專利名稱：：采用GM-CSF和α干擾素制成的并裝載熱處理的且殺死的癌細胞的樹突狀細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：概括地說，本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域，具體來說，涉及用于生產(chǎn)樹突狀細胞的組合物和方法，所述樹突狀細胞是采用樹突狀細胞活化因子生成的并裝載了熱處理的且殺死的癌細胞。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明描述的與癌細胞疫苗有關(guān)的背景不限制本發(fā)明的范圍。人們已經(jīng)開發(fā)出多種區(qū)分、表征和誘導免疫反應的方法。例如，在授予Engleman等的美國專利第6,821,778號中，教導了一些采用樹突狀細胞激活Y/S-T細胞受體-陽性T細胞的方法。簡言之，該專利教導了采用人樹突狀細胞提呈抗原，從而誘導抗原特異性T細胞介導的免疫反應的方法。特別地，其公開內(nèi)容包括從人血液中分離樹突狀細胞，將細胞暴露給抗原，將抗原致敏的樹突狀細胞與y/S-T細胞受體-陽性T細胞(y/S-TCR+T細胞)共培養(yǎng)以刺激抗原特異性T細胞的增殖和細胞毒性活性，所述y/5-T細胞受體-陽性T細胞獲自未激活的或弱激活的個體。據(jù)稱其中所述的樹突狀細胞抗原提呈系統(tǒng)應用范圍很廣，例如活化和擴增大量抗原特異性主要組織相容性復合物非限制性T細胞，用于對感染性疾病和癌癥的過繼細胞免疫治療(adoptivecellularimmunotherapy)。授予Gong等的美國專利第6,652,848號中還教導了另一個操作樹突狀細胞的例子，其教導了樹突狀細胞的雜種。Gong教導了包含由樹突狀細胞和非樹突狀細胞融合而形成的融合細胞的組合物，使用這些組合物的方法，以及制成樹突狀細胞雜種的方法。授予Albert等的美國專利第6,602,709號包括了使用凋亡細胞向樹突狀細胞遞送抗原以誘導或耐受(tolerization)T細胞的方法。其公開內(nèi)容教導了用于向樹突狀細胞遞送抗原的方法和組合物，這些樹突狀細胞隨后被用于誘導抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞和T輔助細胞。據(jù)稱該公開內(nèi)容提供了用于評價細胞毒性T淋巴細胞活性的分析方法。簡言之，通過凋亡細胞使抗原定向到樹突狀細胞，所述凋亡細胞可以被修飾以表達向樹突狀細胞提呈的非天然抗原。據(jù)稱樹突狀細胞被凋亡細胞激活，能夠加工抗原并提呈加工的抗原，以及誘導細胞毒性T淋巴細胞活性，也可以用于疫苗治療。授予Steinman等的美國專利第6,475,483號公開了用于體外增殖樹突的用途。據(jù)稱其公開內(nèi)容的教導中提供了生成樹突狀細胞前體的增殖性培養(yǎng)物的方法，以及在培養(yǎng)物中由增殖性樹突狀細胞前體生成成熟的樹突狀細胞的方法。成熟的樹突狀細胞培養(yǎng)物提供了生成新的T細胞依賴性抗原的有效途徑，所述T細胞依賴性抗原由樹突狀細胞修飾的抗原或抗原致敏的樹突狀細胞組成，包括微粒，其中抗原經(jīng)加工并在抗原活化的樹突狀細些抗原也可以被用于治療自身免疫性疾病，如青少年糖尿病和多發(fā)性硬化。發(fā)明概述本發(fā)明包括用于誘導樹突狀細胞(DCs)協(xié)調(diào)或調(diào)節(jié)的免疫反應的組合物和方法1，2。DCs存在于外周組織中，隨時準備捕捉抗原。當DCs成熟并向引流(draining)次級淋巴器官移動時，這些抗原隨后被加工成小肽3。在那里，DCs向初始T細胞提呈肽，這樣誘導細胞免疫反應，其涉及了T輔助細胞1(Thl)型CD4+T細胞和溶細胞的CD8+T細胞。DCs的重要性在于通過其活化初始4和記憶5B細胞的能力引發(fā)體液免疫。DCs還能夠活化天然殺傷(NK)細胞6和NKT細胞7。由于其具有多種能力，DCs能夠操縱免疫系統(tǒng)的全部要素，并因此成為接種免疫的基本靶向和工具的代表。間接體內(nèi)生成的并裝載抗原的DCs最近已經(jīng)被用作疫苗來提高免疫性8。許多在小鼠中進行的研究已經(jīng)表明裝載腫瘤抗原的DCs能夠誘導治療性和保護性抗肺瘤免疫9。被遞送到DCs上的抗原的免疫原性已經(jīng)在患有癌癥8和慢性HIV感染w的患者中表現(xiàn)出來，這樣提供了DC疫苗有效的原理驗證。識別誘導不同類型免疫反應的不同DC亞群和DC在具有調(diào)節(jié)/抑制功能的細胞擴增中的作用，為設計用于癌癥患者的更好的接種疫苗策略提供了新的待測參數(shù)。更特別地，本發(fā)明包括制備用于治療癌癥的組合物的方法，該方法通過將一種或多種樹突狀細胞與一種或多種經(jīng)過熱休克并且隨后被殺死的癌細胞一起孵育，活化一種或多種提呈一種或多種癌抗原的樹突狀細胞，并誘導T細胞活化。該方法還可以包括在誘導T細胞活化的條件下，用抗原致敏抗原提呈細胞的步驟，所述抗原包括一種或多種經(jīng)熱休克并且隨后被殺死的癌細胞的殘余物。該方法還可以包括低溫儲存一種或多種抗原提呈細胞的步驟，所述抗原提呈細胞已經(jīng)用經(jīng)熱休克并且隨后被殺死的癌細胞致敏。一種或多種抗原提呈細胞可以是將一種或多種癌癥特異性抗原提呈至一種或多種CD8+或CD4+T細胞的樹突狀細胞，所述抗原是癌細胞熱休克并且被殺死后獲得的。抗原提呈細胞可以是樹突狀細胞、單核細胞、自體細胞、異體細胞、它們的細胞片斷和/或組合。在某些例子中，一種或多種抗原提呈樹突狀細胞包括一種或多種樹突狀細胞，例如已經(jīng)被IFNa活化的單核細胞?？乖岢始毎梢杂膳cGM-CSF和IFNa—起培養(yǎng)的單核細胞獲得?？乖岢始毎睦涌梢詾楸磉_一種或多種源自黑色素瘤細胞的熱休克蛋白的抗原提呈樹突狀細胞，例如，來自患者的熱滅活黑色素瘤細胞?？蛇x擇地，一種或多種熱滅活的黑色素瘤細胞可以是與患者相同的基本細胞類型或者甚至是相同的癌細胞類型。在某些實施方案中，癌細胞為Colo829黑色素瘤細胞。在一個例子中，癌細胞是已確定的癌細胞系，例如培養(yǎng)的黑色素瘤細胞，例如Mel-2，Mel-3,Mel-4，Mel-6和/或Mel-9細胞或它們的組合。在某些實施方案中，在約38。C和46。