專利名稱：：重組hcve2糖蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于丙型病毒性肝炎(HCV)感染的新型和改進(jìn)的治療。特別地，本發(fā)明涉及疫苗組合物，其用于基于施用重組HCV多蛋白來預(yù)防性和治療性地治療HCV感染。
背景技術(shù)：
：根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報告，丙型肝炎病毒(HCV)在世界范圍內(nèi)感染大約1.7億至2億人。盡管政府已增加了關(guān)于HCV如何傳播的教育，以及盡管采取了預(yù)防計劃，但是HCV仍繼續(xù)擴(kuò)散。大約80。/。的感染了HCV的人仍然是該病毒的攜帶者。在澳大利亞，每年報導(dǎo)大約16，OOO例新的HCV感染病例，新感染在靜脈注射吸毒者(injectiondruguser)中最為盛行。HCV是最常見的血液傳播的病毒感染，其導(dǎo)致相當(dāng)大比例的人口死亡。已知HCV感染受害者的肝臟和某些免疫細(xì)胞。因此，HCV比其他形式的肝炎更頻繁地導(dǎo)致嚴(yán)重的肝病，例如纖維化、肝硬變、脂肪變性和肝細(xì)胞癌(肝癌)。HCV是導(dǎo)致需要肝移植的首要原因。通常認(rèn)為，感染的急性期常常由于該感染的亞臨床性質(zhì)而未被識別，并且80%的個體發(fā)展成慢性狀態(tài)。慢性感染是免疫系統(tǒng)不能產(chǎn)生針對該病毒的足夠免疫應(yīng)答的結(jié)果。目前，沒有用于HCV的疫苗，并且唯一可獲得的用于治療HCV的療法依賴于抗病毒藥物和藥物組合的開發(fā)?？共《舅幬镌O(shè)計背后的一般理念是鑒定可以被使得喪失功能或被抑制的病毒蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分。選擇用于患有中度或嚴(yán)重纖維化的患者的標(biāo)準(zhǔn)治療包括a-干擾素或利巴韋林的組合。a-干擾素和利巴韋林聯(lián)合療法的抗病毒效果導(dǎo)致血液中HCV水平的快速降低，甚至在單次劑量后。然而，用于HCV的常規(guī)a-干擾素治療具有幾個缺點。例如，(i)當(dāng)在數(shù)周或數(shù)月的治療后停止a-干擾素治療時，已知病毒載量水平快速地重新建立；(ii)使用a-干擾素/利巴韋林的治療伴隨著嚴(yán)重的副作用，包括流感樣癥狀，減少的紅細(xì)胞或白細(xì)胞計數(shù)，骨髓抑制，神經(jīng)精神效應(yīng)，特別是抑郁癥和貧血；(Hi)有效的治療需要患者堅持接受頻繁的給藥方案，因為a-干擾素快速地被吸收和被從身體中去除；以及(v)此類治療的高費(fèi)用。上述缺點中的一些(特別地提及上述的第(iii)項)已通過使a-干擾素經(jīng)歷其中將聚乙二醇分子附著至干擾素的'PEG化，而得到了解決。PEG化的干擾素與利巴韋林的聯(lián)合施用增加了干擾素的半衰期，并且具有減少給藥頻率從而增加患者順應(yīng)性的優(yōu)點。然而，已證明這樣的治療在少于50。/。的接受治療的患者中是有效的。基于慢性HCV受害者的數(shù)目不斷增加的情況，存在對于開發(fā)用于預(yù)防性和治療性目的的疫苗的需要。開發(fā)提供針對HCV感染的保護(hù)的成功疫苗一直以來是很困難的。該困難的一個所提及的原因是，作為RNA病毒的HCV在遺傳上是不穩(wěn)定的，這使得其能夠達(dá)到高的病毒突變率，從而逃避身體的免疫應(yīng)答。因此，鑒定病毒的保守的部分是對研究者的挑戰(zhàn)。HCV被分類在黃病毒科(FUviv"idae)的分開的屬(丙型肝炎病毒屬(Hepacivirus))中。HCV是非致細(xì)胞病變的，而是觸發(fā)免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答快速清除感染或起始炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致慢性感染和肝損傷。在~30。/。的急性病例中發(fā)生永久性地清除HCVRNA而無需治療的自發(fā)解除感染，這暗示了對HCV的天然免疫性，從而對于疫苗開發(fā)的前景而言是令人鼓舞的。然而，HCV感染的該結(jié)果的決定因素是未知的。HCV病毒粒子包含大約9.5kb的正義單鏈RNA基因組。該基因組編碼具有3，010至3，030個氨基酸的單個多蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白包括形成病毒核殼體的核心蛋白和兩個包膜糖蛋白E1和E2。一些最近的向著HCV疫苗開發(fā)的努力集中在HCV包膜糖蛋白E1和E2上。已發(fā)現(xiàn)，E1和E2在病毒粒子的表面上形成非共價結(jié)合的異二聚體，其介導(dǎo)病毒的附著和進(jìn)入，并從而提供了用于宿主免疫應(yīng)答的靼標(biāo)。最近的研究表明，包膜糖蛋白E2與CD4+T細(xì)胞表面上的CD81結(jié)合。在該結(jié)合過程中，E2經(jīng)歷快速的構(gòu)象變化。迄今為止，還沒有研究能夠提供合適的經(jīng)修飾的包膜糖蛋白，其可以展現(xiàn)出"野生型，，水平的CD81結(jié)合。在整個本說明書(包括權(quán)利要求)中，HCV包膜糖蛋白E1和E2的多肽殘基的所有編號均基于原型HCV-H77多蛋白序列，Genbank登錄號AF009606。糖蛋白E1的成熟形式被包括于多蛋白殘基191和383之間，糖蛋白E2的成熟形式被包括于多蛋白殘基384和746之間。E2的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)被包括于多蛋白殘基384和661之間(E2661)。重組形式的E2^RBD有效地從經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中分泌，并且能夠與CD81和其他細(xì)胞表面分子相互作用。E2RBD包含兩個可變區(qū)，證l(384-410)和證2(474-482)。位于E2的N-末端的可變區(qū)1是HCV基因組中最可變的區(qū)域，其具有高度的免疫原性并且快速地積累中和逃避突變(neutralizationescapemutation)。盡管HVR1中存在高水平的氨基酸變異性，但存在對于病毒進(jìn)入而言重要的堿性殘基的總體保守性。可變區(qū)2位于側(cè)翼為Cys-459和Cys-486的區(qū)域內(nèi)。盡管最初被描述為7-殘基序列，但是來自不同HCV基因型的E2序列的比較表明其可從殘基461延伸至481。與HVR1相比，HVR2的序列在被HCV感染的人中是相對穩(wěn)定的，雖然在該位置處的突變的積累已顯示與對干擾素-a治療的應(yīng)答性相關(guān)。在導(dǎo)致本發(fā)明的工作中，本發(fā)明人觀察到，代表了HCV的6種主要基因型的E2序列的比對揭示出了之前未描述過的在多蛋白殘基570和580之間可變區(qū)，其在基因型之內(nèi)相對保守，但由于氨基酸的插入和缺失而在各基因型之間發(fā)生變化。因此，氨基酸570-580被稱為基因型間可變區(qū)(intergenotypicvariableregion,igVR)。來自HCV的所7有6種基因型以及其中的趨異分離林(divergentisolate)的相應(yīng)區(qū)域的檢查顯示，igVR的側(cè)翼也為保守的半胱氨酸殘基(Cys-569和Cys-581)，這表明這些序列形成受二疏化物約束的環(huán)(disulfide-constrainedloops)。迄今為止，使用適應(yīng)性免疫應(yīng)答途徑進(jìn)行的HCV的疫苗治療還未曾獲得成功。由于用于治療HCV的目前的實驗性療法的缺點，因而存在對于提供細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答以治療HCV感染的未滿足的需要。本發(fā)明的一個目的是提供用于預(yù)防或治療HCV感染的免疫治療方法。本發(fā)明的另一個目的是提供用于預(yù)防或治療HCV感染的免疫治療方法。本發(fā)明的另一個目的是提供經(jīng)修飾的E2糖蛋白，所述糖蛋白接近對于HCV感染的天然細(xì)胞受體的"野生型"結(jié)合水平。國際專利/^開號W002/22155(HawaiiBiotechnologyGroup,Inc.)公開了截短的HCVE2多肽，其缺少HVR1區(qū)域并且當(dāng)在宿主細(xì)胞中以重組形式表達(dá)時能夠分泌入生長培養(yǎng)基中。該多蛋白也可以缺少在殘基662之后的其C-末端。國際專利公開號W003/022880(XTLBiopharmaceuticalsLtd.)也公開了缺少HVR1區(qū)域的E2蛋白的截短形式。上述論述意在介紹本發(fā)明的領(lǐng)域，而無論如何不應(yīng)當(dāng)解釋為承認(rèn)了該領(lǐng)域中的共有一般知識的狀態(tài)。本說明書中提及的出版物的參考書目詳情列于本說明書的末尾。不將并且不應(yīng)當(dāng)將在本說明書中對于任何現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的參考視作對于該文獻(xiàn)形成共有一般知識的一部分的承認(rèn)或任何形式的暗示。發(fā)明概述在整個本說明書和其后的權(quán)利要求書中，除非上下文另外要求，詞語"包括"和/或變化形式例如"包含"或"含有"將理解為意指包括所述的整數(shù)或步驟或者整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他整數(shù)或步驟或者整數(shù)或步驟的組。在一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白，其包含包括HVR1、HVR2和igVR可變區(qū)的HCV-E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)，其中在所述可變區(qū)的至少一個中，可變區(qū)的至少一部分被柔韌的連接體序列替代。在另一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白，其包含包括HVR1、HVR2和igVR可變區(qū)的HCV-E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)，其中HVR2可變區(qū)的至少一部分被去除或被柔韌的連接體序列替代。在另外一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白，其包含包括HVR1、HVR2和igVR可變區(qū)的HCV-E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)，其中igVR可變區(qū)的至少一部分被去除或被柔韌的連接體序列替代。如上寬泛地描述的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白是這樣的糖蛋白，其基本上接近HCV病毒粒子的野生型構(gòu)象，并且保持結(jié)合HCV受體CD81和構(gòu)象依賴性抗體的能力。本發(fā)明還提供了包含如上寬泛地描述的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的組合物。可以將這樣的組合物配制成疫苗組合物，其優(yōu)選地包含佐劑。在另外一個方面，本發(fā)明還提供了用于在患者中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如上寬泛地描述的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白。在這一方面，本發(fā)明包括用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如上寬泛地描述的經(jīng)4務(wù)飾的HCVE2糖蛋白。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了如上寬泛地描述的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白的用途，所述用途為用于在患者中引發(fā)免疫應(yīng)答，或者用于制備用于在患者中引發(fā)免疫應(yīng)答的藥物。在該進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括如上寬泛地描述的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白的用途，所述用途為用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染，或者用于制備用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染的藥物。在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用于在患者中引發(fā)免疫應(yīng)答的試劑，所述試劑包含如上寬泛地描述的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白。在該進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染的試劑，所述試劑包含如上寬泛地描述的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白。本發(fā)明還提供了針對如上寬泛地描述的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白而產(chǎn)生的分離的抗體。所述抗體可以是單克隆的或多克隆的。在該方面，本發(fā)明還提供了用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如上所述的抗體。本發(fā)明還提供了如上所述的抗體的用途，所述用途為用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染，或者用于制備用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染的藥物。在該方面，本發(fā)明還提供了用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染的試劑，所述試劑包含如上所述的抗體。此外，本發(fā)明提供了用于在患者中檢測HCV感染的方法，所述方法包括在允許形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下，使來自所述患者的生物樣品與如上所述的抗體相接觸；以及檢測所述復(fù)合物，其中所述復(fù)合物的形成表明在所述樣品中存在有HCV。附圖簡述圖1顯示了在細(xì)胞裂解物中含有單一可變區(qū)缺失的E1E2的表達(dá)和異二聚化。在i)非還原性條件和U)還原性條件(+P-巰基乙醇)下，用A.抗-ElE2多克隆抗體(779)、B.抗-El單克隆抗體(A4)、C.抗-E2單克隆抗體(All)、和D.抗-E2構(gòu)象依賴性單克隆抗體(H53)來免疫沉淀用野生型(pElE2)、含有一個可變區(qū)缺失的pElE2、或空10載體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的經(jīng)代謝性標(biāo)記的細(xì)胞裂解物。所有樣品在10-15%SDS-PAGE梯度凝膠上走樣，并使用磷光成像儀(phosphoimager)來可視化。該數(shù)據(jù)是兩次獨(dú)立實驗的代表。圖2顯示了來自基因型1-6的不同HCVE2糖蛋白序列的ClustalX比對。兩個公認(rèn)的高變區(qū)HVR1和HVR2以及新的可變區(qū)igVR被突出顯視(灰色)。還標(biāo)示出了位于HVR2和igVR區(qū)側(cè)翼的保守半胱氨酸殘基以及被提出將N-末端區(qū)域錨定至E2糖蛋白的其余部分的第一個保守半胱氨酸殘基(黑體)。標(biāo)示出了CD81-結(jié)合決定子(加框的)和關(guān)于廣泛中和性抗體AP33的表位的位置。還顯示了與可變區(qū)相關(guān)的N-聯(lián)糖基化位點(樹狀物)。預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域加有下劃線。圖3顯示了含有單一可變區(qū)缺失的E1E2糖蛋白向逆轉(zhuǎn)錄病毒假型HIV-1顆粒中的摻入。A.從293T細(xì)胞的組織培養(yǎng)液中沉淀出經(jīng)代謝性標(biāo)記的HCV津唐蛋白4艮型HIV-1顆粒(HCVglycoproteinpseudotypedHIV-1particles),所述293T細(xì)胞在裂解前用野生型(pElE2)、含有可變區(qū)缺失的pElE2或空載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體H53來免疫沉淀E1E2異二聚體。所有樣品在非還原性條件下在10-15%SDS-PAGE梯度凝膠上進(jìn)行分離，并使用磷光成像儀來可視化。B.HIV-l結(jié)構(gòu)蛋白的加工和摻入至逆轉(zhuǎn)錄病毒^f艮型HIV-l顆粒中。使用性標(biāo)記的HCV糖蛋白假型HIV-l顆粒的HIV-l結(jié)構(gòu)蛋白Pr55"g、p24"、p66"和pl7"A。所有樣品在7.5-15%SDS-PAGE梯度凝膠上進(jìn)行分離，并使用磷光成像儀來可視化。該數(shù)據(jù)是兩次獨(dú)立實驗的代表。圖4顯示了含有單一可變區(qū)缺失的HCV糖蛋白假型HIV-1顆粒進(jìn)入Huh7細(xì)胞的能力。以三次重復(fù)，將來自用載體NL4-3.LUC.R-E-和野生型(pElE2)、在可變區(qū)中含有缺失的pElE2或空載體共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的組織培養(yǎng)液用于感染Huh7細(xì)胞。裂解Huh細(xì)胞，并使用裝配有發(fā)光光學(xué)器件(luminescenceoptics)的Fluostar來觀'J量螢光素酶活性(相對光單位)。從三次重復(fù)的感染中計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實驗的代表。圖5顯示了含有單一可變區(qū)缺失的HCVE1E2結(jié)合CD81-LEL的能力。A.E2的細(xì)胞內(nèi)形式結(jié)合CD81-LEL的能力。以漸進(jìn)式的兩倍稀釋，將用野生型(pElE2)、具有可變區(qū)缺失的pElE2或空載體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的經(jīng)代謝性標(biāo)記的細(xì)胞裂解物施加至用CD81MBP-LEL(殘基113-201)包被的酶免疫測定平板。使用抗-E2構(gòu)象依賴性抗體H53和兔抗小鼠辣根過氧化物酶(HRP)綴合物來檢測結(jié)合的E2。在450nm處讀取吸光度值(光密度)，并減去在620nm處的背景。B.摻入病毒粒子中的E2糖蛋白結(jié)合CD81-LEL。以漸進(jìn)式的兩倍稀釋，將經(jīng)代謝性標(biāo)記的HCV糖蛋白假型HIV-1顆粒的裂解物施加至用CD81MBP-LEL(殘基113-201)包被的酶免疫測定平板。如對于A所描述的，檢測結(jié)合的E2。數(shù)據(jù)是兩次獨(dú)立實驗的代表。圖6顯示了在細(xì)胞裂解物中含有經(jīng)修飾的單一可變區(qū)缺失的E1E2的表達(dá)和異二聚化。在i)非還原性條件和ii)還原性條件(+p-巰基乙醇)下，用A.抗-E1E2多克隆抗體(779)、B.抗-El單克隆抗體(A4)、C.抗-E2單克隆抗體(All)、和D.抗-E2構(gòu)象依賴性單克隆抗體(H53)來免疫沉淀用野生型(pElE2)、或含有具有延長的連接體的單一可變區(qū)缺失的pElE2、或空載體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的經(jīng)代謝性標(biāo)記的細(xì)胞裂解物。所有樣品在10-15%SDS-PAGE梯度凝膠上走樣，并使用磷光成像儀來可視化。數(shù)據(jù)是兩次獨(dú)立實驗的代表。圖7顯示了含有經(jīng)修飾的單一可變區(qū)缺失的E1E2糖蛋白向HCV糖蛋白假型HIV-1顆粒中的摻入。A.從293T細(xì)胞的組織培養(yǎng)液中沉淀出經(jīng)代謝性標(biāo)記的E1E2-假型HIV-1顆粒，所述293T細(xì)胞在裂解前用NL4-3.LUC.R-E-和野生型(pElE2)、含有具有延長的連接體的單一可變區(qū)缺失的pElE2或空栽體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體H53來免疫沉淀E1E2異二聚體。所有樣品在非還原性條件下在10-15%SDS-PAGE梯度凝膠上進(jìn)行分離，并使用磷光成像儀來可視化。B.HIV-1結(jié)構(gòu)蛋白的加工和摻入至HCV糖蛋白-假型HIV-1顆粒中。使用來自被的E1E2—艮型HIV-l顆粒的HIV-l結(jié)構(gòu)蛋白Pr55"g、pl7MA、p24"和p66"。所有樣品在7.5-15%SDS-PAGE梯度凝膠上進(jìn)行分離，并使用磷光成像儀來可視化。數(shù)據(jù)是兩次獨(dú)立實驗的代表。圖8顯示了含有單一經(jīng)修飾的可變區(qū)缺失的HCV糖蛋白-假型HIV-1顆粒進(jìn)入Huh7細(xì)胞的能力。以三次重復(fù)，將來自用NL4-3.LUC.R-E-和野生型(pElE2)、含有具有延長的連接體的單一可變區(qū)缺失的pElE2或空載體(pCDNA4)共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的組織培養(yǎng)液用于感染Huh7細(xì)胞。裂解Huh7細(xì)胞，并使用裝配有發(fā)光光學(xué)器件的Fluostar來測量螢光素酶活性(相對光單位)。從三次重復(fù)的感染中計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用Student'st-檢驗來計算/7"值。數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實驗的代表。圖9顯示了含有單一經(jīng)^f，飾的一個可變區(qū)缺失的E2結(jié)合CD81-LEL的能力。A.以漸進(jìn)式的兩倍稀釋，將用野生型(pElE2)、含有經(jīng)修飾的一個可變區(qū)缺失的pElE2或空載體(pCDNA4)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的經(jīng)代謝性標(biāo)記的細(xì)胞裂解物施加至用CD81MBP-LEL(殘基113-201)包被的酶免疫測定平板。使用抗-E2構(gòu)象依賴性單克隆抗體H53和兔抗小鼠辣根過氧化物酶(HRP)綴合物來檢測結(jié)合的E2。在"Onm處讀取吸光度值，并減去在620nm處的背景。數(shù)據(jù)是兩次獨(dú)立實驗的代表。B.在病毒裂解物中，摻入病毒粒子中的E2糖蛋白結(jié)合CD81-LEL。以漸進(jìn)式的兩倍稀釋，將經(jīng)代謝性標(biāo)記的E1E2-假型HIV-l顆粒的裂解物施加至用CD81MBP-LEL(殘基113-201)包被的酶免疫測定平板，并檢測結(jié)合的E2，如上所描述的。在45Qnm處讀取吸光度值，并減去在620nm處的背景。C.B的獨(dú)立重復(fù)。圖10顯示了含有多重可變區(qū)缺失的E1E2的未成熟形式的表達(dá)和異二聚化。在i)非還原性條件和ii)還原性條件(+|3-巰基乙醇)下，用A.抗-ElE2多克隆抗體(779)、B.抗-El單克隆抗體(A4)、C.抗-E2單克隆抗體(All)、和D.抗-E2構(gòu)象依賴性單克隆抗體(H53)來免疫沉淀用野生型(pElE2)、含有多重可變區(qū)缺失的pElE2、或空載體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的經(jīng)代謝性標(biāo)記的細(xì)胞裂解物。所有樣品在10-15%SDS-PAGE梯度凝膠上走樣，并使用磷光成像儀(phosphoimager)來可13視化。