專利名稱：：抗衣原體感染疫苗的制作方法抗衣原體感染疫苗發(fā)明領域本發(fā)明一般地涉及治療或預防衣原體感染。特別地，本發(fā)明涉及治療或預防眼沙眼衣原體感染的方法和相關方面。
背景技術：
：衣原體是細胞內細菌病原體，其是多種重要的人和動物感染的原因。沙眼衣原體(C/z/am少Jzarrac/zom^w)在人之間通過社會或性接觸而傳播。存在大量沙眼衣原體血清型，并且盡管血清型的鑒定和分類仍在發(fā)展，目前已經(jīng)報道了至少18種。血清型A到C主要與眼沙眼相關，血清型D到K與眼殖疾病相關并且血清型Ll到L3與性病淋巴肉芽腫(LGV)相關(Brunham，RC等</.A^.Aev./mww"o/.20055:149-161)。然而，所述疾病相關不是絕對的，例如，血清型B已在生殖道分離物中發(fā)現(xiàn)(Caldwell,HB等人.C""./m^"2003111(11):1757-1769)。沙眼衣原體是最普遍的性傳播疾病之一，并且可導致骨盆炎性疾病(PID),導致輸卵管閉塞和不育癥。沙眼衣原體還可在男性不育癥中起重要作用。在1990年，在美國治療PID的成本估計是$四十億。世界衛(wèi)生組織估計1999年世界范圍內發(fā)生超過9千萬的性傳播沙眼衣原體的新病例(GlobalPrevalenceandIncidenceofSelectedCurableSexuallyTransmittedInfections,WorldHealthOrganisation,Geneva,2001)。而且，潰瘍性性傳纟番疾病例如沙眼衣原體感染是HIV獲取的主要風險因子(Bmnham，RC等J.iVaf.Aev./m/mmo/.20055:149-161;Igietseme,JU等人.5^/e尸/"Aev.]^acc^wes20032(1):129-146)。通常沙眼衣原體感染是無癥狀的和亞臨床的，使得嚴重和經(jīng)常不可逆的并發(fā)癥可能以生殖器感染的首次癥狀存在。產于具有生殖道沙眼衣原體感染的母親的嬰兒可能發(fā)展肺炎，并且沙眼衣原體被認為在最初六個月的生命期中是最普遍的肺炎致病物質(delaMaza,LM等Cwrr.O//"./"ve幼g.Z>w^20023(7):980-986)。由于沙眼衣原體的眼感染的沙眼是世界范圍內可預防的失明的主要原因，并且估計感染了3億-5億的人(West,SK尸rag.200423:381-401)。目前的治療涉及使用抗生素例如四環(huán)素(每天，4到6周時間)或阿奇霉素(單個劑量)。盡管在對抗感染中有效，由于感染的地方性，普遍存在再感染。許多年內重復的感染導致眼瞼瘢痕，眼瞼邊緣的變形和眼睫毛對角膜的摩擦(倒睫)。角膜持續(xù)的沙眼是疼痛的并且導致角膜混濁和失明(Mabey，DCW等T7e2003362:223-229)。已經(jīng)暴露于沙眼衣原體的個體已經(jīng)顯示發(fā)展一定程度的對再感染的天然免疫性，至少在相同血清型的情況下(Katz,BP等&x198714:160-164),盡管保護程度可能依賴于先前感染發(fā)生之后的消逝時間。年齡也已經(jīng)顯示在感染過程中是重要的，更年老的個體顯示出更短的眼沙眼衣原體感染的持續(xù)期(Bailey,R等/w/e".1999123:479-486),再次暗示存在適應性的免疫學保護。已經(jīng)暗示使用抗生素可能實際上阻礙了對沙眼衣原體的天然免疫的發(fā)展(Brunham,RC等丄A^.Aev./wmw朋/.20055:149-161;Atik,B等人.丄AMA2006296(12):1488-1497)。沙眼衣原體感染因此在發(fā)達和發(fā)展中國家都構成了顯著的健康問題。出于公共健康的考慮，和目前治療的成本在許多發(fā)展中國家是過度的的事實，用于衣原體種的疫苗的研發(fā)已經(jīng)成為重要的研究目標。由于沙眼衣原體的基因構成是相對穩(wěn)定的，并且由于動物宿主的存在是可以忽略的，甚至具有有限效率的疫苗可能具有對于感染流行的顯著作用。主要外膜蛋白(Momp)占細菌外膜蛋白質量的大約60%，并且相信在確定血清型特異性中是重要的。該氨基酸序列包含四個區(qū)域，其是外部暴露的并且其中存在主要的序列變化。在Momp序列中的ca.400個氨基酸中，高達70個氨基酸在不同血清型的Momp之間是不同的。特別令人驚訝的是發(fā)現(xiàn)基于氨基酸序列同一性的血清型分組與基于相關疾病狀態(tài)(即，眼，眼殖和LGV)的血清型分組是不對應的(Stothard，DR等/"/e"./mmw".199866(8):3618-3625)。類似地，編碼Momp的ow;^基因的核苷酸序列同一性對比與疾病狀態(tài)不對應(Meijer,A等丄腦e"o/.1999181(15》4469-4475;Lysen,M等丄C//".A^cra&o/.200442(4):1641-1647)。Momp的單克隆抗體在培養(yǎng)和一些8動物模型中是有效的，然而，保護可以是有限的并且通常是血清型特異的。用外糖脂抗原的單克隆抗-獨特型抗體皮下或口服免疫的小鼠發(fā)展出對于血清型C的保護性應答，盡管保持對用血清型K攻擊的易感性(Whittum-Hudson,JA等淑19962(10):1116-1121)。目前已經(jīng)公開并且顯示在不同血清型之間的高水平序列同源性的一種蛋白，即1類可及蛋白-1(classIaccessibleprotein-1)(表示為Cap-l,或Ct-529)。所述蛋白具有在疫苗研發(fā)中的潛在用途，所述疫苗刺激針對多于一種血清型的保護(Fling,SP等尸M4S200198(3):1160-1165)。然而，除了需要血清型之間高水平的序列同源性之外，用于疫苗中的蛋白必須也引發(fā)充分的免疫應答。Lyons,JM等認C/"/ec"歸D&簡es20055:105描述了在小鼠生殖道感染之后獲取針對眼殖沙眼衣原體血清型的同型和異型的免疫性。Patel,HC等Gw"own'".199571:294-97發(fā)現(xiàn)具有結膜和生殖道的雙重衣原體感染的患者比單獨具有眼或生殖道感染的患者具有更高的IgG滴度。Ogm，PL等C/z".A^,cro&o/.Aev.200114(2):430-445討論了用于獲得粘膜免疫應答的一般接種策略。國際專利申請?zhí)朠CT/US2006/010793,公開號WO2006簡890，公開了用于預防和/或治療衣原體感染的衣原體抗原的組合，但是沒有特別公開它們用于治療眼感染。本領域仍然需要治療和預防眼沙眼衣原體感染的有效方法。也需要治療和預防產生于多種血清型的眼沙眼衣原體感染的有效方法。本發(fā)明滿足了這些需要并且進一步提供了其他的相關優(yōu)點。本發(fā)明已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)某些免疫組合物的給藥是誘導保護免于眼沙眼衣原體感染的免疫應答的有效方法。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體蛋白Ct-089、Ct-858和Ct-875特別地都是高度抗原性的并且在不同的沙眼衣原體血清型中具有高度的序列同一性。在預測的表位區(qū)域中具有特別高的保守性。根據(jù)此發(fā)現(xiàn)，存在發(fā)展抗眼沙眼衣原體感染的疫苗的可能性，所述疫苗針對多種沙眼衣原體血清型是有效的(即，其可用于交叉保護)。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供了用于治療或預防眼沙眼衣原體感染的方法，該方法通過給予安全和有效量的免疫原性組合物，所述組合物包含一種或更多種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(passengerdomain)(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。另外提供了用于治療或預防眼沙眼衣原體感染的免疫原性組合物，其包含一種或更多種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核普酸。還提供了一種或更多種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所迷蛋白或片段的多核苷酸在制備用于治療或預防眼沙眼衣原體感染的免疫原性組合物中的用途。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于治療或預防眼沙眼衣原體感染的方法，該方法通過給予安全和有效量的免疫原性組合物，所述組合物包含兩種或更多種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。物，其包含兩種或更多種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。還提供了兩種或更多種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸在制在本發(fā)明的進一步的方面，提供了用于治療或預防眼沙眼衣原體感染的方法，該方法通過經(jīng)眼給予安全和有效量的免疫原性組合物，所述組合物包含一種或更多種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct國622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。還提供了用于治療或預防眼沙眼衣原體感染的方法，該方法通過非經(jīng)眼給予安全和有效量的免疫原性組合物，所述組合物包含一種或更多種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。適當?shù)?，免疫原性組合物包含Ct-089、Ct-858或Ct-875蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。在本發(fā)明的進一步的方面，提供了用于治療或預防第二沙眼衣原體血清型的眼沙眼衣原體感染的方法，該方法包含給予免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含源于第一沙眼衣原體血清型的選自Ct-089、Ct-858或Ct-875的蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。還提供了源于第一沙眼衣原體血清型的選自Ct-089、Ct-858或Ct-875的蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸，在用于制備治療或預防第二沙眼衣原體血清型的眼沙眼衣原體感染的免疫原性組合物中的用途。另外提供了用于治療或預防第二沙眼衣原體血清型的眼沙眼衣原體感染的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含源于第一沙眼衣原體血清型的選自Ct-089、Ct-858或Ct-875的蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。適當?shù)?，免疫原性組合物包含兩種或更多種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苦酸(特別是兩種或更多種選自Ct-089、Ct-858和Ct-875，例如Ct-858和Ct-875,的沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核普酸)。特別地，免疫原性組合物包含涉及Ct-089、Ct-858和Ct-875中的每種的沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。在特定的實施方式中，免疫原性組合物可配制為藥物組合物，進ii一步包含藥學上可接受的稀釋劑或載體。免疫原性組合物的免疫原性可通過配制為進一步包含佐劑的疫苗組合物而增強。附圖簡述圖1顯示了來自沙眼衣原體血清型E的Ct-089與來自多種其他沙眼衣原體血清型的Ct-089的序列比對。圖2a和2b顯示了來自沙眼衣原體血清型E的Ct-858與來自多種其他沙眼衣原體血清型的Ct-858的序列比對。圖3a和3b顯示了來自沙眼衣原體血清型E的Ct-875與來自多種其他沙眼衣原體血清型的Ct-875的序列比對。圖4顯示了在用沙眼衣原體原體眼攻擊之后第7天取自免疫小鼠的眼拭子的結果。圖5顯示了在用沙眼衣原體原體眼攻擊之后第14天取自免疫小鼠的眼拭子的結果。圖6顯示了在用沙眼衣原體原體眼攻擊之后第21天取自免疫小鼠的眼拭子的結果。發(fā)明詳述術語"兩種或更多種選自Swib,Momp,Ct-858，Ct-875,Ct-622,Ct-089，PmpG的過客^或(passengerdomain)(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白，其免疫片段或編碼所述蛋白或片段的多核普酸"表示包含與來自上述名單的第一衣原體抗原相關的至少一種成分(即，蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸)和與來自上述名單的第二衣原體抗原相關的至少一種成分(即，蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸)。"三種或更多種"和所述類似物的參考相應地構建。多核苷酸和多肽序列序列鑒定號的簡述SEQIDNO:1是Ct-460的cDNA序列，也稱為Swib,來自沙眼12衣原體血清型LGVII(血清型LGVII也表示為血清型LII或L2)。SEQIDNO:2是Ct-460的蛋白序列，也稱為Swib,來自沙眼衣原體血清型LGVII,所述蛋白被SEQIDNO:1編碼。SEQIDNO:3是來自沙眼衣原體血清型F的稱為主要外膜蛋白(Momp)的衣原體抗原的cDNA序列。SEQIDNO:4是來自沙眼衣原體血清型F的稱為主要外膜蛋白(Momp)的衣原體抗原的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:3編碼。SEQIDNO:5是來自沙眼衣原體血清型E的Ct-858的cDNA序列。SEQIDNO:6是來自沙眼衣原體血清型E的Ct-858的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:5編碼。SEQIDNO:7是來自沙眼衣原體血清型E的Ct-875的cDNA序列。SEQIDNO:8是來自沙眼衣原體血清型E的Ct-875的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:7編碼。SEQIDNO:9是來自沙眼衣原體血清型E的Ct-622的cDNA序列。SEQIDNO:10是來自沙眼衣原體血清型E的Ct-622的蛋白序列，所述蛋白一皮SEQIDNO:9編碼。SEQIDNO:11是來自沙眼衣原體血清型LGVII也稱為Ct-871的PmpG過客域的cDNA序列。SEQIDNO:12是來自沙眼衣原體血清型LGVII也稱為Ct-871的PmpG過客域的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:11編碼。