專利名稱：：通過完整的死亡細菌細胞將藥物、治療性核酸和功能性核酸靶向遞送至哺乳動物細胞的制作方法通過完整的死亡細菌細胞將藥物、治療性核酸和功能性核酸耙向遞送至哺乳動物細胞i相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2006年6月23日提交的美國臨時專利申請第60/815,883號和2007年3月30日提交的美國臨時專利申請第60/909，078號的優(yōu)先權(quán)利益，據(jù)此通過引用將這兩件申請合并至本文中。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及通過完整的死亡細菌細胞將包括治療性核酸、功能性核酸、藥物、肽、蛋白質(zhì)、碳7JC化合物、脂質(zhì)的生物活性分子靶向遞送至哺乳動物宿主細胞。許多障礙不斷阻礙著生物活性分子向哺乳動物細胞(例如癌細胞)的靶向遞送，特別是在體內(nèi)的靶向遞送。這些障礙包括(a)遞送載體的組成、功能特性和穩(wěn)定性；(b)包裹治療有效濃度的生物活性分子；(c)靶定所需的體內(nèi)患病細胞；(d)克服一系列細胞內(nèi)屏障并成功地將治療濃度的生物活性分子遞送至細胞內(nèi)的耙標；(e)避開可在載體到達靶標之前將其破壞的許多宿主免疫元件，例如抗體、補體和巨噬細胞；(f)穿過血管壁的內(nèi)皮屏障，特別是在瘤塊位置；(g)遷移通過幾層細胞到達靶標(例如，已知實體瘤是含有腫瘤細胞和正常細胞的組織結(jié)構(gòu)；因此載體必須穿過幾層正常細胞來到達惡性細胞)；(h)遷移通過填充細胞間空間因而阻礙載體的運輸?shù)?、由糖蛋白、硫酸糖胺聚糖、乙酰透明質(zhì)酸、蛋白多糖和膠原質(zhì)組成的細胞外基質(zhì)(ECM);和(i)解決在腫瘤微環(huán)境中的高間質(zhì)高壓(血管外增加的流體靜力壓力)問題，高間質(zhì)高壓可限制生物活性分子的進入。已經(jīng)提出許多不同的載體用于核酸和藥物的遞送，包括病毒載體、非病毒非活載體和非病毒活載體。非病毒非活載體適合于核酸和藥物的遞送。其余兩種載體適合于核酸的遞送。非病毒活載體主要被開發(fā)出直接的腫瘤細胞殺傷能力。雖然所有這些載體都有優(yōu)點，但它們也有缺點。病毒載體已被開發(fā)用于基因遞送，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、痘病毒、單純皰滲病毒和慢病毒。但是如果不感染正常組織，病毒載體就不能系統(tǒng)地和特異性地將基因遞送至原代腫瘤細胞和/或轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞(Akporiaye和Hersh，1999;Biederer等，2002;Green&Seymour,2002)。另外，病毒粒子在細胞外間隙內(nèi)極有限的擴散性顯著地阻礙了病毒載體的傳播。而且，由于病毒具有抗原性，因而會引起宿主的免疫應(yīng)答。這種免疫應(yīng)答包括特異性獲得性應(yīng)答和非特異性先天性應(yīng)答(Chen等，2003;Ferrari等，2003;Wakimoto等，2003)。后者在消除腺病毒載體(Liu和Muruve,2003)和HSV(Wakimoto等，2003)中起重要作用。非病毒非活載體的例子有陽離子聚合物(多聚物復(fù)合物(polyplexes))、陽離子脂質(zhì)(脂質(zhì)體、脂質(zhì)體復(fù)合物(lipoplexes))和合成納米粒子(納米復(fù)合物)(nanoplexes))。這些物質(zhì)比病毒載體功能更多，由于它們的分子組成可被控制、制造和分析這種載體非常容易、它們可容納許多轉(zhuǎn)基因尺寸(Kreiss等,1999;deJong等,200l)以及免疫原性較小(Whitmore等,1999,2001;Dow等,1999;Ruiz等，2001)，因此能提供幾種不同的優(yōu)點。但是，用非病毒非活載體進行基因遞送的效率顯著低于病毒載體。至少需要106個質(zhì)?？截悂磙D(zhuǎn)染單個細胞，其中實際上約有102-104個拷貝使基因到達細胞核從而進行轉(zhuǎn)基因表達(Feigner和Ringold，1989;James和Giorgio，2000;Tachibana等,2002)。這種低效率可歸因于非病毒非活載體不能克服在給藥位置與靶細胞核內(nèi)定位之間遇到的許多障礙，包括(a)DNA及其遞送載體在細胞外間隙中的物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性；(b)通過內(nèi)吞作用進行的細胞攝?。?c)在運輸?shù)饺苊阁w和胞漿運輸之前脫離內(nèi)體區(qū)室(endosomalcompartment);以及(d)用于轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒的核定位。除了這些物理和化學(xué)的障礙之外，還存在生物學(xué)障礙，例如對載體自身的免疫源性應(yīng)答和由具有中間去曱基化的CpG模體的特定DNA序列引起的免疫刺激(Yew等,1999;Scheule,2000;Ruiz等，2001)。作為非生活核^/藥物遞送載體的替代物，活細菌載體也被開發(fā)用于腫瘤靶向治療(Pawalek等,2003;Soghomonyan等,2005)。這些載體沒有攜帶核酸或藥物的負載物(payload)，但是優(yōu)先在腫瘤細胞中累積，在細胞內(nèi)復(fù)制并殺死受感染的細胞(Pawelek等,1997)。這種現(xiàn)象被認為是由將細菌蛋白直接引入哺乳動物細胞的復(fù)雜的細菌系統(tǒng)促成的，其能夠?qū)е抡T導(dǎo)細胞凋亡(Chen9等,1996;Monack等，1996;Zhou等,2000)。最近，正在研究將雙歧桿菌(Yazawa等，2000;2001;Li等，2003)、梭菌(Minton等，1995;Fox等，1996;Lemmon等,1997;Theys等，2001;Dang等，2001;Nuyts等，2002a;2002b;Liu等,2002)、沙門氏菌(Pawelek等,1997;Low等,1999;Platt等,2000;Luo等,2001;Rosenberg等，2002)和弧菌(Yu等,2004)作為肺瘤選擇性活細菌載體。活減毒細菌也已被開發(fā)用作遞送可編碼血管原性抑制因子(Lee等,2005a;2005b;Li等,2003)、藥物前體轉(zhuǎn)化酶(King等,2002)或細胞因子(Yamada等,2000)的核酸的載體(Paglia等^000;Weiss和Chakraborty2001;Yuhua等，2001)。該方法的重大缺點包括(a)活重組細菌在體內(nèi)逐漸丟失質(zhì)粒DNA，這主要由于選擇壓力的缺失以及相關(guān)的質(zhì)粒分離；(b)攜帶質(zhì)粒DNA的細菌相比于不含質(zhì)粒的細菌趨向具有較低的生長速度，并顯得在較低水平累積，且在腫瘤內(nèi)的停留時間較短；(c)活的革蘭氏陰性細菌載體可在哺乳動物宿主內(nèi)導(dǎo)致嚴重的內(nèi)毒素反應(yīng)，這可能是由于體內(nèi)內(nèi)毒素(脂多糖，LPS)的脫落造成的，并且可由于細胞侵入而引起Toll樣受體反應(yīng)；(d)大多數(shù)腫瘤靶向性活細菌蓄積并生長在腫瘤中壞死的和含氧量較低的病灶集中點內(nèi)，而不是在成長小瘤的邊緣上的含氧量較高的腫瘤內(nèi)，在那里腫瘤細胞通常生長最迅速；(e)與這些細菌有可能恢復(fù)成有毒表型相關(guān)的風(fēng)險是主要考慮的問題(Dunham,2002);以及(f)感染正常細胞的風(fēng)險可能導(dǎo)致菌血癥及相關(guān)的敗血性休克。后者可能尤其對免疫受損病人(例如晚期癌癥患者)來說是一個難題。特別是由于各種問題不斷妨礙著癌癥治療的成功，因此迫切需要一種靶向遞送策略，其選擇性地將生物活性劑遞送至腫瘤細胞和靶器官，或者保護正常組織不被服用抗腫瘤劑。這種策略將通過增加抗癌劑的治療指數(shù)來改善治療功效，同時使治療相關(guān)毒性的風(fēng)險最小化。本發(fā)明提供一種多功能遞送載體，其用于改良的藥物、治療性核酸和功能性核酸遞送策略，特別是但并非唯一地用于癌癥化療的情況中。
發(fā)明內(nèi)容為滿足上述及其他需要，本發(fā)明一方面提供一種包含多個完整的死亡細菌細胞和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。死亡細菌細胞包含治療性核酸、藥物或功能性核酸。對于后者，在一種實施方案中，功能性核酸不含質(zhì)粒。在這點上，通過穿過細菌細胞的完整的細胞膜，功能性核酸被直接包裹進入死亡細菌細胞中，而不需要使用以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的表達載體或宿主細胞的表達系統(tǒng)。這種不含質(zhì)粒的功能性核酸的例子有單鏈、雙鏈或多鏈DNA或RNA。在一種實施方式中，死亡細菌細胞包含無質(zhì)粒的功能性核酸，即調(diào)節(jié)性RNA。在優(yōu)選的實施方式中，該組合物本質(zhì)上不含內(nèi)毒素。本發(fā)明還提供了用于將死亡細菌細胞靶定至哺乳動物宿主細胞的雙特異性配體。雙特異性配體可以是多肽、碳水化合物或糖肽，且可包含抗體或抗體片段。在優(yōu)選的實施方式中，所述雙特異性配體具有第一個臂和第二個臂，所述第一個臂具有對細菌表面結(jié)構(gòu)的特異性，所述第二個臂具有對哺乳動物細胞表面結(jié)構(gòu)的特異性。此外，所述雙特異性配體的第一個臂和第二個臂可以是單特異性的或多價的。所期望的用于配體結(jié)合的細菌表面結(jié)構(gòu)為脂多糖(LPS)的O-多糖成分。所期望的用于配體結(jié)合的哺乳動物細胞表面結(jié)構(gòu)為受體，優(yōu)選為能夠活化受體介導(dǎo)的內(nèi)呑作用的受體。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種遞送方法，該方法包括將多個死亡細菌細胞與具有吞噬功能或內(nèi)吞功能的哺乳動物細胞接觸，使得所述死亡細菌細胞被哺乳動物細胞吞噬并在細胞內(nèi)釋放它們的負載物。所述負載物可包含治療性核酸、功能性核酸或藥物。在一種實施方式中，遞送功能性核酸的方法包括(a)在藥物載體中提供多個死亡細菌細胞，每個死亡細菌細胞都包含(i)功能性核酸或(ii)含有編碼功能性核酸的片段的質(zhì)粒，然后(b)將多個所述死亡細菌細胞與靶標哺乳動物細胞接觸，使得所述哺乳動物細胞吞噬所述死亡細菌細胞，從而將所述功能性核S吏釋放至靶細胞的細胞質(zhì)中。一方面，死亡細菌細^^不含質(zhì)粒，而另一方面，功能性核酸為調(diào)節(jié)性RNA。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種靶向遞送方法，該方法包括將雙特異性配體與(i)含有所需負載物的完整的死亡細菌細胞和(ii)哺乳動物細胞(優(yōu)選為非噬菌性哺乳動物細胞)接觸。該雙特異性配體對完整的死亡細菌細胞上的表面成分和哺乳動物細胞上的表面成分(例如受體)都具有特異性。因此，所述配體4吏死亡細菌細胞結(jié)合至哺乳動物細力包，所述死亡細菌細力包^皮哺乳動物細胞吞噬，而包含在死亡細菌細胞中的負載物被釋^:至哺乳動物細胞的細胞質(zhì)中。所述負載物可包含治療性核酸、功能性核酸或藥物。在又一方面，本發(fā)明提供一種克服抗藥性或凋亡抗性并通過將功能性核酸遞送至耙細胞來治療體內(nèi)惡性腫瘤的方法。該方法包括將含有(i)功能性核酸分子或(ii)含有編碼功能性核酸分子的片段的質(zhì)粒與靶標哺乳動物細胞接觸。所述哺乳動物細胞吞噬死亡細菌細胞，所述功能性核酸纟皮釋力丈到細胞質(zhì)中、被運輸至細胞核并被靶細胞表達。在本發(fā)明中，死亡細菌細胞與哺乳動物細胞間的接觸可以在體內(nèi)或體外。本發(fā)明還提供將藥物加入死亡細菌細胞的方法。一種這樣的方法包括在含有死亡細菌細胞的細胞外介質(zhì)和死亡細菌細胞的細胞質(zhì)之間形成所述藥物的濃度梯度。藥物沿此濃度梯度自然移動，進入死亡細菌細胞的細胞質(zhì)。因為細菌細胞的代謝失活，因而防止了藥物從細菌的細胞質(zhì)泄漏。另一種將藥物加入死亡細菌細胞的方法包括在各種環(huán)境下培養(yǎng)細菌細胞，培養(yǎng)的細菌細胞轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼藥物的治療性核酸，使得藥物被釋放進入細菌細胞的細胞質(zhì)，隨后殺死所述細菌細胞以形成一個或多個在其細胞質(zhì)中含有所述藥物的死亡細菌細胞。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供用不含質(zhì)粒的功能性核酸制備死亡細菌細胞的方法。該方法包括在緩沖液中將多個死亡細菌細胞與功能性核酸(例如調(diào)節(jié)性RNA)共培養(yǎng)，所述調(diào)節(jié)性RNA例如siRNA、miRNA或shRNA。在某些實施方式中，所述共培養(yǎng)可包括溫和的搖動，而在其他實施方式中所述共培養(yǎng)是靜止的。在某些方面，所述共培養(yǎng)持續(xù)約半小時，而在其他方面其持續(xù)約一小時。在一種實施方式中，所述緩沖液包含緩沖液鹽，例如lx磷酸鹽緩沖液。在另一種實施方式中，所述共培養(yǎng)在約4。C至約37。C、約2(TC至約3(rC、約25。C或約37。C的溫度下進行。所述共培養(yǎng)可包含約107、108、109、1010、1011、1012或1013個死亡細菌細胞。本發(fā)明提供完整的死亡細菌細胞和雙特異性配體在制備藥物中的應(yīng)用，用于通過向細胞、組織或器官給予所述藥物來治療疾病或修飾遺傳特征的方法中。在該藥物中，死亡細菌細胞包含治療性核酸分子、藥物或功能性核酸分子，以及非必需地，能夠結(jié)合至所述死亡細菌細胞和靶定非噬菌性哺乳動物細胞的雙特異性配體。這種藥物可用來通過增加所需蛋白質(zhì)的表達或功12能，或通過抑制靶蛋白質(zhì)的表達或功能來治療各種身體不適和疾病。這種身體不適和疾病的例子有癌癥和獲得性疾病，例如AIDS、肺炎、肺氣腫和肺結(jié)核?；蛘?，所述治療可影響遺傳特征，例如生育能力或與過壽l原或傳染性病原體有關(guān)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供一種用于純化完整的死亡細菌細胞的藥學(xué)上可接受的方法。該方法包括(i)用抗生素殺死活細菌細胞，(ii)通過交叉流過濾和/或死端過濾以除去游離的內(nèi)毒素、細胞碎片、游離的核酸、細菌膜皰(membranebleb)、培養(yǎng)基污染物，和(iii)基于抗體的螯合作用以除去殘留的游離內(nèi)毒素。圖l顯示通過靶定有雙特異性抗體的、包裹有化療藥物的完整的死亡細菌細胞產(chǎn)生的非常顯著的抗腫瘤作用。在Balb/c無胸腺小鼠的皮下(肩胛之間)建立人乳腺癌(MDA-MB-468)異種移植物，并且當腫瘤體積達到70mm3時，使用游離阿霉素(G2)、或包裹有阿霉素的非靶定的完整死亡鼠傷寒沙門氏菌細胞(G3)、或包裹有阿霉素的EGFR耙定的完整死亡鼠傷寒沙門氏菌細胞(G4),靜脈注射(體內(nèi))處理小鼠("=每組11只小鼠)。Gl小鼠是對照并接受無菌生理鹽水(體內(nèi))。在x-軸上用三角形標記的那天進^f亍所述處理，測得的腫瘤體積顯示在y軸上。結(jié)果顯示，當egfr死亡鼠傷寒沙門氏菌d。x(G4)被用作治療手段時具有非常顯著的抗肺瘤作用，而G2和G3小鼠未顯示出抗腫瘤作用。每個測量都顯示標準偏差。圖2圖示了包裹有紫杉醇或siRNA的完整的死亡細菌細胞抑制人結(jié)腸癌細胞(HCT116)腫瘤在體內(nèi)的生長。圖3顯示通過使用雙重治療方案對在鼠載人結(jié)腸癌(Caco-2)異種移植物中的抗藥性的逆轉(zhuǎn)，其中第一種治療包括包裹有EGFR的、攜帶抗MDR-1shRNA的死亡鼠傷寒沙門氏菌，而第二種治療包括包裹有EGFR的、攜帶伊立替康(Irinotecan)或5-氟脲嘧啶(5-FU)的死亡鼠傷寒沙門氏菌。第一種治療和第二種治療分別由x-軸下方的三角形和箭頭顯示。具體實施方式本發(fā)明的發(fā)明人已確定，完整的死亡細菌細胞是在體內(nèi)和體外將治療性核酸、功能性核酸和藥物靶向遞送至患病細胞(特別是癌細胞)的有效載體。許多驚人的發(fā)現(xiàn)奠定了上述確定內(nèi)容的基礎(chǔ)。例如，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當將包含(a)含有治療性核酸、藥物或功能性核酸負載物的完整的死亡細菌細胞(b)雙特異性靶向配體，和(c)將藥學(xué)上可接受的載體的組合物接觸體內(nèi)或體外的患病細胞，完整的死亡細菌細胞載體以高效率被內(nèi)吞進入靶標非噬菌性哺乳動物細胞。此發(fā)現(xiàn)是驚人的，因為盡管雙特異性配體已^^皮用來將病毒遞送載體和非病毒遞送載體靶定至非噬菌性哺乳動物細胞(Wickham等，1996;Nettelbeck等,2001;Boucher等,2003;0§1^&Wagner,2002),但認為受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用不會對與細菌細胞一樣大的微粒起作用。例如，腺病毒載體已被改用來靶定哺乳動物細胞表面受體，例如內(nèi)皮細胞上的內(nèi)皮糖蛋白(endoglin),并通過在哺乳動物細胞質(zhì)膜中的披網(wǎng)格蛋白小窩被內(nèi)化。Wickham等，1996;Nettelbeck等，2001;Boucher等,2003。披網(wǎng)格蛋白小窩類似杯子，其包住載體，但杯子的尺寸被認為是限制因素。因為網(wǎng)格蛋白包被的尺寸的原因，披網(wǎng)格蛋白小窩具有85-110nm的有限尺寸。Swanson&Watts，1995。相反，細菌細胞的直徑至少為400nm，長度至少為1000nm。因此，并不預(yù)期這種耙向方法也能用于死亡細菌細胞。有關(guān)其他大載體的知識證明了死亡細菌細胞不會通過披網(wǎng)格蛋白小窩被內(nèi)化的預(yù)期。例如，大的脂質(zhì)體復(fù)合物(大至500nm的非病毒載體)優(yōu)先通過受體非依賴性和網(wǎng)格蛋白非依賴性內(nèi)吞作用進入細胞，而較小的脂質(zhì)體復(fù)合物(小于200nm)可通過非特異性、網(wǎng)格蛋白依賴性方法被內(nèi)化。Simoes等,1999。同樣，尺寸在約350nmx250nm的大病毒，例如牛痘病毒，不會通過網(wǎng)才各蛋白包被途徑感染哺乳動物細胞。Essani和Dales,1979。相似地，非噬菌性哺乳動物細胞不能吞噬大的病原體，例如細菌細胞。只有專職噬菌細胞，例如巨噬細胞，才吞噬這種病原體，且吞噬過程不依賴于網(wǎng)格蛋白和受體，而通過噬菌作用完成。大的病原體與細胞表面的相互作用誘導(dǎo)復(fù)雜的信號級聯(lián)，導(dǎo)致肌動蛋白在質(zhì)膜處重排，以形成大的噬菌杯，其吞噬細菌。Dramsi和Cossart,1998。人們對于在細菌進入時造成肌動蛋白在質(zhì)膜處重排的信號級聯(lián)了解得還比較少。Galan,1996;Menard等,1996;Finlay14和Cossart,1997;Dramsi和Cossart,1998。對于粒度對受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的影響的特定研究顯示，該過程具有非常強的尺寸依賴性。例如，Aoyama等,2003,研究了粒度對糖病毒基因遞送的影響，并得出用于受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的最佳粒度是25nm的結(jié)論。還參見Nakai等,2003;Osaki等,2004。Gao等，2005，證實了上述結(jié)論。而且，即使雙特異性配體據(jù)才艮道已被用來使病毒性載體改向，該方法在基因遞送應(yīng)用中也并非總是成功的。在將病毒從它們的天然受體重新靶定(retarget)至另外的受體的嘗試中，許多試驗已經(jīng)表明，細胞表面附著物對于持續(xù)的病毒進入和基因表達是不夠的。同樣，當病毒包膜蛋白被修飾以用于重新靶定時，它們表現(xiàn)出低融合活性，導(dǎo)致病毒進入細胞的效率低。Zhao等，1999。在缺乏特異性靶定時，策略依賴于局部位置的直接注射。Akporiaye&Hersh,1999。因此，現(xiàn)有技術(shù)表明，雙特異性配體不能使完整的死亡細菌細胞載體進入非噬菌性哺乳動物細胞。進一步證明這點的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，即使以延長在許多哺乳動物細胞系中的培養(yǎng)周期的方式重復(fù)嘗試之后，未被靶定的死亡細菌細胞也不能特異性地粘附至非噬菌性哺乳動物細胞并將負載物遞送至其中。特別地，未被靶定的死亡細菌細胞不被非噬菌性哺乳動物細胞內(nèi)化。相反，死亡細菌細胞會輕易地被專職噬菌細胞(像巨噬細胞)吞噬。這確證了早前的發(fā)現(xiàn)，即大至12,的微粒被專職噬菌細胞吞噬(Kanke等,1983)且當顆粒小于2)im時會達到進入巨噬細胞的微粒的最大吸收量(Tabata和Ikada,1988;1990)。因此，不同于病毒載體特異性粘附至病毒受體并引起它們的內(nèi)化，死亡細菌細胞沒有相似的機制以侵入非噬菌性哺乳動物細胞。與此背景相反，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，雙特異性配體可引導(dǎo)完整的死亡細菌細胞在非噬菌性哺乳動物細胞中的內(nèi)吞作用。初步的數(shù)據(jù)顯示，細菌細胞的內(nèi)化可能通過受體依賴性和大胞飲依賴性途徑發(fā)生，盡管申請人不受這樣的理論的約束。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)下述內(nèi)吞作用，死亡細菌在細胞內(nèi)液泡內(nèi)(大概是在內(nèi)吞溶酶體內(nèi))被完全降解。這是令人驚訝的，因為能夠降解大的生物顆粒(像細菌細胞和寄生細胞)的苛刻(harsh)降解機制被認為只在專職噬菌細胞(像巨噬細胞)進行。那種機制被認為是允許由專職噬菌細胞完成的完全的抗原加工和呈遞。因為大多數(shù)非噬菌細胞不加工和呈遞抗原，所以認為它們只含有輕微的抗原呈遞系統(tǒng)，其主要用于細胞成分的再循環(huán)。在被受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化后，載體被包含在內(nèi)體膜或溶酶體膜內(nèi)，因而與細胞質(zhì)分離開。這相當大地阻礙了負載物的遞送，尤其是因為內(nèi)體和溶酶體可變得腐蝕性非常強，并降解超過99%的負載物(例如載體中的核酸)。成功的基因遞送載體具有讓核酸進入細胞質(zhì)的機制，但專家們不會期望小細胞具有這種機制。例如，病毒已經(jīng)進化出了進入哺乳動物細胞的細胞質(zhì)的非常復(fù)雜的方法。有包膜逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如HIV-l,通過與質(zhì)膜直接融合而進入細胞質(zhì)。Stein等,1987。無包膜病毒在內(nèi)吞后，使用各種策略穿透內(nèi)體膜。例如，流感病毒誘導(dǎo)病毒與內(nèi)體膜的融合，這是由內(nèi)體的酸性環(huán)境引起的。Marsh&Helenius,1989。在低pH時，主要的流感病毒包膜糖蛋白血凝素(HA)的構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致疏水性刺突伸入內(nèi)體膜，這啟動了膜融合。Bullough等，1994。腺病毒也被認為是通過依賴于內(nèi)體的酸化的機制而進入細胞溶質(zhì)的。低pH對腺病毒殼體具有幾種影響。例如，殼體的五鄰體蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，其暴露出疏水區(qū)用于內(nèi)體膜相互作用。Seth等，1985。另外，腺病毒殼體的固有蛋白酶活性似乎也有助于內(nèi)體脫離。Greber等，1996。對于脂質(zhì)體載體，內(nèi)體膜屏障仍限制基因遞送的效率。脂質(zhì)體核酸的成功釋》文被認為是由內(nèi)吞溶酶體膜的破裂引起的。Xu&Szoka,1996;ElOuahabi等，1997;Zelphati&Szoka,1996a;Wattiaux等，2000。內(nèi)吞溶酶體膜的破裂被認為是通過脂質(zhì)的跨膜翻轉(zhuǎn)而發(fā)生的，導(dǎo)致膜不穩(wěn)定和棵DNA穿透進入細胞質(zhì)。Zelphati&Szoka,1996a;1996b;Mui等，2000。