專利名稱：：用于預(yù)防和治療眼部病癥的內(nèi)皮分化基因亞家庭3(edg-3，s1p3)受體的拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于減弱內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的組成物的領(lǐng)域，所述減弱用來在涉及CTGF積累的眼部病癥中下調(diào)受體信號傳導(dǎo)和結(jié)締組織生長因子(CTGF)產(chǎn)生的下游減少。
背景技術(shù)：
：大多數(shù)眼部病癥與包括細胞增殖、存活、遷移、分化和血管生成的細胞過程有關(guān)。CTGF被認為是作為這些細胞過程中的中心中介體的一種分泌的細胞因子。尤其是，已知CTGF通過I型膠原蛋白和纖連蛋白的儲存增加來增加細胞外基質(zhì)產(chǎn)生。暗示CTGF的過量表達是例如硬皮病、纖維增生性疾病和細胞外基質(zhì)成分過量積累的瘢痕的病況中的主要致病因素。在小梁網(wǎng)(TM)區(qū)域中的細胞外基質(zhì)的過量積累是某些形式青光眼的標志；認為這種增加導(dǎo)致對水流出阻力的增加以及因此提高的眼內(nèi)壓(IOP)。屬于Fleenor等人在2003年11月13日作為W003/092584公布并轉(zhuǎn)讓給Alcon，Inc.的國際專利申請序號PCT/US2003/012521描述了相對正常TM細胞，在青光眼的TM細胞中CTGFmRNA的存在升高。于是，認為CTGF在小梁網(wǎng)細胞的細胞外基質(zhì)產(chǎn)生中起作用小梁網(wǎng)(TM)是一種復(fù)合組織，其包括內(nèi)皮細胞、結(jié)締組織和位于角膜和虹膜之間夾角的提供維持正常IOP所需的正常阻力的細胞外基質(zhì)。需要適當?shù)腎OP來維持眼的形狀并且提供壓力梯度從而允許眼房水流進入無血管的角膜和晶狀體。通常在青光眼中出現(xiàn)的過高IOP，對視神經(jīng)具有有害作用，引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞和軸突的損失，并導(dǎo)致漸進的視覺喪失而且如不治療可導(dǎo)致失明。青光眼是世界范圍內(nèi)失明的首要原因之一。原發(fā)性青光眼起因于具有解剖學(xué)、生物化學(xué)或生理基礎(chǔ)的眼房水流的擾亂。繼發(fā)性青光眼發(fā)生是眼睛的損傷或創(chuàng)傷或先在疾病的結(jié)果。原發(fā)性開角型青光眼(P0AG),也就是所知的慢性或簡單型青光眼，占美國所有原發(fā)性青光眼的90%。P0AG的特征為導(dǎo)致對眼的流體排水的異常高阻力的TM病理改變。這種阻力的結(jié)果是IOP的增加。已知例如潑尼松、地塞米松和氫化可的松的某些藥物通過提高IOP誘導(dǎo)青光眼。此外，施用方式似乎影響IOP。例如，地塞米松的眼內(nèi)施用比全身性施用導(dǎo)致IOP的更強的升高。由施用類固醇導(dǎo)致的青光眼被稱為類固醇誘導(dǎo)的青光眼。目前抗青光眼的治療通過使用藥物治療來壓制眼房水形成或促進水流出來降低IOP,也可通過手術(shù)程序，例如激光小梁成形術(shù)、或小梁切除術(shù)來改善水排出。藥物性抗青光眼方法已經(jīng)顯現(xiàn)多種不希望的副作用。例如，縮瞳劑(如匹魯卡品)可引起視覺模糊和其他負面的局部副作用。全身性使用碳酸酐酶抑制劑可引起惡心、消化不良、疲勞和代謝性酸中毒。此外，已將p-阻斷劑與肺部副作用聯(lián)系起來是由于其對肺部組織中的p-2受體的作用。Alpha2-激動劑可引起心動過速、心律不齊和高血壓。這類負面的副作用可導(dǎo)致患者依從性的降低或治療終止。公布于2005年10月20日屬于Fleenor等人的美國公布專利申請序號2005/0234075(將其通過引用并入本文)，提供了GSK-3和CDK抑制劑對在人小梁網(wǎng)細胞中基礎(chǔ)的以及TGFP2誘導(dǎo)的CTGF的表達具有抑制活性。黃斑變性是在中央視網(wǎng)膜的部分(稱為黃斑)的光受體的丟失，黃斑負責(zé)高敏銳視覺。黃斑的變性與細胞外基質(zhì)組分在視網(wǎng)膜色素上皮與脈管脈絡(luò)膜之間的膜上的異常沉積有關(guān)。這種碎片樣物質(zhì)稱為脈絡(luò)膜小疣。通過眼底檢查觀察到脈絡(luò)膜小疣。正常眼睛可具有無脈絡(luò)膜小疣的黃斑，然而在視網(wǎng)膜周邊有豐富的脈絡(luò)膜小疣。在黃斑視覺無任何損失的情況下，黃斑上柔軟脈絡(luò)膜小疣的存在被認為是早期AMD。除其他眼部病癥之外，在黃斑變性中通常還發(fā)生脈絡(luò)膜新生血管形成，并其與脈絡(luò)膜內(nèi)皮細胞增殖、細胞外基質(zhì)過量產(chǎn)生以及維管亞視網(wǎng)膜形成有關(guān)。視網(wǎng)膜色素上皮細胞增殖和血管生成因子的產(chǎn)生似乎影響脈絡(luò)膜新生血管形成。糖尿病性視網(wǎng)膜病變是一種在糖尿病中由于毛細血管基底膜增厚癥。周細胞的丟失增加毛細血管的滲漏并引起血-視網(wǎng)膜屏障的瓦解。膜和纖維性膜的細胞增殖有關(guān)。