C之間的溫度下，加熱約0.5至4小時處理癌細胞?？梢酝ㄟ^劑量為約160Gy的Y射線照射約0.5小時殺死癌細胞和/或通過加熱、循環(huán)凍融、法式細胞石皮碎(Frenchpress)、剪切、直接或間接壓縮、冷凍、破裂、干燥、化學暴露以及引起細胞死亡(而不是凋亡)的生物試劑等殺死癌細胞。本發(fā)明還包括加入一種或多種致敏的抗原提呈細胞，所述抗原提呈細胞可以包括去核的樹突狀細胞和一種或多種能夠誘導T細胞活化的熱處理的癌細胞，其被隨后被殺死的熱休克細胞致敏并經(jīng)處理用于提呈。在某些實施方案中，在至少一個選自前股部或上臂的位置皮下注射組合物。用于熱處理并殺死以制成用于提呈的抗原的癌細胞的非限制性例子可以包括來自，例如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜癌、間皮癌、尤因瘤(Ewing'stumor)、平滑肌肉瘤、才黃紋月幾肉瘤(rhabdomyosarcoma)、4黃紋肌肉瘤(rhabdosarcoma)、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、嚢腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝臟腫瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞癌、胚胎性癌、維爾姆斯癌(Wilms'tumor)、宮頸癌、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、；^果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、腦膜瘤、神經(jīng)母細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、骨髓瘤、淋巴瘤和白血病的細胞?？梢杂糜谥旅艏毎?或作為治療對象的癌可以包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜癌、間皮癌、尤因瘤、平滑月幾肉瘤、才黃紋月幾肉瘤(rhabdomyosarcoma)、4黃紋月幾肉瘤(rhabdosarcoma)、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、嚢腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝臟腫瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞癌、胚胎性癌、維爾姆斯癌(Wilms'tumor)、宮頸癌、睪丸癌、肺癌、小細月包肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、腦膜瘤、神經(jīng)母細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。另一個實施方案為制備樹突狀細胞的方法，所述樹突狀細胞通過將一種或多種單核細胞分化成一種或多種樹突狀細胞，并用抗原提呈組合物裝載一種或多種樹突狀細胞來提呈癌抗原，所述抗原提呈組合物包括一種或多種經(jīng)熱休克并被隨后殺死的癌細胞，其中一種或多種樹突狀細胞處于使一種或多種樹突狀細胞提呈組合物中的抗原的條件下。本發(fā)明的另一個方法為制備提呈黑色素瘤抗原的IFNa樹突狀細胞的方法，其中從疑似患有癌癥的患者分離一種或多種單核細胞；使一種或多種單核細l包成熟成一種或多種IFNa初于突狀細胞；以及用包含一種或多種經(jīng)熱休克并且隨后被殺死的癌細胞的抗原提呈組合物裝載一種或多種IFNa樹突狀細胞，其中負載的一種或多種IFNa樹突狀細胞能夠誘導T細胞活化并處在使得一種或多種IFNa樹突狀細胞提呈組合物中的一種或多種抗原的條件下。本發(fā)明還包括能夠誘導T細胞活化的癌特異性疫苗，包括藥學上有效量的一種或多種被活化的以提呈抗原的樹突狀細胞，其中所述樹突狀細胞提呈一種或多種抗原，所述抗原為一種或多種已經(jīng)經(jīng)熱休克并且在熱休克后被殺死的癌細胞。在一個實施方案中，癌細胞在殺死的時候已經(jīng)經(jīng)熱休克或處理并被殺死(但不是凋亡)。本發(fā)明的另一個例子為能夠誘導T細胞活化的黑色素瘤特異性疫苗，該疫苗包括藥學上有效量的一種或多種暴露于IFNa并且已經(jīng)成熟成樹突狀細胞(IFNa樹突狀細胞)的單核細胞，其負載并提呈的抗原為經(jīng)熱休克并隨后被殺死的黑色素瘤細胞，其中一種或多種IFNa樹突狀細胞在促進一種或多種黑色素瘤向T細胞提呈的條件下孵育。制備疫苗的方法還包括加入用于T細胞活化的致敏的制劑，該制劑包含一種或多種致敏的去核抗原提呈細胞。本發(fā)明的另一個實施方案包括治療疑似患有癌細胞生長的患者的方法，其中在包括抗原提呈和誘導T細胞活化的條件下，將一種或多種癌抗原裝載到活化的樹突狀細胞上，其中所述癌抗原包括已經(jīng)被熱休克并且隨后被殺死的癌細胞；以及給予有需要的患者一種或多種提呈一種或多種癌抗原以活化T細胞的樹突狀細胞。本發(fā)明的另一種方法包括治療疑似患有癌癥的患者的方法，其中分離一種或多種單核細胞，并用IFNa和GM-CSF使其成熟成成熟的含有這些細胞因子的樹突狀細胞，用包含一種或多種熱處理的癌細胞的組合物裝載一種或多種能夠誘導T細胞活化的樹突狀細胞，所述熱處理的癌細胞經(jīng)熱休克并且隨后被殺死以形成一種或多種抗原提呈樹突狀細胞；以及給予有需要的患者一種或多種抗原提呈樹突狀細胞。附圖簡述為了更完整地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點，現(xiàn)在參考附圖詳細地說明本發(fā)明，其中圖1顯示IFN-DCs有效地活化了溶細胞的CD8+T細胞。初始CD8T細胞與IFN-DCs(上面)或TNF-DCs(下面)一起培養(yǎng)5天。T細胞用抗CD8(縱坐標)和抗顆粒酶A(左)，或抗CD8(縱坐標)和抗顆粒酶B(右)染色。兩者都呈陽性CD8+T細胞的百分比。圖2顯示了IFN-DCs在體外對成熟刺激物的不同反應。暴露給所示刺激物6小時后，細胞因子向IFN-DCs的上清液分泌的歸一化表達。標尺0(藍色)-20(紅色)。所示細胞因子的多重細胞因子珠分析。