專利名稱：：引起或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及引起或誘導(dǎo)受試者，特別是人體受試者中的免疫應(yīng)答的方法，且更具體地說，本發(fā)明涉及使用無針給藥途徑的方法，由此為更傳統(tǒng)的疫苗注射給藥途徑，諸如皮下和肌內(nèi)途徑提供了可替代選擇。
背景技術(shù)：
：許多年來，已經(jīng)進行了各種嘗試以使用呼吸道作為遞送非活疫苗抗原的方式。這種途徑被看作在疫苗可接受性(避免"針頭恐怖癥")，誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答的機會和假定粘膜免疫系統(tǒng)的一致性在遠端粘膜部位上誘導(dǎo)應(yīng)答的潛能方面提供了優(yōu)點。對在人和動物中通過鼻內(nèi)途徑遞送疫苗給予了更多的關(guān)注。迄今為止的結(jié)果表明這種途徑需要極高的抗原劑量和/或使用專門遞送技術(shù)以確保抗原攝入和免疫誘導(dǎo)。類似地，通過肺內(nèi)或肺部途徑遞送疫苗在過去一般需要專門遞送技術(shù)，諸如微嚢化(例如，參見0yaAlpa等，2005)，以便優(yōu)化免疫應(yīng)々合。在導(dǎo)致本發(fā)明的工作中，本發(fā)明人已經(jīng)觀察到通過鼻內(nèi)途徑遞送疫苗非常無效，致使甚至在高抗原劑量下極差的局部免疫性。因此，本發(fā)明人已經(jīng)研究了保留避免"針頭恐怖癥"的優(yōu)點的疫苗給藥的可替代途徑。令人意外的是，本發(fā)明人已經(jīng)證實疫苗遞送至肺部優(yōu)于通過鼻內(nèi)途徑遞送作為誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方式。他們還已證實在通過肺與佐劑一起遞送時可以使用極少量的抗原誘導(dǎo)強烈的全身免疫應(yīng)答。特別地，本發(fā)明人已經(jīng)證實合并抗原和佐劑的簡單疫苗組合物無需專門攝入技術(shù)就可在肺內(nèi)遞送時誘導(dǎo)強烈的全身免疫應(yīng)答。重要的是，已經(jīng)證實肺內(nèi)遞送導(dǎo)致肺粘膜免疫應(yīng)答，甚至在通過肺與佐劑一起遞送極少量的抗原時，它們也可以多達高于通過常規(guī)非腸道免疫接種誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的100倍(100x)。Griffith等(1997)描述了在脂質(zhì)體中，使用氫氧化鋁或在PBS中配制的蓖麻蛋白類毒素的氣管內(nèi)遞送。脂質(zhì)體配制的組表現(xiàn)出最佳保護作用；氫氧化鋁對保護作用的改善未超過PBS。W02005/110379描述了顆粒癡疾疫苗的肺部遞送。將該制品作為顆粒制品遞送并且能夠緩釋抗原。在本說明書中對任何在先出版物(或來源于其中的信息)或任何已的信息)或已知材料構(gòu)成組本說明書所涉及的致力領(lǐng)域中的一般性常識的一部分的承認或許可或任何形式的提示。除非在上下文中另有需要，否則在本說明書和隨后的權(quán)利要求書中的措辭"包含"和或變化形式，諸如"包括"或"含有"可以理解為暗示包含所述的整體或步驟或整體或步驟組，但不排除任何其它整體或步驟或整體或步驟組。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于引起或誘導(dǎo)人或動物受試者中的免疫應(yīng)答的方法，包括對所述的受試者給予包含抗原和佐劑的組合物，其中通過肺內(nèi)或肺部途徑將該組合物給予受試者。優(yōu)選配制適合于肺內(nèi)或肺部給藥的組合物。另一個方面本發(fā)明提供了包含抗原和佐劑的組合物在或在制備用于對人或動物受試者肺內(nèi)或肺部給藥以引起或誘導(dǎo)該受試者中的免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。另一個方面，本發(fā)明提供了用于通過肺內(nèi)或肺部途徑引起或誘導(dǎo)人或動物免疫應(yīng)答的藥劑，其中該藥劑為包含抗原和佐劑的組合物。附圖簡述在圖2，3,4,6,9和10中水平條=中位值空心條=中間值50%垂直線=10和9Q百分位數(shù)值圖1為例證相當(dāng)于上肺和下肺(或深部)肺區(qū)域的綿羊肺(由Nickel等，1979修改的肺示意圖)。圖2和3為在初步實驗中獲得的結(jié)果的示意圖。通過皮下(s/c)或肺內(nèi)(肺)途徑使用三次劑量的單獨的流感病毒抗原(流感抗原)或是使用100|LigISCOMATRIX頂佐劑(IMX=ISCOMATRIXtm佐刑)配制的抗原在三周間隔時免疫接種綿羊組。在第一次劑量前l(fā)周，在第一次劑量后2周和第二和第三次劑量后1周取血液(血清)和肺(支氣管-肺泡灌洗液-BAL)樣品。圖2表示抗體應(yīng)答[在1，2和3次劑量(l。，2°和3。)的由15pg單獨的流感病毒抗原組成的制品(相當(dāng)于單價劑量的目前可得到的流感疫苗)和減量的使用100|ugISCOMATRIXtm佐刑配制的流感抗原后的酶免疫測定(EIA)中的流感-特異性終點滴度。對血清和BAL(肺)樣品進行IgG和IgA測定。('使用Mann-Whitney分析具有顯著性差異)圖3表示使用與圖2相同免疫接種和取樣方案和測定操作的抗原應(yīng)答，其中通過皮下和肺內(nèi)途徑，使用極低劑量的流感抗原(0.04pg)與和不與ISCOMATRIXTM佐劑進行免疫接種。(#，'，A,§，^9使用Mann-Whitney分析具有顯著性差異)就圖4，6,7，9，IO而言，在對數(shù)據(jù)進行l(wèi)og轉(zhuǎn)換后進行統(tǒng)計學(xué)分析并且通過方差分析(ANOVA)與Dunnett"因果分析，應(yīng)用SPSS軟件版本13比較各組。圖4表示在使用三次劑量的為遞送至上或下肺而用lOOjLigISCOMATRIXtm佐刑配制的0.04pg流感抗原免疫接種后各組綿羊中的抗體應(yīng)答(圖1)。