視網(wǎng)膜色素上皮細胞增殖和遷移常見于此眼部病癥中。與增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變有關(guān)的膜包含細胞外基質(zhì)組分，例如I、II和IV型膠原蛋白以及纖連蛋白，并逐漸地變成纖維變性(fibroUc)。創(chuàng)傷愈合病癥可引起嚴重的眼組織損害，其通過炎性細胞的激活、生長因子和細胞因子釋放、眼細胞的增殖和分化、毛細血管滲透性的增加、基底膜基質(zhì)組成物的改變、細胞外基質(zhì)沉積(deposition)的增加、纖維化、新生血管形成和組織重塑。鑒于如上所述的眼部病癥的重要性，尤其是小梁網(wǎng)的病理損害和由于細胞外基質(zhì)過量產(chǎn)生造成的損害，需要有一種治療這些眼部病癥的改良的方法來解決其進展的潛在原因。本文所有縮寫包括:AC腺苷酸環(huán)化酶AP-1激活蛋白1轉(zhuǎn)錄因子CTGF結(jié)締組織生長因子DG二?；视虴dg3內(nèi)皮分化基因亞家族3受體，見S1P3ERK細胞外信號調(diào)控激酶G12/13，Gq/11，Gi鳥噪呤核苷酸結(jié)合蛋白亞類IOP眼內(nèi)壓IP3三磷酸肌醇LPA溶血磷脂酸PAI-1纖溶酶原激活物抑制劑1PKC蛋白激酶CPLC磷脂酶CPLD磷脂酶DRaf蛋白激酶raf-lRas小GTP-結(jié)合蛋白Rho小GTP-結(jié)合蛋白SIP鞘氨醇-l-磷酸S1P3或S1PR3鞘氨醇-1-磷酸受體3Smad-l、-2、-3受體調(diào)節(jié)的Smad轉(zhuǎn)錄因子Smad—4^〉共伴4呂(commonpartner,Co—)Smad轉(zhuǎn)錄因子TGFP轉(zhuǎn)化生長因子PTGFPR、TpRI、TpRII轉(zhuǎn)化生長因子e受體、I型轉(zhuǎn)化生長因子p受體、II型轉(zhuǎn)化生長因子p受體本發(fā)明概述本發(fā)明探討本領(lǐng)域如上所述的問題并且提供了一種通過提供SIP-3受體的拮抗劑用于減弱受試者眼內(nèi)的Smad信號傳導(dǎo)的方法。減弱受試者眼內(nèi)的Smad信號傳導(dǎo)的方法包括向受試者施用一種組成物，該組合物含有有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽、以及藥物學(xué)可接受的載體。從而減弱受試者眼內(nèi)的Smad信號傳導(dǎo)。受試者可能具有導(dǎo)致不適當?shù)慕Y(jié)締組織生長因子積累的Smad信號傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥或處于發(fā)展成這類眼部病癥的危險中。Smad信號傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥可以是例如高眼壓、青光眼、青光眼性視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)病變、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變或眼創(chuàng)傷愈合。內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑降低天然配體與該受體的結(jié)合。所述拮抗劑包括該受體的天然配體的類似物一一鞘氨醇-l-磷酸。該拮抗劑可為取代的噻唑烷、取代的噢溱烷(thiazinane)、或具有如下所述結(jié)構(gòu)III的S1P類似物。所述拮抗劑可為例如蘇拉明的多磺化萘脲、對S1P3受體具有結(jié)合親和性和特異性的抗體、其生物活性片段、或?qū)λ鍪荏w具有結(jié)合親和性和特異性的肽或擬肽。本發(fā)明的另一個實施方案是一種治療與有此需要的受試者體內(nèi)的不適當?shù)慕Y(jié)締組織生長因子積累關(guān)聯(lián)的Smad信號傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥的方法。所述方法包括向受試者施用一種組成物，所述組成物包含有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽，以及藥物學(xué)可接受的載體。從而治療Smad信號傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供一種在受試者中治療青光眼的方法。所述方法包括向受試者施用一種組成物，該組成物包含有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽，以及藥物學(xué)可接受的栽體，其中青光眼從而被治療。在本發(fā)明另一個實施方案中，提供了一種治療受試者中的青光眼性視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)病變、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變或眼創(chuàng)傷愈合的方法。