數(shù)據(jù)是兩次獨(dú)立實驗的代表。圖11顯示了含有多重可變區(qū)缺失的E1E2糖蛋白向HCV糖蛋白-假型HIV-1顆粒中的摻入。A.從293T細(xì)胞的組織培養(yǎng)液中沉淀出經(jīng)代謝性標(biāo)記的E1E2-假型HIV-1顆粒，所述293T細(xì)胞在裂解前用NL4-3.LUC.R-E-和野生型(pElE2)、含有多重可變區(qū)缺失的pElE2或空載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。用構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體H53來免疫沉淀E1E2異二聚體。所有樣品在非還原性條件下在10-15%SDS-PAGE梯度凝膠上進(jìn)行分離，并使用磷光成像儀來可視化。B.HIV-1結(jié)構(gòu)蛋白的加工和摻入至HCV糖蛋白-假型HIV-1顆粒中。使用來自被HIV-1感染的個體的IgG(IgG14)來免疫沉淀來自裂解的經(jīng)代謝性標(biāo)記的ElE2-假型HIV-1顆粒的HIV-l結(jié)構(gòu)蛋白Pr55"g、pl7MA、p24"和p66"。樣品在還原性條件下在7.5-15%SDS-PAGE梯度凝膠上進(jìn)行分離，并使用磷光成像儀來可視化。數(shù)據(jù)是兩次獨(dú)立實驗的代表。圖12顯示了含有多重可變區(qū)缺失的ElE2-假型HIV-l顆粒進(jìn)入Huh7細(xì)胞的能力。以三次重復(fù)，將來自用HIV-1螢火蟲螢光素酶栽體(NL4-3.LUC.R-E-)和野生型(pElE2)、含有多重可變區(qū)缺失的pElE2或空載體(pCDNA4)共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的組織培養(yǎng)液用于感染Huh7細(xì)胞。裂解Huh7細(xì)胞，并使用裝配有發(fā)光光學(xué)器件的Fluostar來測量螢光素酶活性。從三次重復(fù)的感染中計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實驗的代表。圖13顯示了含有多重可變區(qū)缺失的E2結(jié)合CD81-LEL的能力。A.以漸進(jìn)式的兩倍稀釋，將用野生型(PE1E2)、含有多重可變區(qū)缺失的pElE2或空栽體(pCDNA4)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的經(jīng)代謝性標(biāo)記的細(xì)胞裂解物施加至用CD81MBP-LEL(殘基113-201)包被的酶免疫測定平板。使用抗-E2構(gòu)象依賴性單克隆抗體H53和兔抗小鼠辣根過氧化物酶(HRP)綴合物來檢測結(jié)合的E2。在450nm處讀取吸光度值，并減去在620nm處的背景。B.摻入病毒粒子中的形式的含有多重可變區(qū)缺失的E2結(jié)合CD81-LEL的能力。以漸進(jìn)式的兩倍稀釋，將經(jīng)代謝性標(biāo)記的ElE2-假型HIV-1顆粒的裂解物施加至用CD81MBP-LEL(殘基113-201)包被的酶免疫測定平板。如上所描述的，檢測結(jié)合的E2。在450nm處讀取吸光度值，并減去在620mn處的背景。數(shù)據(jù)是兩次獨(dú)立實驗的代表。圖14顯示了在細(xì)胞裂解物中含有單一和多重可變區(qū)缺失的E2RBD(殘基384-661)的表達(dá)。A.用抗-E2構(gòu)象依賴性抗體H53來免疫沉淀用野生型(E2-myc)、含有單一或多重可變區(qū)缺失的E2-myc或空載體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的經(jīng)代謝性標(biāo)記的細(xì)胞裂解物。B.含有單一和多重可變區(qū)缺失的E2RBD(殘基384-661)分泌入上清液中。用抗-E2構(gòu)象依賴性抗體H53來免疫沉淀來自用野生型(E2-myc)、含有單一或多重可變區(qū)缺失的E2-myc或空載體轉(zhuǎn)染的經(jīng)代謝性標(biāo)記的293T細(xì)胞的上清液。所有樣品在10-15。/cSDS-PAGE梯度凝膠上進(jìn)行分離，并使用磷光成像儀來可視化。關(guān)于單一可變區(qū)缺失的數(shù)據(jù)來自一個實驗。圖15顯示了含有單一可變區(qū)缺失的E2RBD(殘基384-661)結(jié)合CD81-LEL的能力。A.以漸進(jìn)式的兩倍稀釋，將來自用野生型(E2-myc)、含有單一可變區(qū)缺失的E2-myc或空載體轉(zhuǎn)染的經(jīng)代謝性標(biāo)記的293T細(xì)胞的細(xì)胞裂解物施加至用CD81MBP-LEL(殘基113-201)包被的酶免疫測定平板。使用抗-E2構(gòu)象依賴性抗體H53和兔抗小鼠辣根過氧化物酶(HRP)綴合物來檢測結(jié)合的E2。在450nm處讀取吸光度值，并減去在認(rèn)處的背景。B.分泌的含有單一可變區(qū)缺失的E2RBD(殘基384-661)結(jié)合CD81-LEL的能力。以漸進(jìn)式的兩倍稀釋，將來自用野生型(E2-myc)、含有單一可變區(qū)缺失的E2-myc轉(zhuǎn)染的經(jīng)代謝性標(biāo)記的293T細(xì)胞的組織培養(yǎng)液施加至用CD81MBP-LEL(殘基113-201)包被的酶免疫測定平板。使用抗-E2構(gòu)象依賴性抗體H53和兔抗小鼠辣根過氧化物酶(HRP)綴合物來檢測結(jié)合的E2。在450nm處讀取吸光度值，并減去在620nm處的背景。數(shù)據(jù)來自單次實驗。圖16顯示了含有多重可變區(qū)缺失的E2RBD(殘基384-661)結(jié)合CD81-LEL的能力。A.以漸進(jìn)式的兩倍稀釋，將來自用野生型(E2-rayc)、含有多重可變區(qū)缺失的E2-myc或空載體轉(zhuǎn)染的經(jīng)代謝性標(biāo)記的293T細(xì)胞的細(xì)胞裂解物施加至用CD81MBP-LEL(殘基113-201)包被的酶免疫測定平板。在45Qnm處讀取吸光度值，并減去在620nm處的背景。B.分泌的含有多重可變區(qū)缺失的E2RBD(殘基384-661)結(jié)合CD81-LEL的能力。以漸進(jìn)式的兩倍稀釋，將來自用野生型(E2-myc)、含有多重可變區(qū)缺失的E2-myc或空載體轉(zhuǎn)染的經(jīng)代謝性標(biāo)記的293T細(xì)胞的上清液施加至用CD81MBP-LEL(殘基113-201)包被的酶免疫測定平板。在450nm處讀取吸光度值，并減去在620nm處的背景。數(shù)據(jù)來自單次實驗。圖17顯示了E2-myc蛋白與全長的表面表達(dá)的CD81的結(jié)合。將等量的從293T細(xì)胞產(chǎn)生的、單體的、分泌的E2-myc蛋白施加至用編碼全長CD81的載體轉(zhuǎn)染的CH0-Kl細(xì)胞。在于Y計數(shù)器中進(jìn)行測量之前，用碘化的9E10來檢測結(jié)合的E2-myc。三次獨(dú)立測定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。通過使用Studentst檢驗(假定不等方差(unequalvariance))與E2A23-mycE2構(gòu)建體進(jìn)行比較來得出P值。圖18顯示了E2-myc和E2Al23-myc被人構(gòu)象敏感型單克隆抗體檢測出的能力。對野生型(E2-myc)和E2Al23-myc進(jìn)行代謝性標(biāo)記，并用對于E2的三個免疫原性結(jié)構(gòu)域(A、B和C)特異的構(gòu)象依賴性人單克隆抗體的"CBH，，組來進(jìn)行免疫沉淀。通過下列方式來分析經(jīng)免疫沉淀的蛋白質(zhì)在非還原性條件下在10-15°/。聚丙烯酰胺梯度凝膠中進(jìn)行SDS-PAGE，然后在磷光成像儀中進(jìn)行掃描。圖19顯示了含有單一和多重可變區(qū)缺失的E1E2多蛋白的示意圖。pElE2載體編碼El(暗灰色)和E2(淺灰色)的全長H77c序列，其中包括在El和E2的C-末端處的其跨膜結(jié)構(gòu)域(水平條紋)和具有所標(biāo)示的信號肽酶切割位點(箭頭)的信號肽。E2可變區(qū)(加點的)和與HVR1相鄰的保守區(qū)(斜條紋)獨(dú)個地和組合地被所示的柔韌的Gly-Ser-Ser-Gly(GSSG)連接體基序替代。圖20顯示了重疊延伸PCR策略的示意圖。使用兩個寡核苷酸對從HCV糖蛋白模板序列(斜條紋)中刪除可變區(qū)，所述兩個寡核苷酸對各自包括所示的用于擴(kuò)增與HVR1相鄰的5'或3'片段的一個外部引物和一個內(nèi)部引物。內(nèi)部引物序列引入Gly-Ser-Ser-Gly連接體基序(粗體)和與各自的5'或3'片段互補(bǔ)的短'重疊，序列。這些序列退火從而形成用于第二輪PCR擴(kuò)增的模板，所述第二輪PCR擴(kuò)增使用外部引物來擴(kuò)16增缺失了HVR1的糖蛋白序列。圖21顯示了含有經(jīng)修飾的單一可變區(qū)缺失(具有延長的連接體)的HCVE1E2多蛋白的示意圖。pElE2載體編碼El(暗灰色)和E2(淺灰色)的全長H77c序列，其中包括在El和E2的C-末端處的其跨膜結(jié)構(gòu)域(垂直條紋)。還標(biāo)示了信號肽酶切割位點(箭頭)。E2可變區(qū)和與HVR1相鄰的保守區(qū)(con)被部分刪除，并且用柔韌的Gly-Ser-Ser-Gly連接體基序替代。圖22顯示了包含單一或多重可變區(qū)缺失的E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(E2RBD661)的示意圖。pE2661載體編碼E2RBD編碼性殘基384-661(E2-myc)。可變區(qū)(加點的)和與HVR1相鄰的保守序列(斜條紋)獨(dú)個地和組合地被所示的短的柔韌的Gly-Ser-Ser-Gly(GSSG)連接體基序替代。還在這些構(gòu)建體的C-末端處引入myc表位標(biāo)簽(垂直條紋)。圖23顯示了用于產(chǎn)生HCV糖蛋白-假型HIV-1顆粒的策略的示意圖。以及缺少其天然包膜基因且包含螢光素酶報告基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(HIV-1NL4-3.LUC.R—E_)共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒核心蛋白在細(xì)胞內(nèi)裝配，因而它們通過從質(zhì)膜中出芽、摻入HCVE1E2糖蛋白而獲得包膜。然后，收集這些病毒粒子，并用于經(jīng)歷一輪在Huh7細(xì)胞中的感染和復(fù)制。然后，通過在這些經(jīng)感染的Huh7細(xì)胞內(nèi)的所得的螢光素酶活性來定量由E1E2介導(dǎo)的進(jìn)入的水平。圖24顯示了E2-myc和E2Al23-myc蛋白凈皮一組從受HCV感染的個體中獲得的人血清免疫沉淀的能力。通過下列方式來分析經(jīng)免疫沉淀的蛋白質(zhì)在非還原性條件下在10-15。/。聚丙烯酰胺梯度凝膠中進(jìn)行SDS-PAGE,然后在磷光成像儀中進(jìn)行掃描。每一個泳道下面是對于該血清樣品而言的HCVRNA的狀態(tài)，使用BioRadMonolisa、AbbotMurex或ChironRIBA測定法之一檢測的HCV特異性抗體的存在，和50%中和抗體滴度。分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物示于左邊。圖25顯示了含有可變區(qū)缺失的E2-myc蛋白與重組的CD81大細(xì)胞外環(huán)相互作用的能力。A.野生型E2-myc、E2A12-myc、E2A23-myc和含有突變L441M(其破壞與CD81的相互作用)的E2-myc蛋白與野生型重組MBP-LEL相互作用的能力。將E2-myc蛋白在用MBP-LEL包被的酶免疫測定平板中進(jìn)行系列稀釋。數(shù)據(jù)是2至7次獨(dú)立實驗的平均值，并且表示為相對于野生型E2-myc而言的平均結(jié)合百分比±標(biāo)準(zhǔn)偏差。B.WTE2-myc、E2Al3-myc和E2A123-myc與野生型重組MBP-LEL(實線)或含有F186S突變(其破壞E2結(jié)合)的重組MBP-LEL(虛線)相互作用的能力。數(shù)據(jù)是2至7次獨(dú)立實驗的平均值，并且表示為相對于野生型E2-myc而言的平均結(jié)合百分比土標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖26顯示了含有可變區(qū)缺失的E2-myc蛋白與全長的表面表達(dá)的CD81相互作用的能力。A.WTE2-myc、E2A12-myc、E2A23-myc和含有突變L441M的E2-myc蛋白與用全長CD81轉(zhuǎn)染的CH0-Kl細(xì)胞相互作用的能力。將野生型或缺失了可變區(qū)的E2-myc蛋白的稀釋物施加至水冷的用人CD81轉(zhuǎn)染的CH0-Kl細(xì)胞，并在水上溫育4小時。在洗滌后，加入lxl06CPMmI-9E10，并且將平板在室溫下溫育l小時，洗滌，并在PackardAutoGammaCounter中進(jìn)行計數(shù)。所顯示的數(shù)據(jù)是2至5次獨(dú)立實驗的相對于野生型而言的平均結(jié)合百分比土標(biāo)準(zhǔn)誤差。B.WTE2-myc、E2Al23-myc和E2Al3-myc與用全長人CD81(實線)或F186S-CD81(虛線)轉(zhuǎn)染的CH0-K1細(xì)胞相互作用的能力。所顯示的數(shù)據(jù)是2至5次獨(dú)立實驗的相對于野生型而言的平均結(jié)合百分比±標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖27顯示了純化的HCVE2蛋白變體在4-20%聚丙烯酰胺梯度凝膠中的SDS-PAGE，其中包括不含可變區(qū)缺失(野生型)或者含有一個或多個可變區(qū)缺失的E2-his蛋白。通過用考馬斯亮藍(lán)染色來使蛋白質(zhì)可視化。圖28顯示了E2-his蛋白的藍(lán)非變性PAGE(blue-nativePAGE)分析。在非變性條件下在5-15%聚丙烯酰胺梯度凝膠中對純化的蛋白質(zhì)(10jig)進(jìn)行電泳。在電泳后，使凝膠脫色過夜，并在LicorOdyssey掃描儀中于680nra處進(jìn)行掃描。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)參照物的遷移位置顯示于右邊。圖29顯示了純化的E2-his蛋白的Western印跡分析。使純化的蛋白質(zhì)的樣品經(jīng)歷還原性SDS-PAGE，隨后電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。通過使用非構(gòu)象依賴性E2特異性單克隆抗體，隨后使用偶聯(lián)至Alexafluor680nm的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Invitrogen),來檢測E2蛋白。在LicorOdyssey掃描儀中掃描免疫印跡。分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物顯示于左邊(kDa)。圖30顯示了HCVE2-his蛋白結(jié)合重組形式的CD81大細(xì)胞外環(huán)(CD81-LEL)的能力。使用融合至下列部分的麥芽糖結(jié)合蛋白來包被酶免疫測定平板(A)野生型CD81大細(xì)胞外環(huán)(殘基113-201)(CD81-LEL)，或(B)在CD81-LEL的E2結(jié)合位點中含有F186S突變的CD81-LEL。用牛血清白蛋白封閉平板，然后將其與E2-his蛋白的系列稀釋物(于50jil含有5mg/ml牛血清白蛋白和0.05%Tween20的PBS中)一起溫育2小時。使用E2特異性單克隆抗體和偶聯(lián)至辣根過氧化物酶的兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako)來檢測結(jié)合的E2-his。平板用四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽底物來進(jìn)4亍顯色，并通過加入1MHC1來終止。在450nm處測量吸光度，并減去在620nm處的背景。通過將每種蛋白的吸光度值除以對于野生型E2-his而獲得的最大吸光度，并乘以100來計算結(jié)合百分比。圖31顯示了在用E2-his蛋白進(jìn)行2次免疫接種后獲得的小鼠血清的針對同源E2-his抗原的免疫反應(yīng)性。在用雪花蓮(^/a/U力2、/7/^//s)(GNA)凝集素預(yù)包;f皮的96孔MaxisorW效量滴定板(Nunc)上捕獲E2-his蛋白。將免疫小鼠血清的系列稀釋物與捕獲的用于免疫接種的相應(yīng)的E2蛋白變體一起溫育，并用偶聯(lián)至辣根過氧化物酶的兔抗、鼠免疫球蛋白來檢測結(jié)合的免疫球蛋白。該測定用四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽底物來進(jìn)行顯色，并通過加入1MHC1來終止。在Fluostar平板閱讀器(BMGtechnologies)中于450nm處測量吸光度值，并減去在620nm處的背景。將各個血清的抗體滴度測定為產(chǎn)生5倍背景吸光度的血清稀釋度。顯示了對于各免疫原組的最大(上方的誤差條)、第75和第25百分位數(shù)(分別為框的上和下邊緣)、中間(框內(nèi)的水平線)19和最小(下方的誤差條)的滴度。圖32顯示了在用E2蛋白變體進(jìn)行2次免疫接種后獲得的小鼠血清的針對E2-his(A)和E2A123-his(B)抗原的免疫反應(yīng)性。如圖31中所描述的，在96孔Maxisorb微量滴定板上捕獲E2-his和E2Al23-his蛋白，并測定各個血清的抗體滴度。顯示了對于各免疫原組的最大(上方的誤差條)、第75和第25百分位數(shù)(分別為框的上和下邊緣)、中間(框內(nèi)的水平線)和最小(下方的誤差條)的滴度。圖33顯示了在用E2-his蛋白進(jìn)行3次免疫接種后獲得的小鼠血清的針對同源E2-his抗原的免疫反應(yīng)性。如圖31中所描述的，在96孔Maxisorb微量滴定板上捕獲E2-his蛋白，并測定各個血清的抗體滴度。顯示了對于各免疫原組的最大(上方的誤差條)、第75和第25百分位數(shù)(分別為框的上和下邊緣)、中間(框內(nèi)的水平線)和最小(下方的誤差條)的滴度。圖34顯示了在用E2蛋白變體進(jìn)行3次免疫接種后獲得的小鼠血清的針對E2-his(A)和E2A123-his(B)抗原的免疫反應(yīng)性。如圖31中所描述的，在96孔Maxisorb微量滴定板上捕獲E2-his和E2Al23-his蛋白，并測定各個血清的抗體滴度。顯示了對于各免疫原組的最大(上方的誤差條)、第75和第25百分位數(shù)(分別為框的上和下邊緣)、中間(框內(nèi)的水平線)和最小(下方的誤差條)的滴度。圖35顯示了在用E2蛋白變體進(jìn)行3次免疫接種后獲得的小鼠血清的針對ConlE2,-his(A)和JFH1E2RBD-myc(B)抗原的免疫反應(yīng)性。如圖31中所描述的，在96孔Maxisorb微量滴定板上捕獲Conl和JFH1RBD蛋白，并測定各個血清的抗體滴度。顯示了對于各免疫原組的最大(上方的誤差條)、第75和第25百分位數(shù)(分別為框的上和下邊緣)、中間(框內(nèi)的水平線)和最小(下方的誤差條)的滴度。圖36顯示了在用E2-his蛋白進(jìn)行3次免疫接種后獲得的小鼠血清的80%中和滴度(logl。)。將熱滅活的免疫小鼠血清的系列5倍稀釋物與H77cHCV糖蛋白-假型HIV-l螢光素酶報告病毒(l小時)一起于37。C預(yù)溫育l小時，然后添加至一式四份的在48-孔組織培養(yǎng)板中的Huh7細(xì)胞單層。在4小時的溫育(37°C，5%C02)后，用PBS洗滌細(xì)胞，并更換培養(yǎng)基。在額外的3天溫育(37°C,于5%C02中)后，裂解細(xì)胞，并在裝配有發(fā)光光學(xué)器件的fluostar中測定螢光素酶活性。將各個血清的中和滴度測定為相比于僅用培養(yǎng)基預(yù)溫育的HCV糖蛋白-假型HIV-1螢光素酶報告病毒而言產(chǎn)生80%中和的血清稀釋度。發(fā)明詳述HCV病毒粒子的經(jīng)修飾的E2核心結(jié)構(gòu)(其中通過除去或刪除可變區(qū)的至少一部分，并且任選地插入連接體序列，來修飾至少一個可變區(qū)，特別是由本發(fā)明人鑒定的可變區(qū)igVR)可實際用作能夠引發(fā)針對不同林系的HCV的廣泛中和性抗體的疫苗。該經(jīng)修飾的E2糖蛋白的結(jié)合效能展示出野生型的與HCV受體CD81的結(jié)合，并且該經(jīng)修飾的E2糖蛋白提供了通過下列方式來治療HCV感染的手段模擬對于有效的CD81結(jié)合來說所必需的E2胞外域的復(fù)雜構(gòu)象變化，從而起始免疫反應(yīng)而無需細(xì)胞侵入。在一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白，其包含包括HVR1、HVR2和igVR可變區(qū)的HCV-E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)，其中在所述可變區(qū)的至少一個中，可變區(qū)的至少一部分被柔韌的連接體序列替代。在另一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白，其包含包括HVR1、HVR2和igVR可變區(qū)的HCV-E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)，其中HVR2可變區(qū)的至少一部分被去除或被柔韌的連接體序列替代。在另外一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的丙型肝炎病毒(HCV)E2糖蛋白，其包含包括HVR1、HVR2和igVR可變區(qū)的HCV-E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)，其中igVR可變區(qū)的至少一部分被去除或被柔韌的連接體序列替代。此處的"HVR1"和"HVR2"可變區(qū)是指HVR1(384-410)和證2(461-481)這兩個可變區(qū)，而此處的"igVR，，是指由本發(fā)明人鑒定的基因型間可變區(qū)igVR(570-580)。術(shù)語"柔韌的連接體序列"在此處用于指短的、柔韌的多肽序列，其允許在經(jīng)修飾的糖蛋白中的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵連接，從而導(dǎo)致保留天然或"野生型"二硫鍵連接，特別是保留結(jié)合HCVCD81受體和構(gòu)象依賴性抗體的能力。合適的連接體序列在George和Heringa，2002以及Argos,1990的綜述文章中進(jìn)行了論述，并且可由多至20個氨基酸殘基例如Gly和Ser組成，且包括，和包含選自Gly、Ser、Ala、Thr和Arg的氨基酸，更特別地Gly-和Ser-Ser-Gly(GSSG)。合適的連接體序列包括例如下列序列(Gly)廠Ala-(Gly)2、(Gly)5或(Gly)8(參見Sabourin等人，2007)，(Gly)6、(Gly)7或(Glyh。(參見Yang和Gruebele，2006),Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(參見Dipti等人，2006)，(Gly)4(參見Anandarao等人，2006)，Gly-Ala-Gly(參見Wyatt等人，1995),(Gly)廣Arg-(Gly)廣Ser(參見BelUmy-Mclntyre等人，2007),(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n=3—4(參見Arai等人，2006),和Ser-(Gly)2-Ser-Gly(參見Bahrami等人，2007)。優(yōu)選的序列是此處公開的序列Gly-(Ser)2-Gly。應(yīng)當(dāng)理解，合適題，并且本發(fā)明的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白不限于此處公開的特定的連接體序列。