在第三次劑量后1周收集血清和BAL(肺)樣品。圖5為在與NHS-活化的HP柱偶連的gB-特異性58-15單克隆抗體的親和柱上純化蛋白質(zhì)后純化的巨細胞病毒(CMV)厶gB蛋白的考馬斯染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠。泳道1-4表示純化自4種不同親和稠合試驗的AgB。圖6表示三次劑量的使用lOOpgISCOMATRIXTM佐劑配制的通過皮下或肺內(nèi)途徑遞送的CMVAgB后8只綿羊組中的CMVAgB-特異性抗體應(yīng)答。測定血清和BAL樣品中的抗體應(yīng)答并且使用厶gB-特異性EIA測定IgG和IgA的終點滴度。該示意圖表示第一次劑量后2周(初次后)和第二次劑量后1周(二次后)和第三次(第三次后)的抗體應(yīng)答。('使用ANOVA的顯著性差異)。圖7表示對來自與圖6中相同組綿羊的各只綿羊的CMV的個體百分比中和滴度。對使用lOOjagISCOMATRIXtm佐刑配制的CMV△gB的第一次劑量前l(fā)周(免疫前)，第一次劑量后2周(二次)和第二次(二次)和第三次(第三次)劑量后1周從放出的血液中取血清樣品，對其測定CMV中和活性。每一循環(huán)點為在標定劑量點采集的各綿羊血清的中和百分比。就肺內(nèi)和皮下遞送而言，2和3次劑量的所述制品后的血清CMV-中和滴度顯著高于免疫前血清。('使用ANOVA的顯著性差異)。圖8表示與厶gB蛋白孵育后外周血單核細胞(PBMC)的體外再刺激結(jié)果。在給予使用lOOjagISCOMATRIXTM佐劑配制的第三次劑量的CMVAgB后1周從與實施例7相同的綿羊外周血液中采集PBMC。在使用△gB刺激后，通過測定摻入細胞的氚標記胸普測定細胞增殖。將刺激指數(shù)(SI)計算為摻入使用AgB刺激的細胞的氖與摻入對照組未刺激細胞的氚之比。SI24被視為陽性增殖應(yīng)答。圖9表示使用用各種佐劑配制的流感抗原免疫接種的綿羊組(4只綿羊在FluNo佐劑組中；在各佐劑組中7只綿羊)中的抗體應(yīng)答。免::接仲和取樣方案與圖l相同。('使用ANOVA的顯著性差異)。圖IO表示對與圖9相同組綿羊的血細胞凝集素抑制測定(HAI)結(jié)果。通過火雞紅細胞上的終點抑制測定各樣品的HAI滴度。('使用ANOVA的顯著性差異)。發(fā)明詳述本發(fā)明在一個方面中提供了用于引起或誘導(dǎo)人或動物受試者中的免疫應(yīng)答的方法，包括對所述的受試者給予包含抗原和佐劑的組合物，其中通過肺內(nèi)途徑將該組合物給予受試者。優(yōu)選所述的受試者為人，然而，本發(fā)明的方法還擴展至引起或誘導(dǎo)動物受試者的免疫應(yīng)答，諸如家畜類動物(例如綿羊，母牛或馬)，實驗室試驗動物(例如小鼠，大鼠，兔或豚鼠)，陪伴動物(例如狗或貓)或野生動物。本文所用的涉及的組合物的"肺內(nèi)"或"肺部"遞送是指將組合物遞送至肺粘膜表面，其中組合物的活性成分(即抗原和佐劑)可以接觸肺和/或粘膜免疫系統(tǒng)中的毛細管系統(tǒng)。這些術(shù)語包括組合物的"深部肺"或"下肺"遞送，即將組合物遞送至肺的深部支氣管，細支氣管和/或肺泡。優(yōu)選作為氣溶膠或以干粉形式將包含抗原和佐劑的本發(fā)明組合物遞送入受試者肺部，其中使用噴霧器或類似裝置遞送所述的氣溶膠或干粉。用于藥物活性產(chǎn)品的肺內(nèi)或肺部遞送的標準裝置或產(chǎn)品為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。如上所述，本發(fā)明在另一個方面中提供了包含抗原和佐劑的組合物在或在制備用于對人或動物受試者肺內(nèi)給藥以便引起或誘導(dǎo)該受試者中的免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明在另一個方面中提供了用于通過肺內(nèi)途徑引起或誘導(dǎo)人或動物免疫應(yīng)答的藥劑，其中該藥劑為包含抗原和佐劑的組合物。答的抗原，所述的病原體諸如流感，肺炎衣原體(C/"歷7心apie咖o/2/ae)，呼吸道合胞病毒，肺炎球菌等。不過，應(yīng)理解還可以選擇所述的可以以便引起或誘導(dǎo)對其它病原體的免疫應(yīng)答，包括其它粘膜部位的病原體，例如幽門螺桿菌(#e7/co々acfe/";^/oW);沙門菌屬(Sa7邁o/7e"a),大腸桿菌(Aco7/),霍亂，HIV或性傳播疾病生物體等。按照本發(fā)明給予的抗原具有高度接受者可接受性的優(yōu)點(避免了"針頭恐怖癥，，且易于給藥)。特別地，它產(chǎn)生強的粘膜和全身免疫應(yīng)答，表明它用于所有疫苗接種，包括在全身免疫應(yīng)答時可信賴的那些?？乖€可以為腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原。優(yōu)選所述的腫瘤與粘膜部位相關(guān)。與粘膜部位相關(guān)的腫瘤包括，但不限于肺部腫瘤，胃腸道腫瘤和生殖道腫瘤。抗原可以為任意的化學(xué)本體，它可以引起或誘導(dǎo)人或動物的免疫應(yīng)答，包括，但不限于全細胞滅活的細菌或其亞單位，全滅活病毒或其亞單位，蛋白質(zhì)或肽，糖蛋白，碳水化合物，神經(jīng)節(jié)苷脂，多糖，脂多糖或脂肽；或它可以為上述任意的組合。還優(yōu)選所述的佐劑為免疫刺激佐劑，更優(yōu)選基于皂苷的佐劑，且甚至更具體地說為免疫刺激復(fù)合物(或ISC0M),諸如ISCOMATRIXtm佐劑。然而，本發(fā)明還包括其它免疫剌激佐劑，無論是單個的還是與另一種佐劑的組合的應(yīng)用，所述的另一種佐劑諸如免疫刺激復(fù)合物，包括，例如脂質(zhì)體；水包油型佐劑，諸如MF59;鋁鹽佐劑，諸如氫氧化鋁和磷酸鋁；脂多糖佐劑，諸如脂質(zhì)A和單磷酰脂質(zhì)A(MPL);寡核苷酸佐劑，諸如CpG寡核苷酸佐劑；和粘膜佐劑，諸如霍亂毒素。