SEQIDNO:13是來自沙眼衣原體血清型LGVII也稱為Ct-812的PmpD過客域的cDNA序列。SEQIDNO:14是來自沙眼衣原體血清型LGVII也稱為Ct-812的PmpD過客域的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:13編碼。SEQIDNO:15是來自沙眼衣原體血清型E的Ct-089的cDNA序列。SEQIDNO:16是來自沙眼衣原體血清型E的Ct-089的蛋白序列，所述蛋白^皮SEQIDNO:15編碼。SEQIDNO:21是來自沙眼衣原體血清型D的Ct-875的cDNA序列。SEQIDNO:22是來自沙眼衣原體血清型D的Ct-875的蛋白序列，所述蛋白^皮SEQIDNO:21編碼。SEQIDNO:27是來自沙眼衣原體血清型D也稱為Ct-871的PmpG的cDNA序列。SEQIDNO:28是來自沙眼衣原體血清型D也稱為Ct-871的PmpG的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:27編碼。SEQIDNO:33是來自沙眼衣原體血清型D的Ct-858的cDNA序列。SEQIDNO:34是來自沙眼衣原體血清型D的Ct-858的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:33編碼。SEQIDNO:41是來自沙眼衣原體血清型D也稱為Ct-812的PmpD的cDNA序列。SEQIDNO:42是來自沙眼衣原體血清型D也稱為Ct-812的PmpD的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:41編碼。過客域橫跨氨基酸31到1203。SEQIDNO:47是來自沙眼衣原體血清型LGVII的衣原體抗原的cDNA序列，所述抗原稱為主要外膜蛋白(Momp),也稱為Ct-681。SEQIDNO:48是來自沙眼衣原體血清型LGVII的衣原體抗原的蛋白序列，所述抗原稱為主要外膜蛋白(Momp),也稱為Ct-681,所述蛋白凈皮SEQIDNO:47編碼。SEQIDNO:49是來自沙眼衣原體血清型J的衣原體抗原的cDNA序列，所述抗原稱為主要外膜蛋白(Momp),也稱為Ct-681。SEQIDNO:50是來自沙眼衣原體血清型J的衣原體抗原的蛋白序列，所述抗原稱為主要外膜蛋白(Momp)，也稱為Ct-681,所述蛋白^:SEQIDNO:49編碼。SEQIDNO:51是來自沙眼衣原體血清型H的衣原體抗原的cDNA序列，所述抗原稱為主要外膜蛋白(Momp),也稱為Ct-681。SEQIDNO:52是來自沙眼衣原體血清型H的衣原體抗原的蛋白序列，所述抗原稱為主要外膜蛋白(Momp),也稱為Ct-681，所述蛋白謬皮SEQIDNO:51編碼。SEQIDNO:53是來自沙眼衣原體血清型E的衣原體抗原的cDNA14序列，所述抗原稱為主要外膜蛋白(Momp)，也稱為Ct-681。SEQIDNO:54是來自沙眼衣原體血清型E的衣原體抗原的蛋白序列，所述抗原稱為主要外膜蛋白(Momp),也稱為Ct-681,所述蛋白尋皮SEQIDNO:53編碼。SEQIDNO:55是來自沙眼衣原體血清型D的衣原體抗原的cDNA序列，所述抗原稱為主要外膜蛋白(Momp),也稱為Ct-681。SEQIDNO:56是來自沙眼衣原體血清型D的衣原體抗原的蛋白序列，所述抗原稱為主要外膜蛋白(Momp),也稱為Ct-681,所述蛋白4皮SEQIDNO:55編碼。SEQIDNO:57是來自沙眼衣原體血清型D的Ct-622的cDNA序列。SEQIDNO:58是來自沙眼衣原體血清型D的Ct-622的蛋白序列，所述蛋白^皮SEQIDNO:57編碼。SEQIDNO:63是來自沙眼衣原體血清型D也稱為Swib的Ct-460的cDNA序列。SEQIDNO:64是來自沙眼衣原體血清型D也稱為Swib的Ct-460的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:63編碼。SEQIDNO:71是來自沙眼衣原體血清型D的Ct-089的cDNA序列。SEQIDNO:72是來自沙眼衣原體血清型D的Ct-089的蛋白序列，所述蛋白^LSEQIDNO:71編碼。SEQIDNO:79是來自沙眼衣原體血清型A的Ct-089的cDNA序列。SEQIDNO:80是來自沙眼衣原體血清型A的Ct-089的蛋白序列，所述蛋白一皮SEQIDNO:79編碼。SEQIDNO:81是來自沙眼衣原體血清型B的Ct-089的cDNA序列。SEQIDNO:82是來自沙眼衣原體血清型B的Ct-089的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:81編碼。SEQIDNO:83是來自沙眼衣原體血清型G的Ct-089的cDNA序列。SEQIDNO:84是來自沙眼衣原體血清型G的Ct-089的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:83編碼。SEQIDNO:85是來自沙眼衣原體血清型H的Ct-089的cDNA序列。SEQIDNO:86是來自沙眼衣原體血清型H的Ct-089的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:85編碼。SEQIDNO:87是來自沙眼衣原體血清型I的Ct-089的cDNA序列。SEQIDNO:88是來自沙眼衣原體血清型I的Ct-089的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:87編碼。SEQIDNO:89是來自沙眼衣原體血清型J的Ct-089的cDNA序列。SEQIDNO:90是來自沙眼衣原體血清型J的Ct-089的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:89編碼。SEQIDNO:91是來自沙眼衣原體血清型K的Ct-089的cDNA序列。SEQIDNO:92是來自沙眼衣原體血清型K的Ct-089的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:91編碼。SEQIDNO:93是來自沙眼衣原體血清型L2的Ct-089的cDNA序列。SEQIDNO:94是來自沙眼衣原體血清型L2的Ct-089的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:93編碼。SEQIDNO:95是來自沙眼衣原體血清型A的Ct-858的cDNA序列。SEQIDNO:96是來自沙眼衣原體血清型A的Ct-858的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:95編碼。SEQIDNO:97是來自沙眼衣原體血清型B的Ct-858的cDNA序列。SEQIDNO:98是來自沙眼衣原體血清型B的Ct-858的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:97編碼。SEQIDNO:99是來自沙眼衣原體血清型G的Ct-858的cDNA序列。SEQIDNO:100是來自沙眼衣原體血清型G的Ct-858的蛋白序16列，所述蛋白^皮SEQIDNO:99編碼。SEQIDNO:101是來自沙眼衣原體血清型H的Ct-858的cDNA序列。SEQIDNO:102是來自沙眼衣原體血清型H的Ct-858的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:101編碼。SEQIDNO:103是來自沙眼衣原體血清型I的Ct-858的cDNA序列。SEQIDNO:104是來自沙眼衣原體血清型I的Ct-858的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:103編碼。SEQIDNO:105是來自沙眼衣原體血清型J的Ct-858的cDNA序列。SEQIDNO:106是來自沙眼衣原體血清型J的Ct-858的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:105編碼。SEQIDNO:107是來自沙眼衣原體血清型K的Ct-858的cDNA序列。SEQIDNO:108是來自沙眼衣原體血清型K的Ct-858的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:107編碼。SEQIDNO:109是來自沙眼衣原體血清型L2的Ct-858的cDNA序列。SEQIDNO:110是來自沙眼衣原體血清型L2的Ct-858的蛋白序列，所述蛋白—皮SEQIDNO:109編碼。SEQIDNO:111是來自沙眼衣原體血清型A的Ct-875的cDNA序列。SEQIDNO:112是來自沙眼衣原體血清型A的Ct-875的蛋白序列，所述蛋白一皮SEQIDNO:111編碼。SEQIDNO:113是來自沙眼衣原體血清型B的Ct-875的cDNA序列。SEQIDNO:114是來自沙眼衣原體血清型B的Ct-875的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:113編碼。SEQIDNO:115是來自沙眼衣原體血清型G的Ct-875的cDNA序列。SEQIDNO:116是來自沙眼衣原體血清型G的Ct-875的蛋白序列，所述蛋白^皮SEQIDNO:115編碼。SEQIDNO:117是來自沙眼衣原體血清型H的Ct-875的cDNA序列。SEQIDNO:118是來自沙眼衣原體血清型H的Ct-875的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:117編碼。SEQIDNO:119是來自沙眼衣原體血清型I的Ct-875的cDNA序列。SEQIDNO:120是來自沙眼衣原體血清型I的Ct-875的蛋白序列，所述蛋白^皮SEQIDNO:119編碼。SEQIDNO:121是來自沙眼衣原體血清型J的Ct-875的cDNA序列。SEQIDNO:122是來自沙眼衣原體血清型J的Ct-875的蛋白序列，所述蛋白4皮SEQIDNO:121編碼。SEQIDNO:123是來自沙眼衣原體血清型K的Ct-875的cDNA序列。SEQIDNO:124是來自沙眼衣原體血清型K的Ct-875的蛋白序列，所述蛋白^皮SEQIDNO:123編碼。SEQIDNO:125是來自沙眼衣原體血清型L2的Ct-875的cDNA序列。SEQIDNO:126是來自沙眼衣原體血清型L2的Ct-875的蛋白序列，所述蛋白被SEQIDNO:125編碼。某些上述序列和來自許多血清型的其他相關衣原體多肽和多核苷酸是本領域已知和可獲得的。進一步相關的序列可發(fā)現(xiàn)于已公布的美國專利號6,447,779,6,166,177，6,565,856,6,555,115，6,432，916,和6,448,234,并且還公開于美國專利申請?zhí)?0/197,220,10/762,058和10/872,155中，其每種全文通過援引并入本文。來自血清型D的Ct-089的序列和這種蛋白作為抗原的潛在應用已經(jīng)被公開，例如公開于WO02/08267(CorixaCorporation)。來自血清型L2的Ct-089的序列公開于W099/28475(Genset)。CopN(也稱作Ct-089)作為III型蛋白分泌系統(tǒng)的推定的輸出調節(jié)物的作用在本領域中已被討論，KAandHackstadt,TA^o/.Mzcra^o/.200038(5):1048-1060。來自血清型D的Ct-858和Ct-875的序列可獲自Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫，原始登錄號分別為084866和084883。對于進一步的信息可見Stephens,RS等Sc/e"ce1998282:754-759。Ct-858作為抗原的用途公開于例如,WO02/08267(CorixaCorporation),來自血清型E的Ct畫875(并入了His-標簽)和其用作抗原的用途公開于例如，US20040137007。然而，該文獻錯誤地將序列號139表示為Ct-875,實際上它是該處的序列號140。適當?shù)?，用于本發(fā)明中的免疫原性組合物將包含三種或更多種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核普酸，例如三種，四種，五種或六種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核香酸。本領域技術人員將認識到免疫原性組合物中的每種成分可獨立地為蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。另外地，本領域技術人員將認識到大量的蛋白或其免疫原性片段可包含在單個融合蛋白中并且不需要分別提供(并且相應地編碼特定蛋白和/或其免疫原性片段的大量多核苷酸可包含在單個多核苷酸序列中，例如編碼融合蛋白的多核普酸序列)。在本發(fā)明的一個實施方式中，所有沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸被提供為多肽(例如單個融合蛋白)。在本發(fā)明的第二實施方式中，所有沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸被提供為多核苷酸(例如單個多核苷酸序列，如編碼融合蛋白的多核苷酸序列)。將認識到多肽成分(即，蛋白或其免疫原性片段)可包含在包含另外殘基的更大的多肽中。類似地，編碼蛋白或其免疫原性片段的多核苷酸可包含在更大的多核普酸中。除了選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸，免疫原性組合物可包含與任何其他衣原體抗原相關的其他蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核普酸(例如與一種，兩種或三種其他衣原體抗原相關的蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸)。為在多種遠系繁殖(out-bred)的人群中獲得有效的免疫應答，利19用抗原的組合是有利的。并非所有的抗原組合是互補的。本發(fā)明人已適當?shù)?，免疫原性組合物包含Ct-089、Ct-858或Ct-875蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。更適當?shù)?，免疫原性組合物包含兩種或更多種選自Ct-089、Ct-858和Ct-875(例如Ct-089和Ct-858;Ct-089和Ct-875;或Ct-858和Ct-875)的沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。特別地，免疫原性組合物可包含涉及Ct-089、Ct-858和Ct-875中的每種的沙眼衣原體蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。例如，免疫原性組合物可包含涉及成分的組合中的一個，條件是所有組合都包含Ct-858和Ct-875成分1.下列中的五種Swib、Momp、PmpDpd、Ct醫(yī)858、PmpGpd和Ct-8752.下列中的三種PmpDpd、Ct-858、Ct-0875、Swib3.