多項研究進一步證實，月旨質(zhì)體內(nèi)容物(liposomalcontent)的胞質(zhì)釋》文包括(aH吏用陰離子大分子(例如陰離子脂質(zhì)和蛋白聚糖)來電荷中和陽離子絡(luò)合劑，(b)陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的融合，和(c)由pH敏感性脂質(zhì)造成的膜不穩(wěn)定。Wrobel&Collins,1995;Meyer等，1997;Clark&Hersh,1999。另外的研究顯示，中性脂質(zhì)(DOPE)與陽離子脂質(zhì)的混合物有利于膜破裂并增加釋放至細胞質(zhì)中的脂質(zhì)體內(nèi)容物的量，因為DOPE促進脂質(zhì)體顆粒與內(nèi)體膜的融合。Farhood等，1995;Fasbender等，1997;Hafez等，2001。而且，陽離子PEI和多胺樹狀聚體已被用來幫助破裂內(nèi)吞溶酶體膜，因為它們具有引起內(nèi)體膨脹和破裂的廣泛的緩沖能力。Klemm,1998;Sonawane等，2003。可以來自單核細胞增生李斯特菌的溶內(nèi)體成孔蛋白質(zhì)一一李斯特菌溶胞素O(LLO)的形式賦予脂質(zhì)體載體額外的功能。Lorenzi和Lee，2005。LLO能夠打破內(nèi)體膜，從而讓內(nèi)體內(nèi)容物釋放進入細胞質(zhì)。Lee等，1996。所以，現(xiàn)有的教導(dǎo)表明，需要復(fù)雜的機制以讓某些載體負載物突破溶酶體膜。死亡細菌細胞是無生命的顆粒，且不具有任何使溶酶體膜不穩(wěn)定的功能。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果死亡細菌細胞攜帶至少70至100個拷貝的質(zhì)粒DNA,那么某些此DNA可突破內(nèi)體膜，而不需要使內(nèi)體膜不穩(wěn)定或破裂。這暗示，當大多凄緩粒DNA很可能在內(nèi)吞溶酶體液泡中被降解時，可能會摧毀系統(tǒng)從而讓某些DNA完整地突破進入哺乳動物細胞的細胞質(zhì)。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，雖然非噬菌性哺乳動物細胞不被認為具有苛刻的溶酶體處理機制(可以降解像細菌細胞的復(fù)雜的多成分結(jié)構(gòu))，但這可能是錯誤的。當前的觀點指明，像細菌細胞這樣的復(fù)雜結(jié)構(gòu)的細胞內(nèi)降解只限于能夠進行完全抗原加工和呈遞的專職噬菌細^^。在相關(guān)的方面，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由雙特異性配體靶定的、包裹有藥物的死亡細菌細胞攜帶的有效濃度的生物活性藥物，也突破內(nèi)吞溶酶體膜并進入哺乳動物細胞的細胞質(zhì)。另外，他們發(fā)現(xiàn)，死亡細菌細胞具有的包裹許多不同藥物(例如，親水性、疏水性和兩性藥物，例如阿霉素、紫杉醇、順鉑、卡鉑、5-氟脲嘧啶和伊立替康)的能力使得其用途非常廣泛，且已發(fā)現(xiàn)所有藥物都能容易地以治療有效濃度凈皮包裹在死亡細菌細胞中。發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)，當雙特異性抗體靶定的、包裹有藥物的死亡細菌細胞(為簡便起見，也稱作"治療性的")被靜脈給藥至攜帶人腫瘤異種移植物的棵鼠中時，它們從包圍瘤塊的血管壁溢出并進入腫瘤微環(huán)境。在癌癥治療中耙定含顆粒的系統(tǒng)已充分利用了滲漏腫瘤維管結(jié)構(gòu)(Jain,1998)和有效淋巴流向的缺乏(Maeda和Matsumura，1989;Seymour,1992;Yuan等，1994),這導(dǎo)致循環(huán)顆粒的通透性增強與滯留(EPR)效應(yīng)(Maeda,2001)(被動靶向)。腫瘤血管具有不規(guī)則的直徑、異常的分支模式，且不能適用細動脈、毛細管或小靜脈的慣常分類。Warren，1979;Less等,1991,1997;Konerding等，1995。在特別重要的功能中，腫瘤血管滲漏顯著。Peterson和Appelgren,1977;Gerlowski和Jain，1986;Jain,1987,1997;Dvorak等，1988。腫瘤17孩i血管對大分子的高通透性已在許多研究中^皮觀察到。Gerlowski和Jain,1986;Jain,1987;Jain1996。但是，可穿過不同腫瘤血管的試劑的尺寸上限以及它是如何被調(diào)節(jié)的，尚不清楚。一個研究測定了在免疫缺陷小鼠皮下生長的人結(jié)腸癌的孔尺寸端值(cutoff)為400-600nm。Yuan等，1995。其他凈艮道稱，某些腫瘤只具有100nm的孔尺寸端值。Hobbs等，(1998)。因此，發(fā)現(xiàn)大于1000pm的完整的死亡細菌細胞能夠外滲出腫瘤周圍的內(nèi)皮細胞壁是令人驚訝的。此發(fā)現(xiàn)使得完整的死亡細菌細胞能夠用于體內(nèi)腫瘤治療。另外，之前已表明，異常肺瘤微環(huán)境的特點是間質(zhì)高壓(血管外側(cè)的升高的流體靜力壓；Less等，1992;Jain,2001)，其限制了抗癌治療法的使用。例如，據(jù)報道，當研究在SCID小鼠中原位建立的乳腺癌(MDA-MD-231)肺瘤時，在靜脈注射對比劑二乙烯三胺五乙酸釓后，對比劑進入腫瘤的量減少。Dadiani等,2004。那篇報道的作者推測，觀察到的間質(zhì)高壓的增加表明，高間質(zhì)壓力使流體再次進入血管，從而增加了流出量與流入量的比率。有趣的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，死亡的細菌細胞不受這種間質(zhì)高壓的阻礙，但能夠?qū)崿F(xiàn)非常大的抗肺瘤效應(yīng)(圖l)。以下描述概括了與這些發(fā)現(xiàn)相關(guān)的發(fā)明，而非將本發(fā)明限制在所描述的特定實施方式、方法、方案或試劑。同樣，此文所使用的術(shù)語只描述特定的實施方式，并不限制本發(fā)明的范圍。除非另有說明，所有在此描述中使用的外，除非文中明確另有表示，單數(shù)形式"一個(a)"、"一個(an)"或"所述(the)"包括復(fù)數(shù)。包含完整的死亡細菌細力包的組合物一方面，本發(fā)明提供包含完整的死亡細菌細胞和用于它的藥學(xué)上可接受的載體的組合物。死亡細菌細胞可含有治療性核酸、藥物、功能性核酸分子或它們的組合。完整的死亡細菌細胞才艮據(jù)本發(fā)明，如在BERGEY'SMANUALOFSYSTEMATICBIOLOGY的第二版中所定義的，死亡細菌細胞是細菌、藍細菌、真細菌和古細菌的無生命原核細胞。如果它們具有完整的細胞壁和/或細胞膜并含有該細菌種類內(nèi)源性的遺傳物質(zhì)(核酸)，那么這樣的細胞即纟皮i見為"完整的"。治療性核酸和治療性表達產(chǎn)物治療性核酸分子編碼的產(chǎn)物例如肽、多肽或蛋白質(zhì)，其產(chǎn)物在靶細胞中是合乎需要的。例如，感興趣的遺傳物質(zhì)編碼激素、受體、酶或具有治療價值的多肽。這種方法可導(dǎo)致未整合的(non-integrated)轉(zhuǎn)移DNA的短暫表達、染色體外的復(fù)制和轉(zhuǎn)移復(fù)制子(例如游離基因)的表達，或轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)整合進入宿主細胞基因組DNA。詞語"核酸分子"和術(shù)語"多核苷酸"表示任何長度的核苦酸(核糖核苷酸或脫氧糖核苷酸)的聚合形式。它們包括單鏈、雙鏈或多鏈DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜交體或包含噤呤堿基和嘧p定堿基或其他天然的、化學(xué)或生化修飾的、非天然的或衍生的核苷酸堿基的聚合物。多核苷酸的骨架可包含糖和磷il基團(通常對于RNA和DNA是這樣)，或修飾的或取代的糖或磷酸基團。或者，多核苷酸的骨架可包含合成亞基(例如亞磷酰胺)的聚合物，因此可以是寡脫氧核苷氨基磷酸酯或混合的氨基磷酸面旨-磷酸二酯寡聚體。多核苷酸可含有修飾的核苷酸(例如甲基化的核苦酸和核芬酸類似物)、尿嘧咬(uracyl)、其他糖類和例如氟核糖和碌u基(thioate)的連接基團，和核香酸分支(皿cleotidebranches)。多核苷酸可進一步^皮修飾，例如通過與標記成分結(jié)合。其他類型的修飾包括加帽、用類似物取代一種或多種天然核苦酸，以及引入將多核苷酸附著至蛋白質(zhì)、金屬離子、標記成分、其他多核苷酸或載體的手段(means)。在此文中可互用的"多肽"和"蛋白質(zhì)"是指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可包括翻譯的、未翻譯的、化學(xué)修飾的、生化修飾的和衍生的氨基酸。多肽或蛋白質(zhì)可以是天然的、重組的或合成的，或任何這些的組合。而且，多肽或蛋白質(zhì)可包含天然蛋白質(zhì)或肽的片段。多肽或蛋白質(zhì)可以是單個分子或可以是多分子復(fù)合體。另外，這種多肽或蛋白質(zhì)可具有被修飾的肽骨架。這兩個術(shù)語包括融合蛋白(包括具有或沒有N末端蛋氨酸殘基的具有異源氨基^列的融合蛋白、具有異源或同源前導(dǎo)序列的融合蛋白)、免疫標記蛋白，等等。術(shù)語"表達"通常指多核苷酸序列進行成功的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程，使得表達出可檢測水平的氨基酉1^列或蛋白質(zhì)。在本文的特定環(huán)境下，表達是指產(chǎn)生mRNA。在其他環(huán)境下，表達是指產(chǎn)生蛋白質(zhì)。給定的治療性核酸分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯可用于治療癌癥或獲得性疾病，例如AIDS、肺炎、肺氣胂，或用于矯正新陳代謝的先天性障礙，例如嚢性纖維性變。治療性核酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯也可招致避孕性絕育，其包括野生動物的避孕性絕育。過敏原介導(dǎo)的和傳染性病原體介導(dǎo)的炎性疾病，也可憑借本發(fā)明，通過服用治療性核酸分子而治療，所述治療性核酸分子一旦在病人體內(nèi)表達就分別影響與過敏原和感染性病原體有關(guān)的免疫應(yīng)答。治療性核酸分子也可具有表達產(chǎn)物，或者可以有表達產(chǎn)物翻譯后修飾的下游產(chǎn)物，其減少了與移植有關(guān)的免疫后遺癥或其幫助組織生長和再生。在此文中互用的術(shù)語"癌癥"、"瘤"、"月中瘤"、"惡性胂瘤"和"癌"是指表現(xiàn)出異常生長表型的細胞或組織，其特點是細胞增殖的重大失控。本發(fā)明的方法和組合物特別適用于癌癥前期細胞、癌細胞、轉(zhuǎn)移前細胞、轉(zhuǎn)移細月包和不轉(zhuǎn)移細月包。治療性核酸分子可以是基因的正鏈副本，該基因表達功能異常的蛋白質(zhì)或者在疾病狀態(tài)下以異常水平存在的蛋白質(zhì)，例如，在嚢性纖維性變中的嚢性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(Kerem等，1989;Riordan等，1989;Rommens等，1989)、在鐮刀形紅細胞貧血癥中的p-球蛋白和在地中海貧血癥中的任何的a-球蛋白、P-球蛋白和y-球蛋白。因此，a-球蛋白比p-球蛋白過量產(chǎn)生(p-地中海貧血癥的特點)，根據(jù)本發(fā)明，可通過使用被改造成含有質(zhì)粒的完整的死亡細菌細胞的基因治療來改善，所述質(zhì)粒含有這樣的序列，即其具有與a-球蛋白mRNA的把序列相對的反義RNA轉(zhuǎn)錄子。在治療癌癥中，根據(jù)本發(fā)明適合使用的治療性核酸分子可具有這樣的序列，即其對應(yīng)于或衍生自與腫瘤抑制有關(guān)的基因，例如p53基因、成視網(wǎng)膜細胞瘤基因和編碼腫瘤壞死因子的基因。根據(jù)本發(fā)明，許多種實體腫瘤——癌、乳頭狀瘤和疣——應(yīng)該可被此方法治療。代表性的這種癌包括結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、皮膚癌、肝癌、骨癌、卵巢癌、胰腺癌、腦癌、頭頸癌和淋巴瘤。示例性的乳頭狀瘤是扁平細胞乳頭狀瘤、脈絡(luò)叢乳頭狀瘤和喉乳頭狀瘤。疣疾病的例子有生殖器疣、腳底疣、疣狀表皮發(fā)育不良和惡性疣。用于本發(fā)明的治療性核酸分子也可包含編碼酶的DNA片段，該編碼酶將無活性前體藥物轉(zhuǎn)化成一種或多種細胞毒素代謝物，使得前體藥物被51入體內(nèi)后，有效的靶細胞(可能和相鄰細胞一起)被強迫自殺。這種"自殺基因"(可以是非人源性的或人源性的)的臨產(chǎn)前和臨床應(yīng)用已由Spencer(2000)、Shangara等(2000)和Yazawa等(2002)綜述過。非人源性自殺基因的例子分別是編碼HSV-胸香激酶(A)、胞嘧咬脫氨基酶(CDA)+尿嘧啶轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(GPT)、硝基還原酶(NTR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP,DeoD)、細胞色素P450(CYP4B1)、羧肽酶G2(CPG2)和D-氨基酸氧化酶(DAAO)的基因。人源性自殺基因的例子分別是編碼羧肽酶A1(CPA)、脫氧胞苷激酶(dCK)、細胞色素P450(CYP2B1,6)、LNGFR/FKBP/Fas、FKBP/胱天蛋白酶和ER/p53的基因。自殺基因治療可被用于治療AIDS。此策略已經(jīng)使用以下方法測試過，即被治療哺乳動物細胞一被HIV-1感染就使用表達有毒基因產(chǎn)物的自殺載體測試。在被HIV-1感染后，這些載體使用HIV-1調(diào)節(jié)元件，Tat和/或Rev,來誘導(dǎo)毒性基因的表達，例如a-白喉毒素、胞核嘧梵脫氨酶或干擾素-a2。參見Curiel等,1993;Dinges等,1995;Harrison等,1992a;Harrison等，1992b;Ragheb等，1999。本發(fā)明的治療性核酸通常被包含在死亡細菌細胞內(nèi)的質(zhì)粒上。質(zhì)粒也可含有額外的核酸片段作為調(diào)節(jié)元件，例如啟動子、終止子、增強子或信號序列，且其可操作地連接至治療性核酸片段。如治療環(huán)境決定的，合適的啟動子可以是組織特異性的，或者甚至是腫瘤特異性的。治療性核酸可編碼自殺基因或表達出功能異常或以異常水平存在于哺乳動物細胞中的蛋白質(zhì)的基因的正鏈副本。而且，治療性核酸可被包含含有多個核酸序列的質(zhì)粒上。此外，質(zhì)粒可含有調(diào)節(jié)元件和/或報道元件(reporterdement)術(shù)語"基因"是指包含產(chǎn)生多肽或前體所需的控制序列和編碼序列的多核苷酸序列。多肽可由全長編碼序列或由所述編碼序列的任何部分編碼。基因可以是連續(xù)的編碼序列，或者其可包括一個或多個由適當?shù)募艚狱c連接的內(nèi)含子。而且，基因可在編碼區(qū)或未翻譯區(qū)含有一個或多個修飾，這可影響表達產(chǎn)物的生物活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)、表達的速度或表達控制的方式。這樣的修飾包括，但不限于，突變、插入、缺失，以及一個或多個核苷酸的替換。在這點上，這樣修飾的基因可被稱作為"天然"基因的"變體"。術(shù)語"宿主細胞"是指可被或已被用作重組載體或其他多核苷酸轉(zhuǎn)移的受體的細胞，且包括已被轉(zhuǎn)染的原始細胞的后代。由于自然的、偶發(fā)的或故意的突變的原因，單個細胞的后代可不必與原始母本在形態(tài)、基因組或總DNA補體上完全相同。調(diào)節(jié)元件通過本發(fā)明的方法被引入的核酸分子也可具有所需的編碼片段，該片段可操作地被連接至調(diào)節(jié)元件，例如啟動子、終止子、增強子和/或信號序列。如治療環(huán)境決定的，合適的啟動子可以是組織特異性的，或者甚至是腫瘤特異性的。當啟動子被優(yōu)先在給定的組織中被激活，因而有效地驅(qū)動被可操作地連接的結(jié)構(gòu)序列在靶標組織中的表達時，啟動子即是"組織特異性的"。組織特異性啟動子的種類包括，例如分別用于白蛋白和al-抗胰蛋白酶的肝細胞特異性啟動子；在胰腺細胞中活躍的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)；在胰腺p細胞中活躍的胰島素基因控制區(qū)；在睪丸細胞、乳腺細胞、淋巴細胞和肥大細胞中活躍的小鼠乳癌病毒控制區(qū)；在腦中的少突細胞中活躍的髓磷脂堿性蛋白基因控制區(qū)；和在下丘腦的細胞中活躍的促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)。參見Frain等(1990)，Ciliberto等(1985)，Pinkert等，(1987)，Kelsey等(1987),Swift等(1984),MacDonald(1987),Hanahan,(1985),Leder等(1986),Readhead等(1987)，和Mason等(1986)。也有優(yōu)先在特定腫瘤細胞中表達或在腫瘤細胞本身的啟動子，根據(jù)本發(fā)明這些啟動子對于治療不同的癌癥是有用的。對于癌細胞特異性的啟動子的種類的例子有靶定黑素瘤的酪氨酸酶啟動子；靶定乳腺癌的MUC1/Df3啟動子；靶定橫紋肌肉瘤(RMS)表達的雜交w少oD增強子/SV40啟動子；對于CEA-表達細胞(例如結(jié)腸癌細胞)特異性的癌胚抗原(CEA)啟動子；和靶定非小細胞肺癌的己糖激酶II基因啟動子。參見Hart(1996),Morton&Potter(1998),Kurane等(1998)和Katabi等(1999)。依賴于RNA聚合酶(pol)II或polII的啟動子對于基因轉(zhuǎn)錄來說是優(yōu)選的啟動子。用于shRNA轉(zhuǎn)錄的非常優(yōu)選的啟動子是RNAIII聚合酶啟動子Hl和U6。才艮據(jù)本發(fā)明，可使用信號序列來影響表達產(chǎn)物的分泌或影響表達產(chǎn)物定位至特定細胞區(qū)室。因此通過完整的死亡細菌細胞遞送的治療性多核苷酸分子可在合適的閱讀框包含信號序列，使得所感興趣的表達產(chǎn)物由吞噬細胞或其后代分泌，從而與所選擇的治療模式一致而影響周圍細胞。信號序列的例子包括在美國專利第5,143,830號中描述的溶血素C末端分泌序列，在美國專利第5，037，743號中描述的BARI分泌序列，和在美國專利第6，025,197號中描述的zsig32多肽的信號序列部分。報道元件通過本發(fā)明的方法被引入的核酸分子可包含凈艮道元件。"t艮道元件通常通過編碼宿主不生產(chǎn)的多肽而賦予其重組宿主容易被^r測的表型或特性，所述多肽一旦表達即可通過組織學(xué)分析或原位分析(例如，通過體內(nèi)成像技術(shù))而被檢測。例如，根據(jù)本發(fā)明通過完整的死亡細菌細胞遞送的報道元件，可編碼在吞噬性宿主細胞中產(chǎn)生色度變化或熒光變化的蛋白質(zhì)，所述色度或熒光變化可通過原位分析檢測到并且是轉(zhuǎn)錄活化的定量或半定量函數(shù)。這些蛋白質(zhì)的例子有酯酶、磷酸酶、蛋白酶或其他酶，它們的活性產(chǎn)生可檢測的發(fā)色團或熒光團。優(yōu)選的例子為通過裂解龍原底物(indigogenicsubstrate)——吲-朵-p-D-半乳糖香一一來實現(xiàn)顏色變化的大腸桿菌P-半乳糖苷酶，和氧化長鏈醛(細菌的熒光素酶)或雜環(huán)羧酸(熒光素)同時發(fā)光的熒光素酶。同樣可用于本文的報道元件是，如Prasher等人(1995)所描述的，編碼水母(j^worea的綠色熒光蛋白(GFP)。與GFP相關(guān)技術(shù)的領(lǐng)域由兩個公布的PCT申請，WO095/21191(公開了編碼238個氨基酸的GFP脫輔基蛋白的多核苷酸序列，其含有由第65位氨基酸到第67位氨基酸形成的發(fā)色團)和WO095/21191(公開了對Av/ctoW"GFP的脫輔基肽的cDNA的修飾，其提供具有改變的熒光性質(zhì)的肽)，以及Heim等(1994)關(guān)于突變GFP(特點為激發(fā)振幅(excitationamplitude)提高4至6倍)的才艮道闡明。另一種報道元件與使重組死亡細菌細胞能抵抗毒素的表達產(chǎn)物有關(guān)。例如，weo基因保護宿主抵抗毒性水平的抗生素G418,而編碼二氬葉酸還原酶的基因提供對氨甲喋呤的抗性，且氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因提供對氯霉素的抗性。其它用作報道元件的基因包括可轉(zhuǎn)化宿主死亡細菌細胞以表達不同的細胞表面抗原的基因，例如，病毒包膜蛋白(例如HIVgpl20或皰滲gD),它們可容易地通過免疫分析而被檢測。藥物用于本發(fā)明中的藥物可以是任何生理或藥理活性物質(zhì)，其在動物，尤其是哺乳動物和人類體內(nèi)產(chǎn)生想要的局部或全身效應(yīng)。藥物可以是無機或有機化合物，不受限制地，包括肽、蛋白質(zhì)、核酸和小分子，其中任一種可被特征化或不被特征化。它們可以為各種形式，例如無變化的分子、分子復(fù)合物、藥理上可接受的鹽，例如氫氯化物、氫溴化物、硫酸鹽、月桂酸鹽、棕櫚酸鹽、磷酸鹽、亞硝酸鹽、硝酸鹽、硼酸鹽、醋酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、水楊酸鹽等。對于酸性藥物，可使用金屬鹽、銨鹽或有機陽離子，例如季銨鹽。還可以使用藥物衍生物，例如堿、酯和酰胺。不溶于水的藥物能以其水溶性衍生物的形式或作為其堿性衍生物被使用，無論在任何情況下或通過其遞送，該藥物可通過酶被轉(zhuǎn)化成、通過體內(nèi)pH或其它代i射過程:帔水解成原始的治療活性形式。有用的藥物包含化療制劑、免疫抑制劑、細胞因子、細胞毒素劑、核溶解化合物(nucleolyticcompound)、方文射性同位素、受體和藥物前體活化酶，它們可以是天然的或通過合成方法或重組方法而制備的。受經(jīng)典型多藥抗藥性影響的藥物在本發(fā)明中具有特別的用處，例如長春花生物堿(例如，長春堿和長春新堿)、蒽環(huán)類抗生素(例如，阿霉素和柔紅霉素)、RNA轉(zhuǎn)錄抑制劑(例如，放線菌素-D)和微管穩(wěn)定藥物(例如，紫杉醇)。(Ambudkar等，1999)。通常，癌癥化療劑為優(yōu)選的藥物。有用的癌癥化療藥物包括氮齊、亞硝基脲(nitrosorueas)、乙烯亞胺、磺酸烷酯、四噢、鉑化合物、嘧咬類似物、噪呤類似物、抗代謝物、葉酸類似物、蒽環(huán)類抗生素、紫杉烷類、長春花生24物堿、拓樸異構(gòu)酶抑制劑和激素劑。示例性的化療藥物為放線菌素-D、左旋苯丙氨酸氮芥、阿糖胞苷(Ara-C)、阿那曲唑、天冬酰胺酶、BiCNU、比卡魯胺、博來霉素、白消安、卡培他濱、卡鉑、碳鉑、卡莫司汀、CCNU、苯丁酸氮齊、順鉑、克拉屈濱、CPT-ll、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞香(Cytosineambinoside)、環(huán)石粦酰胺(Cytoxan)、達卡巴。秦、方丈線菌素(Dactinomycin)、柔紅霉素、右丙亞胺、多西他賽、阿霉素、DTIC、表柔比星、乙烯亞胺、依托泊苷、氟尿嘧啶脫氧核苷、氟達拉濱、氟尿嘧啶、氟他胺、福莫司汀、吉西他濱、赫賽汀、六曱胺、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯曱基二乙胺、美法侖、巰噤呤、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、氨羥二磷酸二鈉、噴司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、利妥昔單抗、類固醇、鏈佐星、STI-571、鏈佐星、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、四溱、硫鳥。票呤、塞替派、雷替曲塞、托泊替康、曲奧舒凡、三甲曲沙、長春堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞濱、VP-16和希羅達。