所述方法包括向受試者施用一種組成物，該組成物包含有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽，以及藥物學(xué)可接受的載體。青光眼性視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)病變、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變或眼創(chuàng)傷愈合從而被治療。附圖簡述圖1提供了顯示信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的示意圖，其包括SlP和Smad，并包括TGF-(3和Smad;S1P-1、-2、-3、S1P受體；TGF卩R、l型和2型TGF-p受體(改編自Xin等人，潔，Vol.279(34):35255-35262，2004;Blom:等人，"/o/o^r，Vol.21:473-482,2002;Takuwa，Y.,^r.oc力/邁"/o;力/sJc".，Vol.1582:112—120，2002;Pyne等人，^/oc力e/z/,Vol.349:385-402，2000;和Xu等人，^"a尸/sr則co/57".，Vol.25:849-854，2004)。圖2A和圖2B。存在多種量的內(nèi)源Edg受體激動劑S1P(圖2A)或存在多種量的S1P結(jié)構(gòu)類似物FTY720(圖2B)的情況下，使用(空圓圏)或不使用(實圓團)Edg3受體亞型拮抗劑CAY10444來處理人小梁網(wǎng)細胞培養(yǎng)物。24小時之后，是如實施例2中所述通過對來自的處理后培養(yǎng)物的上清等份試樣的ELISA確定分泌的PAI-1蛋白的水平。發(fā)明詳述SlP-3(Edg-3)受體屬于LPA或S1P作為其內(nèi)源配體的G蛋白偶聯(lián)受體家族。LPA是Edg-2、-4、和-7受體的配體而SlP是Edg-1、-3、-5、-6、和-8受體的配體。國際藥理學(xué)聯(lián)合會已經(jīng)將Edg受體重新命名為S1P(Chun等人，戶力ar軀o/執(zhí)Vol.54:265-269，2002)。因此，如本文所用，術(shù)語"Edg受體"是術(shù)語"S1P受體，，的同義詞。圖l提供了S1P受體與調(diào)節(jié)靶標Smad之間以及TGFp受體和相同的調(diào)節(jié)靶標Smad之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系的示意圖。Smad通過磷酸化激活并且與Smad4形成復(fù)合物以產(chǎn)生一個異源復(fù)合物，所述異源復(fù)合物進入核內(nèi)，其中該復(fù)合物與其他轉(zhuǎn)錄因子一起激活基因轉(zhuǎn)錄，例如編碼CTGF的基因的轉(zhuǎn)錄。較之于"正常，，眼睛，從青光型人眼中收集到的眼房水中發(fā)現(xiàn)顯著更高水平的TGFp2同種型(Tripathi等人，^r/7f/eiw，Vol.59(6):723—727,1994;Inatani等人，Crae尸esj"力輛Ma/邁o/，Vol.239(2):109-113，2001;Picht等人，toe尸e"rc/C72./3^77^7力Ma7/z/o厶Vol.239(3):199-207，2001;Ochiai等人，/;w/。/7雄"邁o/，Vol.46(3):249-253，2002)。此外，在灌注人眼前段模型中TGFp2可以激起IOP的大幅增加(Fleenor等人，/"mW0;力M"邁o/P7"c/，Vol.47(1):226-234，2006)。因此，TGF|3，尤其是TGFJ32，似乎在IOP相關(guān)病變?nèi)缜喙庋壑衅鹬虏∽饔?。S1P-3受體似乎在腎系膜細胞中激活S隨d信號傳導(dǎo)通路(Xin等人，/戶力s7vzaco7,Vol.147:164-174，2006)。另外，已知Smad蛋白介導(dǎo)通過TGF亞家族成員激活的標準信號通路，包括TGF-(3信號通路(由圖l所示)。因此，SlP-3誘導(dǎo)的Smad蛋白信號激活似乎模擬了一些已知受TGFp調(diào)控的細胞反應(yīng)。此外，已知TGFP和S1P都增強CTGF的表達(Xin等人，2004/cT.，Katsumaetal.，尸i^5^e〃ei^，Vol.579:2576-2582，2005)，CTGF似乎是在青光眼過程中起重要作用的一個蛋白(屬于Fleenor等人在2003年11月13日作為WO03/092584公布并轉(zhuǎn)讓給Alcon，Inc.的國際專利申請序號PCT/US2003/012521)。因為TGFI3在組織中既有正面作用又有反面作用，所以希望得到TGF)3/S1P3信號通路的選擇性調(diào)制。正面作用包括，例如，TGFp作為抗炎劑、作為免疫抑制劑、以及作為T細胞遷移和歸巢的促進劑。本文提供了這種選擇性調(diào)制。本發(fā)明人在本文提供了眼部S1P3受體的拮抗劑，所述拮抗劑導(dǎo)致經(jīng)由Smad受體的信號傳導(dǎo)降低，由此降低下游的CTGF積累。本文所提供的Smad下游通路的調(diào)制導(dǎo)致TGF(3信號傳導(dǎo)的負面的降低，同時保留TGFp的正面信號傳導(dǎo)效用基本上不受影響。