下列中的五種Momp、PmpDpd、Ct-858、Ct-622、Ct-875和Swib4.下列中的五種Momp、PmpDpd、Ct畫858、PmpGpd、Ct-622和Ct-8755.下列中的三種:Ct-858、Ct-875、Ct-622和Ct-0896.下列中的三種:PmpDpd、Ct-858、Ct-875、Ct-0897.下列中的四種Momp、PmpD、Ct-858、PmpGpd和Ct-875特定的免疫原性組合物可包含涉及一種下列組合的成分(其每種包含Ct-858和Ct-875成分):la.Momp、PmpDpd、Ct-858、Ct隱875、Swib、Ct-0892a.PmpDpd、Ct-858、Ct-875、Swib、Ct-0893a.Momp、PmpDpd、Ct-858、Ct誦622、Ct-875、Swib、Ct-0894a.Momp、PmpDpd、Ct-858、PmpGpd、Ct-622、Ct-875、Ct-0895a.Ct-858、Ct-8756a.Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-0897a.Momp、Ct-858、Ct-8758a.Momp、PmpD、Ct-858、PmpGpd、Ct-875、Ct-0899a.PmpDpd、Ct-858、Ct-875、Ct-089所有可選的免疫原性組合物可包含涉及Momp、Ct-089、Ct-858、Swib和PmpDpd的成分。用于本發(fā)明的免疫原性組合物可通過任何適當?shù)慕臃N途徑而給藥。在本發(fā)明的一個實施方式中，免疫原性組合物經(jīng)眼給藥。在本發(fā)明的第二實施方式中，免疫原性組合物非經(jīng)眼給藥。非眼給藥途徑包括通過眼之外的粘膜表面給藥。在本發(fā)明的一個實施方式中，非眼給藥是通過粘膜表面(例如，鼻內，口或陰道)。在本發(fā)明的第二實施方式中，非眼給藥是通過注射(例如，皮內注射，皮下注射，肌肉內注射或靜脈內注射，特別是肌肉內注射)。在本發(fā)明的進一步方面，提供了治療或預防第二沙眼衣原體血清型的眼沙眼衣原體感染的方法，包括給予免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含源于第一沙眼衣原體血清型的選自Ct-089、Ct-858或Ct-875的蛋白，其免疫原性片段或編碼所迷蛋白或片段的多核苷酸。還提供了源于第一沙眼衣原體血清型的選自Ct-089、Ct-858或Ct-875的蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸，在制備用于治療或預防第二沙眼衣原體血清型的眼沙眼衣原體感染的免疫原性組合物中的用途。另外提供了用于治療或預防第二沙眼衣原體血清型的眼沙眼衣原體感染的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含源于第一沙眼衣原體血清型的選自Ct-089、Ct-858或Ct-875的蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。在本發(fā)明的一個實施方式中，用于交叉保護的免疫原性組合物包含一種選自Ct-089、Ct-858和Ct-875的蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。僅僅包含一種選自Ct-089、Ct-858和Ct-875的蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸的免疫原性組合物將適當?shù)剡M一步包含至少一種另外的衣原體抗原(例如，一種、兩種、三種或四種另外的抗原)。在本發(fā)明的第二實施方式中，用于交叉保護的免疫原性組合物包含兩種選自Ct-089、Ct-858和Ct-875的蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。例如Ct-089和Ct-858;Ct-089和Ct-875;21或Ct-858和Ct-875。所述組合物可進一步包含另外的衣原體抗原(例如，一種、兩種或三種另外的抗原)。在本發(fā)明的第三實施方中，用于交叉保護的免疫原性組合物包含三種選自Ct-089、Ct-858和Ct-875的蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。所述組合物還可進一步包含另外的衣原體抗原(例如，一種或兩種另外的抗原)?？蔀?白，其免疫原性片段或^碼所述蛋白或片段的多核苷酸的形式、)將選自Swib、Momp、Ct-622、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD過客域(PmpDpd),特別是選自Swib、Momp和PmpD過客域。第一沙眼衣原體血清型可以是任何沙眼衣原體血清型。第二沙眼衣原體血清型可以是任何沙眼衣原體血清型，第一沙眼衣原體血清型除外。在本發(fā)明的一個實施方式中，第一沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體血清型A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、Ja、K、Ll、L2和L3。在本發(fā)明的第二實施方式中，第一沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體眼血清型(例如，A、B、Ba和C)。在本發(fā)明的另一實施方式中，第一沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體眼殖血清型(例如，D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、Ja和K)。在本發(fā)明的進一步的實施方式中，第一沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體LGV血清型(例如，Ll，L2和L3)。在本發(fā)明的一個實施方式中，第二沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體血清型A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、Ja、K、Ll、L2和L3。在本發(fā)明的第二實施方式中，第二沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體眼血清型(例如，A、B、Ba和C)。在本發(fā)明的另一實施方式中，第二沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體眼殖血清型(例如，D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、Ja和K)。在本發(fā)明的進一步的實施方式中，第二沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體LGV血清型(例如，Ll、L2和U)。為最大化交叉保護方法和用途的作用范圍，可期望選擇第一沙眼衣原體血清型使得與大多數(shù)其他沙眼衣原體血清型(例如至少50%，特別是至少70%,特別是至少80%,更特別是至少90%的其他沙眼衣原體血清型)具有高水平的序列同一性(例如，至少90%,特別是至少95%,特別是至少98%,更特別是至少99%的序列同一性)。為最大化本發(fā)明的方法和用途的實踐應用，可期望選擇第一沙眼衣原體血清型使得與大多數(shù)(例如至少50%,特別是至少70%，特別是至少80%,更特別是至少90%)的常見沙眼衣原體血清型(例如，普通眼血清型，普通眼殖血清型，普通LGV血清型，或任何兩種這些血清型組的組合，例如，普通眼和眼殖血清型)具有高水平的序列同一性(例如，至少90%,特別是至少95%,特別是至少98%，更特別是至少99%的序列同一性)。常見沙眼衣原體眼血清型包括A和B。常見沙眼衣原體眼殖血清型包括D,E,F和I(Lan，J等丄CV,力.A/,cro6,0/.199533(12):3194-3197;Singh,V等J.C/w.A^'cto&o/.200341(6):2700-2702)。常見沙眼衣原體LGV血清型包括L2。在本發(fā)明的一個實施方式中，第一沙眼衣原體血清型是沙眼衣原體血清型E。在本發(fā)明的一個實施方式中，第二沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體血清型A、B和K。在本發(fā)明的一個實例中，其中免疫原性組合物包含源于沙眼衣原體血清型E的Ct-089蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸，該免疫原性組合物可用于產生于沙眼衣原體血清型A、B、D、G、H、I、J、K或L2;特別是A、B、D、G、H、I或K;特別是A或B的感染的治療或預防中。在本發(fā)明的第二實例中，其中免疫原性組令物包含源于沙眼衣原體血清型E的Ct-858蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸，其免疫原性片段或編碼它的多核苷酸，該免疫原性組合物可用于產生于沙眼衣原體血清型A、B、D、G、H、I、J、K或L2;特別是J或L2的感染的治療或預防中。在本發(fā)明的進一步的實施例中，其中免疫原性組合物包含源于沙眼衣原體血清型E的Ct-875蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苦酸，其免疫原性片段或編碼它的多核苷酸，該免疫原性組合物可用于產生于沙眼衣原體血清型A、B、D、G、H、I、J、K或L2;特別是A、B、D、G、H、I或K的感染的治療或預防中。第一和第二沙眼衣原體血清型可與相同疾病狀態(tài)相關(例如，它們可以都是眼血清型或都是眼生殖道血清型)，或者第一和第二沙眼衣原體血清型可與不同的疾病狀態(tài)相關(例如，第一沙眼衣原體血清型可以是眼生殖道血清型并且第二沙眼衣原體血清型可以是眼血清型，或反之亦然)。在用于本發(fā)明的免疫原性組合物包含多于一種選自Ct-089、Ct-858和Ct-875的蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸，的情形中，應該注意每種蛋白，其免疫原性片段或編碼它們的多核苷酸，可任選源于獨立選擇的不同的第一沙眼衣原體血清型。然而，本領域技術人員將認識到免疫原性組合物還可包括另外的源于第二沙眼衣原體血清型的Ct-089、Ct-858和Ct-875蛋白，其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。肽序列或其變體，這些的免疫原性片段，或編碼這些的多核苷酸序列(其可為，例如，提供在序列表中的多核苷酸序列或編碼多肽的免疫原性片段的這些的片段)。本文所述的蛋白抗原可以為融合蛋白的形式。融合蛋白也可包含另外的多肽，任選來自衣原體或其他來源的異源肽。融合序列之內的抗原可以被修飾，例如通過添加如下所述的連接肽序列。這些連接肽可被插入構成融合蛋白的每種的一種或更多種多肽之間。本文所述的抗原還可為化學綴合物的形式。很明顯在PmpD和PmpG的過客域的例子下，這些可在PmpD或PmpG蛋白或多核苷酸的更大部分的情況下存在，例如全長PmpD或PmpG或其片段，只要該片段包含過客域即可。在特別的實施方式中(i)Ct-089成分將典型地為具有與本文序列表中提供的Ct-089序列至少90%同源性(例如95%同源性)的多肽，其免疫原性片段，或具有與本文序列表中提供的Ct-089序列至少90%同源性(例如95%同源性)的多核苷酸，或編碼相應蛋白的免疫原性片段的其片段。特別地，Ct-089成分將源于沙眼衣原體血清型E。(ii)Ct-858成分將典型地為具有與本文序列表中提供的Ct-858序列至少卯％同源性(例如95%同源性)的多肽，其免疫原性片段，或具有與本文序列表中提供的Ct-858序列至少90%同源性(例如95%同源性)的多核苦酸，或編碼相應蛋白的免疫原性片段的其片段。特別地，Ct-858成分將源于沙眼衣原體血清型E。(iii)Ct-875成分將典型地為具有與本文序列表中提供的Ct-875序列至少90%同源性(例如95%同源性)的多肽，其免疫原性片段，或具有與本文序列表中提供的Ct-875序列至少90%同源性(例如95%同源性)的多核芬酸，或編碼相應蛋白的免疫原性片段的其片段。特別地，Ct-875成分將源于沙眼衣原體血清型E。(iv)PmpDpd成分將典型地為具有與本文序列表中提供的PmpDpd序列至少90%同源性(例如95%同源性)的多肽，其免疫原性片段，或具有與本文序列表中提供的PmpDpd序列至少90%同源性(例如95%同源性)的多核苷酸，或編碼相應蛋白的免疫原性片段的其片段。特別地，PmpDpd成分將源于沙眼衣原體血清型LII。序列至少90%同源性(例如95%同、源'^)的多肽，其免疫原性片段，或具有與本文序列表中提供的PmpGpd序列至少90%同源性(例如95%同源性)的多核苷酸，或編碼相應蛋白的免疫原性片段的其片段。特別地，PmpGpd成分將源于沙眼衣原體血清型LII。(vi)Momp成分將典型地為具有與本文序列表中提供的Momp序列至少90%同源性(例如95%同源性)的多肽，其免疫原性片段，或具有與本文序列表中提供的Momp序列至少90%同源性(例如95%同源性)的多核普酸，或編碼相應蛋白的免疫原性片段的其片段。特別地，Momp成分將源于沙眼衣原體血清型F。(vii)Swib成分將典型地為具有與本文序列表中提供的Swib序列至少90%同源性(例如95%同源性)的多肽，其免疫原性片段，或具有與本文序列表中提供的Swib序列至少90%同源性(例如95%同源性)的多核普酸，或編碼相應蛋白的免疫原性片段的其片段。特別地，Swib成分將源于沙眼衣原體血清型LII。(viii)Ct-622成分將典型地為具有與本文序列表中提供的Ct-622序列至少90%同源性(例如95%同源性)的多肽，其免疫原性片段，或具有與本文序列表中提供的Ct-622序列至少90%同源性(例如95%同源性)的多核苷酸，或編碼相應蛋白的免疫原性片段的其片段。特別地，Ct-622成分將源于沙眼衣原體血清型E。25用于本發(fā)明的免疫原性組合物可進一步包含設計為增強抗原的抗原性或在其他方面提高這些抗原的其他成分，例如，通過在抗原的末端添加一段組氨酸殘基而分離這些抗原。在抗原的末端添加一段組氨酸殘基還可提高表達。用于本發(fā)明的免疫原性組合物可包含另外的抗原拷貝，或來自衣原體屬的另外的多肽或多核苷酸。免疫原性組合物還可包含來自其他非衣原體來源的其他異源多肽或多核苷酸。例如，本發(fā)明的組合物可包括多肽或編碼多肽的核酸，其中該多肽增強抗原的表達，例如，NS1,—種流感病毒蛋白，或其免疫原性部分(見，例如WO99/40188和WO93/04175)。本發(fā)明的核酸可基于選擇的物種，例如人，的密碼子偏好性而被工程化。當抗原的蛋白序列開始于Met殘基時，將認識到這種殘基可典型地被省略而不損害抗原的功能特性。定義"融合多肽"或"融合蛋白"指具有直接或通過氨基酸連接體共價連接的至少兩種衣原體多肽(其可以是相同或可以是不同的)的蛋白。