有用的癌癥化療藥物還包括烷基化劑，例如塞替派和環(huán)磷酰胺；烷基磺酸鹽，例如白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡；氮丙啶，例如硫丹、卡波醌、麥吞多派(Meturedopa)和尤里多派(Uredopa);乙烯亞胺和曱基氨基吖啶，包括六曱蜜胺、曲他胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基碌u化磷酰胺和三鞋甲蜜胺(trimethylolomelamine);氮齊，例如苯丁酸氮芥、萘氮齊、氯磷酰胺(Cholophosphamide)、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、二氯曱基二乙胺、氧氮芥鹽酸化物、美法侖、Novembiehin、苯芥膽甾醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫司汀；硝基脲，例如卡莫司汀(Cannustine)、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司??；抗生素，例如阿柔比星(Aclacinomysins)、放線菌素、Authramycin、偶氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、刺孢霉素、洋紅霉素(Carabicin)、去曱柔紅霉素、嗜癌霉素、色霉素(Chromoinycins)、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、重氮氧代正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅霉素、絲裂霉素、麥考盼酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素(Potfiromycin)、嘌羅霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈佐星、殺結(jié)核菌素(Tubercidin)、烏苯美司、凈司他丁和佐柔比星；抗代謝物，例如曱氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物；例如二曱葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三曱曲沙；嘌呤類似物，例如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、好u鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟脲嘧啶脫氧核苷和5-FU;雄激素類，例如卡普睪酮、屈他雄酮、環(huán)疏雄醇、Rnepitiostane和睪內(nèi)酪；抗腎上腺抗體(anti-adrenals),例如氨格魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑，例如亞葉酸(frolinicacid);醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苦；氨基乙酰丙酸；安吖啶；Bestrabucil;比生群、依達曲沙、地磷酰胺、秋水仙胺、地吖醌、依氟鳥氨酸(Elfomithine);依利醋銨、依托格魯、硝酸鎵、鞋基脲、磨茹多糖、氯尼達明；米托胍腙；米托蒽醌、莫哌達醇；二胺硝吖啶；噴司他?。坏鞍钡R；吡柔比星；足葉草酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；PSK;雷佐生；Sizofiran;鍺螺胺；細才各孢氮雜酸；三亞胺醌；三氯乙胺；烏拉坦；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；派泊溴烷；Gacytosine;阿糖胞苷("Ara-C");環(huán)磷酰胺；塞替派；紫杉醇，例如紫杉醇(TAXOL,Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ)和多西紫杉醇(Doxetaxel)(TAXOTERE,Rhone-PoulencRorer，Antony,France);苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-碌u鳥嘌呤；巰噪呤；甲氨蝶呤；鉑類似物例如順鉑和卡鉑；長春堿；鉑、依托泊苷(VP-16);異磷酰胺；絲裂霉素C;米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；諾維本；能滅瘤；替尼泊苷；柔紅霉素；氨喋呤；希羅達；伊班膦酸鹽；CPT-11;拓樸異構(gòu)抑制劑酶RFS2000;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);維A酸；Esperamicins;卡培他濱；以及上述任意藥物的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。還包括用于調(diào)節(jié)或抑制腫瘤上激素作用效果的抗激素劑，例如抗雌激素類，其包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制劑4(5)-咪唑、4羥泰米芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬鹽酸鹽(Keoxifene)、奧那司酮和托瑞米芬(法樂通)；以及抗雄激素類，例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任意藥物的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。有用的藥物還包括細胞因子。這樣的細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。所述細胞因子中包括生長激素，例如人生長激素、N-曱硫氨酰基人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺素；曱狀腺素；胰島素；前胰島素；松弛素；前松弛素(prorelaxin);糖蛋白激素，例如促卵胞激素(FSH)、促曱狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH);肝生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-a和-P;苗勒氏抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活蛋白；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長因子，例如NGF-(3;血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF),例如TGF-a和TGF-(3;胰島素樣生長因子I和II;紅細胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子；干擾素，例如干擾素a、P和y;集落刺激因子(CSF)，例如巨噬細胞-CSF(M-CSF);粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF);和粒細胞-CSF(GCSF);白細胞介素(IL)，例如IL-1、IL-la、IL-2、IL-3、IL畫4、IL-5、IL畫6、IL-7、IL畫8、IL畫9、IL畫ll、IL畫12、IL-15;腫瘤壞死因子，例如TNF-ot或TNF-P;以及其他多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。如在此文中所使用的，術(shù)語細胞因子包括來源于自然資源或來源于重組細胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列細胞因子的生物活性等價物。所述藥物可以是前體藥物，之后由將類似肽基化療劑的前體藥物轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥物的前體藥物激活酶來激活。參見例如WO88/07378;WO81/01145;美國專利第4,975,278號。通常，酶成分包括任何能夠以這種方式作用于前體藥物從而將其轉(zhuǎn)化成更有活性、更有細胞毒性形式的酶。為本發(fā)明的目的，如果完整的死亡細菌細胞含有編碼藥物的核酸，那么其就含有藥物。例如，質(zhì)?？删幋a在哺乳動物靶細胞中表達的藥物。這就使藥物的內(nèi)源遞送成為可能，其比外源遞送的短暫性(transientnature)有優(yōu)勢。功能性核酸"功能性核酸"是指一種核酸分子，在引入宿主細胞后，其特異性地干擾蛋白質(zhì)的表達。通常，功能性核酸分子能夠通過直接與編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄體相互作用而減少蛋白質(zhì)的表達。功能性核酸的例子有調(diào)節(jié)性RNA,例如siRNA、shRNA、短RNA(通常長度短于400個堿基)、微RNA(miRNAs)、核酶和i秀辨RNA,以及反義核酸。"調(diào)節(jié)性RNA"表示包括通過RNA干擾、抑制基因表達或其他機制來影響表達的RNA的類型。因此，除shRNA、siRNA、miRNA和反義ssRNA之夕卜，調(diào)節(jié)性RNA的類型還包括核酶和誘斜RNA。功能性核酸的靶標本發(fā)明的功能性核酸優(yōu)選靶定促成抗藥性、抑制凋亡、或促成瘤表型(neoplasticphenotype)的基因或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄體。雖然在本領(lǐng)域中已在這些文章中成功應(yīng)用了功能性核酸策略，但是不具有死亡細菌細胞載體的優(yōu)點。參見，例如，Sioud(2004),Caplen(2003),Wu等(2003),Nieth等人(2003)，Caplen和Mousses(2003)，Duxbury等(2004),Yague等(2004),Duan等(2004)。具有抗藥性的蛋白質(zhì)是功能性核酸的優(yōu)選的靶標。這種蛋白質(zhì)可能有助于獲得性抗藥性或固有抗藥性。當患病細胞，例如腫瘤細胞，開始對藥物有反應(yīng)但對后續(xù)的治療周期變得難以治療時，就獲得了抗藥表型。與獲得性抗藥性有關(guān)的有用靶標包括ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體，例如P-糖蛋白(P-gp、P-170、PGY1、MDR1、ABCB1、MDR相關(guān)蛋白、多藥抗藥性蛋白l)、MDR-2和MDR-3。與獲得性抗藥性有關(guān)的另外的靶標有MRP2(多藥抗藥性相關(guān)蛋白)、BCR-ABL(斷裂點簇集區(qū)-ABL原癌基因)、STI-571抗藥性相關(guān)蛋白、肺抗藥性相關(guān)蛋白、環(huán)氧化酶-2、核因子k、XRCC1(X線修復(fù)交叉互補基因l)、ERCC1(切除修復(fù)交叉互補基因)、GSTP1(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)、突變|3-微管蛋白、以及生長因子，例如IL-6。如果之前未被處理的細胞未能對一種或多種藥物起反應(yīng)時，那么抗藥表型是固有的。具有固有抗藥性的蛋白質(zhì)的例子是LRP(肺抗藥性相關(guān)蛋白)。具有抗藥性的特別有用的靶標包括ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體，例如P-糖蛋白、MDR-2、MDR畫3、BCRP、APTlla和LRP。有用的耙標還包括具有凋亡抗性的蛋白質(zhì)。其包括Bcl-2(B細胞白血病/淋巴瘤)、BC1-XL、Al/Bfl1、成簇黏附激酶、二氫二醇脫氫酶和p53突變蛋白。有用的靶標還包括致癌性和突變性腫瘤抑制蛋白。例子包括P-聯(lián)蛋白、PKC誦a(蛋白激酶C)、C-RAF、K國Ras(V12)、DP97死盒(Deadbox)RNA解旋酶、DNMT1(DNA曱基轉(zhuǎn)移酶1)、FLIP(Flice樣抑制蛋白)、C-Sfc、53BPI、多梳族蛋白EZH2(zeste基因增強子同系物)、ErbBl、HPV-16E5和E7(人乳頭狀瘤病毒early5和early7)、Fortilin&MCI1P(髓樣細胞白血病l蛋白)、DlP13a(DDC相互作用蛋白13a),MBD2(曱基CpG結(jié)合域)、p21、KLF4(Kruppel樣因子4)、tpt/TCTP(翻譯控制肺瘤蛋白)、SPK1&SPK2(鞘氨醇激酶)、P300、PLK1(Polo樣激酶l)、Trp53、Ras、ErbBl、VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)、BAG-I(BCL2關(guān)聯(lián)抗死亡基因1)、MRP2、BCR-ABL、STI-571抗藥性相關(guān)蛋白)、肺抗藥性相關(guān)蛋白、環(huán)氧化酶-2、核因子k、XRCC1、ERCC1、GSTP1、突變p-微管蛋白和生長因子。關(guān)于HIV感染，靶標包括HIV-Tat、HIV-Rev、HIV-Vif、HIV-Nef、HIV-Gag、HIV-Env、LTR、CD4、CXCR4(趨化因子受體)和CCR5(趨化因子受體)。由于腫瘤細胞的異質(zhì)性，許多不同的抗藥性或凋亡抗性途徑可在靶細胞中進行。因此，用于本發(fā)明方法中的功能性核酸可能需要隨時間而改變。例如，如果活組織檢查樣品顯示出導(dǎo)致獲得性抗藥性的新突變，則可以設(shè)計特異性的siRNA并編碼在適當?shù)谋磉_質(zhì)粒上，所述表達質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化進入死亡細菌細胞制造菌抹，該菌抹被用來制造重組的死亡細菌細胞，其被施用以克服獲得性抗藥性。siRNA分子短干擾RNA(siRNA)分子可用于進行RNA干擾(RNAi)(—種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制)。根據(jù)本發(fā)明，siRNA是指長度為約10至約30個核苷酸的雙鏈RNA分子或單鏈發(fā)夾RNA分子，它們以其特異性地干擾蛋白質(zhì)表達的能力而得名。優(yōu)選地，雙鏈siRNA分子為12-28個核苷酸長度、更優(yōu)選為15-25個核苦酸長度，還更優(yōu)選為19-23個核苷酸長度，最優(yōu)選為21-23個核苷酸長度。因此，優(yōu)選的siRNA分子的長度為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29個核苦酸。單個鏈的長度顯示了雙鏈siRNA分子的長度。例如，被描述為21個核糖核苦酸長度(21-mer)的雙鏈siRNA可包含2個RNA相對鏈，它們退火在一起的有19個連續(xù)的堿基對。每條鏈上剩余的2個核苷酸會形成"突出物"。當siRNA含有不同長度的兩條鏈時，較長的鏈顯示了siRNA的長度。例如，包含一條21個核苷酸長度的鏈和另一條20個核苷酸長度的鏈的dsRNA,是21-mer。包含突出物的雙鏈siRNA是合乎需要的。突出物可位于鏈的5'或3'端。優(yōu)29選地，其位于RNA鏈的3'端。突出物的長度可變化，但是優(yōu)選為約1至5個堿基長，更優(yōu)選為約2個核苷酸長。優(yōu)選地，本發(fā)明的siRNA將包含約2至4個堿基的3'突出物。更優(yōu)選地，3'突出物為2個核糖核苷酸長度。更優(yōu)選地，組成3'突出物的2個核糖核苷酸為尿嘧啶(U)。本發(fā)明的siRNA被設(shè)計為與靶核糖核苷酸序列相互作用，意指著它們充分地與靶序列互補從而與靶序列雜交。在一種實施方式中，本發(fā)明提供的siRNA包含與靶核糖核苷酸序列或耙核糖核苷酸序列互補體至少70%、75%、80%、85%或90%相同的核糖核苷酉吏序列。優(yōu)選地，siRNA分子與耙核苷,列或革巴核苷酸序列互補體至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。最優(yōu)選地，siRNA與靶核苷酸序列或靶核苷酸序列互補體100。/。相同。但是，相對靶標具有插入、缺失或單點突變的siRNA分子也是有效的。輔助siRNA設(shè)計的工具對公眾來說易于獲得。例如，基于計算機的siRNAi殳i十工具可在互聯(lián)網(wǎng)www.dharmacon.com上才尋到。相關(guān)地，shRNA包括形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA單鏈，其中莖由互補鏈和包含雙鏈siRNA的反義鏈組成，而環(huán)是具有變化的尺寸的接頭。shRNA的莖結(jié)構(gòu)通常為約10個至約30個核苷酸長。優(yōu)選地，shRNA分子的莖為12-28個核苷酸長，更優(yōu)選為19-23個核苷酸長，最優(yōu)選為21-23個核苷酸長。因此，優(yōu)選的shRNA分子包含長度為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29個核苷酸的莖。核酶核酶是具有酶活性的RNA分子，其可以核苷酸堿基序列特異性的方式重復(fù)切割其它RNA分子。這種酶RNA分子事實上可靶定至任何RNA轉(zhuǎn)錄體，且可在體外實現(xiàn)有效的切割。目前已知有6種基本的天然酶RNA的變體。每種都能在生理條件下催化反式RNA磷酸二酯鍵的水解(因此能切割其它RNA分子)。通常，酶多核苷酸首先結(jié)合至扭RNA。這樣的結(jié)合發(fā)生在整個酶多核苷酸的靶標結(jié)合部，所述酶多核苷酸靠近切割靶RNA的分子的酶部分。因此，酶多核苷酸首先識別然后通過互補的堿基配對結(jié)合輩巴RNA,并且一旦結(jié)合至正確的位點，即酶活切割把RNA。這種耙RNA的策略性切割將毀壞其被編碼蛋白質(zhì)的直接合成能力。在酶多核苷酸酶結(jié)合并切割其耙RNA后，其^皮/人該RNA上釋放，以尋找另一個靶標并且能重復(fù)地結(jié)合并切割新耙標。核酶的酶活性是有利的。因為單個核酶分子能夠切割許多耙RNA分子，核酶的有效濃度可以很低。有用的核酶可包含幾個模體，包括錘頭狀(Rossi等(1992))、發(fā)夾狀(Hampel和Tritz,(1989),Hampel等(1990))、丁型肝炎病毒沖莫體(Perrotta和Been(l"2))、I型內(nèi)含子(美國專利第4,987，071號)、與RNA引導(dǎo)序列關(guān)聯(lián)的RNasePRNA(Guerrier-Takada等(1983)),以及脈孢菌VSRNA(Saville&Collins(1990);Saville&Collins(1991);Collins&Olive(1993))。并不限于這些特異性才莫體，因為所有在本發(fā)明的核酶中是重要的的才莫體，都有與一個或多個耙RNA區(qū)域互補的特異性底物結(jié)合位點，并且該模體具有在底物結(jié)合位點內(nèi)部或周圍的核苦酸序列，其賦予核酶分子RNA切割活性。本發(fā)明的核酶可包含被修飾的寡核苷酸(例如，為改善穩(wěn)定性、靶向性等而修飾)。編碼核酶的核酸序列可受強組成型啟動子控制，例如，RNA聚合酶n或RNA聚合酶m啟動子，使得受轉(zhuǎn)染的細胞將產(chǎn)生足夠量的核酶以破壞靶向內(nèi)源性信息并抑制翻i奪。反義寡核苷酸本發(fā)明的反義寡核苷酸與編碼蛋白質(zhì)的核酸特異性地雜交，并干擾蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄或翻譯。在一種實施方式中，反義寡核苷酸靶定DNA并干擾其復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄。在另一實施方式中，反義寡核苷酸與RNA(包括mRNA前體和mRNA)特異性地雜交。這種反義寡核苷酸可影響，例如，RNA轉(zhuǎn)運至蛋白質(zhì)翻譯位點、由RNA翻譯成蛋白質(zhì)、RNA剪切產(chǎn)生一個或多個mRNA種類，以及可能由RNA參加或促進的催化活性。這種干擾的總體效果是調(diào)節(jié)、降低或抑制靶蛋白的表達。"寡核苷酸"是指包含例如約10個核苷酸(nt)至約1000個nt的多核苷酸。用于本發(fā)明的寡核苷酸優(yōu)選為約10個nt至約150個nt。寡核苷酸可以是天然的寡核苷酸或合成的寡核苷酸。寡核苷酸可被修飾。"被修飾的寡核苷酸"和"被修飾的多核苷酸"是指具有一個或多個在所有或任何堿基、糖部分、核苦酸間磷酸4定合的天然分子結(jié)構(gòu)的分子水平的化學(xué)修飾的寡核香酸或多核苷酸，也指在這些位點上具有附加的取代基或多種修飾的組合的分子。核苷酸間磷酸鍵合可以是磷酸二酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧曱基醚、乙酰胺、氨基曱酸鹽、硫醚、橋聯(lián)氨基磷酸酯、橋聯(lián)亞曱基磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、二硫代磷酸酯、橋聯(lián)硫代磷酸酯或砜核苷酸間鍵合，或3'-3'、5'-3'或5'-5'鍵合，以及這些相似鍵合的組合。磷酸二酯鍵可被替代的鍵合代替，如硫代磷酸酯、曱氨基、曱基磷酸酯、氨基磷酸酯和胍類，且多核苷酸的核糖亞基也可被取代(例如，己糖磷酸二酯和肽核酸)?！穭?wù)飾可位于寡核苷酸分子的內(nèi)部(單一或重復(fù))或末端，且可包括添加至核苷酸間磷酸4建合分子結(jié)構(gòu)的例如脫氧核糖和磷酸修飾，所述脫氧核糖和磷酸修飾粘附或交聯(lián)至相對的鏈或相關(guān)酶或其它蛋白質(zhì)。術(shù)語"被修飾的寡核苷酸"和"被修飾的多核苷酸"還包括含有對糖部分的修飾(例如，3'-取代的核糖核香酸或脫氧核糖核苦酸單體)的寡核苷酸或多核苦酸，任何一個均通過5'向3'鍵合而結(jié)合在一起?；騼?nèi)有幾個位點可被用于設(shè)計反義寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸可結(jié)合開放閱讀框的包含翻譯起始密碼子(也稱作開始密碼子)的區(qū)域。在這點上，"起始密碼子，，和"翻譯起始密碼子"通常指下述mRNA或基因的一部分，所述mRNA或基因包含從翻譯起始密碼子開始在任意方向上(即，5'或3')的至少約25個到至少約50個連續(xù)的核苷酸。另一個發(fā)生反義相互作用(antisenseinteraction)的位點是開方文閱讀框的終止密碼子。術(shù)語"終止密碼子區(qū)"和"翻i奪終止密碼子區(qū)，，通常指下述mRNA或基因的一部分，所述mRNA或基因包含從翻譯終止密碼子開始在任意方向上的至少約25個到至少約50個連續(xù)的核苷酸。開放閱讀框或編碼區(qū)也可被有效耙定。開放閱讀框通常被認為是指在翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區(qū)域。另一個靶區(qū)域是5'非翻譯區(qū)域，它是mRNA從翻譯起始密碼子開始5'方向上的一部分。它包括mRNA的5'加帽位點和翻譯起始密碼子之間的核香酸，或基因上相應(yīng)的核苷酸。相似地，3'非翻譯區(qū)可被用作反義寡核苷酸的靶標。3'非翻譯區(qū)是mRNA從翻譯終止密碼子開始3'方向上的一部分，因此包括mRNA的翻譯終止密碼子與3'末端之間的核香酸，或基因上相應(yīng)的核苷酸。反義寡核苷酸還可耙定mRNA的5'加帽區(qū)。5'帽包括通過5'-5'三磷酸鍵連接至mRNA的5'-最末端(5'-most)殘基的N7-曱基化的鳥核苷殘基。5'加帽區(qū)被認為包括5'帽結(jié)構(gòu)本身以及與帽相鄰的前50個核苷酸。盡管某些真核mRNA的轉(zhuǎn)錄體是被直接翻譯的，但許多mRNA含有一個或多個內(nèi)含子區(qū)域，其在轉(zhuǎn)錄體被翻譯前被從其中剪切掉。剩下的(因此是被翻譯的)外顯子區(qū)域被剪接在一起以形成連續(xù)的mRNA序列。mRNA剪接位點，即，內(nèi)含子-外顯子結(jié)合部代表了可能的靶區(qū)域，并且在異常剪接涉及疾病時或者特定mRNA剪接產(chǎn)物的過量生成涉及疾病時尤為有用。此外，由于重排或缺失產(chǎn)生的異常融合結(jié)合部也可能是反義寡核苷酸的靶標。記住了這些不同的耙位點，必須選擇與靶多核苷酸充分互補的反義寡核苷酸。"互補"指兩個分子的相互作用表面的拓樸學(xué)相容性或者彼此匹配。必須具有足夠程度的互補性或精確的配對，使得寡核苷酸和多核苷酸靶標之間具有穩(wěn)定的和特異性的結(jié)合。重要的是，反義寡核苷酸的序列不必與其可特異性雜交的靶多核苷酸的序列100%互補。當反義寡核苷酸與靶多核苷酸的結(jié)合干擾靶多核苷酸的正常功能而導(dǎo)致喪失實用性時，反義寡核苷酸是可特異性雜交的，并且在需要特異性結(jié)合的情況下(即，如果是體內(nèi)分析或治療性處理則是在生理條件下，而如果是體外分析則是在分析所進行的條件下)有足夠程度的互補性來避免反義寡核苷酸與非輩巴序列的非特異性結(jié)合。