不希望受任何理論的束綽，通過用短的柔韌的連接體替代HVR1、證2和igVR，Cys-569和Cys-581之間以及Cys-459和Cys-486之間二硫鍵的形成，例如，和保守的E2核心結(jié)構(gòu)域的固有折疊，在經(jīng)修飾的糖蛋白中基本上得到保留。在本說明書中，HCVE2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)之一的至少一部分的"缺失"是指刪除或除去可變區(qū)序列的至少一部分，以及任選地插入柔韌的連接體序列以替代被刪除的序列。本發(fā)明的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白可通過任何合適的方法來制備，特別地包括通過表達(dá)本文實施例中所描述的合適的DNA缺失構(gòu)建體來以重組產(chǎn)物的形式制備所述經(jīng)修飾的糖蛋白。優(yōu)選地，核心E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第二個和第三個可變區(qū)(HVR2和igVR)中的至少一個通過除去所述區(qū)域內(nèi)的至少一部分殘基并且插入柔韌的連接體序列來進(jìn)行修飾。已發(fā)現(xiàn)，HVR2區(qū)域的至少一部分的缺失，與其他可變區(qū)缺失一起，顯著地減少了E1E2的異二聚化。在進(jìn)一步的實施方案中，所有三個所述可變區(qū)通過除去這些區(qū)域內(nèi)的至少一部分殘基并且插入連接體序列來進(jìn)行修飾。從已包含HVR1和HVR2缺失的E2糖蛋白中刪除基因間可變區(qū)(igVR),相對于僅HVR1和HVR2的同時缺失而言，改善了與CD81的結(jié)合。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，HVR1、HVR2和igVR全都是由ElE2-pp介導(dǎo)的病毒進(jìn)入Huh7細(xì)胞所必需。已發(fā)現(xiàn)，包含HVR1、HVR2和igVR中的至少每一個的缺失的E1E2-pp保持野生型水平的重組CD81結(jié)合。這表示在下列能力方面的顯著改善(a)模擬HCV病毒粒子的細(xì)胞結(jié)合，和(b)起始免疫應(yīng)答，而無需4吏患者暴露于可以為免疫i秀斜(immunedecoy)的高變免疫顯性區(qū)域。在優(yōu)選的實施方案中，所有三個可變區(qū)可以被刪除，并且保留核心E2折疊結(jié)構(gòu)域，其是裝配至少三個參與CD81-結(jié)合位點的不連續(xù)結(jié)合元件所必需。從E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中HVR1、HVR2和igVR的各種組合式刪除的另外的優(yōu)點是，可獲得可溶形式的E2核心結(jié)構(gòu)域，其適合用作免疫原。本發(fā)明還提供了組合物，其包含如上寬泛地描述的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。這樣的組合物可以配制為疫苗組合物，優(yōu)選包含佐劑。常規(guī)的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、緩沖劑或稀釋劑可被包括在本發(fā)明的疫苗組合物中。通常，根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物將包含免疫有效量的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白和任選地佐劑，以及一種或多種常規(guī)的藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。大量的盡管并非窮盡的佐劑列表可見于Cox和Coulter，"AdvancesinAdjuvantTechnologyandApplication11,^"http://z/a/尸aras/7eCo/2^ro/^^///z//2g^/ofecAi2(7o^7，第4章，Ed.Young，W.K.，CRCPress1992，和見于Cox和Coulter，"Adjuvants_AClassificationandReviewofTheirModesofAction",「痕/ze15(3)，248-256，1997。此處所使用的"藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑"包括任意溶劑、分散介質(zhì)、水溶液、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑，等等。此類介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，并且例如描述于ye/z7//^0/7尸力ar邁acew〃ca7Sc/e/7ces，第18版，MackPublishingCompany,Pennsylvania,U.S.A中。在另外一個方面，本發(fā)有還提供了用于在患者中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如上寬泛地描述的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白。在該方面，本發(fā)明包括用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如上寬泛地描述的經(jīng)《奮飾的HCVE2糖蛋白。此處的"治療"將在其最寬的背景中來進(jìn)行理解。因此，術(shù)語"預(yù)防性地(的)治療"包括用于保護(hù)患者免受感染或減少感染可能性的治療。類似地，術(shù)語感染的"治療性地(的)治療"不是必需意味著對患者進(jìn)行治療直至從感染中完全恢復(fù)，而是包括感染的癥狀的改善以及降低感染的嚴(yán)重度或消除感染。本發(fā)明的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白以有效量進(jìn)行施用。"有效量"是指對于獲得所期望的應(yīng)答或者對于延遲感染的發(fā)作或抑制感染的進(jìn)展或完全停止感染的發(fā)作或進(jìn)展而言至少部分地所必需的量。該量隨待治療的個體的健康和身體狀況、待治療的個體的人種背景、所期望的保護(hù)程度、組合物的配制、醫(yī)學(xué)狀態(tài)的評估和其他相關(guān)因素而變化。預(yù)期該量將落在可通過常規(guī)試驗而確定的相對較寬的范圍之內(nèi)。如果需要，可一次或數(shù)次重復(fù)施用有效量。施用的實際量將通過待治療的感染的性質(zhì)和通過活性免疫原的施用速率來確定。優(yōu)選地，患者是人，然而本發(fā)明擴(kuò)展至對其他哺乳動物患者(包括靈長類動物和實驗室的實驗動物(例如，小鼠、兔子、大鼠、豚鼠))的治療和/或預(yù)防。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選通過腸胃外施用途徑來將經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白施用給患者。腸胃外施用包括不通過消化道(即，非腸內(nèi)的)的任何施用途徑，包括通過注射、輸注等的施用。通過注射的施用包括例如注射至靜脈(靜脈內(nèi))、動脈(動脈內(nèi))、肌肉(肌內(nèi))和皮膚下(皮下)。還可以以足以獲得所期望的藥理學(xué)效應(yīng)的劑量，例如通過皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi)方式，以貯庫制劑或緩釋制劑的形式來施用經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白。適合于腸胃外施用的組合物方便地包含活性組分的無菌水性制劑，其優(yōu)選與受者的血液等滲。可以使用合適的分散劑或濕潤劑以及懸浮劑，根據(jù)已知的方法來配制該水性制劑。無菌可注射制劑還可以是在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如在聚乙二醇和乳酸中的溶液。在可以使用的可接受的載體和溶劑之中包括，水、林格溶液、合適的糖類(例如，蔗糖、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖)和等滲的氯化鈉溶液。此外，方便地將無菌的固定油用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此目的，可使用任何溫和的固定油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于制備注射劑。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了如上寬泛地描述的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白的用途，所述用途為用于在患者中引發(fā)免疫應(yīng)答，或者用于制備用于在患者中引發(fā)免疫應(yīng)答的藥物。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括如上寬泛地描述的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白的用途，所述用途為用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染，或者用于制備用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染的藥物。在該進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用于在患者中引發(fā)免疫應(yīng)答的試劑，所述試劑包含如上寬泛地描述的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白。25在該進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染的試劑，所述試劑包含如上寬泛地描述的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白。在本發(fā)明的一個實施方案中，已發(fā)現(xiàn)，其中至少區(qū)域igVR經(jīng)歷在該區(qū)域中的殘基缺失以及用柔韌的連接體序列替代的重組E2糖蛋白改善了被構(gòu)象依賴性抗體的識別。此外，已發(fā)現(xiàn)，在與'野生型，E2糖蛋白的比較研究中，單獨(dú)地和以與HVR1和HVR2的各種組合形式進(jìn)行的區(qū)域igVR的修飾顯示出接近野生型的與全長CD81-LEL(人四跨膜蛋白(tetraspanin)CD81的大細(xì)月包夕卜環(huán)(largeextracellularloop))的結(jié)合。本發(fā)明人已揭示，跨越6種主要基因型之間的不同E2糖蛋白序列的比對鑒定出了在殘基560和581之間的新的第三個可變區(qū)，"igVR"。表明，"igVR"不是嚴(yán)格意義上的高變區(qū)，因為其在不同基因型之間展示出其最大的可變性，然而其在基因型內(nèi)相對保守，從而不可能處于免疫選擇壓下。此外，其由移動(但總是維持)位于該區(qū)域內(nèi)的糖基化位點的一系列插入或缺失組成。本發(fā)明人還已觀察到，可變區(qū)HVR2和"igVR，，的側(cè)翼都為保守的半胱氨酸殘基，從而提出這些區(qū)域可形成通過這些殘基之間的二硫鍵而穩(wěn)定化的暴露于溶劑的環(huán)。本發(fā)明人已提出，所述高變區(qū)形成柔韌的暴露于溶劑的亞結(jié)構(gòu)域，所述亞結(jié)構(gòu)域使得E2糖蛋白能夠在'開放的，和'關(guān)閉的，構(gòu)象之間移動，前者通過暴露位于本研究中所描繪的核心E2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的保守CD81-結(jié)合決定子而更具有結(jié)合CD81的能力。事實上，之前在CD81結(jié)合后已觀察到E2糖蛋白內(nèi)的構(gòu)象變化。此外，非中和抗體與E2糖蛋白的結(jié)合已被證明降低了其對中和抗體的易感性，并且符合這樣的模型，在所述模型中，非中和抗體抑制這些表面暴露的高變區(qū)的柔韌性，從而阻斷了與位于E2核心結(jié)構(gòu)域內(nèi)的保守表位的接近。因此，這暗示，經(jīng)修飾的E2核心結(jié)構(gòu)域代表了用于引發(fā)針對E2糖蛋白內(nèi)的保守表位(包括CD81-結(jié)合決定子)的中和抗體的具有前景的疫苗候選物，所述表位被這些表面暴露的可變區(qū)遮蔽，所述可變區(qū)可在HCV復(fù)制期間用作在糖蛋白復(fù)合物表面上的免疫學(xué)誘餌。本發(fā)明還提供了針對如上寬泛地描述的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白而產(chǎn)生的分離的抗體。術(shù)語"抗體"在此處寬泛地用于包括特異性地結(jié)合該經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體，以及此類抗體的抗原結(jié)合片段，包括例如保持了對于該經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白的特異性結(jié)合活性的抗體的Fab、F(ab1)2、Fd和Fv片段?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法(參見，例如，Harlow和Lane，"Antibodies,Alaboratorymanual",ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988)來獲得具有所期望的特異性的抗體(單克隆的和多克隆的)。用于制備抗體及其抗原結(jié)合片段的方法還描述于國際專利公開W002/22155中。本發(fā)明還提供了用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如上所述的抗體。因此，該方法提供了患者的被動免疫療法。如之前所描述的，本發(fā)明還提供了如上所迷的抗體的用途，所述用途為用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染，或者用于制備用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染的藥物。在該方面，本發(fā)明還提供了用于在患者中預(yù)防性或治療性地治療HCV感染的試劑，所述試劑包含如上所述的抗體。此外，本發(fā)明提供了如上寬泛地描述的抗體在診斷HCV感染中的用途。在該方面，本發(fā)明提供了用于在患者中檢測HCV感染的方法，所述方法包括在允許形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下，使來自所述患者的生物樣品與如上所述的抗體相接觸；以及檢測所述復(fù)合物，其中所述復(fù)合物的形成表明在所述樣品中存在有HCV。優(yōu)選地，所述抗體被可檢測地標(biāo)記。合適的標(biāo)記是本領(lǐng)域熟知的，并且包括例如酶，放射性同位素，熒光化合物，膠態(tài)金屬，以及化學(xué)發(fā)光化合物、磷光化合物和生物發(fā)光化合物。優(yōu)選地，所述生物樣品是來自所述患者的體液樣品，例如血液樣品。本發(fā)明的經(jīng)修飾的HCVE2糖蛋白還可以用于藥物發(fā)現(xiàn)技術(shù)，包括例如小分子篩選技術(shù)。本發(fā)明通過下列非限制性的實施例來進(jìn)一步舉例說明。實施例l下面描述用于本實施例的材料和方法。1.各個可變區(qū)在E1E2糖蛋白結(jié)構(gòu)和功能中的作用各種不同的可變區(qū)缺失突變體的結(jié)果概述于表l中。細(xì)胞內(nèi)E1E2前體的折疊和異二聚化為了檢查各個可變區(qū)在細(xì)胞內(nèi)E1E2生物合成中的作用，使用與E1和/或E2表位具有反應(yīng)性的抗體來免疫沉淀用單一可變區(qū)缺失構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的經(jīng)代謝性標(biāo)記的細(xì)胞裂解物。在非還原性和還原性條件下分析這些制劑，以表征在先前所觀察到的共價連接的聚集體的大細(xì)胞內(nèi)群體中存在的非共價締合的E1E2異二聚體。使用多克隆抗-E1E2抗體(779)來進(jìn)行的免疫沉淀檢測出，El(~30kDa)和E2(~70kDa)糖蛋白的總細(xì)胞內(nèi)群體對于每一種單一可變區(qū)缺失構(gòu)建體顯示出發(fā)生了有效的表達(dá)和從多蛋白上的切割(參見圖lA)。突變型E2糖蛋白展示出可變地比野生型更低的分子量HVRlcon<HVR2和"igVR"<HVR1<FT。這與下列糖基化位點的丟失相一致;故預(yù)測存在于HVRlcon缺失中的兩個糖基化位點，在HVR2和"igVR"缺失的每一個中的一個糖基化位點，以及在HVR1缺失中沒有糖基化位點(圖2)。然而，需要對這些E2糖蛋白進(jìn)行去糖基化以確認(rèn)如表2中所預(yù)測的它們的主鏈分子量。遷移至~100kDa的條帶代表未被宿主信號肽酶切割的E1E2多蛋白，并且在單一HVR2和"igVR"缺失構(gòu)建體這兩者中更顯著(圖1A)。這反映在對于HVR2和"igVR"突變體所觀察到的總細(xì)胞內(nèi)E1和E2的水平減少，暗示這些缺失可能影響多蛋白的加工。在還原性和非還原條件下，對于突變型和野生型構(gòu)建體，非構(gòu)象依賴性抗-El單克隆抗體(A4)于~30kDa和27kDa處將El雙重帶(doublet)沉淀出來(圖1B)。該雙重帶代表備選的E1糖基化狀態(tài)或信使RNA剪接同種型，如先前所觀察到的。此外，在非還原性條件下，E1共沉淀低水平的野生型E2糖蛋白，然而在還原性條件下，其有效地共沉淀野生型和突變型E2糖蛋白。這表明，A4識別在共價連接的細(xì)胞內(nèi)E1E2復(fù)合物中更加暴露的E1表位。對于所有獨(dú)個可變區(qū)缺失構(gòu)建體，非構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體(All)檢測出細(xì)胞內(nèi)的E2糖蛋白表達(dá)(圖1C)。然而，在非還原性和還原性條件下，只有包含HVRlcon或HVRl缺失的突變型E2糖蛋白共沉淀可檢測的量的E1。這表明，獨(dú)個HVR2和"igVR"缺失直接或間接地破壞了細(xì)胞內(nèi)E1E2異二聚體的形成。值得注意的是，該減少的異二聚化不是由于對于HVR2和"igVR"缺失所觀察到的更低的總細(xì)胞內(nèi)E1和E2而導(dǎo)致的，因為在這兩種突變體中，通過A11檢測到野生型水平的E2糖蛋白表達(dá)。此外，E2通常共沉淀低水平的E1，特別是在還原性條件下，這暗示A11表位在細(xì)胞內(nèi)E1E2異二聚體復(fù)合物中被部分地遮蔽。已顯示，構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體(H53)識別在HCV病毒粒子表面上的天然E2，從而與該E2種類共沉淀的E1的量是功能性非共價締合的E1E2異二聚體形成比例的良好指標(biāo)。使用H53來進(jìn)行的免疫沉淀對于所有獨(dú)個可變區(qū)缺失構(gòu)建體均檢測出細(xì)胞內(nèi)E2糖蛋白表達(dá)(圖1D)。這表明，所插入的Gly-Ser-Ser-Gly連接體基序在這些E2糖蛋白內(nèi)提供了足夠的柔韌性，從而保留了對于呈現(xiàn)該構(gòu)象依賴性表位而言所需的天然E2糖蛋白的固有折疊。然而，細(xì)胞內(nèi)的包含HVR2或"igVR，，缺失的E2糖蛋白不能共沉淀E1，這暗示這些區(qū)域在非共價締合的E1E2異二聚體的細(xì)胞內(nèi)裝配中是直接或間接需要的。E1E2糖蛋白的成熟和向假型HIV-1顆粒中的摻入為了檢查各個可變區(qū)在E1E2糖蛋白成熟中的作用，富集從經(jīng)ER通過分泌途徑進(jìn)行運(yùn)輸中逃脫的少量E1和E2，以將這些復(fù)合物摻入假型HIV-1顆粒中，如先前所描述的。在使用構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體(H53)和來自被HIV-1感染的個體的IgG(IgG14)進(jìn)行免疫沉淀之前，裂解這些經(jīng)代謝性標(biāo)記的E1E2-假型HIV-1顆粒。使用IgG14來進(jìn)行的免疫沉淀證明，所述單一可變區(qū)缺失構(gòu)建體中沒有一個影響HIV-l結(jié)構(gòu)蛋白Pr55"g、pl7MA、p24"或p66"的加工和病毒粒子摻入(圖3B)。使用H53來進(jìn)行的免疫沉淀將摻入病毒粒子中的E2糖蛋白檢測出為對于包含各種復(fù)合類型和雜合類型的糖修飾的成熟糖蛋白而言典型的彌散性分子量條帶(~70-90kDa)，如先前所描述的(圖3A)。不同的突變型E2糖蛋白展示出在它們的相對分子量方面的另外的變化(HVRlcon<HVR2和"igVR，，<HVR1<WT)，這反映了位于這些缺失的區(qū)域內(nèi)的糖基化位點的丟失，如對于細(xì)胞內(nèi)數(shù)據(jù)所描述的。所有突變型E2糖蛋白以大致野生型的水平摻入E1E2-假型HIV-1顆粒中，除了顯示出顯著減少的E2條帶的HVRlcon缺失外。這暗示，與HVR1相鄰的保守區(qū)是完成E2折疊、成熟和摻入假型HIV-1顆粒中所必需的。使用H53來進(jìn)行的免疫沉淀還檢測出遷移至33kDa處的蛋白質(zhì)種類和在~31kDa處的另一個更低分子量的條帶，這最初暗示摻入病毒粒子中的E1糖蛋白也作為雙重帶進(jìn)行遷移(圖3A)。然而，在兩次獨(dú)立的實驗之間，在陰性對照(空)中，該更低分子量的條帶與非特異性條帶共遷移，從而僅該更高分子量的條帶可能代表E1。摻入病毒粒子中的E1糖蛋白(~33kDa)也比細(xì)胞內(nèi)種類(~30kDa)遷移得慢，這反映了在通過分泌途徑進(jìn)行運(yùn)輸?shù)倪^程中在一個或兩個E1糖基化位點處的額外的糖修飾，如先前所觀察到的。此外，摻入病毒粒子中的包含獨(dú)個HVR2和"igVR"缺失的E2糖蛋白不能以可檢測的水平共沉淀E1，這表明這些可變區(qū)在功能性E1E2異二聚體的形成中是直接或間接需要的。E1E2-介導(dǎo)的向Huh7細(xì)胞中的進(jìn)入已顯示，功能性非共價締合的ElE2異二聚體的形成對于ElE2-介導(dǎo)的向Huh-7細(xì)胞中的進(jìn)入是至關(guān)重要的。為了研究各個可變區(qū)在病毒進(jìn)入中的作用，將單一缺失構(gòu)建體用于產(chǎn)生E1E2-假型HIV-1顆粒以感染Huh7細(xì)胞，如先前所描述的。如所預(yù)期的，HVRlcon缺失由于其阻礙E2糖蛋白向假型HIV-1病毒粒子中的摻入而使進(jìn)入完全喪失，如上所觀察到的(圖4)。類似地，HVR2和"igVR"缺失由于破壞了功能性E1E2異二聚體復(fù)合物而對于進(jìn)入而言是不能勝任的。然而，HVR1缺失也使進(jìn)入完全喪失，盡管其保留了野生型的異二聚化水平和E1E2糖蛋白向HIV-1病毒粒子中的摻入，這暗示該區(qū)域可能在E1E2-介導(dǎo)的病毒進(jìn)入中具有直接作用。CD81-LEL結(jié)合先前已證明，僅E2糖蛋白足以介導(dǎo)與CD81受體的結(jié)合，因而盡管展示出異二聚化和/或病毒進(jìn)入的喪失，仍然就它們結(jié)合CD81的大細(xì)胞外環(huán)(LEL殘基113-201)的能力來對細(xì)胞內(nèi)的和摻入病毒粒子中的突變型E2糖蛋白進(jìn)行檢查。這包括將細(xì)胞和病毒裂解物應(yīng)用于固相CD81MBP-LEL(殘基113-201)結(jié)合測定法，如先前所描述的。將該數(shù)據(jù)對從各載體表達(dá)的單體E2的量(如用構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體H53沉淀出的和在非還原性條件下通過SDS-PAGE觀察到的)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；圖1D(細(xì)胞內(nèi)的)和3A(摻入病毒粒子中的)。