形成融合蛋白的多肽典型地是C-末端與N-末端連接，盡管它們也可C-末端與C-末端，N-末端與N-末端，或N-末端與C-末端連接。融合蛋白的多肽可以為任何順序。這種術語也表示組成融合蛋白的抗原的保守修飾的變體，多態(tài)變體，等位基因，突變體，亞序列，種間同源物，和免疫原性片段。用于本發(fā)明的融合蛋白也可包含另外拷貝的組成抗原或其免疫原性片段。編碼融合蛋白的多核普酸在嚴格條件下與至少兩種核苷酸序列雜交，每種編碼選自Ct-681(Momp)或其免疫原性片段，Ct-871(PmpG)或其免疫原性片段，Ct-812(PmpD)或其免疫原性片段，Ct-089或其免疫原性片段，Ct-858或其免疫原性片段，Ct-875或其免疫原性片段，Ct-460(Swib)或其免疫原性片段，或Ct-622或其免疫原性片段的抗原多肽。編碼融合多肽的各個抗原的多核普酸序列因此包括Ct-681(Momp)、Ct-871(PmpG)、Ct-812(PmpD)、Ct-089、Ct-858、Ct-875、Ct-460(Swib)和Ct-622的保守修飾的變體，多態(tài)變體，等位基因，突變體，亞序列，免疫原性片段，和種間同源物。編碼融合蛋白的各個多肽的多核苷酸序列可以為任何順序。在一些實施方式中，融合蛋白的各個多肽為從大到小的順序(N-到C-末端)。大的抗原大小約為30到150kD,中等抗原大小約為10到30kD,并且小抗原大小約小于10kD。編碼各個多肽的序列可以與，例如免疫原性片段如編碼大約8到9個氨基酸的單獨CTL表位，或例如HTL或B細胞表位，一樣小。該片段還可包括多個表位。T-輔助細胞表位是結合HLAII類分子的肽并且-皮T-輔助細胞識別。推定的T-輔助細胞表位的預測可利用Sturniolo等A^wreS,Wec/z.199917:555-561描述的TEPITOPE方法實施。融合多肽特異地結合抗體，所述抗體抗選自Ct-681(Momp)或其免疫原性片段，Ct-871(PmpG)或其免疫原性片段(例如，PmpGpd或其免疫原性片段)，Ct-812(PmpD)或其免疫原性片段(例如，PmpDpd或其免疫原性片段)，Ct-089或其免疫原性片段，Ct-858或其免疫原性片段，Ct-875或其免疫原性片段，Ct-460(Swib)或其免疫原性片段，和Ct-622或其免疫原性片段的至少兩種抗原多肽?？贵w可以是多克隆的或單克隆的。任選地，融合多肽特異地結合抗體，所述抗體抗抗原的融合接頭，所述抗體不單獨結合抗原，即，當它們不是融合蛋白的部分時。融合多肽任選地包含另外的多肽，例如，三，四，五，六或更多種多肽，多至大約25種多肽，任選異源多肽或重復的同源多肽，其融合于至少兩種抗原。融合蛋白的另外的多肽任選地源于衣原體以及其他來源，例如其他細菌，病毒，或無脊推動物，脊推動物，或哺乳動物來源。融合蛋白的各個多肽可以為任何順序。如本文所述，融合蛋白也可與其他分子連接，包括另外的多肽。用于本發(fā)明的組合物還可包含不連接本發(fā)明的融合蛋白的另外的多肽。這些另外的多肽可以是異源或同源的多肽。術語"融合，，表示融合蛋白中兩種多肽之間的共價連接。多肽典型地互相直接地或通過氨基酸連接體地通過肽鍵連接。任選地，肽可通過本領域技術人員已知的非肽共價連接鍵連接。"FL"表示全長，即，與野生型多肽相同長度的多肽。術語"其免疫原性片段"表示包含表位的多肽，所述表位被T淋巴細胞，特別是細胞毒性T淋巴細胞，輔助T淋巴細胞或B細胞，識別。確定序列的表位區(qū)域的方法在本文別處描述。適當?shù)?，免疫原性片段將包含至?0%,適當?shù)刂辽?0%,特別是至少75%并且特別是至少90%(例如，95%或98%)的參考序列中的氨基酸?；蛘?，免疫原性片段將包含一段至少9,適當?shù)刂辽?5(例如至少25或至少50,特別是至少100)個殘基。免疫原性片段將適當?shù)匕瑓⒖夹蛄械乃斜砦粎^(qū)域。佐劑表示疫苗或治療組合物中的成分，其提高對抗原的特異性免疫應答(見例如，Edelman，」/AS1"仏//wm""raWn^"8:1409-1411(1992))。佐劑誘導Thl-型和Th2-型應答的免疫應答。Thl-型細胞因子(例如，IFN-y,IL-2,和IL-12)傾向于促進誘導細胞介導的對給予的抗原的免疫應答，而Th2-型細胞因子(例如，IL-4,IL-5,11-6,IL-10和TNF-(3)傾向于促進誘導體液免疫應答。多種佐劑中的任何佐劑可用于本發(fā)明的疫苗中以增強免疫應答。一些佐劑包含為保護抗原免于快速分解代謝而設計的物質，例如金屬鹽顆粒(例如，氫氧化鋁或磷酸鋁)或礦物油，和免疫應答的特異性或非特異性刺激物，例如脂質A,百日咳博德特氏菌(Bortadellapertussis)或結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)。適合的佐劑是商業(yè)上可獲得的并且包括，例如，弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑(DifcoLaboratories)和Merck佐劑65(MerckandCompany,Inc.,Rahway,N丄)。其4也適合的佐劑包括單磷酰脂質A,3D-MPL,皂普(例如，QuilA,特別是稱為QS21的QuilA的部分，特別與解毒成分例如膽固醇一起，WO96/033739中對其進行了描述)，包括SBAS1的脂質體制劑，包括SBAS2的水包油乳劑(Ling等人.&cc/"e199715:1562-1567)和CpG寡核苷酸(WO96/02555)。適于用于本發(fā)明的佐劑在下面更詳細地討論。"核酸"表示脫氧核糖核苷酸或核糖核酸和其單鏈或雙鏈形式的聚合物。該術語還延伸到包括包含已知的核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或鍵的核酸，其為合成的，天然存在的，和非天然存在的，其具有與參考核酸類似的結合特性，并且其以與參考核苷酸類似的方式代謝。所述類似物的例子包括，非限制性地，硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，磷酸甲酯，手性-磷酸甲酯，2-0-核糖核酸甲酯，肽-核酸(PNA)。除非另外指明，特定的核酸序列也隱含地包括其保守修飾的變體(例如，簡并密碼子取代)和互補序列，以及明確表明的序列。特別地，簡并密碼子取代可通過產生序列而獲得，所述序列中一種或更多種選擇的(或所有)密碼子的第三位點被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer等，A^c/e/""dM19:5081(1991);Ohtsuka等，腸/.28C/zem.260:2605-2608(1985);Rossolini等，M/.Ce〃.尸ro6w8:91-98(1994))。術語核酸與基因，cDNA，mRNA,寡核苷酸和多核苷酸可互換使用。術語"多肽，，，"肽"和"蛋白"在本文中可互換使用，表示氨基酸殘基的聚合物。這些術語也應用于其中一種或更多種氨基酸殘基是相應的天然存在的氨基酸的人工化學模擬物的氨基酸聚合物，以及應用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。術語"氨基酸"表示天然存在和合成的氨基酸，以及以與天然存在氨基酸類似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是被遺傳密碼編碼的那些，以及后來修飾的那些氨基酸，例如，羥脯氨酸，y-羧基谷氨酸，和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物表示具有與天然存在氨基酸相同的堿基化學結構的化合物，即，與氫，羧基基團，氨基基團，和R基團結合的a碳，例如，高絲氨酸，正亮氨酸，曱硫氨酸亞砜，曱硫氨酸甲基锍。所述類似物具有修飾的R基團(例如，正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保持與天然存在氨基酸相同的堿基化學結構。氨基酸模擬物表示具有與氨基酸的普通化學結構不同的結構但以與天然存在氨基酸類似的方式起作用的化學化合物。氨基酸在本文中可通過它們公知的三字母符號或IUPAC-IUB生化命名法委員會推薦的一字母符號表示。核苷酸，類似地，可通過它們通常接受的單字母編碼表示。"變體"或"保守修飾變體"應用于氨基酸和核酸序列。對于特定的核酸序列，保守修飾的變體表示編碼同一或基本上同一的氨基酸序列的核酸，或當核酸不編碼氨基酸序列時，表示基本上同一的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能等同的核酸編碼任何給出的蛋白。例如，密碼子GCA,GCC,GCG和GCU都編碼丙氨酸氨基酸。因此，在丙氨酸用密碼子表示的每個位點，密碼子可被改變?yōu)槿魏尾桓淖兙幋a的多肽的所述相應密碼子。所述核酸變體是"沉默變體"，其是一種保守修飾變體。本文的編碼多肽的每種核酸序列也描述了核酸的每種可能的沉默變體。本領域技術人員將認識到核酸中的每種密碼子(除了AUG,其通常是曱硫氨酸的唯一密碼子，和TGG,其通常是色氨酸的唯一密碼子)可被修飾以產生功能性等同的分子。相應地，編碼多肽的核酸的每種沉默變體隱含在每種描述的序列中。本發(fā)明的多核苷酸可包含大量當與參考序列比較時沉默的變體(例如，1-10,例如1-5,特別是1或2,并且特別是1個密碼子可被改變)。本發(fā)明的多核苷酸可包含大量當與參考序列比較時非沉默的保守變體(例如，1-10,例如1-5,特別是1或2，并且特別是l個密碼子可被改變)。本領域技術人員將認識到特定的多核苷酸序列可包含沉默和非沉默保守變體。對于氨基酸序列，本領域技術人員將認識到改變，增加或缺失編碼序列中單個氨基酸或小百分比的氨基酸的對于核酸，肽，多肽，或蛋白序列的各個取代，缺失或添加是"保守修飾變體"，其中所述改變產生功能性類似的氨基酸的氨基酸取代或基本上不影響變體的生物學功能的殘基缺失/添加。提供功能類似的氨基酸的保守取代表是本領域公知的。所述保守修飾變體是在本發(fā)明的多態(tài)變體，種間類似物，和等位基因之外，并且不排除這些。本發(fā)明的多肽可包含大量當與參考序列比較時保守的變體(例如，1-10,例如1-5,特別是1或2,并且特別是1個氨基酸殘基可被改變)。通常，所述保守取代將落入下述氨基酸組之一，盡管在一些環(huán)境下基本上不影響抗原的免疫原性特性的其他取代可以是可能的。下列8組每種包含了彼此保守的取代的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D),谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R),賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1),亮氨酸(L),曱硫氨酸(M)，纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W);7)絲氨酸(S),蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C),曱硫氨酸(M)(見，例如，Creighton,Proteins(1984))。適合的氨基酸取代限制于抗原的非表位區(qū)域。多肽序列變體還可包括其中與參考序列相比插入了另外的氨基酸的那些，例如，所述插入可發(fā)生于1-10個位置(例如1-5個位置，適當?shù)?或2個位置，特別是l個)并且可涉及在每個位置的50或更少個(例如20或更少個，特別是10或更少個，特別是5或更少個)氨30基酸的添加。適當?shù)?，所述插入不發(fā)生于表位區(qū)域，并且因此對抗原的免疫原性特性不具有顯著的影響。插入的一個例子包括輔助表達和/或純化所述抗原的一段短的組氨酸殘基(例如，l-6個殘基)。其他多肽序列變體包括其中當與參考序列比較時已經(jīng)缺失了氨基酸的那些，例如，所述缺失可發(fā)生于1-10個位置(例如l-5個位置，適當?shù)?或2個位置，特別是1個)并且可，例如，涉及在每個位置缺失50或更少個氨基酸(例如20或更少個，特別是10或更少個，特別是5或更少個)。適當?shù)兀鋈笔Р话l(fā)生于表位區(qū)域，并且因此對抗原的免疫原性特性不具有顯著影響。確定抗原表位的方法在本文別處描述和例示。術語"異源"當關于核酸的部分使用時表示該核酸包含在自然中沒有以相同的相互關系被發(fā)現(xiàn)的兩種或更多種亞序列。例如，核酸典型地被重組產生，具有來自不相關基因的兩種或更多種序列以產生新的功能性核酸，例如，來自一種來源的啟動子和來自另一來源的編碼區(qū)域。類似地，異源蛋白表示蛋白包含在自然中沒有以相同相互關系被發(fā)現(xiàn)的兩種或更多種亞序列(例如，融合蛋白)。短語"選擇性(或特異性)雜交"表示分子在嚴格雜交條件下僅僅與特定核苷酸序列結合，配對(duplexing),或雜交，當該序列存在于復合混合物(例如，總細胞或文庫DNA或RNA)中時。短語"嚴格雜交條件，，或"在嚴格條件下雜交"表示探針將與其靶亞序列雜交，典型地在核酸的復合混合物中，但不與其他序列雜交的條件。嚴格條件是依賴于序列的并且在不同環(huán)境下是不同的。更長的序列在更高的溫度下特異性雜交。對于核酸雜交的廣泛的指南可見于Tijssen,TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucleicProbes,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)。通常,嚴格條件被選擇為比在限定的離子強度PH下特定序列的熱融點(Tm)低大約5-10°C。Tm是50%的互補于靶標的探針與靶序列在平衡狀態(tài)下雜交(當靶序列過量存在時，在Tm時，50%的探針處于平衡狀態(tài))的溫度(在限定的離子強度，PH,和核濃度)。嚴格條件是在PH7.0到8.3時，鹽濃度小于大約l.OM鈉離子，典型地大約0.01到l.OM鈉離子濃度(或其他鹽)，并且溫度對于短探針(例如，10到50個核普酸)至少大約30°C,對于長探針(例如，大于50個核苷酸)至少大約6(TC的條件。嚴格條件還可用添加去穩(wěn)定劑例如曱酰胺而獲得。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號為至少兩倍背景，任選10倍背景雜交。示例性的嚴格雜交條件可以是如下50%曱酰胺，5xSSC,和1%SDS,在42°C下培養(yǎng)，或5xSSC,1%SDS,在65。C下培養(yǎng)，在0.2xSSC和0.1%SDS中在65t:下洗滌。如果編碼的多肽是基本上同一的，在嚴格條件下互相不雜交的核酸仍然是基本上同一的。例如，當利用遺傳編碼允許的最大密碼子簡并性產生核酸拷貝時，這會發(fā)生。在所述例子中，核酸典型地在中等嚴格雜交條件下雜交。示例性的"中等嚴格雜交條件"包括在40%曱酰胺，lMNaCl,1%SDS的緩沖液中在37。C下雜交并且在1xSSC中在45。C下洗滌。陽性雜交是至少兩倍的背景。本領域普通技術人員將容易地認識到替代的雜交和洗滌條件可被利用以提供類似嚴格的條件。"抗體，，表示包含來自免疫球蛋白基因的框架區(qū)的多肽或其特異性結合和識別抗原的片段。識別的免疫球蛋白基因包括K，x,a,y，5,s,和n恒定區(qū)基因，以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分類為k或人。