對照=沒有加入活^f匕劑。圖3顯示IFN-DCs僅分泌IL-7。詳見圖1。IL-7在6小時時的分泌(縱坐標，pg/ml)。紅色柱(IFN-DCs);綠色柱(IL-4DCs)。圖4:IFN-DCs有效地交叉激活腫瘤特異性CTLs。初始CD8+T細胞暴露于裝載殺死的腫瘤細胞的IL4-DCs和IFN-DCs。兩次刺激循環(huán)之后測定CTL的功能(縱坐標)。圖5顯示IFN-DCs有效地交叉激活CTLs對抗黑色素瘤。HLA-A*0201+初始細胞CD8+T與裝載殺死的Me290黑色素瘤細胞的IFN-DCs—起培養(yǎng)。第7天刺激培養(yǎng)物生長一次，并且5天后將收獲的T細胞用于評價它們在所示的E:T比(橫坐標)下，觸發(fā)鉻從Me290細胞以及從對照K562細胞釋放的能力(縱坐標，特異性溶解)。圖6顯示IFN-DCs有效地交叉激活黑色素瘤特異性CTLs。培養(yǎng)物中四聚體特異性CD8+T細胞的出現(xiàn)頻率，所述培養(yǎng)物中含有裝載殺死的黑色素瘤細胞(Me290)或黑素細胞的IFN-DCs。HIV四聚體用作陰性對照。粗體數(shù)值表示CD8+T細胞結(jié)合四聚體的百分比。圖7顯示對黑色素瘤細胞進行熱處理增加了HSP70.SKMe128黑色素瘤細胞，它們被加熱并用BA殺死。細胞被放在多聚賴氨酸預處理的載玻片上，固定并增加其滲透性。一抗為抗HSP70Ab，二抗為Texas-Red偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG。萊卡(Leica)TCS-NTSP共聚焦顯微技術(shù)(x40)。圖8顯示熱處理的黑色素瘤細胞表現(xiàn)出免疫原性增高Me275細胞和對照K562的殺死。未裝載的DCs(CTL1),裝載對照黑色素瘤抗體的DCs(CTL2)以及裝載熱休克的黑色素瘤抗體的DCs(CTL3)。激活的第14天釋放51Cr(縱坐標)。圖9顯示熱處理的黑色素瘤細胞表現(xiàn)出免疫原性增高用四種黑色素瘤肽(4P;MART-l,gp100，酪氨酸酶和MAGE-3)的混合物或用對照PSA肽致敏的T2細胞的殺死。裝載對照黑色素抗體的DCs(CTL1)以及裝載熱休克的黑色素瘤抗體的DCs(CTL2)。"Cr釋放(縱坐標)。圖IO顯示了用裝載熱處理的殺死的黑色素瘤細胞的DC激活黑色素瘤特異性CD8+T細胞。a)2周培養(yǎng)后四聚體染色，和b)用肽致敏的DCs刺激生長一次后。參見圖7和文本。圖11顯示黑色素瘤細胞的熱處理加強了腫瘤抗原的轉(zhuǎn)錄。實時PCR:冷(無)，加熱的和加熱的+^:線菌素D處理的Me290黑色素瘤細胞。歸一化的倍數(shù)表達(縱坐標)。圖12顯示了在殺死的腫瘤細胞中，對由熱上調(diào)的MAGE-10的交叉激活。裝載未加熱的(冷的)或加熱的(熱的)殺死的黑色素瘤細胞，或者HLA-A*0201+Me290或者HLA-A*0201陰性Skmel28的DCs。2次刺激后，用肽致敏的DCs刺激HLA-A*0201+CD8+T細胞生長。流式細胞術(shù)采用MAGE10四聚體染色。結(jié)合CD3+T細胞的四聚體％。兩次研究。圖13顯示用熱處理的黑色素瘤抗體裝載DCs導致CD8+(上面)和CD4+T細胞(下面)的IL-10分泌減少，并且IFNy分泌增多。在用DCs刺激的第1輪或第2輪后的所示時間，對上清液的Luminex分析。圖14為概述本發(fā)明疫苗的全部生產(chǎn)過程的流程圖；圖15顯示了用于本發(fā)明的疫苗生產(chǎn)的詳細步驟和時間安排；圖16顯示了冷凍疫苗解凍后的形態(tài)；圖17顯示了冷凍的IFN-DC疫苗解凍后的表型；圖18為顯示冷凍疫苗解凍后的細胞因子分泌情況的圖；圖19顯示了采用MART-l肽致敏的冷凍/解凍的IFN-CDs刺激兩次后，冷凍疫苗對自體CD8+T細胞的激活，結(jié)合對照的CD8+T細胞以及MART-1特異性四聚體的百分比。發(fā)明詳述盡管下文詳細地討論了本發(fā)明的不同實施方案的形成和使用，但是應理解本發(fā)明提供了許多可應用的創(chuàng)造性概念，這些概念可以包含在大量的特定上下文中。本發(fā)明討論的特定實施方案只是說明形成和使用本發(fā)明的特定途徑，并不限制本發(fā)明的范圍。為了有助于理解本發(fā)明，下文定義了許多術(shù)語。本發(fā)明限定的術(shù)語具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常理解的含義。術(shù)語如"a","an"和"the"不意味是指僅僅單一的實體，而是包括可以用特定例子來說明的大類。本發(fā)明的術(shù)語用于描述本發(fā)明的特定實施方案，但是它們的使用并不限制本發(fā)明，除非權(quán)利要求中指出?？s寫GM-CSF:粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子；IFNa:a干擾素；LPS:脂多糖；TNF:腫瘤壞死因子；CR:完全響應；PR:部分響應；SD:穩(wěn)定疾??；PD:進行性疾病；NPD:非進行性疾??；NED:無疾病癥狀MDCs:源自單核細胞的樹突狀細胞；CTLs:細胞毒性T淋巴細胞；NK細胞天然殺傷細胞；NKT細胞自然殺傷T細胞；ND:未實施；NT:未檢測；TBD:待測的。癌癥免疫療法。有許多種改善患者對癌癥的抗性的方法。這些方法包括1)采用微生物成分或細胞因子的免疫系統(tǒng)非特異性活化；2)采用抗體和/或T細胞的抗原特異性過繼免疫治療(接種疫苗)；以及3)抗原特異性活性免疫治療(接種疫苗)?？贵w的主要局限在于靶蛋白必須在與T細胞靶點相對的細胞表面上表達，靶蛋白可以是細胞間蛋白，其肽以與MHC分子形成復合物的形式存在于細胞表面11。特定的人腫瘤抗原的識別推動了過繼性T細胞治療的發(fā)展12。然而由于接種疫苗對治療性T細胞免疫(腫瘤特異性效應器T細胞)和保護性T細胞免疫(能夠控制肺瘤復發(fā)的肺瘤特異性記憶T細胞)可預期的誘導，接種疫苗仍是最具有吸引力的方法14—16。人們已經(jīng)開發(fā)出用于患有癌癥的人的治療性接種疫苗的多種方法，包括自體的和異體腫瘤細胞(其經(jīng)常被修飾成表達不同的細胞因子)，肽，蛋白和DNA疫苗8'16—19。