合適的免疫刺激佐劑由Cox和Coulter，1997作為實例描述?？梢允褂矛F(xiàn)存技術(shù)和那些處于研發(fā)中的技術(shù)中的任意一種將本發(fā)明的組合物遞送至肺部。存在能夠?qū)⑺幬锘虻鞍踪|(zhì)制品遞送至肺的機械裝置的大量實例，并且噴霧器和氣溶膠裝置已經(jīng)在治療津喘中使用了數(shù)十年(參見Gonda，2000)。一般而言，預(yù)期這些裝置通過口服吸入將物質(zhì)遞送至肺部。在本領(lǐng)域中近期的發(fā)展(參見Edwards和Dunbar,2002)包括3MCorporation(Shoyele和Slowey，2006)和InhaleTherapeuticsSystems,Inc.(Kuo和Lechuga-Ballesteros，2003)制備的那些。將本發(fā)明的組合物以免疫有效量給予人或動物受試者。本文所用的免疫有效量是指至少并非荻得期望的免疫應(yīng)答或延緩所治療的特定疾患發(fā)作，抑制其發(fā)展，或完全阻止它發(fā)作或發(fā)展所必須的量。該量根據(jù)所治療個體的健康和身體狀況，所治療個體的分組，個體免疫感受態(tài)，期望防護的程度，疫苗制品，醫(yī)療狀況評價和其它相關(guān)因素的不同而改變。預(yù)計該量落入可以通過常規(guī)試驗測定的相對寬的范圍。然而，注意到本發(fā)明特別重要的優(yōu)點包括如下事實已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包含抗原和佐劑的疫苗的肺內(nèi)給藥不僅產(chǎn)生對抗原的全身抗體應(yīng)答和粘膜應(yīng)答，而且在引起或誘導(dǎo)這類全身和粘膜應(yīng)答所需的抗原劑量顯著下降的可能性。此外，本發(fā)明疫苗組合物的有效肺內(nèi)給藥避免了復(fù)雜的遞送系統(tǒng)的必要性，諸如微嚢化或粘膜粘著劑或其它促進疫苗在粘膜部位攝入的技術(shù)。此外，誘導(dǎo)顯著改善的粘膜抗體應(yīng)答表明肺內(nèi)免疫接種可以提高疫苗對粘膜感染的功效，并且能夠減少病原體從免疫接種/感染的人中傳播。特別地，粘膜抗體在改善對流感攻擊的保護性免疫性方面具有巨大價值。近期WHO咨詢報告(Cassetti等，2006)中描述"在小鼠模型中，粘膜IgA與對攻擊的保護相關(guān)，并且在使用活的減毒流感疫苗在人中的研究中，粘膜IgA的存在與病毒脫落和對實驗性感染的抗性相關(guān)。推定粘膜IgA看起來在對流感病毒感染的防護方面起作用并且更多的研究應(yīng)評價疫苗誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答的能力……"。因此，本發(fā)明的肺內(nèi)遞送途徑在疫苗對其它感染的方面具有潛在價值，并且對需要主要全身抗體應(yīng)答的疫苗提供了可替代選擇的遞送途徑。此外，按照本發(fā)明給予的抗原誘導(dǎo)強的細胞免疫應(yīng)答。通過肺內(nèi)途徑遞送的抗原與佐劑刺激特異性增殖作為對抗原應(yīng)答的外周血小板產(chǎn)生。這些細胞屬于CD4+和CD8+類T細胞，它們在促進抗體應(yīng)答和進行效應(yīng)器官能方面起作用，諸如殺傷病毒感染的細胞。誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答和抗體應(yīng)答的能力在抗病原體，特別是HIV，庖滲病毒和包括其生命周期的胞內(nèi)期的細菌，諸如分枝桿菌屬(/T7/co6ac^er/a)，衣原體屬(c力"/z;^")和利斯特氏菌屬(h'WeWa)的疫苗接種中具有潛在價值。在下列實施例中更完整地描述本發(fā)明的更多的特征。然而，應(yīng)理解包括這一詳細描述僅用于例證本發(fā)明的目的，并且不應(yīng)以任何方式理解為對如上所述的本發(fā)明的寬泛描述的限制。實施例實施例1背景通過本發(fā)明的背景，本發(fā)明者在插套管的綿羊模型中檢驗了疫苗遞送模式。插套管能夠使局部引流淋巴結(jié)流出得到相當(dāng)詳細的研究。使用ISCOMATRIXTM佐劑流感疫苗作為疫苗模型在綿羊中進行這項工作。從這項工作中的主要發(fā)現(xiàn)在于鼻內(nèi)遞送非常無效，導(dǎo)致甚至在高抗原劑量下誘導(dǎo)的局部免疫性極差。這些發(fā)現(xiàn)提示了通過肺內(nèi)途徑，經(jīng)將疫苗深部遞送入肺的一葉中來研究疫苗在未插套管綿羊中的遞送結(jié)果的計劃方向的改變。實驗方法血液采集束縛綿羊并且使用10mL注射器和.18G針頭從頸靜脈釆集10mL血液。免疫接種用于這些研究的流感抗原為蔗糖梯度純化的A/NewCaledonia20/99H1N1病毒，已經(jīng)將其滅活和洗滌劑破壞(Coulter等，1998)?？乖瓭舛然谘毎睾坎⑶彝ㄟ^和單徑向免疫擴散測定。通過上述方法限制的CSL制備GMP級ISCOMATRIXtm佐刑(Pearse和Drane，2005)。在免疫接種前，通過混合適量的抗原與ISCOMATRIX佐劑制備疫苗制品。為了進行肺內(nèi)免疫接種，用吊帶謹慎束綽綿羊并且通過左側(cè)鼻孔插入支氣管鏡至左肺尾葉。然后以5mL的總體積輸注疫苗制品，隨后輸注10mL空氣以確保完全遞送。為了進行皮下免疫接種，使用1mL注射器和25G針頭在大腿內(nèi)側(cè)遞送總體積為200juL的疫苗制品。支氣管肺泡灌洗液(BAL)采集為了采集支氣管肺泡灌洗液(BAL)樣品，將支氣管鏡插入束縛的綿羊以便進行疫苗接種并且使用與支氣管鏡連接的肺葉遞送注射器10mLPBS(磷酸緩沖鹽水pH7.2)。然后將相同的注射器用于通過支氣管鏡抽取BAL流體。通過EIA評價抗體應(yīng)答通過EIA(酶免疫測定)按照一式兩份評價BAL和血清樣品至的抗流感抗體。簡言之，用在pH9.6的碳酸鹽緩沖液中的50pL10ng/mL流感抗原將96孔Maxisorp平底平板(匪C,Roskilde，Denmark)包被過夜。