反義寡核苷酸的長度可為至少約8個nt到至少約50個nt。在一個實施方式中，反義寡核苷酸的長度可為約12至約30個nt。根據(jù)本發(fā)明使用的反義寡核苷酸可通過固相合成這一眾所周知的技術(shù)方便且按常規(guī)地制備。多個商家出售用于該合成的設(shè)備，包括例如，AppliedBiosystems(FosterCity,CA)?？深~外地或選擇性地使用任何其他本領(lǐng)域已知的用于該合成的裝置。使用類似技術(shù)制備寡核苷酸(例如硫代磷酸酯和烷基化的衍生物)是熟知的。編碼功能性核酸的核酸為本發(fā)明的目的，如果完整的死亡細菌細胞含有編碼功能性核酸的核酸，那么該細胞就含有功能性核酸。例如，質(zhì)?？删幋a在哺乳動物靶細胞內(nèi)表達的功能性核酸。這使得功能性核酸的內(nèi)源遞送成為可能，其比外源遞送的短暫性有優(yōu)勢。因此，重組的完整死亡細菌細胞可攜帶編碼一個或多個siRNA序列的質(zhì)粒DNA,所述siRNA序列用來使抗藥性基因或凋亡抗性基因沉默。通過使用編碼多功能核酸的死亡細菌細胞，有可能治療表現(xiàn)出多重抗藥性機制的細胞。不同的siRNAyf列可從不同的啟動子分別表達。例如，靶定PgpmRNA的siRNA可從U6啟動子表達，靶定Bcl-2mRNA的siRNA可從Hl啟動子表達。這些多個表達盒優(yōu)選被攜帶在單個質(zhì)粒上，但也可被攜帶在不同的質(zhì)粒上。當重組質(zhì)粒攜帶含多個siRNA-編碼序列(通過非編碼多核苷酸序列連接在一起)的表達盒時，不同的siRNA序列也可從單個的啟動子表達。單個基因轉(zhuǎn)錄終止子可位于完整的表達盒的下游。在一種策略中，質(zhì)粒編碼作為兩個獨立轉(zhuǎn)錄體的siRNA的正義鏈和反義鏈，在耙細胞中表達后，兩個獨立轉(zhuǎn)錄體雜交形成功能性siRNA雙鏈體。在另一個優(yōu)選的策略中，質(zhì)粒編碼一個或多個siRNA，每個都作為單個的形成短發(fā)卡RNA莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄體被表達。發(fā)卡結(jié)構(gòu)可由Dicer酶加工成功能性siRNA。藥學(xué)上可接受的載體"藥學(xué)上可接受的，，是指生理相容性。藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑不會消除被施用的組合物的生物活性，它是化學(xué)惰性的且對被給藥的生物體沒有毒性。內(nèi)毒素"內(nèi)毒素"是指游離脂多糖(LPS)。因此，"不含內(nèi)毒素"的組合物缺乏與細菌細胞膜無關(guān)的LPS。"本質(zhì)上不含內(nèi)毒素"的組合物缺乏足夠量或足夠濃度的LPS來在哺乳動物(例如人類)體內(nèi)產(chǎn)生毒性。與細菌細胞膜無關(guān)的內(nèi)毒素/LPS也被稱作"游離內(nèi)毒素"。通過使用0.2pm的過濾器來過濾，可將內(nèi)毒素從組合物中除去。游離內(nèi)毒素和內(nèi)毒素膠粒小于0.2pm,因此容易從組合物中濾出，組合物保留住死亡細菌細胞(其大于0.2pm)。另外，抗脂質(zhì)A單克隆抗體可被用來結(jié)合至游離內(nèi)毒素?？怪|(zhì)A單克隆抗體可通過其Fc成分而結(jié)合至固體載體(例如親合色譜柱或磁珠)，讓結(jié)合有脂質(zhì)A的Fab片段未被占用，以結(jié)合至游離的LPS。雙特異性配體本發(fā)明的組合物也可以包含一個或多個雙特異性配體。對本發(fā)明有用的配體包括任何結(jié)合至耙細胞上的表面成分和死亡細菌細胞上的表面成分的試劑。優(yōu)選地，靶細胞上的表面成分是受體，特別是能夠介導(dǎo)內(nèi)吞作用的受體。該配體可包含多肽和/或碳水化合物成分。抗體是優(yōu)選的配體。例如，攜帶對由細菌衍生的完整死亡細菌細胞上的表面成分和靶標哺乳動物細胞上的表面成分具有雙重特異性的雙特異性抗體，可被有效地用來將死亡細菌細胞靶定至體外和體內(nèi)的靶標哺乳動物細胞。有用的配體的類別還包括受體、酶、結(jié)合肽、融合/嵌合蛋白和小分子。具體配體的選擇基于兩個主要的標準(i)特異性地結(jié)合至完整的死亡細菌細胞表面上的一個或多個區(qū)域，和(ii)特異性地結(jié)合至靶細胞表面上的一個或多個區(qū)域。因此，配體優(yōu)選具有攜帶對由細菌衍生的完整死亡細菌細胞表面結(jié)構(gòu)具有特異性的第一個臂和攜帶對哺乳動物細胞表面結(jié)構(gòu)具有特異性的第二個臂。第一個臂和第二個臂都可以是多價的。優(yōu)選地，即使是多價的，每個臂也是單特異性的。對于結(jié)合至由細菌衍生的死亡細菌細胞，理想的是，配體的其中一個臂對在母體細菌細胞上發(fā)現(xiàn)的脂多糖的O-多糖成分具有特異性。其它可被用于配體結(jié)合的死亡細菌細胞表面結(jié)構(gòu)包括細胞表面暴露的多肽和外膜上的碳水化合物，例如菌毛(pilli)、傘毛、外膜蛋白和暴露于鞭毛細胞表面的肽片段。對于結(jié)合至耙細胞，配體的其中一個臂對哺乳動物細胞的表面成分具有特異性。這樣的成分包括細胞表面蛋白、肽和碳水化合物，不論是特征化的或未被特征化的。細胞表面受體，特別是能夠激活受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的受體，是用于靶定的理想的細胞表面成分。如果在靶細胞表面過量表達，對于要被治療的細胞的靶定，這樣的受體會賦予額外的選擇性，從而減少遞送至非靶細胞的可能性。例如，通過選擇特異性結(jié)合在想要細胞上的細胞表面受體模體(motif)的配體，可以靶定腫瘤細胞、轉(zhuǎn)移細胞、脈管系統(tǒng)細胞(例如上皮細胞和平滑肌細胞)、肺細胞、腎細胞、血細胞、骨髓細胞、腦細胞、肝細胞等等，或任何被選細胞的前體。細胞表面受體的例子包括癌胚抗原(CEA),其在大多數(shù)的結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和胃腸道癌中過量表達(Marshall,2003);調(diào)蛋白受體(HER-2、wew或c-^Z^-2),其常常在乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌和子宮頸癌中過量表達(Hung等,2000);表皮生長因子受體(EGFR)，其在許多實體瘤中高度表達，包括乳腺癌、頭頸癌、非小細胞肺癌和前列腺癌(Salomon等，1995);唾液酸糖蛋白受體(Stockert，1995);轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Singh,1999);絲氨酸蛋白酶抑制劑酶復(fù)合體受體，其在肝細胞中表達(Ziady等，1997);纖維母細胞生長因子受體(FGFR)，其在胰腺癌細胞中過量表達(Kleeff等，2002);血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)，用于血管生成抑制基因治療(Becker等,2002和Hoshida等，2002);葉酸鹽受體，其在90°/。的非粘液卵巢癌中選擇性地過量表達(Gosselin和Lee，2002);細胞表面多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物(Batra等，1994》碳水化合物受體(Thurnher等,1994);和聚免疫球蛋白受體，其可用于將基因遞送至呼吸上皮細胞，且對于肺病(例如嚢性纖維性變病)的治療具有吸引力(Kaetzel等,1997)。優(yōu)選的配體包含抗體和/或抗體衍生物。此處所用"抗體"包括由在體內(nèi)或體外發(fā)生的免疫源應(yīng)答而獲得的免疫球蛋白分子。術(shù)語"抗體"包括多克隆的、單特異性的和單克隆的抗體，以及抗體衍生物，如單鏈抗體片斷(scFv)。用于本發(fā)明中的抗體和抗體書f生物也可通過DNA重組技術(shù)而獲得。野生型抗體有四個多肽鏈，兩個相同的重鏈和兩個相同的輕鏈。兩種類型的多肽鏈有恒定區(qū)和可變區(qū)，恒定區(qū)在同種類的抗體中不變化或極少變化?？勺儏^(qū)對于特定的抗體是唯一的，且包括一個識別特異性表位的抗原結(jié)合區(qū)。與抗體結(jié)合最直接相關(guān)的抗原結(jié)合區(qū)的區(qū)域即是"互補性決定區(qū)域"(CDR)。術(shù)語"抗體"也包括抗體衍生物，例如保留了特異性結(jié)合至抗原的能力的抗體片斷。這樣的抗體片斷包括Fab片斷(含有抗原結(jié)合區(qū)并包括由二硫4建橋接的輕鏈和部分重鏈的片段)、Fab，(含有單個抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段，其包括Fab和穿過鉸鏈區(qū)的重鏈的另外的部分)、F(ab')2(由重鏈鉸鏈區(qū)的鏈間二硫鍵連接的兩個Fab，分子)、雙特異性Fab(具有兩個抗原結(jié)合36區(qū)的Fab分子，每個抗原結(jié)合區(qū)可指向不同的表位)和scFv(由氨基酸鏈連接在一起的、抗體的單個輕鏈和重鏈的可變抗原結(jié)合決定區(qū))。當抗體(包括抗體片段)構(gòu)成部分或全部配體時，抗體優(yōu)選是人源性的或被修飾以適合用于人類。所謂的"人源化抗體"在本領(lǐng)域是已知的。參見，例如Osbourn等,2003。通過遺傳操作和/或體外處理來修飾抗體以減少它們在人體內(nèi)的抗原性。例如，用于人源化抗體的方法已在，例如，美國專利第6，639,055號、美國專利第5，585,089號和美國專利第5,530，101號中描述。在最簡單的情況下，人源化抗體通過將來自小鼠mAb的被稱為互補性決定區(qū)域(CDR)的抗原結(jié)合環(huán)移植進入人IgG而形成。參見Jones等,1986;Riechmann等,1988;和Verhoeyen等,1988。然而，高親和力人源化抗體的產(chǎn)生通常需要從小鼠親代mAb的所謂的構(gòu)架區(qū)(FR)轉(zhuǎn)移一個或多個額外的殘基。也已開發(fā)出幾個人源化技術(shù)的變體。參見Vaughan等,1998。在本發(fā)明中也可使用人抗體(而不是"人源化抗體")。它們對其各自的抗原具有很高的親和力，且可從非常大的、單鏈可變片段(scFvs)或Fab噬菌體展示庫中按常規(guī)獲得。參見Griffiths等,1994;Vaughan等,1996;Sheets等，1998;deHaard等,1999;和Knappik等,2000。有用的配體還包括雙特異性單鏈抗體，該抗體通常是重組多肽，該重組體多肽由可變輕鏈部分(通過連接分子共價地連接至相應(yīng)的可變重鏈部分)組成。參見美國專利第5,455,030號、第5，260,203號和第4，496,778號。雙特異性抗體也可通過其他方法制備。例如，化學(xué)復(fù)共軛對配合物可通過以化學(xué)方法結(jié)合具有不同特異性的完整抗體或抗體片段而制得。參見Karpovsky等,1984。但是，這種復(fù)共軛對配合物難于以可繁殖的方式制得，并且至少是正常單克隆抗體的兩倍大。雙特異性抗體也可通過二硫化物交換而制得，其包括酶裂解和抗體片段的重新組合。參見Glennie等，1987。因為Fab和scFv片段是單價的，因此它們通常對靶結(jié)構(gòu)具有低親和力。因此，由這些成分制得的優(yōu)選的配體被改造成二聚的、三聚的或四聚的共軛物以增強功能性親和力。參見Tomlinson和Holliger，2000;Carter，2001、Hudson和Souriau,2001;和Todorovska等，2001。這種共扼結(jié)構(gòu)可通過化學(xué)交聯(lián)和/或遺傳交4關(guān)而制備。本發(fā)明的雙特異性配體優(yōu)選在每一端都是單特異性的，即，在一端對死亡細菌細胞上的單個成分具有特異性，而在另一端對靶細胞上的單個成分具有特異性。配體在一端或兩端可以是多價的，例如，以所謂的雙抗體、三鏈抗體和四鏈抗體形式存在。參見Hudson和Souriau,2003。雙抗體是通過兩個scFv的非共價連接而形成的二價二聚體，其具有兩個Fv結(jié)合位點。同樣地，三鏈抗體通過形成三個scFv的三價三聚物而得到，其具有三個結(jié)合位點，而四鏈抗體通過形成四個scFv的四Y介四聚物而得到，其具有四個結(jié)合位點。對哺乳動物細胞上的受體具有特異性的幾個人源化的、人的以及小鼠的單克隆抗體和抗體片段已被批準用于人類的醫(yī)療用途，并且數(shù)量快速增多。參見Hudson和Souriau,2003。例如，這種可^皮用來形成對HER2具有特異性的雙特異性配體的一個臂的抗體的例子是赫賽汀，；曲妥珠單抗?？贵w可變區(qū)也可被融合至許多蛋白質(zhì)域。融合至人免疫球蛋白域，例如IgGlCH3既增加了質(zhì)量又促進了二聚化。參見Hu等，1996。融合至人Ig鉸合部-Fc區(qū)可增加效應(yīng)子功能。同樣，融合至來自多聚體蛋白的異源蛋白域促進了多聚化。例如，將短scFv融合至短的兩親性螺旋已被用于制備微型抗體。參見Pack和Pluckthun,1992。來自形成異源二聚體(例如fos/jun)的蛋白質(zhì)的域，可被用于制備雙特異性分子(Kostelny等,1992),或者，同源二聚化區(qū)域可通過工程化策略，如"凹凸配合(knobsintoholes)"(Ridgway等，1996)，而被改造形成異源二聚體。最后，可選擇使用融合蛋白伴侶(partner)，其提供多聚化作用和額外的功能，例如鏈霉抗生物素蛋白。參見Dubel等,1995。額外的組合物在一個實施方式中，所述組合物包含含有功能性核酸分子和藥物的死亡細菌細胞。功能性核酸分子可以是靶定有助于抗藥性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄體的核酸分子。優(yōu)選地，功能性核酸分子靶定有助于抗組合物中同樣藥物的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄體。藥物可被包含在死亡細菌細胞中，甚至是與包含有功能性核酸分子相同的死亡細菌細胞中，^旦并不必須這樣凈皮包含。遞送至有吞噬或內(nèi)吞能力的細胞的方法在另一方面，本發(fā)明提供遞送方法，其通過將由細菌^"生的死亡細菌細胞與有吞噬或內(nèi)吞能力的哺乳動物細胞接觸。這樣的能夠以胞內(nèi)細菌性病原體的方式吞噬親本細菌細胞的哺乳動物細胞同樣吞噬死亡細菌細胞，該死亡細菌細胞將它們的負載物釋放至哺乳動物細胞的細胞質(zhì)。不需要使用靶向配體即可實現(xiàn)這種遞送方法。在死亡細菌細胞被給定類型的細胞吞噬的過程中可能涉及許多種機制，而本發(fā)明在這點上并不依賴于任何特定機制。例如，吞噬作用是一個被眾多文件記載的過程，在該過程中巨嗟細胞和其它吞噬細胞(例如中性白細胞)通過在顆粒表面伸展偽足直到該顆粒被完全包裹的方式攝取該顆粒。雖然被描述為"非特異性，，吞噬作用，但在該過程中已證實涉及特異性受體。參見Wright&Jong(1986);Speert等(1988)。因此，一種形式的吞噬作用涉及表面配體與位于偽足膜上的配體受體之間的相互作用(Shaw和Griffin,1981)。這種由特異性受體介導(dǎo)的附著步驟^皮認為依賴于細菌表面粘附素。對于較不劇毒的細菌，例如非腸毒性E.coli,在缺乏噬菌細胞受體的表面配體的情況下也可發(fā)生吞噬作用。參見例如Pikaar等(1995)。因此，本發(fā)明包括但不限于利用具有或缺乏表面粘附素的死亡細菌細胞，是否具有粘附素要與它們的親本細菌細胞的性質(zhì)一致，并且該死亡細菌細胞被噬菌細胞(即"有吞噬能力的"宿主細胞)吞噬，其中中性粒細胞和巨噬細胞是哺乳動物中的主要類型。另一個吞噬過程是內(nèi)吞作用，細胞內(nèi)病原體，例如沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、螺桿菌屬、假單胞菌屬和乳桿菌屬，通過這種方式進入哺乳動物上皮細胞中并在那里復(fù)制。在這點上的兩個基本機制是網(wǎng)格蛋白依賴型的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，也稱為"有被小窩內(nèi)吞作用，，(Riezman,1993),以及網(wǎng)格蛋白非依賴型的內(nèi)吞作用(Sandvig&Deurs,1994)。當有吞噬能力的細胞通過內(nèi)吞作用(即，"有內(nèi)吞能力"的宿主細胞)吞噬根據(jù)本發(fā)明的死亡細菌細胞時可能涉及其中一個機制或兩個機制。代表性的有內(nèi)吞能力的細胞有乳腺上皮細胞、胃腸道中的腸上皮細胞、胃上皮細胞、肺上皮細胞以及泌尿道和膀胱上皮細胞。當不使用靶向配體而實現(xiàn)向有吞噬能力的哺乳動物細胞的遞送時，預(yù)期的本申請的性質(zhì)將影響所使用的死亡細菌細胞的細菌來源的選擇。例如，沙門氏菌種、埃希氏菌種和志賀氏菌種攜帶粘附素(可被胃腸道中腸上皮細胞上內(nèi)吞作用介導(dǎo)的受體識別)，且可能適合于遞送對結(jié)腸癌細胞有效的藥物。類似地，由幽門螺桿菌衍生的、攜帶對胃上皮細胞有特異性的粘附素的死亡細菌細胞，可適合于針對胃癌細胞的遞送。對于由假單胞菌種衍生的、攜帶由肺上皮細胞上的受體識別的粘附素的死亡細菌細胞，吸入法或吹入法可能是理想的給藥方法。由乳桿菌衍生的、攜帶對泌尿道和膀胱上皮細胞具有特異性的粘附素的死亡細菌細胞，可非常適合于將藥物尿道內(nèi)遞送至泌尿道癌或膀胱癌。在一個實施方式中，遞送方法是治療性核酸遞送方法，該方法包括將包含含有核酸序列的質(zhì)粒的死亡細菌細胞與具有吞噬或內(nèi)吞能力的哺乳動物細胞接觸，使得死亡細菌細胞被哺乳動物細胞吞噬。質(zhì)粒優(yōu)選編碼治療性表達產(chǎn)物。在死亡細菌細胞與哺乳動物細胞接觸后，哺乳動物細胞產(chǎn)生治療性核酸序列的表達產(chǎn)物。治療性核酸遞送方法可在體外或體內(nèi)進行。在另一個實施方式中，遞送方法是藥物遞送方法，該方法包括將含有藥物的死亡細菌細胞與具有吞噬或內(nèi)吞能力的哺乳動物細胞接觸，使得死亡細菌細胞被哺乳動物細胞吞噬。藥物隨后被釋放進入哺乳動物細胞的細胞質(zhì)中。或者，死亡細菌細胞可含有編碼藥物的質(zhì)粒，此時質(zhì)粒任選地包含調(diào)節(jié)元件和/或才艮道元件。藥物遞送方法可在體外或體內(nèi)進行。在另一個實施方式中，遞送方法是功能性核酸遞送方法，該方法包括將包含有功能性核酸分子或編碼功能性核酸分子的質(zhì)粒的死亡細菌細胞與具有吞噬或內(nèi)吞能力的哺乳動物細胞接觸，使得死亡細菌細胞被哺乳動物細胞吞噬。功能性核酸或質(zhì)粒隨后被釋放進入哺乳動物細胞。當死亡細菌細胞含有編碼功能性核酸分子的質(zhì)粒時，質(zhì)粒任選地包含調(diào)節(jié)元件和/或報道元件，且哺乳動物細胞優(yōu)先表達功能性核酸。功能性核酸遞送方法可在體外或體內(nèi)進行。因此，在一方面，遞送功能性核酸的方法包括使用包括無質(zhì)粒的功能性核酸的死亡細菌細胞。在這點上，功能性核酸穿過細菌細胞的完整細胞膜被直接包裹進入死亡細菌細胞中，而不使用含質(zhì)粒的表達載體或宿主細胞的表達系統(tǒng)。因此，在一個實施方式中，遞送功能性核酸的方法包括(a)提供多個在藥學(xué)上可接受的載體中的完整的死亡細菌細胞，其中每個細菌細胞包含無質(zhì)粒的功能性核酸，和(b)將多個死亡細菌細胞與哺乳動物細胞接觸，使得哺乳動物細胞吞噬多個死亡細菌細胞，從而將功能性核酸釋放進入靶細胞的細胞質(zhì)中。限定詞"無質(zhì)粒"意味著缺少用于調(diào)節(jié)性RNA的原位表達的載體，例如質(zhì)?；虿《据d體。引導(dǎo)死亡細菌細胞至特異性哺乳動物細胞在另一方面，本發(fā)明提供使用雙特異性配體的靶向遞送方法。該配體將死亡細菌細胞與靶標哺乳動物細胞接觸，使得哺乳動物細胞吞噬死亡細菌細胞，包括該死亡細菌細胞的負載物。在一個實施方式中，該乾向遞送方法是治療性核酸遞送方法，該方法包括將雙特異性配體與含有治療性核酸序列的死亡細菌細胞和非噬菌性哺乳動物細胞接觸。雙特異性配體導(dǎo)致死亡細菌細胞結(jié)合至哺乳動物細胞，且死亡細菌細胞被哺乳動物細胞吞噬。哺乳動物細胞隨后可產(chǎn)生治療性核酸的表達產(chǎn)物。核酸遞送的效率與死亡細菌細胞攜帶的質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)有關(guān)。已知核酸遞送的瓶頸是大于99%的內(nèi)化DNA在內(nèi)體或溶酶體中被降解，而沒有到達耙細胞的細胞質(zhì)。作為非活顆粒，預(yù)期死亡細菌細胞缺乏使靶細胞的內(nèi)吞溶酶體膜不穩(wěn)定或破碎的功能，且不可能具有允許內(nèi)化DNA脫離內(nèi)吞溶酶體膜的復(fù)雜機制。因此，根據(jù)本發(fā)明，攜帶質(zhì)粒DNA的至少70個到100個拷貝的死亡細菌細胞是優(yōu)選的。發(fā)明人已將這樣的死亡細菌細胞成功地用于核酸遞送。成功的結(jié)果表明，即使大多凄t^粒DNA在內(nèi)吞溶酶體液泡中被降解，它也能摧毀系統(tǒng)并讓一些DNA以完整形式脫離并進入哺乳動物細胞的細胞質(zhì)。在另一個實施方式中，耙向遞送方法是藥物遞送方法，該方法包括將雙特異性配體與含有藥物分子的死亡細菌細胞和非噬菌性哺乳動物細胞接觸。雙特異性配體導(dǎo)致死亡細菌細胞結(jié)合至哺乳動物細胞，并且死亡細菌細胞被哺乳動物細胞吞噬。藥物分子隨后被釋放進入哺乳動物細胞的細胞質(zhì)中。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，雙特異性配體靶定的死亡細菌細胞攜帶的相當大濃度的藥物也脫離內(nèi)吞溶酶體膜，并且進入哺乳動物細胞的細胞質(zhì)。而且，死亡細菌細胞是多功能的，表現(xiàn)在它們能夠包裹許多不同藥物，如親水的、疏水的和兩性的，例如阿霉素、紫杉醇、順鉑、卡鉑、5-氟尿嘧啶、伊立替康。所有這些藥物都易于以治療顯著濃度包裹在死亡細菌細胞中。在另一種實施方式中，靶向遞送方法是一種功能性核酸遞送方法，該方法包括將雙特異性配體與(a)含有功能性核酸分子或包含編碼功能性核酸分子的片段的質(zhì)粒的死亡細菌細胞，和(b)靶標哺乳動物細胞接觸。雙特異性配體使得死亡細菌細胞結(jié)合至哺乳動物細胞，并且所述死亡細菌細胞被哺乳動物細胞吞噬。死亡細菌細胞被吞噬后，功能性核酸分子被釋放至靶細胞的細胞質(zhì)中或由靶細胞表達。這些耙向遞送方法可在體內(nèi)或體外進行，或者在體內(nèi)和體外進行。雙特異性配體、死亡細菌細胞和哺乳動物細胞之間可以以許多不同的方式4妄觸。對于體內(nèi)遞送，優(yōu)選給予已附著雙特異性配體的死亡細菌細胞。因此，當雙特異性配體耙定的死亡細菌細胞在體內(nèi)到達靶細胞時，死亡細菌細胞、雙特異性配體和耙細胞全都接觸?；蛘?，雙特異性配體和死亡細菌細胞可在體內(nèi)被分別地給予。雙特異性配體、死亡細菌細胞和哺乳動物細胞之間的接觸也可發(fā)生在體外的一個或多個培養(yǎng)期間。在一種實施方式中，這三個元件被立刻培養(yǎng)在一起，或者，也可進行分步培養(yǎng)。在一個分步式方法的實施例中，死亡細菌細胞和雙特異性配體首先^皮一起培養(yǎng)形成雙特異性配體靶定的死亡細菌細胞，隨后將該雙特異性配體靶定的死亡細菌細胞與靶細胞一起培養(yǎng)。在另一個實施例中，雙特異性配體先同靶細胞一起培養(yǎng)，隨后與死亡細菌細胞一起培養(yǎng)。一個或多個體外培養(yǎng)以及體內(nèi)給予的組合也可使雙特異性配體、死亡細菌細胞以及哺乳動物耙細胞4妄觸。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)靶向遞送方法廣泛適用于許多哺乳動物細胞，所述哺乳動物細胞包括通常耐特異性粘附以及耐死亡細菌細胞的內(nèi)吞作用的細胞。例如，在一個臂上有抗0-多糖特異性和在另一個臂上有抗HER2受體、抗EGF受體或抗雄激素受體特異性的雙特異性抗體配體，有效地將死亡細菌細胞結(jié)合至許多耙標非噬菌性細胞上的各個受體。這些靶標非噬菌性細胞包括肺癌細胞、卵巢癌細胞、腦癌細胞、乳腺癌細胞、前列腺癌細胞和皮膚癌細胞。此夕卜，所述有效的結(jié)合優(yōu)先于由每個非噬菌性細胞進行的死亡細菌細胞的快速內(nèi)吞作用。本發(fā)明的靶細胞包括任何其中被引入治療性核酸、藥物或功能性核酸的細胞。理想的靶細胞的特征是，一旦結(jié)合配體，細胞表面受體的表達有利于菌性的，意指該靶細胞不是諸如巨噬細胞、樹突狀細胞以及自然殺傷細胞(NK)之類的專業(yè)的噬菌細胞。優(yōu)選的靶細胞也是哺乳動物細胞。本發(fā)明的遞送方法可^皮用來治療疾病病癥。術(shù)語"處理(treatment)"、"治療(treating)"、"治療(treat)"及相似術(shù)語是指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可能是預(yù)防性的，即完全或部分地預(yù)防疾病或癥狀，和/或可能是治療性的，即部分地或完整地穩(wěn)定或治療疾病和/或由疾病引起的不利影響。"