專利名稱：：Fkbp-l及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及FKBP-L多肽、FKBP-L肽、FKBP-L肽衍生物及其用途。
背景技術(shù)：
：血管發(fā)生是指從已有的脈管系統(tǒng)形成新的血管，其可以借助可溶性因子由復(fù)雜的信號通路所控制。與血管發(fā)生有關(guān)的病理可包括癌癥(FolkmanJ.(1971)TV.五/ig/./M^T.285:1182;FolkmanJ.(1999)7Va似^3/^/.1:27-31)、動Ji^化(Lip，GY"Blann，A.D.(2004)Jw/iM^/.36(2)119-125)、4!L屑病(Powell,J.(1999)C"ir.O/;/".P^/,Wr.11:457-463)、子宮內(nèi)膜異位癥(Olive,D.L.，Lindheim,S.R"Pritts，E.A.(2004)iVfl".及仏C7/"cG戸flecC18(2)319-328)以及一些眼病例如糖尿病性視網(wǎng)膜病(FolkmanJ.(1999)A^似i^3f^/.1:27-31)。血管發(fā)生對于傷口修復(fù)可能也是必需的，這是因為新血管提供了支持活躍細胞、促進肉芽組織形成以及促使清除碎片的營養(yǎng)物。約60%的肉芽組織塊可以由血管組成，所述血管還提供了刺激修復(fù)和血管生長所必需的氧。已有充分記栽稱，血管發(fā)生因子存在于傷口滲液(woundfluid)中并促進修復(fù)，而抗血管發(fā)生因子則抑制修復(fù)。在腫瘤中，當內(nèi)皮細胞暴露于刺激血管發(fā)生的可溶性因子時，它們可經(jīng)歷多種生理變化，其包括增殖、降解以及穿過已有血管基膜的侵入大幅度增加，以及a管遷移到新位置。在新位置處，所述內(nèi)皮細胞可再次增殖并形成毛細血管，最終形成高度無組織的肺瘤脈管系統(tǒng)(GarceaLloydTD，GescherA,DennisonAR,StewardWP,BerryDP.(2004)五wr/Jun;4099):1302-13)?；罨膬?nèi)皮細胞可顯示出不同的基因表達模式，其導(dǎo)致參與血管發(fā)生的主要細胞功能的改變。這些包括蛋白水解平衡的調(diào)控(其導(dǎo)致局部的胞周基質(zhì)降解)、參與細胞外基質(zhì)相互作用的粘附分子的合成以及最重要地參與細胞遷移的細胞骨架再組織(GarceaGLloydTD,GescherA，DennisonAR,StewardWP,BerryDP.(2004)五"r/CVmc^:Jun;4099):1302-13)。新型抗血管發(fā)生化合物已顯示出抑制多種內(nèi)皮細胞標志物，已鑒定所述標志物在活化的內(nèi)皮細胞中上調(diào)。這些可包括受體、差^質(zhì)金屬蛋白和粘附蛋白。這些抑制劑的成功率已相當高。最近，新型抗血管發(fā)生化合物阿瓦斯汀(Avastin)(—種VEGF抗體)已通過FDA的批準，并且抗血管發(fā)生已被認為是用于癌癥治療的第四種形式(AbdollhiA.，HlatkyL.，HuberP.E.(2005)及^/對"wce2月-4月；8:59-74)。與常規(guī)化療相比，這些療法具有以下優(yōu)點。第一，血管發(fā)生主要是癌胚(onco-foetal)機制，因此預(yù)期施用時的副作用最小，甚至在長期治療之后也是如此。第二，與腫瘤有關(guān)的血管發(fā)生是生理宿主機制，因此對其進行藥物抑制應(yīng)該不會導(dǎo)致抗性的產(chǎn)生。最后，肺瘤塊自身難以靶向，而覆蓋于供應(yīng)性脈管系統(tǒng)內(nèi)側(cè)的內(nèi)皮細胞常常認為是易于攻擊的。促血管發(fā)生化合物也可以是治療性的。例如，可促進傷口修復(fù)的0管發(fā)生化合物包括血管發(fā)生細胞因子，例如FGF、VEGF、TGF-p、血管生成素和肥大細胞類胰蛋白酶。最近，鑒定并部分表征了一種新型多肽及其基因。該新型多肽^L命名為FKBP-L、DIR1或WISP39。該基因已證實在應(yīng)^^應(yīng)中起作用(Robson，T"Lohrer，H.，Bailie,J.R.，Hirst,D.G，Joiner,M.C,Arrand，J.E.(1997)丑,V^/ie附/ai//.rr"fisfl"/做s25,335-341)。還顯示抑制FKBP-L基因可保護細胞免受X射線和UV資導(dǎo)的氧化細胞損傷(Robson，T.，Joiner,M.C.，McCullough，W"Price,M.E.，McKeown，S.R.,Hirst,D.(i(1999)JW/flftVw152,451-461;Robson,T"Price,M.E.,Moore，M.L，Joiner,M.C.，McKelvey國Martin,V.J"McKeown,S.R"Hirst,D.G，(2000)/W./.及mftW)。FKBP-L還可以通過與p21和Hsp卯形成三聚體復(fù)合物來穩(wěn)定新合成的p21(—種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑以及細胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物)(Jascur,T.等(2005)MolecularCell,Vol.17,237-249)。需要提供可以調(diào)節(jié)血管發(fā)生以及細胞遷移的新治療劑。這些治療劑作為獨立治療或者與其它治療劑聯(lián)用可能是重要的。7發(fā)明概述本發(fā)明的實施方案涉及FKBP-L多肽用于調(diào)節(jié)血管發(fā)生和細胞遷移的用途。本發(fā)明可以多種方式實施。例如，在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L及其片段可用于調(diào)節(jié)血管發(fā)生。同時，在一些實施方案中，F(xiàn)KBP-L多肽可用于調(diào)節(jié)細胞遷移和/或腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。FKBP-L的作用可通過CD44來介導(dǎo)。因此，在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L多肽可用于調(diào)節(jié)血管發(fā)生、細胞遷移和/或表達CD44之細胞的轉(zhuǎn)移。在一些實施方案中，本發(fā)明包括治療由細胞遷移和/或血管發(fā)生和/或肺瘤轉(zhuǎn)移之至少一種所介導(dǎo)或與^M目關(guān)的疾病的方法。該方法可包括向有此需要的受試者施用治療有效量的(i)包含分離的FKBP-L多肽、FKBP-L多肽的生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段之生物活性衍生物的活性化合物，或(ii)編碼這樣的FKBP-L多肽的多核苷酸。在另一些實施方案中，本發(fā)明包括(i)包含分離的FKBP-L多肽、FKBP-L多肽的生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段之生物活性衍生物的活性化合物，或者(ii)編碼這樣的FKBP-L多肽的多核普酸、片段或衍生物在制備用于治療由細胞遷移、血管發(fā)生和/或腫瘤轉(zhuǎn)移之至少一種所介導(dǎo)或與"M目關(guān)的疾病的藥劑中的用途。本發(fā)明的另一些特征將在下文描述。應(yīng)理解，本發(fā)明在其應(yīng)用中不限于以下權(quán)利要求書、說明書和附圖中所述的細節(jié)。本發(fā)明能夠包括其它實施方案，并且能夠以多種方式實踐或?qū)嵤?。通過參照下述非限制性附圖可更好地理解本發(fā)明。圖1:圖A-C顯示根據(jù)本發(fā)明之替代性實施方案的全長FKPB-L、FKBP-L片段的替代性氨基酸序列。圖2:圖A-E顯示根據(jù)本發(fā)明之可替代實施方案的編碼FKBP-L及其某些缺失突變體和變體的多核普酸序列。8圖3顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，瞬時轉(zhuǎn)染FKBP-LcDNA(SEQIDNO:31)對于HMEC-1傷口閉合的抑制作用。圖4舉例說明了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，帶His標簽的全長FKBP-L重組多肽(SEQIDNO:1)在體外傷口閉合測定中對HMEC-1遷移之作用的劑量反應(yīng)圖。圖5舉例說明了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，帶血凝素(HA)標簽的全長FKBP-L多肽在HMEC-1細胞中活躍分泌。圖6舉例說明了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，全長FKBP-L重組多肽隨時間對HMEC-1傷口閉合的抑制作用。圖7舉例說明了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，全長FKBP-L重組多肽對Matrigd基質(zhì)基膜上HMEC-1管形成之作用的劑量反應(yīng)圖。圖8舉例說明了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，使用小鼠海綿測定(mousespongeassay)的全長重組蛋白FKBP-L對體內(nèi)血管發(fā)生的作用，其中A圖顯示單獨用牛成纖維細胞生長因子(bFGF)處理細胞，B圖顯示用bFGF和全長FKBP-L多肽處理細胞。圖9顯示根據(jù)本發(fā)明的可替代實施方案，較之單獨用bFGF治療，用bFGF和全長重組FKBP-L多肽(SEQIDNO:1)處理后可見血管數(shù)量的減少。圖10舉例說明了根據(jù)本發(fā)明的一些替代性實施方案，全長FKBP-L重組多肽對離體大鼠主動脈環(huán)外植模型的血管發(fā)生之作用的劑量反應(yīng)。圖ll顯示根據(jù)本發(fā)明的一些替代性實施方案，在MTT測定中一定濃度范圍的全長重組FKBP-L多肽在24小時后(圖A)和48小時后(圖B)對HMEC-1生存力或增殖的作用。圖12顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，暴露于全長FKBP-L重組多肽的遷移中內(nèi)皮細胞細胞骨架形態(tài)的變化，其中使用抗微管蛋白抗體對HMEC-1微管染色。圖13顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，暴露于全長FKBP-L重組多肽的遷移內(nèi)皮細胞細胞骨架形態(tài)的變化，其中使用抗波形蛋白抗體對HMEC-1中間纖維染色。圖14舉例說明了根據(jù)本發(fā)明的一些替代性實施方案，全長重組多肽FKBP-L對PC3(圖A)、MDA(圖B)和HT29(圖C)腫瘤細胞遷移的作用。圖15舉例說明了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，直接向腫瘤內(nèi)注射FKBP-LcDNA構(gòu)建體對DU145人前列腺腫瘤異種移植細胞體內(nèi)生長的作用。圖16顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，在HMEC-1和5種肺瘤細胞系DU145、PC3、HT29、MCF-7、MDA-231中細胞遷移的抑制與CD44的表達相關(guān)。圖17顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，全長重組FKBP-L對DU145(CD44-ve)(圖A)、HT29(CD44+ve)(圖B)、PC3(CD44+ve)(圖C)、MDA(CD44+ve)(圖D)和MCF-7(CD44-ve)(圖E)肺瘤細胞遷移的作用。圖18顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，通過siRNA靶向方法敲低(knock-down)PC3細胞中的CD44抑制了FKBP-L介導(dǎo)的PC3遷移抑制。圖19顯示根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，在受傷的hmec-1單層細胞中FKBP-L可以與內(nèi)源CD44相互作用。圖20舉例說明了根據(jù)本發(fā)明的可替代實施方案的FKBP-L缺失突變體，其中a圖和b圖舉例說明一些fkbp-l缺失突變體的測序結(jié)果，c圖舉例說明瞬時轉(zhuǎn)染fkbp-l缺失突變體對傷口閉合的抑制作用。圖21顯示根據(jù)本發(fā)明的一些替代性實施方案，使用傷口刮擦測定(woundscrapeassay)對全長重組FKBP-L(SEQIDNO:1)、4吳選肽FKBP-L1-57(1-57)(SEQIDNO:6)和覆蓋FKBP-L活性結(jié)構(gòu)域的FKBP-L24聚體(24聚體)(SEQIDNO:10)進行評估。圖22顯示根據(jù)本發(fā)明的可替代實施方案，在管形成測定中使用合10成基膜Matrigel對全長重組FKBP-L(SEQIDNO:1)、候選肽FKBP-L1-57(1-57)(SEQIDNO:6)和覆蓋FKBP-L活性結(jié)構(gòu)域的FKBP-L24聚體(24聚體)(SEQIDNO:10)在形成內(nèi)皮細胞間接觸中的評估。圖23顯示根據(jù)本發(fā)明的一些替代性實施方案，使用大鼠主動脈環(huán)測定，覆蓋FKBP-L活性結(jié)構(gòu)域的FKBP-L24聚體多肽(SEQIDNO:10)(A圖)和FKBP-L57聚體(SEQIDNO:6)(B圖)對血管發(fā)生萌發(fā)(angiogenicsprouting)的作用。圖24:A圖和B圖顯示根據(jù)本發(fā)明的可替代實施方案，使用大鼠主動脈環(huán)測定，覆蓋FKBP-L活性結(jié)構(gòu)域的候選肽(即FKBP-L24聚體肽，SEQIDNO:10;FKBP-L57聚體肽，SEQIDNO:6;以及帶His標簽的全長重組FKBP-L，SEQIDNO:1)對血管發(fā)生萌發(fā)的平均長度、最大長度以及血管數(shù)的作用。圖25顯示根據(jù)本發(fā)明的一些替代性實施方案，在改良的Boyden室系統(tǒng)(Boydenchambersystem)中FKBP-L24聚體(SEQIDNO:10)對內(nèi)皮細胞(HMEC-1)以及腫瘤細胞侵入(MDA231和PC3)的作用。圖26顯示根據(jù)本發(fā)明的一些替代性實施方案，F(xiàn)KBP-L24聚體(SEQIDNO:10)對內(nèi)皮細胞(HMEC-1)細胞粘附的作用。圖27顯示根據(jù)本發(fā)明的可替代實施方案，F(xiàn)KBP-L24聚體(SEQIDNO:10)對MDA-231(A圖)和PC3(B圖)腫瘤細胞遷移的作用。圖28顯示才艮據(jù)本發(fā)明的可替代實施方案，F(xiàn)KBP-L24聚體是血管發(fā)生抑制劑(angiostaticinhibitor)，其中A圖顯示在第7天加入FKBP-L24聚體的作用，B圖顯示主動脈環(huán)最初暴露于FKBP-L24聚體然后去除24聚體的實驗。圖29舉例說明了根據(jù)本發(fā)明的一些替代性實施方案，使用小鼠海綿測定，F(xiàn)KBP-L24聚體在體內(nèi)抑制血管發(fā)生；還顯示了相比于用bFGF和全長重組FKBP-L多肽(rFKBP-L)(SEQIDNO:1)或者bFGF與FKBP-L24聚體(24聚體)(SEQIDNO:10)多肽聯(lián)合處理，單獨使用bFGF處理后可見的血管數(shù)。一個實施方案，F(xiàn)KBPL24聚體肽(SEQIDNO:10)對小鼠內(nèi)皮細胞(2H-11)遷移的抑制。圖31顯示根據(jù)本發(fā)明的可替代實施方案，在每日腹膜內(nèi)注射后FKBP-L24聚體肽(SEQIDNO:IO)在體內(nèi)抑制DU145腫瘤生長(A圖)；提高存活(B、C和D圖)；以及無毒性(E圖)。圖32顯示根據(jù)本發(fā)明的一些替代性實施方案，使用MTT測定，F(xiàn)KBP-L24聚體肽(SEQIDNO:10)對HMEC-1細胞的生存力或增殖的作用。圖33顯示根據(jù)本發(fā)明的可替代實施方案，使用MTT測定，覆蓋FKBP-L活性結(jié)構(gòu)域的候選肽施用24小時(A圖)或48小時(B圖)后對HMEC-1細胞的生存力或增殖的作用。圖34:A-L圖顯示多種《務(wù)飾/截短版本的FKBP-L24聚體(經(jīng)PEG修飾的FKBP-L24聚體(肽1)、N端帶有焦谷氨酸的FKBP-L24聚體(肽2)以及截短形式的FKBP-L24聚體肽(肽3-12))的反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的一些替代性實施方案，所有這些均在體外HMEC-1傷口刮擦測定中與24聚體肽進行比較。圖35顯示根據(jù)本發(fā)明的可替代實施方案的重組FKBP-L的純化，其中A圖顯示在還原條件下進行SDSPAGE凝膠，其顯示透析之前和之后的純化重組FKBP-L蛋白(分別為l和2道)；B圖顯示用DTT處理之前和之后經(jīng)透析的重組FKBP-L之SDSPAGE的比較(3和4道)。3道是非還原樣品，4道是用50mMDTT還原的樣品。C圖顯示通過凝膠過濾進一步純化重組FKBP-L。插圖顯示使用(+)以及不使用(-)100mMDTT對凝膠過濾純化的兩個峰以及經(jīng)透析蛋白質(zhì)的非變性PAGE分析。圖36顯示根據(jù)本發(fā)明的一些替代性實施方案對重組FKBP-L的凝膠滲透色譜分析。圖37顯示根據(jù)本發(fā)明的一些替代性實施方案，在100mMDTT存在(+)和不存在(-)時重組FKBP-L的戊二醛交聯(lián)。c道是對照(無DTT)。12發(fā)明詳述定義除非另有定義，本文使用的所有科技術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的同樣含義。關(guān)于本領(lǐng)域的定義及術(shù)語，專業(yè)人員具體可參考CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel)。氨基酸殘基的縮寫是本領(lǐng)域中所用的指代20種常用L-氨基酸之一的標準3字母和/或單字母代碼。盡管本發(fā)明廣義范圍所指的數(shù)值范圍和參數(shù)均為近似值，但是對具體實施例中所涉及的數(shù)值進行盡可能精確地記載。然而，任何數(shù)值固有地包括一定的誤差，這由其相應(yīng)測量中存在的標準偏差必然所導(dǎo)致。并且，本文公開的所有范圍應(yīng)理解為涵蓋其中包含的任何及所有子范圍。例如，所記載的范圍"1至10"應(yīng)認為包含最小值1和最大值10之間(包含端點)的任何及所有子范圍；也就是說，所有以最小值l或更大值(例如1至6.1)起始的并且以最大值10或更小值(例如5.5至10)終止的子范圍。另外，任何稱作"并入本文"的參考文獻應(yīng)理解為以其整體并入。還應(yīng)注意，本說明書中使用的單數(shù)形式包含所指代物的復(fù)數(shù)含義，除非清楚且明確地限于一個所指代物。術(shù)語"或"可與術(shù)語"和/或"互換使用，除非上下文另有清楚指明。同樣地，術(shù)語"部分"和"片段"可互換使用以指代多肽、核酸或其它分子構(gòu)建體的部分。本文使用的術(shù)語"具有生物活性的FKBP-L多肽"(例如片段和/或經(jīng)修飾的多肽)用于指與全長FKBP-L多肽表現(xiàn)出相同或相似的活性大小和活性類型的多肽。在上下文中，F(xiàn)KBP-L多肽、片段或衍生物的"生物活性"包括以下任一種抗血管發(fā)生活性、抑制腫瘤細胞生長和/或增殖、抑制肺瘤細胞遷移和/或轉(zhuǎn)移?？梢允褂盟綄嵤├兴龅娜我怏w外或體內(nèi)測定來測試FKBP-L片段或衍生物較之全長FKBP-L的生物活性，所述測定例如傷口閉合或傷口刮擦測定、體外細胞遷移測定、測試細胞間粘附的Matrigel(tm)測定、小鼠海綿測定、主動脈環(huán)外植13體測定、MTT增殖測定、HMEC-1管形成測定、體內(nèi)腫瘤細胞生長測定。有關(guān)這點，可以基于殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性或親水性的相似性有意地對所述多肽進行氨基酸取代，只要保持其活性(即功能)的特異性即可。本文使用的"受試者"可以是動物。例如，所述受試者可以是哺乳動物。同樣地，所述受試者可以是人。在可替代的實施方案中，所述受試者可以是雄性或雌性。在某些實施方案中，所述受試者可以是患者，其中該患者是針對某疾病或病癥正在進行治療和/或積極尋求治療的個體。"多肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用以描述可包括部分或全長蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)分子。術(shù)語"肽"用于指短于全長的蛋白質(zhì)或者非常短的蛋白質(zhì)，除非上下文另有所指。如本領(lǐng)域已知的，"蛋白質(zhì)"、"肽"、"多肽，，和"寡肽"是氨基酸(通常是L-氨基酸)鏈，其中所述氨基酸的a碳通過一個氨基酸a碳的羧基與另一氨基酸a碳的氨基之間的縮合反應(yīng)形成肽鍵而鍵合。通常，對構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸按順序進行編號，從氨基端殘基起始，朝所述蛋白質(zhì)的羧基端殘基方向增加。本文使用的術(shù)語"上游"當所述分子是蛋白質(zhì)時指另一殘基N端的殘基，或者當所述分子是核酸時指另一殘基5，端的殘基。同樣地，本文使用的術(shù)語"下游"當所述分子是蛋白質(zhì)時指另一殘基C端的殘基，或者當所述分子是核酸時指另一殘基3，端的殘基。"核酸"是指多核普酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。該術(shù)語用于包括單鏈核酸、雙鏈核酸以及由核苷酸或核苷類4以物構(gòu)成的RNA和DNA。術(shù)語"栽體"是指可用于將另一核酸分子遞送進細胞的核酸分子。在一個實施方案中，所述載體允許插入該栽體中的DNA序列復(fù)制。所述載體可包含啟動子以在至少某些宿主細胞中增強該核酸分子的表達。栽體可自主復(fù)制(染色體外)或者可整合進宿主細胞染色體。在一個實施方案中，所述載體可包括表達載體，其能夠產(chǎn)生來源于插入所述栽體的核酸序列之至少一部分的蛋白質(zhì)。如本領(lǐng)域已知地，使核酸序列彼此雜交的條件可以描述為低至高嚴謹度。一般地，高嚴謹度雜交條件指在高溫下用低鹽緩沖液清洗雜交物。可以使用本領(lǐng)域標準的雜交溶液(如0.5MNaHPO4、7%十二烷基硫酸鈉(SDS))在65。C進行與濾膜結(jié)合的DNA雜交，用0.25MNaHPO4、3.5。/。SDS清洗，然后在室溫至68。C范圍內(nèi)(取決于探針長度)的溫度下用O.lxSSC/0.1%SDS清洗(參見，例如Ausubel，F(xiàn).M.等，S/ioWiVotoo/s/"A/o/"w/at丑,Wogy，4thEd.，Chapter2，JohnWiley&Sons,N.Y)。例如，高嚴謹度清洗包括用6xSSC/0.05。/。焦磷酸鈉清洗，其中對于14個堿基的寡核苷酸探針來說在37'C下，或者對于17個堿基的寡核苷酸探針來說在48'C下，或者對于20個堿基的寡核苷酸來說在55'C下，或者對于25個堿基的寡核普酸探針來說在60'C下，或者對于約250個核苷酸的核苷酸探針來說在65。C下?？梢杂梅派湫院塑账嵬ㄟ^末端標記(例如使用Y;P!ATP)來標記核酸探針，或者通過隨機引物標記來摻入放射性標記的核普酸(如[a-"PdCTP)?；蛘?，可以通過摻入生物素化的或熒光素標記的核苷酸來標記探針，并使用鏈霉親和素或抗熒光素抗體來檢測探針。術(shù)語"同一性，，或"一致性百分比"是指兩個氨基酸序列之間或兩個核酸序列之間的序列同一性。可以通過比對兩個序列來確定同一性百分比，所謂同一性百分比是指與所比較序列共有位置處相同殘基(即氨基酸或核苷酸)的數(shù)目?？墒褂帽绢I(lǐng)域的標準算法(例如Smith和Waterman,1981，爿dv.J/;/;/.J/"^.2:482;Needleman和Wunsch，1970，/AM5iV/.48:443;Pearson和Lipman，1988，/Vw.胸/.Jaw/.5H，C/5L4，85:2444)或者通過這些算法的可作為BLAST和FASTA公開獲得的計算機化版本(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0，GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,WI)進行序列比對和比較。另夕卜，可從國立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth,BethesdaMD)獲得的ENTREZ可用于序列比較。當使用BLAST和缺口BLAST程序(GappedBLASTprogram)時，可使用各程序(例如BLASTN，可從美國國家生物技術(shù)信息中心的網(wǎng)站上獲得)的默認參數(shù)。在一個實施方案中，可使用GCG來確定兩個序列的同一性百分比，其中缺口權(quán)重為1，從而給予每個氨基酸缺口的權(quán)重如同兩個序列間單一氨基酸不15匹配一般?；蛘?，可使用ALIGN程序(2.0版)，其是GCG(Accelrys，SanDiego，CA)序列比對軟件包中的一部分。包含受體或配體的蛋白質(zhì)之結(jié)合特性可表示為結(jié)合特異性，所述結(jié)合特異性可通過測量與結(jié)合于該受體之其它已知物質(zhì)的相對值來確定。用于對結(jié)合定量以及確定結(jié)合親和力的標準測定是本領(lǐng)域已知的并包括例如平衡透析、平衡結(jié)合、凝膠過濾、表面等離子共振、帶標記結(jié)合伴侶的使用、ELISA和間接結(jié)合測定(例如竟爭性抑制測定)。例如，如本領(lǐng)域公知的，可以通過將蛋白質(zhì)與結(jié)合伴侶進行接觸并測量結(jié)合的和游離的蛋白質(zhì)的濃度作為其濃度函數(shù)來測定所述蛋白質(zhì)的解離常數(shù)。本文使用的術(shù)語"保守殘基"是指在具有相同結(jié)構(gòu)和/或功能的多個蛋白質(zhì)之間相同的氨基酸。保守殘基區(qū)域?qū)τ诘鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能可能是重要的。因此，在三維立體蛋白質(zhì)中所鑒定的毗鄰保守殘基對于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能可能是重要的。為了找到保守殘基或3-D結(jié)構(gòu)的保守區(qū)域，可以對來自不同物種或相同物種不同個體之相同或相似蛋白質(zhì)的序列進行比較。當涉及氨基酸或核苷酸序列時，本文使用的術(shù)語"相似"或"同源"意為多肽與該野生型氨基酸序列具有一定程度的同源性或同一性。同源性比較可以通過肉眼進行，或者更常用地借助于易獲得的序列比較程序。這些市售的計算機程序可以計算兩個或多個序列之間的同源性百分比(例如Wilbur,W.J.和Lipman，D.J.，1983，/VociVarf.Jo^.￡/5^4，80:726-730)。例如，在替代性的實施方案中，同源序列可包括彼此間具有至少70%同一性、75°/。同一性、8(T/。同一性、85%同一性、卯％同一性、95%同一性、96%同一性、97%同一性或98%同一性的氨基酸序列。本文使用的術(shù)語"與其具有至少90%的同一性"包括與所指序列具有90~99.99%同一性范圍內(nèi)的序列，并包含其間的所有范圍。因此，術(shù)語"與其具有至少90°/。同一性"包括與所指序列具有91%、91.5%、92%、92.5%、93%、93.5%、94%、94.5%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%同一性的序列。類似地，術(shù)語"至少70%同一性"包括具有70~99.99%同一性的序列，其包含其間的所有范圍。使用本文所述的算法來確定同一性百分比。16本文使用的多肽或蛋白質(zhì)"結(jié)構(gòu)域"包含多肽或蛋白質(zhì)上含有獨立單元的區(qū)域。結(jié)構(gòu)域可以用結(jié)構(gòu)、序列和/或生物活性來進行定義。在一個實施方案中，多肽結(jié)構(gòu)域可包含以基本上與該蛋白質(zhì)其余部分獨立的方式進行折疊的蛋白質(zhì)區(qū)域?？梢允褂媒Y(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫來鑒定結(jié)構(gòu)域，所述數(shù)據(jù)庫例如但不限于PFAM、PRODOM、PROSITE、BLOCKS、PRINTS、SBASE、ISRECPROFILES、SAMRT和PROCLASS'本文使用的術(shù)語"相連"表示兩個不同基團(例如核酸序列、多肽、多肽結(jié)構(gòu)域)之間的共價連接，所勤目連的兩個不同基團之間可以具有插入的原子。本文使用的"直接相連"表示兩個不同基團(例如核i^列、多肽、多肽結(jié)構(gòu)域)之間的共價連接，所勤目連的兩個不同基團之間不存在插入的原子。本文使用的"配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域"是指負責(zé)結(jié)合配體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。