所有細(xì)胞內(nèi)的包含單一可變區(qū)缺失的E2糖蛋白前體展示出野生型水平的CD81-LEL結(jié)合，除了顯示結(jié)合完全喪失的HVRlcon外(圖5A)。這表明，所插入的Gly-Ser-Ser-Gly連接體基序在缺失了HVRl、HVR2和"igVR，，的E2糖蛋白內(nèi)提供了足夠的柔韌性，從而形成E2CD81-結(jié)合位點，并且暗示，這些獨(dú)個的可變區(qū)在該功能中不是必需的。還表明，細(xì)胞內(nèi)的缺少與HVR1相鄰的保守區(qū)的E2糖蛋白前體(HVRlcon)不能形成CD81-LEL結(jié)合位點，盡管其保持了被H53所識別的構(gòu)象依賴性表位。細(xì)胞內(nèi)形式的HVR2和"igVR"缺失都展示出與野生型相比較而言最大CD81-LEL結(jié)合31的額外增加(圖5A)，盡管它們不展示總結(jié)合曲線的顯著偏移，從而需要另外的獨(dú)立實驗來確定這些可變區(qū)是否調(diào)控CD81-LEL結(jié)合。如所預(yù)期的，摻入病毒粒子中的包含HVRlcon缺失的E2糖蛋白不能介導(dǎo)CD81-LEL結(jié)合，這反映了其減少的向E1E2-假型HIV-l顆粒中的摻入以及上述的細(xì)胞內(nèi)數(shù)據(jù)(圖5B)。相反地，摻入病毒粒子中的包含HVR1、HVR2和"igVR"缺失的E2糖蛋白都保留了至少野生型水平的CD81-LEL結(jié)合，這表明這些突變型E2糖蛋白即使在成熟后仍保留CD81-結(jié)合位點。有趣地，摻入病毒粒子中的包含HVR1缺失的E2糖蛋白顯示出與野生型相比較而言最大CD81-LEL結(jié)合的額外增加，并且展示出總結(jié)合曲線的大約4倍的增加(圖5B)。這暗示，HVR1在摻入病毒粒子中的E2糖蛋白內(nèi)負(fù)調(diào)節(jié)CD81-LEL結(jié)合，盡管不是該功能所必需的。觀察到該效應(yīng)在包含相同缺失的細(xì)胞內(nèi)E2糖蛋白前體中不存在(圖5A)反映了在通過分泌途徑的糖蛋白成熟過程中發(fā)生的在E1E2折疊和CD81-結(jié)合位點方面的變化，如先前所觀察到的。2.延長的連接體對于E1E2糖蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響細(xì)胞內(nèi)E1E2前體的折疊和異二聚化為了增強(qiáng)包含各個可變區(qū)缺失的E2糖蛋白的折疊，通過重新引入幾個從原始構(gòu)建體上刪除的靠近保守半胱氨酸的殘基來延長Gly-Ser-Ser-Gly連接體。值得注意的是，該系列的經(jīng)修飾的缺失構(gòu)建體由于該區(qū)域的高度可變的性質(zhì)而不具有HVR1對應(yīng)物。通過脈沖追蹤代謝性標(biāo)記法(pulse-chasemetabolic-label1ing)和免疫沉淀法,就E1和E2糖蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)和異二聚化來分析這些構(gòu)建體。使用抗-E1E2多克隆抗體(779)來進(jìn)行的免疫沉淀檢測出，對于每種延長的連接體缺失構(gòu)建體發(fā)生了El(~30kDa)和E2(~70kDa)糖蛋白的表達(dá)和從多蛋白上的切割(圖6A)。多蛋白切割在HVR21ink和"igVRlink"構(gòu)建體中表現(xiàn)出略低的效率，這暗示這些缺失可能影響多蛋白的加工。延長的連接體并不恢復(fù)被從原始構(gòu)建體中刪除的糖基化位點，因而突變型E2糖蛋白再次展示出由于這些聚糖的不存在而賦予的可變地比野生型更低的分子量(kDa):HVRlconlink<HVR21ink和"igVRlink"<WT。然而，需要對這些E2糖蛋白進(jìn)行去糖基化以驗證如表2中所預(yù)測的它們的主鏈分子量?？?El單克隆抗體(A4)對于所有延長的連接體構(gòu)建體均檢測出El雙重帶(~30kDa和27kDa)的存在(圖6B)。El在非還原性條件下不能共沉淀野生型E2糖蛋白，然而其在還原性條件下共沉淀突變型和野生型E2，這再次反映了A4抗體對于非共價締合的E1的低敏感性。使用非構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體(All)來進(jìn)行的沉淀對于每種延長的連接體構(gòu)建體均檢測出野生型E2糖蛋白表達(dá)，盡管只有HVRlconlink缺失共沉淀可檢測的量的E1(圖6C)。對于每種延長的連接體構(gòu)建體，構(gòu)象依賴性單克隆抗體(H53)也沉淀野生型水平的細(xì)胞內(nèi)E2糖蛋白，這表明這些突變體保留了對于呈現(xiàn)該構(gòu)象依賴性表位而言所需的天然E2糖蛋白的固有折疊性質(zhì)(圖6D)。此外，延長的"igVR"連接體恢復(fù)了野生型水平的與E1的共沉淀，這暗示該額外的連接體區(qū)域?qū)τ诜枪矁r締合的E1E2異二聚體的細(xì)胞內(nèi)裝配而言是直接或間接需要的。然而，值得注意的是，對于延長的HVR2連接體構(gòu)建體沒有觀察到該效應(yīng)。E1E2糖蛋白的成熟和向假型HIV-1顆粒中的摻入為了檢查延長的連接體是否改變E1E2糖蛋白的突變和病毒粒子摻入，將經(jīng)修飾的單一缺失引入E1E2-假型HIV-l顆粒，然后裂解并用構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體(H53)和來自被HIV-l感染的個體的IgG(IgG14)進(jìn)行免疫沉淀，如先前所描述的。使用IgG14來進(jìn)行的免疫沉淀表明，所述經(jīng)修飾的單一缺失構(gòu)建體中沒有一個影響HIV-l結(jié)構(gòu)蛋白的加工和病毒粒子摻入(圖7B)。使用H53來進(jìn)行的沉淀再次檢測出對于成熟的摻入病毒粒子中的E2糖蛋白而言典型的彌散性分了量條帶(~70-90kDa)(圖7A)。摻入病毒粒子中的突變型E2糖蛋白還展示出由于丟失了一個或兩個糖基化位點而賦予的比野生型種類略微更低的分子量(kDa),如對于細(xì)胞內(nèi)數(shù)據(jù)所描述的。使用H53來進(jìn)行的沉淀再次證明了包含HVRlconlink缺失的E2糖蛋白的減少的病毒粒子摻入，盡管重新引入了4個在原始HVRlcon缺失構(gòu)建體中不存在的靠近保守半胱氨酸的殘基。HVR21ink缺失顯示出野生型水平的被摻入假型HIV-1顆粒中的E2糖蛋白，然而仍然不能共沉淀可檢測的量的E1(映證了細(xì)胞內(nèi)數(shù)據(jù))。相反地，摻入病毒粒子中的包含延長的"igVR"連接體的E2糖蛋白共沉淀野生型水平的E1，這暗示該區(qū)域在功能性E1E2異二聚體的形成中是直接或間接需要的。E1E2-介導(dǎo)的向Huh7細(xì)胞中的進(jìn)入為了檢查這些延長的連接體是否賦予E1E2-介導(dǎo)的向Huh-7細(xì)胞中的進(jìn)入，將這些經(jīng)修飾的單一缺失構(gòu)建體用于產(chǎn)生E1E2-假型HIV-l顆粒以感染Huh7細(xì)胞，如先前所描述的。如所預(yù)期的，HVRlconlink和HVR21ink缺失構(gòu)建體中的延長的連接體不恢復(fù)任何進(jìn)入活性，這分別與所觀察到的這些突變型E2糖蛋白不能摻入病毒粒子中或異二聚化相一致(圖8)。然而，摻入病毒粒子中的包含延長的"igVR"連接體的E2糖蛋白顯示出與陰性對照(空)相比較而言顯著的進(jìn)入活性的回復(fù)(~8倍)，這與其恢復(fù)的與E1的異二聚化相一致。然而，值得注意的是，"igVRlink"仍然展示出與野生型相比較而言減少的進(jìn)入活性(~IO倍)。CD81-LEL結(jié)合為了檢測細(xì)胞內(nèi)的或摻入病毒粒子中的包含這些延長的連接體的E2糖蛋白是否改變CD81-LEL結(jié)合，將細(xì)胞和病毒裂解物應(yīng)用于固相CD81MBP-LEL(殘基113-201)結(jié)合測定法，如先前所描述的。將該數(shù)據(jù)對從各載體表達(dá)的單體E2的量(如用H53沉淀出的和在非還原性條件下通過SDS-PAGE觀察到的)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；圖6D(細(xì)胞內(nèi)的)和7A(摻入病毒粒子中的)。延長的連接體似乎不改變包含HVR21ink或"igVRlink"的細(xì)胞內(nèi)E2糖蛋白的CD81-LEL結(jié)合能力，因為它們?nèi)匀伙@示出野生型水平或甚至比原始HVR2和"igVR"缺失構(gòu)建體所展示的結(jié)合略微增加的結(jié)合(圖9A)。值得注意的是，細(xì)胞內(nèi)的包含HVRlconlink缺失的E2糖蛋白顯示出與陰性對照(空)相比較而言在CD81-LEL結(jié)合方面的略微恢復(fù)，這暗示被重新引入該構(gòu)建體中的靠近保守半胱氨酸的殘基可直接或間接地促成CD81-結(jié)合位點的形成。然而，摻入病毒粒子中的包含HVRlconlink缺失的E2糖蛋白甚至喪失了該降低的CD81-LEL結(jié)合能力(圖9B),這與其阻礙向HIV-l病毒粒子中的摻入相一致。摻入病毒粒子中的包含HVR21ink和"igVRlink"缺失構(gòu)建體的E2糖蛋白在病毒裂解物中保持了CD81-LEL結(jié)合，但在兩次獨(dú)立的測定(圖9B和9C)之間，在它們的相對CD81-LEL結(jié)合能力方面產(chǎn)生了不一致的結(jié)果，因而需要第三次獨(dú)立的測定來驗證這些結(jié)果。3.多重可變區(qū)缺失對于E1E2糖蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響細(xì)胞內(nèi)E1E2前體的折疊和異二聚化盡管喪失與E1的異二聚化和/或病毒進(jìn)入，但上述發(fā)現(xiàn)表明，HVR1、HVR2和"igVR"可獨(dú)個地從細(xì)胞內(nèi)的和摻入病毒粒子中的E2糖蛋白中刪除，而不破壞其被構(gòu)象依賴性單克隆抗體H53所識別的固有折疊性質(zhì)以及與CD81受體的大細(xì)胞外環(huán)(LEL)的結(jié)合。為了進(jìn)一步表征這些可變區(qū)和描繪保守的E2核心結(jié)構(gòu)域，將多重缺失引入E1E2多蛋白中并且通過脈沖追蹤代謝性標(biāo)記法和免疫沉淀法在293T細(xì)胞中進(jìn)行分析。使用抗-ElE2多克隆抗體(779)來進(jìn)行的沉淀顯示出，對于所述多重可變區(qū)缺失構(gòu)建體中的每一種發(fā)生了E1(~30kDa)和E2(~70kDa)糖蛋白的有效表達(dá)和從多蛋白上的切割(圖10A)。這些突變型E2糖蛋白還比野生型種類遷移得快，這相應(yīng)于在每種HVR2和/或"igVR"缺失中丟失了糖基化位點HVRl+2+igVR和HVR2+igVR<HVR1+2和HVRl+igVR<WT。然而，需要對這些糖蛋白進(jìn)行去糖基化以確認(rèn)如表3中所預(yù)測的它們的主鏈分子量?？?E1單克隆抗體(A4)再次檢測出對于所述可變區(qū)缺失構(gòu)建體中的每一種存在E1雙重帶(~30kDa和27kDa)(圖10B)。E1在還原性條件下與野生型和突變型E2糖蛋白共沉淀，這證明形成了共價連接的E1E2異二聚體。在非還原性條件下不能檢測出野生型E1E2異二聚體再次映證了A4對于非共價締合的E1糖蛋白的低敏感性。相反地，非構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體(All)在還原性或非還原性條件下沒有檢測出共沉淀E1的包含這些多重可變區(qū)缺失的E2糖蛋白，盡管對于這些缺失構(gòu)建體中的每一種證明了野生型水平的細(xì)胞內(nèi)E2糖蛋白表達(dá)(圖10C)。構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體H53還沉淀野生型水平的突變型E2糖蛋白(圖10D)。這表明，所插入的Gly-Ser-Ser-Gly連接體基序在這些突變型E2糖蛋白內(nèi)提供了足夠的柔韌性，從而呈現(xiàn)該構(gòu)象依賴性表位，盡管引入了多重可變區(qū)缺失(圖10D)。這些突變型E2糖蛋白還顯示喪失了與E1的異二聚化，這與在E1E2異二聚體的裝配中所需的HVR2和/或"igVR"不存在相一致，如上所觀察到的。E1E2糖蛋白的成熟和向假型HIV-l顆粒中的摻入為了檢查所述多重可變區(qū)缺失是否改變E1E2糖蛋白的成熟，將這些缺失引入E1E2-假型HIV-l顆粒中，并在使用構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體H53和來自被HIV-l感染的個體的IgG(IgG14)進(jìn)行免疫沉淀之前將其裂解，如先前所描述的。IgG14沉淀表明，所述多重可變區(qū)缺失中沒有一個影響HIV-l結(jié)構(gòu)蛋白的加工和病毒粒子摻入(圖11B)。使用H53來進(jìn)行的免疫沉淀再次將E2檢測出為對于成熟的摻入病毒粒子中的E2糖蛋白而言典型的彌散性條帶(~70-90kDa)(圖11A)，并且證明包含多重可變區(qū)缺失的E2糖蛋白以野生型水平摻入HIV-1病毒粒子中。這些突變型E2糖蛋白還略微比野生型種類遷移得快，這反映了HVR2和/或"igVR"缺失內(nèi)的一個或兩個糖基化位點的丟失，如對于細(xì)胞內(nèi)數(shù)據(jù)所描述的。這暗示，摻入病毒粒子中的包含多重可變區(qū)缺失的E2糖蛋白即使在成熟后仍然保留構(gòu)象依賴性H53表位。再一次地，這些突變型E2糖蛋白中沒有一個共沉淀可檢測的量的E1，如在細(xì)胞內(nèi)數(shù)據(jù)中所觀察到的。36ElE2-介導(dǎo)的向Huh7細(xì)胞中的進(jìn)入如所預(yù)期的，包含多重可變區(qū)缺失的E1E2-假型HIV-1顆粒對于進(jìn)入Huh7細(xì)胞而言是不能勝任的(圖12)。CD81-LEL結(jié)合盡管喪失了異二聚化和ElE2-介導(dǎo)的病毒進(jìn)入，但通過將細(xì)胞和病毒裂解物應(yīng)用于固相CD81MBP-LEL(殘基113-201)結(jié)合測定法，就它們結(jié)合CD81-LEL的能力來檢查細(xì)胞內(nèi)的和摻入病毒粒子中的包含多重可變區(qū)缺失的E2糖蛋白，如先前所描述的。將該數(shù)據(jù)對從各載體表達(dá)的單體E2的量(如用H53沉淀出的和在非還原性條件下通過SDS-PAGE觀察到的)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；圖10D(細(xì)胞內(nèi)的)和11A(來源于病毒粒子的)。細(xì)胞內(nèi)的包含多重可變區(qū)缺失的E2糖蛋白全都顯示出野生型水平的CD81-LEL結(jié)合(圖13A)。這表明，Gly-Ser-Ser-Gly連接體基序在這些突變型E2糖蛋白內(nèi)提供了足夠的柔韌性，從而形成前體CD81受體-結(jié)合位點。此外，包含HVR2和"igVR，，雙重缺失的E2糖蛋白(pElE2A23)在兩次獨(dú)立實驗之間顯示出最大CD81結(jié)合的進(jìn)一步增強(qiáng)。這與在獨(dú)個HVR2和"igVR"突變體中所觀察到的該相同效應(yīng)相一致，盡管類似地，總結(jié)合曲線未增加，從而需要另外的獨(dú)立測定來確定該效應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)顯著性。摻入病毒粒子中的包含多重可變區(qū)缺失的E2糖蛋白都保持CD81-LEL結(jié)合(圖13B)，這再次表明所插入的連接體基序在這些糖蛋白內(nèi)提供了足夠的柔韌性，從而即使在成熟后仍呈現(xiàn)CD81-結(jié)合位點。這再次暗示，HVR1、HVR2和"igVR"不是該功能所必需的，這映證了細(xì)胞內(nèi)數(shù)據(jù)和對于獨(dú)個可變區(qū)缺失所獲得的數(shù)據(jù)。重要的是，這證明，包含三重可變區(qū)缺失的E2糖蛋白包括了在CD81-LEL結(jié)合中所需的所有結(jié)構(gòu)和功能決定子，從而構(gòu)成了最小E2核心結(jié)構(gòu)域。這些來源于病毒粒子的包含雙重和三重可變區(qū)缺失的E2糖蛋白還分別顯示出與野生型相比較而言略微減少或增加的最大CD81-LEL結(jié)合活性，盡管再次地，這些突變體中沒有一個展示出總結(jié)合曲線的顯著增加。4.可變區(qū)在E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(E2RBD661my。)的結(jié)構(gòu)和功能中的作用4斤疊和分泌上述結(jié)果證明，所有三個可變區(qū)的同時缺失不會破壞被構(gòu)象依賴性單克隆抗體H53所識別的E2糖蛋白的固有折疊或者與CD81-LEL的結(jié)合，這強(qiáng)有力地暗示該構(gòu)建體構(gòu)成了E2核心結(jié)構(gòu)域。然而，在全長E2糖蛋白的情況下，跨膜區(qū)和近膜區(qū)兩者的存在使得難以結(jié)晶出該核心E2結(jié)構(gòu)。因此，將單一和多重可變區(qū)缺失均引入可溶性的且易于高水平表達(dá)的E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(E2RBD661ray。)中。在293T細(xì)胞內(nèi)代謝性地標(biāo)記包含單一和多重可變區(qū)缺失的E2RBD"一糖蛋白，并且通過使用構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體(H53)進(jìn)行免疫沉淀來分析細(xì)胞內(nèi)的和分泌的蛋白。對于所有單一和多重缺失構(gòu)建體，H53沉淀出野生型水平的細(xì)胞內(nèi)E2RBD661ray。(~50kDa),這表明這些突變型糖蛋白中的每一種均得到了有效表達(dá)(圖14A)。這些細(xì)胞內(nèi)E2RBD66—糖蛋白還展示出可變地比野生型更低的分子量，這與位于被刪除的區(qū)域中的糖基化位點的丟失相一致，如在全長E1E2異二聚體的情況下所觀察到的。然而，需要對這些截短的糖蛋白進(jìn)行去糖基化以確認(rèn)如表4中所預(yù)測的它們的分子量。此外，H53沉淀出相應(yīng)于分泌形式的E2RBD④，的彌散性分子量條帶(~55-65kDa)(圖l化)，這反映了在通過分泌途徑進(jìn)行運(yùn)輸?shù)倪^程中獲得的各種復(fù)合類型和雜合類型的糖修飾。所有含有單一和多重可變區(qū)缺失的E2RBD66—糖蛋白顯示被有效地分泌，并且再次展現(xiàn)出可變的分子量(kDa)，如對于細(xì)胞內(nèi)數(shù)據(jù)所描述的。這些結(jié)果一起證實，可以獨(dú)個地和組合地從E2RBD"—中刪除可變區(qū)，并且保持細(xì)胞內(nèi)的和分泌的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的固有折疊，如通過構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體H53所檢測的。CD81-LEL結(jié)合為了確定含有單一和多重可變區(qū)缺失的E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是否結(jié)合CD81-LEL,將細(xì)胞內(nèi)的和分泌的E2RBD"—裂解物應(yīng)用于固相CD81MBP-LEL(殘基113-201)結(jié)合測定法，如先前所描述的。將該數(shù)據(jù)對從各載體表達(dá)的單體E2的量(如用H53沉淀出的和通過SDS-PAGE觀察到的)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；圖14A(細(xì)胞內(nèi)的)和14B(分泌的)。細(xì)胞內(nèi)和分泌形式的含有單一可變區(qū)缺失的E2RBD66哞顯示出CD81-LEL結(jié)合，盡管，如在全長E2糖蛋白的情況下所觀察到的，HVRlcon缺失使CD81-LEL結(jié)合完全喪失(圖15A和15B)。分泌形式的含有單一HVR1缺失的E2糖蛋白還展示出與野生型相比較而言CD81-LEL結(jié)合的額外增強(qiáng)，這與對于成熟的來源于病毒粒子的形式的全長E2糖蛋白所獲得的數(shù)據(jù)相一致。重要的是，細(xì)胞內(nèi)和分泌形式的包含三重可變區(qū)缺失的E2RBD—ye(HVRl+2+igVR)保持了野生型水平的CD81-LEL結(jié)合(圖16A和16B)，這證實了該糖蛋白種類包括所有結(jié)構(gòu)和功能性CD81-結(jié)合決定子，從而構(gòu)成最小或接近最小的E2核心受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。5.帶有同時的HVR缺失的E2RBD^與細(xì)胞表面表達(dá)的全長CD81的結(jié)合測定分泌的具有多重HVR缺失的E2RBD^蛋白結(jié)合細(xì)胞表面表達(dá)的全長CD81的能力。用編碼人CD81的載體轉(zhuǎn)染CH0-Kl細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時，將細(xì)胞置于冰上，并向細(xì)胞中加入等量的E2。4小時后，使用經(jīng)放射性碘化的MAb9E10來檢測所結(jié)合的E2，并定量所結(jié)合的E2的量。結(jié)果(圖17)顯示，野生型和缺失了AHVR2+igVR的E2RBD^以相似的水平結(jié)合全長CD81。相反地，AHVRl+2-E2RBD^與CD81的結(jié)合顯著降低(p=0.038);構(gòu)建體E2Al23-myc中igVR的進(jìn)一步缺失恢復(fù)了野生型CD81結(jié)合活性(p=0.11)。這些數(shù)據(jù)表明，所述3個可變區(qū)可以同時缺失而不破壞E2的CD81結(jié)合能力。有趣的是，從E2RBD^上同時刪除HVR1和HVR2導(dǎo)致降低的CD81結(jié)合，然而該缺陷通過進(jìn)一步刪除igVR而得到矯正。396.帶有同時的HVR缺失的E2RBD^被人構(gòu)象敏感型單克隆抗體識別的能力用35S-Met/Cys對野生型E2-myc和E2A123-myc進(jìn)行放射性標(biāo)記，并且用一組人構(gòu)象敏感型單克隆抗體來進(jìn)行免疫沉淀(Keck等人，2004),并通過非還原性SDS-PAGE進(jìn)行分析。該組構(gòu)象依賴性Mab對于代表三個不同的免疫原性結(jié)構(gòu)域E2-A、B和C的構(gòu)象表位來說是特異的(Keck等人，2004)。E2A123-myc蛋白顯示出與野生型E2-myc蛋白類似的免疫原特性譜(圖18)，這表明缺少所有三個可變區(qū)的E2-myc保留了對于E2的這三個不同的結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域而言特異的構(gòu)象表位。該數(shù)據(jù)與先前由Keck等人公布的數(shù)據(jù)(所述數(shù)據(jù)也證明HVR1不參與這些結(jié)構(gòu)域)(Keck等人，2004)相一致。該數(shù)據(jù)將這些觀察結(jié)果擴(kuò)展至暗示HVR2和igVR也不參與這些結(jié)構(gòu)域。7.討論在本研究的過程中，將兩個公認(rèn)的E2可變區(qū)(HVR1和HVR2)以及新的可變區(qū)"igVR"獨(dú)個地刪除，以進(jìn)一步研究這些區(qū)域在E1E2生物合成、異二聚化、CD81結(jié)合和病毒進(jìn)入方面的作用。所有包含這些可變區(qū)缺失的E2糖蛋白顯示出保持了被構(gòu)象依賴性單克隆抗體H53所識別的野生型糖蛋白的固有折疊。進(jìn)一步顯示，HVR2和"igVR"是異聚化所必需的，并且所有三個可變區(qū)在病毒進(jìn)入中在CD81結(jié)合之前的階段或CD81結(jié)合之后的階段中是所必需的。還證明，所述獨(dú)個可變區(qū)中沒有一個是CD81結(jié)合所必需的，并且可以從E2糖蛋白中同時刪除所有三個可變區(qū)，而仍保留CD81結(jié)合性質(zhì)。包膜糖蛋白E1和E2在HCV基因組中展示出最大的遺傳異質(zhì)性，特別是在高變區(qū)l(HVR1)(其是位于E2糖蛋白N-末端的高度可變的~27個氨基酸的序列)中。