然后用1°/。酪蛋白鈉封閉平板，此后添加1Q0iliL按照1/5的順序樣品稀釋液，一式兩份進行。使用綴合了馬辣根過氧化物酶的兔抗綿羊總Ig(Dako，Denmark)或抗牛/羊IgA(Serotec，Oxford),隨后使用兔抗小鼠馬辣根過氧化物酶(Dako)檢測特異性抗流感抗體結(jié)合。通過添加TMB底物(Zymed，SanFrancisco)顯色，通過添加2MH2S04終止。使用Bio-TekELx800平板讀出器測定450nm處的光密度并且計算抗體終點滴度。血細胞凝集抑制活性評價還檢驗了通過ELISA得到抗原特異性抗體應(yīng)答的血清和BAL樣品的血細胞凝集抑制活性(HAI)。該測定法通過測定流感病毒對紅細胞聚集的抑制測定了功能性抗體滴度。使用火雞紅細胞測試樣品抗卵生長的A/NewCaledonia/20/99病毒(證l)的HAI。將HAI滴度測定為抑制紅細胞的流感聚集的終點稀釋度。由WHOCollaboratingCentreforReferenceandResearchonInfluenza,Melbourne,Australia進行HAI測定。外周血單核細胞的體外抗原再刺激將使用注射器和18G針頭從頸靜脈釆集的血樣(50mL)放入含1005000U/mL肝素的50mL試管。然后以800g將細胞不停止地離心20分鐘，將血沉棕黃層采集入15mL試管并且用PBS稀釋至8mL。使用轉(zhuǎn)移用移液管將3.5mL菲科帕克加入到細胞混懸液底部，并且以1000g將樣品不減速地離心30分鐘。然后從Ficoll-PBS界面上采集外周血單核細胞，用PBS洗滌并且以5xl07mL重新懸浮于完全培養(yǎng)基(補充了10%FCS,L-谷氨酰胺，青霉素(100U/mL)，鏈霉素(100|ug/mL)和50jiM2-巰基乙醇的Dulbecco改良的Eagles培養(yǎng)基)中。為了進行抗原再刺激測定，將10QiliL細胞(5xl07孔)等分入96-孔組織培養(yǎng)平板，向其中一式三份加入100iliL單獨的培養(yǎng)基或含10或20|ug/mLA/NewCaledonia流感抗原的培養(yǎng)基(終濃度5或10Hg/mL抗原)。在37。C下增濕孵育箱內(nèi)5天培養(yǎng)后，用20pL1pCi氚標記胸苷將所有孔脈沖24小時。然后使用Packard采集器將細胞采集在玻璃濾膜上，放入具有Microscint閃爍液的膠巻暗盒內(nèi)并且使用自動化微量培養(yǎng)板閃爍計數(shù)器測定P-放射。上肺和下肺免疫接種的評價接種進行有效性檢驗。圖1(來自Nickel等，1979)例證了用于遞送至上和下肺的綿羊肺的部位。使用光導(dǎo)纖維支氣管鏡將遞送至'上肺，的疫苗-遞送入上肺。將疫苗導(dǎo)入經(jīng)過主氣管杈lcm的主支氣管。使用光導(dǎo)纖維支氣管鏡將遞送至'下肺，的疫苗-深部遞送入肺近尾部。導(dǎo)入疫苗，其中尾部支氣管連接經(jīng)過主氣管杈10cm的尾部段支氣管。如對其它實驗所述進行免疫接種，放血，BAL采集和ELISA測定。綿羊接受三次劑量的0.04jtig流感抗原與lOOpgISCOMATRIXTM佐劑。結(jié)果通過經(jīng)肺內(nèi)途徑免疫接種的抗體誘導(dǎo)在3次獨立的實驗中，通過肺內(nèi)途徑給綿羊免疫接種。在1。劑量后2周和2°和3。劑量后1周取血。實驗1給綿羊免疫接種l，5或15^ig抗原+100)igISCOMATRIXTM佐劑。間隔三周給予三次免疫接種。在開始前和每次疫苗接種之后采集血清樣品。在肺內(nèi)遞送的lpg佐劑流感抗原與15)Llg具有同樣有效的令人意外的發(fā)現(xiàn)后，第二次實驗檢驗了抗原劑量的進一步減小。實驗2給綿羊免疫接種0.04，0.2，1，5或15ng抗原+100pgISCOMATRIXTM佐劑。間隔三周給予三次免疫接種。在開始前和每次疫免疫接種之后采集血清樣品。這些實驗證實所有抗原劑量在接受動物中均誘導(dǎo)顯著性抗體應(yīng)答-甚至在低至0.04pg抗原劑量下。較低的抗原劑量在1次劑量后誘導(dǎo)極少的抗體。然而，在接受動物中的免疫性與2和3次劑量后的較高抗原劑量等效。這些抗體應(yīng)答包括功能性血細胞凝集(HAI)。使用0.04iug抗原和100|ugISCOMATRIX頂佐劑肺內(nèi)免疫接種的綿羊中的血清IgG和IgA水平與在使用15網(wǎng)單獨抗原(目前的疫苗劑量)皮下免疫接種獲得的那些等效。低劑量肺內(nèi)免疫接種在肺內(nèi)產(chǎn)生了極為良好的特異性IgA和IgG水平(BAL-支氣管肺泡灌洗液)，它優(yōu)于通過皮下注射的較高劑量誘導(dǎo)的特異性IgA和IgG水平。實驗3第三次實驗評價了(i)對用低抗原劑量誘導(dǎo)顯著免疫性的佐劑的要求，(ii)直接比較了肺內(nèi)遞送的低抗原劑量(O.04jLig)與皮下遞送的劑量，(iii)檢驗了甚至較低的抗原劑量(O.008iug抗原)。第三次實驗；(a)重復(fù)前兩次中進行的觀察；(b)證實佐劑是誘導(dǎo)對極低劑量抗原的免疫性必不可少的；(c)發(fā)現(xiàn)佐劑化肺內(nèi)遞送的低劑量抗原誘導(dǎo)類似血清抗體和超過經(jīng)皮下遞送的相同低抗原劑量疫苗或目前疫苗劑量的肺抗體；(d)發(fā)現(xiàn)經(jīng)皮下注射的2次劑量以上的在第3次劑量后表現(xiàn)出誘導(dǎo)作為血清抗體的耐受或抑制作用的佐劑化極低劑量抗原減少。這種抑制作用在肺部遞送后為出現(xiàn)；(e)發(fā)現(xiàn)盡管使用0.04pg抗原與ISCOMATRIXTM佐劑誘導(dǎo)程度較低，但是甚至使用0.008ng抗原與100pgISCOMATRIXTM佐劑共同給藥的肺內(nèi)免疫接種誘導(dǎo)顯著性抗體誘導(dǎo)。將實驗1-3的合并數(shù)據(jù)概括在圖2和表1中。