所有這些方法都依賴于含有宿主DCs的疫苗的隨機相遇。如果疫苗抗原未能與DCs相遇，免疫反應不能發(fā)生。此外，與非活化的DCs或"錯誤"的DCs亞群的不適合相遇會導致免疫反應沉默，這些情況可以解釋現(xiàn)有的癌癥疫苗的某些缺點。而且，還不知道為了得到適當?shù)拿庖叻磻?，如何在體內(nèi)將需要遞送的腫瘤抗原遞送到DCs。因此，人們需要基于體外生成的自體DCs的研究，在可以確立最佳接種抗癌疫苗的參數(shù)的可控條件下，用腫瘤抗原裝載所述DCs。體外生成大量自體DCs的方法的發(fā)現(xiàn)推動了釆用DCs作為疫苗的臨床研究2"23。應該被認為是改善DC疫苗接種在癌癥中的療效的參數(shù)包括DC相關(guān)因子；宿主相關(guān)因子；以及DC疫苗與其他治療的組合。下文簡單討論了兩種與DC相關(guān)的參數(shù)，即新的DC亞群和裝載腫瘤抗原的新方法。DC疫苗的參數(shù)。DC亞群GM-CSF和IL-4能夠使單核細胞分化成不成熟的DCs22",這一發(fā)現(xiàn)使我們對DC的生物學和功能的了解取得重大進展。依據(jù)Nestle等25(使用腫瘤溶解產(chǎn)物裝載的DCs)和Schuler及同事26(采用黑色素瘤-肽-裝載的DCS)在患有轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的患者中進行的開創(chuàng)性臨床研究，幾個研究機構(gòu)已經(jīng)使用IL4-DCs作為疫苗8。然而，最近的發(fā)現(xiàn)指出了替代產(chǎn)生DCs的經(jīng)典方法的新方法。例如，對于體內(nèi)誘導抗原特異性CTL分化而言，黑色素瘤-肽-致敏的IL15-DCs比IL4-DCs更有效，而它們刺激CD4+T的能力是可比的27。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)三天的培養(yǎng)物中生成的IFN-a-DCs對誘導特異性免疫有效28。因此，這些不同的DC疫苗的免疫原性保證了臨床研究中的體內(nèi)測試。抗原裝載。用源自規(guī)定的抗原的肽將I型MHC和II型MHC分子裝載到DCs上，這是DC疫苗接種中最普遍使用的方法15，29。盡管這種技術(shù)對于"概念驗證"研究是重要的，但是肽的使用還是限制了疫苗的進一步發(fā)展對特定HLA型的限制；充分表征的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)數(shù)量有限；外源性肽-MHC復合物相對快速的轉(zhuǎn)換導致在注射后DC進入引流淋巴結(jié)的時候，抗原提呈相對低；以及T細胞克隆的限制性組成成分的誘導，這樣限制了免疫系統(tǒng)控制肺瘤抗原變異的能力。許多種這樣的肽可以由天然加工的表位來區(qū)分。因此，預期用總抗原制劑裝載DCs,并且進行"天然的"加工和表位選^奪可以改善療效，并產(chǎn)生涉及多種CD4+T細胞和CTLs的免疫反應。所有這些方法都用重組蛋白、外來體，病毒載體31、質(zhì)粒DNA、RNA轉(zhuǎn)染32、免疫復合物"和DC表面分子的特異性抗體15，34裝載DCs。另一種技術(shù)涉及應用DCs從吞噬的死亡腫瘤細胞上將肽提呈到I型MHC分子(以及II型MHC分子)的能力。這被稱之為交叉激活35'36。實際上，與殺死的異體黑色素瘤、前列腺癌或乳腺癌細胞系一起培養(yǎng)的DCs以腫瘤抗原體外激活初始的CD8+T細胞36'37。20名患有轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的患者已經(jīng)在BIIR接種疫苗，以接觸(datew池)先前暴露于殺死的異體黑色素瘤細胞系的源自自體單核細胞的DCs(每個月接種疫苗8次)。免疫接種已經(jīng)被證明是安全的(無自體免疫或其它不良事件)，并且能夠誘導黑色素瘤特異性T細胞免疫。在兩名患者中，已經(jīng)觀察到長期的腫瘤消退。這些結(jié)果為證明疫苗制劑方法效力的更大型臨床研究提供了保證。GM-CSF和IFNa誘導的樹突狀細胞疫苗。幾項IFN生物學方面的最新發(fā)現(xiàn)重新激發(fā)了免疫學家對該類分子的興趣。這些發(fā)現(xiàn)包括1)證實漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs,人和鼠DCs的亞群)迅速分泌大量I型IFNs以響應病毒信號74;2)IFNa/卩活化不成熟的髓系DCs"和誘導單核細胞分化成DCs28'76的能力；3)IFNa/卩在生成記憶CD8+T細胞中的活性77'78以及對抗體反應的刺激5'79，8();4)IFNa/卩在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機理中的核心作用81，82;5)少量IFNa/卩的分泌加速了免疫系統(tǒng)的工作，正如IFNa/(3在LPS信號傳導和感染性休克發(fā)展中的重要作用所表明的83。本發(fā)明人最近認識到IFNa對于引發(fā)針對流感病毒的人特異性體液反應4艮重要的5。這就存在這樣的可能性，即IFNa可能強化CTLs的生成，最特別是被定向針對于肺瘤抗原的那些。IFN-DCs有效地活化了溶解細胞的CD8+T細胞通過將單核細^^與GM-CSF和IFNa(IFN-DC)—起培養(yǎng)，由單核細胞制備DC疫苗，通過將單核細胞與GM-CSF和TNF(TNF-DCs)，或者IL-4(IL4-DCs)—起培養(yǎng)制備兩種已有的產(chǎn)品，即DC疫苗，比較它們的生物學性質(zhì)。異體CD8+T細胞與每種DC亞群一起培養(yǎng)5天，然后通過細胞分類再純化并通過流式細胞術(shù)分析。令人驚訝的是，結(jié)果表明IFN-DCs能夠誘導CD8+T細胞，如顆粒酶A和B(圖1)和穿孔素(未顯示)的溶解細胞的T細胞分子表達相當高。IFN-DCs對成熟刺激物的響應不同為了進一步表征IFN-DCs在癌癥疫苗中的作用，在體外暴露于不同活化信號的IFN-DCs中分析細胞因子生物標記，活化信號包括CD40配體、離子霉素和TLR配體，如LPS(TLR4),聚I:C(TLR3)和酵母聚糖(TLR2)。