處理(Treatment)"包括哺乳動物(尤其是人)體內(nèi)疾病的任何處理，其包括(a)防止疾病或癥狀在受治療者身上發(fā)生，該受治療者可能是易于患該疾病或癥狀但尚未診斷出具有該疾病；(b)抑制疾病癥狀，即阻止其發(fā)展；或(c)減輕疾病癥狀，即使疾病或癥狀的退化。使用功能性核酸來克服抗藥性和治療疾病在另一方面，本發(fā)明提供一種通過使用功能性核酸克服抗藥性和治療患者體內(nèi)的疾病(例如癌癥或艾滋病)的方法。該方法包括(a)提供含有功能性核酸分子或包含編碼功能性核酸分子的片段的質(zhì)粒的完整死亡細菌細胞，其中功能性核酸分子靶定基因或促成抗藥性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄體，(b)將死亡細菌細胞與耙標哺乳動物細胞接觸，使得哺乳動物細胞吞噬死亡細菌細胞，和(c)將藥物遞送至耙標哺乳動物細胞。優(yōu)選地，步驟(c)在步驟(a)和步驟(b)之后進行，以讓功能性核酸在給藥前減少抗藥性。藥物的遞送和功能性核酸的引入能以任何順序連續(xù)地或同時地發(fā)生。可通過任何常規(guī)方式遞送藥物。例如，藥物可通過口服、胃腸外(包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)和通過注入)、局部、經(jīng)皮或吸入方式遞送。醫(yī)藥領(lǐng)域的技術(shù)人員可輕松確定每種藥物的合適遞送模式和劑量。盡管可由常規(guī)方式進行藥物遞送，但是優(yōu)選經(jīng)死亡細菌細胞遞送。就這一點而言，發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)，同樣的哺乳動物細胞能通過包裹有不同負載物的靶定的死亡細菌細月包凈皮成功地重新轉(zhuǎn)染。例如，包裹有編碼質(zhì)粒的siRNA的死亡細菌細胞可轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，其后包裹有藥物的死亡細菌細l包可將藥物遞送至相同的哺乳動物細胞。該發(fā)現(xiàn)是令人驚訝的，并且表明與死亡細菌細胞的降解、負載物的內(nèi)體釋放和負載物脫離進入胞內(nèi)靶標相關(guān)的胞內(nèi)過程43在第一輪轉(zhuǎn)染和負載物遞送后仍保留完全的功能。藥物可被包裹在不同于功能性核酸或編碼功能性核酸的質(zhì)粒的單獨的死亡細菌細胞中，或者，藥物可被包裹在與功能性核酸分子或編碼功能性核酸分子的質(zhì)粒相同的死亡細菌細胞中。某些藥物可與核酸相互作用，并排斥在相同死亡細菌細胞內(nèi)的藥物和核酸的共同包裹(co-packaging)。例如，已知阿霉素可與DNA相互作用。將功能性核酸包裹進入死亡細菌細胞功能性核酸可被直接包裹進入完整的死亡細菌細胞。該過程省略了之前所需的步驟，例如，將編碼調(diào)節(jié)性RNA的核酸克隆進入表達質(zhì)粒中、用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化產(chǎn)生小細胞的親代細菌和產(chǎn)生重組的小細胞。取而代之的是，通過將多個完整的死亡細菌細胞與功能性核酸在緩沖液共培養(yǎng)，可將無質(zhì)粒的功能性核酸直接包裹進入死亡細菌細胞中。在某些實施方式中，共培養(yǎng)可包括輕微的振蕩，而在其它實施方式中共培養(yǎng)是靜止的。共培養(yǎng)約一個小時已經(jīng)足夠，但更短的時間，例如約半個小時也可能是有效的。在一種實施方式中，緩沖液包括緩沖液鹽，例如lx磷酸緩沖液。所述緩沖液鹽可為凝膠形式。在另一種實施方式中，共培養(yǎng)在約4。C至約37。C、約2(TC至約3(TC、約25。C或約37。C的溫度進行。在其他方面，共培養(yǎng)可包括約107、108、109、1010、1011、1012或1013個死亡細菌細胞?？蓛?yōu)化溫度、時間、緩沖液、小細胞濃度等特異性參數(shù)，以得到特定的條件組合。將藥物力p入死亡細菌細月包優(yōu)選地，本發(fā)明的死亡細菌細胞含有足夠量的藥物以在靶細胞上發(fā)揮藥物生理學(xué)或藥理學(xué)作用。還優(yōu)選的是，包含在死亡細菌細胞內(nèi)的藥物為對死亡細菌細胞而言異源的或外來的，意味著死亡細菌細胞的親代細菌細胞通常不產(chǎn)生藥物。通過在含有死亡細菌細胞的胞外介質(zhì)與死亡細菌細胞細胞質(zhì)之間造成藥物的濃度梯度，可將親水性和疏水性藥物包裹在死亡細菌細胞內(nèi)。當胞外介質(zhì)比死亡細菌細胞細胞質(zhì)含有更高的藥物濃度時，藥物自然沿著該濃度梯度移動進入死亡細菌細胞細胞質(zhì)。然而，當濃度梯度被逆轉(zhuǎn)時，藥物不會從死亡細菌細月包移出。為將正常情況下非水溶性的藥物加入死亡細菌細胞，首先將藥物溶解于合適的溶劑中。例如，紫杉醇可溶解于乙醇和cremophoreEL(聚氧乙烯蓖麻油)的l:l混合液中，隨后在PBS中稀釋以獲得部分稀釋在水介質(zhì)中并具有最少量有才幾溶液的紫杉醇溶液，以確保藥物仍留在溶液中。死亡細菌細胞可在此最終介質(zhì)中培養(yǎng)以用于藥物的加荷。因此，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，甚至疏水性藥物可擴散進入死亡細菌細胞細胞質(zhì)，以達到大量的且治療顯著的細胞質(zhì)的藥物加荷。這是未曾預(yù)料到的，因為死亡細菌細胞膜由疏水性磷脂雙層組成，該細胞膜被認為會阻止疏水性分子擴散進入細胞質(zhì)。另一種將藥物加入死亡細菌細胞的方法包括在親代細菌細胞轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼藥物的核酸的條件下培養(yǎng)重組的親代細菌細胞，使得藥物被釋放進入親代細菌細胞的細胞質(zhì)。例如，編碼用于所需藥物的細胞生物合成途徑的基因簇可被克隆，并轉(zhuǎn)移進入能夠產(chǎn)生死亡細菌細胞的親代細菌菌株中。基因蔟的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯導(dǎo)致藥物在親代細菌細胞細胞質(zhì)內(nèi)的生物合成，使細菌細胞質(zhì)充滿藥物。當親代細菌細胞分裂并形成子代死亡細菌細胞時，所述死亡細菌細胞在其細胞質(zhì)中也含有藥物。可通過任何本領(lǐng)域已知的和如上所述的死亡細菌細胞純化方法來純化被預(yù)先包裹的死亡細菌細胞。相似地，另一種將藥物加入死亡細菌細胞的方法包括在使編碼藥物的基因在死亡細菌細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯的條件下，培養(yǎng)含有編碼藥物的表達質(zhì)粒的重組死亡細菌細月包。組合物的純度本發(fā)明中的死亡細菌細胞基本上不含雜質(zhì)親代細菌細胞，即活細菌細胞。因此，含有本發(fā)明組合物的死亡細菌細胞優(yōu)選為每107個死亡細菌細胞含有少于約l個雜質(zhì)親代細菌細胞，更優(yōu)選為每108個死亡細菌細胞含有少于約l個雜質(zhì)親代細菌細胞，甚至更優(yōu)選為每109個死亡細菌細胞含有少于約1個雜質(zhì)親代細菌細胞，還更優(yōu)選為每10"個死亡細菌細胞含有少于約1個雜質(zhì)親代細菌細胞，和最優(yōu)選為每1()U個死亡細菌細胞含有少于約1個雜質(zhì)親代細菌細胞。本質(zhì)上由死亡細菌細胞組成，且任選地包含本發(fā)明的治療性核酸、藥物、45功能性核酸和雙特異性配體的組合物(即包含所述死亡細菌細胞和不過分干擾組合物遞送質(zhì)量的其它成分的制劑)，可按常規(guī)方法，使用一種或多種藥學(xué)上可接受載體或賦形劑來制備。培養(yǎng)物中的細菌可使用許多不同的方法殺死，包括(a)用細菌菌才朱敏感的抗生素處理；(b)以低于使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固的水平的熱處理和(c)使用不破壞細菌細胞完整性和關(guān)閉細菌膜上蛋白質(zhì)通道的濃度的諸如乙醇的溶劑來處理。在生產(chǎn)死亡細菌疫苗的領(lǐng)域中，所述殺死細菌細胞的過程是熟知的。優(yōu)選地，殺死細菌細胞的過程不包括使分子的立體構(gòu)型大范圍變性，即該過程優(yōu)選保留來自細菌細胞的大分子(如蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì))的三維結(jié)構(gòu)。其他可用于獲得上述死亡細菌細胞制備物的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的?？赏ㄟ^本領(lǐng)域內(nèi)任何已知的方法來證明在制備死亡細菌細胞中膜沒有變性。例如，可從重組死亡細菌細胞中提取出質(zhì)粒DNA,并對質(zhì)粒DNA測序以確認重組DNA的完整性。通過實時PCR可確定質(zhì)粒內(nèi)容(plasmidcontent)，并與相同數(shù)量的活重組細菌細胞中的質(zhì)粒內(nèi)容相比較。如果膜的完整性在殺死過程中沒有得以保存，則預(yù)期可能發(fā)生質(zhì)粒丟失。此外，如果殺死過程破壞了重組質(zhì)粒，則可觀察到DNA序列畸變。也可進行這樣的測試，即沖企測相同數(shù)量的活體細菌細胞和死亡細菌細胞包裹化療藥物的能力。通過過濾，例如通過0.2pm交叉流過濾，可乂人死亡細菌制備物中除去雜質(zhì)，例如介質(zhì)、緩沖液、細胞碎片、膜泡、游離核酸和游離內(nèi)毒素。優(yōu)選使用約0.2pm的過濾器孔眼尺寸，因為污染物通常小于0.2(im。因此，使用這樣的過濾器孔眼尺寸讓污染物#皮濾出，而留下完整的死亡細菌細胞。這種過濾可以為死端過濾或交叉流過濾。交叉流過濾具有的優(yōu)點是較少的過濾器堵塞。而且，優(yōu)選進行緩沖液交換沖洗步驟，其也可使用約0.2]11111的過濾器孔眼尺寸。組合物的給藥途徑和形式本發(fā)明的組合物可通過不同途徑給藥至哺乳動物體內(nèi)的不同位點，以獲得局部或系統(tǒng)的所需治療效果。可通過以下方法完成遞送，例如，通過口服給藥、通過將制劑應(yīng)用至體腔、通過吸入或吹入法、或者通過腸胃外、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)、肝內(nèi)、腹膜、皮下、腫瘤內(nèi)或經(jīng)皮給藥。.給藥的模式和位點取決于把細胞的位置。例如，通過^皮耙定的死亡細菌細胞的吸入遞送可有效靶定嚢性纖維性變細胞。類似地，通過被靶定的死亡細菌細胞的靜脈遞送可更加有效地治療腫瘤轉(zhuǎn)移。通過被耙定的死亡細菌細胞的腹腔內(nèi)遞送可治療源發(fā)性卵巢癌。組合物可以單位劑量的形式提供，例如可被提供在安瓿或管形瓶中，或者被提供在多次劑量容器中，其具有或不具有添加的防腐劑。組合物可為溶液、懸浮液或者在油性或水性載體中的乳狀液，并可包含配方劑，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。合適的溶液與接受者血液等壓，例子有生理鹽溶液、林嘉氏溶液和葡萄糖溶液?；蛘?，組合物可為冷凍干粉形式，用于使用諸如無菌、無熱原水或生理鹽水之類的合適載體來復(fù)原。組合物還可制備成孩吏球的形式。這種長效組合物可通過植入(例如皮下或月幾肉內(nèi))或肌肉內(nèi)注射給藥。關(guān)于本發(fā)明組合物的給藥，在此文中可互用的術(shù)語"個體"、"對象，，、"宿主"和"患者"，是指需要診斷、處理或治療的任何哺乳動物對象。在一個優(yōu)選實施方式中，個體、對象、宿主或病人是人類。其它對象可包括但不限于牛、馬、狗、貓、豚鼠、豬、兔子、大鼠、靈長類和小鼠。給藥安排通常，此文公開的組合物可以經(jīng)給藥途徑測試確定的適當劑量使用，以達到最佳的生理學(xué)作用，同時4吏任何潛在的毒性最小化?？刹鹏迵?jù)不同因素進行選擇攝入劑量，所述因素包括年齡、重量、性別、患者的醫(yī)療條件、要被治療的病癥的嚴重程度、給藥途徑以及患者的腎功能和肝功能。在獲得死亡細菌細胞和治療劑的濃度在產(chǎn)生最大效力和最小副作用的范圍內(nèi)的最佳精確度時，可能需要一種基于死亡細菌細胞動力學(xué)和對耙位點及靶細胞的治療實用性的方案。當確定治療方案的最佳濃度時，可能考慮死亡細菌細胞或治療劑的分散、平衡和消除。當結(jié)合使用死亡細菌細胞和治療劑時，可調(diào)整死亡細菌細胞和治療劑的劑量以達到所需效果。而且，可使用藥動學(xué)/藥效學(xué)模型系統(tǒng)優(yōu)化組合物的給藥劑量。例如，可選擇一個或多個劑量方案，并使用藥動學(xué)/藥效學(xué)模型來確定所述一個或多個劑量方案的藥動學(xué)/藥效學(xué)曲線。隨后，選擇其中一個用于給藥的劑量方案，該方案根據(jù)特定的藥動學(xué)/藥效學(xué)曲線獲得所需的藥動學(xué)/藥效學(xué)反應(yīng)。參見，例如，WO00/67776。具體而言，在數(shù)周的過程中，組合物至少每周給藥一次。在一種實施方式中，組合物在數(shù)周至數(shù)月的過程中至少每周給藥一次。更具體地，組合物可至少每天給藥一次，并且持續(xù)約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天?；蛘?，組合物可約每隔一天菱合藥一次、每隔2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天或更長時間給藥一次。或者，組合物可約每隔一周給藥一次、約每隔2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周或更長時間纟會藥一次?；蛘?，該組合物可至少每周給藥一次，并持續(xù)約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周或更長時間?；蛘?，組合物可每隔一月給藥一次，約每隔2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月或更長時間給藥一次。組合物可按單個每日劑量給藥，或按總每日劑量每日分成2次、3次或4次給藥。在給藥前給予死亡細菌細胞的方法中，可在給予死亡細菌細胞后的數(shù)分鐘到數(shù)個小時的任何時間給藥?；蛘撸稍诮o予死亡細菌細胞后的數(shù)個小時到數(shù)天，可能為數(shù)個星期直至到數(shù)個月的任何時間給藥。更為具體而言，可在給藥前至少約l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個小時給予死亡細菌細胞。而且，可在給藥前至少約l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天給予死亡細菌細胞。在另一種實施方式中，可在給藥前至少約l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周或更長時間給予死亡細菌細胞。在另一種實施方式中，可在給藥前至少約l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月給予死亡細菌細月包。在另一種實施方式中，在給藥后給予死亡細菌細胞?？稍诮o藥后數(shù)分鐘到數(shù)個小時的任何時間給予死亡細菌細胞。或者，可在給藥后數(shù)個小時到數(shù)天，可能是數(shù)個星期直至數(shù)個月的任何時間給予死亡細菌細胞。實施例實施例l、死亡細菌^皮成功地包裹有化療藥物阿霉素。在胰酪胨大豆肉湯(TSB)中培養(yǎng)鼠傷寒沙門氏菌菌林過夜。隨后在lOOml的TSB中對所述菌林進行繼代培養(yǎng)(l:lOO),生長到早期對數(shù)期(006。。=0.406)。通過在TSB瓊脂平板上涂布連續(xù)稀釋液并在過夜培養(yǎng)后進行菌落計數(shù)來計數(shù)細菌。結(jié)果顯示，每毫升培養(yǎng)物含有細菌5xl()S個。為殺死細菌細胞，將10ml的培養(yǎng)物與500^ig/ml的慶大霉素和500^ig/ml的氯霉素一起培養(yǎng)4小時。取100pl樣品涂布在TSB瓊脂平板上以確認所述細菌細胞已被殺死。在37。C、lml的lxBSG(緩沖鹽凝膠)中將死亡細菌細胞(lxlO"與60pg/ml的阿霉素一起培養(yǎng)2小時。通過6次重復(fù)沖洗步驟將過量的藥物從細菌細胞洗去，其中所述細胞被以13200rpm離心5分鐘，隨后在新鮮BSG溶液中重懸。在存在97mM鹽酸-異丙醇(HC1-IPA)的情況下，振蕩并超聲處理5個循環(huán)后，從死亡細菌中提取出阿霉素。樣品被稀釋在等體積的水溶液中并重復(fù)上述5個循環(huán)。以13200rpm離心5分鐘以沉淀細胞碎片后，收集上清液用于通過HPLC進行藥物定量。流動相含有100mM曱酸銨+0.05。/。三乙胺(pH,3.5)、MQ和MeCN(乙腈)，三者比例為28:42:30。固定相含有處于40。C的LichrosphereRP18柱(MERCK)。通過在480nm時激發(fā)并在550nm時發(fā)射、使用Shimadzu1OAVP系統(tǒng)、運行版本為7.2的SPIrevB軟件(ShimadzuCorporation)來進行才全測，所述系統(tǒng)包括自動上樣器、溶劑脫氣裝置、四元泵、管柱加熱器(40。C)和熒光檢測器。峰值下方區(qū)域內(nèi)插入了阿霉素的標準曲線，結(jié)果顯示2嗎的阿霉素被包裹在口109個死亡細菌細月包。實施例2、在攜帶人乳腺癌異種移植物的棵鼠體內(nèi)施用EGFR-靶定的、包裹有阿霉素的死亡細菌細胞后的腫瘤退化(regression)/穩(wěn)定此實施例證實，雙特異性配體耙定的、包裹有阿霉素的完整的死亡細菌細胞可實現(xiàn)在6周齡的無胸腺雌棵鼠上建立的人乳腺癌細胞腫瘤異種移植物的退化。如在實施例1中所描述的，死亡的鼠傷寒沙門氏菌細胞包裹有化療藥物阿霉素并且通過重復(fù)的離心和洗去上清液來去掉游離的內(nèi)毒素。具有抗LPS特異性和抗人EGFR特異性的雙特異性抗體構(gòu)建如下:選擇抗EGFR單克隆抗體是因為異種移植的細胞是人乳腺癌細胞MDA-MB-468，已知這種癌細胞在細胞表面過度表達EGF受體。具有抗鼠傷寒沙門氏菌O-抗原特異性和抗EGFR特異性的BsAb如在PCT/US2004/041010中所述的那樣構(gòu)建。簡言之，通過將抗鼠傷寒沙門氏菌O-抗原單克隆抗體(MAb)(IgGl;Biodesign)與抗靶細胞表面受體的Mab(即鼠抗人EGFR(IgG2a;Oncogene))連接而構(gòu)建雙特異性抗體(BsAb)。通過使用純化的重組蛋白A/G(PierceBiotechnology)的Fc區(qū)將這兩個抗體交聯(lián)。簡言之，將蛋白A/G(終濃度為100pg/ml)加入0.5ml含有抗鼠傷寒沙門氏菌O-抗原和抗人EGFR-Mab各20pg/ml的預(yù)混合溶液中，并在4。C培養(yǎng)過夜。通過與結(jié)合有蛋白質(zhì)G的磁珠一起培養(yǎng)，并室溫下輕輕混合40分鐘而除去過量抗體。磁珠被磁性分離后，在室溫下將蛋白質(zhì)A/G-BsAb復(fù)合物與109個包裹有阿霉素的死亡細菌細胞一起培養(yǎng)l小時，以通過將O-抗體特異性Fab臂結(jié)合至表面LPS而使細胞覆蓋有抗體。在此實施例中4吏用的小鼠購自動物資源中心(AnimalResourcesCentre,Perth,WA,Australia),且所有的動物實驗都遵循實驗動物飼養(yǎng)管理及使用規(guī)范且獲得動物倫理委員會批準。試驗在EnGeneICPtyLtd(Sydney,NSW，Australia)的經(jīng)NSW農(nóng)業(yè)部批準的小動物設(shè)備上進行。人乳腺癌細胞(MDA-MB-468,ATCC;人乳腺上皮細胞;非噬菌性的)在組織培養(yǎng)基中生長，直到在37。C、在95%空氣和5%(:02潮濕氣氛中，并在含有用5%的小牛血清(GIBCO-BRLLifeTechnologies,InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA，USA)和谷氨酰胺(Invitrogen)補給的RPMI1640培養(yǎng)基的T-75燒瓶中完全匯合。使用23號針頭將在50^iL無血清培養(yǎng)基中的1xl(^個細胞與50pL生長因子減少的基質(zhì)膠(BDBiosciences,FranklinLakes,NJ,USA)—起皮下注射至每只小鼠肩胛骨之間。使用數(shù)顯卡尺(Mitutoyo,Japan,精確到0.001)每周測量腫瘤2次，50并使用公式長度(mm)x寬度2(mm)x0.5二體積(mm"來計算平均的腫瘤體積。移植16天后，腫瘤體積達到40mmS至70mmS之間，將小鼠隨機分為4個不同的小組，每組5只。實-驗設(shè)計如下組l(對照組)接受i.v.劑量的100pl的無菌生理鹽水。組2(對照組)接受i.v.劑量的游離阿霉素(7mg/kg小鼠體重)。組3(對照組)接受1X10V劑量的、包裹有阿霉素的死亡細菌(死亡的鼠傷寒沙門氏菌DOX)。組4(實驗組)接受lxloV劑量的EGFR-靶定的、包裹有阿霉素的死亡細菌(EGFR死亡鼠傷寒沙門氏菌Dox)。所有劑量由i.v.途徑給藥，且在第21天、28天和34天給藥。結(jié)果顯示(圖l),與三個對照組相比，EGFR死亡鼠傷寒沙門氏菌DOX在實現(xiàn)腫瘤退化/穩(wěn)定方面具有非常高的效率。實施例3、在攜帶人結(jié)腸癌異種移植物的棵鼠中靜脈內(nèi)施用EGFR-靶定的、包裹有紫杉醇或包裹有siRNA-紡錘體驅(qū)動蛋白的死亡細菌細胞后的抗腫瘤作用此實施例考慮的是，包裹有紫杉醇或siRNA的完整的死亡細菌細胞是否可以抑制人結(jié)腸癌細胞腫瘤在體內(nèi)的生長。使用在實施例1中描述的方法，死亡的鼠傷寒沙門氏菌細胞被包裹有化療藥物紫杉醇，并通過重復(fù)離心和洗去上清液來去掉游離的內(nèi)毒素?？辜忓N體驅(qū)動蛋白(KSP)的siRNA^皮單獨地包裹在死亡的鼠傷寒沙門氏菌菌林中。KSP,也稱驅(qū)動蛋白-5或Eg5,是有絲分裂期間兩級紡錘體形成和姐妹染色體正常分離的必不可少的微管驅(qū)動蛋白(Enos和Morris，1990;Blangy等，1995;Dagenbach和Endow,2004)。抑制KSP導(dǎo)致形成單極有絲分裂紡錘體、激活紡錘體組裝檢控點，并使細胞停止在有絲分裂期，這將導(dǎo)致隨后的細胞死亡(Blangy等，199S,Mayer等,19";Kapoor等^000;Tao等,2005)。合成KSP-siRNA雙鏈寡核苷酸序列(正義鏈5'-AACTGGATCGTAAGAAGGCAG-3'),并通過將1x101()個細菌與l(im的siRNA-KSP—起培養(yǎng)而將其包裹進入死亡鼠傷寒沙門氏菌菌林中。共培養(yǎng)在37。C、在lx磷酸緩沖液(PBS)(Gibco)中進行12個小時，伴隨溫和的混合。包裹后，通過在16，200xg離心10分鐘而沉淀細菌并用lxPBS沖洗2次。在lxPBS中洗滌細菌細胞2次以除去過量的未被包裹的siRNA-KSP。述的那樣構(gòu)建。在此實施例中^f吏用的小鼠購自動物資源中心(AnimalResourcesCentre,Perth,WA,Australia)，且所有的動物實驗都遵循實驗動物飼養(yǎng)管理及使用規(guī)范且獲得動物倫理委員會批準。試驗在EnGeneICPtyLtd(Sydney,NSW,Australia)的經(jīng)NSW農(nóng)業(yè)部批準的小動物設(shè)備上進行。人結(jié)腸癌細胞(HCTU6，ATCC)在組織培養(yǎng)基中生長，直到在37。C、在95%空氣和5%(:02潮濕氣氛中，在含有用5。/。小牛血清(GIBCO-BRLLifeTechnologies,InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA,USA)和谷氨酰胺(Invitrogen)補給的RPMI1640培養(yǎng)基的T-75燒瓶中完全匯合。使用23號針頭將在50pL無血清培養(yǎng)基中的lxl()6個細胞與50(iL生長因子減少的基質(zhì)膠(BDBiosciences,FranklinLakes,NJ，USA)—起皮下注射至Balb/c無胸腺小鼠(11=8只小鼠每組)的肩胛骨之間。使用數(shù)顯卡尺(Mitutoyo,Japan,精確到0.001)每周測量月+瘤2次，并使用公式長度(mm)x寬度"mm)x0.5二體積(mm"來計算平均的腫瘤體積。移植16天后，腫瘤體積達到200mm3,將小鼠隨機分為4個不同的小組，每組8只。實-險沒計如下組l(對照組)接受i.v.劑量的的100pil的無菌生理鹽水。組2(對照組)是不攜帶任何治療性負載物的EGFR革巴定的死亡鼠傷寒沙門氏菌(G2;EGFR鼠傷寒沙門氏菌)。