表1使用減少劑量的流感抗原和ISCOMATRIXtm佐刑的肺內(nèi)免疫接種誘導(dǎo)的血細胞凝集抑制(HAI)活性<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表l圖例從3次獨立的實驗中合并數(shù)據(jù)。綿羊組(n-8/組，但15jLigflu組(n-12)和0.04網(wǎng)flu+IMX組(n=16))在左側(cè)肺免疫接種減少劑量的分裂病毒體流感抗原+100jugISCOMATRIXtm佐刑(IMX)。經(jīng)皮下(S/C)給疫苗綿羊?qū)φ战M免疫接種等劑量的目前的人流感疫苗的1種菌林(15ng單獨的流感抗原)。綿羊間隔3周接受3次免疫接種。在初次劑量前和之后2周和二次和第三次劑量后1周從所有綿羊中采集左肺洗滌液(BAL)。然后確定抑制流感介導(dǎo)的血細胞凝集的這些樣品的滴定。所有預(yù)先免疫接種的樣品對HAI活性而言均呈陰性(未顯示)。'與皮下免疫接種的對照組相比具有較高的HAI滴度(MannWhitney;p<0.004)。實驗3的數(shù)據(jù)如表2和圖3中所示。表2佐劑和遞送途徑對使用極低劑量的流感抗原免疫接種誘導(dǎo)的血細胞凝集抑制活性的要求<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2圖例給綿羊組(n-8)的左肺免疫接種極低劑量(0.04pg)的分裂病毒體流感抗原與或不與100pgISCOMATRIXtm佐刑(IMX)。其它組接受相同的經(jīng)皮下(S/C)注射的疫苗。給1個對照組綿羊經(jīng)皮下免疫接種相當(dāng)劑量的目前的人流感疫苗的1種菌林(15|ag單獨的流感抗原)。綿羊間隔3周接受3次免疫接種。在初次免疫接種前和之后2周和二次和第三次劑量后1周從所有綿羊中采集左肺洗滌液(BAL)。然后確定抑制流感介導(dǎo)的血細胞凝集的這些樣品的滴定。所有預(yù)先免疫接種的樣品對HAI活性而言均呈陰性(未顯示)。并與皮下免疫接種的對照組相比具有顯著較低的HAI滴度(MannWhitney;p<0.002)。'與皮下免疫接種的對照組相比具有顯著較高的HAI滴度(MannWhitney;p<0.028)。A與未佐劑化的組相比具有顯著較高的HAI滴度(MannWhitney;p<0.01)。在圖1和2中水平條-中位值空心條=中間值50%垂直線-1Q和9Q百分位數(shù)值IMX=ISCOMATRIXtm佐刑所述的條表示如上所述的首次(1。)，第二次(2。)和第三次(3。)免疫接種后的流感特異性終點抗體滴度。在圖1中'顯著高于15jugs/c組(Mann—Whitney;p<03)。在圖2中#顯著寸氐于15|ugs/c組(Mann-Whitney;p<0.01)。'顯著高于15pgs/c組(Mann-Whitney;p<0.038)。A顯著高于未佐劑化的通過相同途徑遞送的疫苗(Mann-Whitney;p<0.038)?！炱は拢@著高于肺內(nèi)遞送的相同疫苗(Mann-Whitney;p<0.028)。^肺內(nèi)，顯著高于經(jīng)皮下遞送的相同疫苗(Mann-Whitney;p<0.021)。實驗4本實驗評價佐劑化流感抗原遞送至上肺與用于上述實驗的遞送至下肺相比的有效性。2組8只綿羊接受含0.04|ig流感抗原和lOO)iigISCOMATRIXTM佐劑的制品至上和下肺三次并且通過EIA檢'臉血清和BAL抗體應(yīng)答(圖4)。這些結(jié)果表明在三次劑量后，盡管遞送至上肺誘導(dǎo)血清和BAL應(yīng)答，但是通過下肺遞送誘導(dǎo)在血清和BAL中的IgG和IgA顯著更好的應(yīng)答。概述使用流感抗原抗原與100pgISCOMATRIXTM佐劑肺內(nèi)免疫接種證實在誘導(dǎo)具有HAI活性的全身和粘膜(BAL)抗體應(yīng)答方面高度有效。甚至在極低抗原水平下也觀察到了強血清抗體應(yīng)答(D.04pg流感抗原與ISCOMATRIXTM佐劑)。這些應(yīng)答遠強于通過皮下注射(s/c)單獨的15網(wǎng)流感抗原誘導(dǎo)的應(yīng)答(作為每次使用的目前疫苗)并且可與通過皮下0.04jag流感抗原與ISCOMATRIXTM佐劑誘導(dǎo)的那些比擬。通過肺內(nèi)遞送0.04|^g流感抗原與ISCOMATRIXTM佐劑誘導(dǎo)的粘膜抗體應(yīng)答比皮下15jag流感抗原或皮下Q.04jig流感抗原與ISCOMATRIXtm佐刑明顯升高。后兩者均未誘導(dǎo)可檢測到的粘膜(肺)應(yīng)々合。實施例2通過肺內(nèi)途徑疫苗接種的細胞免疫性誘導(dǎo)綿羊接受4次0.04]ug單獨的流感抗原或0.04jag流感+100pgISCOMATRIXTM佐劑的肺內(nèi)免疫接種。在最后一次免疫接種后1周采集外周血液并且在具有單獨的培養(yǎng)基(陰性對照)或5或10pg流感抗原(再刺激的)的96孔平板中培養(yǎng)單核細胞。在5天后，用氚標記胸苷將各孔脈沖24小時。然后測定放射性以計算細胞增殖。通過用再刺激組中每分鐘的平均計數(shù)(cpm)處以單獨培養(yǎng)基的對照組的平均cpm計算刺激指數(shù)。細胞增殖研究結(jié)果如表3中所示。當(dāng)給綿羊肺內(nèi)單獨進行抗原接種疫苗時，在外周血液中可檢測到增殖應(yīng)答。然而，在接受抗原與ISCOMATRIXTM佐劑的綿羊中檢測到了這類應(yīng)答ISCOMATRIXTM佐劑。這要求,表3來自肺內(nèi)免疫接種低劑量抗原與或不與ISCOMATRIXtm佐刑的綿羊的流感刺激的外周血單核細胞的增殖應(yīng)答<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實施例3抗原與微流化水包油型佐劑的用于通過肺內(nèi)途徑的制品將適當(dāng)濃度的抗原(產(chǎn)生終濃度，產(chǎn)生0.01-500)ig的單劑量)與5%v/v角鯊?fù)椋?.5%v/vTween80，在PBSpH7.2中的0.5%v/vSpan85,0.G5。/。疊氮化鈉混合。然后對該混合物在19-20，00G磅/平方英寸(psi)壓力下進行高壓微流化。