通過將純化的單核細胞與GN-CSF和重組的人IFNa2a—起培養(yǎng)制備IFN-DCs,將IFN-DCs暴露于不同的刺激物，細胞因子/趨化因子分泌到培養(yǎng)物上清液中，在不同的時間點使用多細胞因子珠(Multiplexcytokinebeads,Luminex)4全測。初步分析表明在暴露的48小時中，分泌細胞因子的情況未發(fā)生顯著變化(未顯示)。如圖2所示，LPS引發(fā)主要的細胞因子反應，之后是聚I:C和離子霉素引發(fā)的。暴露于CD40配體或酵母聚糖時，僅誘導少量細胞因子分泌。這些初步結(jié)果表明不同的活化信號引發(fā)IFN-DCs中不同的細胞因子標記。IFN-DCs只分泌IL-7，即T細胞生長因子單一的細胞因子分析7見察到IFN-DCs自發(fā)地分泌可^r測到的量的IL-7(圖3),而未活化的IL4-DCs卻不能如此。然而，用已知信號活化IL-4DCs從而活化I型干擾素途徑(脂多糖(LPS)和聚I:C)，而不采用CD40配體或酵母聚糖，導致IL-7分泌的誘導(圖3)。這些結(jié)果形成了兩個關(guān)于T細胞活化的重要結(jié)論1)IFN-DCs分泌的IL-7對于IFN-DCs激活初始CD8+T細胞的較強能力起到作用，以及2)I型干擾素似乎是通過髓系DCs調(diào)節(jié)IL-7的分泌。IFN-DCs有效地交叉激活腫瘤特異性CTLs:為了確定IFN-DCs是否真正在刺激CTLs中更有效，用殺死的黑色素瘤或乳腺癌細胞裝載DCs，并隨后用于在2個培養(yǎng)周期中激活純化的CD8+T細胞。觀察到IFN-DCs比IL4-DCs更有效地激活CTLs，所述CTLs具有殺死癌細胞的能力(圖4)。為了評價IFN-DCs激活初始CD8+T細胞的能力，我們使用我們之前確立的針對腫瘤抗原的體外激活系統(tǒng)。在這種情況下，DCs裝載了殺死的異體肺瘤細胞并且被用于激活經(jīng)兩周培養(yǎng)的自體初始CD8+T細胞。如圖5所示，裝載殺死的異體HLA-A*0201+Me290黑色素瘤細胞的IFN-DCs具有殺死用于免疫的Me290細胞的能力，對刺激CTLs非常有效。四聚體特異性T細胞分析進一步證實了黑色素瘤特異性CD8+T細胞的存在。如圖6所示，得到的CD8+T細胞包含MART-1特異性T細胞的亞群。因此，IFN-DCs已經(jīng)在交叉激活初始CD8+T細胞分化成腫瘤抗原特異性CTLs中顯示出高效率。提示該發(fā)現(xiàn)可用于高治療性癌癥疫苗。因此，IFN-DCs在誘導肺瘤特異性免疫中更有效，這為在臨床應用中驗證其在患者體內(nèi)的活性提供了保證。用于裝載DC疫苗的高免疫原性殺死的腫瘤細胞的生成。高體溫在癌癥治療中的應用，或者單獨使用或者作為放療的佐劑，多年來一直是臨床感興趣的目標84。高體溫與放療和/或放射免疫治療(綜述85，86)的組合看起來特別有效。高體溫導致放射敏感的分子機理還不清楚，然而早期響應基因和熱休克因子(HSFs)的活化，以及隨后的熱休克蛋白(HSPs)可能在這一事件中起到作用87。HSPs是不同蛋白的超家族，根據(jù)它們的分子量適當?shù)孛?，例如hsp70。大多數(shù)HSPs是組成性表達的，并且在應激條件下被進一步誘導，包括溫度升高。HSPs被認為是從肽在細胞溶質(zhì)中生成到肽與ER中的I型MHC結(jié)合的過程中陪伴肽的分子繼電線路(relayline)88，89。最近，已經(jīng)將HSP70、HSP60和GP96確認為與抗原性蛋白或肽一起用于交叉激活的免疫佐劑9°'91。在這個過程中，重組合的hsp或gp96肽復合物被抗原提呈細胞(APCs),包括DCs，通過受體介導的經(jīng)由CD9192、CD4093、L0X-1^或TLR2/4"的胞吞作用而內(nèi)化。因此，本發(fā)明人認識到高體溫能夠增強交叉激活，并由此有助于能夠增加腫瘤消退的疫苗的生產(chǎn)。加熱的黑色素瘤細胞。目前研究的目標已經(jīng)成為制備改變的胂瘤細胞抗體，該抗體具有高免疫原性，并且可用于裝載用于接種疫苗的DCs。因此，在已經(jīng)確立了過表達HSP70的黑色素瘤細胞系實際上更具有免疫原性(未顯示)的前提后，本研究的重點現(xiàn)在轉(zhuǎn)向開發(fā)在臨床級條件下增加HSP表達的方法上來。因此確定了熱處理黑色素瘤細胞是否能夠提高負載的DCs的免疫原性。對黑色素瘤細胞的熱處理增加了HSP70:將黑色素瘤細胞在42°C下孵育4小時(熱休克)。通過ELISA(未顯示)或細胞外染色(圖7)分析HSPs的表達，正如所料，HSP70顯著上調(diào)85。通過樺木酸(BA)誘導，由未處理的或熱休克處理的細胞形成了殺死的黑色素瘤細胞(黑色素瘤抗體)。裝載熱處理的黑色毒瘤抗體的DCs快速產(chǎn)生能夠殺死黑色素瘤細胞的CTLs:未負載的DCs(CTL1)，裝載對照黑色素瘤抗體的DCs(CTL2)以及裝載熱休克黑色素瘤抗體的DCs(CTL3)與純化的初始CD8+T細胞一起培養(yǎng)2周。再剌激T細胞培養(yǎng)物一次(總計兩次刺激)，并在第二周添加可溶性CD40配體和低劑量IL-7(10U/ml，所有培養(yǎng)物)和IL-2(10U/ml)。在再刺激后的第7天(共計培養(yǎng)的第14天)分析T細胞。值得注意的是T細胞與裝載熱處理的Me275黑色素瘤抗體的DCs—起培養(yǎng)，但不與對照抗體一起培養(yǎng)，能夠殺死Me275細胞(圖8)。殺死是對T細胞特異性的，未發(fā)現(xiàn)K562溶解。而且，兩次刺激后，T細胞能夠殺死另一種HLA-A*0201黑色素瘤細胞系(Me290)(未顯示)，表明能夠發(fā)生針對共有抗原交叉激活。殺死是對黑色素瘤細胞特異性的，HLA-A*0201MCF7乳腺癌細胞未被溶解(未顯示)。最終，黑色素瘤細胞的殺死至少部分受到I型MHC表達的限制，用阻斷mAbW6/32的I型MHC預處理靶細胞導致在不同的E:T比下，Me275殺死的抑制率>60%(未顯示)。裝載熱休克的黑色素瘤抗體的DCs快速產(chǎn)生黑色素瘤特異性CTLs:用熱處理的黑色素瘤抗體激活的初始CD8+T細胞能夠特異性地有效殺死裝載四種黑色素瘤肽，但未裝載PSA肽的T2細胞。黑色素瘤細胞系也被破壞了，但是乳腺癌細胞系MCF7和K562未受影響(圖9)。