)。114.權利要求111-113中任一項的藥物組合物，其中在細胞培養(yǎng)中試驗時，所述交聯(lián)血紅蛋白穩(wěn)定HIF-la的表達。115.權利要求111-113中任一項的藥物組合物，其中在細胞培養(yǎng)中試驗時，,斤述交聯(lián)血紅蛋白下調(diào)NF-KB。116.權利要求111-113中任一項的藥物組合物，其中所述交聯(lián)血紅蛋白中血紅蛋白和高碘酸氧化的ATP的摩爾比為1:1至1:3。117.權利要求111-113中任一項的藥物組合物，其中所述交聯(lián)血紅蛋白中血紅蛋白和高碘酸氧化的腺苷的摩爾比為1:1至1:10。118.權利要求111-113中任一項的藥物組合物，其中所述交聯(lián)血紅蛋白中血紅蛋白和還原型谷胱甘肽的摩爾比為1:1至1:20。119.權利要求111-113中任一項的藥物組合物，其中所述交聯(lián)血紅蛋白溶于非電解水溶液中。120.權利要求111一113中任一項的藥物組合物，其進一步包含甘露醇。121.權利要求111一113中任一項的藥物組合物，其進一步包含電解質(zhì)全文摘要本發(fā)明涉及使用血液代用品治療急性失血的新方法和包含血液代用品的新的藥物組合物。本發(fā)明的方法所用的血液代用品可以(1)如在常氧條件下的細胞培養(yǎng)中試驗所示，所述血液代用品能夠誘導促紅細胞生成素的表達，和/或(2)在常氧條件下，如通過(a)個體紅細胞壓積或血紅蛋白的倍增時間減少來檢測，和/或通過(b)個體促紅細胞生成素循環(huán)水平增加來檢測所示，所述血液代用品能夠誘導紅細胞生成。本發(fā)明的藥物組合物所用的血液代用品可以(1)穩(wěn)定HIF-1α的表達，和/或(2)下調(diào)NF-κB。優(yōu)選地，所述血液代用品為交聯(lián)血紅蛋白血液代用品，或者更優(yōu)選地，交聯(lián)血紅蛋白包含與高碘酸-氧化的ATP5分子內(nèi)交聯(lián)、與高碘酸-氧化的腺苷分子間交聯(lián)并且與還原型谷胱甘肽偶聯(lián)的血紅蛋白。文檔編號A61K38/41GK101489581SQ200780027070公開日2009年7月22日申請日期2007年5月15日優(yōu)先權日2006年5月16日發(fā)明者格雷斯·西蒙尼,瑪麗亞·J·費奧拉,簡·S·西蒙尼申請人:得克薩斯理工大學衛(wèi)生科學中心