此外，已證明，HVR1(多蛋白殘基387-408)的缺失導(dǎo)致E1E2-介導(dǎo)的進(jìn)入的喪失，盡管其保持了野生型水平的E1E2的異二聚化和向假型HIV-1顆粒中的摻入，這暗示該區(qū)域在病毒進(jìn)入中具有直接作用。然而，還已顯示，在功能性E1E2異二聚體或E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(E2RBD661mye)的情況下，HVR1不是CD81-LEL結(jié)合所必需的，這表明HVR1在病毒進(jìn)入中參與另一個CD81結(jié)合之前的階段或CD81結(jié)合之后的階段。這與報導(dǎo)了HVR1(多蛋白殘基384-410)的缺失消除E2與SR-Bl受體的結(jié)合的先前研究相一致，這暗示該區(qū)域可能是對于在病毒進(jìn)入中的必不可少的SR-Bl接觸而言所必需的。然而，本發(fā)現(xiàn)與幾個其他研究相矛盾，所述其他研究已證明缺少HVR1的HCW艮型顆粒(HCVpp)介導(dǎo)向Huh7細(xì)胞中的進(jìn)入，盡管以減少的水平，這與該區(qū)域在病毒進(jìn)入中的必不可少的作用不一致。還已報道，在高密度脂蛋白(HDL)(其為SR-Bl的天然配體)存在下所觀察到的HCVpp感染性的增強(qiáng)在刪除HVRl后喪失。這暗示，HVR1有助于感染性，而并非是該功能所必不可少的，盡管該效應(yīng)是否歸因于HCV顆粒與HDL的結(jié)合仍未確定。此外，最近的研究已發(fā)現(xiàn)，HVR1內(nèi)的所有保守的堿性殘基的取代顯著減少HCVpp進(jìn)入，盡管未發(fā)現(xiàn)這些殘基參與CD81-LEL結(jié)合或者與SR-B1結(jié)合的HDL增強(qiáng)相關(guān)。因此，HVR1在病毒進(jìn)入中的確切作用仍不清楚。還已顯示，HVR1的缺失顯著增強(qiáng)CD81結(jié)合(大約4倍)，這與先前的研究一致。這暗示，HVR1負(fù)調(diào)節(jié)E2糖蛋白內(nèi)的保守CD81-結(jié)合位點的可接近性，盡管不是該功能所必需的。這與最近鑒定出位于HVR1和HVR2之間的保守CD81-結(jié)合決定子"G錫WLAGLFY"相一致。此外，已證明，廣泛中和性抗體AP33識別與HVR1直接相鄰的保守表位(多蛋白殘基412-423)，并且抑制CD81和E2糖蛋白的一系列表現(xiàn)形式之間的相互作用。還已顯示，延伸HVRl缺失至包括保守的r"殘基使CD81結(jié)合降低而非增強(qiáng)，這進(jìn)一步使該區(qū)域牽涉于該功能中。類似地，已證明，延伸HVR1缺失至包括該相鄰的保守區(qū)(HVRlcon,多蛋白殘基387-428)破壞了在CD81-結(jié)合位點的形成中至關(guān)重要的E2糖蛋白的折疊和成熟。此外，已證明，位于該保守區(qū)內(nèi)的殘基W""也參與CD81結(jié)合。這些與HVR1相鄰的高度保守的區(qū)域的定位暗示，該高度可變區(qū)執(zhí)行下列雙重功能介導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入，和調(diào)節(jié)這些保守區(qū)對宿主免疫系統(tǒng)的可接近性以逃避被廣泛中和性抗體例如AP33所識別。事實上，先前的研究已發(fā)現(xiàn)，HVR1的缺失導(dǎo)致包膜糖蛋白復(fù)合物對于中和性抗體和血清的敏感性增加。因此，已提出HVR1形成了在E2糖蛋白的保守核心結(jié)構(gòu)域外部的暴露于溶劑的亞結(jié)構(gòu)域，這與其在受體結(jié)合中的調(diào)節(jié)作用和其對免疫顯性應(yīng)答的引發(fā)相一致。為了進(jìn)一步表征該所提及的保守核心結(jié)構(gòu)域，還刪除了其余的E2可變區(qū)HVR2和"igVR，，。如對于HVR1缺失所觀察到的，缺乏獨(dú)個HVR2和"igVR"區(qū)域的E2糖蛋白均保持通過構(gòu)象依賴性單克隆抗體H53檢測出的野生型糖蛋白的固有折疊性質(zhì)。然而，有趣的是，HVR2和"igVR"都顯示為是異二聚化所需的，因此，這些區(qū)域的缺失顯示出完全喪失了ElE2-介導(dǎo)的向Huh7細(xì)胞中的進(jìn)入。這暗示，E2糖蛋白中的這些區(qū)域參與直接的異二聚體接觸，或備選地，調(diào)節(jié)對于該功能而言間接需要的別構(gòu)效應(yīng)。因此，為了進(jìn)一步研究這些區(qū)域的作用，將幾個靠近保守半胱氨酸的殘基重新引入HVR2和"igVR，，缺失構(gòu)建體中，以延長它們的連接體基序，從而增強(qiáng)E2糖蛋白折疊。發(fā)現(xiàn)"igVR"連接體的延伸恢復(fù)了野生型水平的與E1的異二聚化和顯著水平的E1E2-介導(dǎo)的進(jìn)入(~8倍)，盡管對于HVR2未觀察到該效應(yīng)。該發(fā)現(xiàn)可能反映了長度相對較短的"igVR"缺失，其中從該區(qū)域中丟失的五個甘氨酸殘基中的兩個通過引入Gly-Ser-Ser-G1y連接體基序而進(jìn)一步得到補(bǔ)償，從而導(dǎo)致該區(qū)域內(nèi)只有5個氨基酸的總?cè)笔А?igVR"連接體在異二聚化中的作用也與其在基因型那所觀察到的保守性相一致。值得注意的是，延長的"igVR"連接體構(gòu)建體仍然展示出與野生型相比而言進(jìn)入活性的減少(~10倍)，這可能是由于在該區(qū)域內(nèi)保守的N-聯(lián)糖基化位點不存在(先前已觀察到其減少HCVpp進(jìn)入)引起的。此外，已證明，包含HVR2或"igVR"缺失的E2糖蛋白保持野生型水平的CD81結(jié)合，這表明，這些區(qū)域，如在HVR1中觀察到的，在該功能中不是必需的。先前的研究已顯示，靶向HVR2的單克隆抗體抑制E242糖蛋白與CD81的結(jié)合，并且提出，該區(qū)域形成CD81-結(jié)合決定子，盡管基于本發(fā)現(xiàn)，這些抗體更可能產(chǎn)生位阻效應(yīng)，所述位阻效應(yīng)遮蔽與該區(qū)域相鄰的G"，LAGLFYCD81-結(jié)合決定子。因此，盡管喪失了異二聚化和/或病毒進(jìn)入，但HVR1、HVR2和"igVR，，全都可以獨(dú)個地從E2糖蛋白上刪除而不破壞其固有的折疊性質(zhì)，并且事實上，已進(jìn)一步顯示，所有三個可變區(qū)可以同時刪除而保持CD81結(jié)合。這強(qiáng)有力地支持了這樣的假設(shè)，即這些可變區(qū)形成了E2核心結(jié)構(gòu)域外部的暴露于溶劑的亞結(jié)構(gòu)域，其包含對于結(jié)合確認(rèn)的HCV受體CD81而言所需的保守的結(jié)構(gòu)和功能決定子。有趣的是，還觀察到，包含HVR1缺失以及HVR2或"igVR"缺失的E2糖蛋白不展示出對于獨(dú)個HVR1缺失所觀察到的CD81-LEL結(jié)合的顯著增強(qiáng)。先前的研究已證明，以組合的方式用來自不同亞型的相應(yīng)序列增加或降低的CD81結(jié)合(取決于所引入的和主鏈的鏈)?？傊?，該數(shù)據(jù)暗示，在這些區(qū)域之間發(fā)生分子內(nèi)相互作用以調(diào)節(jié)CD81結(jié)合，以及它們可能采取固有地柔韌的結(jié)構(gòu)以接納這些接觸。這通過最近鑒定出直接位于HVR1和HVR2之間的保守CD81-結(jié)合決定子G"、LAGLFYW以及由HVR1和在更低程度上由HVR2引發(fā)的免疫顯性應(yīng)答而得到支持，這與它們的位置(作為可在細(xì)胞附著中執(zhí)行調(diào)節(jié)功能的暴露于表面的亞結(jié)構(gòu)域)相一致。對于HVR1和"igVR"雙重缺失所，見察到的該相同效應(yīng)暗示，"igVR"區(qū)域還可促成這些合作式相互作用。解釋該數(shù)據(jù)的一個假設(shè)提出，可變區(qū)形成柔韌的暴露于溶劑的亞結(jié)構(gòu)域，所述亞結(jié)構(gòu)域使得E2糖蛋白能夠在'開放，和'關(guān)閉，構(gòu)象之間移動，前者通過暴露位于核心E2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的保守CD81-結(jié)合決定子而對于CD81結(jié)合來說是更為勝任的，如在該研究中所描述的。事實上，先前在CD81結(jié)合后觀察到E2糖蛋白內(nèi)的構(gòu)象變化。此外，已顯示，非中和抗體與E2糖蛋白的結(jié)合降低了其對于中和抗體的易感性，并且與這樣的模型相一致，在所述模型中，非中和抗體抑制這些表面暴露的可變區(qū)的柔韌性，從而阻斷了與位于E2核心結(jié)構(gòu)域內(nèi)的保守表位的接近。因此，這暗示，經(jīng)修飾的E2核心結(jié)構(gòu)域代表了用于引發(fā)針對E2糖蛋白內(nèi)的保守表位(包括CD81-結(jié)合決定子)的中和抗體的具有前景的疫苗候選物，所述表位被這些表面暴露的可變區(qū)遮蔽，所述可變區(qū)可在HCV復(fù)制期間用作在糖蛋白復(fù)合物表面上的免疫學(xué)誘斜。所觀察到的含有HVR2和"igVR"缺失的E2糖蛋白的異二聚化的喪失暗示，在這些糖蛋白內(nèi)發(fā)生了可以不被單種構(gòu)象依賴性單克隆抗體H53所識別的構(gòu)象變化。因此，獲得先前已用于鑒定E2糖蛋白內(nèi)的所述三個主要免疫原性區(qū)域的一組構(gòu)象依賴性抗體，以用于檢查由這些可變區(qū)介導(dǎo)的在糖蛋白結(jié)構(gòu)和功能中的更微妙的改變。結(jié)果顯示，在E2RBD"一。的情況下，針對結(jié)構(gòu)域A、B和C的單克隆抗體保持野生型水平的對于同時缺失了所有三個可變區(qū)的RBD的反應(yīng)性。這進(jìn)一步暗示，E2△123-myc/U23RBD構(gòu)建體保持了天然E2RBD的固有核心結(jié)構(gòu)域折疊性質(zhì)。8.材料和方法可變區(qū)缺失突變體的構(gòu)建載體為了將E2可變區(qū)缺失引入E1E2異二聚體中，獲得基于HCV的表達(dá)載體pElE2H77c(Drummer等人，2003)。pElE2H77c栽體包含來自全長pCV-H77c(基因型la)感染性克隆(Yanagi等人，1997)的DNA序列，其編碼所描述的E1E2多蛋白殘基165-746(Drummer等人，2003)。為了確保有效的ER耙向和糖蛋白切割，該序列包括位于未成熟核心蛋白的C-末端的E1信號肽以及全長E1和E2多蛋白序列(圖19)。將該DNA片段克隆入pCDNA4HisMax載體(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)的主鏈中，所述載體包含翻譯增強(qiáng)子序列和巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子以用于在哺乳動物系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。其還包含用于在細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行選擇的氨芐青霉素抗性基因。使用引物5，-CCGAAGCTTCCACCATGGGAGTGGAGGGCTGC-3，和5'畫GGCTCTAGATTAGTACACGGAGCTGTTCCG-3，，通過PCR從pc翻-TAPA-l(Levy等人，1998)30)中擴(kuò)增出CD81開放閱讀框。使用W/^III和Wal(以粗體顯示)將PCR產(chǎn)物克隆入pcDM3中，從而產(chǎn)生質(zhì)粒pcDNA3-CD81。為了使得能夠表征可溶性E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(E2RBD661)內(nèi)的可變區(qū)，還獲得了基于HCV的表達(dá)載體pE2661(Drummer等人，2002)。pE2661載體包含編碼所描述的HCV多蛋白殘基384-661的pCV-H77cDNA序列(Dr畫er等人,2006)2002)。該序列編碼顯示出保持CD81和SR-Bl受體結(jié)合的E2糖蛋白的獨(dú)立折疊亞結(jié)構(gòu)域(Pileri等人，1998，Scarselli等人,2002，Pileri等人,1998)。將該DNA產(chǎn)物在組織纖溶酶原激活物(tpa)前導(dǎo)序列的C-末端處克隆入pCDNA3載體(Invitrogen)主鏈中，所述前導(dǎo)序列被設(shè)計用于確保在E1不存在下(E2-myc)E2RBD^的有效的ER靶向和信號切割。該載體還包含用于在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的CMV啟動子和有助于在細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行選擇的氨千青霉素抗性基因。重疊延伸PCR重疊延伸PCR是有助于刪除DNA的大區(qū)段的兩步驟策略(圖20)(Horton等人，1989)。在笫一輪中，將pElEM7c用作模板以將獨(dú)個可變區(qū)缺失引入全長E1E2多蛋白中。該步驟需要兩個寡核苷酸對(Geneworks，AnnArbor，MI，USA);每一對包含負(fù)責(zé)擴(kuò)增可變區(qū)的上游(5')或下游(3')序列的一個外部引物和一個內(nèi)部引物。內(nèi)部寡核苷酸引物被設(shè)計用于引入Gly-Ser-Ser-Gly連接體以及與相應(yīng)的5'或3'片段互補(bǔ)的短重疊序列(表5)。一旦產(chǎn)生后，通過瓊脂糖凝膠電泳來分離這些第一輪5'和3'PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行純化，然后添加至第二輪PCR反應(yīng)中。第二輪通過它們的重疊且互補(bǔ)的序列使得5'和3'片段能夠退火，從而形成用于通過相關(guān)外部引物進(jìn)行延伸和擴(kuò)增的模板。所述外部引物還包含唯一的EcoRl/Xbal限制性內(nèi)切核酸酶位點以幫助克隆回模板載體中。E1E2可變區(qū)缺失構(gòu)建體將重疊延伸PCR策略用于產(chǎn)生表5中所概括的和圖20中所顯示的單一可變區(qū)缺失。值得注意的是，設(shè)計了兩種備選的HVR1缺失構(gòu)建體，HVRl和HVRlcon,以用于進(jìn)一步研究該區(qū)域。HVR1缺失缺少多蛋白殘基387和408之間的高變區(qū)段，而HVRlcon將該缺失延伸至包括鄰近區(qū)域，直至E2中的第一個保守半胱氨酸殘基(多蛋白殘基387-428),所述半胱氨酸殘基原本計劃用于將該N-末端區(qū)域錨定至該糖蛋白的其余部分。HVR1的前三個氨基酸(E，TH)也被保留在這些構(gòu)建體中以確保在糖蛋白生物合成過程中E1和E2之間的有效切割。HVR2和"igVR"缺失分別包括多蛋白殘基460-485和570-580。為了增強(qiáng)E2糖蛋白折疊，使用重疊延伸PCR來產(chǎn)生第二系列的經(jīng)修飾的單一可變區(qū)缺失構(gòu)建體(圖21)。該策略使用一組經(jīng)修飾的內(nèi)部寡核苷酸引物，以便通過重新引入幾個從原始構(gòu)建體中刪除的靠近保守半胱氨酸的殘基(如表2中所概括的和圖21中所顯示的)來延伸Gly-Ser-Ser-Gly連接體基序。值得注意的是，該經(jīng)修飾的AHVRHnkE1E2系列由于沒有任何位于該區(qū)域內(nèi)的保守殘基而缺少HVR1缺失構(gòu)建體。為了描繪最小E2核心結(jié)構(gòu)域，將多重HVR1、HVR2和"igVR"缺失引入E1E2糖蛋白的背景中，如圖19中所顯示的。再次，使用重疊延伸PCR產(chǎn)生這些多重缺失構(gòu)建體，但利用相關(guān)的單一或雙重可變區(qū)缺失構(gòu)建體而非野生型pElE2H77c載體作為模板，如表3中所概括的。E2RBDs6—可變區(qū)缺失構(gòu)建體(E2-myc)為了表征在可溶性E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(E2RBD661my。)的背景中的單一和多重可變區(qū)缺失，將標(biāo)準(zhǔn)PCR用于從全長E1E2構(gòu)建體中擴(kuò)增多蛋白殘基384至661，所述全長E1E2構(gòu)建體包含表4中所概括的和圖22中所顯示的單一或多重可變區(qū)缺失。所述寡核苷酸引物被設(shè)計用于引入C-末端myc表位標(biāo)簽和唯一的Nhel/Xbal限制性內(nèi)切核酸酶位點以幫助將這些PCR產(chǎn)物克隆入pE2661載體中。在表6中所概括的條件下，使用ExpandHighFidelityPCR系統(tǒng)(Invitrogen)，在BiometraThermocycler(Biometra，Goettingen，Germany)中進(jìn)行所有PCR反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳使用含有TAE(0.001MEDTA和O.04MTris-乙酸鹽)的Bio-Rad電泳槽(geltank)(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA，USA),通過瓊脂糖凝膠電泳來分離DNA產(chǎn)物。使用溴化乙錠(0.5ng/mL)來調(diào)配在TAE中的1。/。(w/v)DNA級別的瓊脂糖，以使得在紫外光下能夠顯現(xiàn)DNA(Sambrook和Russel，2001)。以20°/。(v/v)使用OrangeG凝膠上樣染料(1%(w/v)OrangeG(Sigma，StLouis,M0，USA),50%(v/v)甘油)來調(diào)配DNA樣品。瓊脂糖凝膠于100V，23mA進(jìn)行電泳30至40分鐘，并^吏用GelDOC系統(tǒng)(Bio-Rad),依據(jù)lkbPlusDM標(biāo)準(zhǔn)參照物(InvUrogen)來確認(rèn)和定量DNA片段大小。然后按照廠商說明書，使用MoBioPCRClean-up試劑盒(MoBio，Carlsbad,CA,USA)從PCR反應(yīng)體系中或者使用MoBioGel-Spin試劑盒(MoBio)從瓊脂糖凝膠中純化出經(jīng)確認(rèn)的DNA產(chǎn)物。DNA的限制性內(nèi)切核酸酶消化按照廠商說明書(NewEnglandBiolabs，Ipswich，MA，USA)，使用NewEnglandBiolab限制性內(nèi)切核酸酶來消化所有DNA。使用奸堿性磷酸酶(InvUrogen)于37。C對任何經(jīng)消化的載體進(jìn)行去磷酸化30分鐘，以減少自我退火。質(zhì)粒構(gòu)建體的連接和轉(zhuǎn)化使用T4DM連接酶系統(tǒng)(InvUrogen),以大約4:1的比例將經(jīng)消化的插入片段和栽體DNA連接在一起，并于4。C溫育16小時。使用乙酸鈉沉淀方法(3M乙酸鈉(pH5)和100%乙醇)(Sambrook和Russel，2001)來分離DM連接產(chǎn)物，并在無菌蒸餾水中重懸浮l小時。使用lmm電穿孑L杯池(cuvette)(BTX，Homston，MA，USA)和GenePulserElectroporator(BioRad)(設(shè)置為2.0V，200。和25jiF)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入20uL的電穿孔-感受態(tài)DH10B大腸桿菌細(xì)胞(NewEnglandBioiabs)中。然后，將經(jīng)電處理的DH10B細(xì)胞轉(zhuǎn)移入LuriaBertani培養(yǎng)基(LB)(1%(w/v)胰蛋白胨、0.5%(w/v)酵母提取物、0.5%(w/v)NaCl)中以在37。C下恢復(fù)1小時。然后，將細(xì)胞涂板在含有50ug/mL氨千青霉素的LB-瓊脂平板(LB55。/。(w/v)瓊脂)上，并于37。C溫育16小時以選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(Sambrook和Russel，2001)。菌落PCR為了快速篩選包含所期望的DNA插入片段的經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌落，從每個LB-瓊脂平板上選擇大約20個菌落用于菌落PCR(Sambrook和Russel，2001)。在表6中指定的條件下，在BiometraThermocycler(Biometra)中，使用Taq聚合酶系統(tǒng)(Invitrogen)和合適的外部引物來進(jìn)行菌落PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定包含陽性插入片段的菌落，如上面所描述的。質(zhì)粒DNA的小規(guī)模制備然后，按照廠商i兌明書，利用MoBioMini-prep試劑盒(MoBio)，使用堿裂解法從陽性菌落中小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA。通過限制性內(nèi)切核酸酶消化和瓊脂糖凝膠電泳來確認(rèn)插入片段，如上面所描述的。DNA測序按照MicromonReactionSet-Up方案(Micromon,Victoria,Australia),4吏用相關(guān)的測序引物和PRISMBigDyeTerminatorMix(版本3.1)(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA，USA)來確認(rèn)所有質(zhì)粒DNA插入片段的序列。在表6中所相JL括的條件下在BiometraThermocycler(Biometra)中進(jìn)行所有測序反應(yīng)，并按照MicromonReactionClean-Up方案(Micromon)來制備所得的DM。在Micromon觀'〗序?qū)嶒炇抑?，?730SGeneticAnalyser(AppliedBiosystems)中進(jìn)行序列分析。質(zhì)粒DNA的大規(guī)模制備和定量然后按照廠商說明書，使用基于堿裂解法的QiagenMidi-prep試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)，以更大的規(guī)模從經(jīng)確認(rèn)的克隆中分離質(zhì)粒DM。使用苯酚-氯仿(1:1)來純化這些大規(guī)模質(zhì)粒DNA制劑，并以IO000xg離心3分鐘以獲得含有DNA的上相，并且使用氯仿(50%(v/v))進(jìn)行重復(fù)。使用乙酸鈉(10%(v/v))和2.5倍體積的100%48乙醇在7(TC下濃縮經(jīng)純化的DNA30分鐘。于IO000xg進(jìn)行15分鐘來使DM形成粒狀沉淀，隨后在70。/。沉淀法中洗滌兩次，并重懸浮在100uLTE中。于260nm處使用光度適應(yīng)計(Biophotometer)(Eppendorf，Hamburg,Germany)來測定所有DNA濃度。在該研究期間，所有細(xì)菌工作均使用設(shè)置于37°C的軌道式搖動器(RatekInstruments,Victoria,Australia)或培養(yǎng)箱(Memmet，Schwabach，Germany)。生物化學(xué)和功能測定法細(xì)胞培養(yǎng)將來自人成纖維細(xì)胞系的293T人胚腎細(xì)胞(HEK293T)用于本研究以確保高的轉(zhuǎn)染率和荻得良好水平的細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)。人肝臟肝細(xì)胞是HCV的初級靶細(xì)胞(primarytargetcell)，因而在本研究中將人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系Huh7用作模型肝細(xì)胞系統(tǒng)。此外，已證明Huh7細(xì)胞系支持亞基因組HCV復(fù)制子，高度許可HCVpp進(jìn)入，并且可以支持在細(xì)胞培養(yǎng)物上生長的HCV(HCVcc)，這暗示其包含對于體內(nèi)HCV向性而言所需的所有細(xì)胞因子(ZhongBartosch等人，2005，Wakita等人，20052003a,Lindenbach等人，2005b，Lohmann等人，1999，LindenbachWakita等人，2005a,Zhong等人，2005,Bartosch等人，2003a)。