重鏈分類為y，n，a，5或s,其依次分別定義了免疫球蛋白種類IgG,IgM,IgA,IgD和IgE。示例性的免疫球蛋白(抗體)結構單元包含四聚體。每種四聚體由兩對同一的多肽鏈組成，每對具有一種"輕"(大約25kDa)和一種"重"鏈(大約50-70kDa)。每條鏈的N-末端限定了主要對抗原識別起作用的大約100到110或更多氨基酸的可變區(qū)。術語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別表示這些輕和重鏈?？贵w存在，例如，為完整的免疫球蛋白或為通過用多種肽酶消化產生的大量具有良好特征的片段。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)中的二硫鍵之下消化抗體，以產生F(ab)，2,—種Fab的二聚體，其自身為通過二硫鍵連接于Vh-Ch1的輕鏈。F(ab)，2可在溫和條件下還原以斷裂鉸鏈區(qū)中的二硫鍵，由此將F(ab)，2二聚體轉化為Fab，單體。Fab，單體基本上是具有部分4交鏈區(qū)的Fab(見/^m/ame"/a//www"o/ogy(Pauled.,3ded.1993)。雖然多種抗體片段根據(jù)完整抗體的消化而定義，本領域技術人員將理解所述片段可重新化學地或通過利用重組DNA方法合成。因此，術語抗體，如本文所用，還包括通過全抗體的修飾而產生32的抗體片段，或利用重組DNA方法重新合成的那些(例如，單鏈Fv)或利用噬菌體展示文庫鑒定的那些(見，例如，McCafferty等，A^w^348:552-554(1990))。為制備單克隆或多克隆抗體，本領域已知的任何技術可被使用(見例如，Kohler&Milstein,A^fwre256:495-497(1975);Kozbor等，/附麵wo/ogy7bt/a少4:72(1983》Cole等,pp.77-96inMwoc/o腦/爿""Zw力^朋t/OmcerT72era/y(1985))。用于產生單鏈抗體的技術(美國專利4,946,778)可被修改以產生本發(fā)明多肽的抗體。而且，轉基因小鼠，或其他生物例如其他哺乳動物，可被用于表達人化抗體?；蛘?，噬菌體展示技術可被用于鑒定特異性結合選擇的抗原的抗體和異數(shù)Fab片段(見例如,McCafferty爭，淑臟348:552-554(1990);Marks等人.，^o化c/7"o/ogy10:779-783(1992))。短語"特異性(或選擇性)結合"于抗體或"特異性(或選擇性)免疫反應于"，當指蛋白或肽時，表示確定在蛋白和其他生物制品的異質群體中蛋白的存在的結合反應。因此，在指定的免疫測定條件下，所述抗體結合至少兩倍于背景的特定蛋白并且基本上不以顯著的量結合存在于樣品中的其他蛋白。在所述條件下與抗體的特異性結合可需要由于其對特定蛋白的特異性而選擇的抗體。例如，對融合蛋白產生的多克隆抗體可被選擇以獲得僅僅與融合蛋白特異性免疫反應，并且不與融合蛋白的各個成分免疫反應的多克隆抗體。這種選擇可通過減去與各個抗原交叉反應的抗體而獲得。可利用多種免疫測定以選擇與特定蛋白特異性免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫測定通常用于選擇與蛋白特異性免疫反應的抗體(見例如，Harlow&Lane,J""6o&e^Z^ZwraM^Ma"認/(1988)，有關可用于確定特異性免疫反應的免疫分析格式和條件的描述)。典型地，特定的或選擇性的反應將為至少兩倍背景信號或噪音(noise)并且更典型地多于10到100倍的背景。多核苷酸可包含天然序列(即，編碼單獨抗原或其部分的內源序列)或可包含所述序列的變體。多核苷酸變體可包含一種或更多種取代，添加，缺失和/或插入使得編碼的融合多肽的生物活性相對于包含天然抗原的融合多肽不減少。變體優(yōu)選顯示出與編碼天然多肽或其部分的多核苷酸序列至少大約70%的同一性，更優(yōu)選至少大約80%同一性并且最優(yōu)選至少大約90%的同一性。術語"同一的"或"同一性"百分比，在兩種或更多種核酸或多肽序列的上下文中，表示當利用一種下列序列比較算法或通過人工比對和目測測量，在比較窗口或指定區(qū)域上為最大一致性而比較和比對時，相同或具有特定百分比(即，在特定區(qū)域上70%同一性，任選75%,80%,85%,90%，或95%(例如98%)同一性)的相同的氨基酸殘基或核普酸的兩種或更多種序列或亞序列。所述序列然后被認為是"基本上同一的"。這種定義也表示測試序列的補體序列(compliment)。任選地，同一性存在于至少大約25到大約50個氨基酸或核苷酸長度的區(qū)域上，或任選在75-100個氨基酸或核普酸長度的區(qū)域上。適當?shù)?，同一性存在于參考序列的全長上。具有在參考序列(例如，全長)的特定區(qū)域上至少70%同一性，任選75%,80%,85%,90%，或95%(例如98%)同一性的變體多核普酸和多肽序列是特別感興趣的。為序列比較，典型地一種序列作為參考序列，測試序列與其比較。當利用序列比較算法時，測試和參考序列進入計算機，指定亞序列等位物(coordinate),如果必要，并且指定序列算法程序參數(shù)?？衫萌笔〕绦騾?shù)，或指定替代的參數(shù)。序列比較算法然后基于程序參數(shù)計算測試序列相對于參考序列的序列同一性百分比。"比較窗口"，如本文所用，包括參考選自25到500,通常大約50到大約200,更通常大約100到大約150個鄰接位點數(shù)目中的任何鄰接位點數(shù)目的片段，其中在兩種序列被最佳比對之后序列可與相同數(shù)目的鄰接位點的參考序列比較。用于比較的序列的比對方法是本領域公知的。用于比4交的序列最佳比對可通過例如，Smith&Waterman,爿dv.J;p/.M2仇2:(l^l)的局部同源性算法，通過Needleman&W圃ch,脅/.腸/.48:443(1970)的同源性比對算法，通過Pearson&Lipman，」cad/7&485:2444(1988)的搜索類似性方法，通過這些算法的計算機化實施(theWisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI中的GAP,BESTFIT，F(xiàn)ASTA,和TFASTA),或通過人工比對和目測(見例^口,Cw^re"f尸ratocoAyS^o/ogy(Ausubel等,eds.1995supplement))而進行。一種有用算法的例子是PILEUP。PILEUP從一組相關序列中利用34漸進，成對比對產生多重序列比對，以顯示關系和序列同一性百分比。它還描繪了用于產生比對的顯示聚類關系的樹形圖或dendogram。PILEUP利用Feng&Doolittle，./.M/.￡vo/.35:351-360(1987)的漸進比對方法的簡化。利用的該方法類似于Higgins&Sharp,5:151-153(1989)描述的方法。該程序可比對高達300種序列，每種最大長度5000核苷酸或氨基酸。多重比對程序開始于兩種最類似序列的成對比對，產生兩種比對序列的群(cluster)。這種群然后與下一個最相關序列或比對序列群比對。通過兩種單獨序列的成對比對的簡單延伸而比對兩種序列群。通過一系列漸進，成對比對而獲得最終的比對。通過指定用于序列對比區(qū)域的特定序列和它們的氨基酸或核苷酸等位物并通過指定程序參數(shù)而運行程序。利用PILEUP,利用下列參數(shù)將參考序列與其他測試序列比較以確定序列同一性關系百分比缺省缺口權重(defaultg叩weight)(3.00),缺省缺口長度權重(efaultgaplengthweight)(0.10),和加權末端缺口(weightedendgaps)。PILEUP可獲自GCG序列分析軟件包，例如，7.0版(Devereaux等，Jcz'A12:387-395(1984)。適于確定序列同一性和序列類似性百分比的另一算法例子是BLAST和BLAST2.0算法，其分別描述于Altschul等，淑.爿c油L25:3389-3402(1977)和Altschul等，Mo/._6zo/.215:403-410(1990)。實施BLAST分析的軟件通過國家生物化學信息中心(http:〃www.ncbi.nlm.mh.gov/)可公開獲得。這種算法涉及通過鑒定查詢序列中的長度W的短字碼而首次鑒定高得分序列對(HSPs),當用數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字碼比對時，其匹配或滿足一些正值的閾得分T。T表示鄰近字碼得分閾(上述Altschul等)。這些起始的鄰近字碼命中(hits)作為啟動發(fā)現(xiàn)包含它們的更長HSPs的檢索的種子(seeds)。這些字碼命中沿著每種序列的兩種方向延伸遠至累積比對得分可被提高之處。對于核苷酸序列，利用參數(shù)M(對于一對匹配殘基的獎勵得分；通?！?)和N(對于不匹配殘基罰分；通常<0)計算累積得分。對于氨基酸序列，利用得分矩陣計算累積得分。當出現(xiàn)下列情形時，字碼命中在每個方向的延伸停止累積比對得分從它的最大獲得值下降數(shù)量X;由于一種或更多種負得分殘基比對的累積，累積得分降到0或更低；或者到達每種序列的末端。BLAST算法參數(shù)W，T和X確定了比對的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字碼長度(W)11,期望值(E)10，M=5,N=-4和比較兩條鏈作為缺省值。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用字碼長度3，期望值(E)IO,和BLOSUM62得分矩陣(見Henikoff&Henikoff,A^/.」c^/.[/&489:10915(1989》，隊列(alignments)(B)50,期望值(E)10，M=5，N=-4,和比較兩條鏈作為缺省值。BLAST算法還實施兩種序列之間類似性的統(tǒng)計學分析(見例如，Karlin&Altschul,vVW/.Jcac/.V&490:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的類似性的一種度量是最小總概率(P(N)),其提供了概率的指示，兩種核苷酸或核酸序列之間的匹配將通過所述概率偶然發(fā)生。例如，如果測試核酸與參考核酸的比較中的最小總概率小于大約0.2,更優(yōu)選小于大約0.01，并且最優(yōu)選小于大約0.001,則核酸祐_認為與參考序列類似。多核普酸組合物如本文所用，術語"DNA節(jié)段"和"多核苷酸"表示已經(jīng)脫離特定種的總基因組DNA而分離的DNA分子。因此，編碼多肽的DNA節(jié)段表示包含一種或更多種編碼序列，然而基本上從獲得DNA片段的種的總基因組DNA分離出或從其純化出的DNA節(jié)段。在術語"DNA節(jié)段"和"多核苷酸"中包括的是DNA節(jié)段和所述節(jié)段的更小片段，以及重組載體，包括例如，質粒，粘粒，噬菌粒，噬菌體，病毒等。如本領域技術人員理解的，本發(fā)明的DNA節(jié)段可包括表達或可修改為表達蛋白，多肽，肽等的基因組序列，基因組外和編碼質粒序列和更小的工程化基因節(jié)段。所述節(jié)段可以是天然分離的，或通過人的人工修飾。術語"分離的，，，"純化的"或"生物學上純的"因此表示基本上或本質上沒有在天然狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的通常伴隨它的成分。當然，這表示原始分離的DNA節(jié)段，并且不排除通過人工后來添加到組合物中的其他分離的蛋白，基因，或編碼區(qū)。純度和同源性典型地利用分析化學技術例如聚丙烯酰胺凝膠電泳法或高效液相色譜法而確定。存在于制劑中的主要種類的蛋白是基本上純化的。分離的核酸從插入基因側翼并且在該基因之外編碼蛋白的其他開放閱讀框中分離。如本領域技術人員所認識的，多核苷酸可以是單鏈(編碼或翻譯)或雙鏈的，并且可以是DNA(基因組的，cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其包含內含子并且以一對一的方式對應于DNA分子，和不包含內含子的mRNA分子。另外的編碼或非編碼序列可以是，但不需要是，存在于本發(fā)明的多核苷酸之內，并且多核普酸可以，但不需要與其他分子和/或支持材料連接。多核普酸可包含天然序列(即，編碼衣原體抗原的內源序列或其部分)或可包含所述序列的變體，或生物學或抗原性功能等同物。如下面進一步描述的，多核普酸變體可包含一種或更多種取代，添加，缺失和/或插入，優(yōu)選使得編碼多肽的免疫原性不減少。對于編碼多肽的免疫原性的效果通常可如本文描述地被評價。術語"變體"也包括異種來源的同源基因。在另外的實施方式中，本發(fā)明利用包含同一或互補于本文公開的一種或更多種序列的不同長度鄰接段的序列的分離的多核苷酸和多肽。例如，包含本文公開的一種或更多種序列的至少大約15,20,30,40，50，75,100,150，200,300,400，500或1000或更多個以及所有它們之間的中間長度的鄰接核苷酸的多核苷酸。在上下文中，可以容易地理解"中間長度"表示在引用的數(shù)值之間的任何長度，例如16,17，18,19,等；21,22,23,等；30,31,32,等；50，51，52,53,等；100,101,102,103，等；150,151,152,153,等；包括200-500;500-1000等之間的所有整數(shù)。多核苦酸或其片段，不考慮其編碼序列的長度，可與其他DNA序列組合，例如啟動子，聚腺普酸化信號，另外的限制性酶位點，多克隆位點，其他編碼節(jié)段等，使得它們的全長可大大改變。因此預期可利用幾乎任何長度的核酸片段，總長度優(yōu)選受限于制備的便利和在計劃的重組DNA方案的用途。例如，總長大約10,000,大約5000,大約3000,大約2,000，大約1,000,大約500，大約200，大約100,大約50個堿基對長度等(包括所有中間長度)的例示性DNA節(jié)段預期在許多實施方式中是有用的。而且，本領域普通技術人員將理解，作為遺傳密碼簡并性的結果，具有許多編碼如本文所述的多肽的核苷酸序列。但是，由于密碼子使用上的不同而改變的多核苷酸是特別預期的，例如為人和/或靈長類動物密碼子選擇而最優(yōu)化的多核苷酸。而且，包含本文提供的基因的等位基因也是有用的。等位基因是作為一種或更多種突變例如核苷酸的缺失，添加和/或取代的結果被改變的內源基因。產生的mRNA和蛋白可以，但不需要，具有改變的結構或功能。等位基因可利用標準技術(例如雜交，擴增和/或數(shù)據(jù)庫序列比較)而鑒定。多核苷酸鑒定和表征可利用任何多種已經(jīng)良好建立的技術鑒定，制備和/或操作多核普酸。例如，如下面更詳細描述地，多核普酸可通過篩選cDNAs-微陣列被鑒定。例如，可利用Synteni微陣列(PaloAlto,CA)根據(jù)制造商指示(和基本上如Schena等，尸roc.A^/.爿c^/.OSL493:10614-10619(1996)和Heller等，尸rac.淑/.力cW.園94:2150-2155(1997)所述)實施所述薛選?；蛘撸嗪丝嗨峥蓮膹谋磉_本文所述蛋白的細胞，例如沙眼衣原體細胞，中制備的cDNA中擴增。所述多核苷酸可通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。