裝載熱處理殺死的黑色素瘤細胞的DCs有效地促使初始CD8+T成為黑色素瘤特異性細月包毒性T細月包。四聚體結(jié)合分析證實了這種發(fā)現(xiàn)，并表明高達0.4%的CD8+T細胞具有對MART-1的特異性(圖10)。然而，幾乎4僉測不到其它特異性。因此，在第2次刺激后的第7天，采用經(jīng)四種黑色素瘤肽中的每一種，或者對照PSA肽致敏的自體DCs再刺激T細胞。在培養(yǎng)7天后分析這些培養(yǎng)物。結(jié)果顯示用黑色素瘤肽致敏的DCs促進生長可以擴增黑色素瘤特異性CD8+T細胞(圖10),而采用對照肽促進生長未觀察到擴增增加(未顯示)。因此，黑色素瘤細胞的熱處理導致黑色素瘤特異性反應增強。黑色素瘤細胞的熱處理增強了腫瘤抗原的轉(zhuǎn)錄。最初假設交叉激活的強化歸因于熱休克蛋白表達增強，研究表明純化的HSP70、HSP60和GP96作為免疫佐劑與抗原性蛋白或肽一起用于交叉激活9G，91，發(fā)現(xiàn)上述假設與研究相一致。然而，在對對照和HSP70轉(zhuǎn)導的Sk-Mel28細胞進行微陣列分析后，觀察到幾種包括MAGE-AIO(未顯示)的腫瘤抗原的轉(zhuǎn)錄增加。因此，通過實時PCR表達來^r測編碼MAGE肺瘤抗原家族的不同成員的12個基因。這些抗原包括MAGE-B3、MAGE-A8(圖11)、MAGE-B4和MAGE-A10(未顯示)。除對放線菌素D的敏感性之外，MAGE-B3的表達增加至1000倍，由此證明了轉(zhuǎn)錄的活化(圖11)。因此，鑒定了源自MAGE-A8和MAGE-A10的HLA-A*0201限制性肽，并進行分析以確定裝載熱處理的抗體的DCs能否激活特異性針對這兩個表位的CTLs。如圖12所示，與以未加熱的黑色素瘤細胞激活的CTLs相比，以熱HLA-A*0201+Me290或HLA-A*0201negSk-Mel28細胞激活的HLA-A*0201+CTLs表現(xiàn)出更高的MAGE-A10四聚體結(jié)合CD8+T細胞的頻率。因此，高體溫引起的腫瘤抗原轉(zhuǎn)錄增加可以歸因于交叉激活的增強。裝載熱處理殺死的黑色素瘤抗體的DCs誘導自體初始CD8+或CD4+T細胞產(chǎn)生的IFNy的水平升高，IL-10水平降低。調(diào)節(jié)/抑制T細胞被認為是成功給患者接種疫苗以對抗其癌癥的主要障礙之一。如圖13所示，當與用未加熱的腫瘤裝載的DC制備的培養(yǎng)物相比時，用熱處理殺死的黑色素瘤細胞裝載的DC疫苗使得IL-10分泌減少，且IFNy的生成增加。這些結(jié)果支持了在臨床試驗中體內(nèi)進行DC裝載的獨特方法。因此，用熱處理的并且殺死的黑色素瘤細胞裝載的DC疫苗導致廣泛的黑色素瘤特異性I型CD8+T細胞免疫性的誘導。本發(fā)明包括的自體樹突狀細胞源自具有GM-CSF和IFNy,并且裝載了殺死的異體Colo829黑色素瘤細胞的單核細胞。自體樹突狀細胞是由單核細胞生產(chǎn)的，所述單核細胞是由采血獲得的外周血單核細胞通過淘析分離出的單核細胞。在封閉的系統(tǒng)中，在粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和干擾素a(IFNa)存在下培養(yǎng)單核細胞，所述單核細胞裝載了加熱的且殺死的異體COL0829腫瘤細胞并進行深低溫保藏。疫苗儲存在液氮(蒸氣相)中。樹突狀細胞是由采血產(chǎn)品生產(chǎn)的，采用Elutra系統(tǒng)(GambroBCT)處理采血產(chǎn)品以分離出單核細胞。將單核細胞由淘析袋轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋(每袋體積100ml)，以1xl0"lml體積培養(yǎng)72小時。在這個例子中，培養(yǎng)基包括添加了重組人GM-CSF(100ng/ml;Berlex)和干擾素a2b(500IU/ml;ScheringPlough)的無血清培養(yǎng)基。然而，技術(shù)人員會知道滴加的量、細胞暴露于GM-CSF和/或a干擾素的時間點和時間長度以使活化最大化。在最初培養(yǎng)24小時后，疫苗裝載了殺死的Colo829細胞。在總計72小時的培養(yǎng)之后，收獲樹突狀細胞，用生理鹽水洗掉培養(yǎng)基和細胞因子。將細胞再懸浮在包含10%DMSO和10%Plasmalyte的自體血清中，并且以30xlO6細胞/管分配到冷凍管中。使用自動速率可控冷凍機冷凍冷凍管并儲存在液氮中(蒸氣相)。表l:生產(chǎn)步驟<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>分離。釆血一收集PBMC。使用COBESPECTRATM通過采血獲得自體外周血單核細胞。淘析一分離單核細胞。然后在GAMBROBCTELUTRAtm上從外周血單核細胞中分離單核細胞。淘析系統(tǒng)是半自動化的封閉離心系統(tǒng)，其使用連續(xù)逆流淘析技術(shù)，根據(jù)尺寸和密度將細胞分成多個組分。Elutra系統(tǒng)固有的用途是富集單核細胞。該系統(tǒng)根據(jù)尺寸和密度自動收集5種細胞組分。組分5包含富集的單核細胞群(~90%純度，n=7個的健康志愿者采血)，其被用于樹突狀細胞的生產(chǎn)。培養(yǎng)一將包含組份5的袋離心，將緩沖鹽排出并棄去。將細胞再懸浮于CellGenixDC培養(yǎng)基中，取樣進行細胞計數(shù)，確定活力和表型。一旦單核細胞的數(shù)量被確定，將細胞稀釋至濃度為1xl(^單核細胞/mL，并且無菌連接到AFCVueLife培養(yǎng)袋。加入濃度為100ng/mL的細胞因子GM-CSF(Leukine)(BerlexInc.)以及濃度為500IU/mL的IFNa-2b(INTRONA)(Schering-PloughCorp.),并將細胞置于37。C、5%C02用于培養(yǎng)的培養(yǎng)箱中。裝載一培養(yǎng)開始后24小時，加入作為抗原來源的殺死的腫瘤細胞(COL0829)以及第2劑量的GM-CSF和IFNa-2b。采用y射線按批次制備殺死的COL0829,檢測其無菌度以及無增殖能力，正如通過氘代胸腺嘧咬脫氧核苷結(jié)合所測定的，以50xl06/mL的濃度用10。/。DMSO冷凍在冷凍管中，并儲存在蒸氣相氮氣里。