組3(實驗組)是包裹有化療藥物紫杉醇的EGFR靶定的死亡鼠傷寒沙門氏菌(G3;EG^鼠傷寒沙門氏菌紫杉醇)。組4(實驗組)是包裹有抗紡錘體驅(qū)動蛋白的siRNA的EGFR靶定的死亡鼠傷寒沙門氏菌(G4;EG^鼠傷寒沙門氏菌礎(chǔ)風(fēng)-KSP)。每星期進行3次治療。結(jié)果顯示(圖2)，與兩個對照組相比，兩種治療，即EGFR死亡鼠傷寒沙門氏菌f杉醇和EGFR鼠傷寒沙門氏菌siRNA.KSP,均顯示出相當大的抗腫瘤作用。因此，數(shù)據(jù)證實了包裹有紫杉醇或siRNA的完整死亡細菌細胞抑制人結(jié)腸細胞腫瘤在體內(nèi)的生長。實施例4、雙重治療的使用，其包括受體靶定的死亡細菌介導(dǎo)的shRNA,隨后為受體靶定的死亡細菌介導(dǎo)的藥物遞送。為證實受體靶定的死亡細菌能夠在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)在癌細胞中的抗藥性，我們對Balb/c無胸腺小鼠進行了如下研究。對于異種移植細胞，我們使用人結(jié)腸癌細胞系Caco-2，該細胞系對用于結(jié)腸癌的一線化療藥物(例如伊立替康和5-氟尿嘧啶(5-FU))具有非常大的抗性。使用在實施例1中所描述的方法，使鼠傷寒沙門氏菌死亡細菌包裹有化療藥物伊立替康或5-FU。通過在13，200rpm將細菌細胞離心10分鐘，而洗去非特異性結(jié)合至死亡細菌外表面的過量的伊立替康或5-FU，并將洗滌后的細胞在新鮮的lxPBS中重懸。重復(fù)該洗滌步驟。如之前實施例中所描述的，包裹有伊立替康或5-FU的死亡鼠傷寒沙門氏菌細胞通過抗O-多糖/抗EGFR雙特異性抗體結(jié)合至細菌細胞表面而靶定至EGFR。選擇抗EGFR單克隆抗體是因為已知異種移植細胞，Caco-2，在細胞表面過量表達EGFR(Nyati等,2004)。EGFR靶定的、包裹有藥物的死亡細菌被標記為EGFR鼠傷寒沙門氏菌5-FU和EGFR鼠傷寒沙門氏菌伊立替康。攜帶編碼抗MDR1shRNA序列的質(zhì)粒的重組鼠傷寒沙門氏菌菌林按如下方法產(chǎn)生。在本研究中使用的MDR-1shRN踏列(5'-TCGAAAGAAACCAACTGTCAGTGTAgagtactgTACACTGACAGTTGGTTTCTTTTTTT-3')在Wu等,2003中有描述。合成shRNA序列并亞克隆至質(zhì)粒IMG-800(ImgenexCorp.,SanDiego,CA，USA)中，-使得該序列可從質(zhì)粒U6啟動子開始表達。該質(zhì)粒攜帶復(fù)制的pUC起始位點，該起始位點使得能在細菌細胞產(chǎn)生高質(zhì)粒拷貝數(shù)。將重組質(zhì)粒測序以確保shRNA序列是正確的并確保位于從U6啟動開始的表達框內(nèi)。重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化進入鼠傷寒沙門氏菌，且將重組菌4朱標記為鼠傷寒沙門氏菌shRNA.MDRl。EGFR耙定的鼠傷寒沙門氏菌shRNA-MDIU是通過將抗O-多糖/抗EGFR雙特異性抗體結(jié)合至重組細菌的表面而產(chǎn)生EGFH鼠傷寒沙門氏菌s,^MD^而構(gòu)建的。不同的小鼠組(每組5只小鼠)接受如下治療組l(對照組)為無菌生理鹽水；組2(對照組)為EGm鼠傷寒沙門氏菌shRNA-MD!U;組3(對照組)為EGFR耙定的、包裹有5-FU的死亡細菌(EGFR鼠傷寒沙門氏菌5.Fu);組4(實驗組)為EGFR鼠傷寒沙門氏菌shRNA.MDR!及隨后的EGFR鼠傷寒沙門氏菌5-FU;組5(對照組)為EGFR耙定的、包裹有伊立替康的死亡細菌(EGFR鼠傷寒沙門氏菌伊立替康)；組6(實驗組)為EGFR鼠傷寒沙門氏菌shRNA-M面及隨后的EGFR鼠傷寒沙門氏菌伊甜A。組2至組6接受&109個細菌細胞，并且所有的治療都是靜53脈內(nèi)治療。結(jié)果顯示(圖3),如預(yù)期的一樣，Caco-2細胞在用EGFR鼠傷寒沙門氏菌伊立替康、EGFR鼠傷寒沙門氏菌5-FU和EGFR鼠傷寒沙門氏菌艦脅函!U處理后仍具有抗性。接受了雙重治療，即EGFR鼠傷寒沙門氏菌艦NA-MD!U及隨后的EGFR鼠傷寒沙門氏菌伊立替康(G6小鼠)或EGFR鼠傷寒沙門氏菌5-FU(G4小鼠)的細胞顯示了抗藥性和腫瘤退化的非常大的逆轉(zhuǎn)。數(shù)據(jù)證實，雙重治療方案，例如受體耙定的死亡細菌介導(dǎo)的shRNA遞送及隨后的受體靶定的死亡細菌介導(dǎo)的化療藥物遞送，在逆轉(zhuǎn)非噬菌性哺乳動物細胞內(nèi)的抗藥性方面具有高度有效。參考文獻所有在本說明書中提到的出版物和專利都通過引用合并至此文中。但是，引用出版物或?qū)＠⒎浅姓J其為現(xiàn)有技術(shù)。Akporiaye,E.T.&Hersh,E.Clinicalaspectsofintratumoralgenetherapy.CwrMo/.77zw.1:443-453(1999).Ambudkar,etal.,Annu.Rev.Pharmacol.7bx/co/.39:361(1999).BatraRK,Wang-JohanningF,\VagnerE，GarverRIJr,CurielDT.Receptor-mediatedgenedeliveryemployinglectin-bindingspecificity.7Tze廣1994Jul;l(4):255-60.BeckerCM,FarneboFA,IordanescuI,BehonickDJ，ShihMC,DunningP，ChristoffersonR,MulliganRC,TaylorGA,KuoCJ，ZetterBR.GenetherapyofprostatecancerwiththesolublevascularendothelialgrowthfactorreceptorFIk1.Cawcerr/^r.2002Sep-Oct;l(5):548-53.Bergey'sManualofSystematicBioloty,2nded.，Springer-Verlag,2001.Blangy，A.,Lane,H.A.,d'Herin,P.,Harper,M.,Kress,M.，Nigg,E.A.Phosphorylationbyp34cdc2regulatesspindleassociationofhumanEg5,akinesin-relatedmotoressentialforbipolarspindleformationinvivo.Ce〃83:1159-1169(1995).Boucher,R.C.,Pickles,R丄，Rideout,J丄.，Pendergast,W.&Yerxa,B.R.TargetedgenetransferusingGproteincoupledreceptors.L^.S.;afew/"a/_p//ca/io/7.US2003/004123Al.Jan2,2003.Bullough,P.A.，Hughson，F(xiàn).M.,Skehel,J丄,Wiley,D.C.StructureofinfluenzahaemagglutininatthepHofmembranefusion.iVart^e371:37—43(1994).Caplen,五x戸/C(p/ra.層.77^,3(4):575-86(2003).CaplenandMousses,TV.KXcm/.&丄，1002:56-62(2003).Carter,P.Improvingtheefficacyofantibody-basedcancertherapies.iVafCawce廣2001Nov;1(2):118-29.CilibertoW"/.,"Cell-specificexpressionofatransfectedhumanalpha1-antitrypsingene,"Ce〃.41:531(1985).Chen，L.M.,Kaniga,K.,Galan,J.E.Salmonellaspp.arecytotoxicforculturedmacrophages.編.21:1101-1115(1996).Chen,D.,Murphy,B.sSung,R.,Bromberg,J.S.Adaptiveandinnateimmuneresponsestogenetransfervectors:roleofcytokinesandchemokinesinvectorfunction.Gewe77e%10:991-998(2003).Clark,P.R.&Hersh,E.M.Cationiclipid-mediatedgenetransfer:currentconcepts.CmtC*/z'w.Mo/.77^.1:158-176(1999).Collins&Olive,322795-99(1993).Curiel"a/,"Long-terminhibitionofclinicalandlaboratoryhumanimmunodeficiencyvirusstrainsinhumanT-celllinescontaininganHIV-regulateddiphtheriatoxinAchaingene,"http://iww.G麼77^.4:741(1993).Dagenbach,E.M.,andEndow,S.A.Anewkinesintree.J!Ce〃5W.117:3-7(2004).Dang,L.H.,Bettegowda,C，Huso,D丄.,Kinzler,K.W"Vogelstein,B.Combinationbacteriolytictherapyforthetreatmentofexperimentaltumors.Ato/.爿cfld5W.98:15155-15160(2001).deHaard,H.J.Wa/.Alargenon-immunizedhumanFabfragmentphagelibrarythatpermitsrapidisolationandkineticanalysisofhighaffinityantibodies.J".CTzew.274,18218-18230(1999).deJong,G"Telenius,A.，Vanderbyl,S.，Meitz.A.，Drayer,J.Efficientz力-v//rotransferofa60-Mbmammalianartificialchromosomeintomurineandhamstercellsusingcationiclipidsanddendrimers.C7zrowoso附e9:475-485(2001》Dingesa/.，"HIV-regulateddiphtheriatoxinAchaingeneconferslong-termprotectionagainstHIVtype1infectioninthehumanpromonocyticcelllineU937，"Gewe77^r.6:1437(1995),Dow，S.W"Fradkin，L.G,Liggitt,D.H.,Willson,A.P.,Heath，T.D.，Potter,T.A,Lipid-DNAcomplexesinducepotentactivationofinnateimmuneresponsesandantitumoractivitywhenadministeredintravenously.乂im附wwo/.163:1552—1561(1999).Dramsi，S.&Cossart,P.Intracellularpathogensandtheactincytoskdeton.Annu.iev.Ce〃.Dev.14:137-166(1998).D腿etal.，Mol.C"歸r77^ra戸"'"，3(7):833-38(2004).DubelS,BreitlingF,KontermannR,SchmidtT,SkerraA,LittleM.Bifimctionalandmultimericcomplexesofstreptavidinfiisedtosinglechainantibodies(scFv).J7m鵬wo/.M"/oA(1995)178,201-209.Dunham，S.P.Theapplicationofnucleicacidvaccinesinveterinarymedicine,ffef.9-16(2002).Duxburyetal.,J.爿附.Co〃.&/rg.，198:953-59(2004).ElOuahabi,A.，Thiry,M.，F(xiàn)uks,R.,Ruysschaert，J.&Vandenbranden,M.Theroleoftheendosomedestabilizingactivityinthegenetransferprocessmediatedbycationiclipids.i^AS丄e仏414:187-192(1997).Enos，A.P"andMorris，N.R.Mutationofagenethatencodesakinesin-likeproteinblocksnucleardivisioninA,nidulans.Cell60:1019-1027(1990).Essani,K.&Dales,S.Biogenesisofvaccinia:evidenceformorethan100polypeptidesinthevirion.95;385-394(1979).Farhood,H,，Serbina，N.&Huang,L.Theroleofdioleoylphosphatidylethan-olamineincationicliposomemediatedgenetransfer.5/oc/>n,1235:289-295(1995).56<formula>formulaseeoriginaldocumentpage57</formula>Green,N.K.&Seymour,L.W.Adenoviralvectors:systemicdeliveryandtumortargeting.Gewe772er9:1036-1042(2002).Griffiths,A.D.c/.Isolationofhighaffinityhumanantibodiesdirectlyfromlargesyntheticrepertoires.J.13，3245-3260(1994).Guerrier-Takadaetal.,Ce〃，35:849(1983).Hafez，I.M.,Maurer,N.&Cullis，P.R.Onthemechanismwherebycationiclipidspromoteintracellulardeliveryofpolynucleicacids.G^we77^.8:1188-1196(2001》HampelandTritz，28:4929(1989).Hampeletal.，7Vwc/e/d/<iyi，a/r/:299(1990)Hanahan,Heritableformationofpancreaticbeta-celltumoursintransgenicmiceexpressingrecombinantinsulin/simianvirus40oncogenes.1985May9-15;315(6015):115-122,HarrisonW"Inhibitionofhumanimmunodeficiencyvirus-1productionresultingfromtransductionwitharetroviruscontaininganHIV-regulateddiphtheriatoxinAchaingene,"http://諷G潔3:461(1992a).Harrison"1，"InhibitionofHIVproductionincellscontaininganintegrated,HIV-regulateddiphtheriatoxinAchaingene,"J/ASi^.//謡.ie加v/ra鄉(xiāng)8:39(1992b).Hart,"Tissuespecificpromotersintargetingsystematicallydeliveredgenetherapy,"Sfe/w/w.23:154(1996),HeimWa/,"Wavelengthmutationsandposttranslationalautoxidationofgreenfluorescentprotein,"尸亂淑'/5W.,91:12501(1994).Hobbs,S.K.,Monsky,W丄.，Yuan，F(xiàn).，Roberts,W.G"Griffith,L.,Torchilin,V.P,andJain,R.K.Regulationoftransportpathwaysintumorvessels:Roleoftumortypeandmicroenvironment,Wa//.95:4607-4612(1998).HoshidaT,SunamuraM,DudaDQEgawaS,MiyazakiS,ShinehaR,HamadaH,OhtaniH，SatomiS,MatsunoS.Genetherapyforpancreaticcancerusinganadenovirusvectorencodingsolubleflt-1vascularendothelialgrowthfactorreceptor.尸awcreas1.2002Aug;25(2):l11-21.Hu,S,LShively，ARaubitschek,MSherman,LEWilliams,JYWong，JEShivdy,andAMWilMinibody:Anovelengineeredanti-carcinoembryonicantigenantibodyfragment(single-chainFv-CH3)whichexhibitsrapid,high-leveltargetingofxenografts.199656:3055-3061.Hudson,PJ.&Souriau，C.Recombinantantibodiesforcancerdiagnosisandtherapy.ficpeW脂77^.1,845-855(2001).HudsonPJ,SouriauC.Engineeredantibodies.AtoMe<i.2003Jan;9(1):129-34.HungMC,HortobagyiGN,UenoNT.DevelopmentofclinicaltrialofE1AgenetherapytargetingHER墨2/neu隱overexpressingbreastandovariancancer.Xc/v_&cpMed2000;465:171-80.Jain,R.K.Transportofmoleculesacrosstumorvasculature.CawcerAfe/"sfa57、Jev.6:559-593(1987).Jain,R.K.Deliveryofmolecularmedicinetosolidtumors.5Wewce271:1079-1080(1996).Jain，R.K.TheEugeneM,LandisAwardLecture1996:Deliveryofmolecularandcellularmedicinetosolidtumors,M/crac/n:w/ariow4:1-23(1997).Jain,R.K.Deliveryofmolecularandcellularmedicinetosolidtumors.乂Cow/ro/.53,49-67(1998).Jain,R.K.Deliveryofmolecularandcellularmedicinetosolidtumors.Jc/v.Z)e//v.及ev.46:149-68(2001).James,M,B.,Giorgio,T.D.Nuclear-associatedplasmid，butnotcell-associatedplasmid,iscorrelatedwithtransgeneexpressioninculturedmammaliancells.Mol.Ther.1:339-346(2000).Jones，P.T"Dear,P.H.，F(xiàn)oote,J-，Neuberger，M.S.&Winter,G,Replacingthecomplementarity-determiningregionsinahumanantibodywiththosefromamouse.Atowre321,522-525(1986).KaetzelCS,BlanchVJ,HempenPM,PhillipsKM,PiskurichJF,YoungmanKRThepolymericimmunoglobulinreceptor:structureandsynthesis,5/oc/2e附5bc7>"/125:475A80(1997).59Kanke，M.,Sniecinski,L.，&DeLuca,P.P.Interactionofmicrosphereswithbloodconstituents.I.Uptakeofpolystyrenespheresbymonocytesandgranulocytesandeffectonimmuneresponsivenessoflymphocytes.J尸are她5W.7fec/wo/.37:210-217(1983》Kapoor,T.M.,Mayer，T.U.,Coughlin,M丄.,Mitchison,T丄Probingspindleassemblymechanismswithmonastrol，asmallmoleculeinhibitorofthemitotickinesin,Eg5.JO//150:975-988(2000).KarpovskyB，TitusJA，StephanyDA，SegalDM.Productionoftarget-specificeffectorcellsusinghetero-cross-linkedaggregatescontaininganti-targetcellandanti-Fcgammareceptorantibodies.JE^M^f.160:1686-701(1984).Katabi""/.，"HexokinaseTypeII:ANovelTumorSpecificPromoterforGene-TargetedTherapyDifferentiallyExpressedandRegulatedinHumanCancerCells,"Gewer旨，10:155(1999).Kelsey"Species-andtissue-specificexpressionofhumanalpha1-antitrypsinintransgenicmice,"G^wesam/Z)ew/.1:161(1987).Kerema/,,"Identificationofthecysticfibrosisgene:geneticanalysis,"Sc/ewce245:1073(1989).King，L,etal.Tumor-targetedSalmonellaexpressingcytosinedeaminaseasananticanceragent.//證G潔n13:1225隱1233(2002).KleeffJ，F(xiàn)ukahiK5LopezME，F(xiàn)riessH,BuchlerMWSosnowskiBAKorcM.TargetingofsuicidegenedeliveryinpancreaticcancercellsviaFGFreceptors.TT^r.2002Jun;9(6):522-32.Klemm，A.R.Effectsofpolyethylenimineonendocytosisandlysosomestability,^/oc/zew.尸/7aw"c0/.56:41A6(1998),Knappik,A.a/.Fullysynthetichumancombinatorialantibodylibraries(HuCAL)basedonmodularconsensusframeworksandCDRsrandomizedwithtrinucleotides.MoZ296，57-86(2000).Konerding,M.A.,Miodonski，AJ.,Lametschwandtner,A.Microvascularcorrosioncastinginthestudyoftumorvascularity:areview.5tfl朋/wgM/cmsr.9:1233-1243(1995).60KostelnySA,ColeMS,TsoJY.Formationofabispecificantibodybytheuseofleucinezippers.J/mmwwo/.1992Mar1;148(5):1547-53.Kreiss,P"Cameron，B.,Rangara，R.,Mailhe,P"Aguerre-Charriol,O.,Airiau,M.,Scherman,D.，Crouzet,J.