為此方法，序列特異性引物可根據(jù)本文提供的序列設計，并且可纟皮采購或合成。多核苷酸的擴增部分可用于利用公知技術從適當?shù)奈膸旆蛛x全長基因(例如，沙眼衣原體cDNA文庫)。在所述技術之內，利用適于擴增的一種和更多種多核苷酸探針或引物篩選文庫(cDNA或基因組)。優(yōu)選，文庫的大小被選擇以包括更大的分子。為鑒定基因的5'和上游區(qū)域隨機的引物文庫也可以是優(yōu)選的。為獲得內含子和延伸的5'序列，基因組文庫是優(yōu)選的。對于雜交技術，部分序列可利用公知技術被標記(例如，通過用32P的切口平移或末端標記)。然后通常通過將包含變性細菌集落的濾器(或包含噬菌體斑的菌苔)與標記的探針(見Sambrook等，Mo/ecw/wC/om力g.'爿LWora^o^A^肌a/(1989))雜交而篩選細菌或噬菌體文庫。雜交集落或斑被選擇和擴增，并且DNA被分離用于進一步分析。cDNA克隆可被分析以通過例如，利用來自部分序列的引物和來自載體的引物的PCR,而確定另外的序列的量?？僧a生限制性圖譜和部分序列以鑒定一種或更多種重疊克隆。全序列然后可利用標準技術確定，其可涉及產生一系列缺失克隆。產生的重疊序列然后可裝配成單個鄰接序列。全長cDNA分子可通過利用公知技術連接適當?shù)钠味a生?；蛘?，存在大量用于從部分CDNA序列獲得全長編碼序列的擴增技術。在所述技術之內，擴增通常通過PCR實施。多種商業(yè)上可獲得的試劑盒中的任何試劑盒可用于實施擴增步驟?？衫美绫绢I域公知的軟件設計引物。引物優(yōu)選長度22-30個核苷酸，具有至少50%的GC含量并且在大約68°C到72°C的溫度下對靶序列退火。擴增的區(qū)域可如上所迷被測序，并且重疊序列裝配為鄰接序列。一種所述擴增技術是反向PCR(見Triglia等，M/c/.爿czAAa16:8186(1988),其利用限制性酶以在基因的已知區(qū)域中產生片段。該片段然后通過分子內連接被環(huán)化并且用作利用來自已知區(qū)域的不同引物的PCR的模板。在一種替代方法之中，連接到部分序列的序列可通過利用連接序列的引物和特異于已知區(qū)域的引物的擴增而回收。擴增的行第二輪的擴增。這種方法的變體，其利用從已知序列啟動相反方向的延伸的兩種引物，描述于WO96/38591。另一所述技術被稱為"cDNA末端快速擴增"或RACE。這種技術涉及內部引物和外部引物的使用，其雜交于polyA區(qū)域或載體序列，以鑒定已知序列的5'和3'的序列。另外的技術包括捕獲PCR(Lagerstrom等，尸CAA^Ao^4^/zc.1:111-19(1991))和步移PCR(Parker等，M/c/.爿"血19:3055-60(1991))。利用擴增的其他方法也可利用以獲得全長cDNA序列。在某些例子中，可能通過分析在表達序列標簽(EST)數(shù)據(jù)庫，例如獲自GeneBank，中提供的序列而獲得全長cDNA序列。通?？衫霉某绦?例如，NCBIBLAST檢索)實施重疊ESTs的檢索，并且所述ESTs可用于產生鄰接全長序列。全長DNA序列也可通過基因組片段的分析而獲得。宿主細胞中的多核苦酸表達編碼多肽，或其融合蛋白或功能等同物的多核普酸序列或其片段，可用于指引在適當?shù)乃拗骷毎械亩嚯牡谋磉_的重組DNA分子。由于遺傳密碼固有的簡并性，編碼基本上相同或功能性等同的氨基酸序列的其他DNA序列可被產生并且這些序列可用于克隆和表達給定的多肽。如本領域技術人員理解的，在一些例子中產生具有非天然存在密39碼子的編碼多肽的核苷酸序列是有利的。例如，特定原核或真核宿主偏愛的密碼子可被選擇以提高蛋白表達率或產生具有期望特性，例如長于從天然存在的序列產生的轉錄物的半衰期，的重組RNA轉錄物。而且，為了由于多種原因改變編碼多肽的序列，包括但不限于修飾基因產物的克隆，加工和/或表達的改變，可利用本領域已知的方法工程化多核苷酸序列。例如，可利用通過基因片段和合成的寡核苷酸的隨機斷裂和PCR裝配的DNA改組工程化核普酸序列。另外，可利用定點突變插入新的限制性位點，改變糖基化途徑，改變密碼子偏好，產生剪接變體，或引入突變等。天然，修飾，或重組的核酸序列可與異源序列連接以編碼融合蛋白。例如，對于為了多肽活性抑制劑而篩選肽文庫，編碼可^皮商業(yè)上可獲得的抗體識別的雜合蛋白是有用的。融合蛋白也可被工程化以包含定位于編碼多肽序列和異源蛋白序列之間的剪切位點，因此多肽可被從異源部分中剪切和純化出來。為表達期望的多肽，編碼多肽或功能等同物的核苷酸序列可被插入適當?shù)谋磉_載體，即，包含用于插入的編碼序列的轉錄和翻譯的必要元件的載體。本領域技術人員公知的方法可用于構建包含編碼感興趣多肽的序列和適當?shù)霓D錄和翻譯控制元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術，合成技術，和體內遺傳重組。所述技術描述于Sambrook等,Mo/ecw/orC7om'"g,j丄"/ora/10/^Maw認/(1989),andAusubel等,Cwrewf7V由coAs1^A/o/ecw/"r歷o/ogy(1989)?？衫枚喾N表達載體/宿主系統(tǒng)以包含和表達多核苷酸序列。這些包括，但不限于，微生物，例如用重組噬菌體，質粒，或粘粒DNA表達載體轉化的細菌；用酵母表達載體轉化的酵母；用病毒表達載體感染的昆蟲細胞系統(tǒng)(例如，桿狀病毒(baculovirus));用病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒(cauliflowermosaicvirus)，CaMV;煙草花葉病毒(tobaccomosaicvirus),TMV)或細菌表達載體(例如，Ti或pBR322質粒)轉化的植物細胞系統(tǒng)；或動物細胞系統(tǒng)。存在于表達載體中的"控制元件"或"調節(jié)序列"是載體的未翻譯區(qū)-增強子，啟動子，與宿主細胞蛋白互相作用以實施轉錄和翻譯的5，和3'未翻譯區(qū)。所述元件長度和特異性可改變。根據(jù)利用的載體系統(tǒng)和宿主，任何數(shù)量的適當?shù)霓D錄和翻譯元件，包括組成型和可誘導的啟動子，可被利用。例如，當在細菌系統(tǒng)中克隆時，可誘導的啟動子例如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene,LaJolla,Calif.)或PSP0RT1質粒(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)的雜合lacZ啟動子等可被利用。在哺乳動物細胞系統(tǒng)中，來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子通常是優(yōu)選的。如果有必要產生包含多拷貝的編碼多肽的序列的細胞系，基于SV40或EBV的載體與適當?shù)目蛇x擇標記可以被一起有利地利用。在細菌系統(tǒng)中，可根據(jù)表達多肽意圖的用途而選擇大量表達載體。例如，當需要大的數(shù)量時，例如對于誘導抗體，可利用引導容易地純化的融合蛋白的高水平表達的載體。所述載體包括但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達載體，例如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中編碼感興趣多肽的序列可與用于氨基末端Met的序列和接下來的P-半乳糖苷酶7個殘基一起符合讀框地連接入載體，使得產生雜合蛋白；pIN載體(VanHeeke&Schuster,J.腸/.C/zem.264:5503-5509(1989));等。pGEX載體(Promega,Madison,Wis.)也可用于將外來多肽表達為具有谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)的融合蛋白。通常，所述融合蛋白是可溶的，并且可通過吸附于谷胱甘肽-瓊脂糖珠然后在游離谷胱甘肽存在下洗脫而容易地從裂解的細胞中純化。在所述系統(tǒng)中產生的蛋白可被設計為包括肝素，凝血酶，或因子XA蛋白酶剪切位點，以使感興趣的克隆多肽可從GST部分中隨意釋放。在酵母，酉良酒酵母(&jfcc/2<3,cw^cwcerev&;'(3e),中，包含組成型或可誘導啟動子例如a因子，醇氧化酶和PGH的大量載體可被利用。包含組成型或可誘導啟動子的其他載體包括GAP,PGK,GAL和ADH。對于綜述，見Ausubel等(上述)，Grant等，M"/zoA五"矽mo/.153:516-544(1987)和Romas等8423-88(1992)。在利用植物表達載體的例子中，編碼多肽的序列的表達可被大量啟動子中的任何啟動子所驅動。例如，病毒啟動子例如CaMV的35S和19S啟動子可單獨利用或與來自TMV的co前導序列一起利用(Takamatsu,五A^(9丄6:307-311(1987))?；蛘撸参飭幼永鏡UBISCO小亞單元或熱激啟動子可被利用(Coruzzi等，EAffi(9J.3:1671-1680(1984);Broglie等,Sc/e"ce224:838-843(1984);和Winter等，尺^w/"Ce〃Z)#w17:85-105(1991))。這些構建體可通過直41接DNA轉化或病原體-介導的轉染被引入植物細胞中。所述技術描述于大量通?？色@得的綜述(見例如，Hobbs//,〃l^AodSc/e/ce朋d7fec/mo/og少pp.191-196(1992》。昆蟲系統(tǒng)也可被用于表達感興趣的多肽。例如，在一種所述系統(tǒng)中,苜蓿銀纟丈夜蛾核型多角體病毒(y4wtogra//z"ca/z/or"/c(3nuclearpolyhedrosisvirus)(AcNPV)被用作在草地夜蛾(S戶&ra/n/gz>e^/a)細胞或7Wc/2o;/ww》/ww/e中表達外來基因的載體。編碼多肽的序列可被克隆入病毒的非必需區(qū)域，例如多角體蛋白基因，并且置于多角體蛋白啟動子的控制之下。編碼多肽序列的成功插入將導致多角體蛋白基因失活并且產生缺乏包被蛋白的重組病毒。重組病毒然后可用于感染，例如，草地夜蛾(S./n/g0eraf")纟田胞或7Wc/o;/w"fl/arv"e,在其中感興趣的多角體蛋白可被表達(Engelhard爭，尸rac.A^/.^c"dS"91:3224-3227(1994》。在哺乳動物宿主細胞中，通?？色@得大量基于病毒的表達系統(tǒng)。例如，在利用腺病毒作為表達載體的例子中，編碼感興趣多肽的序列可連接入由后啟動子和三聯(lián)前導序列組成的腺病毒轉錄/翻譯復合物中。可利用在病毒基因組非必需El或E3區(qū)域的插入獲得能夠在感染的宿主細胞中表達多肽的存活病毒(Logan&Shenk,尸roc.A^/.爿c"J.81:3655-3659(1984))。另外，轉錄增強子，例如勞氏肉瘤病毒(Roussarcomavirus)(RSV)增強子，可用于提高在哺乳動物宿主細胞中的表達。特定的起始信號也可用于獲得編碼感興趣多肽的序列的更有效的翻譯。所述信號包括ATG起始密碼子和相鄰的序列。在編碼多肽的序列的例子中，它的起始密碼子，和上游序列被插入適當?shù)谋磉_載體，不需要另外的轉錄或翻譯控制信號。然而，在僅僅插入編碼序列或其部分的例子中.，應提供包括ATG起始密碼子的外源翻譯控制信號。而且，起始密碼子應該在正確的讀碼框中以確保完整插入的翻譯。外源翻譯元件和起始密碼子可以是多種來源的，天然和人工的?？赏ㄟ^包括適于使用的特定細胞系統(tǒng)的增強子而增強表達效率，例如文獻中描述的那些(Scharf.等，尺纖/"尸威.CW/20:125-162(1994))。另外，可為調節(jié)插入序列的表達或以期望的方式加工表達的蛋白的能力而選擇宿主細胞株。多肽的所述修飾包括但不限于乙酰化，羧化，糖基化，磷酸化，脂化，和?；?。剪切蛋白的"prepro"形式的翻譯后加工也可用于促進正確的插入，折疊和/或起作用。不同的宿主細月包例如CHO,Hela,MDCK,HEK293和WI38,其具有用于所述翻譯后活性的特定的細胞機構和特征性機理，可被選擇以確保外來蛋白的正確修飾和加工。對于長期，高產量的重組蛋白的生產，通常優(yōu)選穩(wěn)定的表達。例如，可利用表達載體轉化穩(wěn)定表達感興趣的多核苷酸的細胞系，所述表達載體可在相同或在不同載體上包含復制的病毒起點和/或內源表達元件和可選擇標記基因。在引入載體之后，細胞可^皮允許在它們轉換到選擇性培養(yǎng)基之前在富集培養(yǎng)基中生長1-2天?？蛇x擇標記的目的是和回收?？衫眠m于該細胞類型的組織培養(yǎng)技術使穩(wěn)定轉化細胞的抗性克隆增殖?？衫萌魏螖?shù)量的選擇系統(tǒng)回收轉化的細胞系。這包括但不限于單純皰滲病毒(herpessimplexvirus)胸苷激酶(Wigler等，O〃11:223-32(1977))和腺。票呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等，Ce〃22:817-23(1990))基因，其可分別用于tk.sup,或aprt.sup,細胞。而且，可分別利用抗代謝物，抗生素或除草劑抗性作為選擇的基礎，例如，賦予曱氨蝶呤抗性的dhfr(Wigler等，尸rac.淑/.v4c"dS"77:3567-70(1980));賦予氨基糖普，新霉素和G-418抗性的叩t(Colbere-Gar叩in等，J.嵌編.150:1-14(1981));和分別賦予氯磺隆(chlorsulfuron)和膦絲菌素乙酰4爭移酶(phosphinotricinacetyltransferase)抗性的als或pat(Murry,上述)。另外的可選擇基因已描述于例如，trpB，其允許細胞利用。引咮代替色氨酸，或hisD,其允許細胞利用histinol替代組氨酸(Hartman&Mulligan,尸roc.JcW.Sc/.85:8047-51(1988))。最近，可見標記的利用已經(jīng)普及，所述標記例如花色素苷，P-葡糖醛酸糖普酶和其底物GUS,和螢光素酶和其底物螢光素，不僅被廣泛利用以鑒定轉化體，而且用以定量可歸因于特定載體系統(tǒng)的瞬時或穩(wěn)定蛋白表達的量(Rhodes等，A/W/zo^Mo/.Ao/.55:121-131(1995》。盡管標記基因表達的存在/不存在暗示了感興趣的基因也存在，它的存在和表達可能需要被確認。例如，如果編碼多肽的序列插入標記43基因序列之內，包含序列的重組細胞可通過標記基因功能的不存在而鑒定?；蛘撸瑯擞浕蚩芍糜谠谛盘枂幼涌刂浦屡c編碼多肽序列串聯(lián)。響應于誘導或選擇的標記基因的表達通常也指示串聯(lián)基因的表達?；蛘?，包含和表達期望的多核苷酸序列的宿主細胞可通過多種本領域技術人員已知的方法鑒定。這些方法包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白生物測定或免疫測定技術，其包括用于檢測和/或定量核酸或蛋白的基于膜，溶液，或芯片的技術。用于檢測和測量多核普酸編碼產物的表達的方案，利用特異于該產物的多克隆或單克隆抗體，是本領域已知的。實例包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA),放射免疫測定(RIA),和熒光激活細胞分類法(FACS)。