將該微流化再重復(fù)7次。通過肺內(nèi)途徑，經(jīng)上述方法遞送該制品。實施例4使用ISCOMATRIXTM佐劑配制的重組巨細胞病毒gB抗原通過肺內(nèi)途徑免疫接種誘導(dǎo)的全身和粘膜免疫性為了證實和擴展使用流感抗原和ISCOMATRIXtm佐刑的觀察結(jié)果，在綿羊中進行研究，以便檢驗通過肺內(nèi)遞送重組病毒抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通過肺內(nèi)和皮下途徑遞送使用ISCOMATRIXtm佐刑配制的巨細胞病毒gB糖蛋白(CMVgB)的截短形式并且通過EIA評價血清和肺中的抗體應(yīng)答。此外，通過血清中的CMV-中和抗體測定評價功能性抗體的誘導(dǎo)。還通過評價外周血單核細胞的gB-特異性細胞增殖檢驗了肺內(nèi)遞送的制品誘導(dǎo)T細胞應(yīng)答的能力。實驗方法截短的重組人CMVgB蛋白(AgB)的生產(chǎn)1.含編碼AgB蛋白的DNA的質(zhì)粒的產(chǎn)生編碼造以便除去蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)的CMVgB的截短形式的DM由RajivKhanna富'J教授，QueenslandInstituteofMedicalResearch,Brisbane,Australia提供。這種DNA編碼含具有框內(nèi)融合的gB胞質(zhì)外-和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的組織纖溶酶原激活物(TPA)的蛋白質(zhì)(NCBIP06473)。同樣，該DNA在編碼氨基酸460/461周圍區(qū)的核苷酸處被點突變，以防止表達的蛋白裂解。將DNA克隆入pCEP4載體(Invitrogen)作為Kpnl/Notl片段。在大腸桿菌中擴增所得質(zhì)粒(pCEP4AgB)并且使用QiagenMaxi試劑盒制備純化的質(zhì)粒。2.哺乳動物細胞中AgB蛋白的表達用pCEP4AgB,應(yīng)用293fectin轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)轉(zhuǎn)染在37°C下?lián)u瓶中的FreeStyleTM表達培養(yǎng)基(Invitrogen)內(nèi)生長的FreeStyle293-F細胞培養(yǎng)物。通過對細胞上清液樣品進行SDS-PAGE凝膠分析測定在使用潮霉素B選擇中分泌的蛋白質(zhì)AgB的表達。收集細胞培養(yǎng)物上清液并且通過以2500rpm離心凈化，且然后使其通過0.45um濾膜，此后進行色譜。3.AgB蛋白質(zhì)的純化使用親和色謙法，通過使用gB-特異性單克隆抗體58-15(Singh和Compton,2000)俘獲純化AgB蛋白質(zhì)。用Prosep-A(微孑L)蛋白質(zhì)A柱純化抗體。為了純化AgB蛋白質(zhì)，使純化的抗體與HiTrapNHS-活化HP柱(Pharmacia-Amersham)在平衡緩沖液(O.2MNa跳/0.5MNaCl，pH8.3)中偶聯(lián)。使用lOOmMBorate/150mMNaClpH8.5按照1:1稀釋凈化的細胞培養(yǎng)物上清液。使稀釋的上清液上HiTrap柱，用平衡緩沖液平衡并且首次用0.1M甘氨酸-HC1pH2.5,隨后用平衡緩沖液稀釋并且再次洗脫，這次使用0.15M氫氧化鋁pH10.5。使用3MTrispH8或1M甘氨酸pH2.5中和洗脫的級分。通過考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠電泳(圖5)檢驗蛋白質(zhì)純度。通過測定280nm處的OD估計蛋白質(zhì)濃度。使用AgB對綿羊免疫接種采血方法與實施例1中所述的那些相同。免疫接種使用應(yīng)用ISCOMATRIXTM佐劑配制的AgB蛋白免疫接種綿羊組。表4).如所述的制備來自巨細胞病毒的AgB蛋白。所有綿羊接受三種疫苗劑量，其詳細內(nèi)容，包括采血描述在實施例1中。表4.使用ISCOMATRXTM佐劑配制的(gB蛋白通過所示途徑免疫接種綿羊組<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>BAL采集如實施例1中所述采集BAL樣品。通過EIA評價抗體應(yīng)答用于檢測綿羊IgG和IgA的方法與實施例1中的那些類似。用在PBS中100pl/孔的2pg/mL純化的(gB蛋白將平板(96孑L)包被過夜。使用以馬辣根過氧化物酶綴合的家兔抗綿羊IgG(H+L)(SouthernBiotech)檢測結(jié)合的綿羊IgG。就IgG和IgA而言，TMB過氧化物酶底物分別來源于KPLKirkegaard和PerryLaboratories。通過添力口50inl/孑L0.5MH2S04終止反應(yīng)。對CMV的功能性活性評價使用基于MRC-5細胞的重組人巨細胞病毒感染的中和測定法評價疫苗誘導(dǎo)功能性血清抗體的能力。由RajivKhanna副教授和同仁，QueenslandInstituteofMedicalResearch,Brisbane,Australia使用表達綠色熒光蛋白的重組CMVAdl69wt86-EGFP進行測定(Marschall等，2000;Wang等,2004)。在使Adl69wt86—EGFP接觸血清稀釋液后，通過使用流式細胞計量術(shù)(FACS)對細胞核發(fā)熒光的百分比進行定量評價病毒感染人成纖維細胞(MRC-5細胞)的能力。操作如下所述1.將來自綿羊的血清在56。C下孵育30分鐘；2.將來自綿羊的血清(純凈的和在100jaLDMEM在以2倍和4倍稀釋)調(diào)配在96孔托盤上；3.將25|tiL(2.5x104PFU)Adl69wt86-EGFP病毒加入到每一血清樣品中；4.將血清/病毒樣品在37。C下和空氣中7%C02中孵育2小時；5.