本發(fā)明的另一個實施方案提供了拮抗S1P3受體結(jié)合從而干擾S1P3下游信號傳導(dǎo)級聯(lián)，并尤其干擾Smad信號傳導(dǎo)的方法，所述方法用于治療其中Smad蛋白信號傳導(dǎo)導(dǎo)致不適當?shù)慕Y(jié)締組織生長因子積累的眼部病癥，。沖發(fā)為VA差厲亞家族憂雄(^/^-義57戶-"S1P-3受體的拮抗劑包括減弱S1P-3受體和其天然配體S1P之間的結(jié)合親和力或特異性的試劑。所述拮抗劑可以是S1P類似物。拮抗劑可以是取代的噢唑烷，尤其是烷基取代的噻唑烷或芳基烷基取代的噻唑烷；取代的噻溱烷，尤其是烷基取代的噻溱烷；多磺化萘脲，例如蘇拉明(最常見可得的是六鈉鹽；或具有如下所述結(jié)構(gòu)III的S1P類似物；對于S1P3受體具有結(jié)合特異性和親和力的抗體、其生物活性抗體片段、肽或擬肽；或拮抗劑的藥物學(xué)可接受的鹽。本文所述拮抗劑可以是外消旋混合物、非對映體或?qū)τ丑w。"拮抗劑的藥物學(xué)可接受的鹽"是保持S1P3受體拮抗活性并為人體可接受的拮抗劑的鹽。因為本文的拮抗劑可具有氨基或羧基取代，所以鹽可以是酸性鹽或堿性鹽。取代的噻唑烷具有結(jié)構(gòu)I:HI其中R,為C6-C13烷基、或取代為C5-C9烷基的烷基取代的芳基。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)I，其中R,為d。烷基或Cu烷基，(2-烷基噻唑坑-4-羧酸，其中烷基為d。或Cu)。當R,為Cn烷基，所述拮抗齊'J為通過商業(yè)途徑從CaymanChemical(AnnArbor，Michigan)獲得的CAY10444。在本發(fā)明另一個實施方案中，所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)I，其中Ri是烷基-取代的苯基，并且苯環(huán)上的取代為邁-或；t~C廣烷基，也就是(2-(t或^"庚基苯基)瘞唑烷-4-羧13本發(fā)明一個實施方案中，S1P3的拮抗劑具有結(jié)構(gòu)II:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中R2為C9-C13烷基。本發(fā)明另一個實施方案中，S1P3的拮抗劑具有結(jié)構(gòu)III:其中R3為o-或iC廠"烷基；并且l是磷酸脂、磷酸脂類似物、膦酸酯或硫酸酯。本文所用"磷酸類似物"包括術(shù)語例如硫代磷酸脂、二硫代磷酸脂、硒代磷酸脂、二硒代磷酸脂、phosphoro-anilothioates、磷酸酰苯胺、氨基磷酸脂或磷酸硼2005年10月6日公布的屬于Lynch等人的美國專利申請公布號2005/0222422(通過引用并入本文)以及Koide等人C力e邁，Vol.45:4629-4638，2002描述了S1P3信號傳導(dǎo)中有活性的其他化合物，。用于鑒定另外的S1P3受體拮抗劑的測定法使用竟爭性結(jié)合測定，所述測定包括組合候選拮抗劑、S1P、S1P3受體和對活化的S1P3受體具有活性的激酶，并測量所得磷酸化S1P3受體的量。將結(jié)果與在不存在候選拮抗劑的相同試驗中所獲得的磷酸化S1P3受體的量相比較。當磷酸化S1P3受體水平低于候選拮抗劑不存在時的水平，候選拮抗劑具有拮抗活性。進一步的測定包括如下測定通過候選拮抗劑抑制受體特異性的抗體結(jié)合、通過候選拮抗劑減少CTGFmRNA的積累、或通過候選拮抗劑減少CTGF蛋白的積累。先前通過引用并入本文的2005年10月6日公布的屬于Lynch等人的美國專利申請公布號2005/0222422，描述了用來測量SIP模擬物對人的SIP受體的SIP活性的GTP結(jié)合測定。使用本領(lǐng)域所知的方法合成取代的噻唑烷和取代的噻嗪烷，例如Koide等人描述的方法(/C力e邊，Vol.45:4629-4638，2002)。先前通過引用并入本文的2005年10月6日公布的屬于Lynch等人的美國專利申請公布號2005/0222422描述了具有結(jié)構(gòu)III的SIP類似物的合成。市場上可買到對于S1P3受體具有結(jié)合特異性和親和性的抗體，例如鼠的單克隆抗體可從GENETEX，Inc.(CatalogNumberGTX12254,SanAntonio,TX)獲得，針對鞘脂受體Edg3/SlP3的兔多克隆抗體可從NovusBiologiesInc.(CatalogNumberNLS1031，Littleton,CO)獲得，而且EDG-3CT抗體可從ExalphaBiologicals,Inc.(WatertownMA)獲得。EDG-3CT對于人S1P3受體的獨特的C端肽具有結(jié)合親和性和特異性。也通過觀察在眼部病癥中的改善推斷人和哺乳動物中S1P-3受體的拮抗作用以及產(chǎn)生的對CTGF積累的抑制作用。例如在年齡相關(guān)的黃斑變性中，視覺喪失的減緩和逆轉(zhuǎn)表明了CTGF積累的抑制作用，以及在青光眼患者中，在具有發(fā)展為青光眼的危險的受試者中眼內(nèi)壓的降低和癥狀發(fā)生的延遲或預(yù)防表明了CTGF積累的抑制作用。