將所有細(xì)胞維持于DMF10之中Dulbecco極限必需培養(yǎng)基(Invitrogen)、10%(v/v)熱滅、活的月臺牛血、清(Invitrogen)、2mML-谷氨酰胺(GEHealthcare,Bukinghamshire，UK)、1MHEPES緩沖液(Invitrogen)、慶大霉素(GEHealthcare)和2ugM米諾環(huán)素鹽酸鹽(Sigma)。每3至4天將細(xì)胞于75cm2或150cm2Falcon瓶(BectonDickenson,FranklinLakes,NJ，USA)中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，其中使用在PBS-EDTA(磷酸緩沖鹽水(PBS)-乙二胺四乙酸(EDTA))中的O.025%(v/v)胰蛋白酶來脫離單層。在ThermoDirectHeatC02培養(yǎng)箱(The訓(xùn)，Waltham，MA，USA)中于37。C和5。/。C02下培養(yǎng)所有細(xì)胞。在本研究過程中，使用FuGene6轉(zhuǎn)染試劑(Roche)將所有載體轉(zhuǎn)染入接種在6-孔培養(yǎng)板(NalgeNunc，Rochester,NY，USA)中的HEK293T細(xì)胞中，如先前所描述的(Drummer等人，2003)。抗體非構(gòu)象的抗-El單克隆抗體A4和非構(gòu)象的抗-E2單克隆抗體All由JeanDubuisson和HarryGreenberg博士(Dubuisson等人，1994)貝曾予。構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體H53也由JeanDubuisson博士(Deleersnyder等人，1997)贈予。獲得了從被HCV基因型la感染的個體的血漿中純化出的抗-E1E2多克隆抗體779(Drummer和Poumbourios未公布的)。還獲得了來自被HIV-1感染的個體的免疫球蛋白G(IgG14)和抗-myc單克隆抗體9E10(Drummer等人，2002，Drummer等人，2003)。從StevenFoung博士(Keck等人，2004)處獲得對于代表E2的三個不同免疫原性結(jié)構(gòu)域A、B和C的構(gòu)象表位而言特異的一組構(gòu)象依賴性人Mab。E1E2假型HIV-l顆粒進(jìn)入測定法通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒核心顆粒來進(jìn)行的功能性HCV包膜糖蛋白的摻入和展示(稱為假型包裝(pseudotyping))提供了用于表征突變型E1E2糖蛋白的相對快速和簡單的方法，而無需將這些突變引入全長HCV基因組(Drummer等人，2003,Bartosch等人，2003b)2003a，Drummer等人，2003)。該策略涉及E1E2表達(dá)載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒表達(dá)載體的共轉(zhuǎn)染，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒表達(dá)載體缺少其天然的包膜基因并且包含報告構(gòu)建體(圖23)。由于病毒核心蛋白在細(xì)胞內(nèi)裝配，因此它們通過從質(zhì)膜中出芽而獲得包膜，并且摻入存在于細(xì)胞表面上的HCV包膜糖蛋白以代替它們的天然包膜復(fù)合物。這些E1E2-假型顆粒(HCVpp)可進(jìn)行單輪由E1E2介導(dǎo)的感染和復(fù)制，這可通過測量在感染的細(xì)胞內(nèi)報告基因的活性來進(jìn)行定量。在本研究過程中，將人免疫缺陷病毒(HIV-1)螢火蟲螢光素酶載體，HIV-lNL4-3.LUC.RI(He和Landau等人，1995)，用于產(chǎn)生用于感染Huh-7細(xì)胞的ElE2-假型病毒，如先前所描述的(Drummer等人，2003)。將293T細(xì)胞以350000個細(xì)胞/孔接種在6-孔培養(yǎng)板(NalgeNunc)中，并用lug的NL4-3.LUC.R—E和lug的pElE2H77c(野生型)、p譜RElE2或空pCDNA4HisMax載體(陰性對照)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。在三天溫育后，收集含有E1E2-假型HIV-l顆粒的組織培養(yǎng)液，并使用0.45um的無菌注射器式過濾器(Sartorius，GoettingenGermany)進(jìn)行過濾。然后，以三次重復(fù)，將經(jīng)過濾的產(chǎn)物用于感染以30000個細(xì)胞/孔接種在48-孔培養(yǎng)板(NalgeNunc)中的Huh-7細(xì)胞。在37。C下溫育4小時后，除去接種物(innoculum),并在使用細(xì)胞培養(yǎng)物裂解試劑(Promega，Madison，WI，USA)進(jìn)行裂解之前，將細(xì)胞于DMF10中進(jìn)一步培養(yǎng)3天。除去細(xì)胞碎片以使細(xì)胞裂解物變得澄清，然后將其轉(zhuǎn)染入白色96-孔平板(BMGLabtech，Offenburg，Germany)中以便使用Steady-Glo安光素酶試劑系統(tǒng)(Promega)和裝配有發(fā)光光學(xué)器件的Fluostar(BMGLabtech)來分析螢光素酶活性。從三次重復(fù)的感染中計算出平均螢光素酶活性(相對光單位)，并因而計算出的標(biāo)準(zhǔn)偏差。放射性免疫沉淀法(RIP)i丈射性才示^己為了分析可變區(qū)在細(xì)胞內(nèi)E1E2生物合成中的作用，用2ug的pElE2(野生型)、含有一個或多個可變區(qū)缺失的pElE2或空pCDNA4栽體(陰性對照)來轉(zhuǎn)染以500000個細(xì)胞/孔接種在6-孔培養(yǎng)板(NalgeNunc)中的293T細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24小時，在缺乏L-半胱氨酸和L-曱硫氨酸的DMF10(DMEM(MPBiomedicals)、10%(v/v)熱滅活的胎牛血清(Invitrogen)和2mML-谷氨酰胺(GEHealthcare))中，使用150pCi反式J5S—才示i己/孑L(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA，USA)于37。C對細(xì)胞進(jìn)行脈沖追蹤代謝性標(biāo)記30分鐘。然后，細(xì)胞在3rC下在DMF10中追蹤4小時，隨后在PBS中進(jìn)行洗滌并在RIP裂解緩沖液(0.6MKC1、0.05MTrispH7.4、1mMEDTA、0.02%疊氮化鈉、1%TritonX-100)中進(jìn)行裂解。通過在經(jīng)冷卻的臺式離心機(jī)(Heraeus，Hanau，Germany)中于4。C離心10分鐘來除去任何剩余的細(xì)胞碎片以使細(xì)胞裂解物變得澄清。為了富集摻入假型HIV-1顆粒中的成熟E1E2異二聚體，使用lug的pNL4-3.LUC.R-E-加上lug的pElE2(野生型)、含有一個或多個可變區(qū)缺失的pElE2或空pCDNA4載體(陰性對照)來轉(zhuǎn)染以350OOO個細(xì)胞/孔接種在6-孔培養(yǎng)板中的293T細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24小時，在缺乏L-半胱氨酸和L-曱硫氨酸的DMF10中，使用75nCi反式-"S-標(biāo)記/孔(SantaCruzBiotechnology)于37。C對細(xì)月包進(jìn)行謝性標(biāo)記16小時。然后，收集組織培養(yǎng)液，并通過Minisart0.2um注射器式過濾器(Sartorius)進(jìn)行過濾，然后^f吏用BeckmanL-90超速離心才幾(SW41rotor,Beck訓(xùn)Coulter,Fullerton,CA，USA)以25000xg在4。C下進(jìn)行蔗糖梯度(在PBS中的25。/。蔗糖(v/v))離心2小時以富集病毒粒子。移出上清液，然后在RIP裂解緩沖液中裂解病毒粒子。為了表征可變區(qū)在E2受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(E2RBD661ray。)的背景中的作用，使用2ug的E2-myc(野生型)、含有一個或多個可變區(qū)缺失的E2-myc或空pCDNA3載體(陰性對照)來轉(zhuǎn)染以350000個細(xì)胞/孔接種在6-孔培養(yǎng)板(NalgeNunc)中的經(jīng)代謝性標(biāo)記的卩"T細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后6'J、時，4吏用75nCi反式一"S—才示^己/孑L(SantaCruzBiotechnology)于37°C對細(xì)胞進(jìn)行脈沖追蹤代謝性標(biāo)記l小時，并且在0ptiMEM血清減少的培養(yǎng)基(Invitrogen)中追蹤16小時以積累經(jīng)分泌的蛋白質(zhì)。然后，收集該組織培養(yǎng)液，并在RIP裂解緩沖液中進(jìn)行裂解，隨后通過于4。C以10，000xg離心來進(jìn)行澄清。細(xì)胞單層也在PBS中進(jìn)行洗滌，在RIP裂解緩沖液中進(jìn)行裂解，并進(jìn)行澄清，如上面所描述的。免疫沉淀將放射性免疫沉淀法用作用于分析蛋白質(zhì)表達(dá)的構(gòu)象敏感型策略。在4。C下，在相關(guān)抗體存在下，用偶聯(lián)至BSA(Sigma)的Sepharose(GEHealthcare)對所有上述的蛋白質(zhì)制備物進(jìn)行預(yù)清除16小時。于8000xg進(jìn)行10分鐘來^f吏BSA-Sepharose形成粒狀沉淀，以除去任何非特異性的蛋白質(zhì)種類。然后，在室溫下使用在RIP裂解緩沖液中的3(^(v/v)G蛋白質(zhì)Sepharose(GEHealthcare)來使含有抗體-結(jié)合的蛋白質(zhì)的上清液沉淀l小時，并如上所述通過離心來進(jìn)行分離，隨后在5RIP洗滌緩沖液(0.5MNaCl、0.05MTrispH7.4、1mMEDTA、0.02%疊氮化鈉和1°/。Triton-X100)中洗滌3次和在PBS中洗滌一次。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGB)蛋白質(zhì)分離和分析將所有免疫沉淀物重懸浮在樣品上樣緩沖液(0.5MTrispH6.8、5%(v/v)SDS、10。/。(v/v)甘油、0.05%(w/v)溴酚藍(lán))中。在還原性條件(+3%(v/v)p-巰基乙醇)或非還原性條件(無卩-巰基乙醇)下使細(xì)胞內(nèi)裂解物進(jìn)行走樣，以在先前觀察到的大量細(xì)胞內(nèi)共價連接的E1E2聚集體內(nèi)鑒定出非共價締合的E1E2種類(Dubuisson等人，1994)。在非還原性條件下使在病毒裂解物中的經(jīng)代謝性標(biāo)記的摻入病毒粒子中的E1E2進(jìn)行走樣，而在還原性條件下使HIV-l結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行走樣。將所有樣品在100。C下變性5分鐘，然后使用MiniproteanIISDS-PAGE系統(tǒng)(BioRad),依據(jù)預(yù)染色的寬范圍蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)參照物(BioRad)，在10-15%SDS-PAGE聚丙烯酰胺梯度凝膠上進(jìn)行分離(除了在7.5-15。/。梯度上進(jìn)行分離的IgG14樣品外)。在1x電極緩沖液(0.2MTris-HC1和2M甘氨酸)中，于100V，23mA進(jìn)4亍電泳1.5小時。然后，將SDS-PAGE凝膠浸沒在10y。(v/v)乙酸和10。/。(v/v)曱醇中以固定樣品，隨后使用真空平板凝膠干燥器(HoeferScientific,SanFrancisco,CA，USA)于80。C進(jìn)行干燥。使用"S-反式標(biāo)記(SantaCruzBiotechnology)來標(biāo)示所述寬范圍標(biāo)準(zhǔn)參照物的位置，然后使用FLA-2000磷光成像儀和軟件(FujiFilm,Tokyo,Japan)來進(jìn)行蛋白質(zhì)分析和定量。固相CD81-LBL結(jié)合測定法已證明，CD81的大細(xì)胞外環(huán)足以介導(dǎo)E2糖蛋白結(jié)合(Pileri等人，1998，Petracca等人，2000，Pileri等人,1998),并且包含形成E2相互作用位點的所有殘基和包含形成E2相互作用位點的所有殘基(Drummer等人，2002)。因此，為了快速篩選可變區(qū)缺失突變體中的CD81-LEL結(jié)合能力，我們使用了固相結(jié)合測定法，所述固相結(jié)合測定法是使用由連接至CD81大細(xì)胞外環(huán)殘基ll3-201的麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)組成的嵌合體(MBP-LEL)來構(gòu)筑的，如先前所描述的(Drummer等人，2002)。簡而言之，用在PBS中的5ug/mL二聚體CD81MBP-LEL來包被96-孔maxisorb酶聯(lián)免疫吸附平板(NalgeNunc)，并且在4。C下溫育16小時。除去MBP-LEL，然后使用BSA!。PBS(在PBS中的IOmg/mLBSA(Sigma))于37。C封閉2小時以減少非特異性結(jié)合。然后，將平板在PBST(在PBS中的O.05%Tween-20(Sigma))中洗滌4次，隨后以在BSA5PBST(在PBST中的5mg/mLBSA)中的12個2倍系列稀釋添加所有蛋白質(zhì)裂解物制劑。將平板在室溫下溫育2小時，再次洗滌，并用構(gòu)象依賴性抗-E2單克隆抗體H53(在BSA5PBST中的1:IOOO稀釋物)來就結(jié)合的E2進(jìn)行探測1小時。在PBST中進(jìn)一步洗滌后，使用兔抗小鼠免疫球蛋白-辣根過氧化物酶綴合物(DAKO)(在BSA5PBS/Tween中的l:1000稀釋物)來檢測抗體-結(jié)合的E2復(fù)合物，并按照廠商說明書，使用四甲基聯(lián)苯胺底物(Sigma)來進(jìn)行顯色。在Fluostar(BMGtechnologies)上于450nm處讀取所得的吸光度值(光密度)，并減去在620nm處的背景。然后，將該數(shù)據(jù)針對在前面的部分中通過構(gòu)象依賴性抗體H53檢測出的、經(jīng)可視化的且經(jīng)定量的單體E2進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。E2-myc-CD81細(xì)月包表面結(jié)合測定法將CHO-Kl細(xì)胞以l.25x105個細(xì)胞/孔接種在12-孔培養(yǎng)板中，并在24小時后用2ngpcDNA3-CD81進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后48小時，將經(jīng)CD81轉(zhuǎn)染的CH0-K1細(xì)胞在冰上冷卻，并且與野生型或含有可變區(qū)缺失的E2-myc蛋白在BSA!。PBS中的系列稀釋物一起在冰上溫育4小時。然后，將細(xì)胞在BSAi。PBS中洗滌兩次，隨后與1251-MAb9E10(106cpm)(其已在水上用1(T個CH0-Kl細(xì)胞預(yù)清除2小時)一起溫育l小時。在用BSA,。PBS再洗涂4次后，將細(xì)胞在PBS中的1。/。SDS之中進(jìn)行裂解，并在PackardAuto-Gamma計數(shù)器中進(jìn)行計數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>表3.用于將多重可變區(qū)缺失引入HCVE1E2多蛋白中的重疊延伸PCR策略的概括。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>大寫的和加下劃線的引物序列分別表示引入的Gly-Ser-Ser-Gly連接體基序和限制性內(nèi)切核酸酶位點。表4.用于將單一和多重可變區(qū)缺失構(gòu)建入EZ受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(殘基384-661)中的標(biāo)準(zhǔn)PCR策略的概括。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>大寫的和加下劃線的寡核苷酸序列分別表示引入的Gly-Ser-Ser-Gly連接體基序和限制性內(nèi)切核酸酶位點。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>實施例21.使用一組從被HCV感染的個體獲得的血清探測出的E2-myc和E2Al23-myc的抗原結(jié)構(gòu)將一組從衩Hc:v懲染的個俸獲得的血滑用于逋遼光敬沉》較經(jīng)生物合成性標(biāo)記的E2-myc和E2Al23-myc的總體抗原特性譜。如先前所描述的(Grollo等人，2006),就針對H77cE1E2假型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的中和抗體的存在來篩選血清，觀察到0至1，600的50%中和滴度(圖24，下圖)。E2-myc的抗體反應(yīng)性模式(圖24，上圖)幾乎與E2A123-myc的抗體反應(yīng)性模式(圖24,中圖)相同，這表明這兩種蛋白質(zhì)的總的抗原結(jié)構(gòu)是類似的。2.E2-myc野生型和變體蛋白的CD81結(jié)合性質(zhì)檢查了分泌的E2-rayc蛋白與HCV細(xì)胞受體CD81的大細(xì)胞外環(huán)(LEL)相互作用的能力。在該測定中，在采用融合至CD81的大細(xì)胞外環(huán)(殘基113-201;"CD81-LEL")的固相麥芽糖結(jié)合蛋白的ELISA中，使用構(gòu)象依賴性E2單克隆抗體(H53)來檢測CD81-E2-myc結(jié)合。含有一個或多個可變區(qū)缺失的E2-myc蛋白展示出野生型水平的CD81-LEL結(jié)合，這再次表明E2的總體折疊并沒有可檢測地受到所述缺失的影響(圖25A、B)。相反地，未觀察到在包含LEL結(jié)合位點突變(L441M)的E2L441M-myc蛋白和CD81-LEL之間的結(jié)合，這證實了該結(jié)合測定法的特異性(圖25A)。3.E2-myc野生型和變體蛋白與在CHO-Kl細(xì)胞中表達(dá)的全長CD81的相互作用的能力如先前所描述的(Drummer等人，2002)，使用用全長CD81表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的CH0-Kl細(xì)胞，通過細(xì)胞表面結(jié)合測定法來測定E2-myc蛋白與全長CD81受體相互作用的能力。對分泌的E2-myc野生型和變體蛋白進(jìn)行系列稀釋，并與用CD81轉(zhuǎn)染的CH0-K1細(xì)胞一起在冰上進(jìn)行溫育。在洗滌后，通過使用1251-標(biāo)記的針對C-末端c-myc表位標(biāo)簽的單克隆抗體9E10來檢測結(jié)合的E2-myc蛋白。通過包含L441MCD81結(jié)合位點突變的E2L441M-myc不與用野生型CD81轉(zhuǎn)染的CH0-Kl細(xì)胞結(jié)合來證實該測定法的特異性(圖26A)。圖26A和B中所顯示的結(jié)果表明E2-myc、E2A23-myc、E2Al3-myc和E2A123-myc具有類似的CD81結(jié)合性質(zhì),然而HVR1+HVR2的缺失(E2△12-myc)引起相比于E2A23-myc的結(jié)合而言在CD81結(jié)合方面大約50%的減少(p<0.035)。相反地，E2A13-myc(其展示出與E2-myc相同的結(jié)合曲線)和E2A123-myc的CD81結(jié)合能力沒有顯著差異(=0.62)，這表明當(dāng)HVR1和HVR2不存在于E2Al2-myc中時，igVR的存在削弱了CD81結(jié)合功能。盡管HVR1、HVR2和igVR不是E2RBD^的核心折疊性質(zhì)所必需的，但是這些數(shù)據(jù)指向igVR與HVRl和HVR2中之一或兩者之間的功能性相互作用，從而正確地形成CD81結(jié)合位點或所述CD81結(jié)合位點變成對于受體是完全可接近的。盡管在圖25A和25B中對于經(jīng)單一和多重缺失的E2-myc構(gòu)建體沒有檢測到在與重組CD81-LEL結(jié)合方面的變化，^f旦在圖26A和26B中觀察到在與表面表達(dá)的CD81結(jié)合方面的差異，這可能反映了當(dāng)以分離形式和以天然四跨膜蛋白形式表達(dá)時，在LEL結(jié)構(gòu)中的微妙差異。4.材料和方法中和測定法如下測定免疫人血清和對照人血清中和單輪由HCV糖蛋白-假型HIV-1螢光素酶報告病毒引起的感染的能力。通過用pElE2和p駄3LUCR-E-質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T單層(350，000個細(xì)胞/6-孔培養(yǎng)板的孔)來制備HCV糖蛋白-假型HIV-1螢光素酶報告病毒(Drummer等63人，2003)。于37。C在含有5。/。C02的潮濕氣氛中溫育3天后，通過O.45jim無菌注射器式過濾器(Sartorius)來過濾培養(yǎng)物上清液。將熱滅活的免疫和對照人血清的系列稀釋物與HCV糖蛋白-假型HIV-1螢光素酶報告病毒一起預(yù)溫育(l小時)，然后將添加至一式四份的在48-孔培養(yǎng)板中的Huh7細(xì)胞單層。在4小時的溫育(37°C，5%(:02)后，用PBS洗滌細(xì)胞，并更換新鮮培養(yǎng)基。在額外的3天溫育(37°C，于5%C02中)后，裂解細(xì)胞，通過離心來澄清裂解物，然后在裝配有發(fā)光光學(xué)器件的Fluostar(BMG)中就螢光素酶活性(Promega)來進(jìn)行測定。將各個血清的中和滴度測定為相比于僅用培養(yǎng)基預(yù)溫育的HCV糖蛋白-假型HIV-l安光素酶報告病毒而言產(chǎn)生50。/。中和的血清稀釋度。放射性免疫沉淀法4吏用Fugene6(Roche),用E2-myc表達(dá)載體來轉(zhuǎn)染以500，OOO個細(xì)胞/孔接種在6-孔培養(yǎng)板中的293T細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24小時，在缺乏L-半胱氨酸和L-甲硫氨酸的DMFIO(DMEM[MPBiomedicals]、10%(v/v)熱滅活的胎牛血清[Invitrogen]和2mML-谷氨酰胺[GEHealthcare])中，4吏用150^tCi反式一35S—才示i己/孑L(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA，USA)對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。在收獲細(xì)胞上清液后，將經(jīng)標(biāo)記的分泌的蛋白質(zhì)調(diào)整至O.6MKCl、0.05MTrispH7.4、1raMEDTA、0.02%疊氮化鈉、1%TritonX-100,并且在相關(guān)抗體存在下，用偶聯(lián)至BSA(Sigma)的CNBr-活化的Sepharose(GEHealthcare)于4。C預(yù)清除16小時。然后，使用30°/(v/v)G蛋白Sepharose(GEHealthcare)來免疫沉淀在經(jīng)澄清的上清液中的抗體-抗原復(fù)合物，隨后在RIP洗滌緩沖液(0.5MNaCl、0.05MTrispH7.4、1mMEDTA、0.02%疊氮化鈉和1°/。Triton-X100)中洗滌3次和在PBS中洗滌1次。使免疫沉淀出的蛋白質(zhì)經(jīng)歷在非還原性條件下于10-15%聚丙烯酰胺梯度凝膠中的SDS-PAGE，并且通過在磷光成像儀中進(jìn)行掃描來可視化。