術(shù)語"配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域"包括配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的同源物或其部分。關(guān)于這點，可以基于殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性或親水性的相似性而有意地在配體結(jié)合位點上進行JL^酸取代，只要保留所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性即可。本文使用的"配體結(jié)合位點"包含直接與配^M目互作用的蛋白質(zhì)殘基，或者參與配體定位到緊鄰與該配體直接相互作用之殘基的戎基?？梢酝ㄟ^模型或結(jié)構(gòu)中所述殘基與配體的空間接近度來定義所述配體結(jié)合位點中殘基的相互作用。術(shù)語"配體結(jié)合位點"包括配體結(jié)合位點的同源物或其部分。關(guān)于這點，可以基于殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性或親水性的相似性而有意地在配體結(jié)合位點上進行M酸取代，只M留所述配體結(jié)合位點的結(jié)合特異性即可。配體結(jié)合位點可存在于蛋白質(zhì)或多肽的一個或多個配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中。本文使用的術(shù)語"相互作用"是指兩個分子之間或單個分子的某些部分(例如肽中的不同結(jié)構(gòu)域)之間的接近狀態(tài)。該相互作用可以是非共價的(例如，由于氫鍵、范德華力相互作用或者靜電或疏水相互作用所致)，或者可以是共價的。本文使用的"配體"是指與配體結(jié)合位點相互作用的分子或化合物或?qū)嶓w，其包括底物或者其類似物或部分。本文所述的術(shù)語"配體"可以指與目的蛋白結(jié)合的化合物。配體可以是激動劑、拮抗劑或調(diào)節(jié)劑?；蛘?，配體可以不具有生物學(xué)效應(yīng)?；蛘?，配體可以阻止其它配體結(jié)合，從而抑制生物學(xué)效應(yīng)。配體可包括但不僅限于小分子抑制劑。這些小分子可包括肽、模擬肽、有機化合物等。配體還可包括多肽和/或蛋白質(zhì)。本文使用的"調(diào)節(jié)"是指改變目的分子的生物活性。"調(diào)節(jié)劑"化合物可以提高或降低目的分子的活性，或者改變其物理或化學(xué)特征，或者其功能或免疫學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑化合物可包括天然的和/或化學(xué)合成或人工的FKBP-L肽、模擬肽、經(jīng)修飾肽(例如磷酸肽、環(huán)肽(cyclicpeptide)、含有D-和非天然氨基酸的肽、合成肽(stapledpeptide)、含ii射性標記的肽)、或者與抗體、碳水化合物、單糖、寡糖、多糖、糖脂、雜環(huán)化合物、核苷或核苷酸或其部分和/或有機或無機小分子(例如經(jīng)PEG或其它穩(wěn)定化基團修飾的肽)的肽。因此，本發(fā)明的FKBP-L多肽還包含經(jīng)化學(xué)修飾的肽或者異構(gòu)體和外消旋形式。"激動劑"包括與受體結(jié)合、形成引發(fā)該所涉及受體特異性的藥理學(xué)反應(yīng)之復(fù)合物的化合物。"拮抗劑"包括與激動劑或受體結(jié)合以形成復(fù)合物的化合物，所迷復(fù)合物不產(chǎn)生顯著的藥理學(xué)反應(yīng)，并且可抑制由激動劑誘導(dǎo)的生物學(xué)反應(yīng)。術(shù)語"模擬肽"是指在分子間相互作用中用作肽替代物的結(jié)構(gòu)(Morgan等，1989,及e/^"sM^/.C7^附.，24:243-252)。模擬肽可包含合成結(jié)構(gòu)，該合成結(jié)構(gòu)可含有或不含氨基酸和/或肽鍵但保留了肽、激動劑或拮抗劑的結(jié)構(gòu)和功能特征。模擬肽還包括擬肽(peptoid)、寡聚類肽(oligopeptoid)(Simon等，1972，7V"汰JcflASc/"1/54，89:9367)以及含有所設(shè)計長度之肽的肽文庫(其代表了對應(yīng)于本發(fā)明的肽、激動劑或拮抗劑的所有可能氨基酸序列)。本文使用的術(shù)語"EC50"定義為產(chǎn)生50%所測量生物學(xué)效應(yīng)的藥劑濃度。例如，具有可測量生物學(xué)效應(yīng)的治療劑的EC50值可包括該藥劑顯示50%生物學(xué)效應(yīng)時的值。本文使用的術(shù)語"IC50"定義為導(dǎo)致所測量效應(yīng)抑制50%的藥劑濃度。例如，拮抗劑結(jié)合的IC50值可包括該拮抗劑將配體與配體結(jié)合位點的結(jié)合降低50%時的值。本文使用的"有效量"是指在受試者中有效產(chǎn)生預(yù)期效應(yīng)的藥劑的量。術(shù)語"治療有效量"表示會引發(fā)動物或人中所期望的治療效應(yīng)的藥物或藥劑的量。包括有效量的實際劑量可取決于施用途徑、受試者體型和健康狀況、所治療的疾病等。本文使用的術(shù)語"可藥用載體"可指適用于人或動物受試者的化合物和組合物，例如，適于施用來治療目的疾病或病癥的治療性組合物。本文使用的術(shù)語"藥用組合物"是指可例如經(jīng)口、胃腸外、局部、通過吸入噴霧、鼻內(nèi)或直腸而施用給哺乳動物宿主的組合物，其釆用包含常規(guī)非毒性栽體、稀釋劑、輔藥、栽體等的單位劑量制劑。本文使用的術(shù)語"胃腸外"包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腦池內(nèi)注射或輸注技術(shù)。"穩(wěn)定的"制劑是指其中的多肽或蛋白質(zhì)在保存后基本保持其物理和化學(xué)穩(wěn)定性以及生物活性的制劑。用于測量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的多種分析技術(shù)在本領(lǐng)域中可獲得，并且綜述于PeptideandProteinDrugDelivery,247-301，VincentLeeEd.，MarcelDekker，Inc.,NewYork,N.Y"Pubs.(1991)以及Jones，A.Adv.DrugDeliveryRev.10:29-卯(1993)?？梢栽谒x溫度下所選時間段內(nèi)測定穩(wěn)定性。對于快速篩選來說，可以將目的制劑保持在40'Cl周至1個月，在此時間測量穩(wěn)定性?？墒褂脙龈珊捅４婧蟮木奂潭茸鳛殡暮?或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的指標。例如，"穩(wěn)定的"制劑是指制劑中少于約10%、優(yōu)選少于約5%的多肽或蛋白質(zhì)以聚集體形式存在?？梢詼y定凍干和凍干制劑保存后聚集體形成的增加。例如，"穩(wěn)定的"凍干制劑可以是當所述凍干制劑在40'C下孵育至少一周時，該凍干制劑中聚集體增加低于約5%或低于約3%?？梢允褂蒙锘钚詼y定(例如本文所述的結(jié)合測定)來測量融合蛋白制劑的穩(wěn)定性。FKBP-L多肽作為細胞遷移、血管發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)劑本發(fā)明發(fā)現(xiàn)FKBP-L、FKBP-L片段和經(jīng)修飾的FKBP-L及其片段可抑制細胞遷移，并且可具有有效的血管發(fā)生調(diào)節(jié)性質(zhì)。本發(fā)明的實施19方案涉及源自FKBP-L的肽及其用途。本發(fā)明可以多種方式實施。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的FKBP-L多肽可顯示抗血管發(fā)生的性質(zhì)。同時，在某些實施方案中，本發(fā)明的FKBP-L多肽可用于調(diào)節(jié)細胞遷移和/或肺瘤細胞轉(zhuǎn)移。在某些實施方案中，本發(fā)明FKBP-L多肽的作用可由CD44來介導(dǎo)。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L多肽可用于調(diào)節(jié)血管發(fā)生、細胞遷移和/或表達CD44之細胞的轉(zhuǎn)移。在某些實施方案中，本發(fā)明可用于治療細胞遷移介導(dǎo)的或與其相關(guān)的疾病。例如，可使用FKBP-L肽來抑制或?qū)鼓[瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。或者，在一些實施方案中，可使用FKBP-L肽來抑制參與傷口愈合之細胞的遷移。在另一些實施方案中，可使用FKBP-L肽來抑制血管發(fā)生從而治療血管發(fā)生所介導(dǎo)的疾病。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明包括治療由細胞遷移、血管發(fā)生或腫瘤轉(zhuǎn)移中至少一種所介導(dǎo)的或與其相關(guān)的疾病的方法，其中該方法包括向有此需要的患者施用治療有效量的(i)活性化合物，其包括分離的FKBP-L多肽或FKBP-L多肽的生物活性片段、或者FKBP-L多肽或其片段的生物活性衍生物，或者(ii)編碼上述FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明包括調(diào)節(jié)血管發(fā)生或腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括向有此需要的受試者施用治療有效量的活性化合物，所述活性化合物包括分離的FKBP-L多肽或FKBP-L多肽的生物活性片段、或者FKBP-L多肽或其片段的生物活性衍生物，或者編碼上述FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸。在另一些實施方案中，本發(fā)明包括(i)活性化合物，其包括分離的FKBP-L多肽或FKBP-L多肽的生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段的生物活性衍生物，或者(ii)編碼上述FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸在制備用于治療由細胞遷移和/或血管發(fā)生至少之一所介導(dǎo)或與其相關(guān)之疾病的組合物或藥劑中的用途。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明包括(i)活性化合物，其包括分離的FKBP-L多肽或FKBP-L多肽的生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段的生物活性衍生物，或20者(ii)編碼上述FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸在制備用作血管發(fā)生抑制劑的藥劑中的用途?？墒褂帽景l(fā)明的組合物和/或藥劑來治療由血管發(fā)生和/或細胞遷移所介導(dǎo)或與其相關(guān)的多種疾病。因此，在可替代的實施方案中，所述藥劑可用于治療血管發(fā)生相關(guān)炎癥、血管發(fā)生所介導(dǎo)的眼病、傷口愈合或癌癥之至少一種。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明包括(i)活性化合物，其包括分離的FKBP-L多肽或FKBP-L多肽的生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段的生物活性衍生物，或者(ii)編碼上述FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸在制備用于治療血管發(fā)生相關(guān)炎癥之藥劑中的用途。在另一些實施方案中，血管發(fā)生相關(guān)疾病是眼病例如黃斑變性以及本文所述的其它眼病。或者，血管發(fā)生相關(guān)疾病是動脈硬化、關(guān)節(jié)炎、銀屑病或子宮內(nèi)膜異位癥。因此，在替代性的實施方案中，本發(fā)明提供了治療眼病、動脈硬化、關(guān)節(jié)炎、銀屑病或子宮內(nèi)膜異位癥之至少一種的方法，該方法包括向有此需要的受試者施用治療有效量的活性化合物(其包括分離的FKBP-L多肽、FKBP-L多肽的生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段的生物活性衍生物)或者編碼上述FKBP-L多肽、片段或其衍生物的多核普酸?；蛘撸景l(fā)明可包括(i)活性化合物，其包括分離的FKBP-L多肽或FKBP-L多肽的生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段的生物活性衍生物，或者(ii)編碼此FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸在制備用于治療血管發(fā)生所介導(dǎo)眼病之藥劑中的用途。例如，在替代性的實施方案中，所述FKBP-L肽或多核普酸可用于制備治療黃斑變性疾病或糖尿病性視網(wǎng)膜病的藥劑。或者，本發(fā)明可包括(i)活性化合物，其包括分離的FKBP-L多肽或FKBP-L多肽的生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段的生物活性衍生物，或者(ii)編碼上述FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸在制備用于治療動脈硬化、關(guān)節(jié)炎、銀屑病或子宮內(nèi)膜異位癥之至少一種的藥劑中的用途。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了治療癌癥的方法。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，其包括施用治療有效量的活性化合物(其包括分離的FKBP-L多肽、FKBP-L多肽的生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段的生物活性衍生物)或者編碼上述FKBP-L多肽、片段或其衍生物的多核苷酸用來治療癌癥、抑制腫瘤細胞遷移和/或轉(zhuǎn)移、或抑制腫瘤細胞生長和/或增殖中至少之一。在一個實施方案中，通過抑制血管發(fā)生來抑制腫瘤細胞遷移和轉(zhuǎn)移。例如，本發(fā)明可包括(i)活性化合物，其包括分離的FKBP-L多肽或FKBP-L多肽的生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段的生物活性衍生物，或者(ii)編碼上述FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸在制備用于治療癌癥之藥劑中的用途。在某些實施方案中，本發(fā)明的化合物和組合物可阻止腫瘤細胞生長和/或轉(zhuǎn)移。在一個實施方案中，通過抑制血管發(fā)生來抑制腫瘤細胞的遷移和轉(zhuǎn)移。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明可包括(i)活性化合物，其包括分離的FKBP-L多肽或FKBP-L多肽的生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段的生物活性衍生物，或者(ii)編碼上述FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸在制備用作腫瘤細胞遷移和/或轉(zhuǎn)移抑制劑之藥劑中的用途。在另一些實施方案中，本發(fā)明可包括(i)活性化合物，其包括分離的FKBP-L多肽或FKBP-L多肽的生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段的生物活性衍生物，或者(ii)編碼上述FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸在制備用作肺瘤細胞生長和/或增殖抑制劑之藥劑中的用途。在本說明書中，表述FKBP-L多肽以其廣義含義使用。它是指SEQIDNO:1、2和29所示的天然存在蛋白質(zhì)以及保留其血管發(fā)生調(diào)節(jié)活性的由多態(tài)性導(dǎo)致的同源物、所述多肽的其它變體、突變體以及部分。例如，在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L多肽包括帶有N端序列(參見圖l所示SEQIDNO:1中粗體的氨基酸殘基)的SEQIDNO:1，其包含與該蛋白質(zhì)N端連接的六個組氨酸殘基的多組氨酸標簽，或者在野生型序列第181位為蘇氨酸和第186位為甘氨酸的SEQIDNO:2?；蛘?，可以使用SEQIDNO:29多肽(GENBank編號No.NPJ)71393;NM_022110;gi:34304364)。本發(fā)明其它FKBP-L多肽的構(gòu)建體實例(例如A段和其它修飾)示于圖l。另外，在圖2中提供了編碼FKBP-L多JIM^建體的多核苷酸構(gòu)建體實例。本發(fā)明的實施方案包括將分離的FKBP-L多肽或FKBP-L多肽的生物活性片段、或者上述FKBP-L多肽或其片段的生物活性衍生物用作藥劑。因此，本發(fā)明的一些替代性實施方案包括本文所述FKBP-L肽或編碼FKBP-L肽之核苷酸的用途，其中所述FKBP-L多肽包含SEQIDNO:IO所示的氨基酸序列、或者SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:29所示的氨基酸序列，或者SEQIDNO:3至7或11至28任一項所示的氨基酸序列，或者與SEQIDNO:1至29任一項所示氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列?；蛘?，可使用包含SEQIDNO:10之至少18個毗鄰氨基酸的序列(例如SEQIDNO:11、16、23)。除非另有指明，本文中提及顯示為經(jīng)修飾的肽(及其用途X例如SEQIDNO:12、13和28)應(yīng)理解為涵蓋不帶有所列修飾的相同氨基酸序列的肽(及其用途)。如本文所述，本發(fā)明的方法和組合物可使用全長FKBP-L多肽或該多肽的片段。因此，本發(fā)明的某些實施方案包括FKBP-L衍生物，其包含天然存在的FKBP-L之N端氨基酸序列的有效部分，或由其組成。該序列可包含F(xiàn)KBP-L多肽的N端活性部分，或由其組成。在一些替代性的實施方案中，所述多肽可包含SEQIDNO:2的1至57位氨基酸(即SEQIDNO:6)或SEQIDNO:2的34-57位氨基酸(即SEQIDNO:10)，或由其組成?；蛘?，所述肽可包含含有SEQIDNO:10的至少18個窗比鄰氨基酸的序列(例如SEQIDNO:11、16或23)，或由其組成。在替代性的實施方案中，本發(fā)明方法和組合物中使用的多肽可包含SEQIDNO:1-7、10-29中任一項所示氨基酸序列之一，或由其組成。在某些實施方案中，本發(fā)明包含F(xiàn)KBP-L的生物活性片段，其中所述多肽包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:29所示氨基酸序列的不超過200個連續(xù)氨基酸。如本文所述，可以對所述肽進行修飾(例如使之含有PEG和/或His標簽或其它修飾)。或者，本發(fā)明可包含與SEQIDNO:1-29任一項所示氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、卯％、95%、96%、97%、98%或99%同一性之序列的分離多肽?；蛘?，用于制備藥劑的所述分離多肽或肽可包含與SEQIDNO:10的至少18個敗鄰^J^酸具有至少70%、75%、80%、85%、卯％、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列(例如SEQIDNO:11、16、23)，或由其組成。本發(fā)明的FKBP-L衍生物可具有不同的長度，只要它保留其抗血23管發(fā)生/促血管發(fā)生活性并可根據(jù)上述本發(fā)明各方面進行使用即可。本發(fā)明還涵蓋了FKBP-L的功能等同物。例如，在某些實施方案中，功能等同物可包含能夠結(jié)合CD44和/或阻止配體(例如MIF)與含CD44和CD74的復(fù)合物結(jié)合的小分子，或由其組成?；蛘?，功能等同物可包含以類似于FKBP-L及其肽衍生物的方式作用來抑制細胞遷移、血管發(fā)生和/或轉(zhuǎn)移中至少一種的小分子，或由其組成。施用FKBP-L多肽的劑量可根據(jù)所治療的疾病而變化。在一些替代性的實施方案中，體內(nèi)達到的劑量將等同于大于10—12M、IO-"M、lO—"*M、10-9M、l(T8M、1(T7M、l(T6M或10—5M的體外水平。因此，體內(nèi)達到的劑量可等同于10-12M~-1(T5M、10_11M~-1(T6M、10"°M~-l(T7M、10—9M-10〃或其中之范圍的體外水平。在一些替代性的實施方案中，所使用的劑量可等同于約1-10000ngml1、約10-5000ngml"或約100-1000ngml4的體外水平。或者，在某些實施方案中，所述劑量可包括約0.00001~500mg/kg/天、約0.0001~300mg/kg/天、約0.003~100mg/kg/天、約0.03~30mg/kg/天、約0.1mg/kg/天~10mg/kg/天或約0.3mg/kg/天~3mg/kg/天。在一個實施方案中，將所述FKBP-L多肽施用給有此需要的受試者。本文使用的"有此需要的受試者"是可以從施用FKBP-L中受益的受試者。在另一些實施方案中，本發(fā)明包括編碼包含SEQIDNO:l-29任一分子，以及這些分子用于制備藥劑和/或作為治療劑的用途。在一個實施方案中，生物活性片段包含SEQIDNO:10的至少18個班比鄰氨基酸(例如SEQIDNO:ll、16、23)，或由其組成。例如，本發(fā)明的實施方案包括多核苷酸的用途，所述多核苷酸編碼FKBP-L肽、FKBP-L肽的生物活性片段或其生物活性衍生物，其中編碼所述FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸包括SEQIDNO:30-39任一項所示的核苷酸序列。另外，本發(fā)明包含編碼FKBP-L肽的分離核酸。所述核酸分子可包括具有SEQIDNO:30-39所示序列的核酸分子或其片段，其中所述核酸分子編碼具有SEQIDNO:l-28所示序列的多肽，或這些多肽的片24段。在一個實施方案中，片段包含SEQIDNO:IO的至少18個毗鄰氨基酸(例如SEQIDNO:11、16、23)，或由其組成。在某些實施方案中，可使用簡并核酸分子來編碼本發(fā)明的FKBP-L多肽、片段和/或衍生物，所述簡并核酸分子包含氨基酸密碼子第三位的簡并改變從而使該筒并序列編碼相同的氨基酸。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明可包含具有與SEQIDNO:30-39所示序列具有至少70%、75%、80%、85%、卯％、95°/。、96%、97%、98。/?；?9%同一性的序列的分離核酸分子或其片段。本發(fā)明還包括可用于產(chǎn)生SEQIDNO:31之多核苷酸片段的引物，其中該片段編碼圖l所示的FKBP-L肽。因此，在一些替代性的實施方案中，本發(fā)明包括寡核普酸引物，其包含SEQIDNO:45-58所示序列或與其具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的序列。在又一些實施方案中，本發(fā)明包括含有本發(fā)明分離核酸分子的載體。在某些實施方案中，本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)染了這些載體從而表達FKBP-L多肽的細胞。這些實施方案在本文中有更詳細地描述。在又一些實施方案中，本發(fā)明包括與FKBP-L基因編碼鏈或其部分反義的分離核酸分子，以及這些分子用于制備藥劑和/或作為治療劑的用途。因此，在又一實施方案中，本發(fā)明包括與編碼本發(fā)明FKBP-L多肽mRNA編碼鏈反義的核酸序列具有至少70°/。、75%、80%、85%、卯％、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核香酸。在某些實施方案中，所述反義分子可用于有利地促i^J&L管發(fā)生和/或細胞遷移，以及用于治療由血管發(fā)生或細胞遷移之至少一種所介導(dǎo)或與其相關(guān)的疾病。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明包括能夠特異性下調(diào)FKBP-L表達的反義寡核苷酸或siRNA在制備用作促進血管發(fā)生之調(diào)節(jié)劑的藥劑中的用途。同樣，在某些實施方案中，本發(fā)明包括能夠特異性下調(diào)FKBP-L表達的反義寡核苷酸或siRNA在制備用作促進血細胞生成或血管發(fā)生至少一種之調(diào)節(jié)劑的藥劑中的用途。在一個實施方案中，本發(fā)明包括能夠特異性下調(diào)FKBP-L表達的反義寡核苷酸或siRNA在制備用于促進傷口愈合的藥劑中的用途。另外，本發(fā)明還可包括能夠特異性下調(diào)FKBP-L表達的反義寡核苷酸或siRNA在制備用于治療消化性潰瘍、骨折或瘢痕疙疼至少一種之藥劑中的用途。在另一些實施方案中，本發(fā)明可包括能夠特異性下調(diào)FKBP-L表達的反義寡核普酸或siRNA在制備用于治療血管發(fā)生所介導(dǎo)的牙周炎(pardentitis)或牙周病(periodontopathy)的藥劑中的用途。在另一些實施方案中，本發(fā)明可包括能夠特異性下調(diào)FKBP-L表達的反義寡核苷酸或siRNA在制備用于治療或調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)(例如排卵、月經(jīng)(mestruation)和胎盤形成)的藥劑上的用途。在又一些實施方案中，本發(fā)明可包括能夠特異性下調(diào)FKBP-L表達的反義寡核苷酸或siRNA在制備用于治療或調(diào)節(jié)腦和神經(jīng)系統(tǒng)中功能紊亂(例如中風(fēng)所引起的)的藥劑中的用途。因此，能夠特異性下調(diào)FKBP-L表達的反義寡核苷酸或siRNA可用于治療某些類型的癡呆和/或精神發(fā)育i^。本發(fā)明某些實施方案的另外方面在下文中更詳細地加以討論。FKBP-L調(diào)節(jié)細胞遷移、血管發(fā)生和轉(zhuǎn)移在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L及其片段可用于調(diào)節(jié)血管發(fā)生。在一個實施方案中，F(xiàn)KBP-L或其片段可用于抑制血管發(fā)生。例如，用FKBP-L轉(zhuǎn)染細胞可抑制內(nèi)皮細胞遷移和血管發(fā)生(圖3)，這表明FKBP-L蛋白是潛在的抗遷移蛋白。圖4中顯示了FKBP-L對細胞遷移的劑量依賴效應(yīng)。因此，可以看出l(T6M劑量的帶His標簽的全長FKBP-L有效阻止細胞遷移。在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L可從某些類型的細胞如內(nèi)皮細胞(圖5)和腫瘤細胞分泌。因此，在一個實施方案中，F(xiàn)KBP-L的抗血管發(fā)生作用可能是通過受體活化來實現(xiàn)的。FKBP-L從內(nèi)皮細胞分泌表明，施用FKBP-L蛋白或用cDNA構(gòu)建體過表達FKBP-L都可能能夠發(fā)揮在體外和體內(nèi)均觀察到的抗血管發(fā)生作用。在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L顯示出在生理相關(guān)時間段內(nèi)對細胞遷移的作用。例如，用帶His標簽的全長重組FKBP-L多肽(SEQIDNO:1)處理的HMEC-1細胞可表現(xiàn)出減慢的傷口閉合(多達2至3天)(圖6)。因此，可根據(jù)需要施用FKBP-L蛋白數(shù)小時、數(shù)天或數(shù)周以抑制細胞遷移和/或血管發(fā)生。26在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L對細胞遷移和/或血管發(fā)生的作用可對于受細胞遷移和/或血管發(fā)生影響的任何細胞有效。因此，如本文實施例中詳細描述地，全長重組FKBP-L(例如SEQIDNO:1)在寬劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出在多種血管發(fā)生模型中的抗遷移作用，所述模型包括HMEC-1傷口閉合(圖3、4和6)以及HMEC-1管形成(圖7)、小鼠海綿測定(圖8、9A和9B)以及主動脈環(huán)外植體模型(圖10)。另外，在一個實施方案中，F(xiàn)KBP-L對細胞運動和/或血管發(fā)生的作用并非由該化合物的毒性所致。因此，當細胞暴露于重組全長FKBP-L多至48小時時可能沒有毒性跡象(圖11A和11B)。FKBP-L作用于細胞可能有多種機制。在一個實施方案中，F(xiàn)KBP-L介導(dǎo)遷移抑制的機制可能是針對細胞骨架(圖12和13)。例如，在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L可導(dǎo)致細胞骨架纖維的破壞或其它改變。FKBP-L的抗血管發(fā)生作用表明FKBP-L可具有抗腫瘤生成和/或抗轉(zhuǎn)移活性。