利用具有與給定多肽上的兩種非干擾表位的反應性的單克隆抗體的兩位點，基于單克隆的免疫測定對于一些應用可以是優(yōu)選的，但是也可利用竟爭性結合測定。這些和其他測定描述于Hampton等，Sera/og/ca/她/7zc^，"丄a60na^07Ma肌a/(1990)和Maddox等,i平她d158:1211-1216(1983)等。寬范圍的標記和綴合(conjugation)技術是本領域技術人員已知的，并且可用于多種核酸和氨基酸測定。用于產生標記的雜交或用于檢測與多核苷酸相關的序列的PCR探針的方法包括寡標記，切口平移，末端標記或利用標記的核苦酸的PCR擴增?；蛘?，序列，或其任何部分可被克隆入用于產生mRNA探針的載體。所述載體是本領域已知的，并且是商業(yè)上可獲得的，并且可用于通過添加適當?shù)腞NA聚合酶例如T7,T3或SP6和標記的核普酸體外合成RNA探針。這些方法可利用多種商業(yè)上可獲得的試劑盒實施?？衫玫倪m當?shù)膱蟮婪肿踊驑擞洶ǚ派湫院怂兀?，熒光，化學發(fā)光，或產色試劑以及底物，輔因子，抑制劑，磁性顆粒等。用感興趣的多核苷酸序列轉化的宿主細胞可在適于從細胞培養(yǎng)物中表達和回收蛋白的條件下培養(yǎng)。根據(jù)使用的序列和/或載體，重組細胞產生的蛋白可被分泌或細胞內包含。如本領域技術人員理解的，包含本發(fā)明的多核苷酸的表達載體可被設計為包含指引編碼的多肽穿過原核或真核細胞膜分泌的信號序列。其他重組構建體可被利用以將編碼感興趣的多肽的序列與編碼將促進可溶蛋白的純化的多肽結構域的核香酸序列連接。所述促進純化結構域包括但不限于金屬螫合肽例如，允許在固定的金屬上純化的組氨酸-色氨酸模塊，允許在固定的免疫球蛋白上純化的蛋白A結構域，和在FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)(ImmunexCorp.,Seattle,Wash.)中利用的結構域。在純化結構域和編碼多肽之間包括可剪切連接序列例如特異于因子XA或腸激酶的那些(Invitrogen.SanDiego,Calif.)可用于促進純化。一種所述表達載體提供了融合蛋白的表達，所述融合蛋白包含感興趣多肽和編碼在硫氧還原蛋白或腸激酶之前的6個組氨酸殘基的核酸。如Porath等，Exp.尸wn/3:263-281(1992)中所述，組氨酸殘基促進了在IMIAC(固定金屬離子親和層析法)上的純化，而腸激酶剪切位點提供了用于從融合蛋白中純化期望的多肽的工具。包含融合蛋白的載體的討論提供于Kroll等，DA^Ce諸o/.12:441-453(1993》。體內多核苷酸遞送技術在另外的實施方式中，包含多核苷酸的遺傳構建體被體內引入細胞中。這可利用大量已知方法中的任何方法獲得，為例示目的的幾種該方法在下面概述。l.腺病毒用于體內遞送一種或更多種核酸序列的一種優(yōu)選方法涉及腺病毒表達載體的利用。"腺病毒表達載體"表示包括包含足以(a)支持構建體的包裝和(b)表達以正義或反義方式克隆入其中的多核苷酸的腺病毒序列的構建體。當然，在反義構建體的情況中，表達不需要基因產物被合成。表達載體包含腺病毒的基因工程化形式。腺病毒，一種36kb,線性，雙鏈DNA病毒，的遺傳組織的知識允許用多至7kb的外來序列取代大段的腺病毒DNA(Grunhaus&Horwitz,1992)。與逆轉錄病毒相比，宿主細胞的腺病毒感染不導致染色體整合，因為腺病毒DNA可以游離基因的模式復制，而沒有潛在的基因毒性。而且，腺病毒是結構上穩(wěn)定的，并且在廣泛擴增之后沒有檢測到基因組重排。腺病毒實際上可感染所有上皮細胞，而不管它們的細胞循環(huán)節(jié)段。迄今為止，腺病毒感染顯示出僅僅與溫和的疾病有關，例如人中的急性呼吸道疾病。腺病毒特別適于用作基因轉移載體，因為它中等大小的基因組，容易處理，高滴度，廣泛的粑細胞范圍和高感染性。病毒基因組的兩端包含100-200個堿基對反向重復(ITRs),其是對于病毒DNA復制和包裝必要的cis元件。基因組的早期(E)和晚期(L)區(qū)域包含由病毒DNA復制起始分隔的不同轉錄單元。El區(qū)域(E1A和E1B)編碼對病毒基因組和一些細胞基因的轉錄調節(jié)起作用的蛋白。E2區(qū)域(E2A和E2B)的表達導致用于病毒DNA復制的蛋白的合成。這些蛋白涉及DNA復制，晚期基因表達和宿主細胞的關閉(shut-off)(Renan,1990)。晚期基因的產物，包括大多數(shù)病毒衣殼蛋白，僅僅在由主要晚期啟動子(MLP)產生(issued)的單個初級轉錄物的有效加工之后表達。MLP(定位于16.8m.u.)在感染的晚期過程中是特別有效的，并且從該啟動子產生的所有mRNA，s具有三聯(lián)體前導(TPL)序列，其使得它們成為用于翻"^的優(yōu)選mRNA's。在一種通用的系統(tǒng)中，重組腺病毒產生于穿梭載體和原病毒載體之間的同源重組。由于兩種原病毒載體之間可能的重組，野生型腺病毒可從這一方法產生。因此，從獨立的斑分離單個克隆并沖全查它的基因組結構是關鍵的。復制缺陷的通用腺病毒載體的產生和繁殖依賴于獨特的輔助細胞系，命名為293,其通過Ad5DNA片段從人胚腎細胞轉化而來并且組成型表達E1蛋白(Gmham等，1977)。由于E3區(qū)域對于腺病毒基因組不是必要的(Jones&Shenk，1978),通用腺病毒載體，在293細胞的輔助下，在El,D3或兩種區(qū)域攜帶外來DNA(Graham&Prevec，1991)。在自然中，腺病毒可包裝大約105。/。野生型基因組(Ghosh-Choudhury等，1987)，提供大約2額外kB的DNA的容量。與El和E3區(qū)域中可取代的大約5.5kB的DNA組合，通用腺病毒載體的最大容量在7.5kB以下，或大約15%的載體總長以下。超過80%的腺病毒基因組保持在載體主鏈中并且是載體傳播的細胞毒性的來源。而且，El-缺失病毒的復制缺陷是不完全的。例如，已經(jīng)用高感染復數(shù)(MOI)的目前可獲得的載體觀察到病毒基因表達的遺漏(Mulligan,1993)。輔助細月包系可源于人細月包例如人胚腎細月包，月幾肉細月包，造血細月包或其他人胚間充質或上皮細胞。或者，輔助細胞可源于允許用于人腺病毒的其他哺乳動物種的細胞。所述細胞包括，例如，Vero細胞或其他猴胚間充質或上皮細胞。如上所述，目前優(yōu)選的輔助細胞系是293。最近，Racher等.(1995)公開了用于培養(yǎng)293細胞和繁殖腺病毒的改進的方法。在一種才莫式中，通過將獨立細胞接種入包含100-200ml培養(yǎng)基的1升硅化旋轉燒瓶中(Techne,Cambridge,UK)而生長天然細胞聚集體。在40rpm下攪拌之后，用臺盼藍評估細胞存活性。在另一模式中，如下所述使用Fibra-凝膠微載體(BibbySterlin,Stone,UK)(5g/l)。懸浮于5ml培養(yǎng)基中的細胞接種物添加到在250mlErlenmeyer燒瓶中的載體(50ml)中，并且靜置1到4h,偶爾攪拌。培養(yǎng)基然后用50ml新鮮培養(yǎng)基取代，并且開始振蕩。對于病毒生產，細胞被允許生長到大約80%的匯合，該時間之后，培養(yǎng)基被取代(到25%的最終體積)并且腺病毒以0.05的MOI被添加。培養(yǎng)物靜置過夜，之后體積增加到100%并且另外開始振蕩72h。除了腺病毒載體為復制缺陷，或至少有條件缺陷的要求之外，腺病毒載體的性質被認為對于成功實施本發(fā)明不是關鍵的。腺病毒可以是42種不同已知血清型或亞組A-F中的任何一種。亞組C的腺病毒5型是為獲得用于本發(fā)明的有條件復制缺陷的腺病毒載體的優(yōu)選的起始材料，因為腺病毒5型是人腺病毒，關于其已知大量生化和遺傳信息，并且它歷史上被用于大多數(shù)利用腺病毒作為載體的構建體。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的典型載體是復制缺陷的并且不具有腺病毒E1區(qū)域。因此，在El-編碼序列已被從其除去的位點引入編碼感興趣的基因的多核苷酸是最便利的。然而，在腺病毒序列中插入構建體的位點對于本發(fā)明不是關鍵的。如Karlsson等(1986)所述，編碼感興趣基因的多核苷酸也可插入而替代E3取代載體中缺失的E3區(qū)域，或插入輔助細胞系或輔助病毒補充E4缺陷的的E4區(qū)域。腺病毒在體外和體內易于生長和操作并且顯示出廣泛的宿主范圍。這組病毒可以高滴度獲得，例如，每ml109-10"斑形成單元，并且它們是高度感染性的。腺病毒的生活周期不需要整合入宿主細胞基因組。通過腺病毒載體遞送的外來基因是游離的并且因此具有對宿主細胞低的基因毒性。在用野生型腺病毒接種的研究中沒有報道有副反應(Couch等，1963;Top等人.，1971),證實了它們的安全性和作為體內基因轉移載體的治療潛能。腺病毒載體已被用于真核基因表達(Levrero等，1991;Gomez-Foix等，1992)和疫苗研發(fā)(Grunhaus&Horwitz,1992;Graham&Prevec,1992)。最近，動物研究暗示重組腺病毒可用于基因治療(Stratford-Perricaudet&Perricaudet,1991;Stratford-Perricaudet等,1990;Rich等人.，1993)。在將重組腺病毒給予不同組織的研究包括氣管滴注(Rosenfeld等，1991;Rosenfeld等分，1992),肌肉注射(Ragot等，1993),外周靜脈注射(^6^&Gerard,1993)和趨實體性接種入腦(LeGalLaSalle等，1993)。2.逆轉錄病毒逆轉錄病毒是單鏈RNA病毒的組，其特征在于在感染細胞中通過逆轉錄的方法將它們的RNA轉化為雙鏈DNA的能力(Coffin,1990)。產生的DNA然后穩(wěn)定地整合入細胞染色體作為原病毒并且指引病毒蛋白的合成。整合導致在接受體細胞和它的后代中病毒基因序列的保持。逆轉錄病毒基因組分別包含三種基因，編碼衣殼蛋白，聚合酶，和包膜成分的gag,pol,和env。從gag基因上游發(fā)現(xiàn)的序列包含用于將基因組包裝入病毒體的信號。兩種長的末端重復(LTR)序列存在于病毒基因組的5，和3，末端。這些包含了強的啟動子和增強子序列并且對于在宿主細胞基因組中的整合也是需要的(Coffin，1990)。為構建逆轉錄病毒載體，編碼一種或更多種感興趣的寡核苷酸或多核香酸序列的核酸在某些病毒序列的位置插入病毒基因組以產生復制缺陷病毒。為了產生病毒體，包含gag,pol,和env基因但沒有LTF和包裝成分的包裝細胞系被構建(Mann等，1983)。當包含cDNA,與逆轉錄病毒LTR和包裝序列的重組質粒凈皮引入這種細胞系時(例如通過^5舞酸釣沉淀)，包裝序列允許重組質粒的RNA轉錄以;故包裝為病毒顆粒，其然后分泌入培養(yǎng)基中(Nicolas&Rubenstein,1988;Temin,1986;Mann等，1983)。包含重組逆轉錄病毒的培養(yǎng)基然后4t收集，任選祐_濃縮，并且用于基因轉移。逆轉錄病毒載體能夠感染寬范圍的細胞類型。但是，整合和穩(wěn)定的表達需要宿主細胞的分裂(Paskind等，1975)。設計為允許逆轉錄病毒載體的特異性靶向的一種新方法最近通過化學添加乳糖殘基到病毒包膜基于逆轉錄病毒的化學修飾而發(fā)展。這種修飾可允許通過唾液酸糖蛋白受體的肝細胞的特異性感染。已經(jīng)設計了耙向重組逆轉錄病毒的一種不同方法，其中使用了針對逆轉錄包膜蛋白和針對特定細胞受體的生物素化抗體。通過利用鏈霉親和素通過生物素成分偶聯(lián)抗體(Roux等，1989)。利用針對主要組48織相容性復合體I類和II類抗原的抗體，他們證實了利用親嗜性病毒體外感染了多種具有那些表面抗原的人細胞(Roux等，1989)。3.腺-相關病毒AAV(Ridgeway,1988;Hermonat&Muzycska,1984)是一種細小病毒(parovims),發(fā)現(xiàn)為一種腺病毒儲存的污染。它是一種不與任何疾病相關的普遍存在的病毒(存在于85%的美國人群中的抗體)。它還分類為一種依賴病毒，因為它的復制依賴于輔助病毒的存在，例如腺病毒。已經(jīng)分離了五種血清型，其中AAV-2特征是最優(yōu)良的。AAV具有單鏈線性DNA,其包殼入衣殼蛋白VP1,VP2和VP3以形成20到24nm直徑的二十面體病毒體(Muzyczka&McLaughlin,1988)。AAVDNA大約4.7千堿基長。它包含兩個開放閱讀框并且側翼插入兩個ITRs。在AAV基因組中有兩種主要的基因r印和ca戶。r印基因編碼對病毒復制起作用的蛋白，然而cap編碼衣殼蛋白VPl-3。每種ITR形成T-形發(fā)夾結構。這些末端重復是用于染色體整合的AAV的唯一實必需c&成分。因此，AAV可用作所有病毒編碼序列被除去并且被用于遞送的基因盒取代的載體。已經(jīng)鑒定了三種病毒啟動子，根據(jù)它們的圖語位置命名為p5，p19,和p40。從p5和p19的轉錄導致rep蛋白的產生，并且從p40的轉錄產生了衣殼蛋白(Hermonat&Muzyczka,1984)。具有幾種促使研究者研究利用rAAV作為表達載體的可能性的因素。一是遞送基因以整合入宿主染色體的需求令人驚訝是很少的。有必要具有145bp的ITRs，其僅僅為AAV基因組的6%。這在載體中留下了裝配4.5kb的DNA插入的空間。雖然這種攜帶容量可能防止了AAV遞送大的基因，它對于遞送反義構建體是充分適合的。由于其安全性，AAV也是遞送載體的良好的選擇。具有相對復雜的援救機制為了移動rAAV,不僅野生型腺病毒，而且AAV基因是需要的。類似地，AAV不是病原性的并且不與任何疾病相關。病毒編碼序列的除去使得對病毒基因表達的免疫反應最小化，并且因此，rAAV不引起炎性應答。4.作為表達構建體的其他病毒載體其他病毒載體可用作用于遞送寡核苷酸或多核苷酸序列到宿主細胞中的本發(fā)明中的表達構建體?？衫迷从诓《纠缗６幻绮《?007(vacciniavirus)(Ridgeway,1988;Coupar等,1988),慢病毒(lentiviruses),脊髓灰質炎病毒(polioviruses)和皰滲病毒(herpesviruses)的疫苗。其他痘病毒(poxvirus)源的載體，例如禽痘源的載體，也可期望是有用的。它們提供了用于多種哺乳動物細胞的幾種吸引人的特征(Friedmann,1989;Ridgeway,1988;Coupar等，1988;Horwich等，1990)。根據(jù)對于缺陷乙型肝炎病毒的最近認識，已經(jīng)獲得了對于不同病毒序列的結構功能關系的新的認識。體外研究顯示盡管缺失多至80%的基因組，病毒可保持用于輔助依賴包裝和逆轉錄的能力(Horwich等，1990)。這暗示了基因組的大部分可被外來遺傳材料取代。嗜肝性(hepatotropism)和持久性(整合)是對于定向于肝的基因轉移的特別吸引人的特性。Chang等(1991)將氯霉素乙酰轉移酶(CAT)基因引入鴨乙型肝炎病毒基因組取代聚合酶，表面和前表面(pre-surface)編碼序列。其與野生型病毒一起共轉染入禽肝癌細胞系。包含高滴度的重組病毒的培養(yǎng)基用于感染原代小鴨肝細胞。轉染之后檢測了至少24小時的穩(wěn)定的CAT基因表達(Chang等，1991)。另外的"病毒，，載體包括病毒樣顆粒(VLPs)和噬菌體。5.非病毒載體為了實現(xiàn)寡核苷酸或多核苷酸序列的表達，表達構建體必須遞送入細胞。遞送可以在體外完成，如在用于轉化細胞系的實-瞼室程序中，或在體內或離體(exvivo),如在治療某些疾病狀態(tài)中。