E2-myc蛋白的瞬時表達(dá)使用Fugene6(Roche)，用E2-myc表達(dá)載體來轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞(350，000個細(xì)胞/6-孔培養(yǎng)板的孔)。在轉(zhuǎn)染后8小時，用0ptimem(Invitrogen)置換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并將細(xì)胞于37。C在含有5。/。C02的潮濕氣氛中溫育3天。通過O.45-ftm-孔徑大小的過濾器來澄清組織培養(yǎng)液，然后在CentriconYM30濃縮器(Amersham)中濃縮大約10倍。重組CD81大細(xì)胞外環(huán)(CD81-LEL)結(jié)合性質(zhì)使用固相酶免疫測定法來檢查E2-myc蛋白與HCV細(xì)胞受體CD81相互作用的能力。在4。C下用PBS中的5ng/ml融合至CD81的重組大細(xì)胞外環(huán)(殘基113-201)的麥芽糖結(jié)合蛋白來包被酶免疫測定法平板(NuncMaxisorb)過夜。除去包被溶液，在室溫下用在PBS中的牛血清白蛋白(10ing/ini)(BSA!。PBS)來封閉未被占據(jù)的位點1小時。用含有O.05%Tween20的PBS(PBST)洗滌平板4次。將分泌的E2-myc蛋白在50一含有5mg/ml牛血清白蛋白的PBS(BSA5PBST)中進(jìn)行系列稀釋，并溫育2小時。使用E2特異性單克隆抗體，隨后使用偶聯(lián)至辣根過氧化物酶的兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako)來檢測結(jié)合的E2-myc蛋白。平板用四曱基聯(lián)苯胺鹽酸鹽底物來進(jìn)行顯色，并通過加入1MHC1來終止。在Fluostar平板閱讀器(BMGtechnologies)中于450nm處測量吸光度值，并減去在620nm處的背景。CD81結(jié)合性質(zhì)將CH0-Kl細(xì)胞以l.25x105個細(xì)胞/孔接種在12-孔培養(yǎng)板中，并在24小時后用2pgpcDNA3-CD81進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后48小時，將經(jīng)CD81轉(zhuǎn)染的CH0-K1細(xì)胞在冰上冷卻，并且與野生型E2-myc或含有可變區(qū)缺失的E2-myc蛋白在BSA^PBS中的系列稀釋物一起在水上溫育4小時。然后，將細(xì)胞在BSA,。PBS中洗滌兩次，隨后與^I-MAb9E10(106cpm)(其已在冰上用10'個CHO-K1細(xì)胞預(yù)清除2小時)一起溫育l小時。在用BSA,。PBS再洗滌4次后，將細(xì)胞在PBS中的1。/。SDS之中進(jìn)行裂解，并在PackardAuto-Gamma計數(shù)器中進(jìn)行計數(shù)。65實施例31.純化的E2-his野生型和變體蛋白的SDS-PAGE分析在還原性條件下通過SDS-PAGE來估計E2-his野生型和變體蛋白的純度。圖27顯示了關(guān)于每種純化的蛋白質(zhì)種類的單個條帶。每種種類的遷移與被刪除的可變區(qū)的數(shù)目相一致。例如，缺少3個可變區(qū)的E2Al23-his展示出最快的遷移。蛋白質(zhì)條帶的彌散性質(zhì)與E2的糖基化相一致。2.純化的E2-his蛋白的藍(lán)非變性PAGE使用藍(lán)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(bluenativepolyacrylamidegelelectrophoresis)來分析純化的E2-his野生型和變體蛋白的寡聚化狀態(tài)。圖28顯示了關(guān)于每種E2-his蛋白的兩個主要條帶，其在分子量方面相應(yīng)于單體和二聚體。3.E2-his蛋白的免疫檢測在Western印跡法中通過非構(gòu)象依賴性E2特異性單克隆抗體(H52)來檢測純化的E2-his野生型和變體蛋白。對于每種E2-his蛋白變體，揭示出以所預(yù)期的分子量進(jìn)行遷移的主要蛋白質(zhì)種類(圖29)。4.E2-his野生型和變體蛋白的CD81結(jié)合性質(zhì)檢查了純化的E2-his蛋白與HCV細(xì)胞受體CD81的大細(xì)胞外環(huán)(LEL)相互作用的能力。在該測定中，在釆用融合至CD81的大細(xì)胞外環(huán)(殘基113-201;"CD81-LEL")的固相麥芽糖結(jié)合蛋白的ELISA中，使用構(gòu)象依賴性E2單克隆抗體(H53)來檢測CD81-E2-his結(jié)合。含有一個或多個可變區(qū)缺失的E2-his蛋白展示出野生型水平的CD81-LEL結(jié)合，這表明EZ的總體折疊并沒有可檢測地受到所述缺失的影響(圖30A)。相反地，未觀察到在E2-his蛋白和包含E2結(jié)合位點突變(F186S)的CD81-LEL之間的結(jié)合，這證實了該結(jié)合測定法的特異性(圖30B)。5.在用E2-his蛋白變體進(jìn)行2次免疫接種后獲得的小鼠血清針對同源E2-his抗原的免疫反應(yīng)性通過ELISA來檢查在用E2-his野生型和變體蛋白進(jìn)行2次免疫接種后獲得的小鼠血清針對固相"同源抗原"(即用于對特定小鼠組進(jìn)行免疫接種的抗原)的免疫反應(yīng)性。在每一只經(jīng)疫苗接種的動物中顯示了相當(dāng)大的針對同源固相抗原的抗體結(jié)合活性(圖31)。相反地，在僅用佐劑進(jìn)行疫苗接種的小鼠中，以及在來自各疫苗接種組的在免疫接種之前(預(yù)放血(prebleed))獲得的兩個代表性對照血清中，均沒有檢測到針對固相E2-his蛋白的抗體反應(yīng)性(數(shù)據(jù)未顯示)，這證實接受E2-his蛋白的動物引發(fā)了對于所述免疫原特異的抗體。6.在用E2-his蛋白變體進(jìn)行2次免疫接種后獲得的小鼠血清針對E2-his和E2A123-his抗原的免疫反應(yīng)性在ELISA中，將在來自各疫苗接種組的免疫血清中的抗體與固相E2-his(包含所述3個可變區(qū))結(jié)合的能力與針對固相E2A123-his(缺少所述3個可變區(qū))的抗體反應(yīng)性相比較。對于所有免疫接種組(除了僅使用佐劑的組之外；數(shù)據(jù)未顯示)，都觀察到相當(dāng)大的針對固相E2-his(圖32A)和E2Al23-his(圖32B)的結(jié)合滴度。進(jìn)行對于各個不同免疫接種組而獲得的抗體結(jié)合滴度的成對統(tǒng)計學(xué)分析，以確定在結(jié)合滴度方面的表觀差異(apparentdifference)是否顯著。表7表明，對于E2-his免疫接種組而計算出的針對固相E2-his的抗體滴度與其他免疫接種組沒有顯著差異(p>0.06)。然而，在E2A1-his免疫接種組與E2Al3-his、E2A23-his和E2Al23-his之間觀察到針對固相E2-his的抗體反應(yīng)性的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.04)。各個不同免疫接種組的針對固相E2A123-his的抗體結(jié)合滴度的成對統(tǒng)計學(xué)分析揭示出，與E2-his免疫接種組相比較，E2Al23-his免疫接種組的抗體反應(yīng)性高度顯著地增加(；？=0.003，表8)。觀察到E2Al-his、E2A3-his和E2Al2-his免疫接種組對于E2-his而言的抗體反應(yīng)性的統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加，還觀察到E2Al-his相對于E2A2-his免疫接種組而言的抗體反應(yīng)性的統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加(/7<0.04)。7.在用E2-his蛋白變體進(jìn)行3次免疫接種后獲得的小鼠血清針對同源E2-his抗原的免疫反應(yīng)性通過ELISA來檢查在用E2-his野生型和變體蛋白進(jìn)行3次免疫接種后獲得的小鼠血清針對固相"同源抗原"(即用于對特定小鼠組進(jìn)行免疫接種的抗原)的免疫反應(yīng)性。在每一只經(jīng)疫苗接種的動物中顯示了相當(dāng)大的針對同源固相抗原的抗體結(jié)合活性(圖33),但在來自各疫苗接種組的在免疫接種之前(預(yù)放血)獲得的兩個代表性對照血清中沒有顯示出針對同源固相抗原的抗體結(jié)合活性(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，在僅用佐劑進(jìn)行疫苗接種的小鼠中沒有檢測到針對固相E2-his蛋白的抗體反應(yīng)性(數(shù)據(jù)未顯示)，這證實接受E2-his蛋白的動物引發(fā)了對于所述免疫原特異的抗體。8.在用E2-his蛋白變體進(jìn)行3次免疫接種后獲得的小鼠血清針對E2-his和E2A123-his抗原的免疫反應(yīng)性在ELISA中，將在來自各疫苗接種組的免疫血清中的抗體與固相E2-his(包含所述3個可變區(qū))結(jié)合的能力與針對固相E2A123-his(缺少所述3個可變區(qū))的抗體反應(yīng)性相比較。對于所有免疫接種組(除了僅使用佐劑的組之外，數(shù)據(jù)未顯示)，都觀察到相當(dāng)大的針對固相E2-his(圖34A)和E2Al23-his(圖34B)的結(jié)合滴度。進(jìn)行對于各個不同免疫接種組而獲得的抗體結(jié)合滴度的成對統(tǒng)計學(xué)比較，以確定在結(jié)合滴度方面的表觀差異是否顯著。與在第二次免疫接種后獲得的數(shù)據(jù)相反，表9表明，對于E2-his免疫接種組而計算出的針對固相E2-his的抗體滴度顯著高于7個其他免疫接種組中的6個(/7=0.003至0.04)，除了E2Al23-his夕卜(p=0.11)。各個不同免疫接種組的針對固相E2Al23-his的抗體結(jié)合滴度的成對統(tǒng)計學(xué)分析揭示出，與E2-his免疫接種組相比較，E2Al23-his免疫接種組的抗體反應(yīng)性高度顯著地增加(/7=0.0007，表IO)。還觀察到E2-his與E2A3-his、E2Al2-his和E2A23-his免疫接種組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異，并且還觀察到E2A1-his與E2A3-his、E2△12-his、E2A23-Ms和E2A123-his免疫接種組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p=0.009至0.022)。最后，將對于各免疫接種組而獲得的針對固相野生型E2-his抗原(即，包含HVRl、HVR2和IgVR)的平均結(jié)合滴度與針對固相E2Al23-his抗原(即，缺少HVR1、HVR2和igVR并且表現(xiàn)出保守的糖蛋白核心)的結(jié)合滴度相比較。進(jìn)行該分析以精確測定所述免疫原引發(fā)與E2RBD的保守核心具有反應(yīng)性的抗體的相對能力。表11顯示了，對于由E2-his免疫原(~4.4倍的減少；p-0.0009)和E2A1-his免疫原(~2倍的減少；P=0.005)所引發(fā)的抗血清，針對固相E2A123-his抗原的抗體滴度比針對固相E2-his抗原的抗體滴度顯著更低。9.在用E2-his蛋白變體進(jìn)行3次免疫接種后獲得的小鼠血清針對固相ConlE2aB。-his和JFHlE2,-myc抗原的免疫反應(yīng)性通過在ELISA中將免疫血清與固相ConlE2RBD-his(基因型lb)和JFH1E2RBD-rayc(基因型2a)抗原的免疫反應(yīng)性相比較，來測定來源于基因型laH77c分離林的E2-his野生型和變體蛋白引發(fā)跨基因型(cross-genotype)反應(yīng)性抗體的能力。對于所有免疫接種組(除了僅使用佐劑的組之外，數(shù)據(jù)未顯示)，都觀察到相當(dāng)大的針對固相ConlE2,-his(圖35A)和JFH1E2咖-myc(圖35B)的結(jié)合滴度。各個不同免疫接種組的針對固相ConlE2,-his的抗體結(jié)合滴度的成對統(tǒng)計學(xué)分析揭示出，與E2-his免疫接種組相比較，E2A2-his、E2A3-his、E2A12-his和E2Al23-his免疫接種組具有顯著更高的結(jié)合滴度(/<0.05，表12)。在E2Al23-his免疫接種組中所引發(fā)的ConlE2RBD-his-結(jié)合滴度也顯著高于由E2Al-his和E2A23-his所引發(fā)的ConlE2RBD-his-結(jié)合滴度(p<0.05)。相反地，各個不同免疫接種組的針對固相JFH1E2KB。-inyc的抗體結(jié)合滴度(表13)。盡管缺乏顯著性，但上面所觀察到的趨勢在這些分析中也是明顯的。10.中和測定了免疫小鼠血清和對照小鼠血清中和單輪由同源H77c林系E1E2-假型HIV-l螢光素酶報告病毒引起的感染的能力。將熱滅活的免疫小鼠血清和對照小鼠血清的系列5倍稀釋物與E1E2-假型HIV-1螢光素酶報告病毒一起預(yù)溫育(l小時)，然后與Huh7細(xì)胞單層一起溫育4小時。用PBS洗滌細(xì)胞，加入新鮮的培養(yǎng)基，并且在額外的3天溫育(37'C，于5%0)2中)后，裂解細(xì)胞并就螢光素酶活性來對其進(jìn)行分析測定。圖36顯示各個血清的80。/fl中和滴度，其被測定為相比于僅用培養(yǎng)基預(yù)溫育的HCV糖蛋白-假型HIV-l螢光素酶報告病毒而言產(chǎn)生80。/。中和的血清稀釋度。至少80。/。的用E2-his、E2A123-his和E2A23-his進(jìn)行免疫接種的小鼠產(chǎn)生針對ElE2-HIV-l假型的中和抗體，其平均80y。中和滴度分別為908、413和140。相反地，至少80。/。的用E2Al-his或僅佐劑70進(jìn)行免疫接種的小鼠缺乏80°/。-中和活性，其平均80%中和滴度分別為7和26(表14)。11.討論包含所述3個可變區(qū)中的一個或多個缺失的E2-his蛋白能夠引發(fā)對于同源抗原具有反應(yīng)性的抗體。通過將免疫血清與包含3個可變區(qū)的完整野生型E2-his蛋白反應(yīng)的能力和與E2Al23-his蛋白(其代表了缺少所有3個可變區(qū)但保持了CD81結(jié)合的核心E2折疊單元)反應(yīng)的能力相比較來檢查該抗體應(yīng)答的特異性。該分析揭示，用E2-his蛋白或缺少HVR1的E2(E2A1-his)進(jìn)行免疫接種的小鼠引發(fā)顯著更少的與E2的核心結(jié)構(gòu)域具有反應(yīng)性的抗體。相反地，在用缺少HVRl和2的E2-his蛋白(E2Al2-his)、缺少HVRl和igVR的E2-his蛋白(E2Al3-his)、缺少HVR2和igVR的E2-his蛋白(E2A23-his)或缺少所有三個可變區(qū)的E2-his蛋白(E2A123-his)進(jìn)行免疫接種的小鼠中所引發(fā)的抗體類似地與野生型E2-his和E2A123-his抗原進(jìn)行反應(yīng)。這暗示，HVR2和igVR可能阻礙抗體接近存在于E2的處于下面的保守核心結(jié)構(gòu)域中的表位。為了檢測這種假設(shè)，合成了代表來自基因型lb(Conl)和基因型2a(JF-Hl)的異源HCV分離抹的E2咖構(gòu)建體。在第3次疫苗接種后獲得的小鼠血清對于這些異源E2,構(gòu)建體的免疫反應(yīng)性揭示出，用E2△123-his、E2Al2-his、E2A3-his、E2A2-his進(jìn)行免疫接種的小鼠引發(fā)了顯著更高水平的針對存在于基因型lb分離林Conl中的表位的交叉反應(yīng)性抗體。盡管也引發(fā)了針對基因型2a分離抹JF-H1的E2,的交叉反應(yīng)性抗體，但免疫原組之間的結(jié)合滴度的差異在統(tǒng)計學(xué)上是不顯著的，雖然觀察到與上述相類似的趨勢。這些數(shù)據(jù)暗示，至少一個可變區(qū)(優(yōu)選HVR2和/或igVR)的缺失可提高E2-his蛋白引發(fā)具有更廣泛中和能力的交叉反應(yīng)性抗體的能力。使用HCVE1E2假型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒來檢查免疫血清中和同源病毒的能力。數(shù)據(jù)顯示，用E2A123-his或E2A23-his進(jìn)行疫苗接種的小鼠具有相比于僅缺少HVRl的E2-his而言平均為其59和20倍的中和抗體滴度(分別地，p=0.ll和O.002)。先前已顯示，HVR1為E1E2糖蛋白復(fù)合物的免疫顯性區(qū)域。僅缺失HVR1區(qū)域可能導(dǎo)致重要的類型特異性免疫顯性表位的去除。然而，在缺失了HVRl的構(gòu)建體中HVR2和/或igVR區(qū)域的存在可掩蔽處于下面的隱藏的中和表位。因此，由野生型E2-his蛋白所引發(fā)的抗體應(yīng)答可能主要針對HVRl區(qū)域而不是保守的核心。這一點部分地反映在下列方面(i)較低水平的與E2核心結(jié)構(gòu)域具有反應(yīng)性的抗體(圖34B),和(ii)較低水平的交叉反應(yīng)性抗體(圖35A)。這些數(shù)據(jù)綜合在一起暗示，HVR2和/或igVR區(qū)域的缺失對于不缺少任何可變區(qū)的或僅缺少HVR1的E2RBD構(gòu)建體的使用是顯著的提高。缺少至少HVR2和/或igVR以及可能所有3個可變區(qū)的E2RBD蛋白將可能引發(fā)能夠交叉中和基因型內(nèi)的不同HCV抹系的抗體以及引發(fā)跨基因型中和。缺少一個或多個可變區(qū)的E2RBD蛋白對于用于預(yù)防或治療HCV感染的治療性或預(yù)防性疫苗接種策略而言可以是有用的工具。此外，這些缺失了可變區(qū)的E2RBD構(gòu)建體還可用于引發(fā)中和HCV的針對保守E2核心區(qū)域的抗體的新型特異性，以用于治療性和預(yù)防性用途。12.材料和方法野生型和變體HCVE2-hiscDNA的構(gòu)建以及所編碼的蛋白質(zhì)在哺乳動物細(xì)胞中的分泌表達(dá)編碼HCVE2-his變體的cDNA表達(dá)質(zhì)粒的產(chǎn)生由Ge職rtAG(Regensburg，Germany)構(gòu)建編碼野生型E2蛋白片段(殘基384-661;抹系H77c)的合成基因。以符合讀框的方式將人胰蛋白酶原信號肽(MNPLLILTFVAAALA)附加至野生型E2成熟蛋白的N-末端，以幫助成熟多肽分泌至表達(dá)培養(yǎng)基中。正好在N-末端之前處引入Kozak序列以增加翻譯起始，并且以符合讀框的方式添加(His)6序列以使得能夠隨后通過固定化金屬親和層析來純化分泌的蛋白質(zhì)。在C-末端處的His-標(biāo)簽之后添加兩個終止密碼子以確保有效的翻譯終止。該構(gòu)建體稱為E2-his。調(diào)整E卩-hiscDM的密碼子使用以適應(yīng)于智人(〃咖o^2/7/e/;)基因的密碼子偏倚性。在cDNA的5'末端引入NheI限制位點和在3'末端引入XhoI限制位點，以便將GeneartcDNA連接入經(jīng)NheI-XhoI消化的pcDNA3.1(Invitrogen)中。按照廠商說明書使用Accupritne/Y;rDNA聚合酶(Invitrogen)以及使用表l5中所顯示的引物，釆用標(biāo)準(zhǔn)PCR誘變程序來構(gòu)建編碼E2-his成熟蛋白的7個變體(其中所述可變區(qū)中的一個或多個被連接體序列取代)的cDM。用于構(gòu)建E2-his的cDNA的引物的組合顯示在表16中。具體的PCR參數(shù)如下在95。C下變性2分鐘，然后進(jìn)行18個循環(huán)(95。C15秒，64°C30秒，和68。C2分鐘)，最后在68。C下溫育2分鐘。將Geneart野生型E2-hiscDNA用作用于所有E2-his變體cDNA的PCR模板。采用多個片段的連續(xù)重疊PCR來構(gòu)建每種缺失變體。一旦每種cDM完成，就用NheI和XhoI對其進(jìn)行消化，并將其連接入pcDNA3.1中。使用QiagenMaxi試劑盒來進(jìn)行質(zhì)粒DNA的大規(guī)模制備。所有質(zhì)粒構(gòu)建體的核苷酸序列通過^f吏用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencing和AppliedBiosystems自動觀寸序4義觀'J定兩條鏈的序歹'J來進(jìn)行驗證。成熟的野生型和變體E2蛋白的序列如下E2-his成熟蛋白TIFKVRMYVGGVEHRLEAACNWTRGERCDLEDRDRSEE2A2-his成熟蛋白TIF"KVRMYVGGVEHRLEAACNWTRGERCDIjEDRDRSEE2A3-his成熟蛋白73E2Al3-his成熟蛋白YVGGVEHRLEAAC麗TRGERCDLEDRDRSEE2A23-his成熟蛋白YVGGVEHRLEAAC麗TRGERCDLEDRDRSEE2A123-his成熟，白LEDRDRSE細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充有青霉素/鏈霉素/兩性霉素B(Invitrogen)的FreeStyle^表達(dá)培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)FreeStyleTM293-F細(xì)胞(Irwitrogen)。于"。C在具有8M()02氣氛的潮濕培養(yǎng)箱中維持所有細(xì)胞。瞬時蛋白質(zhì)表達(dá)通過按照廠商說明書用基于pcDNA3.l的表達(dá)質(zhì)粒和293fectin轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，而在FreeStyleTM293-F細(xì)胞中進(jìn)行每種E2-his蛋白的瞬時表達(dá)。以lx1(T個活細(xì)胞/ml的終濃度轉(zhuǎn)染總體積為18Qml的細(xì)胞，并在3rC的具有8W002氣氛的潮濕培養(yǎng)箱中，在以150rpm旋轉(zhuǎn)的軌道式搖動器(IKA)上，在無菌搖瓶(Corning)中溫育5天。在轉(zhuǎn)染后2U、時，向細(xì)胞培養(yǎng)物補(bǔ)充以胰蛋白胨N1(Organotechnie，F(xiàn)rance)至O,5%v/v的終濃度。通常，在轉(zhuǎn)染后5天收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。通過下列方式來檢查蛋白質(zhì)表達(dá)使用4-20%Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠對細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的樣品進(jìn)行電DYPYR!LWHYPCT工NYTIFKVRMYVGGVEHKLEAAC麗TRGERCDLEDRDRSEE2A12-his成熟蛋白TRGERCDIjEDRDRSEcsKcYHpQLpYVYFFD.1:1VVGDMG工YGel-sOJGAcGRGTEcARYTDT工ypsVSNSCTpDNpTQG;wTVGEs>>泳，并通過用考馬斯藍(lán)試劑染色來使蛋白質(zhì)可視化。關(guān)于蛋白質(zhì)的純化，通過以2500rpm進(jìn)行離心來收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，然后在進(jìn)行層析之前使其通過O.45pM過濾器(Nalgene)。所表達(dá)的野生型和變體HCVE2-his蛋白的純化在過濾后，將細(xì)胞培養(yǎng)物上清液經(jīng)歷使用鎳Sepharose的固定化金屬親和層析(IMAC)，以純化野生型和變體E2-his蛋白。純化程序描述如下1.緩沖液Ni-MAC緩沖液A50mMNaH具pH8.0300mMNaCl10mM咪哇Ni-MAC緩沖液B(洗脫)50mMNaH2P04pH8.0300mMNaCl500mM咪喳2.方案1.在4-rc下進(jìn)行工序2至62.用5倍體積的(1犯20洗滌在10mlPoly-Prep柱(Bio-Rad)中的lmlNiSepharose6FastFlow樹月旨(GEHealthcare)。3.用10mlNi-MAC緩沖液A平衡所述柱。4.將樣品加載到所述柱上，并且收集漏出液(breakthrough)(B/T)。5.用IOmlNi-MAC緩沖液A洗滌所述柱。