例如，如圖14中的A、B和C圖所示，全長重組FKBP-L多肽可以劑量依賴性方式抑制腫瘤細胞遷移，這表明FKBP-L可用作治療劑，用于減少依賴于遷移而轉(zhuǎn)移的肺瘤細胞侵襲和肺瘤細胞轉(zhuǎn)移。在某些實施方案中，通過基因治療用編碼全長FKBP-L多肽的表達構(gòu)建體在體內(nèi)治療腫瘤(圖15)使腫瘤生長減少。FKBP-L與參與血管發(fā)生的基因的相互作用FKBP-L可調(diào)節(jié)多種生化途徑。在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L可導(dǎo)致某些與血管發(fā)生和/或細胞遷移有關(guān)的基因表達增加。例如，在某些實施方案中，用反義FKBP-L核酸轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致PI3K、RhoGTP酶激活蛋白攀寡膈蛋白(oligophrenin)1、ROCK、微管相關(guān)蛋白1B、MMP樣1蛋白和/或TNF配體超家族成員1蛋白表達的增加(參見本文實施例12)。已知提高的RhoA、RhoC、ROCKI和ROCKII表達與肺瘤發(fā)展相關(guān)，并且已提示Rho和ROCK信號途徑促成某些腫瘤細胞發(fā)生形態(tài)變化和轉(zhuǎn)移行為。因此，在某些實施方案中，過表達FKBP-L可抑制血管發(fā)生，而使用反義寡核苷酸對FKBP-L進行抑制可通過激活與血管發(fā)生相關(guān)的基因(例如Rho和ROCK)來促進血管發(fā)生。FKBP-L與CD44的相互作用CD74在抗原呈遞細胞中表達。CD74的主要功能是細胞內(nèi)分選MHCII類分子。CD74表達于腎、肺、胃和胸腺來源的腫瘤上并由某些肉瘤所表達。另外，CD74可響應(yīng)于某些肺瘤基因而表達。例如，視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白可增強乳癌系中INF-Y所誘導(dǎo)的CD74表面表達。因此，CD74在正常組織中的受限表達及其快速內(nèi)化可使CD74成為癌癥和免疫疾病的吸引人的治療劑。巨虔細胞抑制因子(macrophageinhibitoryfactor,MIF)也可參與腫瘤發(fā)生。人肺瘤中可見高水平的MIF，其與分級和預(yù)后有關(guān)。另外，MIF可通過Rho依賴性途徑參與血管發(fā)生、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移(Amin等，2006，Blood,107:2252-2261;Ren等，2006,Oncogene,25:3501-3508;Sun等，2005，Clin.CancerRes"11:1050-1058;Sun等,2003，Int.J.Mol.Med.12:633-641)。MIF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過與CD74的結(jié)合而起始(Leng等，2003，J.Exp.Med.，197:1467-1476)。還認為CD74的激活需要與CD44的相互作用(Naujokas等，1993，Cell,74:257-268;以及Naujokas等，1995,Immunity,3:359-372)。已顯示MIF與CD74和CD44在復(fù)合物中相互作用，并且^制該復(fù)合物導(dǎo)致膀胱癌細胞增殖減少(Meyer-Siegler等，2004,BMCCancer,July12;4:34;也參見Leng等，2006，CellRes"16:162-168)。MIF、CD44和CD74之間形成復(fù)合物對于MIF介導(dǎo)的生物信號途徑是重要的(Shi等，Immunity,2006，25(4):595-606)。在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L可通過與CD44相互作用來發(fā)揮作用。在一個實施方案中，F(xiàn)KBP-L可結(jié)合CD44并阻止CD44與CD74的相互作用。如果FKBP-L或其部分能夠從CD44上取代CD74，則FKBP-L多肽可阻止CD44-CD74-MIF復(fù)合物的形成，而該復(fù)合物是MIF誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的?；蛘?，在另一些實施方案中，F(xiàn)KBP-L可通過替代機制起作用。CD44被認為在大多數(shù)上皮細胞中表達，并提示其參與血管發(fā)生(Cao等，2006，Am.J.Pathol.,169:325-336)。因此，在一個實施方案中，CD44可能是FKBP-L抑制內(nèi)皮細胞遷移和/或血管發(fā)生所必需的。另夕卜，在一個實施方案中，CD44可能是FKBP-L抑制腫瘤細胞遷移所必需的。28因此，如圖16和17A-17E所示，在某些實施方案中，全長重組FKBP-L可在表達CD44的肺瘤細胞系(即CD44陽性或CD44+ve)中抑制腫瘤細胞遷移，而在CD44陰性(CD44-ve)腫瘤細胞系中不抑制，這提示FKBP-L可在CD44陽性胂瘤細胞系的亞群中抑制肺瘤遷移。HMEC-1細胞也是CD44陽性的(未顯示)。在一個實施方案中，CD44的失活(例如使用CD44特異性的siRNA)導(dǎo)致阻止了FKBP-L介導(dǎo)的腫瘤細胞遷移的抑制(例如圖18)，這表明CD44可能參與FKBP-L抑制胖瘤細胞遷移和/或轉(zhuǎn)移。在一個實施方案中，F(xiàn)KBP-L可直接與CD44相互作用。例如，在受傷的單層細胞中外源性地過表達的FKBP-L(例如由SEQIDNO:31產(chǎn)生的SEQIDNO:1)可與內(nèi)源CD44相互作用(圖19，實施例16)。在一個實施方案中，在未受傷的單層細胞中內(nèi)源FKBP-L和CD44之間沒有顯著相互作用，這提示需要表達明顯水平的FKBP-L才可檢測到與CD44的相互作用。另外，該相互作用可能僅發(fā)生在引發(fā)遷移的內(nèi)皮細胞(即受傷的單層細胞)中。因此，在一些實施方案中，全長FKBP-L針對CD44陽性微血管內(nèi)皮細胞有活性(圖16)，因此可靶向?qū)嶓w瘤內(nèi)的這些細胞從而阻止進一步的微血管生長支持腫瘤生長。同樣地，F(xiàn)KBP-L可乾向脈管系統(tǒng)而非具體的腫瘤類型，并且可活躍地抗大部分(如果不是全部的話)實體腫瘤以及微轉(zhuǎn)移。另外，如下文更詳細討論地，F(xiàn)KBP-L肽顯示類似的活性。例如，F(xiàn)KBP-L的34-57位氨基酸(即FKBP-L"24聚體")、FKBP-L的1-57位氨基酸(即FKBP-L的"1-57聚體")以及另一些來自FKBP-L蛋白N端的FKBP-L肽可抑制表達CD44之胖瘤細胞的遷移。因此，F(xiàn)KBPL多肽及其衍生物可抑制內(nèi)皮細胞遷移和/或肺瘤細胞遷移，暗示以與FKBP-L和CD44相互作用一致的方式抑制血管發(fā)生和侵襲。FKBP-L片段本發(fā)明的實施方案表明FKBP-L蛋白的N端某些區(qū)域可表現(xiàn)出生物活性。因此，在某些實施方案中，表達全長野生型(WT)FKBP-L的表達構(gòu)建體(或者在一些替代性實施方案中，表達截短的突變體(例如但不限于A48、A58、A86、A151、A200))可抑制傷口閉合(圖20)。這些構(gòu)建體之每一個的氨基酸序列示于圖1。例如，在某些實施方案中，29WT-FKBP-L和A58分別抑制傷口閉合36.2%和48.8%?？赡艽嬖诨钚运璧淖钚⌒蛄?。例如，在某些實施方案中，截短的FKBP-LA34可能無法顯著抑制傷口閉合，這提示該突變體中缺失了活性結(jié)構(gòu)域。因此，這些實驗可能表明，活性結(jié)構(gòu)域位于全長FKBP-L(例如SEQIDNO:2)的34位和57位氨基酸之間。因此，如圖20A-20C所示，在某些實施方案中，對抗血管發(fā)生活性重要的結(jié)構(gòu)域可能位于FKBP-L的34位和57位氨基酸之間(即N端)'在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L在34位和57位氨基酸之間的部分顯示出與全長FKBP-L相同的生物活性。在一些實施方案中，F(xiàn)KBP-L24聚體可顯示出比全長FKBP-L更強的效力。例如，針對抑制內(nèi)皮細胞遷移/傷口閉合(圖21)、在Matrigel管形成測定中抑制內(nèi)皮細胞間接觸形成(圖22)、血管發(fā)生萌發(fā)(圖23A、23B、24A和24B)、細胞侵襲的能力(圖25)和/或細胞粘附的能力(圖26)方面，F(xiàn)KBP-L24聚體肽(SEQIDNO:10)可顯示出較之全長重組FKBP-L(例如SEQIDNO:1)相似或更強的生物活性。然而，在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L24聚體和FKBP-L1-57聚體表現(xiàn)出較之全長FKBP-L更強的效力(參見例如圖21、22和24)。在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L的生物活性可需要CD44。例如，F(xiàn)KBP-L24聚體肽(SEQIDNO:10)可以與全長重組FKBP畫L(rFKBP-L)相似的方式起作用，并抑制MDA-231和PC3腫瘤細胞遷移。這些肺瘤細胞都是CD44陽性的(CD44+ve)(即表達CD44蛋白)(圖27A和27B)，這表明FKBP-L24聚體可能能夠抑制CD44+ve肺瘤細胞系亞群中的腫瘤轉(zhuǎn)移。在一個實施方案中，F(xiàn)KBP-L及其衍生物可抑制腫瘤細胞遷移和侵襲以及內(nèi)皮細胞遷移，其方式與FKBP-L和CD44相互作用的方式一致。另外，在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L24聚體肽(SEQIDNO:10)是血管發(fā)生抑制劑(圖28A和28B)。因此，當血管成熟或新嵌入時，F(xiàn)KBP-L24聚體可抑制血管發(fā)育。但是，在一個實施方案中，F(xiàn)KBP-L多肽可通過抑制機制來起作用，當被加入時其阻止血管發(fā)育，但是當其被除去時卻沒有或很少有殘留效應(yīng)。另外，在某些實施方案中，使用小鼠海綿測定，F(xiàn)KBP-L24聚體在寬劑量范圍內(nèi)抑制體內(nèi)血管發(fā)生(圖29)，也抑制體外小鼠內(nèi)皮細胞遷移(圖30)，這表明這種人的肽在小鼠中也有活性。這由圖29和31中提供的數(shù)據(jù)所支持。類似于全長FKBP-L蛋白，在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L24聚體肽(SEQIDNO:10)可在體內(nèi)抑制肺瘤細胞生長(圖31A)。另外，用FKBP-L24聚體處理的小鼠顯示出顯著增加的存活率(圖31B-D)。因此，如圖31A所示，與僅用載體處理的肺瘤相比，以0.3mg/kg/天或3xl(T3mg/kg/天的劑量腹膜內(nèi)注射24聚體FKBP-L肽的處理顯著減慢了SCID小鼠中DU145肺瘤的生長。在一個實施方案中，用這些劑量的24聚體FKBP-L肽處理的肺瘤顯示壞死中心的跡象，而這是抗血管發(fā)生的典型效應(yīng)。在一個實施方案中，如同全長FKBP-L—樣，F(xiàn)KBP-L24聚體肽的活性不是由于該肽的毒性所致(圖31E、32和33)。在某些實施方案中，可使用FKBP-L24聚體肽的部分或片段(SEQIDNO:10)作為治療劑。實施例29(圖34)提供了FKBP-L24聚體的肽片段實例，其可與FKBP-L24、FKBP-L1-57和全長FKBP-L具有相似的活性和效力。FKBP-L衍生物如上所述，用于本發(fā)明的FKBP-L衍生物是指通過改變FKBP-L氨基酸序列(例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:29)進行修飾的多肽或其片段，或者與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98°/?；?9%同一性的多肽，或者通過添加官能團(例如PEG)進行修飾的這些肽?？梢酝ㄟ^操作編碼所述多肽的核酸或者通過改變所述蛋白質(zhì)自身來產(chǎn)生這些肽。在SEQIDNO:2(即FKBP-L插入片段(最初由CambridgeBioscience克隆進PUC18中，現(xiàn)克隆進pcDNA3.1中))中，其與PUBMED數(shù)據(jù)庫中所示序列(SEQIDNO:29)相比具有兩個插入點突變。其中一個點突變位于540bp(從起始密碼子算起)從TCT變?yōu)锳CT,因而絲氨酸(S)變成蘇氨酸(T)(第181位氨基酸)。另一點突變位于555bp(從起始密碼子算起)從AGG變?yōu)镚GG,因而精氨酸(R)變成甘氨酸(G)(第186位氨基酸)。這兩種FKBP-L多肽(SEQIDNO:2和SEQIDNO:29)都表現(xiàn)出生物活性。FKBP-L衍生物包括天然FKBP-L氨基酸序列的類似物，并且可包含一個或多個氨基酸的插入、添加、缺失和/或取代，同時提供了與對應(yīng)于截短突變體(A48(SEQIDNO:7)、A58(SEQIDNO:6)、A86(SEQIDNO:5)、A151(SEQIDNO:4)或A200(SEQIDNO:3))的部分具有相似的血管發(fā)生作用的多肽(圖1)。本發(fā)明的FKBP-L衍生物還包括來源于A58(SEQIDNO:6)的多肽，其包括圖1所示的FKBP國L24聚體(SEQIDNO:10)和肽1隱17(SEQIDNO:12-28)。因此，在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L的N端結(jié)構(gòu)域(34-57位氨基酸)對抗血管發(fā)生特性是重要的。圖20C和實施例17顯示了多種FKBP-L片段與時間匹配的陰性對照在抑制細胞遷移有效性方面的比較研究。在一個實施方案中，A58片段在所測試片段中顯示出最大的抑制活性。提供血管發(fā)生抑制的FKBP-L多肽部分可能存在于具有活性的肽A48(SEQIDNO:7)與A58(SEQIDNO:6)共有的FKBP-L部分的多肽中。這樣的多肽可包含SEQIDNO:10(圖1)。因此，本發(fā)明方法和組合物中使用的FKBP-L衍生物還包括天然存在的FKBP-L的片段、部分或突變體。在某些實施方案中，所述片段選自FKBP-L的N端結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，所述片段選自全長FKBP-L的1至85位氨基酸(例如SEQIDNO:2或29)。優(yōu)選地，這些類似物包括5個或更少、優(yōu)選4個或更少、更優(yōu)選3個或更少、最優(yōu)選僅l或2個氨基酸的插入、添加、缺失和/或取代。根據(jù)本發(fā)明的FKBP-L衍生物還包括多聚體肽(其包括所述FKBP-L多肽、類似物或片段序列，例如SEQIDNO:1-7、SEQIDNO:10-28)以及包含這些序列的前藥。例如，在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L或FKBP-L片段可通過單體間形成二硫鍵來形成多聚體。32本發(fā)明的FKBP-L多肽衍生物可包括與偶聯(lián)伴侶相連的多肽，所述偶聯(lián)伴侶例如效應(yīng)物分子、標記物、藥物、毒素和/或栽體或運載分子。將本發(fā)明多肽與肽基和非肽基偶聯(lián)伴侶相偶聯(lián)的技術(shù)都是本領(lǐng)域公知的。FKBP-L多肽的"片段"是指至少6個氨基酸的氨基酸殘基段。本發(fā)明的FKBP-L衍生物包括融合肽。例如，衍生物可包括與例如抗體相連的本發(fā)明肽或多肽，所述抗體將所述肽靶向到患病組織(例如腫瘤組織或視網(wǎng)膜)。FKBP-L多肽或其類似物可與免疫球蛋白(IgA、IgE、IgG、IgM)的恒定區(qū)或其部分(CH1、CH2、CH3或其任意組合)融合，得到嵌合多肽。這些融合多肽或蛋白質(zhì)可有利于純化，并且可顯示增加的體內(nèi)半衰期。這些融合蛋白可以比單獨的單體多肽或其片段更有效的結(jié)合以及中和其它分子。參見例如Fountoulakis等，J.Biochem.，270:3958-3964(1995)。本發(fā)明的融合蛋白還包括與白蛋白(例如重組的人血清白蛋白或其片段或變體)融合的FKBP-L多肽(參見，例如美國專利No.5876969，歐洲專利0413622和美國專利No.5766883)。本發(fā)明還涵蓋了編碼本文所述這些融合蛋白之多核苷酸的用途。與細胞毒性劑融合的多核苷酸之用途也涵蓋在本發(fā)明中。在該實例中，F(xiàn)KBP-L多肽可結(jié)合受體，由此細胞毒性藥物可以被內(nèi)化。例如，在一些替代性實施方案中，衍生物可包括肽的位點特異性PEG化(或類似的)以增加半衰期；或者摻入非天然氨基酸以及修飾骨架以增強其對抗蛋白水解的穩(wěn)定性；或者環(huán)化衍生物(以提供蛋白水解抗性)；或者封閉N端和C端以阻止或減少外肽酶和/或蛋白酶活性；或者通過使用接頭鏈在毗鄰鏈中或者以分枝形式將多個拷貝的肽連接在一起，以增加與細胞表面CD44的"親合力"。例如24聚體的三聚共價連掩時生物可用作FKBP-L的衍生物?；蛘?，可以將FKBP-L24聚體連接至可同源三聚化而形成非共價三聚體的結(jié)構(gòu)域?；蛘撸瑫c鏈霉親和素形成四聚復(fù)合物的肽之生物素衍生物可用作FKBP-L衍生物?；蛘?，F(xiàn)KBP-L或FKBP-L片段可通過單體間形成二石克鍵來形成多聚體。另外，F(xiàn)KBP-L可通過非共價結(jié)合形成寡聚體，其可能通過所述蛋白質(zhì)序列中預(yù)測的三十四肽重復(fù)(tetratricopeptiderepeat)結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)。反向肽類似物用于本發(fā)明的類似物還包括天然FKBP-L蛋白、其部分或其合成衍生物的反向或逆向類4以物(reverse-orretro-analogue)。參見，介寸如EP0497366，U.S.5,519，115，和Merrifield等，1995，PNAS，92:3449-53，其公開內(nèi)^ii過參考并入本文。如EP0497366中所述，通過顛倒天然存在或合成肽的JL&酸序列而產(chǎn)生反向肽。這些反向肽可保留與親本JIM目同的總體三維結(jié)構(gòu)(例如a螺旋)，但是內(nèi)部蛋白S^:感位點附近的構(gòu)象以及N端和C端的特征除外。反向肽號稱不僅保留非反向"正常"肽的生物活性，還可具有增強的特性(其包括提高的生物活性)。(參見Iwahori等，1997，Biol.Pharm.Bull.20:267-70)。因此，用于本發(fā)明的衍生物可包括天然和合成FKBP-L蛋白的反向肽?？赏耆虿糠滞ㄟ^化學(xué)合成或通it^核^達來產(chǎn)生用于本發(fā)明的肽(包括反向肽以及任一片段)?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的完善的標準液相或優(yōu)選固相肽合成方法容易地制備用于本發(fā)明的肽(參見，例如J.M.Stewart和J.D.Young，SolidPhasePeptideSynthesis,第2版,PierceChemicalCompany,Rockford，Illinois(1984),inM.Bodanzsky和A.Bodanzsky,ThePracticeofPeptideSynthesis,SpringerVerlag,NewYork(1984))。多聚肽如上所述，所述肽可取用多聚體形式。因此，本發(fā)明的范圍包括2、3或更多個單獨FKBP-L多肽單體單元或者兩個或更多個FKBP-L片段的多聚物。在一個實施方案中，這些多聚體可用于制備單體肽，其通過制備包含所述單體單元和可切割位點(即酶促切割位點)的多聚肽然后將該多聚體切割以產(chǎn)生所需單體來實現(xiàn)。在一個實施方案中，多聚體的使用可增加對受體的結(jié)合親合力。所述多聚體可以是同聚體(homomer)或雜聚體(heteromer)。本文使用的術(shù)語"同聚體"是指僅含有對應(yīng)于本文所述特定氨基酸序列(例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:IO或SEQIDNO:29)或變體、剪接變體、融合蛋白或其它FKBP-L類似物或衍生物的多肽的多聚體。這些同聚體可包含具有相同或不同氨基酸序列的FKBP-L肽。例如，所述多聚體可僅包含具有相同氨基酸序列的FKBP-L肽，或者可包含不同的氨基酸序列。所迷多聚體可以是同二聚體(例如僅含有FKBP-L肽，其可具有相同或不同的氨基酸序列)、同三聚體或同四聚體。本文使用的術(shù)語"雜聚體"是指除本文所述FKBP-L(多)肽之外還包含一個或多個異源多肽(即非FKBP-L肽或多肽)的多聚體。所述多聚體可以是疏水、親水、離子和/或共價相互作用的結(jié)果和/或可以通過例如形成脂質(zhì)體而間接相連。因此，在一個實施方案中，當本文所述的FKBP-L肽在溶液中彼此接觸時形成多聚體。在另一實施方案中，當FKBP-L和非FKBP-L(多)肽在溶液中接觸本文所述(多)肽的抗體(其包括針對本文所述融合蛋白中異源(多)肽序列的抗體)時形成異源多聚體。在另一些實施方案中，可通過與本文所述FKBP-L肽(以及任選地非FKBP-L肽)和/或所述FKBP-L肽之間的共價結(jié)合來形成本文所述的多聚體。這些共價相互作用可包括FKBP-L序列中所含的一個或多個氨基酸殘基(例如SEQIDNO:1-28所記載的)。在一個實施方案中，所述共價結(jié)合是化學(xué)或重組操作的結(jié)果。或者，這些共價結(jié)合可包含F(xiàn)KBP-L融合蛋白中異源多肽序列內(nèi)含有的一個或多個氨基酸殘基。在一個實施例中，共價結(jié)合來自本文所述融合蛋白中所含異源序列之間(參見例如美國專利No.5478925)。在另一具體的實施例中，本文所述融合蛋白的共價結(jié)合是使用來自另一能夠形成共價結(jié)合多聚體之蛋白(例如骨保護素，參見例如國際^^開No:WO98/49305)的異源多肽序列。在另一實施方案中，本文所述的兩個或更多個多肽通過肽接頭相連。實例包括美國專利No.5073627中所述的肽接頭。可以使用常規(guī)重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生包含由肽接頭所分隔之多個FKBP-L肽的蛋白質(zhì)。還可以通過將FKBP-L(多)肽與亮氨酸拉鏈或異亮氨酸拉鏈多的亮氨酸拉鏈中有二聚化或三聚化的天然存在肽及其衍生物。適于產(chǎn)生本文所述可溶性多聚蛋白質(zhì)的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的實例有PCT申請WO94/10308中所述的那些。包含與在溶液中二聚化或三聚化的多肽序列融合的本文所述多肽的重組融合蛋白可以在合適的宿主細胞中表達，并且可以使用本領(lǐng)域已知技術(shù)從培養(yǎng)物上清回收所得可溶多聚融合蛋白。還可以使用本領(lǐng)域已知的化學(xué)技術(shù)來產(chǎn)生所述多聚體。例如，可以使用本領(lǐng)域已知的接頭分子和接頭分子長度優(yōu)化技術(shù)對包含在本文所述多聚體中的多肽進行化學(xué)交聯(lián)(參見例如美國專利No.5478925)。另外，可以使用本領(lǐng)域已知技術(shù)，以在位于預(yù)期包含在多聚體中的多肽序列內(nèi)的半胱氨酸殘基之間形成一個或多個分子間交聯(lián)來產(chǎn)生所述多聚體(參見例如美國專利No.5478925)。另外，本文所述多肽可以通過在該多肽的C端或N端添加半胱氨酸或生物素來進行常規(guī)修飾，本領(lǐng)域已知的技術(shù)可用于產(chǎn)生含有一個或多個這些經(jīng)修飾多肽的多聚體(參見例如美國專利No.5478925)。另外，可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來制備含有預(yù)期包含在所述多聚體中的兩個或更多個C-12-C肽的脂質(zhì)體(參見例如美國專利No.5478925)。或者，可以使用本領(lǐng)域已知的遺傳工程技術(shù)形成那些僅包含天然存在氨基酸的多聚體。作為替代，可通過重組技術(shù)和化學(xué)修飾的組合來制備那些包含翻譯后或其它修飾的多聚體。在一個實施方案中，使用本文所述的融合蛋白技術(shù)或本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)來重組產(chǎn)生FKBP-L肽(參見例如美國專利No.5478925，其通過參考以整體并入本文)。例如，可以通過將編碼本文所述FKBP-L肽的多核苷酸序列與編碼接頭多肽的序列連接，然后再與編碼反向(從最初的C端至N端方向)的多肽翻譯產(chǎn)物的合成多核苷酸(缺少前導(dǎo)序列)連接，以產(chǎn)生編碼本文所述同二聚體的多核苷酸(參見例如美國專利No.5478925)。本文所述重組技術(shù)或本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)可用于產(chǎn)生含有跨膜結(jié)構(gòu)域(或疏水肽，或信號肽)的重組FKBP-L(多)肽，該肽可通過膜重建技術(shù)被摻入到脂質(zhì)體中(參見例如美國專利No.5478925)。前藥至少在一些實施方案中，本文所述的多肽意欲施用給人或其它哺36乳動物來治療或預(yù)防與血管發(fā)生相關(guān)的疾病。肽通常經(jīng)胃腸外施用，例如通過靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)注射或者經(jīng)由鼻腔內(nèi)施用，并且其可容易地被血漿蛋白酶所代謝。在一些情況下，F(xiàn)KBP-L肽可在聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(poly(DL-lactide-co-glycolide))微膠嚢中受控釋放超過30天進行遞送。已開發(fā)了多種前藥以實現(xiàn)胃腸外和經(jīng)口施用治療肽?？梢詫㈦幕蚨嚯呐c多種部分(例如多聚部分)相綴合，以改變肽藥物的理化特性(例如增加對酸和酶降解的抗性以及增強這些藥物穿透粘膜的透過性)。例如，Abuchowski和Davis描述了多種對酶進行衍生化以提供水溶性的、非免疫原性的、在體內(nèi)穩(wěn)定化的產(chǎn)物的方法("Solublepolymers-Enzymeadducts,"EnzymesasDrugs,Eds.Holcenberg和Roberts,J.Wiley和Sons,NewYork,N.Y.(1981))。因此，在某些實施方案中，可以將FKBP-L肽與聚合物(例如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、聚乙二醇和聚氨基酸)綴合。所得綴合多肽保留了其生物活性以及用于胃腸外施用的水溶性。在一個實施方案中，所述FKBP-L肽可以與分子量為500~20，000道爾頓的聚乙二醇或聚丙二醇偶聯(lián)，以提供具有生理活性、非免疫原性、水溶性的多肽組合物(參見例如美國專利No.4,179,337和Garman，A丄和Kalindjian，S.B.，尸五Ay丄e汰，1987，223，361-365)。聚乙二醇或聚丙二醇可保護所述多肽免受活性損失，并且可將所述組合物注射入哺乳動物循環(huán)系統(tǒng)中，而基本上沒有免疫原性應(yīng)答。在另一些實施方案中，F(xiàn)KBP-L與包含親酯性和親水性部分的寡聚體偶聯(lián)(參見例如美國專利No.5681811、5438040和5359030)。可例如通過首先從多分散的MPEG5000制備順丁烯二酸酐試劑、然后將該試劑與本文所公開的多肽進行偶聯(lián)來制備前藥。氨基酸與順丁烯二酸酐的反應(yīng)是公知的。鄰近游離羧基的存在以及雙鍵所建立的攻擊構(gòu)形有助于馬來基-酰胺鍵的水解從而改良含有胺的藥物。在生理條件下所述肽可被釋放(通過前藥的水解來實現(xiàn))。所述多肽還可以通過可降解的連接與聚合物(例如多分散的PEG)偶聯(lián)，所述可降解的連接如Roberts,M.J.等,^^uDn^De/iVeiji^v.,2002，54，459-476中所示(針對聚乙二醇化的干擾素a-2b所述)。所述多肽還可與聚合物(例如PEG)相連，其使用1,6或1,4爺基消除(benzylelimination,BE)策略(參見例如Lee,S.等,5"co"yw^^C7^附"(2001)，12,163-169;Gree鼎ald，R.B.等,美國專利No.6，180，095，2001/Greenwald,R.B.等，J.Med.Chem.，1999，42，3657-3667);使用三甲基鎖內(nèi)酯化(trimethyllocklactonization，TML)(Greenwald，R.B，等,J.Med.Chem.,2000，43，475-487);PEG羧酸與末端是羥基的羧酸接頭偶聯(lián)(Roberts,M.J.，J.Pharm.Sci"1998，87(11)，1440-1445)以及包含通過氨基甲酸芳基酯與含胺藥物連接的MPEG苯基醚和MPEG苯甲酰胺家族的PEG前藥(Roberts,M丄等，Adv.DrugDeliveryRev"2002，54，459-476)，其包括在氨基甲酸酯與PEG酰胺或醚之間含有間位關(guān)系的前藥結(jié)構(gòu)(Bently等的美國專利No.6413507);以及涉及與水解機制相反的還原機制的前^(Zalipsky,S.等，BioconjugateChem.，1999,10(5)，703-707)。本發(fā)明的FKBP-L多肽具有游離的^、酰氬基、羥基和/或氛基，這些官能團可用于將所述肽轉(zhuǎn)化為前藥。前藥包括下述化合物，所述化合多種聚合物(例如聚亞烷基二醇，如聚乙二醇)的游離氨基、羥基或g相連。