，Pitard，B.PlasmidDNAsizedoesnotaffectthephysicochemicalpropertiesoflipoplexesbutmodulatesgenetransferefficiency.7Viwe/e/c^4c/(iy7fe義27:3792-3798(1999).KuraneW"TargetedGeneTransferforAdenocarcinomaUsingaCombinationofTumorspecificAntibodyandTissue-specificPromoter,"JQmcer89:1212(1998).LederWa/""Consequencesofwidespreadderegulationofthec-mycgeneintransgenicmice:multipleneoplasmsandnormaldevelopment,"CW/45:485(1986).Lee,K-D,OhY,Portnoy,D，"a/"DeliveryofmacromoleculesintocytosolusingliposomescontaininghemolysinfromListeriamonocytogenes.JCT^w.271:7249-7252(1996).Lee，C.H.,Wu，C.L,andShiau,A.L.(2005a).EndostatingenetherapydeliveredbySalmonellacholeraesuisinmurinetumormodels.JGeweMed6:1382-1393.Lee,C.H.,Wu,C.L.,andShiau,A.L.(2005b).SystemicadministrationofattenuatedSalmonellacholeraesuiscarryingthrombospondin-1geneleadstotumor-specifictransgeneexpression,delayedtumorgrowthandprolongedsurvivalinthemurinemelanomamodel.QmcerGewe77^.12:175—184.Lemmon,M丄,vanZijl,R，F(xiàn)ox,M.E.,aZ.，Anaerobicbacteriaasagenedeliverysystemthatiscontrolledbythetumormicroenvironment.Ge/e77era,8:791-796(1997).Less,J.R.,Skalak,T.C.,Sevick,E.M.,Jain,R.K.Microvasculararchitectureinamammarycarcinoma:branchingpatternsandvesseldimensions.C"/cer51:265-273(1991).Less,J.R.，Posner,M.C.,Boucher,Y"Borochovitz,D.,Wolmark，N.,Jain，R.K.Interstitialhypertensioninhumanbreastandcolorectaltumors.Qmcer52:6371-6374(1992).Less,J.R.,Posner,M.C.，Skalak，T.C.，Wolmark，N.，Jain,R.KGeometricresistanceandmicrovascularnetworkarchitectureofhumancolorectalcarcinoma.M/crac7>rw/"/icm4:25-33(1997).Li,X.,Fu,G-F"Fan,Y-R.，"Bifidobacteriumadolescentisasadeliverysystemofendostatinforcancergenetherapy:selectiveinhibitorofangiogenesisandhypoxictumor61growth.Ca"cw7Tzer.10:105-111(2003).Liu,Q.,Muruve,D.A.Molecularbasisoftheinflammatoryresponsetoadenovirusvectors.Gewe77zw.10:935-940(2003).Liu,S-C,Minton，N.P.,Giaccia,A丄,Brown,J.M.Anticancerefficacyofsystemicallydeliveredanaerobicbacteriaasgenetherapyvectorstargetingtumorhypoxia/necrosis.Gewe77^.9:291-296(2002).Lorenzi,G.L.,Lee，K.D.EnhancedplasmidDNAdeliveryusinganionicLPDIIbylisteriolysinOincorporation./GeweAfefif.7:1077-1085(2005).LowKBIttensohnM，LeT,Wa/.LipidAmutantSalmonellawithsuppressedvirulenceandTNFinductionretaintumor-targetinginvivo.jVa/歷她c/zwo11999;17:37-41.LuoX,LiZ,LinS,Wa/.AntitumoreffectofVNP20009,anattenuatedSalmonella,inmurinetumormodels.0腳/i".2001;12:501—508.MacDonalda/""ExpressionofthepancreaticelastaseIgeneintransgenicmice,"http://e—/ogy7:425(1987).Maeda,H.Theenhancedpermeabilityandretention(EPR)effectintumorvasculature:thekeyroleoftumor-selectivemacromoleculardrugtargeting,jfifuAegwl41:189-207(2001).Maeda,H.&Matsumura,Y.Tumoritropicandlymphotropicprinciplesofmacromoleculardrugs.Tev.77^:i>wgOrnw6,193-210(1989).Marsh,M.&A.M.Helenius,A.M.Virusentryintoanimalcells.Jc/v.36:107-151(1989).Marshall.Carcinoembryonicantigen-basedvaccines.Sew/".Owco/.2003Jun.;30(3Suppl.8):30-36.MasonWa/""Thehypogonadalmouse:reproductivefunctionsrestoredbygenetherapy,"234:1372(1986).Mayer,T.U.,Kapoor,T.M.，Haggarty,SJ.，King,R.W"Schreiber,S丄.,Mitchison，TJ.Smallmoleculeinhibitorofmitoticspindlebipolarityidentifiedinaphenotype-basedscreen.5Wewce286:971-974(1999),Menard,R.,Dehio,C.&Sansonetti,PJ.Bacterialentryintoepithelialcells:theparadigmof幼扭〃a.7>^feM/cra歸.4:220-226(1996).Meyer，K.，Uyechi，L.S.&Szoka，F(xiàn).CJ.Manipulatingtheintracellulartraffickingofnucleicacids，in:K丄.Brigham(Ed.),GeneTherapyforDiseasesoftheLung,MarcelDekkerInc，NewYork,pp,135-180(1997).Minton,N.P"Mauchline,M丄.,Lemmon,M丄etal.Chemotherapeutictumourtargetingusingclostridialspores.F五MSMZc油'o/.Rev.17:357-364(1995).Monack,D.M.,Raupach,B.,Hromockyj,A.E.,Falkow，S,Sa/mowe//"/^p/z/附wr/w/winvasioninducesapoptosisininfectedmacrophages.Ato/.93:9833-9838(1996),Morton&Potter,"Rhabdomyosarcoma-specificexpressionoftheherpessimplexvirusthymidinekinasegeneconferssensitivitytoganciclovir,"JP/"r附aco/ogyc&Ex/^k77^m戸"b286:1066(1998).Mui，B.,Ahkong,Q.,Chow,L&Hope,M.Membraneperturbationandthemechanismoflipid-mediatedtransferofDNAintocells.所oc/n'm.所op/^s.爿c^r1467:281-292(2000).Nakai，T"Kanamori,T"Sando，S,&Aoyama^Y.Remarkablysize-regulatedcellinvasionbyartificialviruses.Saccharide-dependentself-aggregationofglycovirusesanditsconsequencesinglycoviralgenedelivery.J爿附.C7^肌125:8465-8475(2003).Nettelbeck,D.M.,Miller,D.W.,Jerome,V.，Zuzarte,M.,^Watkins,S.J.,Hawkins，R.E.,Muller，R.&Kontermann,R.E.Targetingofadenovirustoendothelialcellsbyabispeciftcsingle-chaindiabodydirectedagainsttheadenovirusfiberknobdomainandhumanendoglin(CD105》Afo/,77^r3:882-891(2001).Niethetal.,i^朋Ze脅s,545:144-50(2003).NuytsS，MellaertIV，TheysJ5Landuyt^V,LambinP,AnneJ.Clostridiumsporesfortumor-specificdrugdelivery.QmcwZ)rwgs.2002a;13:115—125.NuytsS,VanMellaertL,TheysJ，Wa/.Radio-responsiverecApromotersignificantlyincreasesTNFaproductioninrecombinantClostridiaafter2Gyirradiation.GeweT7^尸"^y.2002b;8:1197-1201.Ogris.M.&Wagner,E.Targetingtumorswithnon陽viralgenedeliverysystems.DragZfcc騰/77b—7:479-485(2002).Osaki,F.,Kanamori,T"Sando,S.，Sera，T.&Aoyama,Y.Aquantumdotconjugatedsugarballanditscellularuptake.Onthesizeeffectsofendocytosisinthesubviralregion.爿m.C7zew.126:6520-6521(2004).Osbourn,J.,Jermutus，L.,Duncan,A.Currentmethodsforthegenerationofhumanantibodiesforthetreatmentofautoimmunediseases.i>wg￡)e//ve/yTfec/z8:845-851(2003).PackP，PluckthunA.Miniantibodies:useofamphipathichelicestoproducefunctional,flexiblylinkeddimerl.cFvfragmentswithhighavidityinEscherichiacoli.5zoc/zem/5t^K1992Feb18;31(6):1579-84.PagliaP，TerrazziniN,SchulzeK,GuzmanCA,ColomboMR7wv/vocorrectionofgeneticdefectsofmonocyte/macrophagesusingattenuatedSalmonellaasoralvectorsfortargetedgenedelivery.G匿7:1725-1730.PawelekJM，LowKB5BermudesD.Tumor-targeted5"a/,we//"asanovelanticancervector.Omceri^1997;57:4537-4544.PawelekJ,LowKIB，BermudesD.Bacteriaastumourtargetingvectors.丄awce/(9wco/2003;4:548-556.PerrottaandBeen,5/oc/^w.，31:16(1992).PetersonHI，AppelgrenL:Tumourvesselpermeabilityandtranscapillaryexchangeoflargemoleculesofdifferentsize.所Z)Mwaf1911,15:262—265.Pikaaretal.,J:碌".Z)Ay.172:481(1995).Pinkerta/，"Analbuminenhancerlocated10kbupstreamfunctionsalongwithitspromotertodirectefficient,liver-specificexpressionintransgenicmice,"Gewes"wc/Z)eve/.1:268(1987).PlaitJ,SodiS,KelleyM,WAntitumoureffectsofgeneticallyengineeredSalmonellaincombinationwithradiation.JQmcer.2000;36:2397-2402.64Prasher"a/,"UsingGFPtoseethelight,"75Tw^yG^/^/ay11:320(1995》Ragheb"a/，"Inhibitionofhumanimmunodeficiencyvirustype1byTat/Rev墨regulatedexpressionofcytosinedeaminase,interferonalpha2,ordiphtheriatoxincomparedwithinhibitionbytransdominantRev，"T/w附.Gewe7Tzer，10:103(1999).ReadheadWa/""Myelindeficientmice:expressionofmyelinbasicproteinandgenerationofmicewithvaryinglevelsofmyelin,"Ce//48:703(1987).RidgwayJB,PrestaLG，CarterP.'Knobs-into-holes'engineeringofantibodyCH3domainsforheavychainheterodimerization./Vo/^/w1996Jul;9(7):617-21.Riechmann,L.,Clark,M,，Waldmann，H.&Winter,G.Reshapinghumanantibodiesfortherapy,胸wre332,323-327(1988).Riezman，7>^/<iyCW/5/o/o肌3:330(1993).Riordand"Identificationofthecysticfibrosisgene:cloningandcharacterizationofcomplementaryDNA,"5We"ce245:1066(1989).Rommens"Identificationofthecysticfibrosisgene:Chromosomewalkingandjumping,"SWe騰245:1059(1989).Rosenberg,S.A.，Spiess，P.M.,andKleiner，D.E,AntitumoureffectsinmiceoftheintravenousinjectionofattenuatediS^//woe//"/)^/n7wwnw附.乂Tmmwwc^/^r.25:218-225(2002).Rossietal.，爿^fai,arc/zaw<ii/謂awiCrovims^，8:183(1992)Ruiz,F.E.，Clancy,J.P"Perricone,M.A.,Bebok,Z.,Hong，J.S.,Cheng，S.H.,Meeker,D.P"Young,K.R.,Schoumacher,R.A.,Weatherly，M.R.，Wing,L.,Morris,J.E.,Sindel,L.，Rosenberg,M.,vanGinkel,F.W"McGhee，J.R,，Kelly,D.，Lyrene，R,K.,Sorscher,E丄Aclinicalinflammatorysyndromeattributabletoaerosolizedlipid-DNAadministrationincysticfibrosis.H諷G瘡rW.12:751—761(2001).SalomonDS,BrandtR,CiardielloF,NormanxioN.Epidermalgrowthfactor-relatedpeptidesandtheirreceptorsinhumanmalignancies.CWYievOwco///e附她/1995,19,183-232.Sandvig&Deurs,7)^^&Ce〃說o/ogy,4:275(1994).Saville&Collins,Ce〃,61:685-96(1990).Saville&Collins,iWAS(m4人88:8826-30(1991).Scheule,R.K.TheroleofCpGmotifsinimmunostimulationandgenetherapy.爿c/vi>wgDe/zV.44:119-134(2000).Seth,P"Willingham,M.C.&Pastan,I.BindingofadenovirusanditsexternalproteinstoTritonX-l14.DependenceonpH./及W.C/ze附.260:14431—14434(1985).Seymour,L.W.Passivetumortargetingofsolublemacromoleculesanddrugconjugates.O".77e/:DragC頻er扭9，135-187(1992).Shangara"a/""Suicidegenes:past,presentandfutureperspectives,"/w/wwwo/ogyroc/aj;21:48(2000).Shaw&Griffen,AWwe289:409(1981).Sheets,M.D.Wfl/.Efficientconstructionofalargenonimmunephageantibodylibrary:theproductionofhigh-affinityhumansingle-chainantibodiestoproteinantigens.Ato/乂cad脂95,6157-6162(1998).Simoes,S.,Pedro,P.,Duzgunes,N.&PedrosadeLima,M.Cationicliposomesasgenetransfervectors:barrierstosuccessfulapplicationingenetherapy.Cwrr.C(pZw.Sifrw".1:147-157(1999).Singh,Transferrinasatargetingligandforliposomesandanticancerdrugs.Cwr尸/zar附Z)es.7P卯Jun;5(6):443-51.Siould,"TherapeuticsiRNAs,"!Trewcife尸/ar,co/og/ca/5We"ces,25(1):22-28(2004).Soghomonyan,S.A.,Doubrovin,M.,Pike，J.,Luo,X.,Ittensohn,M.,Runyan,J.D.,Balatoni，J.,Finn,R.,Tjuvajev,丄G"Blasberg,R.,andBermudes,D.Positronemissiontomography(PET)imagingoftumor-localizedexpressingHSVl-TK.Ca"cerGewe77^.12:101-108(2005).Sonawane,N.,Szoka,F丄&Verkman,A.ChlorideaccumulationandswellinginendosomesenhancesDNAtransferbypolyamine-DNApolyplexes./C7e柳.278:44826-44831(2003).66<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>targeting.乂/附膽wo/.MW/zoiis*248，47—66(2001).Tomlinson,I.&Holliger,P.Methodsforgeneratingmultivalentandbispecificantibodyfragments.五wz拜o/.326,461-479(2000).Vaughan,T.J.etal.Humanantibodieswithsubnanomolaraffinitiesisolatedfromalargenon-immunizedphagedisplaylibrary.TVa/^w14，309-314(1996).Vaughan,T.丄，Osbourn，J.K.&Tempest,P.R,Humanantibodiesbydesign.7Va/w"歷她c/zwo/.16,535-539(1998).Verhoeyen,M.,Milstein,C.&Winter,G.Reshapinghumanantibodies:graftinganantilysozymeactivity.5We腳239,1534—1536(1988).Wakimoto,H.,Johnson,P.R.，Knipe,D.M.，Chiocca,E.A.(2003)Effectsofinnateimmunityonherpessimplexvirusanditsabilitytokilltumorcells.Gewe77^.10:983-990(2003).Warren，B.A.Thevascularmorphologyoftumors.TumorBloodCirculation:Angiogenesis,VascularMorphologyandBloodFlowofExperimentalandHumanTumors.EditedbyPetersonH-I.BocaRaton,CRCPress,Inc.,pp148(1979).Wattiaux,R.,Laurent,N.，Wattiaux-DeConinck,S.&Jadot,M.Endosomes,lysosomes:theirimplicationingenetransfer.」<iv.Z>n/gZ)e/zv.iev.41:201-208(2000).Weiss.S.&Chakraborty,T,Transferofeukaryoticexpressionplasmidstomammalianhostcellsbybacterialcarriers.Cwt:Cjp/w.祝她c/zw/.12:467~472(2001).Whitmore，M.，Li,S.,Huang,L.LPDlipopolyplexinitiatesapotentcytokineresponseandinhibitstumorgrowth.Gewe77ier.6:1867-1875(1999).Whitmore,M.M.,Li,S.,FaIo5L.,Jr，Huang,L.SystemicadministrationofLPDpreparedwithCpGoligonucleotidesinhibitsthegrowthofestablishedpulmonarymetastasesbystimulatinginnateandacquiredantitumorimmuneresponses.Cawcer/mwwwoZ.50:503—514(2001).Wickham,TJ.,Segal,D.M.,Roelvink，P.W"Carrion,M.E.,Lizonova，A.，Lee,GM,&Kovesdi，I.Targetedadenovirusgenetransfertoendothelialandsmoothmusclecellsbyusingbispecificantibodies.乂Fra/.70:6831-6838(1996).Wright&Jong，Ex戸/附e齒/她A"163:1245(1986).Wrobel，I.