解凍適當數(shù)量的冷凍管，使得每2個樹突狀細胞裝載1個殺死的腫瘤細胞。殺死的COL0829用培養(yǎng)基清洗3次，并以小體積加到培養(yǎng)袋中。樹突狀細胞的收獲。培養(yǎng)開始后的72小時，收獲細胞并將疫苗深冷保藏。將培養(yǎng)袋離心，上清液擠出，用生理鹽水清洗細胞3次。清洗包括將生理鹽水袋與培養(yǎng)袋相連，在生理鹽水中再懸浮細胞，離心培養(yǎng)袋，并將生理鹽水擠到廢物收集袋中。第三次清洗后，將細胞再懸浮在作為冷凍溶液稀釋劑的Plasmalyte中。取樣用于細胞計數(shù)和確定活力。速率可控的冷凍_使用速率可控的冷凍機冷凍冷凍管。將管置于冷凍室中，液氮通過電磁閥進入冷凍室。由于蒸發(fā)幾乎是瞬時的，控制液氮進入冷凍室的速率就直接控制了熱吸收速率和從冷凍室中移出的速率以及冷凍室的內(nèi)容物。深冷保藏。以30x106細胞/mL的濃度深冷保藏細胞。一旦細胞數(shù)量確定，用自體血清將細胞稀釋至最終濃度的2倍。制備包含體積與細胞體積相等的冷凍溶液的袋子。冷凍溶液為含有20%DMSO和20%Plasmalyte的自體血清?？焖俚夭僮?，將冷凍溶液加到細胞袋中并將細胞轉(zhuǎn)移至標記的冷凍管中。DMSO的最終濃度為10%。使用自動化速率可控的冷凍才幾以rc/分鐘的速率冷凍冷凍管，并儲存在蒸氣相氮氣中。儲存一將冷凍管從速率可控的冷凍機轉(zhuǎn)移至液氮罐用于長期儲存。庫存控制由經(jīng)過GMP培訓的人員釆用數(shù)據(jù)庫來維護。表2:生產(chǎn)的檢驗批次<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>活性藥物成分的最終劑型的穩(wěn)定性。說明包含lmL深冷儲藏細胞的管在37。下迅速解凍，并立即吸入包含9mL無菌生理鹽水的注射器中(注射前細胞在臨床現(xiàn)場立即被解凍的條件)。生理鹽水為室溫或者4。C(冷藏的)。然后將細胞平均地分配到6個管中，并保持在室溫下或冷藏。然后在不同的時間點分析稀釋的細胞。表3:作為解凍后時間的函數(shù)的產(chǎn)物活力<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表4:產(chǎn)物的回收作為解凍后時間的函數(shù)的有活力的細胞(相對于冷凍前每管的細胞數(shù)量)有活力的細胞的回收％<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表5:混合的淋巴細胞與CD4+T細胞的反應中的產(chǎn)物效價<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表6:在室溫和4n下解凍時產(chǎn)物的回收和活力<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>可以接受的批次釋放結(jié)果為室溫下解凍后的15分鐘，回收至少50%的活細胞和至少50%的活力。對在冷凍過程的開始(第l)、中間(第2)和最終(第3)獲得的三個管進行釋放實驗。冷凍疫苗的表征。為了進一步表征冷凍的疫苗，除了上述用CD4+T細胞刺激MLR的活力和能力外，還可以分析一種或多種以下指標(1)形態(tài)學和表型；(2)細胞因子分泌；和/或(3)誘導自體CD8+T細胞分化的能力。圖14為概述本發(fā)明全部疫苗生產(chǎn)過程的流程圖。在步驟10中，選擇患者參與疫苗生產(chǎn)過程。在步驟12,對患者進行采血以分離用于裝載的細胞，用于裝載的細胞在步驟14中獲得并篩選。步驟10、12和14可以在第1天內(nèi)進行。在接著的幾天內(nèi)，培養(yǎng)細胞(步驟16)并用步驟16中獲得的抗原和培養(yǎng)物裝載(步驟18)，所述抗原是通過裝載抗原的樹突狀細胞提呈的。接著，在步驟20中，細胞可以被冷凍并儲存以備將來使用，和/或最后在步驟22中解凍并釋放。最終，細胞疫苗可以在步驟24中用于注射。在一個實施方案中，全部過程可以在大約IO天內(nèi)發(fā)生。圖15顯示了用于生產(chǎn)本發(fā)明的疫苗的詳細步驟和時間安排，其中用淘析袋提供細胞T—步驟26)7并^r敏胞轉(zhuǎn)移至一個或多個培養(yǎng)袋中(步驟28)。在步驟30中，例如，在3天培養(yǎng)過程中，零小時加入細胞因子。細胞暴露于細胞因子后，細胞暴露于殺死的耙細胞，例如，Colo629以及任選的其它細胞因子。最后，約72小時后可以收獲細胞和/或?qū)ζ溥M行冷凍、檢驗、滅菌等。培養(yǎng)袋中生成了未裝載或裝載殺死的Colo829細胞的IFNa-DCs,冷凍并于-80。C下儲存1、2和3周。冷凍的細胞在l周、2周和3周解凍，并通過Giemsa染色評價它們的形態(tài)。如圖16所示，裝載和未裝載的IFN-DCs在冷凍/解凍后保持DC形態(tài)。圖17顯示了用所示抗體表面染色和流式細胞術(shù)分析的冷凍/解凍的疫苗表型的例子。在IFN-a存在下，DCs顯示出與它們的世代一致的預期表型，包括CD1分子的表達(CDla和CDlb/c)，CD14的表達與作為間質(zhì)性DCs的IFN-DCs—致；高水平的HLA-DR和共刺激CD80和CD86分子。因此，冷凍/解凍疫苗保持IFN-DCs的形態(tài)和表型。一旦與T細胞相互作用，DCs分泌調(diào)節(jié)T細胞分化的細胞因子。因此，當冷凍的/解凍的IFN-DCs(裝載或未裝載殺死的Colo829細胞)暴露于可溶性CD40配體，而不是T細胞信號時，我們評價其分泌的細胞因子。培養(yǎng)6和24小時后，寸吏用MultiplexCytokineAnalysis(Luminex)^H介上清液。選擇三種分泌水平〉lng/ml的主要細胞因子，包括IL-8(~10ng/ml)、IL-6和MIPla。正如我們的臨床前研究所預期的，IFN-DCs分泌IL-7(圖19)。另外，可以檢測到低水平的IL-10(<100pg/ml)。然而，IL-10的分泌并不歸因于裝載了殺死的Colo829細胞，因為未負載或負載的DCs的培養(yǎng)物中的水平相似(圖18)。最終，IL-10分泌看起來與供體相關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。