前藥還包括下述化合物，其中所述化合物中PEG、碳酸酯、氨基曱酸酯、酰胺和烷基酯通過C端羧酸與上述肽共價鍵合。例如，本文使用的肽1是具有C端PEG基團的FKBP-L肽。因此，本發(fā)明的實施方案包括位點特異性的PEG添加。在某些實施方案中，可使用酶抑制劑來減慢蛋白質(zhì)和肽在胃腸道中的降解速率。或者，可調(diào)節(jié)消化道中的pH以4吏局部的消化酶失活?；蛘?，可使用透過增強劑來通過增加肽的細胞旁轉(zhuǎn)運和跨細胞轉(zhuǎn)運而提高肽的吸收?；蛘?，可使用納米顆粒作為微粒載體以促進腸上皮(尤其是派爾集合淋巴結(jié)(Peyer，spatch))的完好吸收，并增加對酶降解的抗性。在另一些實施方案中，可使用液體乳劑來保護所述藥物免受腸腔中的化學(xué)分解和酶分解，或者可使用微團制劑用于7jC難溶性藥物。因此，在一些替代性實施方案中，可以在具有腸衣的合適膠嚢或片劑中提供所述多肽，使得所述肽不在胃中釋放。作為替代地，或另外地，所述多肽可作為前藥拔_供，例如上文所述的前藥。在一個實施方案中，所38述多肽作為前藥存在于這些藥物遞送裝置中。包含本發(fā)明多肽的前藥或者從其中釋放或可釋放本發(fā)明肽(包括類似物和片段)的前藥被認為是本發(fā)明的類似物。本發(fā)明還涵蓋同位素標記的肽或肽前藥的用途。這樣的肽或肽前藥與本發(fā)明的肽或肽前藥是一致的，只是一個或多個原子被原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同于天然常見原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)的原子所替代?？蓳饺氡景l(fā)明化合物中的同位素實例有氫、碳、氮、氧、磷、疏、氟、碘和氯的同位素，分別例如2H、3H、13C、"C、15N、180、170、125I和35S。本發(fā)明的多肽、其前藥和/或含有前述同位素和/或其它原子之同位素的前藥在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明中某些同位素標記化合物(例如摻入了放射性同位素如3H和14C的化合物)可用于藥物和/或底物的組織分布測定。氚(即3H)和碳-14(即"C)同位素由于其制備和檢測的簡便而特別優(yōu)選。另外，用較重的同位素(例如氘，即2H)取代可提供由較高代謝穩(wěn)定性所導(dǎo)致的某些治療優(yōu)點，例如體內(nèi)半衰期增加或者劑量需求減小，因此在一些情況下是優(yōu)選的。通常可通過實施容易獲知的步驟來制備同位素標記的肽及其前藥，所述步驟包括用容易獲得的同位素標記之試劑(例如經(jīng)標記的氨基酸)來取代非同位素標記的試劑。核酸可通過使用表達系統(tǒng)中的核酸產(chǎn)生本發(fā)明中使用的肽。例如，在一個方面，可用于本發(fā)明的核酸包括任何編碼本發(fā)明多肽的分離多核苷酸。在一個優(yōu)選實施方案中，所述多核苷酸包含SEQIDNO:30-39(圖2)所示的任一核酸序列。編碼FKBP-L其它片段的序列(例如SEQIDNo:10-28)可來源于所述全長核酸序列，并包含如本領(lǐng)域已知的簡并核酸序列。實施例1、2和17提供了對可用于表達本發(fā)明FKBP-L多肽的載體的描述。編碼本發(fā)明所使用FKBP-L多肽的核酸分子可包含DNA或RNA。所述核酸構(gòu)建體可以重組、合成方法或本領(lǐng)域可用的任何方法(包括使用標準技術(shù)進行克隆)來產(chǎn)生?？梢詫⑺龊怂岱肿硬迦肴魏魏线m載體中。包含本發(fā)明核酸的載體形成本發(fā)明的另一方面。在一個實施方案中，所述栽體是表達載體，可使用多種載體。例如，合適的載體可包括病毒(例如痘病毒、腺病毒、桿狀病毒等)；酵母載體、噬菌體、染色體、人工染色體、質(zhì)粒、粘粒DNA和脂質(zhì)體、多聚物(polyplex)或細胞(例如間充質(zhì)干細胞、巨噬細胞)。可使用所述載體將本發(fā)明核酸引入宿主細胞。許多種宿主細胞均可用于表達本發(fā)明的核酸。適用于本發(fā)明的宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。它們包括細菌(例如大腸桿菌)、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞?？墒褂玫牟溉閯游锛毎蛋ǖ幌抻谥袊鴤}鼠卵巢(CHO)細胞、幼倉鼠腎細胞、NSO小鼠黑素瘤細胞、猴和人細胞系及其衍生細胞系等?？墒褂谜{(diào)節(jié)基因產(chǎn)物表達、修飾和/或特異性加工基因產(chǎn)物的宿主細胞林。這些加工可包括糖基化、泛素化、二硫鍵形成以及一般的翻譯后修飾。關(guān)于涉及對核酸進行操作(例如，核酸構(gòu)建體的制備、誘變、測序、將DNA引入細胞和基因表達)以及蛋白質(zhì)分析的已知技術(shù)和方案的更多詳情，參見例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2版，Ausubel等eds"JohnWiley&Sons,1992以及MolecularCloning:aLaboratoryManual:第3版Sambrook等,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2000。藥物組合物本發(fā)明還提供了包含F(xiàn)KBP-L多肽(或者編碼FKBP-L多肽的核酸)的藥物組合物。除了活性成分之外，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物以及根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物可包含可藥用的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的物質(zhì)。這些物質(zhì)應(yīng)為無毒的，并且不應(yīng)干擾所述活性成分的效力。所述載體或其它物質(zhì)的確切性質(zhì)將取決于施用途徑，所述施用途徑例如可以是經(jīng)口、靜脈內(nèi)或局部。所述制劑可以是液體，例如含有pH6.8-7.6的非磷酸緩沖液的生理鹽溶液或者凍干粉末。劑量所述組合物優(yōu)選以"治療有效量"施用給個體，該治療有效量足以表現(xiàn)出其對所述個體的益處。實際施用量以及施用的速率和時程將取決于所治療疾病的性質(zhì)和嚴重程度。治療處方(例如對劑量的決定等)最終由全科醫(yī)生及其它醫(yī)生來負責(zé)及作出判斷，通常考慮所治療的疾病、患者個體的情況、遞送部位、施用方法以及醫(yī)生已知的其它因素。在一些替代性實施方案中，F(xiàn)KBPL24聚體的劑量范圍是30mg/kg/天~0.00003mg/kg/天，或者3mg/kg/天~0.0003mg/kg/天，或者0.3mg/kg/天~0.03mg/kg/天。這些劑量分別等同于在體外的105M~1012M，或106M~IO"M，或107M~1010M。施用A.FKBP國L肽本發(fā)明中的多肽以及本發(fā)明所使用的多肽可以單獨施用，但優(yōu)選地作為藥物組合物來施用，所述藥物組合物通常包含取決于所計劃施用途徑選擇的合適的藥物賦形劑、稀釋劑或載體?？梢酝ㄟ^任何適當?shù)耐緩綄⒍嚯氖┯媒o有治療需要的患者。精確劑量將取決于多種因素，包括所述多肽的確切性質(zhì)。一些合適的施用途徑包括(但不限于)口服、直腸、鼻、局部(包括口腔和舌下)、皮下、陰道或胃腸外(包括皮下、肌肉、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)和硬膜外)施用。對于靜脈內(nèi)注射以及在病患處注射來說，活性成分將釆用可胃腸外使用的水溶液形式，其不含熱源并具有合適的pH值、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域中相關(guān)技術(shù)人員使用例如等滲載體(如氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringer'sInjection)，乳酸林格氏注射液)完全能夠制備適合的溶液。需要時，可包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或41另外的添加劑?？诜┯玫乃幬锝M合物可以是片劑、膠嚢、粉劑或液體形式。片劑可包含固體載體，如明膠或輔藥。液體藥物組合物通常包含液體載體，如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。也可以包含生理鹽溶液、葡萄糖或其它糖溶液或者二醇類(如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)。還可以通過微球、脂質(zhì)體、另一些微粒遞送系統(tǒng)或置于某些組織(包括血液)中的持續(xù)釋放制劑來施用所述組合物。合適的持續(xù)釋放載體的實例包括采用共用物品(sharedarticle)形式的半透性聚合物基質(zhì)，如栓劑或微膠嚢?？芍踩氲幕蛭⒛z嚢的持續(xù)釋放基質(zhì)包括L-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸酯的聚交酯(美國專利NO.3773919;歐洲A-0058481)共聚物(Sidman等，Biopolymers22(1):547-556,1985)、聚(2-幾乙基-異丁烯酸酯或乙烯-醋酸乙烯酯(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15:167-277,1981,以及Langer,Chem.Tech.12:98-105，1982)。包含多肽的脂質(zhì)體可利用^S知方法制備DE3，218，121A;Epstein等，PNASUSA,82:3688-3692，1985;Hwang等，PNASUSA,77:4030-4034,1980;EP-A-0052522;E畫A-0036676;EP畫A-0088046;EP-A國0143949;EP-A匪0142541;JP-A-83-11808;美國專利No4,485,045和4,544,545。通常，脂質(zhì)體為小的(約200-800埃)單層狀，其中脂含量大于約30mol。/。膽固醇，所選比例根據(jù)多肽滲漏最優(yōu)速率進行調(diào)整。上述技術(shù)和方案的實例以及可用于本發(fā)明的其它技術(shù)和方案可參見Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版,Oslo,A.(ed),1980。還可以通過利用乾向系統(tǒng)(如抗體或細胞特異性配體)而使用靶向治療來更特異性地遞送活性劑(例如多肽)至腫瘤組織或視網(wǎng)膜組織。在另一些實施方案中，可利用試劑來處理純化的重組或合成肽，以便將能夠促進交聯(lián)的結(jié)構(gòu)部分與所述蛋白質(zhì)連接。這些結(jié)構(gòu)部分可以是可光活化交聯(lián)劑(例如二苯甲酮)或化學(xué)交聯(lián)劑(如馬來酰亞胺或活化酯)。因此，例如有可能使FKBPL中的半胱氨酸殘基與二苯甲酮的馬來酰亞胺衍生物或用于可光活化交聯(lián)的苯基疊氮化合物的馬來耽亞胺衍生物反應(yīng)，或者與含有例如馬來酰亞胺和活化酯的雜雙功能交聯(lián)劑反應(yīng)。如本領(lǐng)域已知的，存在多種可與FKBPL連接的雜雙功能交聯(lián)劑和同雙功能交聯(lián)劑，其可用于通過酰胺、硫醚、腙、肟等形成反應(yīng)與其它生物分子交聯(lián)。在一個實施方案中，有可能全部使用化學(xué)合成步驟以位點特異性方式將這些交聯(lián)劑引入合成肽中。或者，可以將可光活化基團特異性地引入c端，或者可使用蛋白連接方法以特異性方式將交聯(lián)劑引入重組FKBPL中。如本文更詳細描述地，還可以與其它治療劑一起施用FKBP-L肽。B.編碼FKBP-L或反義/siRNAFKBP-L的核酸在一個實施方案中，將FKBP-L多肽的編碼序列或核酸插入表達載體中。然后，可以使用分子技術(shù)將包含目的宿主細胞中可操作之啟動子的調(diào)控序列與cDNA序列連接。也可以使用其它調(diào)控序列，例如一個或多個增強子序列、具有功能性剪接供體和接受位點的內(nèi)含子、指導(dǎo)重組多肽分泌的信號序列、多聚腺普酸化序列、另一些轉(zhuǎn)錄終止子序列以及與宿主細胞基因組同源的序列?？梢詫⒘硪恍┬蛄?如復(fù)制起點)添加到載體上，以優(yōu)化所需產(chǎn)物的表達。同樣，所述載體中還可以包含選擇標記用于在轉(zhuǎn)化宿主細胞中選擇其存在。調(diào)控序列可以來自多種來源。例如，其中的一種或多種可通常與編碼序列有關(guān)，或者可來自于目的宿主細胞中存在的調(diào)節(jié)子系統(tǒng)或與之同源。表達載體的各元件可直接連接在一起或通過接頭連接，所述接頭如本領(lǐng)域已知地構(gòu)成限制酶識別位點。本發(fā)明中可以使用允許編碼FKBP-L多肽之核酸表達的任何啟動子。例如，可以使用來自哺乳動物病毒的哺乳動物啟動子序列，其高度表達并具有寬的宿主范圍。所述啟動子可以是在大多數(shù)哺乳動物細胞中組成性表達的啟動子。使得有可能實現(xiàn)在真核細胞中組成性表達的合適元件的實例包括被RNA聚合酶III識別的啟動子或病毒啟動子、CMV增強子、CMV啟動子、SV40啟動子或LTR啟動子，例如來自MMTV(小鼠乳腺腫瘤病毒)(例如，Lee等，1981，A^wm,214，228-232)以及源自例如HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV或HIV的其它病毒啟動子和激活因子序列。使得有可能實現(xiàn)真核生物內(nèi)調(diào)控表達的元件的其它實例包括四環(huán)素操縱子與相應(yīng)阻抑蛋白的組合(GossenM.等，1994,Cm/t.fiiWec/i腳/.,5，516-20)。在一個實施方案中，F(xiàn)KBP-L序列的表達可在組織特異性啟動子的控制下發(fā)生。作為替代地，所述啟動子可以是在細胞周期或發(fā)育階段的特定時間開啟的啟動子。例如，所述構(gòu)建體可包含使得在真核生物中實現(xiàn)組織特異性表達成為可能的調(diào)節(jié)元件，例如來自那些編碼只在某些細胞類型中表達之蛋白質(zhì)的基因的啟動子或增強子的啟動子或激活因子序列。使得在真核細胞中實現(xiàn)細胞周期特異性表達成為可能的調(diào)節(jié)元件的實例有以下基因的啟動子cdc25A、cdc25B、cdc25C、細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白E、cdc2、E2F-1至E2F-5、B-myb或DHFR(參見例如美國專利No.6,856,185;美國專利No.6，903，078;以及ZwkkerJ.和MullerR.，1997，7>e"rfs(7e"C,13,3-6)。將本發(fā)明所用多肽或核酸的表達限制在增殖細胞的情形下，可以使用受細胞周期調(diào)節(jié)的啟動子。其它實例包括受缺氧、輻射、熱等控制的啟動子。在另一個實施方案中，可將增強子元件與啟動子序列相組合。這些增強子不僅可以增強目的基因的表達，還能夠調(diào)節(jié)目的基因的表達。用于哺乳動物表達系統(tǒng)中的合適增強子元件包括例如源自宿主范圍廣泛之病毒的增強子元件，例如SV40早期基因增強子、源自勞氏肉瘤病毒LTR的增強子/啟動子以及來自人巨細胞病毒的增強子/啟動子。另外，如本領(lǐng)域已知的，其它合適的增強子包括可摻入到僅在誘導(dǎo)劑(如激素、金屬離子或酶底物)存在時有活性之啟動子序列內(nèi)的增強子。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可將轉(zhuǎn)錄終止序列置于目的基因編碼序列翻譯終止密碼子的3，端。因此，所述終止子序列與啟動子均位于編碼序列的兩側(cè)。表達載體還可包含復(fù)制起點，這使得該載體可作為復(fù)制子進行維持，所謂復(fù)制子能夠在宿主中自主復(fù)制并穩(wěn)定維持。這樣的復(fù)制起點包括那些使得表達載體能夠在合適蛋白存在下在細胞內(nèi)以高拷貝數(shù)復(fù)制的復(fù)制起點，例如在酵母中有效的2ji和自主復(fù)制序列，以及SV40關(guān)鍵T抗原(SV40vitalT-antigen)的在COS-7細胞中有效的復(fù)制起點。哺乳動物復(fù)制系統(tǒng)可包括那些源自需要反式作用因子來進行復(fù)制之動物病毒的復(fù)制系統(tǒng)。例如，可以使用乳多空病毒(例如在合適的關(guān)鍵T抗原存在下以極高拷貝數(shù)進行復(fù)制的多瘤病毒一一SV40)的復(fù)制系統(tǒng)，或者可以^JI源自牛乳頭瘤病毒和EB病毒的復(fù)制系統(tǒng)。在一些情況下，所述表達載體可具有多于一種的復(fù)制系統(tǒng)，因此，核宿主中(參見，例如美國專利No.5,677,278)。在一個實施方案中，可以將所i^達載體作為整合載體整合到宿主細胞基因組中。本文所述的整合載體可包含與宿主細胞基因組同源、允許所述載體整合的至少一種多核苷酸序列。例如，在一個實施方案中，可使用噬菌體或轉(zhuǎn)座子插入序列。在本發(fā)明的某些實施方案中，所&達栽體中可包含一個或多個選擇標記以允許選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞?？稍谒拗骷毎斜磉_的選擇標記包括可使宿主細胞對藥物(例如衣霉素、G418、氨千青霉素、氯霉素、紅霉素、卡那霉素(新霉素)和四環(huán)素)產(chǎn)生抗性的基因。選擇標記還包括生物合成的基因，例如在組氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途徑中的基因，例如ade2、his4、leu2、trpl，或者可使用使宿主細胞能夠在有毒化合物(例如金屬)存在下生長的基因?？墒褂枚喾N方法將編碼FKBP-L多肽的多核苷酸和/或編碼FKBP-L反義DNA或FKBP-LsiRNA的核酸轉(zhuǎn)移進宿主細胞中。因此，本發(fā)明的制劑可包含有助于將核酸轉(zhuǎn)移進細胞的特定組分。例如，為了使通過轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或感染將核酸引入真核細胞和/或原核細胞，所述核酸可以質(zhì)粒、病毒或非病毒載體的一部分而存在。合適的病毒載體可包括桿狀病毒、痘病毒、慢病毒(參見例如Siprashvili和Khavari，T7^k，2004，9,93-100)、腺病毒、腺伴隨病毒和皰滲病毒。具有基因治療能力的載體實例包括病毒載體，例如腺病毒栽體或逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體(Lindemann等，1997，編.3/^/"3，466-76;Springer等，1998，Mo/.O//.,2,549-58)。另外，由于棵DNA能夠穿透某些細胞，因此分離形式的真核表達栽體適用于基因治療(Hengge等，1996，丄C7iVi.J"veW.，97,2911-6;Yu等，1999，/J"ve紅Z)w附fl^/"112，370-5)?？赏ㄟ^將上述核酸施加至金顆粒并借助于所謂"基因槍"將其射入組織(優(yōu)選射入皮膚)或細胞中來獲得另一種形式的基因治療載體(Wang等,1999，//w^對.De/7ii"似/"112，775-81;Tuting等，1998，//"ve釔Dc附"似/"111,183-8)。在替代性的實施方案中，可使用脂質(zhì)體來促進編碼FKBP-L的多核苷酸轉(zhuǎn)移進細胞中。脂質(zhì)體是人工制備的小嚢泡，其具有由磷脂組成的脂雙層膜(Jeschke,M.G.等,G^"e77^"12,1718-24(2005);美國專利No.6,576,618)。可將核酸、蛋白質(zhì)及其它生物材料包封于脂質(zhì)體中用于通過與細胞的質(zhì)膜融合來遞送至哺乳動物細胞。脂質(zhì)體可以是吸引人的遞送系統(tǒng)，因為它們是非病毒的、穩(wěn)定的并可以與細胞膜相互作用。脂質(zhì)體可由陽離子型、陰離子型或中性脂質(zhì)以及其混合物所組成(Luo,D.&Saltzman，W.M"胸.jB/咖A"18，33-37(1999))。對于DNA轉(zhuǎn)移來說，還可以對所述脂質(zhì)進行化學(xué)改性以摻入化學(xué)基團來促進DNA濃縮或釋放。陽離子脂質(zhì)(例如季銨去污劑、膽固醇和二酰基甘油的陽離子衍生物以及多胺的脂類衍生物)可有利于細胞轉(zhuǎn)染，因為它們降低了DNA的凈負電荷并有助于其與細胞膜相互作用(Mshikawa，M.和Huang，L.，好謂.G綴77^:,12，861-70(2001))。可將中性脂質(zhì)(例如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二月桂酸甘油酯、聚環(huán)氧乙烷-10-硬脂基醚(POE-10)和膽固醇)作為"輔助脂質(zhì)"加入陽離子脂質(zhì)DNA復(fù)合物中，以促進在復(fù)合物被胞吞攝入后DNA從內(nèi)含體釋放?？墒褂迷鰪奃NA轉(zhuǎn)移的輔劑，例如與DNA或合成肽-DNA分子結(jié)合的聚合物或蛋白質(zhì)，其4吏得更有效地將DNA轉(zhuǎn)運入細胞核成為可能(參見，例如Niidome，T.&Huang,L.,(7ewerAc，9,1647-52(2002))。因此，可將陽離子聚合物(例如聚賴氨酸或魚精蛋白)用于脂質(zhì)-DNA復(fù)合物中，因為它們引起DNA的緊密濃縮，這防止了復(fù)合物凝集和核酸酶降解。例如，將l，2-二油?；?3-(三曱基銨)丙烷(DOTAP)脂質(zhì)體與硫酸魚精蛋白混合，然后與質(zhì)粒DNA混合，得到穩(wěn)定的135nm小顆粒，并在多種組織(例如肺、肝、心臟)中得到高水平的基因表達(Li，S.等，77^/:,5，930-37(1998))。加入作為輔助脂質(zhì)的膽固醇可提高脂質(zhì)體-肽-DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。另外，可以在加入陽離子脂質(zhì)(LipofectamineRPR115335或RPR120535)或聚合物(聚乙烯亞胺)之前將源自人組蛋白或魚精蛋白的短肽與螢光素酶或P-半乳糖苷酶基因DNA事先密集在一起(precompact)，以提高轉(zhuǎn)染效率，甚至在血清存在時亦如此(參見，例如Schwartz,B.等，T7^r.，6,282-92(1999))。如本領(lǐng)域已知的，可以通過加熱脂質(zhì)形成脂相來制備脂質(zhì)體(Wu，H.等，/"t/.i^"/7imc^/t，221，23-24(2001))。然后，可以通it^冷卻^Hf下在注射器中來回推吸混合物使含有水、鹽或緩沖液的水相與脂相混合，之后超聲處理直至達到脂質(zhì)體最終大小為100~140nm。然后，通過顛倒混合加入將包含在脂質(zhì)體中的DNA或蛋白質(zhì)(以溶液形式)。所使用的脂質(zhì)、其比例、用于產(chǎn)生脂質(zhì)體的DNA濃度以及所添加脂質(zhì)體的量通常需要根據(jù)經(jīng)驗來確定最優(yōu)選擇?？梢詫⒂兄贒NA轉(zhuǎn)移的輔劑(例如肽)與DNA混合，然后再加入所述脂質(zhì)體混合物中，但是該DNA輔劑必須保持足夠高的水溶性以適當?shù)匕庠谥|(zhì)體的外部脂相中?；蛘?，可通it^聲處理脂質(zhì)體混懸液來制備小的單層嚢泡，所述混懸液由與1，2-二油酰氡基丙基-3-三甲基溴化銨(DOTMA)或二油酰磷脂酰溴化乙醇胺(DPOE)混合的陽離子脂質(zhì)(例如CytofectinGS2888)組成。在顛倒混合后，所述DNA或蛋白質(zhì)可以離子方式結(jié)合于脂質(zhì)體表面，其比例維持所述復(fù)合物上為正的凈電荷，同時DNA與10t)o/。的脂質(zhì)體復(fù)合。另外，可使用可二聚化的陽離子硫醇去垢劑來制備遞送DNA用的脂質(zhì)體(參見，例如Dauty,E.等，/爿附.C7^附.5^.，123,9227-34(2001))。氧化后，脂質(zhì)中的硫醇基團可轉(zhuǎn)變成二硫鍵并使得DNA-脂質(zhì)復(fù)合物形成穩(wěn)定的納米顆粒，其可靜電結(jié)合到細胞表面陰離子硫酸肝素蛋白聚糖(heparinsulfateproteoglycan)用于細胞^A。一經(jīng)ii^細胞，細胞內(nèi)谷胱甘肽提供的還原性環(huán)境將二硫鍵還原成硫醇并釋放所述DNA。治療性抗體在另一實施方案中，本發(fā)明涉及對FKBP-L(或其片段或功能等同物，如下所述)具有免疫學(xué)特異性的抗體用于在體內(nèi)特異性下調(diào)FKBP-L活性的治療性用途。這樣的抗體可用于治療受益于FKBP-L活性特異性下調(diào)的疾病病癥，尤其是受益于刺激/上調(diào)血管發(fā)生的疾病/病癥。在一些具體實施方案中，本發(fā)明涵蓋了對FKBP-L(或其片段或功能等同物，如下所述)具有免疫學(xué)特異性的抗體用于促進血管發(fā)生的用途。一個實施方案涉及對FKBP-L(或其片段或功能等同物，如下所述)具有免疫學(xué)特異性的抗體用于促進傷口愈合的用途。本文使用的術(shù)語"抗體"涵蓋了具有所需免疫學(xué)特異性的經(jīng)純化或經(jīng)分離的任何同工型的天然存在抗體，以及通過合成產(chǎn)生的抗體或其47結(jié)構(gòu)類似物?？贵w制備物可以是多克隆或單克隆的。如上所述，提及這樣的"抗體"時，不僅包括完整的抗體分子，還包括保留基本的抗原(即FKBP-L)結(jié)合能力的其片段。任意效應(yīng)功能不一定均保留在這些片段中，盡管它們可以包括在內(nèi)?？墒褂玫暮线m抗體片段包括F(ab，)2片段、scAb、Fv、scFv片段和納米抗體等?？赏ㄟ^已知技術(shù)獲得含有所述分子獨特型的抗體片段，例如，這樣的片段包括但不限于可通過胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab，)2片段；可通過還原F(ab，)2片段的二硫鍵得到的Fab，片段；以及可通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段?？衫帽绢I(lǐng)域公知的重組表達技術(shù)來制備具有所需抗原結(jié)合活性的另一些抗體片段。可通過重組改造來制備嵌合的人源化以及完全人源化單克隆抗體。通過將人的恒定鏈添加到F(ab，)2片段，有可能制備可用于免疫治療應(yīng)用的人源化單克隆抗體，在所述免疫治療中患者產(chǎn)生抗小鼠Ig的抗體是一個缺點。BreedveldF.C.TherapeuticMonoclonalAntibodies,Lancet2000年2月26日；335,735-40頁?？赏ㄟ^哺乳動物宿主細胞(例如CHO細胞)中的重組表達來有利地制備治療性重組單克隆抗體?？赏ㄟ^用合適的^抗原(例如全長的FKBP-L或其表位)免疫合適的宿主動物(例如小鼠或兔)來制備對FKBP-L具有免疫學(xué)特異性的單克隆抗體。治療性用途本發(fā)明的多肽和核酸以及本發(fā)明中使用的多肽和核酸可用于在哺乳動物(包括人)中控制和/或治療多種臨床病癥。本發(fā)明的多肽和方法可用于治療抗血管發(fā)生劑或促血管發(fā)生劑對其有治療性用途的病癥或疾病。本文使用的"治療"或"療法"包括可使人或非人動物受益的任何方案。所述治療可針對已存在的病癥，或者可以是預(yù)防性的(預(yù)防性治療)。治療可包括治愈、減輕或預(yù)防性作用。可通過向有此治療需要的患者施用有效量的FKBP-L多肽或編碼所述肽的核酸來抑制細胞遷移、血管發(fā)生以及相關(guān)適應(yīng)癥(例如腫瘤生長和/或轉(zhuǎn)移)。該方法可用于治療腫瘤、多種自身免疫病、遺傳病、眼病和其它血管發(fā)生介導(dǎo)的或血管發(fā)生相關(guān)的疾病。或者，可通過向有此治療需要的患者施用反義FKBP-L核酸(例如siRNA)或抗FKBP-L抗體來促進血管發(fā)生。該方法可用于治療傷口愈合，包括大多數(shù)組織(例如皮膚和骨)的傷口愈合以及慢性潰瘍(糖尿病等)治療。本文所述的治療和診斷方法通常包括向患者施用有效量的本發(fā)明肽、核酸或包含所述多肽或核酸的組合物。施用的準確劑量將根據(jù)組合物的使用以及根據(jù)患者年齡、性別和狀況而變化，治療醫(yī)師可容易地對其進行確定。所述組合物可以單次給藥或在一段時間內(nèi)連續(xù)給藥來施用?？梢暻闆r重復(fù)給藥。所述組合物和方法可用于治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病，其包括血管瘤、實體瘤、白血病、淋巴瘤轉(zhuǎn)移、毛細管擴張、銀屑病、子宮內(nèi)膜異位癥、動脈硬化、硬皮病、化膿性肉芽腫、心肌血管發(fā)生、克羅恩病、斑塊新血管形成、冠脈側(cè)支(coronarycollateral)、腦側(cè)支(cerebralcollateral)、動靜脈崎形、缺血肢體血管發(fā)生(ischemiclimbangiogenesis)、角膜病、紅變、新生血管性青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維增生癥、關(guān)節(jié)炎、糖尿病性血管形成、黃斑變性、消化性潰瘍、螺桿菌相關(guān)疾病、骨折、瘢痕疙瘩和血管生成?？芍委煹木唧w疾病以及可用于這些方法的化合物和組合物在下文中有更詳細的描述。癌/腫瘤可治療的腫瘤包括其生長受到血管發(fā)生促進的腫瘤。在一個實施方案中，這樣的腫瘤可表達CD44。