&Collins，D.Fusionofcationicliposomeswithmammaliancellsoccursafterendocytosis.5/0//z3^.爿"a1235:296-304(1995).Wu,W"/.,Om,M,63:1515-19(2003).Xu，Y.&Szoka，F(xiàn).C.MechanismofDNAreleasefromcationicliposome/DNAcomplexesusedincelltransfection.5zoc/^附.,35:5616-5623(1996》Yagueetal.，G匿T7z冊，11:1170-74(2004).Yamada，H.,Matsumoto,S.，Matsumoto,T"Yamada，T"andYamashita,U.MurineIL-2secretingrecombinantBacillusCalmette-GuerinaugmentsmacrophagemediatedcytotoxicityagainstmurinebladdercancerMBT-2.J!f/ra/.164:526—531(2000).YazawaK,FujimoriM,AmanoJ,KanoY,TaniguchiS.5zydo6ac^n'wm/o;gwmasadeliverysystemforcancergenetherapy:Selectivelocalizationandgrowthinhypoxictumors.Qmcer77^r2000;7:269-274.YazawaK，F(xiàn)ujimoriM,NakamuraT,da/.Bzydo6""enwm/ozgw附asadeliverysystemforcancergenetherapyofchemicallyinducedratmammarytumors.Sretx^C"wceries7>^"/.2001;66:165-170.Yazawae/1a/.，"Currentprogressinsuicidegenetherapyforcancer，"附rWJ!26:783(2002).Yew,N.S.,Wang，K.X"Prz勿lska，M.,Bagley,R.G"Stedman,M.,Marshall,J.,Scheule,R.K"Cheng,S.H.ContributionofplasmidDNAtoinflammationinthelungafteradministrationofcationiclipid:pDNAcomplexes.他附.GeweTTzer.10:223-234(1999).Yu,Y.A.,Shabahang,S.,Timiryasova,T.M,"a/.Visualizationoftumorsandmetastasesinliveanimalswithbacteriaandvacciniavirusencodinglight-emittingproteins.Ato.歷她c/mo/.22:313-320(2004).Yuan,F.,Le皿ig,M.,Huang,S.K"Berk,D.A.,Papahadjopoulos,D.&Jain,R.K.Microvascularpermeabilityandinterstitialpenetrationofstericallystabilized(stealth)liposomesinahumantumorxenograft.Cawceries1.54,3352-3356(1994).69Yuan,F.,Dellian,M.，F(xiàn)ukumura,D.,Leunig,M.,Berk,D.,Torchillin,V.&Jain,R.Vascularpermeabilityinahumantumorxenograft:molecularsizedependenceandcutoffsize.Qwceri仏55:3752-3756(1995).Yuhua,L.，Kunyuan,G"Hui，C5etal.Oralcytokinegenetherapyagainstmurinetumorusingattenuated>S<3/wo"e//a(yp/n'mwn'wm./"f.Cancer94:438-443(2001).Zelphati,O.&Szoka,F.Intracellulardistributionandmechanismofdeliveryofoligonucleotidesmediatedbycationiclipids.ZVz"nw.13:1367—1372(1996).Zelphati,O.&Szoka,F.Mechanismofoligonucleotidereleasefromcationicliposomes.尸rac.扁v4a^5W.A93:11493-11498(1996).Zhao,Y.,Zhu,L.,Lee,S.,Li,L.,Chang,E.,Soong,N.W"Douer，D.&Anderson,W.F.Identificationoftheblockintargetedretroviral-mediatedgenetransfer.ZVoc.jVa"^cadSd.96:4005-4010(1999).Zhou,X"Mantis,N.,Zhang,X.R"Potoka,D.A"Watkins,S.C"andFord,H.R.Salmonellatyphimuriuminducesapoptosisinhumanmonocyte-derivedmacrophages.M'craZ)/。/im扁朋/.44:987-995(2000).ZiadyAG5PeralesJC，F(xiàn)erkolT,GerkenT,BeegenH，PerlmutterDH,DavisPB.Genetransferintohepatomacelllinesviatheserpinenzymecomplexreceptor.■/尸/^57'o/.1997Aug;273(2Ptl):G545-52.WO81/01145WO88/07378WO95/21191WO00/67776U.S.PatentNo.4,975,278U.S.PatentNo.4,987,07170權(quán)利要求1.一種組合物，其包括(i)多個完整的死亡細菌細胞，其中的每個死亡細菌細胞包含治療性核酸、藥物或功能性核酸；和(ii)用于所述細胞的藥學(xué)上可接受的載體。2.根據(jù)權(quán)利要求l的組合物，其中所述死亡細菌細胞含有功能性核酸。3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中所述功能性核酸不含質(zhì)粒。4.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中所述功能性核酸是調(diào)節(jié)性RNA。5.根據(jù)權(quán)利要求l的組合物，其中所述組合物本質(zhì)上不含內(nèi)毒素。6.根據(jù)權(quán)利要求l的組合物，其中所述死亡細菌細胞含有藥物。7.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中所述功能性核酸靶定有助于抗藥性、凋亡抗性或瘤生成的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。8.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所述功能性核酸是靶定有助于抗藥性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄的siRNA、shRNA或miRNA。9.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所述功能性核酸是靶定有助于抗藥性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄的反義分子。10.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所述功能性核酸是靶定有助于抗藥性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄的核酶。11.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所述功能性核酸靶定P-糖蛋白、MDR-2或MDR-3的轉(zhuǎn)錄。12.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所述功能性核酸靶定MRP2、BCR-ABL、STI-571耐藥相關(guān)蛋白、肺耐藥相關(guān)蛋白、環(huán)氧合酶-2、核因子k、XRCC1、ERCC1、GSTP1、突變的p-微管蛋白或生長因子的轉(zhuǎn)錄。13.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所述功能性核酸靶定有助于凋亡抗性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。14.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述功能性核酸靶定Bcl-2、Bcl-XL、Al/Bfll、粘著斑激酶或p53蛋白的轉(zhuǎn)錄。15.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所述功能性核酸靶定有助于瘤生成的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。16.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中所述功能性核酸靶定(3-聯(lián)蛋白、PKC畫a、C-RAF、K-Ras、DP97Dead盒RNA解旋酶、DNMT1、FLIP、C-Sfc、53BPI、聚梳族蛋白EZH2、ErbBl、HPV-16E5和E7、Fortilin和MCIlP、DIP13ouMBD2、p21、KLF4、tpt/TCTP、SPK1和SPK2、P300、PLK1、Trp53、Ras、ErbB1、VEGF或BAG-1的轉(zhuǎn)錄。17.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其還包含藥物。18.根據(jù)權(quán)利要求17的組合物，其中所述功能性核酸靶定有助于對所述藥物有抗性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。19.根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中所述藥物被包裹在死亡細菌細胞中。20.根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，其中所述功能性核酸和所述藥物被包裹在相同的死亡細菌細月包中。21.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述治療性核酸序列編碼自殺基因。22.根據(jù)權(quán)利要求l的組合物，其中所述治療性核酸編碼下述基因的正鏈副本，該基因表達功能異?；蛟谒霾溉閯游锛毎幸援惓Ｋ酱嬖诘牡鞍踪|(zhì)。23.根據(jù)權(quán)利要求l的組合物，其中所述治療性核酸被包含在質(zhì)粒上，所述質(zhì)粒由多個核酸序列組成。24.根據(jù)權(quán)利要求23的組合物，其中所述質(zhì)粒包含調(diào)節(jié)元件。25.根據(jù)權(quán)利要求24的組合物，其中所述質(zhì)粒包含報道元件。26.根據(jù)權(quán)利要求l的組合物，其還包含雙特異性配體。27.權(quán)利要求26的組合物，其中所述雙特異性配體包含抗體或抗體片段。28.權(quán)利要求26的組合物，其中所述雙特異性配體包含多肽或碳水化合物。29.根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其中所述雙特異性配體包含第一個臂和第二個臂，所述第一個臂具有對細菌細胞表面結(jié)構(gòu)的特異性，所述第二個臂具有對非噬菌性哺乳動物細胞表面受體的特異性。30.權(quán)利要求29的組合物，其中所述哺乳動物細胞表面受體能夠活化所述死亡細菌細胞的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。31.根據(jù)權(quán)利要求29的組合物，其中所述細菌細胞表面結(jié)構(gòu)是在所述死亡細菌細胞表面上的脂多糖的O-多糖成分。32.權(quán)利要求29的組合物，其中所述第一個臂和所述第二個臂是單特異性的。33.權(quán)利要求29的組合物，其中所述第一個臂和所述第二個臂是多價的。34.—種組合物，其本質(zhì)上由死亡細菌細胞組成，所述死亡細菌細月包含有治療性核酸、藥物或功能性核酸。35.—種核酸遞送方法，其包括將含有由第一種核酸序列組成的質(zhì)粒的死亡細菌細胞與具有吞噬作用或內(nèi)吞作用的哺乳動物細胞接觸，使得所述死亡細菌細胞被所述哺乳動物細胞吞噬，因而所述哺乳動物細胞產(chǎn)生所述第一種核酸序列的表達產(chǎn)物。36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述哺乳動物細胞是在體內(nèi)的，而所述第一種核酸序列編碼治療性表達產(chǎn)物。37.—種核酸遞送方法，其包括將雙特異性配體與(a)含有治療性核酸序列的死亡細菌細胞和(b)非噬菌性哺乳動物細胞接觸，使得(i)所述雙特異性配體使所述死亡細菌細胞結(jié)合至所述哺乳動物細胞和(ii)所述死亡細菌細胞被所述哺乳動物細胞吞噬，所述哺乳動物細胞產(chǎn)生所述治療性核酸序列的表達產(chǎn)物。38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述哺乳動物細胞在體外。39.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述哺乳動物細胞在體內(nèi)。40.—種靶向藥物遞送方法，其包括將雙特異性配體與(a)含有藥物分子的死亡細菌細胞和(b)耙標哺乳動物細胞接觸，使得(i)所述雙特異性配體使所述死亡細菌細力包結(jié)合至所述哺乳動物細力包，(ii)所述死亡細菌細胞被所述哺乳動物細胞吞噬，和(iii)所述藥物被釋放進入所述哺乳動物細胞的細胞質(zhì)。41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述靶標哺乳動物細胞是非噬菌性細胞。42.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述藥物是化療制劑。43.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述哺乳動物細胞在體外。44.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述哺乳動物細胞在體內(nèi)。45.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述藥物被編碼在所述死亡細菌細胞內(nèi)的質(zhì)粒上。46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述質(zhì)粒包含調(diào)節(jié)元件。47.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述質(zhì)粒包含報道元件。48.—種藥物遞送方法，其包括將含有藥物的死亡細菌細胞與具有吞噬作用或內(nèi)吞作用的哺乳動物細胞接觸，使得所述死亡細菌細胞被所述哺乳動物細胞吞噬，且所述藥物被釋放進入所述哺乳動物細胞的細胞質(zhì)。49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述藥物是化療制劑。50.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述哺乳動物細胞在體外。51.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述哺乳動物細胞在體內(nèi)。52.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述藥物被編碼在所述死亡細菌細胞的質(zhì)粒上。53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述質(zhì)粒包含調(diào)節(jié)元件。54.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述質(zhì)粒包含報道元件。55.—種遞送功能性核酸的方法，其包括(a)在藥物載體中提供多個死亡細菌細胞，所述多個死亡細菌細胞中的每一個均包含(i)功能性核酸或(ii)包含編碼功能性核酸的片段的質(zhì)粒；隨后，(b)將所述多個死亡細菌細胞與靶標哺乳動物細胞接觸，使得所述哺乳動物細胞吞噬所述死亡細菌細胞，因而所述功能性核酸被釋放進入耙細胞的細胞質(zhì)。56.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述功能性核酸不含質(zhì)粒。57.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中所述功能性核酸是調(diào)節(jié)性RNA。58.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述功能性核酸由所述靶細胞表達。59.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述死亡細菌細胞含有包含調(diào)節(jié)元件的質(zhì)粒，所述調(diào)節(jié)元件可操作地連接至所述片段。60.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中所述調(diào)節(jié)元件是依賴于RNA聚合酶的啟動子。61.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中所述啟動子是RNAIII聚合酶啟動子H1或U6。62.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述死亡細菌細胞與所述哺乳動物細胞之間的接觸發(fā)生在體外。63.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述死亡細菌細胞與所述哺乳動物細胞之間的接觸發(fā)生在體內(nèi)。64.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述質(zhì)粒編碼多功能核酸。65.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中所述質(zhì)粒還包含用于每個被編碼的功能性核酸的啟動子。66.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其還包括步驟(c):將藥物遞送至所述標革巴哺乳動物細月包。67.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中所述功能性核酸靶定有助于所述藥物耐藥性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。68.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中所述藥物被包裹在死亡細菌細胞中。69.根據(jù)權(quán)利要求68的方法，其中所述功能性核酸或質(zhì)粒，和所述藥物#皮包裹在相同的死亡細菌細胞內(nèi)。70.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述死亡細菌細胞和所述靶標哺乳動物細胞之間的接觸由雙特異性配體促成。71.—種將藥物加入死亡細菌細胞的方法，其包括在含有死亡細菌細胞的胞外介質(zhì)與死亡細菌細胞細胞質(zhì)之間造成所述藥物的濃度梯度的步驟，使得所述藥物沿著所述濃度梯度移動進入所述死亡細菌細胞的細胞質(zhì)。72.—種將藥物加入死亡細菌細胞的方法，其包括以下步驟(a)在使細菌細胞轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼所述藥物的治療性核酸的條件下培養(yǎng)細菌細胞，使得所述藥物釋放進入所述細菌細胞的細胞質(zhì)，隨后(b)殺死所述細菌細胞以形成在它們的細胞質(zhì)中含有所述藥物的一個或多個死亡細菌細月包。73.死亡細菌細月包和雙特異性配體在制備藥物中的應(yīng)用，所述死亡細菌細胞含有治療性核酸、藥物或功能性核酸，且所述雙特異性配體能夠結(jié)合至所述死亡細菌細胞和革巴標非嗟菌性哺乳動物細胞，所述藥物用于通過向細胞、組織或器官給予所述藥物來治療疾病或修飾遺傳特征的方法中。74.—種純化完整的死亡細菌細胞的方法，其包括(i)殺死活細菌細胞，(ii)進行過濾以將死亡細菌細胞與污染物分開，和(iii)將所述死亡細菌細胞與游離的內(nèi)毒素分開。75.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中所述殺死是利用抗生素進行的。76.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中所述過濾包括交叉流過濾。77.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中所述過濾包括死端過濾。78.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中所述分開包括內(nèi)毒素基于抗體的螯合作用。79.根據(jù)權(quán)利要求78的方法，其中所述過濾使用約0.2)am的過濾器孔眼尺寸。80.—種制備權(quán)利要求3的組合物的死亡細菌細胞的方法，其包括將多個完整的死亡細菌細胞與功能性核酸在緩沖液中共培養(yǎng)。81.權(quán)利要求80的方法，其中所述共培養(yǎng)包括溫和的搖動。82.權(quán)利要求80的方法，其中所述共培養(yǎng)持續(xù)約0.5小時。83.權(quán)利要求80的方法，其中所述共培養(yǎng)持續(xù)約l個小時。84.權(quán)利要求80的方法，其中所述緩沖液包含緩沖液鹽。85.權(quán)利要求84的方法，其中所述緩沖液鹽為凝膠形式。86.權(quán)利要求80的方法，其中所述緩沖液包含lx磷酸緩沖液。87.權(quán)利要求80的方法，其中所述共培養(yǎng)在約4。C至約37。C的溫度進行。88.權(quán)利要求80的方法，其中所述共培養(yǎng)在約20。C至約30。C的溫度進行。89.權(quán)利要求80的方法，其中所述共培養(yǎng)在約25。C的溫度進行。90.權(quán)利要求80的方法，其中所述共培養(yǎng)在約37。C的溫度進行。91.權(quán)利要求80的方法，其中所述共培養(yǎng)包含約1(T個死亡細菌細胞。92.權(quán)利要求80的方法，其中所述共培養(yǎng)包含約107、108、109、101Q、IO11、1012或1013個死亡細菌細胞。93.權(quán)利要求80的方法，其中所述共培養(yǎng)包含約101()個死亡細菌細胞。94.根據(jù)權(quán)利要求80的方法，其中所述功能性核酸不含質(zhì)粒。95.根據(jù)權(quán)利要求94的方法，其中所述功能性核酸是調(diào)節(jié)性RNA。96.根據(jù)權(quán)利要求94的方法，其中所述功能性核酸是DNA。97.權(quán)利要求3的方法，其中所述功能性核酸是DNA。98.權(quán)利要求56的方法，其中所述功能性核酸是DNA。全文摘要一種用于靶向遞送至哺乳動物細胞的組合物，其包含完整的死亡細菌細胞，所述細胞含有治療性核酸、藥物或功能性核酸。所述靶向遞送任選地使用雙特異性配體，該配體包含具有對死亡細菌細胞表面結(jié)構(gòu)特異性的第一個臂和具有對哺乳動物細胞表面受體特異性的第二個臂，以將死亡細菌細胞靶定至特定的哺乳動物細胞，并使哺乳動物細胞內(nèi)吞所述死亡細菌細胞?；蛘?，所述遞送方法使用噬菌性哺乳動物細胞的天然能力來吞噬死亡細菌細胞，而不需要使用雙特異性配體。文檔編號A61K31/7105GK101505768SQ200780031190公開日2009年8月12日申請日期2007年6月20日優(yōu)先權(quán)日2006年6月23日發(fā)明者希曼休·布蘭巴特,珍妮弗·麥克迪爾米德申請人:因詹尼克分子遞送控股有限公司