本發(fā)明的拮抗刑可與用于治療CTGF積累或活性不適當?shù)难鄄坎“Y的其他試劑組合使用，例如先前通過引用并入本文的2005年10月20日公布的屬于Fleenor等人的美國專利申請?zhí)?005/0234075描述的試劑。滋>55^#4:使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)將拮抗劑直接遞送到眼部(例如局部的眼部滴劑或軟骨劑；在官隆(cul-de-sac)中或植入臨近鞏膜(穿鞏膜)或在眼內(nèi)的緩釋裝置；眼周的、結(jié)膜的、筋膜下(sub—Tenons)、前眼房內(nèi)(intracameral)、玻璃體內(nèi)、視網(wǎng)膜下、眼球后的、或小管內(nèi)注射)或全身性的遞送(例如口服；靜脈內(nèi)的、皮下的或肌肉內(nèi)的注射；腸胃外的、真皮遞送)。還包括本發(fā)明的拮抗劑可配制在一個定位裝置中例如視網(wǎng)膜丸劑、眼內(nèi)插入物、導(dǎo)管、栓劑或含有多空的、非多孔的或凝膠狀的材料的植入裝置。前眼房內(nèi)注射可通過角膜進入眼前房從而允許實際到達小梁網(wǎng)。小管內(nèi)注射可進入鞏膜靜脈竇的排水靜脈收集通道或進入鞏膜靜脈竇。愛試者需要治療眼部病癥或處于發(fā)展為眼部病癥的危險中的受試者是具有與CTGF不適當積累的Smad激活相關(guān)的病況或處于具有所述病況的危險中的人或其他哺乳動物。這種眼部病癥包括，例如，高眼壓、青光眼、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變、眼創(chuàng)傷愈合、以及具過度瘢痕、內(nèi)皮細胞增殖或纖維化增殖的病況。與這些病癥相關(guān)的眼部結(jié)構(gòu)包括例如視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、晶狀體、角膜、小梁網(wǎng)、視桿、視錐、神經(jīng)節(jié)、黃斑、虹膜、鞏膜、眼房、玻璃體小室、睫狀體、視神經(jīng)盤、視神經(jīng)乳頭或中央凹。W^和浙量藥物制劑包括拮抗劑、或其鹽，如本文所述多至重量99%的生理可接受的眼部的載體介質(zhì)混合，如水、緩沖劑、鹽水、甘氨酸、透明質(zhì)酸、甘露醇及諸如此類。本發(fā)明各方面包括的可能制劑的實例如下<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>化合物以重量％計量S1P-3受體拮抗劑多至99;0.1-99;0.1-50;0.5-10.0;0.01-5.0;0.01-2.0;0.02-2.0;0.1-1.0;0.5-2.0;0.001磷酸二氫鈉0.05磷酸氫二鈉(無水)0.15氯化鈉0.75二鈉EDTA0.05聚氧乙烯蓖麻油0.1苯扎氯胺0.01HC1和/或NaOHpH7.3-7.4純水適量至100%化合物以重量y。計量S1P-3受體拮抗劑多至99;0.1-99;0.1-50;0.5-10.0;0.01-5.0;0.01-2.0;0.02—2.0;0.1-1.0;0.5-2.0;0.0005磷酸緩沖鹽水1.0羥丙基-P-環(huán)糊精4.0純水適量至100%在另外的一個實施方案中，眼用的組合物經(jīng)配置以提供拮抗劑的眼內(nèi)濃度約0.1-100納摩爾(nM)或，在另外的一個實施方案中是l-10nM的拮抗劑。依據(jù)熟練的臨床醫(yī)師的常規(guī)的酌情決定將局部組合物每日l-4次遞送到眼部表面。制劑的pH應(yīng)為4-9或4.5-7.4。全身性制劑可含有約10-1000mg的拮抗劑。"有效量"指能夠干擾S1P-3受體與Smad之間的結(jié)合的S1P-3受體拮抗劑的量。此干擾導(dǎo)致Smad活性的降低、CTGF基因轉(zhuǎn)錄的降低、CTGF蛋白積累的降低以及由此產(chǎn)生的受試者中眼部病癥的癥狀減輕。此干擾延遲或預(yù)防處于發(fā)展成本文所述的眼部病癥的危險中的受試者中癥狀的發(fā)生。制劑的有效量依賴于如受試者的年齡、種族和性別或例如眼部狀況的嚴重程度的因素。在一個實施方案中，所述拮抗劑以治療劑量局部遞送到眼部并到達小梁網(wǎng)、視網(wǎng)膜或視神經(jīng)頭從而改善眼部病癥的進展。17T接愛辨裁'伴眼用可接受的載體指那些最多引起極少至沒有眼部刺激、如果需要可提供合適的保護、并以均質(zhì)劑量遞送本發(fā)明的一種或多種S1P-3拮抗劑的載體。對于眼部遞送，SlP-3拮抗劑可以與眼科用可接受的防腐劑、共溶劑、表面活性劑、增稠劑、滲透促進劑、緩沖劑、氯化鈉、或水組合形成一種水相的無菌的眼用混懸液或溶液。眼用溶液制劑可通過將拮抗劑溶解在生理可接受的等滲水緩沖劑中來制備。另外，眼用溶液可包括眼科用可接受的表面活性劑來輔助溶解拮抗劑。粘度生成試劑，如羥曱基纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或諸如此類，可添加到本發(fā)明的組合物中以增強化合物的保留。為了制備無菌的眼用軟膏制劑，將S1P-3拮抗劑與在合適載體(如礦物油、液態(tài)羊毛脂或白礦脂)中的防腐劑組合。