可使用本發(fā)明所述化合物、組合物和方法治療的癌可包括結(jié)腸直腸癌、胃癌、印戒細胞癌(signetringtype)、食道癌、腸癌、粘液癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、睪丸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、肝癌、喉癌、間皮瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、神經(jīng)外胚層瘤、黑素瘤、膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)細胞瘤、肉瘤、平滑肌肉瘤、MFII、纖維肉瘤、月旨肪肉瘤、MPNT和軟骨肉瘤。對于癌癥的治療來說，可以將FKBP-L與本領(lǐng)域已知的其它化療試劑和/或化學(xué)預(yù)防性試劑一起施用。這樣的試劑包括但不限于抗血管發(fā)生劑(antiangiogenic)、內(nèi)皮抑素(endostatin)、血管抑素(angiostatin)和VEGF抑制劑、沙利度胺(thalidomide)或其它試劑，或細胞毒性藥物(如阿霉素、道諾霉素(daunomycin)、順鉑、依托泊苷、紫杉醇、泰索帝(taxotere))，和生物堿類(如長春新堿、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑)，以及抗代謝類藥物(如氨曱蝶呤)。在一些替代性實施方案中，可以將FKBP-L肽或編碼FKBP-L多肽的多核苷酸與以下癌癥治療劑一起使用(a)癌癥生長抑制劑，其包括但不限于硼替佐米(bortezomib)、埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、4尹馬替尼(imatinib)和索拉非尼(sorafenib);(b)基因治療方法，例如，使用編碼肺瘤抑制基因的核酸構(gòu)建體或針對癌基因的siRNA;(c)癌癥疫苗；(d)干擾素；(e)阿地流津；(f)單克隆抗體，其包括但不限于卯Y-替伊莫單抗(卯Y-Ibritumomabtiuxetan)、ADEPT、阿侖單抗(Alemtuzumab)、貝伐單抗(Bevacizumab)、西妥昔單抗(Cetuximab)、吉妥單抗(Gemtuzumab)、碘-131妥司莫單抗(Iodine131tositumomab)、帕尼單抗(Panitumumab)、利妥昔單抗(Rituximab)、曲妥珠單抗(Trastuzumab);(g)化療藥物，其包括但不限于胺苯吖啶、博來霉素、白消安、卡培他濱、碳鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、門冬酰胺酶、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達卡巴噪、放線菌素D、柔紅霉素、多西他賽、阿霉素、表阿霉素、依托泊苷、氟達拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、卡莫司汀植入物、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、亞葉酸、脂質(zhì)體包覆的阿霉素、脂質(zhì)體包覆的柔紅霉素、洛莫氮芥、苯丙氨酸氮芥、巰嘌呤、美司鈉、氨甲蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、培美曲塞(Pemetrexed)、噴司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、鏈脲霉素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、替尼泊苷、噻替哌、硫鳥嘌呤、拓樸替康、曲奧舒凡、長春堿、長春新堿、長春地辛和長春烯堿。(h)放射治療；(i)激素治療，其包括但不限于阿那曲唑、比卡魯胺、布舍瑞林、環(huán)丙孕酮酯、己烯雌酴、依西美坦、氟他胺、氟維司群(Fulvestrant)、性瑞林(乳房)、性瑞林(前列腺)、來曲唑、亮丙瑞林、甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、他莫昔芬、托瑞米芬和曲普瑞林；(j)支持治療，其包括但不限于雙膦酸酯類、輸血、促紅細胞生成素、造血劑、生長因子、血漿交換、血小板輸注和類固醇類；以及(k)其它治療，其包括但不限于高壓氧治療、高熱治療和光動力學(xué)治療。這些療法可以單獨地與FKBP-L治療一起^^用或作為FKBP-L治療的補充療法。血管發(fā)生介導(dǎo)的眼病多種眼病是由血管發(fā)生介導(dǎo)的，其可以使用本文所述的活性化合物、組合物和方法來治療。血管發(fā)生介導(dǎo)疾病的一個實例是眼新生血管性疾病(ocularneovasculardisease)，其特征是新生血管侵入到眼部結(jié)構(gòu)中，并且其是最常見的失明原因。在年齡相關(guān)的黃斑變性中，相關(guān)的視覺問題是由脈絡(luò)膜毛細血管通過布魯赫膜的缺陷向內(nèi)生長造成的，其伴隨視網(wǎng)膜色素上皮下纖維血管組織的增生。在最嚴重的年齡相關(guān)黃斑變性中(稱為"濕性"ARMD)，在視網(wǎng)膜下出現(xiàn)血管發(fā)生異常，其導(dǎo)致不可逆的視覺喪失。視覺喪失是由于視網(wǎng)膜的瘢痕引起，其次是由于新生血管的出血所致。目前對"濕性"ARMD的治療使用基于激光的療法以破壞入侵血管。但是，該療法并不理想，這是因為激光可以造成視網(wǎng)膜上永久性的瘢痕，并且入侵血管常常再次生長。針對黃斑變性的替代性治療策略是使用抗血管發(fā)生劑來抑制造成黃斑變性之最嚴重視覺喪失的新血管形成或血管發(fā)生。破壞血管發(fā)生也與糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、角膜移植排斥、新生血管性青光眼和晶狀體后纖維增生病。其它與角膜新生血管相關(guān)的疾病包括但不限于流行性角膜結(jié)膜炎、維生素A缺乏癥、特應(yīng)性角膜炎、上緣角膜炎(superiorlimbickeratitis),翼狀胬肉干燥性角膜炎、天皰掩樣放射狀角膜切開術(shù)(periphigoidradialkeratotomy)以及cornealgraphrejection.與視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新生血管相關(guān)的疾病包括但不限于糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、假性近視、視盤小凹(opticpit)、慢性視網(wǎng)膜脫落、高翁稠度綜合征、外傷和激光后并發(fā)癥(post-lasercomplication),其它疾病包括但不限于與紅變(角的新生血管)相關(guān)的疾病以及由纖維血管或纖維組織的異常增生導(dǎo)致的疾病(包括所有形式的增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變)。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，本發(fā)明的活性化合物、組合物和方法可用于治療血管發(fā)生介導(dǎo)的眼病，例如黃斑變性。炎癥51FKBP-L多肽還可用于治療血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病，諸如血管發(fā)生相關(guān)炎癥，其包括多種形式的關(guān)節(jié)炎(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎)。在這些方法中，將本文所述的化合物與其它可用于治療所述疾病的藥劑(例如環(huán)加氧酶-2(COX-2)抑制劑，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的)組合進行治療。關(guān)節(jié)的滑膜內(nèi)村中的血管可出現(xiàn)血管發(fā)生。內(nèi)皮細胞形成新的血管網(wǎng)絡(luò)，并釋放因子和活性氧，其導(dǎo)致血管翳生長和軟骨破壞。這些因素被認為積極地促成了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎還有骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。血管發(fā)生相關(guān)因子對軟骨細胞的活化導(dǎo)致關(guān)節(jié)受損，并且還促進新骨的形成。本文所述方法可用作治療性介入以預(yù)防骨損傷和新骨形成。病理性血管發(fā)生也被認為涉及慢性炎癥。可使用本文所述的化合物、組合物和方法治療的疾病的實例包括潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、巴爾通體病和動脈硬化。治療組合在使用本發(fā)明的多肽、核酸或方法治療具體疾病中，在治療具體的疾病中，所述多肽或核酸可以與多種現(xiàn)有的針對該疾病的治療劑組合使用。本文所述的FKBP-L多肽與抗組胺藥(Hi拮抗劑)的組合可特別適用于預(yù)防和治療哮喘和鼻炎?？菇M胺藥的實例包括馬來酸氯苯那敏、右溴苯那敏、氯馬斯汀、酮替芬、阿扎他定、氯雷他定、特非那定、西替利嗪、阿司咪唑、他齊茶堿、左卡巴斯汀、甲苯海明、替美斯汀、依托替芬、阿伐斯汀、氮卓斯汀、依巴斯汀、美喹他嚷、KA-398、FK-613、咪唑斯汀、MDL-103896、左旋西替利噪、糖酸莫美他松、DF-1111301、KC-11404、卡瑞斯汀、雷馬曲班、地氯雷他定、諾柏斯汀、selenotifen、阿利那斯汀、E-4716、乙氟利嚷、曲托會啉、去甲阿斯咪唑、ZCR-2060、WY-4卯51、KAA-276、VUF-K-9015、他戈利嚷、KC-11425、依匹斯汀、MDL-28163、特非那定、HSR-609、阿伐斯汀和BMY-25368。另外地或作為替代地，本發(fā)明所述多肽可以有利地與一種或多種其它治療劑組合使用，所述治療劑包括抗生素、抗真菌劑、抗病毒劑、抗組胺藥、非類固醇類抗炎藥或抗風(fēng)濕疾病調(diào)節(jié)藥物(diseasemodifyinganti-rheumaticdrug)。在另一些實施方案中，對于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎來說，可以將FKBP-L多肽與諸如TNF-a抑制劑的試劑組合，所述試劑例如抗TNF單克隆抗體(如英利昔單抗、CDP-870和D2E7)和TNF受體免疫球蛋白分子(如依那西普@)、COX-2抑制劑(如美洛昔康、噻萊昔布、羅非昔布、伐地昔布和依托昔布)、低劑量氨甲蝶呤、來氟米特、羥氯喹、d-青霉胺、金諾芬或者胃腸外或口服金。在又一些實施方案中，還可以將FKBP-L多肽與現(xiàn)有的治療骨關(guān)節(jié)炎的治療劑組合使用。用于組合的合適試劑包括標準的非類固醇類抗炎劑(以下稱作NSAID，s)(如吡羅昔康、雙氯芬酸)、丙酸類(如萘普生、氟比洛芬、非諾洛芬、酮洛芬和布洛芬)、芬那酸類(如甲芬那酸、吲哚美辛、舒林酸、阿扎丙宗)、吡唑啉酮類(如保泰術(shù)>)、水楊酸類(如阿司匹林)、COX-2抑制劑(如噻萊昔布、伐地昔布、羅非昔布和依托昔布)，鎮(zhèn)痛藥或關(guān)節(jié)內(nèi)治療劑(如皮質(zhì)類固醇類)以及透明質(zhì)酸類(如膝爾康和欣維可)。還可以將FKBP-L多肽與抗癌試劑組合4吏用，所述抗癌試劑例如抗血管發(fā)生劑、內(nèi)皮抑素、血管抑素和VEGF抑制劑或其它試劑，或細胞毒性藥物(如阿霉素、道諾霉素、順鉑、依托泊苷、紫杉醇、泰索帝)和生物堿類(如長春新堿、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑)以及抗代謝類藥物(如氨甲蝶呤)。本文還描述了其它抗癌試劑和治療方法，例如癌癥生長抑制劑、基因治療、癌癥疫苗、干擾素、阿地流津、單克隆抗體、化療藥物、放射療法、激素治療或其它可與FKBP-L—起使用的支持療法。另外地或作為替代地，還可以將FKBP-L多肽與抗病毒劑組合使用，所述抗病毒劑例如奈非那韋、AZT、阿昔洛韋和泛昔洛韋以及抗菌化合物(如Zovant、替法可近、NOX-100和13R270773)。也可以將FKBP-L多肽與抗骨質(zhì)疏爭^試劑組合^f吏用，所述抗骨質(zhì)疏松試劑例如roloxifene、屈洛昔芬、拉索昔芬或福善美以及免疫抑制劑類(如FK-506和雷帕霉素)。還可以將FKBP-L多肽與一種或多種如下試劑組合使用(a)白三烯生物合成抑制劑5-脂加氧酶(5-LO)抑制劑和5-脂加氧酶激活蛋白(FLAP)拮抗劑，其選自齊留通，ABT-76,芬留頓，替泊沙林，Abbott-79175，Abbott-85761，N-(5-取代)-噻吩-2-烷基磺胺類藥物，2,6-二叔丁基苯酚腙，甲氧基四氫呋喃類(其包括捷利康ZD-2138、SB-210661化合物以及屬于該類別的化合物)，L-739,010所屬的吡啶基-取代的2-萘?xí)蹼骖惢衔?，L-746,530所屬的2-氰基喹啉類化合物；MK-591、MK-886和BAYX1005所屬的P引咮和會啉類化合物；(b)白三烯LTB4、LTC4、LTD4和LTE4的受體拮抗劑，其選自L-651,392所屬的吩噻溱-3-酮類化合物，CGS-25019c所屬的脒基化合物類，昂唑司特所屬的氨基苯并惡唑(benzoxaolamine)類化合物；BIIL2841260所屬的千脒類化合物以及扎魯司特、阿魯司特、孟魯司特、普侖司特、維魯司特(MK-679)、RG國12525、Ro-2459913、伊拉司特(CGP45715A)和BAYX7195所屬的化合物類；(c)PDE4抑制劑，其包括同工型PDE4D的抑制劑；(d)5-脂加氧酶(5-LO)抑制劑；或5-脂加氧酶激活蛋白(FLAP)拮抗劑；(e)5-脂加氧酶(5-LO)雙重抑制劑和血小板活化因子拮抗劑(PAF);(f)白三烯拮抗劑(LTRA)，其包括LTB4、LTC4、LTD4和LTE4的拮抗劑；(g)抗組胺受體拮抗劑，其包括西替利喚、氯雷他定、地氯雷他定、非索非那定、阿司咪唑、氮卓斯丁和氯苯那敏；(h)胃保護性H2受體拮抗劑；(i)口服或外用用于減輕充血的w-和012-腎上腺素受體激動劑致血管收縮擬交感神經(jīng)類試劑，其包括丙己君、去氧腎上腺素、苯丙醇胺、偽麻黃堿、鹽酸萘甲唑啉、鹽酸羥甲唑啉、鹽酸四氫唑啉、鹽酸賽洛唑啉和鹽酸乙諾那林；(j)5-脂加氧酶(5-LO)抑制劑與ar和ar腎上腺素受體拮抗劑；(k)抗膽堿能試劑，其包括異丙托溴銨、噻托嗅銨、氧托溴銨、哌侖西平和替侖西平；(1)|33-至卩4-腎上腺素受體拮抗劑，其包括奧西那林、異丙腎上腺素、左異丙腎上腺素、沙丁胺醇(albuterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、福莫特羅、沙美特羅、特布他林、奧西那林、甲磺酸比托特羅和吡布特羅；(m)甲基黃嘌呤類(methylxanthanine)，其包括茶堿和氨茶堿；(n)色甘酸鈉；(o)毒萆堿性受體(Ml、M2和M3)拮抗劑；(p)COX-l抑制劑(NTHE);COX-2選擇性抑制劑，其包括羅非昔布；以及一氧化氮NTHE;(q)I型胰島素樣生長因子(IGF-I)模擬物；(r)環(huán)索奈德；(s)全身副作用降低的吸入糖皮質(zhì)激素類，其包括甲潑尼松、甲潑尼龍、氟尼縮松、54曲安奈德、丙酸倍氯米松、布地奈德、氟替卡松丙酸酯和糠酸莫米松；(t)類胰蛋白酶抑制劑；(u)血小板活化因子(PAF)拮抗劑；(v)活躍針對內(nèi)源炎癥實體的單克隆抗體；(w)IPL576;(x)抗腫瘤壞死因子(TNF-a)試劑，其包括依那西普、英夫利昔和D2E7;(y)DMARD，其包括來氟米特；(z)TCR肽；(aa)白介素轉(zhuǎn)化酶(ICE)抑制劑；(bb)IMPDH抑制劑；(cc)粘附分子抑制劑，其包括VLA-4拮抗劑；(dd)組織蛋白酶；(ee)MAP激酶抑制劑；(ff)葡萄糖-6磷酸脫氫酶抑制劑；(hh)采用硫代金與多種親7jc基團形式的金；(ii)免疫抑制劑，例如環(huán)孢菌素、硫唑噪呤和氨甲蝶呤；(jj)抗痛風(fēng)劑，例如秋水仙堿；(kk)黃噪呤氧化酶抑制劑，例如別嘌醇；(ll)排尿酸劑，例如丙磺舒、磺吡酮和苯溴馬??；(mm)抗腫瘤試劑，特別是抗有絲分裂藥，其包括長春花生物堿類如長春堿和長春新堿；(nn)生長激素促分泌劑；(oo)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(MMP)，例如基質(zhì)裂解素類、膠原酶類和明膠酶類以及聚蛋白多糖酶；尤其是膠原酶-l(MMP-1)、膠原酶-2(MMP-8)、膠原酶-3(MMP-13)、基質(zhì)裂解素-l(MMP-3)、基質(zhì)裂解素-2(MMP-10)和基質(zhì)裂解素-3(MMP-11);(pp)轉(zhuǎn)化生長因子(TGFP);(qq)血小板衍生生長因子(PDGF);(rr)成纖維細胞生長因子，例如堿性成纖維細胞生長因子(bFGF);(ss)粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM畫CSF);(tt)辣素軟骨(capsaicincream);(uu)速激肽NK和NK3受體拮抗劑，其選自NKP-608C、SB-233412(他奈坦)和D-4418;以及(vv)彈性蛋白酶抑制劑，其選自UT-77和ZD-0892。傷口愈合血管發(fā)生是傷口愈合中的重要步驟。上文所述的本發(fā)明FKBP-L多肽的反義和/或siRNA和/或抑制性抗體可單獨或者與其它治療劑聯(lián)合用于促進傷口愈合。因此，本發(fā)明的實施方案還涵蓋至少一種本文所述FKBP-L化合物與至少一種可用于治療傷口的其它藥劑之組合。這樣的藥劑可選自參與傷口愈合的生物活性化合物，例如生長因子、細胞因子抑制劑、蛋白酶和粘附分子，其是本領(lǐng)域已知的并描述于例如Kumar等，TurkJMedSci，34(2004)147-160。例如，合適的生長因子可選自TGF卩及其同工型、PDGF、KGF、VEGF和EGF，已知這些因子對于傷口愈合很重要。還可以將FKBP-L多肽及其衍生物與基質(zhì)金屬蛋白酶或粘附分子(例如免疫球蛋白樣超家族、鈣粘素、整合素、受體蛋白酪氨酸磷酸酶、選擇素和透明質(zhì)酸受體)結(jié)合。作為替代地或者與上述任何傷口愈合組分組合地，其它已知促進傷口愈合的藥劑(如抗感染劑、抗生素等)也可與本發(fā)明化合物一起使用。在某些實施方案中，可以將本文中詳述的反義寡雉苷酸用于傷口愈合的方法和組合物中。另外，反義FKBP-L寡核苷酸、FKBP-LsiRNA或針對FKBP-L的抗體可單獨應(yīng)用或與上述活性成分組合應(yīng)用，其可作為粉劑或溶液或分散體系來局部應(yīng)用，并用于制備多種敷料。這樣的敷料可以是經(jīng)典的敷料(例如棉或纖維制品)，并作為基底材料(如纖維素或醋酸纖維素或尼龍或再生纖維素)或塑料基底材料(片層形式的編織或非編織、有孔或無孔)上的涂層沉積?？梢允褂煤线m的粘附制劑(例如果膠、明膠、淀粉、無毒植物膠等)將針對FKBP-L多肽之抗體與合適的基底材料(例如棉紗布、塑料片等)連結(jié)，其根據(jù)美國專利No.3,194,732中公開的已知步驟。作為替代地，可以將本發(fā)明的FKBP-L抗體與更精致形式的傷口敷料(例如促進形成對傷口愈合有益的濕潤環(huán)境之保濕且半封閉的敷料)相結(jié)合。反義和siRNA寡核苷酸治療A.反義RNA如上所述，本發(fā)明可包括反義核酸分子或反義寡核普酸作為治療劑。在一個實施方案中，所述反義寡核苷酸可包含抑制劑RNA(例如RNAi或siRNA)。反義寡核苷酸是DNA或RNA的短片段，其具有與mRNA部分或全部互補的序列。由于與特定靶mRNA互補，反義寡核苷酸與該mRNA特異性結(jié)合。已知可通過化學(xué)修飾這些反義分子來促進緊密結(jié)合。一經(jīng)結(jié)合，mRNA被細胞翻譯機器讀取的能力便被抑制，因此阻斷了其所編碼蛋白質(zhì)的合成。與基因敲除不同的是，這種抑制可能需要所述反義分子的持續(xù)存在；因此，它是可逆的，并且僅基于對基因序列的了解就可以設(shè)計該目的基因的特異性抑制劑。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了與本發(fā)明核酸編碼鏈反義的分離核酸分子。在另一個實施方案中，提供了具有與編碼本發(fā)明多肽之mRNA的編碼鏈反義的核苷酸序列的核酸分子。所述反義核酸可以互補于整條編碼鏈，或者互補于其一部分，例如，蛋白質(zhì)編碼區(qū)(或可讀框)的全部或一部分。反義核酸分子可以與編碼本發(fā)明多肽之核苷酸序列的編碼鏈的非編碼區(qū)全部或部分反義。所述非編碼區(qū)("5，和3，非翻譯區(qū)")是編碼區(qū)兩側(cè)的5'和3，序列，并且不被翻譯成氨基酸。反義寡核普酸可以是例如約5、10、15、18、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸或更長?？梢岳没瘜W(xué)合成和酶促連接反應(yīng)使用本領(lǐng)域已知的步驟來構(gòu)建本發(fā)明的反義核酸。例如，可使用天然核苷酸或經(jīng)多種修飾的核苷酸化學(xué)合成反義核酸(例如反義寡核苷酸)，所述經(jīng)修飾的核苷酸被設(shè)計為增加該分子的生物穩(wěn)定性或者增加反義和有義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性，例如可使用硫代磷酸衍生物和吖咬取代核苷酸。可用于產(chǎn)生反義核酸的經(jīng)修飾核苷酸的實例包括5-氟尿嗜咬、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃噤呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧曱基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧咬、二氫尿嘧啶、p-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N6-異戊烯基腺噪呤、1-甲基鳥噪呤、l-曱基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺噪呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-曱基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨曱基-2-硫代尿嘧啶、P-D-甘露糖基Q核苷、5，-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺噤呤、尿嘧咬-5-氧基乙酸(v)、假尿苷、假尿嗜啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-疏尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-預(yù)測的N-2-羧基尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基噤呤。作為替代地，可使用表達載體利用生物學(xué)方法制備反義核酸，其中已將核酸以反義方向(即從所插入核酸轉(zhuǎn)錄的RNA為目的耙核酸的反義方向，這將在下文中進一步描述)亞克隆到所述表達載體中?？蓪⒈景l(fā)明的反義核酸分子施用給患者。作為替代地，可原位產(chǎn)生反義核酸分子從而使它們與編碼本發(fā)明所選多肽的細胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，由此抑制表達(例如，通過抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯來實現(xiàn))。雜交可以通過常規(guī)核酸互補形成穩(wěn)定雙鏈體，或者例如在反義核酸分子結(jié)合DNA雙鏈體的情形中，其通過雙螺旋大溝中的特異性相互作用來實現(xiàn)。本發(fā)明反義核酸分子的施用途徑的實例包括直接注射到組織部位?；蛘?，可修飾反義核酸分子以靶向所選的細胞，然后全身性施用。例如，對于全身性施用來說，可以修飾反義分子使得它們特異性結(jié)合所選細胞表面表達的受體或抗原，例如通過將所述反義核酸分子與可與細胞表面受體或抗原結(jié)合的肽或抗體連接來實現(xiàn)。為了達到所述反義分子的足夠細胞內(nèi)濃度，優(yōu)選將所述反義核酸分子置于強II型或III型聚合酶啟動子之控制下的載體構(gòu)建體。含天然糖(D-核糖和D-2-脫氧核糖)與磷酸二酯(PO)連鍵的寡核苷酸被血清和細胞內(nèi)的核酸酶迅速降解，這限制了它們作為有效治療劑的用途。改善核酸酶穩(wěn)定性的化學(xué)策略包括修飾糖部分、堿基部分和/或修飾或替代核普酸間磷酸二酯鍵。迄今，最為廣泛研究的類似物是硫代磷酸酯(PS)寡脫氧核苷酸，其中磷-磷酸二酯骨架中的非橋連氧原子之一被石危取代(Eckstein,F.Ann.Rev.Biochem.1985，54,367)。Robson等描述了適用于本發(fā)明方法的靶向FKBP-L的反義核酸案例(參見Robson等(1999)及flrf/"rtVwi及e卿^152,451-461;Robson，T.等，(2000)/及fl力Vif)。B.siRNA在某些實施方案中，可使用FKBP-L的siRNA用作治療劑。小干擾RNA(siRNA)是在哺乳動物細胞中定向敲減轉(zhuǎn)錄后基因表達的有力工具(Elbashir等,Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature.2001，411:494-8)。siRNA通常包含雙鏈的靶標特異性區(qū)域，該區(qū)域?qū)?yīng)于待下調(diào)的靶基因(即FKBP-L)。該雙鏈的靶標特異性區(qū)域通常具有19至25個堿基對的長度。在特定的非限制性實施方案中，可使用具有對應(yīng)于待下調(diào)把基因(FKBP-L)之具有19、20、21、22、23、24或25個堿基對58的雙鏈靶標特異性區(qū)域的siRNA。所述乾標特異性區(qū)域通常具有與耙基因(FKBP-L)的一部分100%互補的序列。但是，應(yīng)了解100%序列同一性并不是有效的RNA抑制所必需的。還發(fā)現(xiàn)與靶標序列相比具有插入、缺失和單點突變的RNA序列對RNA抑制也是有效的。為此，當用于指siRNA的靶標特異性部分與靶基因(FKBP-L)的靶標區(qū)域之間的序列對應(yīng)性時，術(shù)語"對應(yīng)于"應(yīng)相應(yīng)地解釋為不絕對需要100%序列同一性。然而，雙鏈RNA與靶區(qū)域之間的序列同一性百分比通常至少為90%，或者至少95%或至少99%。因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，能夠特異性下調(diào)FKBP-L表達的siRNA可包含含有SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:29所示核苷酸序列的19、20、21、22、23、24或25個連續(xù)堿基對或由其組成的雙鏈部分，或者包含與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:29所示核苷酸序列的一部分具有至少90%或至少95%或至少99%同一性的或者與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示核苷酸序列一部分相比包含一個或兩個單核普酸錯配的19、20、21、22、23、24或25個連續(xù)堿基的雙鏈部分。siRNA可設(shè)計成乾向FKBP-LmRNA轉(zhuǎn)錄物的任何合適區(qū)域?？色@得siRNA設(shè)計的算法，其基本上基于siRNA—級序列的特征(例如ReynoldsA，等.NatBiotechnol.2004Mar;22(3):326國30.Epub2004Feb1)。Jascur等.2006，MolecularCell,17:237-239描述了適用于本發(fā)明方法的示例性乾向FKBP-L的siRNA。術(shù)語"基因表達下調(diào)"是指在所述靶基因(例如FKBP-L)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物和/或mRNA產(chǎn)物水平上基因表達的可檢測或可觀察到的減少，或者可檢測基因表達的完全消失。當發(fā)生耙基因(例如FKBP-L)下調(diào)而并未影響其它基因時，基因表達下調(diào)是"特異性的"。siRNA可在一端或兩端包含單鏈突出，其在對應(yīng)于FKBP-L的雙鏈靶標特異性區(qū)域的兩側(cè)。在一個具體的實施方案中，所述siRNA可含有3，突出核苷酸，例如兩個3，突出的胸腺嘧咬(dTdT)或尿嘧咬(UU)。如果緊接dsRNA雙鏈部分所包含序列上游的靶基因序列是AA的話，siRNA中可包含3，TT或UU突出。這使得siRNA中TT或UU突出與靶基因雜交。盡管siRNA的另一端也可以包含3，TT或UU突出，但是siRNA雙鏈部分中所包含序列的下游靶序列含有AA卻不是必需的。通常由兩條退火的完全由磷酸二酯鍵連接的核糖核苷酸組成的RNA鏈形成所述siRNA的雙鏈耙標特異性部分。然而，RNA/DNA嵌合體的siRNA也在預(yù)期內(nèi)。這些嵌合體包括例如如上所述包含具有3，突出DNA堿基(例如dTdT)的雙鏈RNA，以及其中整條鏈上一個或多個RNA堿基或核糖核苷酸或者甚至所有核糖核苷酸被DNA堿基或脫氧核糖核苷酸所取代的多核苷酸的雙鏈"RNA"。在另一些實施方案中，siRNA中"RNA"鏈的骨架可以通過加入非天然核堿基(nucleobase)和/或非天然骨架鍵合來進行修飾(參見例如Soutschek等.Nature.2004Nov11;432(7014):173-8;ZimmermannTS，等.Nature441,111-4)。例如，可包含2-0-甲基修飾以穩(wěn)定siRNA(如上Soutschek等所述)?？