預(yù)先制備含有通過在37"下和空氣中7%C02中孵育生長在具有10%胎牛血清(DMEM-10)的DMEM上的MRC-5細胞的48孔平底托盤，并且在使用時處于80-90%融合率；6.從MRC-5細胞中除去細胞培養(yǎng)基。然后將50nL每一病毒/血清樣品轉(zhuǎn)入含MRC-5細胞的48孔平底托盤中的相應(yīng)孔，加入50jLiLDMEM并且將48孔托盤在37。C下和空氣中7%0)2中緩慢振搖孵育2小時；7.從48孔托盤中抽吸接種物，用DMEM-10將各孔洗滌3次，且然將500|uLDMEM-10加入到各孔，并且在37。C下和空氣中7%C02中孵育過夜；8.接下來的1天從48孔托盤中收集培養(yǎng)基和細胞(使用胰蛋白酶)，并且通過離心沉淀細胞；9.將沉淀重新懸浮于PBS中并且通過離心再次沉淀；10.將沉淀重新強力地懸浮于含0.2|xLlmg/mL7-AminoctinmycinD的lOOpL低滲緩沖液(0.1%杵檬酸鈉，0.1%(v/v)TritonX-100)并且在室溫下和黑暗中保持20分鐘；11.將各沉淀樣品轉(zhuǎn)入適合于FACS分析的試管并且加入含1%低聚曱醛的100nLPBS。將該混合物在冰上保持30分鐘，此后進行FACS分析；12.用BectonDickinsonFACSCanto分析樣品并且對樣品中發(fā)熒光的核百分比進行定量；13.使用公式計算各樣品的中和百分比%中和=[發(fā)熒光的核的百分比(不加入血清)-發(fā)熒光核的百分比(血清樣品)/發(fā)熒光的核的百分比(不加入血清)]x100。外周血單核細胞的體外抗原再刺激將使用注射器和18G針頭從頸靜脈采集的血樣(50mL)放入含100|iL5000U/mL肝素的50mL試管。然后以800g將細胞不停止地離心20分鐘，將血沉棕黃層采集入15mL試管并且用PBS稀釋至8mL。使用轉(zhuǎn)移用移液管將3.5mL菲科帕克加入到細胞混懸液底部，并且以1000g將樣品不停止地離心30分鐘。然后從Ficoll-PBS界面上采集外周血單核細胞，用PBS洗滌并且以5xl07mL重新懸浮于完全培養(yǎng)基(補充了10%FCS，L-谷氨酰胺,青霉素(100U/mL)，鏈霉素(100pg/mL)和5QpM2-巰基乙醇的Dulbecco改良的Eagles培養(yǎng)基)中。為了進行抗原再刺激測定，將IOO|iL細胞(5xl07孔)等分入96-孔組織培養(yǎng)平板，向其中一式三份加入IOO^L單獨的培養(yǎng)基或含5，10，20或40ng/mLgB蛋白的培養(yǎng)基(終濃度2.5，5,10或20jng/mL抗原)。在37。C下增濕孵育箱內(nèi)5天培養(yǎng)后，用20|LiL1iuCi氚標記胸苷將所有孔脈沖24小時。然后使用PackardHarvester將細胞采集在玻璃濾膜上，放入具有Microscint閃爍液的膠巻暗盒內(nèi)并且使用自動化微量培養(yǎng)板閃爍計數(shù)器測定P-放射。結(jié)果肺內(nèi)和皮下免疫接種使用ISCOMATRIXTM佐劑配制的重組CMVAgB抗原后的免疫應(yīng)答綿羊接受三次皮下或肺內(nèi)劑量，即間隔3周的使用ISCOMATRIXtm佐劑配制的CMVAgB抗原。在首次劑量前l(fā)周，首次劑量后2周和第二和第三次劑量后1周采集血清和BAL樣品。就抗體EIA數(shù)據(jù)而言，扣除預(yù)先免疫抗體滴度。使用ISCOMATRIXTM佐劑配制的AgB的這些實驗結(jié)果(圖6)廣泛與使用ISCOMATRIXTM佐劑配制的低劑量的流感抗原(0.04pg)的實施例2中所示的那些類似，其中肺內(nèi)后的血清IgG和IgA應(yīng)答與三次劑量后皮下遞送的那些相當(dāng)。然而，與使用流感抗原制品獲得的結(jié)果相反，使用ISCOMATRIXTM佐劑配制的通過肺內(nèi)途徑遞送的AgB僅在兩次劑量后就誘導(dǎo)了與皮下遞送相當(dāng)?shù)难錓gG和IgA,并且在檢驗到一次劑量有應(yīng)答時某些更高的血清IgG(圖6a和b)。就肺內(nèi)抗體應(yīng)答而言，免疫接種使用ISCOMATRIXtm佐刑配制的AgB的免疫接種后的應(yīng)答再次與使用應(yīng)用ISCOMATRIXtm佐刑配制的低劑量流感抗原進行的觀察結(jié)果類似。使用ISCOMATRIXtm佐刑配制的厶gB在肺內(nèi)遞送時3次劑量后在肺中誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答顯著高于皮下遞送相同制品時誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答(圖6c和d)。就功能性抗體誘導(dǎo)而言，對血清進行的CMV中和測定結(jié)果與在EIA中對血清IgG應(yīng)答獲得的那些一致性(圖7)。肺內(nèi)和皮下遞送使用ISCOMATRIXTM佐劑配制的AgB的誘導(dǎo)的中和抗體應(yīng)答顯著高于預(yù)先免疫接種血清。中和應(yīng)答在3次劑量后進一步增加。結(jié)果表明通過肺內(nèi)和皮下途徑遞送在使用ISCOMATRIXtm佐刑配制抗原時的血清中的中和抗體誘導(dǎo)等效性。來自使用AgB再刺激外周血單核細胞的測定結(jié)果(圖8)表明使用ISCOMATRIXTM佐劑配制的通過肺內(nèi)或皮下途徑遞送的抗原在2-3次劑量后誘導(dǎo)T細胞應(yīng)答(刺激指數(shù)為4或4以上)。兩種遞送途徑均誘導(dǎo)了等效的T細胞應(yīng)答。實施例5通過疫苗接種，經(jīng)肺內(nèi)途徑使用不同佐劑技術(shù)誘導(dǎo)的全身和粘膜免疫性進行這些研究以便檢驗非ISCOMATRIXTM的佐劑在通過肺內(nèi)途徑遞送時是否能夠誘導(dǎo)抗原特異性粘膜和全身抗體應(yīng)答。使用應(yīng)用幾種可替代選擇佐劑配制的流感抗原對綿羊組進行免疫接種并且將應(yīng)答與ISCOMATRIXTM佐劑制品比較(表5)。