依據(jù)用于其他眼用制劑的為本領(lǐng)域所知的方法，無菌的眼用凝膠制劑可通過將S1P-3拮抗劑懸浮在親水基質(zhì)中制備，所述親水基質(zhì)從例如CARBOPOL-940(BFGoodrich,Charlotte,NC)或諸如此類的組合中制備而成。例々口VISC0AT⑧(AlconLaboratories,Inc.,FortWorth,TX)可用于眼內(nèi)注射。在SlP-3拮抗劑在眼中滲透性較低的情況下，本發(fā)明的其他組合物含有滲透促進劑如乳浮(cremophor)和TWEE^80(聚氧乙烯山梨醇酐單月硅酸酯，SigmaAldrich，St.Louis,MO)。試浙盒；本發(fā)明的實施方案提供了包括用于減弱細胞內(nèi)的S1P3受體信號傳導(dǎo)的拮抗劑的試劑盒。所述試劑盒包括含本發(fā)明拮抗劑的密封的一個或多個容器、藥物學(xué)可接受的載體以及可選的印刷使用說明。實施例1對SlP-刺激的CTGF基因表達的抑制Edg3受體拮抗作用對培養(yǎng)的人小梁網(wǎng)細胞中CTGF基因表達的作用可如下確定。用或不用刺激性量的鞘氨醇-l-磷酸(SIP)以及用或不用Edg3受體拮抗劑對轉(zhuǎn)化的或非轉(zhuǎn)化的人TM細胞培養(yǎng)物處理一定的時間(Pang等人，Cf/iTAes，Vol.13:51-63，1994;Steely等人，//zmW0//^Aa//z7o/r/s&/，Vol.33:2242-2250，1992;Wilson等人，C"r""麵Vol.12:783-793，1993;Stamer等人，Ci/rri/eies，Vol.14:611-617，1995)。用必需稀釋度的載體處理另外的培養(yǎng)物以用作對照。使用QiagenRNeasy96系統(tǒng)依照制造商的使用說明(Qiagen)從TM細胞中分離總RNA?；旧先缦惹八?Shepard等人，IOVS，Vol.42:3173，2001)使用ABIPrism7700SequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems)，通過定量實時RT-PCR(QRT-PCR)驗證細胞處理后的CTGF的差異表達。如屬于Fleenor等人于2004年10月8日提交的USSN10/510,585、于2005年10月20日公布的美國公布專利申請?zhí)?0050234075所述，^f吏用PrimerExpress軟件(AppliedBiosystems)設(shè)計用于CTGF擴增的引物以退火到Genbank收錄號#賜001901.1的鄰近的外顯子上，從而產(chǎn)生76-bp的擴增子。CTGF的擴增相對于18S核糖體RNA表達進行標準化，其中使用如屬于F1eenor等人的美國公布專利申請?zhí)?0050234075所述(同上)針對18SrRNA基因(GenBank收錄號#X03205)設(shè)計的引物來產(chǎn)生69-bp擴增子。CTGFQRT-PCR與18S引物/探針集一起以50ul終體積進行多重執(zhí)行，所述終體積由40nM18S或900nMCTGF引物;lOOnM18S探針或lOOnMCTGF;5ulRNA;IXMultiscribeandRNaseInhibitorMix(ABI);以及IXTaqManUniversalMix(ABI)組成。熱循環(huán)條件由481C30min和95"C10min，隨后40個循環(huán)的95t:15sec和60X:1min構(gòu)成。用SDS軟件1.9.1版本(AppliedBiosystems)和MSExcel2002(Microsoft)進行數(shù)據(jù)分析。使用PEBiosystemsUserBulletin#2中所述的AACt法進行相對RNA濃度的定量。用四份QRT-PCR測定的平均土SEM表示擴增產(chǎn)物的水平。用SDS軟件1.9.1版本(AppliedBiosystems)和MSExcel97(Microsoft)進行數(shù)據(jù)分析。實施例2對SlP-刺激的細胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白表達中的變化的抑制Edg3受體拮抗劑對培養(yǎng)的人小梁網(wǎng)細胞的細胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白表達的作用如下確定。將人TM細胞培養(yǎng)物分成重復(fù)的和/或?qū)嶒灲M和/或?qū)φ战M，向其中加入對照溶液或?qū)嶒炄芤海鋈芤汉邢♂屳d體(作為對照)和/或S1P(作為刺激劑)和/或Edg3受體拮抗劑。隨后通過標準酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)測試每個細胞培養(yǎng)物組中細胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的水平，例如纖連蛋白、纖溶酶原激活物抑制劑I(PAI-1)、膠原蛋白、肌原纖蛋白、玻連蛋白、層纖連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白I、蛋白聚糖或整合素。