梢砸员绢I(lǐng)域已知的方式制備siRNA。例如，可以使用本領(lǐng)域公知的化學(xué)或酶促多核苷酸合成技術(shù)在體外合成siRNA。在一種方法中，可以分別合成siRNA的兩條分開的鏈，然后退火形成雙鏈。未經(jīng)修飾的"外源"siRNA已知在體內(nèi)有效沉默基因，而不需要其它試劑(FilleurS，等.CancerRes63，3919-22;DuxburyMS,等.Oncogene23，465-73)。在另一些實施方案中，siRNA可與運威體或遞送載體聯(lián)合使用，所述運載體或遞送載體例如膠原支架(atelocollagen)(NozawaH，等.CancerSci.2006年10月;97(10):1115-24;TakeshitaF，等.ProcNatlAcadSciUSA.2005年8月23日;102(34):12177-82.Epub20058月9日)或納米顆粒(SchiffelersRM，等.NucleicAcidsRes.2004年11月1日；32(19):e149)或者基于脂質(zhì)的運栽體(其包括例如促進^的水包油乳液、微團和脂質(zhì)體)。遞送載體(例如脂質(zhì)體和納米顆粒)可通過與針對特定配體的載體(例如單克隆抗體、糖、糖脂或蛋白質(zhì))偶聯(lián)而靶向到特定組織。在另一實施方案中，除了由兩條獨立的RNA鏈退火所形成之外，"siRNA"可具有折回的頸環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中形成siRNA的靶向特異性部分的退火序列是共價相連的。在一個實施方案中，所述退火序列可以存在于單條RNA鏈上。如果dsRNA是通過體內(nèi)表達或體外轉(zhuǎn)錄形成60的，則具有這樣結(jié)構(gòu)的RNA是典型的。連接兩條RNA鏈的"環(huán)"的確切性質(zhì)和序列對于本發(fā)明來說通常不是重要的，除了它應(yīng)該不削弱所述分子的雙鏈部分介導(dǎo)RNAi的能力以外。所述"環(huán)"結(jié)構(gòu)不必需由核酸形成。在一個實施方案中，可通過在宿主細胞或生物中從合適表達載體進行細胞內(nèi)表達來合成siRNA(或可被加工產(chǎn)生siRNA的前體結(jié)構(gòu)，例如通過內(nèi)源酶"dicer"的作用產(chǎn)生)。用于體內(nèi)表達siRNA的許多非病毒(例如質(zhì)粒)或病毒表達載體系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的。通常，siRNA表達為莖環(huán)，其可在細胞內(nèi)被迅速加工產(chǎn)生"游離的"siRNA(參見綜述Tuschl,NatureBiotechnology,Vol.20(5),446-448，2002)。表達siRNA的載體系統(tǒng)?；赗NA聚合酶III啟動子，因為這些特別適于極短RNA序列的精確表達。合適的載體系統(tǒng)描述于例如Brummelkamp,T.R.等.，Science,Vol.296，550-553，2002;Lee，N.S.等，NatureBiotechnology,Vol.20，500-505，2002;Miyagashi,M&Taira,K.MatureBiotechnology,Vol.20，497-500,2002;Paul,CP.等，NatureBiotechnology,Vol.20，505-508，2002，其內(nèi)容通過參考并入本文。siRNA可被配制成藥物組合物，所述組合物包含與任何本領(lǐng)域已知的標準生理和/或藥學(xué)可接受載體相組合的治療有效量的核酸。靶向靶向治療可用于通過使用靶向系統(tǒng)(例如抗體或細胞特異性配體)將活性藥劑(例如多肽)更特異地遞送至特定組織或細胞。這些靶向系統(tǒng)可以與肽序列共價連接，或者與藥物遞送載體(例如脂質(zhì)體、微球、微粒、微膠嚢等)連接。通過將肽摻入到大小合適(使其能穿過靜脈但容納在毛細血管床中)的微粒或其他藥物遞送載體中，還可以將所述多肽靶向至生長中的腫瘤床(其與附著的毛細血管床相關(guān)聯(lián))。當容納于所述床中時，所述多肽在它們最有用的位置局部釋放(而不是全身釋放)。如上所述，本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明核苷酸的基因治療方法。在另一實施方案中，F(xiàn)KBP-L肽可用于將細胞毒性劑靶向到腫瘤細胞。因此，在一個實施方案中，可使用本領(lǐng)域已知方法將所述FKBP-L61肽與細胞毒劑綴合。然后，F(xiàn)KBP-L肽可通過與CD44相互作用將所述細胞毒劑遞送至表達CD44的細胞。當所述細胞毒劑是能夠優(yōu)選抑制肺瘤細胞生長的藥劑時，則所述藥劑可能能夠活躍地抗CD44十ve腫瘤細胞?？寡馨l(fā)生或促血管發(fā)生活性本發(fā)明的某些實施方案可包括評估本發(fā)明組合物的血管發(fā)生活性。可通過本領(lǐng)域已知的任何方法或如上所述評估血管發(fā)生。例如，可使用任何標準測定來檢測血管發(fā)生活性，例如Matrigel測定和實施例中使用的測定。實施例參考下述非限制性實施例可更好地理解本發(fā)明。"N"提供了針對該具體實施例所進行的各個實驗的數(shù)量。實施例1:FKBP-L的瞬時轉(zhuǎn)染抑制傷口閉合(N=3)進行實驗以確定FKBP-L(SEQIDNO:1，圖1)對傷口閉合的影響。這些研究中所用的體外遷移測定是Ashton等(1999)TheJ.ofBiol.Chem.,1999，274:50，35562-35570所述方法的改良版本。將A^bfii管內(nèi)皮細胞(HMEC1)鋪在玻璃載玻片上的單獨腔室中，培養(yǎng)至卯％匯合度。在lipofectin(Invitrogen，UK)存在的情況下，用具有SEQIDNO:31核苷酸序列插入片段的FKBP-L/pcDNA哺乳動物表i^I建體轉(zhuǎn)染單層細胞。為了制備所^A狄建體，用BamHl將SEQIDNO:31核酸片段從重組pUC18構(gòu)建體上切下來，并連接到pcDNA3.1(Invitrogen)的BamHl限制性位點中。FKBP-L插入片段的表達產(chǎn)生SEQIDNO:2中的全長重組多肽。6小時之后，移去轉(zhuǎn)染試劑，用移液槍槍頭使所述單層細胞受傷，再添入MCDB-131,并孵育7小時。在4%經(jīng)PBS緩沖的多聚甲醛溶液中固定所述單層細胞10分鐘。由獨立的研究人員在不知情地情況下用顯微鏡評估"傷口"閉合的程度，并使用帶刻度的目鏡網(wǎng)格(lmm/lOOum刻度)在20x放大倍率下(OlympusBX50)進行定量。將FKBP-L處理的載玻片中的閉合程度與0時刻時的傷口尺寸進行比較。這些實驗的結(jié)果顯示于圖3。發(fā)現(xiàn)瞬時轉(zhuǎn)染的FKBP-L產(chǎn)生了等同于SEQIDNO:2的肽，并且較之只有l(wèi)ipofectin和空載體對照的情況顯著抑制HMEC-l遷移的能力。在受傷后7小時，較之對照(Lipo-lipofectin試劑；僅pcDNA-僅僅載體)，F(xiàn)KBP-L抑制50%的HMEC-l遷移。該數(shù)據(jù)提示FKBP-L蛋白質(zhì)是潛在的抗遷移蛋白。實施例2:在傷口閉合測定中全長重組FKBP-L蛋白抑制內(nèi)皮細胞遷移(N=3)這些研究中所用的體外遷移測定是Ashton等(1999)所述方法的改良版本。將HMEC-l鋪在玻璃載玻片上的單獨腔室中，過夜培養(yǎng)至卯%匯合度。移去培養(yǎng)基，并使單層細胞受傷。將新鮮培養(yǎng)基再添加到單層細胞上，加入所需體積的帶his標簽的重組全長FKBP-L蛋白(SEQIDNO:1)以得到所需的終濃度。為了產(chǎn)生重組全長FKBPL蛋白，將FKBPLcDNA(多核苷酸SEQID:31;多肽變體Thrl82、Glyl86;SEQIDNO:1)從pcDNA3.1/FKBPL亞克隆進pRSET-A載體(Invitrogen)的丑a附HI和尸對I位點，并在BL21(DE3)中表達以得到相應(yīng)的N端多His標簽的(his-tag)蛋白質(zhì)(SEQIDNO:1)。在OD0.6時用0.2mMIPTG誘導(dǎo)表達，在15'C下過夜培養(yǎng)細胞。離心使細胞沉淀，并保存在-20'C。使用標準IMAC純化法來純化蛋白質(zhì)，然后脫鹽以除去任何污染的大腸桿菌蛋白(完整說明參見實施例32)。所表達的重組蛋白具有38kDa的計算分子量；如SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)所證實的，發(fā)現(xiàn)計算分子量為42220Da的帶His標簽FKBP-L具有42kDa的分子量。暴露于重組FKBP-L蛋白之后，將所述單層細胞孵育7小時，然后在4%經(jīng)PBS緩沖的多聚曱醛中固定。由獨立的研究人員在不知情的情況下用顯微鏡評估"傷口，，閉合的程度，并使用帶刻度的目鏡網(wǎng)格(1mm/100刻度)在20x放大倍率下(OlympusBX50)進行定量。將FKBP國L處理的載玻片中的閉合程度與時間匹配的假處理對照進行比較，并計算較之時間匹配對照的傷口閉合抑制％。63在圖4中顯示這些實驗的結(jié)果?？梢钥闯觯肍KBP-L重組蛋白處理導(dǎo)致遷移的顯著抑制，其最佳濃度750ngmr1誘導(dǎo)較之時間匹配對照來說HMEC-1遷移進所述單層細胞棵露區(qū)域(denudedarea)的60%的抑制。該實驗的發(fā)現(xiàn)支持了瞬時轉(zhuǎn)染FKBP-L中所觀察到的結(jié)果(圖3)。該結(jié)果還提示，F(xiàn)KBP-L在細胞內(nèi)(如前述圖3中使用表ii^建體)或細胞外(即通it^組織培養(yǎng)基中加入重組蛋白)表達時可抑制內(nèi)皮細胞遷移。這提示，或者FKBP-L通過兩種不同機制抑制內(nèi)皮細胞遷移，或者FKBP-L從細胞中分泌。如本文所示，F(xiàn)KBP-L事實上是分泌的。實施例3:FKBP-L蛋白從HMEC-1細胞分泌(N=l)將人^ir管內(nèi)皮細胞(HMEC1)鋪在35mm塑料培養(yǎng)板上，并培養(yǎng)至100%匯合度。在lipofectin(Invitrogen,UK)存在下，用帶血凝素(HA)標簽的FKBP-L/pcDNA哺乳動物表ii^J建體轉(zhuǎn)染所述單層細胞。這會得到帶HA標簽的SEQIDNO:2的表達。為了得到帶HA標簽的FKBPL質(zhì)粒，通過用BamHI消化將所述FKBPLcDNA(多核苷酸SEQIDNO:31;多肽變體Thrl82、Glyl86;SEQIDNO:2)從pUC18切下來，4吏其平端化，然后定向克隆到pCMV-HA哺乳動物表達載體(Clonetech，U.K.)的平端化Sail位點。這各致帶有N端HA標簽的SEQIDNO:2的表達，以產(chǎn)生44kDa的蛋白。6小時之后，移去轉(zhuǎn)染試劑，用移液槍槍頭使所述單層細胞受傷(對照未受傷)，再添入MCDB-131，并再孵育7小時。收集培養(yǎng)基用于分析，然后用PBS清洗所述細胞兩次，收集至lOOfil2xLaemmli緩沖液(Sigma)中，加熱至100'C保持10分鐘。將細胞裂解物和培養(yǎng)基狹線點樣在硝酸纖維素膜上，用單克隆抗HA抗體(Clontech)(1:1000稀釋)#*測帶HA標簽的FKBP-L蛋白，然后用HRP綴合的兔Ig二抗(1:7500稀釋)(AmershamBiosciences)進行檢測。用SuperSignalWestPico化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑(Pierce)檢測抗體結(jié)合。結(jié)果顯示于圖5中，圖5是狹線/Western印跡，其顯示將帶HA標簽的FKBP-LcDNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進正常HMEC-1單層細胞或受傷單層細胞中，導(dǎo)致在轉(zhuǎn)染后24小時帶HA標簽的FKBP-L蛋白分泌進培養(yǎng)基。用HA抗體進行Western印跡檢測。這些數(shù)據(jù)表明，在正常的生長條件下，F(xiàn)KBP-L蛋白活躍分泌，這支持了以下假說FKBP-L可能通過受體活化來介導(dǎo)其抗血管發(fā)生作用。該數(shù)據(jù)還解釋了為何重組蛋白或使用cDNA構(gòu)建體的it^達在體外和體內(nèi)均能夠觀察到發(fā)揮抗血管發(fā)生作用。實施例4:作為時間函數(shù)測量的全長重組FKBP-L蛋白對傷口閉合測定的作用(N=3)進行下述研究以確定作為時間函數(shù)的全長帶His標簽之重組FKBP-L蛋白對傷口閉合測定的作用。另夕卜，這些研究中所用的體外遷移測定是Ashton等(1999)所述方法的改良版本。將HMEC-1鋪在玻璃載玻片上的單獨腔室中，過夜培養(yǎng)至90%匯合度。除去培養(yǎng)基，并使單層細胞受傷。將新鮮培養(yǎng)基再添加到單層上，加入所需體積的帶his標簽的重組全長FKBP-L蛋白(即SEQIDNO:1)以得到所需的終濃度750ngml"。在固定的時間點移出載玻片，直至傷口完全閉合，然后在4%經(jīng)PBS緩沖的多聚甲醛中固定。由獨立的研究人員在不知情的情況下用顯微鏡評估"傷口"閉合的程度，并使用帶刻度的目鏡網(wǎng)格(1mm/100pm刻度)在20x放大倍率下(OlympusBX50)進行定量。將FKBP-L處理的栽玻片中的閉合程度與時間匹配的假處理對照進行比較，并計算較之時間匹配對照的傷口閉合抑制百分比。這些實驗的結(jié)果顯示于圖6中。可見，較之對照來說，F(xiàn)KBP-L處理(750ngml")的HMEC-1細胞傷口閉合總體被明顯抑制。在第7小時對照中觀察到50%傷口閉合，而在FKBP-L處理的單層細胞中直至最初受傷后第16小時仍未觀察到50%傷口閉合，造成9小時的顯著延遲。在對照實驗中，第16小時觀察到傷口完全閉合，相反地，F(xiàn)KBP-L處理的單細胞層直至第34小時仍有開口。這些結(jié)果表明，F(xiàn)KBP-L單次施用的作用在該體外模型中可以是非常有效的延遲傷口閉合的方法。實施例5:全長重組FKBP-L蛋白對于在合成基膜Matrigel上形成內(nèi)皮細胞的細胞間接觸的作用(N=3)在該實驗中，評估了帶His標簽的全長重組FKBP-L蛋白(SEQIDNO:l)對于形成內(nèi)皮細胞的細胞間接觸的作用。一式三份測定樣品。這些研究中使用的體外管形成測定是Ashton等(1999)所述方法的改良版本。簡言之，使用BDBioCoatTMMatrigelTM基質(zhì)薄層24孔多孔板(BDDiscoveryLabware，Oxford,UK)進行測定。用500^1MCDB-131無血清培養(yǎng)基再水化MatrigelTM,在37。C孵育30分鐘。除去過量培養(yǎng)基，將HMEC-l以lxl()S密度接種，將所述板在37。C、5%C(V95。/?？諝庵蟹跤?小時。將濃度遞增的重組FKBP-L蛋白(SEQIDNO:1)加入每個孔中，一式三份(250-1000ngmr1),將所述板再孵育18小時。通過對指定區(qū)域中不同HMEC-1細胞之間細胞-細胞接觸進行計數(shù)，在每個孔的5個視野中評估鄰近HMEC-1細胞之間形成血管的程度。獨立的研究人員評估每個孔，將FKBP-L處理的孔與假處理孔進行比較。所得結(jié)果顯示于圖7中。發(fā)現(xiàn)重組FKBP-L蛋白以劑量依賴性方式抑制HMEC-1在Matrigel上形成細胞-細胞接觸或血管的能力。該作用的最優(yōu)濃度是750ngmr1，其效率為80%，EC50效力為314ngml1。這些結(jié)果表明，在這些劑量下，F(xiàn)KBP-L抗血管發(fā)生，阻止HMEC-1細胞的管形成。實施例6:使用小鼠海綿測定的全長重組FKBP-L多肽對體內(nèi)血管發(fā)生的作用(N=l;每組兩只小鼠)該實驗使用兩種另外的體外模型---J、鼠海綿測定和主動脈環(huán)模型來測量FKBP-L對血管發(fā)生的作用。在這些實驗中，在C57黑色小鼠皮下植入聚醚海綿，隔日注射10ng牛成纖維生長因子(bFGF)或10ngbFGF+5pg帶His標簽的全長重組FKBP-L多肽(SEQIDNO:1)。處理14天之后，收集海綿、切片并用蘇木精和伊紅染色。結(jié)果顯示于圖8和9。在圖8A中，可以在bFGF處理海綿的微血管中觀察到顯示為暗灰色細胞并用箭頭標出的紅細胞。另外，可以看出大量的細胞向內(nèi)生長(顯示為淺灰色)。在還用FKBP-L處理的海綿中，紅細胞和細胞向內(nèi)生長都不明顯得多(圖8B)。來自每組2只小鼠的海綿中的血管計數(shù)顯示于圖9，其是在不知情的情況下以40x放大倍率進行計數(shù)。FKBP-L處理的海綿比bFGF單獨處理的海綿具有顯著較少的血管(p=0.0008)。結(jié)果顯示全長重組FKBP-L多肽可在體內(nèi)抑制血管發(fā)生，并且這種多肽可能對臨床具有潛在的治療價值。實施例7:全長重組FKBP-L多肽對離體主動脈環(huán)外植體模型的血管發(fā)生的作用，其研究了對平均長度、最大長度和血管形成數(shù)量的作用(N=3)對雄性Wistar大鼠處以安樂死，無菌操作摘除胸主動脈，將其切片成1cm厚的環(huán)。在無菌培養(yǎng)基中將所述環(huán)洗10次，以除去任何細菌，并包埋在24孔板上的Matrigel中。在所述孔中添加2ml培養(yǎng)基以及濃度遞增的帶His標簽的全長重組FKBP-L蛋白(SEQID1)。孵育所述板8天，孵育后將Matrigel和環(huán)固定于4%經(jīng)PBS緩沖的多聚曱醛中，并保存在PBS中。由獨立的研究人員在不知情的情況下用顯微鏡評估血管發(fā)育的程度，并使用帶刻度的目鏡網(wǎng)格(lmm/100[im刻度)在20x放大倍率(OlympusBX50)下定量。測定每個視野中的血管長度、最大血管長度和血管數(shù)，并將其與時間匹配假對照進行比較，計算抑制百分比(％)。這些實驗的結(jié)果顯示于圖10中?？梢奆KBP-L在此離體模型中是強力的劑量依賴性血管發(fā)生抑制劑。形成的平均血管長度和最大血管長度在濃度為1000ngmr1時被顯著抑制，與時間匹配對照相比分別顯示出63%和70%的抑制。在用500ngmr1的FKBP-L蛋白處理后，從主動脈外植體形成的血管數(shù)最優(yōu)地被抑制65%。實施例8:使用MTT測定的全長重組FKBP-L多肽對HMEC-1生存力或增殖的作用(N=3)這些實驗評估了全長FKBP-L蛋白的抗血管發(fā)生作用是否由該多肽的毒性所致。使用MTT測定來檢測細胞生存力/增殖。簡言之，在96孔板中接種HMEC-1細胞(2.5xl03)，使之貼壁5小時。用濃度遞增的帶His標簽的重組FKBP-L蛋白(SEQIDNO:1)處理所述細胞，醉育24小時(圖11A)和48小時(圖IIB)。孵育后，將所述細胞暴露于5mgmr1的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑鹽(MTT)溶液4小時。吸出所述細胞的培養(yǎng)液，將200nlDMSO加入以還原鹽，而誘導(dǎo)顏色變化。在550nm處用比色法分析所述孔，將結(jié)果與未處理對照細胞進行比較。實驗重復(fù)進行三次。結(jié)果顯示于圖11A和11B中。發(fā)現(xiàn)在所測定的任何時間點FKBP-L較之時間匹配對照來說對HMEC-1細胞沒有顯著影響，這提示在先前測定中觀察到的抗血管發(fā)生作用不是由細胞生長抑制或FKBP-L介導(dǎo)的毒性造成的。實施例9:暴露于750mgml"全長重組FKBP-L多肽的遷移內(nèi)皮細胞之細胞骨架形態(tài)的變化(N=2)用FKBP-L處理后通過對微管蛋白和波形蛋白染色進行免疫組化分析來評估細胞骨架形態(tài)。將HMEC-1接種于四孔腔室中的栽玻片上，過夜孵育至形成匯合的細胞層。從每個孔中除去培養(yǎng)基，如前所述使單細胞層受傷。再次添加含750ngml1帶His標簽的重組FKBP-L蛋白(即SEQIDNO:1)培養(yǎng)基到所述細胞。孵育所述細胞5小時，從載玻片移去所述腔室，在PBS中清洗所述細胞4次，然后在4。/。經(jīng)PBS緩沖的多聚甲醛中固定，用0.1%TritonX處理20分鐘。在PBS中清洗所述細胞3次，在含0.1%TritonX的2°/。BSA中封閉20分鐘。在PBS中清洗經(jīng)封閉的細胞，然后與下述單克隆一抗之--起孵育所述細胞90分鐘(A)抗a微管蛋白(1:500);和(B)抗波形蛋白(1:200)。在PBS中清洗所述細胞，然后用FITC綴合的抗小鼠二抗(1:30)在室溫孵育1小時。用含碘化丙啶的Vectashield固定細胞并封片以阻止失水。將載玻片用錫紙包封并保存于4'C，用于熒光共聚焦顯微鏡的分析。結(jié)果顯示于圖12(對細胞進行抗微管蛋白染色)和圖13(對細胞進行抗波形蛋白染色)。在對照遷移HMEC-1中，微管(用抗a微管蛋白染色)(圖12:對照)具有朝向傷口方向的常規(guī)線性結(jié)構(gòu)，由此幫助定向遷移過程?？梢栽诩毎说那懊嬗^察到染色的致密區(qū)，該微管組織中心(MTOC)是固定時發(fā)生定向遷移的良好指示。相反，在FKBP-L處理的細胞中(圖12:FKBP-L),微管看上去幾乎不朝向傷口?？梢姡⒐芸瓷先ポp微彎曲或纖細并且從左向右排列，MTOC看上去位于細68胞的側(cè)面，表明沒有活躍的定向遷移。圖13顯示用抗波形蛋白染色的HMEC-1的中間纖維。對照(未處理)細胞再次顯示出有組織的延長并指向傷口方向，再次表明所述細胞正活躍遷移(圖13:對照)。相反地，在FKBP-L處理的非遷移HMEC-1中的中間纖維看上去高度無組織，甚至成簇分布，這表明它們并未活躍地遷移進傷口(圖13:FKBP-L)。該共聚焦研究的結(jié)果提示FKBP-L介導(dǎo)遷移抑制的機制可能是由細胞骨架引導(dǎo)的。實施例10:全長重組FKBP-L對PC3、HT29和MDA腫瘤細胞遷移的影響(N=3)在這些實驗中，評估了重組FKBP-L對于腫瘤細胞遷移的作用。這些研究中所使用的體外遷移測定是Ashton等(1999)所述方法的改良版本，見上文。將PC3、MDA231和HT29肺瘤細胞鋪在玻璃載玻片上的單獨腔室中，過夜培養(yǎng)至90%匯合度。除去培養(yǎng)基，使單細胞層受傷。再次添加新鮮培養(yǎng)基和所需體積的帶His標簽的重組FKBP-L蛋白(SEQIDNO:1)到所述細胞，以達到所顯示的終濃度。孵育所述單層細胞24小時，然后在4。/。經(jīng)PBS緩沖的多聚甲醛中固定。由獨立的研究人員在不知情的情況下用顯微鏡評估"傷口，，閉合的程度，并使用帶刻度的目鏡網(wǎng)格(1mm/100jim刻度)在20x放大倍率下(OlympusBX50)進行定量。將FKBP-L處理的載玻片中的閉合程度與時間匹配的假處理對照進行比較，計算較之時間匹配對照的傷口閉合抑制百分比。結(jié)果在圖14中A、B和C圖顯示。發(fā)現(xiàn)重組FKBP-L多肽以劑量依賴性方式抑制腫瘤細胞遷移。這些發(fā)現(xiàn)表明FKBP-L可用作降低腫瘤細胞^l襲和轉(zhuǎn)移的治療劑。實施例11:直接注射FKBP-LcDNA構(gòu)建體對DU145人前列腺腫瘤細胞體內(nèi)生長的作用(N=l,每個治療組4-7只小鼠)進行實驗以確定直接腫瘤內(nèi)注射FKBP-LcDNA構(gòu)建體對DU145人前列腺肺瘤細胞體內(nèi)生長的作用。細胞培養(yǎng)Dul45(前列腺癌)細胞獲得自CancerResearchUK,培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen)中。所有細胞系以單層生長，孵育在37。C5。/。C02中。DNA質(zhì)粒構(gòu)建體通過用BamHI從pUC18上切下FKBPLcDNA(多核苷酸SEQIDNO:31)然后將FKBP-L定向連接到pcDNA3.1(Invitrogen)的BamHI限制性位點中來構(gòu)建FKBP-L/pcDNA3.1質(zhì)粒，如實施例1所述。通過用Hpal(Promega)和EcoV(Invitrogen)消化pBLASThENDOXV質(zhì)粒(InVivoGen)以釋放hEndoXV插入片段來構(gòu)建內(nèi)皮抑素質(zhì)粒(用作抗血管發(fā)生陽性對照)hEndoXV/pcDNA3.1。將hEndoXV插入片段定向連接到pcDNA3.1(Invitrogen)ECoRV限制性位點。前列腺癌異種移植模型使用19只雄性免疫減弱(嚴重的聯(lián)合免疫缺陷)小鼠(Harlan)。在屏障飼養(yǎng)設(shè)施中使小鼠適應(yīng)環(huán)境并以一組5只或更少裝籠。如上所述培養(yǎng)Dul45(前列腺癌)細胞。收獲亞匯合細胞，用PBS將細胞濃度調(diào)節(jié)至5xl(T細胞/ml。在每只小鼠的背上剔毛。施用麻醉劑后，用26號針在每只小鼠后背兩側(cè)皮內(nèi)注射5xl06個Dul45腫瘤細胞(100pi)。使胂瘤生長至達到100-125mn^的體積。將小鼠隨機分為4個治療方案(a)不治療(4只小鼠)；(b)空栽體(pcDNA3.1)(4只小鼠)；(c)hEndoXV/pcDNA3.1(4只小鼠);和(d)FKBP國L/pcDNA3.1(7只小鼠)。小鼠接受肺瘤內(nèi)注射Lipofectamine2000(Invitrogen):質(zhì)粒復(fù)合物，每周兩次，每3或4天一次。簡言之，每只動物每次注射的Lipofectamine2000:質(zhì)粒復(fù)合物如下制備25pi質(zhì)粒(1pg/pl)加入到25jiloptimem(Invitrogen)中,10piLipofectamine2000(Invitrogen)加入到40[iloptimem中。將所述兩種溶液在室溫孵育5分鐘。然后合并兩種溶液，使其在室溫再孵育20分鐘，然后進行腫瘤內(nèi)注射。在每次處理前測量腫瘤。腫瘤體積的計算如下4/3tt一(其中r=l/2GMP，GMP-^/長度x寬度x高度)。結(jié)果顯示于圖15中。FKBP-L和內(nèi)皮抑制素處理的腫瘤都顯示出壞死中心的跡象，即它們呈現(xiàn)圓環(huán)形。這是典型的抗血管發(fā)生的表現(xiàn)。對照達到四倍體積的時間約為35天，但是FKBP-L處理的腫瘤之生長在受到從最初處理后被抑制了超過3個月(IOO天)，腫瘤僅有其初始體積的10%。因此，發(fā)現(xiàn)肺瘤內(nèi)注射FKBP-L表達構(gòu)建體抑制DU145人腫瘤異種移植生長，其相當于(如果未超過的話)目前在至少某些國家(例如中國)批準用于治療肺癌的內(nèi)皮抑素可見的效應(yīng)。另外，這顯示了FKBP-L基因治療對于臨床的潛在治療價值。實施例12:在L132細胞中FKBP-L反義寡核香酸調(diào)節(jié)的與血管發(fā)生/遷移相關(guān)的基因cDNA微陣列分析在暴露于FKBP-L反義寡核酸(FKBP-L反義寡核酸5，ATGGCCAGGCTCCCGCTC3，)(SEQIDNO:40)或僅作為對照的lipofectin8小時之后，從L132細胞中分離總RNA。根據(jù)制造商的說明，使用QiagenOligotex試劑盒(Qiagen,UK)從總RNA樣品中提取多聚A+mRNA。這些mRNA樣品(每種樣品800ng)被送至IncyteGenomics,USA,在那兒進行UniGEM2.0微陣列分析。Incyte，sLifearray芯片能夠同時檢測多達10000個基因，得到兩個不同樣品中基因表達水平的比較。筒言之，進行標準逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將兩種mRNA樣品轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄝ既玖蠘擞浀腸DNA。來自用FKBP-L反義寡核苷酸處理8小時后的L132細胞之mRNA被用于產(chǎn)生花菁3(Cyanine3)(綠色)標記的探針，來自僅用lipofectin處理8小時后的L132細胞之mRNA被用于產(chǎn)生花菁5(Cyanine5)(紅色)標記的探針。將這兩種熒光探針樣品同時施加到含有多種固定于固體支持物上特定位置之cDNA探針的單個微陣列芯片，其中它們竟爭性地與排列的cDNA分子反應(yīng)。孵育之后，將所述微陣列進行一系列清洗，以確保除去所有未雜交的樣品。然后捕捉所述微陣列的圖像，使用用于熒光信號檢測的掃描裝置獲得所述圖像。通過激發(fā)陣列上的熒光染料，該掃描裝置產(chǎn)生每個點強度的數(shù)據(jù)。掃描所述芯片每個元件的Cy3(綠色)熒光標記，然后掃描Cy5(紅色)熒光標記，以產(chǎn)生兩種染料通道的電子圖像。使用IncyteGEMTools軟件包來分析最終的陣列圖像。上調(diào)的基因與血管發(fā)生的增加有關(guān)(表l)。已知升高的RhoA、RhoC、ROCKI和ROCKII的表達與腫瘤發(fā)展到更晚期階段有關(guān)，已提示Rho和ROCK信號途徑促成某些腫瘤細胞的形態(tài)改變和轉(zhuǎn)移行為。這與FKBP-L過表達抑制血管發(fā)生以及使用反義寡核苷酸抑制FKBP-L可通過激活Rho和ROCK而促進血管發(fā)生是一致的。這些數(shù)據(jù)暗示，使用反義寡核苷酸或靼向siRNA敲低FKBPL可促進血管發(fā)生，并可用于促進慢性傷口的愈合。表1暴露于FKBP-L反義寡核苷酸之后差異表達的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>實施例13:在HMEC-l和肺瘤細胞系DU145、PC3、HT29、MCF-7、MDA-231中的細胞遷移抑制依賴于CD44RT-PCR檢測CD74mRNA表達將DU145、HMEC-1、HT29、PC3、MCF-7和MDA-231細胞接種于T25組織培養(yǎng)瓶中，使之生長至達到70%匯合度。根據(jù)制造商的說明，使用RNAqueous試劑盒(Ambion，Cat#AM1912)從細胞分離RNA。