6.用5mlNi-MAC緩沖液B(洗脫)洗脫蛋白質(zhì)并收集lml的級分。7.使用96-孔平板形式的Bradford測定法和用考馬斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠來鑒定峰級分。8.匯集峰級分，并于4。C在1XPBS中透析過夜。759.在透析后，使用96-孔平板形式的Bradford測定法和用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的lmg/mlBSA來測定蛋白質(zhì)濃度。ConlE2RBD-his和JFHlE2RBD-myccDNA的構(gòu)建以及所編碼的蛋白質(zhì)在哺乳動物細(xì)胞中的分泌表達(dá)編碼ConlE2咖-his和JFHlE2哪-myc的cDM表達(dá)載體的產(chǎn)生使用Expand-Hifi聚合酶(Roche)和表17中所示的引物通過PCR來制備編碼ConlE2(HCVConl多蛋白殘基384至661;Genbank登錄號AJ238799)和JFH1E2(HCVJFH1多蛋白殘基384至665;Genbank登錄號AB047369)的cDNA。正向引物編碼用于以符合讀框的方式摻入在cDNA的5'末端處的Nhel限制位點。反向引物編碼用于以符合讀框的方式分別添加至Conl和JFHlcDNA的3'末端處的(His)6和c-myc表位，并且對于這兩種情況，后面均跟隨有TAG翻譯終止密碼子和XbaI限制位點。具體的PCR參數(shù)如下在95。C下變性5分鐘，然后進(jìn)行30個循環(huán)(92°C1分鐘，55°Cl分鐘，和72X:2分鐘)，最后在72。C下溫育10分鐘。將cDNA克隆至載體pcDNA3中的組織纖溶酶原激活物信號肽的下游，以促進(jìn)所表達(dá)的蛋白質(zhì)的分泌。所克隆的cDNA的核苷酸序列通過使用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencing和AppliedBiosystems自動測序儀來驗證。ConlE2咖-his和JFHlE2RBD-mycW瞬時表達(dá)使用Fugene6(Roche),用ConlE2國-his和JFHlE2咖-myc表達(dá)栽體來轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞(350，000個細(xì)胞/6-孔培養(yǎng)板的孔)。在轉(zhuǎn)染后8小時，用0ptimem(Invitrogen)置換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并將細(xì)胞于37。C在含有5。/。C02的潮濕氣氛中溫育3天。通過以1500rpm離心10分鐘并隨后經(jīng)過O.45-fim-孔徑大小的注射器式過濾器進(jìn)行過濾，來澄清組織培養(yǎng)液。野生型和變體E2-his蛋白的生物化學(xué)和功能分析藍(lán)非變性PAGE使用藍(lán)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(BN-PAGE)來分析經(jīng)純化的E2-his蛋白的寡聚化狀態(tài)。將10fig每種蛋白質(zhì)加入至lOpl增溶緩沖液(solubilizationbuffer)和l.5nl樣品緩沖液中，并加栽到含有4%堆積膠的5-15%梯度分離膠上。在4°(:下以10()伏對所述凝膠進(jìn)行電泳直至染料前沿進(jìn)入堆積膠。然后，將電壓增加至200伏直至染料前沿遷移至凝膠的底部。在上層儲槽(upperreservoir)中使用含有O.01%ServaG的lx陰極緩沖液進(jìn)行電泳l.5小時，隨后在無ServaG的lx陰極緩沖液中電泳l-l.5小時。下層儲槽(lowerreservoir)裝有l(wèi)x陽極緩沖液。在電泳后，使凝膠脫色過夜，并在0dyssey掃描儀中于680nm處進(jìn)行掃描。用于BN-PAGE的溶液如下聚丙烯酰胺凝膠:<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>其他溶液3x凝膠緩沖液。150mMBisTris-HCl，5M6-氨基己酸，pH7.0lQx陰極緩沖液。0.5MTricine，150mMBisTris5x陽極緩沖液。0.25MBisTris-HCl，pH7.02xBisTrisACA。200mMBisTris-HCl,1M6-氨基-己酸，pH7.0樣品緩沖液。50mgServaG，500jil2xBisTrisACA，400pi75%蔗糖和100nl水增'溶緩沖液。0.5M6-氨基-己酸，20mMBisT"s，2mMEDTA，pH7.01%TritonX-100,10%甘油脫色液。10%乙酸，10%曱醇，80%水E2-his蛋白的免疫檢測將純化的E2-his蛋白的樣品經(jīng)歷還原性SDS-PAGE,然后電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。使用非構(gòu)象依賴性E2特異性單克隆抗體，隨后使用偶聯(lián)至Alexafluor680nm的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Invitrogen)來檢測E2-his蛋白。在Odyssey檢測系統(tǒng)中掃描免疫印跡。CD81結(jié)合性質(zhì)使用固相酶免疫測定法來檢查E2-his蛋白與HCV細(xì)胞受體CD81相互作用的能力。在4。C下用PBS中的5ng/ml融合至CD81的重組大細(xì)胞外環(huán)(殘基113-201)的麥芽糖結(jié)合蛋白來包被酶免疫測定法平板(NuncMaxisorb)過夜。除去包被溶液，在室溫下用在PBS中的牛血清白蛋白(10mg/ml)(BSAi。PBS)來封閉未被占據(jù)的位點l小時。用含有O.05%Tween20的PBS(PBST)洗滌平板4次。將50ngE2-his蛋白在50jil含有5mg/ml牛血清白蛋白的PBS(BSA5PBST)中進(jìn)行系列稀釋，并溫育2小時。使用E2特異性單克隆抗體，隨后使用偶聯(lián)至辣根過氧化物酶的兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako)來檢測結(jié)合的E2-his蛋白。平板用四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽底物來進(jìn)行顯色，并通過加入1MHC1來終止。在Fluostar平板閱讀器(BMGtechnologies)中于450nm處測量吸光度值，并減去在620mn處的背景。野生型和變體E2-his蛋白在小鼠中的免疫原性免疫接種方案使用與ISC0MATRIX⑧佐劑(Pearse和Drane，2005)—起進(jìn)行配制的純化的E2-his野生型和變體蛋白來免疫接種7-8周齡的雌性Balb/c小鼠，每組10只小鼠(表18)。每一小鼠劑量在O.1ml體積中含有10jig特定蛋白質(zhì)和5pg13(:0\^111^@佐劑。以三周的間隔對小鼠進(jìn)行皮下給藥3次，并且在笫一次給藥前1天和在第二和第三次給藥后1周進(jìn)行采血。酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)在ELISA中就抗-E2抗體的存在情況來檢查免疫小鼠血清。使用雪花蓮(GM)凝集素在96孔Maxisorb微量滴定板(Nunc)上捕獲E2-his、ConlE2RBD—myc或JFHlE2,-myc蛋白。在4。C下用PBS中的5fig/mlGNA凝集素來包被平板過夜。在室溫下用IOOjilBSA!。PBS來封閉未被占據(jù)的位點1小時。在用PBST洗滌平板4次后，將E2蛋白施加到50jilBSA5PBST中，并在室溫下溫育l小時。在用PBST洗滌平板4次后，將小鼠血清的系列稀釋物施加到50jil體積的BSA5PBST中，并在室溫下溫育l小時。使用偶聯(lián)至辣根過氧化物酶的兔抗小鼠免疫球蛋白來檢測結(jié)合的免疫球蛋白，并且用四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽底物來進(jìn)行顯色，并通過加入1MHC1來終止。將Fluostar平才反閱讀器(BMGtechnologies)用于測量450nm處的吸光度和620nm處的背景。從所述吸光度中減去背景，從而產(chǎn)生結(jié)合曲線。中和測定法如下測定免疫小鼠血清和對照小鼠血清中和單輪由HCV糖蛋白-假型HIV-1螢光素酶報告病毒引起的感染的能力。通過用pElE2和pNL4.3LUCR-E-質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T單層(350，000個細(xì)胞/6-孔培養(yǎng)板的孔)來制備HCV糖蛋白-假型HIV-l螢光素酶報告病毒(Drummer等人，2003)。于37。C在含有5"/。C02的潮濕氣氛中溫育3天后，通過O.45jim無菌注射器式過濾器(Sartorius)來過濾培養(yǎng)物上清液。將熱滅活的免疫和對照小鼠血清的系列5倍稀釋物與HCV糖蛋白-假型HIV-1螢光素酶報告病毒一起預(yù)溫育U小時)，然后將添加至一式四份的在48-孔培養(yǎng)板中的Huh7細(xì)胞單層。在4小時的溫育(37°C，5%C02)后，用PBS洗滌細(xì)胞，并更換培養(yǎng)基。在額外的3天溫育(37°C，于5%(:02中)后，裂解細(xì)胞，通過離心來澄清裂解物，然后在裝配有發(fā)光光學(xué)器件的Fluostar(BMG)中就螢光素酶活性(Promega)來進(jìn)行測定。將各個血清的中和滴度測定為相比于僅用培養(yǎng)基預(yù)溫育的HCV糖蛋白-假型HIV-l螢光素酶報告病毒而言產(chǎn)生80。/。中和的血清稀釋度。表7.在笫2次疫苗接種后獲得的與固相E2-his抗原具有反應(yīng)性的抗體滴度的成對統(tǒng)計學(xué)比較。使用Student'sf檢驗來計算/ti。免疫原組E2Al陽hisE2A2-hisE2A3-hisE2A12-hisE2A13-hisE2A23-hisE2A123-hisE2-his0.060.960.250.260.370.60.08E2Al-his0.060.270.090.0340.0140.04表8.在第2次疫苗接種后獲得的與固相E2Al23-his蛋白抗原具有反應(yīng)性的抗體滴度的成對統(tǒng)計學(xué)比較。使用Student/sf檢驗來計算;H!i。免疫原組E2Al-hisE2A2-hisE2A3-hisE2A12-hisE2A13-hisE2A23-hisE2A123-hisE2-his0.040.960.020.020.090.0770扁E2Ahhis0.040.090.120.060.060.17表9.在第3次疫苗接種后獲得的與固相E2-his蛋白抗原具有反應(yīng)性的抗體滴度的成對統(tǒng)計學(xué)比較。使用Student'sf檢驗來計算咸，其中假定不等方差。免疫原組E2Al-hisE2A2-hisE2A3-hisE2A12-hisE2A13-hisE2A23-hisE2A123-hisE2-his0.020.0030.0020.040.0020.020.11E2Al-his0.10.0210.580.440.90.1780<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>表12.在第3次疫苗接種后獲得的與固相ConlE2RBD-his蛋白抗原具有反應(yīng)性的抗體滴度的成對統(tǒng)計學(xué)比較。使用Student'sf檢驗來計算;Hl:，其中假定不等方差。<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>表13,在第3次疫苗接種后獲得的與固相JFH1E2RBD-myc蛋白抗原具有反應(yīng)性的抗體滴度的成對統(tǒng)計學(xué)比較。使用Student'sf檢驗來計算威，其中假定不等方差。<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>表14.平均80%中和抗體滴度和統(tǒng)計學(xué)比較。使用Student'st檢驗來計算;^i,其中假定不等方差。免疫原組<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>表15.用于制備E2-his蛋白變體DNA序列的引物。引物名稱引物序列HCV-15'TATAGCTAGCGCCACCATGAACCCCCTGC3'HCV-25'CTGGATGTTCTGGTGGGTCTCGGCCAG3'HCV-35'GCCGAGACCCACCAGAACATCCAGCTG3'HCV-45'CGCTGCTGCCGCAGGAGGCGAG3'HCV-4a3,HCV-55'GGCAGCAGCGGCTGCTGGCACTAC3HCV-5a3'HCV-6a5'C3'HCV-7a3'HCV-85'TCTGCTCGAGTTATCAGTGGTGATGGTGGTGG3'HCV-ll5'CTCTCGTTGCAGTTCAGGGCGGTGCTG3'HCV-125'CAGCACCGCCCTGAACTGCAACGAGAG3'表16.用于制備E2-his蛋白變體DNA序列的引物組合。E2蛋白引物組合E2M-hisHCV-1HCV-3HCV-8E2A2-hisHCV-1HCV-llHCV-12HCV-8E2A3-hisHCV-1HCV-6aHCV-7aHCV-8E2A12-hisHCV-1HCV-2HCV-3HCV-4HCV-5E2A13-hisHCV-1HCV-6aHCV-7aHCV-8E2A23-hisHCV-1HCV-5aHCV-4AHCV-6AHCV-7AHCV-8E2A123-hisHCV-1HCV-6aHCV-7aHCV-883表17.用于制備ConlE2咖-his和JFHlE2,-mycDNA的引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>參考文獻(xiàn)1.Anandarao,R.,S.Swaminathan,S.Fernando,A.M.Jana,andN,Khanna(2006),"Recombinantmultiepitopeproteinforearlydetectionofdengueinfections".C〃".Fac"'加力顏wno/.13:59-67.2.Arai,R.,W.Wriggers,Y.Nishikawa，T.Nagamune,andT,Fujisawa,(2004),"ConformationsofvariablylinkedchimericproteinsevaluatedbysynchrotronX-raysmall-anglescattering".iVo如'ra57:829-38.3.Argos,P.(1990),"Aninvestigationofoligopeptideslinkingdomainsinproteintertiarystructuresandpossiblecandidatesforgeneralgenefusion".乂Mo/.5'o/.211:943-58.4.Bahrami，S.，M.Duch，andF.S.Pedersen,(2007)，"LigandpresentationonasyntheticflexiblehingeinMoloneymurineleukemiavirusSUsupportsentryviaaheterologousreceptor".Fi>o/ogy,B363B:303-9.5.Bartosch,B.,Bukh,J.,Meunier，J.C.,Granier,C.,Engle，R.E.，Blackwelder,W,C.，Emerson,S.U.,Cosset，F(xiàn).L.&Purcell,R.H.(2003a)InVitroAssayForNeutralizingAntibodyToHepatitisCVirus:EvidenceForBroadlyConservedNeutralizationEpitopes./VociVa^Jco^5Wt/>SM,100，14199-204,6.Bartosch,B.,Dubuisson，J.&Cosset，F(xiàn).L.(2003b)InfectiousHepatitisCVirusPseudo-ParticlesContainingFunctionalE1-E2EnvelopeProteinComplexes,J"五;cp她《197，633-642.7.Bellamy-Mcintyre,A.K.,C.S.Lay,S.Baar，A丄.Maerz，G.H.Talbo,H.E.Drummer,AndP.Poumbourios,(2007),"FunctionalLinksBetweenTheFusionPeptide-ProximalPolarSegmentAndMembrane-ProximalRegionOfHumanImmunodeficiencyVirusGp41InDistinctPhasesOfMembraneFusion"./5;'o/.C/亂282:23104-16.8.Deleersnyder,V.，Pillez,A.,Wychowski,C.,Blight,K.,Xu,J.,Hahn,Y.S.,Rice,C.M.&Dubuisson,J.(1997)FormationOfNativeHepatitisCVirusGlycoproteinComplexes.Jr!>oZ,71，697-704.9.Dipti,C.A.,S.K.Jain,AndK.Navin,(2006),"ANovelRecombinantMultiepitopeProteinAsAHepatitisCDiagnosticIntermediateOfHighSensitivityAndSpecificity",Profe^Expr,戶w"y:47:319-28.8610.Drammer，H.E.,Boo，I.,Maerz,A.L.&Poumbourios,P.(2006)AConservedGly436-Trp-Leu-Ala-Gly隱Leu-Phe-TyrMotifInHepatitisCVirusGlycoproteinE2IsADeterminantOfCd81BindingAndViralEntry.JFfra/,80,7844-53.11.Drummer,H.E.,Maerz，A.&Poumbourios,P.(2003)CellSurfaceExpressionOfFunctionalHepatitisCVirusElAndE2Glycoproteins.尸由丄魄546，385-90.12.D麵mer,H.E.,Wilson,K.A.&Poumbourios,P.(2002)IdentificationOfTheHepatitisCVirusE2GlycoproteinBindingSiteOnTheLargeExtracellularLoopOfCd81.JK,ra/,76,11143-7.13.Dubuisson,J"Hsu,H.H.,Cheung,R.C.,Greenberg:H.B.，Russell,D.G.&Rice,C.M.(1994)FormationAndIntracellularLocalizationOfHepatitisCVirusEnvelopeGlycoproteinComplexesExpressedByRecombinantVacciniaAndSindbisViruses./F>o/,68，6147-60.14.George,R,A.,AndJ.Heringa，(2002)，"AnAnalysisOfProteinDomainLinkers:TheirClassificationAndRoleInProteinFolding",15:871-9.15.Grollo,L.，J.Torresi，H.Drummer,W,Zeng,N.Williamson,andD,C.Jackson,(2006)."Exploitinginformationinherentinbindingsitesofvirusspecificantibodies:designofanHCVvaccinecandidatecross-reactivewithmultiplegenotypes".」《"Vz>.77^r.11:1005—1014.16.He,J.&Landau,N.R.(1995)UseOfANovelHumanImmunodeficiencyVirusType1ReporterVirusExpressingHumanPlacentalAlkalinePhosphataseToDetectAnAlternativeViralReceptor./F/ro/,69，4587-92.17.Horton,R.M.，Hunt,H.D.,Ho,S.N.,Pullen,J.K.&Pease，L.R.(1989)EngineeringHybridGenesWithoutTheUseOfRestrictionEnzymes:GeneSplicingByOverlapExtension.77，61-8,18.Keck,Z.Y.,OpDeBeeck,A.,Hadlock,K.G.,Xia,J.,U,T.K.，Dubuisson,J.&Foung,S.K.(2004)HepatitisCVirusE2HasThreeImmunogenicDomainsContainingConformationalEpitopesWithDistinctPropertiesAndBiologicalFunctions./PW,78，9224-32.19.Levy，S.,Todd，S.C.&Maecker,H.T.(1998)Cd81(Tapa-1):AMoleculeInvolvedInSignalTransductionAndCellAdhesionInTheImmuneSystem.爿朋wiev/;wmmo/,16,89-109.20.Lindenbach,B.D.，E糧s,M.J"Syder,A,J"Wolk，B.，Tellinghuisen,T.L.，Liu,C.C.,Maruyama,T.,Hynes，R.O.,Burton,D.R.，Mckeating,J.A.&Rice，C.M.(2005)CompleteReplicationOfHepatitisCVirusInCellCulture.5W'e"ce.21.Lohmarin,V.,Korner,F,，Koch，J.,Herian,U.,Theilma叫L.&Bartenschlager,R.(1999)ReplicationOfSubgenomicHepatitisCVirusRnasInAHepatomaCellLine.Sc/ewce,285，110-3.22.Petracca，R.，F(xiàn)alugi,F.，Galli，G.,Norais，N,,Rosa,D.，Campag加li,S,,Burgio,V.,DiStasio,E.，Giardina，B.，Houghton，M.,Abrig麵i,S.&Grandi,G.(2000)Structure-FunctionAnalysisOfHepatitisCVirusEnvelope-Cd81Binding.JWroZ,74，4824-30.23.Pearse，MJ.andDrane，D,(2005)."ISCOMATRIXadjuvantforantigendelivery".顛.i>wg￡W.iev.57:465-474.24.Pileri,P.，Uematsu,Y.,Campagnoii,S.,Galli,G,,Falugi，F(xiàn).,Petracca,R.,Weiner，A.J"Houghton，M.,Rosa,D.,Grandi,G.&Abrign肌i,S.(1998)BindingOfHepatitisCVirusToCd81.Sc/ewce,282,938-41.25.Sabourin,M.，C.T.Tuzon，T.S.Fisher,AndV.A.Zaki肌，(2007),"AFlexibleProteinLinkerImprovesTheFunctionOfEpitope-TaggedProteinsInSaccharomycesCereviseae".Teoy/",24:39-45.26.Sambrook,J.&Russel,D.(2001)C7o"z'wg，CshlPress,27.Scarselli,E.，Ansuini,H.,Cerino,R.,Roccasecca,R.M.，Acali，S.,Filocamo,G.,Traboni,C,,Nicosia,A.,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