此測定為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并且是靈敏的免疫測定，其使用連接至抗體或抗原的酶作為檢測特定蛋白的標簽。通過這些方法，在組之間比較不同的細胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的水平用來確定試驗溶液的作用。圖M和卩B顯示了Edg3受體對處理后的人TM細胞培養(yǎng)物而來的上清中PAI-1的水平的拮抗作用的一個實例。對于這些研究，在不同量的內(nèi)源Edg受體激動劑S1P存在時和/或在不同量的一種S1P結(jié)構(gòu)類似物FTY720存在時，用或不用Edg3受體亞型拮抗劑CAY10444處理人TM細胞培養(yǎng)物。24小時后，隨后通過來自處理后的培養(yǎng)物的上清等量試樣的ELISA確定分泌的PAI-1蛋白水平。從這些數(shù)據(jù)表明CAY10444強有力地和有效地拮抗了兩種激動劑的作用(數(shù)據(jù)代表平均和SEM)。本文所引用的文獻以提供了對于本文所述那些補充的示例性的程序性或其它細節(jié)的程度，通過特定地引用并入本文。本領(lǐng)域的技術(shù)人員依照本公開，會理解可產(chǎn)生本文所公開的實施方案的明顯修飾而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。依據(jù)本公開無需過度實驗可進行或執(zhí)行本文所公開的全部實施方案。本公開和其等價的實施方案陳述了本發(fā)明的全部范圍。說明書不應(yīng)該解釋為過度使本發(fā)明給予的保護的全部范圍狹窄。除非另外指明，如本文所用的屬于"一"和"一個"意為"一個""至少一個"或"一個或多個"。權(quán)利要求1.一種減弱受試者眼內(nèi)的Smad信號傳導(dǎo)的方法，包括向受試者施用一種組合物，該組合物包含有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽；以及藥物學(xué)可接受的載體；其中所述受試者眼內(nèi)的Smad信號傳導(dǎo)從而被減弱。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者患有具有不適當?shù)慕Y(jié)締組織生長因子積累的Smad信號傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥。3.權(quán)利要求1的方法，其中受試者處于發(fā)展成具有不適當?shù)慕Y(jié)締組織生長因子積累的Smad信號傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥的危險。4.權(quán)利要求2的方法，其中所述Smad信號傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥是高眼壓、青光眼、青光眼性視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)病變、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變或眼創(chuàng)傷愈合。5.權(quán)利要求l的方法，其中所迷拮抗劑是鞘氨醇-l-磷酸類似物。6.權(quán)利要求l的方法，其中所述拮抗劑是取代的噻唑烷。7.權(quán)利要求l的方法，其中所述拮抗劑是取代的噻溱烷。8.權(quán)利要求l的方法，其中所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)I:其中l(wèi)是C6-Cu烷基、或烷基取代的芳基，其中芳基取代是C「C,烷基。9.權(quán)利要求8的方法，其中Ri是d?；騞烷基。10.權(quán)利要求8的方法，其中R,是烷基取代的苯基并且取代是邁-或；"C廣烷基。11.權(quán)利要求i的方法，其中所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)n:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中R2是C廣d3烷基。12.權(quán)利要求l的方法，其中所述拮抗劑是多磺化萘脲。13.權(quán)利要求l的方法，其中所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)III:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中R3為o-或/~Cs-Cs烷基；并且R4為磷酸脂、磷酸脂類似物、膦酸脂或硫酸脂。14.權(quán)利要求l的方法，其中所述拮抗劑是對所迷受體具有結(jié)合親和性和特異性的抗體或其生物活性片段。15.權(quán)利要求l的方法，其中所迷拮抗劑是對所迷受體具有結(jié)合親和性和特異性的肽或擬肽。16.權(quán)利要求l的方法，其中通過局部、前眼房內(nèi)、玻璃體內(nèi)、經(jīng)鞏膜或植入途徑施用所述組合物。17.