根據(jù)制造商的說明，用TurboDNA-freeTM(Ambion，Cat弁l卯6)處理RNA，以除去雜質(zhì)DNA。使用ImProm11，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，CatA3800)從RNA樣品制備cDNA。簡言之，用不含核酸酶的水將0.5嗎RNA、0.5嗎寡聚dT引物配制成5nl，在70'C孵育5分鐘，然后在水上孵育5分鐘。然后加入下述試劑不含核酸酶的水(5.3jil)、5xImPromIITM反應(yīng)緩沖液(4fil)、25mMMgCl2(3.2pi)、10mMdNTP混合物(1pl)、ImPromII逆轉(zhuǎn)錄酶(1jil)和重組RNasin核糖核酸酶抑制劑(0.5jil)。將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系在25'C孵育5分鐘，在42'C孵育1小時，最后在70'C孵育15分鐘。對于每個PCR反應(yīng)來說，混合下列試劑cDNA(2pl)、10xPCR緩沖液(5pl)、10mMdNTP混合物(2pi)、50mMMgCl2(2nl)、TaqDNA聚合^(5U/nl)(0.25pi)(InvitrogenCat#18038-018)、分子級水(34.75nl)和2pi合適的正向和反向引物(10fiM)(參見表2)。使用下述溫度程序擴增樣品1個循環(huán)的94'C1分鐘，40(CD74)或25(GAPDH)個循環(huán)的94°C45秒、55'C30秒和72'C卯秒；然后是1個循環(huán)的72°C10分鐘。表2:CD74和GAPDH引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>檢測MIF和CD44的Western印跡使用western印跡分析評估所有細胞系包括小鼠內(nèi)皮細胞系2H-11(僅用于MIF測試)的CD44和MIF狀態(tài)。將細胞收集到laemmli緩沖液(Sigma)中，加熱到卯。C保持10分鐘。使用XcellSureLockMini-cell系統(tǒng)(Invitrogen)對樣品進行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，在室溫下1%乳溶液中封閉1小時，并用1:500稀釋的單克隆抗CD44H抗體(R&DSystem,Cat#BBA10)或1:500稀釋的抗MIF抗體(R&DSystem,Cat#AF-289-PB)以及1:5000稀釋的抗p肌動蛋白抗體(Sigma,Cat#A4700)進行檢測。然后，在檢測CD44或P肌動蛋白時，用1:3500稀釋的HRP綴合的小鼠Ig二抗(GEHealthcare,UK，CatNA931V)檢測印跡；或者在檢測MIF時，用HRP綴合的山羊Ig二抗(SantaCruzBiotechnology,Cat弁sc國2020)來檢測印跡。使用SuperSignalWestPico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce,Cat#34080)檢測抗體結(jié)合。結(jié)果顯示于圖16。發(fā)現(xiàn)CD74和MIF在所有先前針對FKBP-L介導(dǎo)傷口閉合抑制進行評估的細胞系中表達。但是，CD44存在于PC3、MDA-231、HT29和HMEC-1中，但不存在于Dul45和MCF-7中。CD44的缺乏與在Dul45和MCf-7中FKBP-L無法抑制傷口閉合相關(guān)聯(lián)(下文實施例14所示)。該數(shù)據(jù)支持了FKBP-L與CD44結(jié)合并且干擾CD74/MIF結(jié)合從而導(dǎo)致來自這些受體的血管發(fā)生信號響應(yīng)被抑制的假說。實施例14:全長重組FKBP-L多JlUfPC3(CD44+ve)、MDA(CD44+ve)、HT29(CD44+ve)、MCF-7(CD44-ve)和DU145(CD44國ve)腫瘤細胞遷移的作用(N=3)這些研究中使用的體外遷移測定是Ashton等(1999)所述方法的改良版本，見上文。將PC3(前列腺腫瘤細胞系；CD44陽性，CD44+ve)、MDA231(乳腺肺瘤細胞系；CD44+ve)、HT29(結(jié)腸直腸腫瘤細胞系；CD44+ve)、MCF-7(乳腺肺瘤細胞系；CD44陰性；CD44-ve)和DU145(前列腺腫瘤細胞系；CD44-ve)鋪在玻璃載玻片上的單獨腔室中，使之過夜生長至90%匯合度。除去培養(yǎng)基，使單層細胞受傷。再次添加新鮮培養(yǎng)基和所需體積的帶His標簽的重組FKBP-L蛋白(SEQIDNO:1)到所述單層細胞，以得到所需終濃度。孵育所述單層細胞24小時，然后在4。/。經(jīng)PBS緩沖的多聚甲醛中固定。由獨立的研究人員在不知情的情況下用顯微鏡評估"傷口"閉合的程度，并使用帶刻度的目鏡網(wǎng)格(1mm/100fim刻度)在20x放大倍率下(OlympusBX50)進行定量。將FKBP-L處理的載玻片中的閉合程度與74時間匹配的假處理對照進行比較，計算較之時間匹配對照傷口的閉合抑制百分比。還使用western印跡分析來評估細胞系中CD44的狀態(tài)(圖16)。將細胞收集到laemmli緩沖液(Sigma)中，加熱到卯'C保持10分鐘。使用XcellSureLockMini-cell系統(tǒng)(Invitrogen)對樣品進行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，在室溫下1%乳溶液中封閉1小時，用1:500稀釋的單克隆抗CD44H抗體(R&DSystem,Cat#BBA10)和1:5000稀釋的抗p肌動蛋白抗體(Sigma,Cat#A4700)進行檢測。然后，在檢測CD44或p肌動蛋白時，用1:3500稀釋的HRP綴合的小鼠Ig二抗(GEHealthcare,UK，CatNA931V)檢測印跡，或者在檢測MIF時用HRP綴合的山羊Ig二抗(SantaCruzBiotechnology,Cat#sc-2020)。使用SuperSignalWestPico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce,Cat#34080)檢測抗體結(jié)合。傷口閉合測定的結(jié)果在圖17A-17E中顯示?？梢娭亟MFKBP-L可在CD44+ve腫瘤細胞系中抑制胂瘤細胞遷移，但是在CD44-ve肺瘤細胞系中不能。該數(shù)據(jù)提示FKBP-L可以在CD44+ve腫瘤細胞系亞群中抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。實施例15:通過siRNA乾向方法在PC3細胞中敲低CD44抑制FKBP-L介導(dǎo)的PC3遷移抑制(N=2)用siRNA對照非耙向siRNA(SCRsiRNA)(Dharmacon,Cat#D-001210-01-05)或CD44乾向siRNA(CD44siRNA)(Dharmacon，Cat#009999)轉(zhuǎn)染PC3細胞72小時。簡言之，將1.2xl(^個PC3細胞接種于兩個P90皿中，在37'C孵育24小時。為了轉(zhuǎn)染，將150nl的siRNA對照非乾向siRNA或CD44乾向siRNA(2jiM)加入到450fil無血清培養(yǎng)基中(管l)。一式兩份地將18pi的Dharmafect2轉(zhuǎn)染試劑(Dharmacon,Cat#T-2002-03)加入到582pi無血清培養(yǎng)基中(管2)。所有管在室溫孵育5分鐘。將管1和2的內(nèi)容物混合，在室溫再孵育20分鐘。在此孵育期間，清洗兩個包含PC3細胞的P卯皿，向每個皿中加入4.8ml完全培養(yǎng)基。然后，將合適的siRNA轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入，將該亞在37'C孵育72小時。然后將轉(zhuǎn)染細胞接種到腔室載玻片中(1.25xl05個細胞/腔室)，在37'C再孵育24小時。使單層細胞受傷，將帶His標簽的全長重組FKBP-L75(SEQIDNO:1)(1500ng/ml)或者完全培養(yǎng)基加入到所述單層細胞中。再過24小時之后，固定所述單層細胞，使用帶刻度的網(wǎng)格以不知情的方式評估傷口閉合的程度。計算FKBP-L處理的單層細船目比于未處理之單層細胞的傷口閉合抑制百分比。FKBP-L抑制了21.7%的SCRsiRNA所處理細胞的遷移，但是對CD44siRNA處理的細胞沒有影響。進行western印跡分析來證實CD44在PC3細胞中的敲低。用siRNA對照非乾向siRNA(50nM)或CD44耙向siRNA(50nM)轉(zhuǎn)染后144小時，將細胞收獲到laemmli緩沖液(Sigma)中，加熱到90。C保持10分鐘。使用XcellSureLockMini-cell系統(tǒng)(Invitrogen)對樣品進行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，在室溫下1%乳溶液中封閉1小時，用1:500稀釋的單克隆抗CD44H抗體(R&DSystem,Cat#BBA10)和1:5000稀釋的抗p肌動蛋白抗體(Sigma，Cat#A4700)進行檢測。然后，用1:3500稀釋的HRP綴合的小鼠Ig二抗(GEHealthcare,UK，CatNA931V)檢測印跡。使用SuperSignalWestPico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce,Cat#34080)檢測抗體結(jié)合。結(jié)果顯示于圖18中。發(fā)現(xiàn)FKBP-L可在CD44+ve細胞系PC3中存在對照siRNA的情況下抑制遷移。通過用CD44siRNA敲低CD44(參見CD44siRNA泳道)，發(fā)現(xiàn)FKBP-L介導(dǎo)的遷移抑制依賴于CD44的存在。這些數(shù)據(jù)還與需要細胞系(如HMEC-l、PC3、MDA-231和HT29)中內(nèi)源性CD44相關(guān)聯(lián)，以促進FKBP-L介導(dǎo)的遷移抑制。在缺乏CD44的細胞系(即MCF-7和DU145)中檢測不到這樣的FKBP-L介導(dǎo)之遷移抑制。實施例16:在受傷HMEC-l單層細胞中FKBP-L與內(nèi)源CD44相互作a用HMEC-l細胞接種4個P卯組織培養(yǎng)亞，使其在24小時后達到卯％匯合度。用FKBP-L/pcDNA3.1DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染所述4個包含HMEC-l細胞的P90皿。簡言之，為每個P90皿如下制備Lipofectin:FKBP-L/pcDNA3.1質(zhì)粒復(fù)合物將4pg質(zhì)粒加入到optimem(Invitrogen)至終體積400pl，將40jxlLipofectin(Invitrogen)加入到360pioptimem。將這兩種溶液在室溫孵育45分鐘。然后合并兩種溶液，使其在室溫再孵育15分鐘。在該孵育期間，用PBS兩次，將3.2mlOptimem加入每個皿中。將Lipofectin/質(zhì)粒復(fù)合物輕柔地加入每個亞中，在37。C孵育6小時。然后，將細胞的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基除去，替換為完全培養(yǎng)基。在37。C再孵育所述細胞18小時。使HMEC-1單層細胞受傷(每個P90皿3處傷口)，在37'C孵育7小時。然后在冰冷的PBS中清洗所述細胞兩次，將之收獲于細胞裂解緩沖液(PBS、1%Igepal、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1%SDS、10mM鉬酸鈉、1個不含EDTA的藥片)；每個P卯皿300pl。將所述細胞裂解液在4'C轉(zhuǎn)動孵育30分鐘。在4。C將所述細胞裂解液以13000rpm離心20分鐘，以除去細胞碎片。然后通過與預(yù)清洗的瓊脂糖G微珠一起在4'C轉(zhuǎn)動孵育1小時來預(yù)澄清上清。將預(yù)澄清的細胞裂解液分為3份，三分之一加入到瓊脂糖G-CD44抗體綴合物，三分之一加入到瓊脂糖G-FKBP-L抗體綴合物，三分之一加入到預(yù)清洗的微珠(陰性對照)。在4卩過夜轉(zhuǎn)動孵育抗體-瓊脂糖G/細胞裂解液混合物。然后用冰冷的細胞裂解緩沖液清洗所述微珠三次，用冰冷的PBS洗三次。然后將所述微珠重新置于60pllaemmli緩沖液中。進行對免疫沉淀樣品的western印跡分析，以證實FKBP-L與CD44的相互作用。將樣品加熱到90'C保持10分鐘。使用XcellSureLockMini-cell系統(tǒng)(Invitrogen)對樣品進行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，在室溫下1%乳溶液中封閉1小時，用1:500稀釋的單克隆抗CD44H抗體(R&DSystem,Cat#BBA10)和1:1000稀釋的抗FKBP-L抗體(Proteintech)進行檢測，然后用1:3500稀釋的HRP綴合的小鼠(CD44)或兔(FKBP-L)Ig二抗(GEHealthcare,UK，CatNA931V)檢測印跡。使用SuperSignalWestPico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce,Cat#34080)檢測抗體結(jié)合。結(jié)果顯示于圖19。因此，使用免疫沉淀在受傷單層細胞中外源性過表達的FKBP-L與內(nèi)源性CD44相互作用。內(nèi)源性FKBP-L和CD44之間的相互作用只在受傷單層細胞中檢測到，未在未受傷單層細胞中檢測到(數(shù)據(jù)未顯示)。這提示可檢測到與CD44的相互作用需要表達臨界水平的FKBP-L。另外，該相互作用僅發(fā)生在被引發(fā)遷移的內(nèi)皮細胞中，即受傷的單層細胞中。實施例17:FKBP-L的N端結(jié)構(gòu)域?qū)τ贔KBP-L的抗血管發(fā)生特性是重要的(N=3)制備截短的FKBP-L突變體構(gòu)建體為了構(gòu)建5個FKBP-L截短突變體質(zhì)粒構(gòu)建體(A34FKBP-L/pcDNA3.1、A40FKBP-L/pcDNA3.1、A48FKBP-L/pcDNA3.1、A58FKBP畫L/pcDNA3.1、A86FKBP畫L/pcDNA3.1、A151FKBP-L/pcDNA3.1和A200FKBP-L/pcDNA3.1);通過定點誘變(Quickchange試劑盒，Stratagene)在第34、40、48、58、86、151或200位氨基酸處引入終止密碼子。對于每個定點誘變反應(yīng)來說混合pcDNA3.1/FKBP-L/DIRl(10ng)、10x^J[緩沖液(5pl)、10mMdNTP(2jil)、PfuTurboDNA聚合酶(2.5，)(lfil)、分子級水(37fil)、QuikSolution(3^1)和ljil合適的正向和反向引物(125ng/ji1)。使用下述溫度程序擴增樣品1個循環(huán)的95'C1分鐘，18個循環(huán)的95'C50秒、60°C50秒和68'C16分鐘；然后是1個循環(huán)的68'C7分鐘。表3用于制備FKBP-L截短的FKBP-L突變體構(gòu)建物的引物FKBP-Ii截短突變體引物序列SEGIDNO:△34FKBP-WpcD船3.15'-GAACCTTGATTCAGTTATTTAGATTAGGCAGCAGCCCCG-315'-CGGGGCTGCTGCCTAATCTAAATAACTGAATCAAGGTTC-3■4546△40FKBP-Lj/pcDNA3.157-CAGATTAGGCAGCAGCCCTGAGACCCTCCTACCGAAAC-3'5'-GTTTCGGTAGGAGGGTCTCAGGGCTGCTGCCTAATCTG-3'4748△48FKBP-Lj/pcDNA315'-CCTACCGAAACGCTTTAGCTGGAAGTAAGCC-3'5'-GGCTTACTTCCAGCTAAAGCGTTTCGGTAGG-3'4950A58FKBP-WpcDNA3.151-CCCAGATCCAGCCAGCTAAATTCTAGAGCATAC-3'5'-GTATGCTCTAGAATTTAGCTGGCTGGATCTGGG-3'5152li/pcDNA3.15，-CATGGATCAACCAGTTAGATGCCAGAGGCCC-315'-(3GGCCTCl"GGCATCTAACTGGTTGATCCATG-3，5354A151FKBP-L/pcDNA3.151-GGCGTAGGGCCATGAAGGGAGGAAACTTG-3'5'CAAGTTTCCTCCCTTCATGGCCCTACGCC-3'5556A200FKBP-5，-CCGAGACTCCTGGTAGCTGGAGACTAGC-3'5，-GCTAGTCTCCAGCTACCAGGAGTCTCGG-3'575878將限制性核酸內(nèi)切酶D/mI(10U/nl)(ljil)直接加入每個擴增反應(yīng)體系，在37'C孵育1小時以消化親本(非突變)DNA。用經(jīng)消化的擴增反應(yīng)轉(zhuǎn)化XL-10-gold超級感受態(tài)細胞，將其鋪在含氨千青霉素(100ng/ml)的LB瓊脂平板上。杏沐一個菌落，將其培養(yǎng)于含氨節(jié)青霉素(100fig/ml)的200mlLB液體培養(yǎng)基中。使用QiagenPlasmidMaxi試劑盒純化每個截短的FKBP-L突變DNA構(gòu)建體。通過自動DNA測序(FusionAntibodiesLtd)證實截短構(gòu)建體中的序列變化(參見例如圖20A和20B)。轉(zhuǎn)染所述7個FKBP-L截短突變構(gòu)建體以表達圖1所示多肽(SEQIDNO:3-9)。體外遷移測定這些研究中使用的體外遷移測定是Ashton等(1999)所述方法的改良版本。將HMEC-1鋪在玻璃載玻片上的單獨腔室中，培養(yǎng)至卯％匯合度。在lipofectin存在時，用1嗎的野生型FKBP-L/pcDNA(以表達多肽SEQIDNO:1)、A34FKBP-L/pcDNA3.1、A40FKBP-L/pcDNA3.1、A48FKBP-L/pcDNA3.1、A58FKBP畫L/pcDNA3.1、A86FKBP-L/pcDNA3.1、A151FKBP-L/pcDNA3.1或A200FKBP-L/pcDNA3.1構(gòu)建體(以表達圖1所示的多肽)轉(zhuǎn)染所述單層細胞。6小時后除去轉(zhuǎn)染試劑，用移液器槍頭4吏單層細胞受傷，再次添加MCDB-131并孵育7小時。在4%經(jīng)PBS緩沖的多聚甲醛中固定所述單層細胞10分鐘。由獨立的研究人員在不知情的情況下用顯微鏡評估"傷口"閉合的程度，并使用帶刻度的目鏡網(wǎng)格(1mm/100刻度)在20x放大倍率下(OlympusBX50)進行定量。結(jié)果顯示于圖20C。發(fā)現(xiàn)全長野生型FKBP-L和截短突變體A48、A58、A86、A151、A200抑制傷口閉合。WT-FKBP-L和A58分別抑制36.26%和48.8%的傷口閉合。A34和A40不能顯著抑制傷口閉合，提示在這些突變體中缺失了活性結(jié)構(gòu)域，并且抗血管發(fā)生活性結(jié)構(gòu)域位于全長FKBP-L的34位和57位#^酸之間。實施例18:使用傷口刮擦測定評估覆蓋FKBP-L活性結(jié)構(gòu)域的候選肽與重組FKBP-L比較(N=3)這些研究中使用的體外遷移測定是Ashton等(1999)所述方法的改良版本，見上文。將HMEC-1鋪在玻璃載玻片上的單獨腔室中，過夜培養(yǎng)至卯％匯合度。除去培養(yǎng)基，使單層細胞受傷。再次添加新鮮培養(yǎng)基到單層細胞，加入所需體積的下述肽至10-"-l(T6M的劑量范圍。SEQIDNO:10恥-QIRQQPRDPPTETLEIiEVSPDPAS-C0OHSEIQIDNO:6NH2METPPVWTIGEKDTSQPQQEWEKKTLRENLDSVIQIRQQPRDPPTETIiELEVSPDPAS-COOH孵育所述單層細胞7小時，然后在4%經(jīng)PBS緩沖的多聚甲醛中固定。由獨立的研究人員在不知情的情況下用顯微鏡評估"傷口"閉合的程度，并使用帶刻度的目鏡網(wǎng)格(1mm/100pm刻度)在20x放大倍率下(OlympusBX50)進行定量。將FKBP-L處理的載玻片中的閉合程度與時間匹配的假處理對照進行比較，計算較之時間匹配對照的傷口閉合抑制百分比。這些實驗的結(jié)果顯示于圖21中。在較低劑量范圍(l(r14-l(T9M)中，F(xiàn)KBP誦L24聚體和1-57聚體是強力的傷口閉合抑制劑。在10氣10—9M之間觀察到最大抑制，針對每種肽的EC50非常近似。在摩爾/摩爾基礎(chǔ)上，這兩種肽顯示出相比于全長重組蛋白增強的效力。結(jié)論是，24聚體和1-57聚體是內(nèi)皮細胞遷移的強力抑制劑。實施例19:在管形成測定中使用合成基膜Matrigel來評估覆蓋FKBP-L活性結(jié)構(gòu)域的候選肽對內(nèi)皮細胞細胞間接觸形成的作用與重組FKBP-L的比較(N=3)方法這些研究中使用的體外管形成測定是Ashton等(1999)所述方法的改良版本。簡言之，使用BDBioCoatMatrigel基質(zhì)薄層24孔多孔板(BDDiscoveryLabware，Oxford,UK)進行測定。用500piMCDB-131無血清培養(yǎng)基再水化Matrigel,在37'C孵育30分鐘。除去過量培養(yǎng)基，將HMEC-1以lxl()5密度接種，將所述板在37。C5%80C(V95。/?？諝庵蟹跤?小時。使用1(T"10-6M濃度遞增的FKBP-L24聚體(SEQIDNO:10)和1畫57聚體(SEQIDNO:6)。再孵育所述板18小時。通過對指定區(qū)域中不同HMEC-1細胞之間細胞-細胞接觸進行計數(shù)，在每個孔的5個視野中評估鄰近HMEC-1細胞之間形成血管的程度。獨立的研究人員評估每個孔，將FKBP-L處理的孔與假處理孔進行比較。所得結(jié)果顯示于圖22中。FKBP-L24聚體和1-57聚體均以劑量依賴性方式抑制HMEC-1在Matrigel上形成細胞-細胞接觸或管的能力。在該測定中所述l-57聚體更有效，其中EC50=0.7pM，而所述24聚體的EC50為30pM。結(jié)論是，該數(shù)據(jù)提示FKBP-L24聚體和FKBP-L1-57聚體是內(nèi)皮細胞管形成的強力抑制劑。實施例20:使用大鼠主動脈環(huán)測定的覆蓋FKBP-L活性結(jié)構(gòu)域的候選肽對血管發(fā)生萌發(fā)的作用。對所形成血管的平均長度、最大長度和血管形成數(shù)量的作用(n=3);與全長重組蛋白比較對雄性Wistar大鼠處以安樂死，無菌操作摘除胸主動脈，將其切片成1cm厚的環(huán)。在無菌培養(yǎng)基中將所述環(huán)洗10次，以除去任何細菌，并包埋在24孔板上的Matrigel中。在所述孔中添加2ml培養(yǎng)基以及濃度遞增的FKBP-L24聚體(SEQIDNO:10)和FKBP-L1-57聚體(SEQIDNO:6)和重組FKBP-L蛋白(SEQIDNO:1)。由獨立的研究人員在不知情的情況下評估所述板，并使用帶刻度目鏡網(wǎng)格(1mm/100刻度)在20x放大倍率(OlympusBX50)下定量。測定每個視野中的血管長度、最大血管長度和血管數(shù)，并將其與時間匹配假對照進行比較，計算抑制百分比(％)。這些實驗的結(jié)果顯示于圖23-24中。發(fā)現(xiàn)當用所有三個參數(shù)(即血管長度、最大血管長度和血管數(shù))評估時，F(xiàn)KBP-L24聚體和FKBP-L1-57聚體在該測定中都是有活性的(分別為圖23A和23B)。但是，在該測定中，尤其在血管數(shù)方面所述24聚體是最強力的，其IC50為0.2pM,而1-57聚體的為0.53nM，全長重組FKBP-L的為1.56nM(圖24A和24B)。所述24聚體還顯示出某些雙相活性。這些數(shù)據(jù)提示所述24聚體對于抑制最初的血管出芽以及由此血管數(shù)的減少可能是最強力的?？傊?，所述FKBP-L24聚體、1-57聚體和重組FKBP-L是強力的血管發(fā)生抑制劑。實施例21:在改良的Bovden腔室系統(tǒng)中，F(xiàn)KBP-L24聚體對細胞侵襲的作用(N=3)該測定測量細胞遷移和侵襲的能力。在血管受到刺激后，微血管內(nèi)皮細胞需要遷移和侵襲細胞外介質(zhì)(ECM)。另外，腫瘤細胞需要遷移和侵襲ECM從而擴散/轉(zhuǎn)移到其它部位。評估了在FKBP-L24聚體存在下HMEC-1(微血管內(nèi)皮細胞；CD44+ve)和兩種肺瘤細胞系(MDA-231(乳癌；CD44+ve)和PC3(前列腺癌；CD44+ve))的侵襲潛力。將12孔板聚碳酸酯插入物分為兩組，一半用100嗎/cm2Matrigel包被，一半不包被。在無菌組織培養(yǎng)箱中，使經(jīng)包被的插入物于室溫干燥過夜。用胰酶消化所需的細胞系HMEC-1、PC3或MDA231,重懸于新鮮培養(yǎng)基，并計算細胞數(shù)。將總體積500pl的5xl()S個細胞加入到插入物(頂部腔室)，將1.5ml完全培養(yǎng)基加入到所述板的底部腔室作為侵襲刺激。在實驗孔中，將FKBP-L24聚體以所需濃度加到所述板的頂部和底部腔室。孵育所述板24h(PC3或MDA231)或48h(HMEC-1)。從12孔板小心移去插入物，將沒有Matrigel包被的插入物直接置于Carnoys固定劑中。包被有Matrigel的插入物，用棉球擦拭其上表面三次以除去未侵入的細胞。然后將所述插入物置于Carnoys中，放置10分鐘。將所述插入物從Carnoys溶液中取出，使之風(fēng)千20分鐘。干燥的插入物在Hoescht(50ng.ml")中染色30分鐘，然后在蒸餾水中清洗。從支架上切下聚碳酸酯插入物，將其置于顯微鏡載玻片上的封片介質(zhì)。應(yīng)用蓋玻片，用指甲油密封。將載玻片保存于4'C待分析。捕捉每個插入物的10個圖像，通過Lucia成像軟件分析每個圖像的熒光細胞數(shù)。將未包被插入物上的可見細胞與Matrigel包被插入物上82的可見細胞的比例表示為侵襲百分比。然后，將對照中的侵襲百分比(o/o)與24聚體處理細胞的進行比較。結(jié)果顯示于圖25?？梢奆KBP-L24聚體(SEQIDNO:10)是HMEC-1、PC3和MDA-231細胞侵襲的強力抑制劑。除了提供進一步的數(shù)據(jù)支持HMEC-1遷移的抑制之外，該數(shù)據(jù)表明FKBP-L24聚體還可抑制通過Matrigel的侵襲——血管發(fā)生過程中的一個重要步驟。該數(shù)據(jù)還表明CD44+ve腫瘤的轉(zhuǎn)移可以在臨床中被抑制。實施例22:FKBP-L24聚體對細胞粘附的作用(N=3)該測定測量細胞粘附的能力。這是血管發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要特征。白細胞募集和粘附到內(nèi)皮細胞的重要介質(zhì)包括E-選擇素、VCAM-1和ICAM-1，其在炎癥期間上調(diào)，引發(fā)白細胞粘附到內(nèi)皮，最終造成疾病發(fā)展或組織損傷。用薄層的Matrigel預(yù)包被96孔板，使其靜置過夜。在37°C95%空氣/5。/。C02孵箱中用0.5n/。BSA封閉所述板的孔1小時。用胰酶消化人微血管內(nèi)皮細胞(HMEC-1)，重懸于新鮮培養(yǎng)基中，并以每孔20000個細胞的密度接種。將所述板置于4'C保持10分鐘，使所述細胞沉在孔底部。將添加了FKBP-L24聚體的所需量培養(yǎng)基加入每個孔中，在37°C孵育所述板1小時。除去過量培養(yǎng)基和未貼壁細胞，用無菌PBS清洗孔三次。向孔中加入新鮮培養(yǎng)基和MTT(5mgml_1)。將所述板在37。C再孵育4小時。將DMSO加到每個孔中以溶解MTT成為甲臢，在540nm處對所述板讀數(shù)，得到對照孔相比于FBKP-L24聚體添加孔的相對吸光度。結(jié)果顯示于圖26中?？梢奆KBP-L24聚體是HMEC-1粘附的強力抑制劑。除了提供進一步的數(shù)據(jù)支持HMEC-1遷移和侵襲的抑制之外，該測定還表明FKBP-L24聚體可抑制粘附——血管發(fā)生過程和其它疾病狀態(tài)的一個重要步驟。實施例23:FKBP-L24聚體對MDA-231和PC3肺瘤細胞遷移的作用(N=3)這些研究中使用的體外遷移測定是Ashton等(1999)所述方法的改良版本，見上文。將MDA231(乳腺肺瘤細胞系；CD44+ve)和PC3(前列腺腫瘤細胞系；CD44+ve)鋪在玻璃栽玻片上的單獨腔室中，過夜培養(yǎng)至卯％匯合度。除去培養(yǎng)基，使單層細胞受傷。再次添加新鮮培養(yǎng)基到單層細胞，加入所需體積的FKBP-L24聚體(SEQIDNO:10)以得到所需的終濃度(1(T14-10-7M)。孵育該單層細胞24小時，然后在4。/。經(jīng)PBS緩沖的多聚曱醛中固定。由獨立的研究人員在不知情的情況下用顯微鏡評估"傷口"閉合程度，并使用帶刻度的目鏡網(wǎng)格(1mm/100nm刻度)在20x放大倍率下(OlympusBX50)進行定量。將FKBP-L處理的載玻片中的閉合程度與時間匹配的假處理對照進行比較，計算較之時間匹配對照的傷口閉合抑制百分比。結(jié)果顯示于圖27A(MDA-231細胞)和27B(PC3細胞)。發(fā)現(xiàn)FKBP-L24聚體可抑制MDA-231和PC3腫瘤細胞遷移。這些是CD44十ve肺瘤細胞系，再次表明FKBP-L可通過CD44起作用，類似于在全長重組蛋白中所觀察到的(圖17)。該數(shù)據(jù)提示FKBP-L24聚體可在CD44+ve肺瘤細胞系亞群中抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。