表5通過肺內(nèi)途徑免疫接種使用各種佐劑制品配制的流感抗原的綿羊組<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實驗方法佐劑制品的制備A.通過下列方法制備脂質(zhì)體緩沖溶液IR緩沖液:0.14MNaCl，3mMKCl，8mMNa2HP04,0.05mMCaCl2.2H20，1.5raMKH2P04pH7.2IVD緩沖液:0.14MNaCl，3.5mMNa2HP04，1.4mMNaH2PO"2H20pH7.21.制備11.4mg/mL膽固醇，12.4mg/mL二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和MegalO在IR緩沖液中的溶液(Chol/DPPC)。2.在30分鐘內(nèi)通過添加IVD緩沖液逐步按照1/40稀釋Chol/DPPC。3.通過在40。C下使用ST200透析過濾柱(Nephral)超濾將稀釋的溶液濃縮至原始稀釋體積的1/40。4.通過使用25個體積的IVD緩沖液超濾洗滌濃縮溶液。5.通過進一步超濾將Chol/DPPC溶液濃縮2倍。6.在擠壓液體前將Chol/DPPC在4(TC下孵育至少1小時。7.使用安裝了在整個操作中維持在42。C下的lOmLThe函barrelExtruder的液體擠壓機(T.001NorthernLipidsInc.,Canada)從Chol/DPPC中擠出脂質(zhì)體。8.使用1400-200OkPa壓力通過0.1PC盤式過濾器對10mL批量的Choi/DPPC進行擠壓。9.重復(fù)該過程至所有Chol/DPPC溶液在系統(tǒng)中均通過了10次。10.測定所得脂質(zhì)體的膽固醇和DPPC含量并且在電子顯微鏡下使用負染色法檢驗，以便評價大小和均勻性。B.MPL的制備將脂質(zhì)A單磷?；?MPL)(SigmaL6895)以2mg/mL重新懸浮于DMSO(SigmaD2650)并且維持在4'C下至使用。C.CpG的制備將CpG(Sigma-Genosys10624856-Oil)重新懸浮于10mMTris/lmMEDTApH8中并且維持在4°C下至使用。D.佐劑制品的制備通過使用PBS作為稀釋劑將相關(guān)成分混合制備佐劑制品，此后添加流感抗原(表5)。此后，使含脂質(zhì)體的制品在設(shè)定為4的使用1/8英寸探頭的VirSonic超聲處理器中進行超聲處理。這些制品接受2次5秒的超聲處理，間隔30秒，所有處理均在冰上進行。免疫接種給綿羊組免疫接種表5中所述的流感抗原和佐劑制品，并且使用實施例1中所述的方法取血。BAL采集如實施例1中所述進行BAL樣品采集。通過ELISA評價抗體應(yīng)答如實施例1中所述進行血清和BAL樣品中對流感抗原的抗體應(yīng)答測定。血細胞凝集抑制活性評價如實施例1中所述對血清和BAL樣品中的HAI活性進行測定。結(jié)果流感抗原與各種佐劑的制品的肺內(nèi)疫苗接種后的免疫應(yīng)答評價綿羊接受3周間隔的三次劑量。在首次劑量前和2周和第二和第三次劑量后1周采集血清和肺(BAL)樣品。就抗體ELISA數(shù)據(jù)而言，扣除預(yù)先免疫接種抗體滴度。這些實驗的結(jié)果表明不同佐劑制品在與合并抗原并且通過肺內(nèi)途徑遞送時誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的能力方面可變(圖9和10)。所有佐劑均比單獨的抗原在誘導(dǎo)血清中的抗體方面賦予了一定有益性。含ISCOMATRIXtm佐刑的制品在血清和BAL中誘導(dǎo)的應(yīng)答顯著優(yōu)于三次劑量后單獨的抗原，并且就此而言血清IgG在兩次劑量后誘導(dǎo)優(yōu)良的應(yīng)答。特別注意到證實ISCOMATRIXTM佐劑制品在兩次劑量后的血清中和在三次劑量后的BAL中誘導(dǎo)功能性(HAI)抗體的數(shù)據(jù)(圖10)。數(shù)據(jù)(圖9)還提示來自將MPL添加到ISCOMATRIXtm佐刑制品中的作用，即超過單獨的佐劑在血清IgG和IgA抗體中的顯著增加分別在免疫接種含抗原和ISCOMATRIXtm佐刑+MPL的制品的綿羊中的1和2次劑量后出現(xiàn)。參考文獻Casetti,M,C.，efa/.Reportofaconsultationonroleofimmunologicalassaystoevaluateefficacyofinfluenzavaccines.InitiativeforVaccineResearchandGlobalInfluenzaProgramme,WorldHealthOrganization,Geneva,Switzerland,25January2005.Wccf"e(2006〉,24(5):5"-543,Coulter,A,Wa,.Studiesonexperimentaladjuvantedinfluenzavaccines:comparisonofimmunestimulatingcomplexes(Iscoms)andoil-in-watervaccines,Kac"'加(l柳)，16(11/12):1243-1253.Cox，J.C.andCoulter,A.R,Adjuvants—aclassificationandreviewoftheirmodesofaction,K"cc/"e(1997)，15(3):248-256.Edwards,D.A.andDunbar,C.Bioengineeringoftherapeuticaerosols,及ev五"g(2002)，4:93-107.Gonda,I.Theascentofpulmonarydrugdelivery.J/VwmSt/(2000)，89:940-5Griffith,G.D.，Wfl/.Liposomally-encaps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