權(quán)利要求l的方法，其中所述組合物中的所述拮抗劑的濃度為0.01%-2%。18.—種在有此治療的受試者中治療具有不適當?shù)慕Y(jié)締組織生長因子積累的Smad信號傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥的方法，包括向受試者施用一種組合物，該組合物包含有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽；以及藥物學(xué)可接受的載體；其中所述Smad信號傳導(dǎo)相關(guān)眼部病癥從而被治療。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述受試者患有高眼壓或青光眼。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述受試者處于發(fā)展成高眼壓或青光眼的危險。21.權(quán)利要求18的方法，其中所述拮抗劑是鞘氨醇-l-磷酸類似物。22.權(quán)利要求18的方法，其中所述拮抗劑是取代的噻唑烷。23.權(quán)利要求18的方法，其中所述拮抗劑是取代的噻溱烷。24.權(quán)利要求18的方法，其中所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)I:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R,是C6-Cu烷基、或烷基取代的芳基，其中芳基取代是C5-C,烷基。25.權(quán)利要求24的方法，其中R,是d?；駽n烷基。26.權(quán)利要求24的方法，其中K是烷基取代的苯基并且取代是ZZ7一或/7~C廣坑基。27.權(quán)利要求18的方法，其中所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)II:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R2是C廣d3烷基。28.權(quán)利要求18的方法，其中所述拮抗劑是多磺化萘脲。29.權(quán)利要求18的方法，其中所述拮抗劑具有結(jié)構(gòu)III:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R3為o-或iC廣Cs烷基；并且R4為磷酸脂、磷酸脂類似物、膦酸脂或硫酸脂。30.權(quán)利要求18的方法，其中所述拮抗劑是對所述受體具有結(jié)合親和性和特異性的抗體或其生物活性片段。31.權(quán)利要求18的方法，其中所述拮抗劑是對所述受體具有結(jié)合親和性和特異性的肽或擬肽。32.權(quán)利要求18的方法，其中通過局部、前眼房內(nèi)、玻璃體內(nèi)、經(jīng)鞏膜或植入途徑施用所述組合物。33.權(quán)利要求18的方法，其中所述組合物中的所述拮抗劑的濃度為0.01%-2%。34.—種在受試者中治療青光眼的方法，包括向受試者施用一種組合物，該組合物包含有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽；以及藥物學(xué)可接受的栽體；其中青光眼從而被治療。35、一種在受試者中治療青光眼性視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)病變、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變或眼創(chuàng)傷愈合的方法，包括向受試者施用一種組合物，該組合物包含有效量的內(nèi)皮分化基因亞家族3受體的拮抗劑或其藥物學(xué)可接受的鹽；以及藥物學(xué)可接受的載體；其中青光眼性視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)病變、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變或眼創(chuàng)傷愈合從而被治療。全文摘要提供S1P3(Edg-3)受體的拮抗劑用來在涉及CTGF積累的眼部病癥中下調(diào)受體信號和下游減少產(chǎn)生的結(jié)締組織生長因子產(chǎn)物的方法中減弱Smad信號傳導(dǎo)。涉及不適當CTGF積累的眼部病癥包括例如高眼壓、青光眼、青光眼性視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)病變、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管形成、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變和眼創(chuàng)傷愈合。通過施用本發(fā)明的拮抗劑治療這些病癥。文檔編號A61K31/426GK101505744SQ200780031138公開日2009年8月12日申請日期2007年7月25日優(yōu)先權(quán)日2006年7月25日發(fā)明者A·R·謝帕德,D·L·弗里諾爾,彭玉豪申請人:愛爾康研究有限公司