實施例24:FKBP-L24聚體是血管發(fā)生抑制劑(N=3)為了確定FKBP-L24聚體對內(nèi)皮細胞出芽具有持久作用還是靜態(tài)作用，遂使用大鼠主動脈環(huán)測定。對雄性Wistar大鼠處以安樂死，無菌操作摘除胸主動脈，將其切片成lcm厚的環(huán)。在無菌培養(yǎng)基中將所述環(huán)洗10次，以除去任何細菌，并包埋在24孔板上的Matrigel中。在所述孔中添加2ml培養(yǎng)基。孵育所述板多至15天。每天對Matrigel環(huán)進行拍照然后將其放回孵箱。進行兩個另外的實驗(A)在血管生長7天后將FKBP-L24聚體加入培養(yǎng)基中；以及(B)在最初包埋階段將FKBP-L24聚體加入培養(yǎng)基中，7天后除去并更換成新鮮培養(yǎng)基再培養(yǎng)7天。使用帶刻度目鏡網(wǎng)格(1mm/100pm刻度)以20x放大倍率(OlympusBX50)定量血管發(fā)育程度，使用Lucia成像軟件進行電子測量。測定血管長度并將其與時間匹配假對照比較，計算抑制百分比(％)。結(jié)果顯示于圖28A和28B中。在對照條件下，在第3天至14天之間觀察到血管發(fā)育，在第14天達到最大長度1400fim。在平行實驗84中，使血管發(fā)育7天(約800pm),除去培養(yǎng)基，重新加入含有10—9M的FKBP-L24聚體的培養(yǎng)基。與時間匹配對照相比，24聚體的加入造成血管發(fā)育的完全抑制(圖28A)。在相反的實驗中(圖28B)，主動脈環(huán)最初暴露于添加了FKBP-L24聚體的培養(yǎng)基，并孵育7天。FKBP-L24聚體幾乎完全抑制血管發(fā)育。從所述環(huán)中除去添加FKBP-L24聚體的培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基，導(dǎo)致血管繼續(xù)生長。這些實驗表明，無論血管是成熟的或新近包埋的，F(xiàn)KBP-L24聚體以抑制血管發(fā)生的方式抑制血管發(fā)育。實施例25:使用海綿測定的FKBPL24聚體(SEOIDNO:10)在體內(nèi)抑制血管發(fā)生；與全長重組FKBPL比較(N=l,每組3只小鼠)該實驗使用小鼠海綿測定來評估FKBP-L24聚體抑制血管發(fā)生的能力。在第0天在C57黑色小鼠中皮下植入聚醚海綿，隔日注射(a)10ngbFGF對照(3只小鼠)、(b)10ngbFGF+5fig帶His標簽的全長重組FKBP-L(相當于體外3.2X10-6M)(3只小鼠)、(c)10ngbFGF+0.35嗎FKBPL24聚體(摩爾量相當于5ng全長重組FKBPL)(3只小鼠)或者(d)0.11ngFKBPL24聚體(>目當于體外109M)(3只小鼠)。第21天處死所有小鼠。取出海綿，固定，用石蠟包埋。用蘇木精和伊紅染色5pm切片。在不知情的情況下，由3個獨立評估者在40x放大倍率下對每枚切片IO個視野中的血管計數(shù)。然后，由每個評估者對每個海綿/小鼠的平均計數(shù)作圖。結(jié)果顯示于圖29?？梢姡瑔为氉⑸鋌FGF得到相當數(shù)量的血管生長進入海綿(平均血管數(shù)/40x視野-10)。在用bFGF和5fig重組全長FKBPL處理的海綿中觀察到血管數(shù)減少50%。在用bFGF和0.35嗎FKBPL24聚體處理的海綿中觀察到血管數(shù)減少80%。甚至最低劑量的FKBPL24聚體相比于單獨用bFGF處理的海綿也減少了70%的血管數(shù)。這些結(jié)果顯示FKBPL24聚體可在體內(nèi)抑制血管發(fā)生，提示在臨床中的潛在治療價值。該數(shù)據(jù)還表明FKBPL24聚體在抑制血管發(fā)生方面可以比全長FKBPL蛋白更強力。實施例26:使用傷口刮擦測定，在小鼠內(nèi)皮細胞系中評估FKBPL24聚體肽(SEOIDNO:10)該實l^f估FKBP-L24聚體在l(T14M至l(T7M劑量范圍內(nèi)抑制內(nèi)皮細胞遷移的能力。這些研究中使用的體外遷移測定是Ashton等(1999)所述方法的改良版本，見上文。在該測定中，將獲得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTissueCultureCollection)的小鼠內(nèi)皮細胞2H-11培養(yǎng)于含10%FCS的D-MEM中。將它們鋪在玻璃載玻片上的單獨腔室中，過夜培養(yǎng)至90o/。匯合度。除去培養(yǎng)基，使單層細胞受傷。再次添加新鮮培養(yǎng)基到單層細胞，加入所需體積的FKBPL24聚體肽至1(T14-10-7M的劑量范圍。孵育單層細胞7小時，然后在4。/c經(jīng)PBS緩沖的多聚甲醛中固定。由獨立的研究人員在不知情的情況下用顯微鏡評估"傷口"閉合程度，并使用帶刻度的目鏡網(wǎng)格(1mm/100fim刻度)在20x放大倍率下(OlympusBX50)進行定量。將FKBP-L24聚體處理的載玻片中的閉合程度與時間匹配的假處理對照進行比較，計算較之時間匹配對照的傷口閉合抑制百分比。這些實驗的結(jié)果顯示于圖30中?？梢奆KBPL24聚體在小鼠內(nèi)皮細胞中抑制傷口閉合。在lO^-lO-11M之間觀察到最大抑制。該數(shù)據(jù)表明FKBPL24聚體抑制小鼠內(nèi)皮細胞的遷移，于是，其可以是細胞遷移、血管發(fā)生和轉(zhuǎn)移的抑制劑。該數(shù)據(jù)支持本文所述在小鼠中進行的體內(nèi)實驗(例如圖8、9、15、29和31)。實施例27:FKBP-L24聚體肽(Q工RQQ卿PPT跳EIjBVSPDPAS—)在每日皿內(nèi)注射后是體內(nèi)DU145腫瘤生長的強力抑制劑(N=l，每個處理組6只小鼠)細胞培養(yǎng)Dul45(前列腺癌)細胞獲得自CancerResearchUK,培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen)中。所有細胞系以單層生長，孵育在37。C5。/。c02中。86前列腺癌異種移植模型使用24只雄性免疫減弱(嚴重的聯(lián)合免疫缺陷)小鼠(Harlan)。在隔離裝置中使小鼠適應(yīng)并一組5只或更少裝籠。如前所述培養(yǎng)Dul45(前列腺癌)細胞。收獲亞匯合細胞，用PBS將細胞濃度調(diào)節(jié)至5xl07個細胞/ml。在每只小鼠的背上剔毛。施用麻醉劑后，用26號針在每只小鼠后背兩側(cè)皮內(nèi)注射5xl(^個Dul45腫瘤細胞(100jil)。4吏腫瘤生長至達到150-175mm3的體積。將小鼠隨機分為4個治療方案(a)對照只有PBS(8只小鼠)；(b)24聚體FKBPL肽0.3mg/kg/天(6只小鼠)；(c)24聚體FKBPL肽3xl(T3mg/kg/天(6只小鼠)；以及(d)24聚體FKBPL肽3x104mg/kg/天(5只小鼠)。所述小鼠每天接受IP注射(lOOjil)的上述治療。每兩天記錄每只小鼠的體重和腫瘤體積。肺瘤體積如下計算長x寬x高x0.5236。最初處理后21天，處死以下動物0.3mg/kg/天24聚體FKBPL(2只小鼠),3xl0-3mg/kg/天(2只小鼠)，3x104mg/kg/天(1只小鼠)以及PBS(2只小鼠)。切下肺瘤并保存于鹽水甲醛溶液中以待將來的組織病理分析。結(jié)果顯示于圖31中?？梢姡c僅用載體處理的腫瘤相比，以0.3mg/kg/天或3xl(T3mg/kg/天劑量的腹膜內(nèi)注射24聚體FKBPL肽處理顯著減慢了SCID小鼠中DU145肺瘤的生長(圖31A)。用最有效劑量的24聚體FKBPL肽處理的許多肺瘤顯示出壞死中心的跡象，即它們呈現(xiàn)圓環(huán)狀。這是抗血管發(fā)生劑的的典型效應(yīng)。圖31A顯示完整的數(shù)據(jù)集合。應(yīng)注意，兩個用PBS對照處理的動物被排除在圖31A所示數(shù)據(jù)以外。第一個對照動物被排除是由于其腫瘤被另一只動物吞食；另一個對照動物被排除是由于其腫瘤被錯誤地移植到太接近于尾部(已知其限制生長)。使用肺瘤達到其3倍處理體積的時間作為處死標準來繪制Kaplan-Meier存活曲線(圖31B-D)?？汕宄乜闯?，以0.3mg/kg/天(圖31B)和0.003mg/kg/天(圖31D)劑量的FKBPL24聚體所處理動物的腫瘤達到3倍處理體積明顯晚于對照。除了0.3mg/kg/天處理組(共6個)的兩個以及0.0003mg/kg/天處理組(共6個)的一個以外的所有腫瘤在實驗期間不能達到三倍體積。但是，在粗略檢查后達到3倍處理體積的肺瘤明顯壞死。因此這些肺瘤也是有響應(yīng)的，它們較大的體積是由大范圍壞死而非活的腫瘤細胞造成的。用最低劑量(0.003mg/kg/天)所處理動物中的肺瘤與對照沒有顯著差異。在用24聚體進行每天處理后，沒有動物體重減輕，這表明它是良好耐受的并且基本沒有毒性。實施例28:使用MTT測定的覆蓋FKBP-L活性結(jié)構(gòu)域的候選肽對HMEC-1生存力或增殖的作用(N=3)使用MTT測定來測量細胞生存力和/或增殖。簡言之，在96孔板中接種HMEC-1細胞(2.5xl03)，使之貼壁5小時。用FKBP-L24聚體(SEQIDNO:10)(105-1010M)、1-57聚體(SEQIDNO:6)(10久10"M)或培養(yǎng)基(對照)處理所述細胞。孵育后，將該細胞暴露于5mgml"的3-(4,5-二甲基瘞唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑鹽(MTT)溶液4小時。吸出細胞培養(yǎng)液，加入200jilDMSO以還原鹽，從而資導(dǎo)顏色變化。在550nm處用比色法分析該孔，將結(jié)果與未處理對照細胞進行比較。結(jié)果顯示于圖32和33中。圖32顯示用FKBP-L24聚體處理細胞的劑量范圍。圖33A和33B分別顯示24小時和48小時后FKBP-L24聚體和FKBP-Ll-57(57聚體)的作用。可見，在任意測量時間點，這兩種肽與時間匹配對照相比對HMEC-1細胞的增殖均沒有顯著影響，這提示在先前測定中觀察到的抗血管發(fā)生作用不是由細胞生長抑制或肽介導(dǎo)的毒性造成的。實施例29:使用傷口刮擦測定，對截短的基于24聚體的肽進行分析以評估每種肽對抑制細胞遷移的重要性這些研究中使用的體外遷移測定是Ashton等(1999)所述方法的改良版本，見上文。將HMEC-1鋪在玻璃載玻片上的單獨腔室中，過夜培養(yǎng)至卯％匯合度。除去培養(yǎng)基，使單層細胞受傷。再次添加新鮮培養(yǎng)基到單層細胞，加入所需體積的每種肽(即肽1-17，SEQIDNO:12-28;下表4)至所需終濃度(l(r14-l(r6M)。為了制備肽1，將熒光團Alexa488(Invitrogen)連接到24聚體序列C端之半胱氨酸殘基的側(cè)鏈硫醇官能團上。使用PEG-間隔序列來連接24聚體序列的C端與該C端半胱氨酸殘基。在肽合成期間通過#^入市售的構(gòu)件Fmoc-8-絲-3，6-二氧代辛酸(一種聚乙二醇間隔序列(NeoMPS))來實現(xiàn)該步驟，以得到24聚體序列與C端經(jīng)Alexa標記的半胱氨酸之間的PEG間隔序列。PEG間隔序列/熒光團具有以下結(jié)構(gòu)-NH-(CH2)20-(CH2)20-(CH2)-CO-Cys-(Alexa488)。通過摻入市售構(gòu)建嵌段還可以制得其它肽，從而得到以下的肽2-17。表4FKBP-L肽<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>將單層細胞孵育24小時，然后固定于4。/。經(jīng)PBS緩沖的多聚曱醛中。由獨立的研究人員在不知情的情況下用顯微鏡評估"傷口"閉合程度，并使用帶刻度的目鏡網(wǎng)格(1mm/100刻度)在20x放大倍率下(OlympusBX50)進行定量。將FKBP-L處理的載玻片中的閉合程度與時間匹配的假處理對照進行比較，計算較之時間匹配對照的傷口閉合抑制百分比。和表5中。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>發(fā)現(xiàn)肽12顯示出與FKBP-L24聚體大致相同的活性。這些數(shù)據(jù)提示某些衍生自FKBP-L的肽表現(xiàn)出雙相劑量效應(yīng)。該數(shù)據(jù)還提示，亞區(qū)域-QQPRDPPTETLELEVSPD-(SEQIDNO:11)可能是有力的抗血管發(fā)生結(jié)構(gòu)域。該數(shù)據(jù)還表明包含18個或更多毗鄰氨基酸的SEQIDNO:10的片段(參見例如肽5，SEQIDNO:16;肽12，SEQIDNO:23和SEQIDNO:11)作為抗血管發(fā)生劑可以是有活性的。包含此結(jié)構(gòu)域的其它肽示于表l。實施例30:對純化的重組FKBP-L的分析重組FKBP-L蛋白的表達克隆進pRSET-A載體之5fl/uHI和戶對I位點之間的FKBP-L(變體Thrl81、Glyl86)在BL21(DE3)中表達以得到相應(yīng)的N端帶多His標簽的蛋白質(zhì)(SEQIDNO:1)。在OD0.6時用0.2mMIPTG誘導(dǎo)表達，在15'C過夜培養(yǎng)細胞。離心使細胞沉淀，并保存在-20。C。重組FKBP-L的純化在變性條件下使用柱上(on-the-column)復(fù)性步驟純化蛋白質(zhì)。通過水上冷卻超聲3x2分鐘在裂解緩沖液(100mMNaH2P04pH8.0,10mMTris，8M尿素，150mMNaCl，5mM(5-巰基乙醇)中裂解細胞。通過在4。C以31，100rcf離心20分鐘除去細胞碎片和不溶物質(zhì)。上清通過0.45jim濾膜用注射器進行過濾。將5mlHisTrapHP柱在結(jié)合緩沖液(8M尿素，0.5MNaCl，20mMpH8.0的磷酸鈉緩沖液，5mMp-巰基乙醇)中進行平衡，將細胞裂解物加樣至所述柱上。用10倍柱體積的清洗緩沖液(8M尿素，0.5MNaCl，20mM罅酸鈉緩沖液(pH8.0)，20mM咪唑，5mM卩-巰基乙醇)清洗柱，然后在結(jié)合緩沖液中再次平衡。在30ml0-100%線性梯度的復(fù)性緩沖液(5mM咪唑，0.5MNaCl，20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4),1mM卩-巰基乙醇)中以及接著在100%復(fù)性緩沖液中保持5分鐘使所結(jié)合蛋白緩慢復(fù)性。在30ml0-100%線性梯度的洗脫緩沖液(500mM咪唑，0.5MNaCl，20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4),lmMp-巰基乙醇)中洗脫結(jié)合的蛋白。用SDSPAGE分析級分并進行相應(yīng)的富集。為了降低咪唑、NaCl和p-巰基乙醇的濃度，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)以及150mMNaCl對所述蛋白進行透析(圖35A),或者在20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)及150mMNaCl、5mM咪唑中過HiLoad26/60Superdex7526/60預(yù)裝柱(圖35C和圖36)。利用SDSPAGE(圖35A和35B)和天然PAGE(圖35C，嵌入)來比較重組FKBP-L樣品。分析型HPLC和質(zhì)鐠利用分析型J叩iter5uc5柱用0-73%梯度的乙腈將50pg重組FKBP-L樣品(含有和不含100mMDTT)過柱超過30分鐘。收i峰，并利用電噴霧質(zhì)鐠進行分析。^i^滲透分析利用Superose1210/300GL柱4吏用緩沖液(20mMNaH2P04(pH7.4)，150mMNaCl，5mM咪唑)將下述分子量標準過柱藍葡聚糖(bluedextran)、乙醇脫氫酶、牛血清白蛋白、卵清蛋白、碳酸酐酶和細胞色素C。峰的洗脫體積用于計算全長重組FKBP-L的Kav，由此可以從校準曲線計算分子量。如下計算Kav:Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)其中Ve是洗脫體積，Vo是柱空體積(藍葡聚糖的洗脫體積)，Vt是總柱體積。針對對數(shù)分子量對Kav作圖，得到直線，從中可4^取出方程并用于估計給定Ve的分子量。為了分析，將140fig重組FKBP-L樣品(含有和不含100mMDTT)在相同條件下過柱，如上估計從Ve估計預(yù)測分子量。另外，用緩沖液+1mMDTT平衡所述柱，并在這些條件下將另一用DTT預(yù)處理的FKBP-L樣品過柱(圖36)。使用戊二醛交聯(lián)蛋白質(zhì)將1%終濃度的戊二醛加入500pi緩沖液(20mMNaH2P04(pH7.4)，150mMNaCl，~5mM咪唑)+25fig重組FKBP畫L(經(jīng)透析)30秒。通過加入NaBH4淬滅反應(yīng)，用脫氧膽酸鈉和TCA沉淀蛋白質(zhì)，并利用SDSPAGE在還原務(wù)降下進行分析(圖37)。這些實驗顯示此處表達、純化并經(jīng)透析的重組FKBP-L蛋白顯示出還原^Hf下的SDSPAGE分析后的單一條帶純凈性(圖35A)。在非還原條件(圖35B第3道和圖35C)和還原條件(圖35B第4道和圖35C)下對FKBP-L的SDSPAGE分沖斤和非變性PAGE分析(分別為圖35B和圖35C)顯示，F(xiàn)KBP-L通過在蛋白質(zhì)內(nèi)半胱氨酸之間形成分子間二硫鍵來形成較高分子量的多聚體。對重組FKBP-L的分析型HPLC分析以及隨后的電噴霧質(zhì)譜得到還原型FKBP-L的質(zhì)量為42,257(預(yù)計42,220)，證實了該蛋白質(zhì)的性質(zhì)。使用^滲透分析嘗試得到關(guān)于重組FKBP-L四級結(jié)構(gòu)的信息(圖9236)。在所述^下，還原型FKBP-L的平均洗脫體積為12ml。根據(jù)對一系列分子量標準的柱的校準，12ml洗脫體積對應(yīng)于99kDa質(zhì)量。類似地，DTT存在時重組FKBP-L的戊二醛交聯(lián)同樣顯示97kDa的SDSPAGE分析條帶(圖37)。這些結(jié)果表明FKBP-L可通過非共價連接形成同二聚體和/或同三聚體。這與預(yù)測的FKBP-L^酸序列內(nèi)存在三十四肽重復(fù)相一致，其已知誘導(dǎo)另一些蛋白質(zhì)的三聚化。實施例31:FKBP-L抗體的產(chǎn)生克隆進pRSET-A載體之BamHI和Pstl位點之間的FKBP-L(變體Thrl81、Glyl86)在BL21(DE3)中表達以得到相應(yīng)的N端帶多His標簽的蛋白質(zhì)(SEQIDNO:l)。將序列經(jīng)驗證的克隆轉(zhuǎn)化進BL21(DE3)大腸桿菌細胞，培養(yǎng)至對數(shù)期，通過加入異丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG,ImM)來誘導(dǎo)粑蛋白表達，在37。C再孵育4小時。重懸細胞沉淀，在含有8M尿素、300mMNaCl和10mM咪唑的50mMNaH2P04(pH8.0)中裂解。通過離心(lO，OOOg，4'C60分鐘)澄清粗制變性裂解物，然后施加到裝填了]>2+離子HiTrap1ml柱(GEHealthcare)的IMAC柱。使用含有8M尿素、300mMNaCl和20mM咪唑的50mMNaH2P04(pH8.0)洗掉非特異性結(jié)合的物質(zhì)，然后通it^過200倍柱體積的8至0M尿素減少進行柱上復(fù)性。再用20倍柱體積的50mMNaH2P04(pH8.0)、300mMNaCl和20mM咪唑清洗復(fù)性的柱結(jié)合物質(zhì)，然后用50mMNaH2P04(pH8.0),300mMNaCl和250mM咪唑洗脫。收集蛋白質(zhì)級分并脫鹽到PBS中。用所述重組蛋白免疫兔子(按照標準UK內(nèi)政部指南)，每三周加強一次，直至完成4次加強。收集血清，利用western印跡分析對重組FKPP-L(作為抗原產(chǎn)生)進行評估。檢測到約39kDa的FKBPL條帶。因此，本發(fā)明的實施方案提供了包含F(xiàn)KBP-L的方法和組合物。在某些實施方案中，F(xiàn)KBP-L及其肽片段是具有作為抗血管發(fā)生劑和/或抗轉(zhuǎn)移劑之臨床用途的多肽，所述抗血管發(fā)生劑和/或抗轉(zhuǎn)移劑用于治療預(yù)期這些療法具有積^L預(yù)后效果的癌癥和/或其它病癥。所述多肽對所選癌細胞的生長具有明顯的抑制作用，這指示針對具體癌癥的潛在的間接或直接治療效果。本說明書提及的所有文獻通過參考并入本文。在不脫離本發(fā)明范圍和精神的前提下，本發(fā)明所述實施方案的多種改變和修^t本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。盡管本發(fā)明結(jié)合具體優(yōu)選實施方案進行了描述，但應(yīng)理解本發(fā)明所主張的權(quán)利不應(yīng)不適當?shù)叵薅ㄓ谶@些具體實施方案。事實上，本發(fā)明旨在涵蓋對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見地對實施本發(fā)明所述方式的多種l務(wù)改。權(quán)利要求1.(i)包含分離的FKBP-L多肽、FKBP-L多肽之生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段之生物活性衍生物的活性化合物或者(ii)編碼這樣的FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸在制備用于治療由血管發(fā)生介導(dǎo)或與之相關(guān)的疾病之藥劑中的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1的(i)包含分離的FKBP-L多肽、FKBP-L多肽或者(ii)編^這樣的FKBP-L;肽、片段或衍生物的多核苷酸在制備用作血管發(fā)生抑制劑的藥劑中的用途。3.(O包含分離的FKBP-L多肽、FKBP-L多肽生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段之生物活性衍生物的活性化合物或者(ii)編碼這樣的FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸在制備用于治療癌癥的藥劑中的用途。4.(i)包含分離的FKBP-L多肽、FKBP-L多肽生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段之生物活性矛;f生物的活性化合物或者(ii)編碼這樣的FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸在制備用作腫瘤細胞遷移和/或轉(zhuǎn)移之抑制劑的藥劑中的用途。5.(i)包含分離的FKBP-L多肽、FKBP-L多肽生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段之生物活性衍生物的活性化合物或者(ii)編碼這樣的FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸在制備用作肺瘤細胞生長和/或增殖之抑制劑的藥劑中的用途。6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項的用途，其中所述FKBP-L多肽、FKBP-L多肽之生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段之生物活性衍生物以與至少一種另外的化學(xué)治療劑或化學(xué)預(yù)防性藥劑或it射療法進行組合而提供。7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述至少一種另外的化學(xué)治療劑或化學(xué)預(yù)防性藥劑包括下列至少之一抗血管發(fā)生劑、內(nèi)皮抑素、血管抑素、VEGF抑制劑、細胞毒性劑、生物堿、抗代謝物、癌癥生長抑制劑、基因治療劑、癌癥疫苗、千擾素、阿地流津、單克隆抗體、化療藥物、放射療法、激素療法或其它支持療法。8.(i)包含分離的FKBP-L多肽、FKBP-L多肽之生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段之生物活性衍生物的活性化合物或者(ii)編碼這樣的FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核普酸在制備用于治療血管發(fā)生相關(guān)炎癥的藥劑中的用途。9.才艮據(jù)權(quán)利要求1的(i)包含分離的FKBP-L多肽、FKBP-L多肽之生物活性片段或者FKBP-L多肽或其片段之生物活性衍生物的活性化合物或者(ii)編碼這樣的FKBP-L多肽、片段或衍生物的多核苷酸在制備用于治療血管發(fā)生所介導(dǎo)眼病的藥劑中的用途。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的用途，其中所述FKBP-L多肽包含SEQIDNO:10中所示的#^酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求IO的用途，其中所述FKBP-L多肽包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:29中所示的^J^酸序列。12.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的用途，其中所述FKBP-L的生物活性片段包含SEQIDNO:3至7、10至28中任一所示的M酸序列。13.根據(jù)權(quán)利要求l至9中任一項的用途，其中所述FKBP-L多肽的生物活性衍生物包含與SEQIDNO:1至28中任一所示M酸具有至少卯%同一性的M酸序列，或者由SEQIDNO:10的至少18個毗鄰氨基酸組成的序列，或者與其具有至少90%同一性的序列。14.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的用途，其中編碼所述FKBP-L多肽、其片段或衍生物的多核苷酸包含SEQIDNO:30-39任一所示的核普酸序列，或SEQIDNO:30-39的至少54個毗鄰核苷酸，或者與其具有至少90%同一性的序列。15.能夠特異性下調(diào)FKBP-L表達的反義寡核苷酸或siRNA在制備用于治療由血管發(fā)生介導(dǎo)或與4^目關(guān)的疾病之藥劑中的用途。16.根據(jù)權(quán)利要求15的能夠特異性下調(diào)FKBP-L表達的反義寡核苷酸或siRNA在制備用作血管發(fā)生促進劑的藥劑中的用途。17.根據(jù)權(quán)利要求15的能夠特異性下調(diào)FKBP-L表達的反義寡核苷酸或siRNA在制備用于治療傷口愈:合的藥劑中的用途。18.分離的多肽，其包含SEQIDNO:10所示的Jl^^列或其片段，或者與SEQIDNO:10或其片段具有至少卯％同一性的序列。19.根據(jù)權(quán)利要求16的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:1-28中至少之一所示的^酸序列。20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的多肽，其包含F(xiàn)KBP-L的生物活性片段，其中所述多肽包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:29所示氨基酸序列的不多于200個連續(xù)氨基酸。21.包含F(xiàn)KBP-L之生物活性片段的分離多肽，其中所述片段由SEQIDNO:3至7、10至28中至少之一所示^J^酸序列組成，不包含來自FKBP-L的任何其它賦鄰^J^^列。22.才艮據(jù)權(quán)利要求21的分離多肽，其由SEQIDNO:3至7或10至28中至少之一所示M酸序列組成。23.編碼權(quán)利要求18-22中任一項所述多肽的分離核酸分子。24.權(quán)利要求23的分離核酸分子，其包含SEQIDNO:31所示的核苷酸序列，或者包含至少SEQIDNO:31之100至172位核苷酸的SEQIDNO:31片段，以編碼SEQIDNO:10的肽或其片段。25.包含權(quán)利要求23或24所述核酸的載體。26.根據(jù)權(quán)利要求25的載體，其為表達載體。27.用權(quán)利要求25或26所述載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞。28.產(chǎn)生權(quán)利要求18至27任一項所述多肽的方法，該方法包括在允回收所表達的多肽。29.包含與可藥用載體混合的權(quán)利要求2至22任一所述分離多肽的組合物。30.用作藥劑的分離的FKBP-L多肽、FKBP-L多肽之生物活性片段或者這樣FKBP-L多肽或其片段之生物活性衍生物。31.根據(jù)權(quán)利要求30使用的分離的FKBP-L多肽、FKBP-L多肽之生物活性片段，其中所述FKBP-L多肽或片段如權(quán)利要求18至22中任一項所定義。32.包含F(xiàn)KBP-L功能等同物的化合物，其中功能等同物是可結(jié)合CD44和/或能夠與CD74或其它受體-配體復(fù)合物竟爭以抑制細胞遷移和血管發(fā)生的分子。33.包含F(xiàn)KBP-L功能等同物的化合物，其中功能等同物是能夠結(jié)合CD44和/或阻止與MIF活化的CD74結(jié)合的分子。全文摘要本發(fā)明公開了利用FKBP-L多肽調(diào)節(jié)血管發(fā)生和/或腫瘤轉(zhuǎn)移的方法和組合物。所述FKBP-L多肽可用于治療由血管發(fā)生所介導(dǎo)的疾病例如癌癥。文檔編號A61K38/00GK101489575SQ200780027668公開日2009年7月22日申請日期2007年6月8日優(yōu)先權(quán)日2006年6月9日發(fā)明者大衛(wèi)·赫斯特,安德烈亞·瓦倫丁,特拉西·羅布森,馬丁·奧魯爾克申請人:阿爾麥克探索有限公司