DC疫苗的最才艮本參數(shù)為其向自體CD8+T細胞提呈腫瘤抗原并誘導它們分化的能力。因此，冷凍的/解凍的HLA-A*0201+IFN-DCs用LPS(5或10ng/ml)刺激24小時，在最后10小時內(nèi)用MART-1肽致壽文并用作純化的自體CD8+T細胞的刺激物。在第7天促進T細胞培養(yǎng)物生長一次，添加il-7和il-2,在促進生長后的第5天通過四聚體染色評價t細胞的分化。如圖19所示，在DC:T細胞比為1:10(即每106個丁細胞有105個DCs)時，在培養(yǎng)的第12天，2%的CD8+T細胞特異性結(jié)合MART-1四聚體。而且，甚至可以在DC:T細胞比低至1:33時，即每106個丁細胞有3000個DCs時可以觀察到MART-1特異性CD8+T細胞的分化。這些結(jié)果表明冷凍的IFN-DCs保持它們的形態(tài)、表型和擴增抗原特異性CD8+T細胞的能力。關(guān)于產(chǎn)物生產(chǎn)的可行性和在患有轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的患者中釋放的初步數(shù)據(jù)。至今，我們已經(jīng)收集了有關(guān)患有IV期黑色素瘤的7名患者的產(chǎn)物生成的數(shù)據(jù)。這些是正在進行的臨床試驗過程中獲得的初步結(jié)果(IRB#005-065,IND#12339)。獲得這些初步的批次生產(chǎn)數(shù)據(jù)使用了來自患有轉(zhuǎn)移性黑色素瘤并進行化療的患者的細胞，表明了使用來自上文描述的健康供體的細胞開發(fā)的方法的可行性。之后的表格總結(jié)了至今使用患者的原料生產(chǎn)的批次。表7:患有IV期黑色素瘤的患者從淘析組份5回收的單核細胞<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>*由于采血產(chǎn)品的質(zhì)量差，在淘析后該患者的所有組份中都出現(xiàn)單核細胞。為了確保足夠數(shù)量的疫苗，收集所有的組份用于培養(yǎng)。表8:患有IV期黑色素瘤的患者至今生產(chǎn)的批次中DC回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表9:患有IV期黑色素瘤的患者無DMSO清洗解凍后的DC活力<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表10:患有IV期黑色素瘤的患者無DMSO清洗解凍后的DC回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>發(fā)明人的參考文獻Banchereau,J.，Palucka,A.K.,Dhodapkar,M.,Burkeholder，S.，Taquet,N.，Alexandre,R.,Taquet，S.,Coquery,S.,Wittkowski，K.，Bhardwaj,N.,Pineiro,L.,Steinman,R.，andFay,J.(2001).ImmuneandclinicalresponsesinpatientswithmetastaticmelanomatoCD34+progenitor-deriveddendriticcellvaccine.CancerResearch.61:6451-6458.Blanco,P"Palucka，A.K.,Gill,M.,Pascual,V.,andBanchereau,J.(2001).InterferonalphaanddendriticcellsinSLE.Science.294:1540-1543.Mohamadzadeh,M.,Berard，F(xiàn)"Essert，G"Cha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(nèi)皮肉瘤、滑膜癌、間皮癌、尤因瘤、平滑月幾肉瘤、才黃纟丈肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、才黃纟丈月幾肉瘤(rhabdosarcoma)、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、嚢腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝臟腫瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞癌、胚胎性癌、維爾姆斯癌、宮頸癌、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、腦膜瘤、神經(jīng)母細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。35.—種治療疑似患有癌細胞生長的患者的方法，其包括以下步驟在誘導抗原提呈和T細胞活化的條件下，將一種或多種癌抗原裝載到經(jīng)GM-CSF和IFNa活化的樹突狀細胞上，其中癌抗原包含已經(jīng)被熱休克并隨后被殺死的癌細胞；以及給予有需要的患者一種或多種提呈一種或多種癌抗原以活化T細胞的樹突狀細胞。36.—種治療疑似患有癌癥的患者的方法，其包括以下步驟分離一種或多種暴露于GM-CSF和IFNa的單核細胞并使其成熟；用組合物裝載一種或多種能夠誘導T細胞活化的樹突狀細胞以形成一種或多種抗原提呈細胞，所述組合物包含一種或多種經(jīng)熱休克并隨后被殺死的熱處理的癌細月包；給予有需要的患者一種或多種抗原提呈細胞。全文摘要本發(fā)明包括用于制備藥學上有效量的一種或多種樹突狀細胞的組合物和方法，所述樹突狀細胞通過暴露于IFNα而成熟，并用來自經(jīng)熱休克并且隨后被殺死的細胞的癌抗原裝載，其中一種或多種IFNα樹突狀細胞處在提呈一種或多種癌抗原的條件下，所述癌抗原存在于自體MHC中。文檔編號A61K39/00GK101511384SQ200780032430公開日2009年8月19日申請日期2007年6月29日優(yōu)先權(quán)日2006年6月30日發(fā)明者A·K·帕呂卡,J·F·班徹羅,N·塔丘特,S·伯克霍爾德申請人:貝勒研究院