如上所述，一種優(yōu)選的用于遞送的機理是通過病毒感染，其中表達構建體包封入感染性病毒顆粒。一旦表達構建體已被遞送入細胞中，編碼期望寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸可在不同位點被定位和表達。在某些實施方式中，編碼構建體的核酸可穩(wěn)定地整合入細胞基因組中。整合可以通過同源重組(基因取代)在特定位置和方向或者它可整合入隨機，非特異性位點(基因增補(geneaugmentation))。在仍然進一步的實施方式中，核酸可作為獨立，游離的DNA節(jié)段穩(wěn)定地維持在細胞中。所述核酸節(jié)段或"游離體"編碼足以允許獨立于或同步于宿主細胞循環(huán)的維持和復制的序列。表達構建體怎樣遞送到細胞并且核酸保持在細胞中的何處依賴于使用的表達構建體的類型。在某些實施方式中，包含一種或更多種寡核苷酸或多核苷酸序列的表達構建體可簡單地由棵重組DNA或質粒組成。構建體的轉移可通過物理或化學地透化細胞膜的任何上述方法實施。這特別可應用于體內轉移，但它也可體內應用。Dubensky等(1984)成功地將磷酸鈣沉淀形式的多瘤病毒DNA注射入成熟和新生小鼠的肝和脾中，證實了活性病毒復制和急性感染。Benvenisty&Reshef(1986)也證實了直接腹膜內注射磷酸4丐沉淀的質粒導致轉染基因的表達?？梢灶A期編碼感興趣基因的DNA也可以類似方式體內轉移并且表達基因產物。用于將棵DNA表達構建體轉移入細胞的本發(fā)明的另一實施方式可涉及粒子轟擊。這種方法依賴于將DNA-包被的微粒加速到允許它們刺穿細胞膜并且進入細胞而不殺死它們的高速度的能力(Klein等，1987)。已經(jīng)發(fā)展了用于加速小顆粒的幾種裝置。一種所述裝置依賴于高電壓放電以產生電流，其反過來提供驅動力(Yang等，1990)。使用的微粒由生物學惰性物質例如鴒或金珠組成。包括大鼠和小鼠的肝，皮膚，和肌肉組織的選擇的器官已被體內轟擊(Yang等，1990;Zelenin等，1991)。這可能需要組織或細胞的手術暴露，以清除槍和靶器官之間的中間組織，即，離體治療。再次，編碼特定基因的DNA可通過這種方法遞送并且仍然;故并入。多肽組合物通常，多肽組合物將是分離的多肽或其免疫原性片段的組合?；蛘?，在發(fā)明的組合物中的一些或所有多肽抗原可以在融合蛋白中。例如，在包含三種抗原的發(fā)明的組合物中(i)抗原可以三種分離的多肽的形式提供(ii)所有三種多肽抗原可以單個融合蛋白提供(iii)兩種抗原可以融合蛋白提供，第三種以分離形式提供。組合的蛋白/多肽可被本文公開的多核苷酸序列+或在中等嚴格條件下與本文公開的多核苷酸序列雜交的序列編碼?；蛘?，蛋白/多肽可定義為每種包含來自本文公開的氨基酸序列的鄰接氨基酸序列的多肽(即，本文公開的序列的免疫原性片段)，或該蛋白/多肽每種包含本文公開的完整氨基酸序列。通?？衫霉募夹g鑒定免疫原性部分，例如Paul,Fw"c/"we"to//mm,o/ogy，3rded.,243-247(1993)和其中引用的參考文獻中總結的51那些。所述技術包括篩選多肽的與抗原特異性抗體，抗血清和/或T-細胞系或克隆反應的能力。如本文所用，抗血清和抗體是"抗原-特異性的"如果它們特異性結合抗原(即，它們與蛋白在ELISA或其他免疫測定中反應，并且不與不相關蛋白可檢測地反應)。所述抗血清和抗體可如本文描述和利用公知技術制備。衣原體屬蛋白的免疫原性部分是與所述抗血清和/或T-細胞以基本上不小于全長多肽的反應性(例如，在ELISA和/或T-細胞反應性測定)的水平反應的部分。所述免疫原性部分在所述測定中可以類似于或大于全長多肽的反應性的水平進行反應。所述篩選通?？衫帽绢I域普通技術人員公知的方法實施，例如Harlow&Lane,J胎'W^.'JZ^ora紐;；她w認/(1988)中所述的那些。例如，多肽可固定在固體支持物上并且與患者血清接觸以允許血清內的抗體與固定多肽的結合。未結合的血清可然后被除去并且利用例如，1251-標記蛋白A檢測結合的抗體?？衫枚喾N公知技術中的任何技術制備多肽。如上所述的DNA序列編碼的重組多肽可利用本領域普通技術人員已知的多種表達載體中的任何載體從DNA序列中容易地制備。可在已經(jīng)用包含編碼重組多肽的DNA分子的表達載體轉化或轉染的任何適當?shù)乃拗骷毎蝎@得表達。適當?shù)乃拗骷毎ㄔ思毎?，酵母，和高等真核細胞，例如哺乳動物細胞和植物細胞。?yōu)選，利用的宿主細胞是大腸桿茵，酵母或哺乳動物細胞系例如COS或CHO。來自將重組蛋白或多肽分泌入培養(yǎng)基的適當?shù)乃拗?載體系統(tǒng)的上清液可利用商業(yè)上可獲得的濾器初次濃縮。濃縮之后，濃縮物可應用到適當?shù)募兓|上例如親和基質或離子交換樹脂。最后，可利用一種或更多種逆相HPLC步驟以進一步純化重組多肽。多肽，可具有例如少于大約100個氨基酸，或少于大約50個氨基酸的其免疫原性片段，也可利用本領域普通技術人員公知的技術通過合成方法產生。例如，所述多肽可利用任何商業(yè)上可獲得的固相技術合成，例如Merrifield固相合成方法，其中氨基酸被連續(xù)添加以產生氨基酸鏈。見Merrifield，丄爿肌C7zem.Soc.85:2149-2146(1963)。自動化合成多肽的設備商業(yè)上可獲得于供應商例如PerkinElmer/AppliedBioSystemsDivision(FosterCity,CA),并且可根據(jù)制造商指示操作。在某些特定實施方式中，多肽可以是融合蛋白，所述融合蛋白包含本文所述的多種多肽，或包含至少一種本文所述的多肽和不相關序列，例如已知蛋白。所述融合伴倡可，例如，輔助提供T輔助表位(免疫學融合伴侶)，優(yōu)選人識別的T輔助表位，或可輔助以高于天然重組蛋白的產量表達蛋白(表達增強子)。某些優(yōu)選融合伴侶是免疫學和表達增強融合伴4呂?？蛇x擇其他融合伴估以提高蛋白的可溶性或使蛋白能夠被靶向于期望的細胞內區(qū)室。仍然進一步地，融合伴侶包括親和標簽，其促進蛋白的純化。融合蛋白通?？衫脴藴始夹g制備，包括化學綴合。由此，融合蛋白可表達為重組蛋白，允許在表達系統(tǒng)中產生相對于非融合蛋白提高的水平。簡短地說，編碼多肽成分的DNA序列可獨立裝配，并且連接入適當?shù)谋磉_載體。用或不用肽連接體將編碼一種多肽成分的DNA序列的3，末端與編碼第二種多肽成分的DNA序列的5，末端連接，因此序列的閱讀框是同相的(inphase)。這允許翻譯為保持兩種組成多肽的生物學活性的單個融合蛋白。典型地，包含兩種或更多種抗原的融合蛋白可省略來自第二和隨后抗原的起始密碼子(Met)?？衫秒倪B接體序列將第一和第二多肽成分分隔一段使得每種多肽能夠折疊為它的二級和三級結構的距離。利用本領域公知的標準技術將所述肽連接體序列引入融合蛋白?？苫谙铝幸蛩剡x擇適合的肽連接體序列(1)它們采取靈活的伸展構象的能力；(2)它們采取能夠與第一和第二多肽上的功能性表位相互反應的二級結構的能力；和(3)缺少可能與多肽功能性表位反應的疏水性或帶電殘基。優(yōu)選的肽連接體序列包含Gly，Asn和Ser殘基。其他近中性氨基酸，例如Thr和Ala也可用于連接體序列中?？捎杏玫赜米鬟B接體的氨基酸序列包括Maratea等，G，40:39-46(1985);Murphy等，尸rac.淑/.^c^/."M83:8258-8262(1986);美國專利號4,935,233和美國專利號4,751,180中描述的那些。連接體序列通?？梢允菑?到大約50個氨基酸長度。當?shù)谝缓偷诙嚯木哂锌捎糜诜指艄δ苄越Y構域和防止位阻影響的非必需N-末端氨基酸區(qū)域時，不需要連接體序列。連接的DNA序列可操縱地連接于適當?shù)霓D錄或翻譯調節(jié)元件。對表達DNA起作用的調節(jié)元件僅僅定位于編碼笫一多肽的DNA序列的5，。類似地，終止翻譯和轉錄終止信號的終止密碼子僅僅存在于編碼第二多肽的DNA序列的3，。53由此，根據(jù)本發(fā)明的組合物可包含一種或更多種融合蛋白。所述蛋白包含本文所述的的組合物的多肽成分以及不相關的免疫原性蛋白。免疫原性蛋白可例如能夠引起回憶應答(recallresponse)。所述蛋白的例子包括破傷風(tetanus),結核(tuberculosis)和肝炎(hepatitis)蛋白(見例如，Stoute等，A^w五"g/.丄A^t/.336:86-91(1997))。在某些實施方式中，免疫學融合伴侶源于蛋白D,—種革蘭氏陰性細菌流感嗜血桿菌(//aem0/7/^/wsz"y7we"zaB)的表面蛋白(WO91/18926)。蛋白D衍生物可包含大約首個三分之一的蛋白(例如，首個N-末端100-110氨基酸)，并且蛋白D衍生物可被脂質化(lipidated)。在某些實施方式中，脂蛋白D融合伴侶的開始的109個殘基包括在N-末端以提供給多肽另外的外源T-細胞表位并且增加大腸桿菌中的表達水平(由此起著表達增強子的作用)。脂質尾部確保了抗原最佳呈遞到抗原呈遞細胞上。其他融合伴侶包括來自流感病毒的非結構蛋白，NS1(血凝素)。典型地，使用N-末端81個氨基酸，盡管可使用包括T-輔助表位的不同片段。在另一實施方式中，免疫學融合伴侶是稱為LYTA的蛋白，或其部分(優(yōu)選C-末端部分)。LYTA源于肺炎鏈球菌(5^印^cocc^;"ewmomae)，其合成稱為酰胺酶LYTA的N-乙?；?L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因編碼；Gewe43:265-292(1986))。LYTA是特異性降解肽聚糖主鏈中的某些鍵的自溶素。LYTA蛋白的C-末端結構域對與膽堿或對一些膽堿類似物例如DEAE的親和性起作用。為了發(fā)展用于表達融合蛋白的大腸桿菌C-LYTA表達質粒，已經(jīng)利用了這種特性。包含在氨基末端的C-LYTA片段的雜合蛋白的純化已被描述(見A0&c/2"0/0gy10:795-798(1"2))。在優(yōu)選實施方式中，LYTA的重復部分可并入融合蛋白。重復部分發(fā)現(xiàn)于開始于殘基178的C-末端區(qū)域。特別優(yōu)選的重復部分并入殘基188-305。通常，本文所述的多肽(包括融合蛋白)和多核苷酸是分離的。"分離的"多肽或多核苷酸是從它的原始環(huán)境中移走的物質。例如，天然存在的蛋白是分離的，如果它從自然系統(tǒng)中的一些或所有共存物質中分離。優(yōu)選地，所述多肽是至少大約90%純的，更優(yōu)選至少大約95%純的并且最優(yōu)選至少大約99%純的。多核苷酸被認為是分離的，如果，例如，它被克隆入不是天然環(huán)境的部分的載體中。T細胞免疫治療組合物也可，或替代地，包含特異于衣原體抗原的T細胞。所述細胞通?？衫脴藴史椒w外或離體制備。例如，T細胞可利用商業(yè)上可獲得的細胞分離系統(tǒng)，例如，IsolexTM系統(tǒng)，獲自NexellTherapeutics,Inc.(Irvine,CA;也見美國專利號5,240,856;美國專利號5,215,926;WO89/06280;WO91/16116和WO92/07243),從患者的骨髓，外周血，或骨髓或外周血的部分中分離?；蛘撸琓細胞可源于相關或不相關人，非人哺乳動物，細胞系或培養(yǎng)物?？捎枚嚯?，編碼所述多肽的多核苷酸，和/或表達所述多肽的抗原呈遞細胞(APC)刺激T細胞。所述刺激在足以允許產生特異于多肽的T細胞的條件和時間下進行。優(yōu)選，多肽或多核苷酸存在于遞送載體之內，例如微球，以促進特異性T細胞的產生。T細胞被認為是特異于多肽的，如果T細胞特異性增殖，分泌細胞因子或殺傷包被了多肽或表達編碼該多肽的基因的靶細胞?？衫枚喾N標準技術中的任何技術評價T細胞特異性。例如，在鉻釋放測定或增殖測定中，相比于陰性對照，在裂解和/或增殖中超過兩倍的增長的刺激指數(shù)指示T細胞特異性。所述測定可，例如，如Chen等，C朋ceri^s.54:1065-1070(1994))中所述實施?；蛘撸琓細胞增殖的檢測可通過多種已知技術完成。例如，T細胞增殖可通過測量DNA合成的增加率而檢測(例如，通過利用氘標胸苷的T細胞脈沖標記培養(yǎng)和測量并入DNA的氘標胸苷的量)。與多肽(100ng/ml-100jag/ml,優(yōu)選200ng/ml-25|ug/ml)接觸3-7天應該導致T細胞增殖的至少2倍的增長。如上所迷接觸2-3小時應該導致T細胞的活化，如利用標準細胞因子測定所測量的，其中細胞因子(例如，tnf或IFN-y)釋放水平的2倍i曾長才旨示T纟田月包;舌4匕(見Coligan等,Cwre"f/Vofoco/s/"/mmw"o/ogy,vol.1(1998))。響應于多肽，多核苷酸或表達多肽的APC而活化的T細胞可以是CD4+和/或CD8+。蛋白特異性T細胞可利用標準技術擴增。在優(yōu)選實施方式中，T細胞源于患者，相關供體或不相關供體，并且在刺激和擴增之后給予患者。為治療目的，響應于多肽，多核苷酸或APC而增殖的CD4+或CD8+T細胞可在體外或體內數(shù)目擴增(expandedinnumber)。所述T細胞在體外的增殖可以多種方式完成。例如，T細胞可再暴露于于多肽，或對應于所述多肽的免疫原性部分的短肽，添加或不添加T細胞生長因子，例如白介素-2,和/或合成多肽的刺激細胞?；蛘撸诘鞍状嬖谙略鲋车囊环N或更多種T細胞可通過克隆而數(shù)目擴增。克隆細胞的方法是本領域公知的，并且包括限制性的稀釋。藥物組合物在另外的實施方式中，本文公開的多核苷酸，多肽，T-細胞和/或抗體組合物將以藥學上可接受或生理學上可接受的溶液配制，所述溶液用于單獨或與一種或更多種其他治療方式組合給予細胞或動物。將理解，如果期望，表達本文公開的多肽組合物的核酸節(jié)段，RNA,DNA或PNA組合物也可與其他試劑組合給予，例如，其他蛋白或多肽或多種藥學活性試劑。事實上，對于還可包括的其他成分實際上沒有限制，只要附加的試劑當接觸靶細胞或宿主組織時不導致顯著的不利效果即可。組合物因此可與特定情形中需要的多種其他試劑一起遞送。所述組合物可從宿主細胞或其他生物學來源純化，或替代地可如本文所述化學合成。類似地，所述組合物可進一步包含取代的或衍生的RNA或DNA組合物。藥學上可接受賦形劑和載體溶液的配制對于本領域技術人員是公知的，用于以多種治療方案利用本文所述的特定組合物的適當?shù)慕o藥和治療方案的發(fā)展也是一樣，包括例如，口服，腸胃外，靜脈內，鼻內，和肌肉內給藥和配制。其他給藥途徑包括通過粘膜表面，例如陰道內癥合藥。1.口服遞送在某些應用中，本文公開的藥物組合物可通過口服給予動物而遞送。同樣地，這些組合物可用惰性稀釋劑或可吸收的食用載體配制，或者它們可封裝入硬或軟殼凝膠膠嚢中，或者它們可被壓縮成片劑，或者它們可直接與飲食食物合并。活性化合物甚至可與賦形劑合并并且以可吸收片劑，口腔片劑，錠劑(troches)，膠嚢，酏劑，懸浮劑，糖漿，薄片(wafers)等的形式利用(Mathiowitz等,1997;Hwang等，1998;美國專利5,641,515;美國專利5,580,579和美國專利5,792,451,每種特別地全文通過援引并入本文)。片劑，錠劑，丸劑，膠嚢等還可包含下列物質粘合劑，如西黃蓍膠，阿拉伯膠，玉米淀粉，或凝膠；賦形劑，如磷酸二鈣；分解劑，如玉米淀粉，馬鈴薯淀粉，褐藻酸等；潤滑劑，如硬脂酸鎂；和甜味劑，如蔗糖，乳糖或糖精可被加入或者調味劑，如薄荷，冬青油，或櫻桃調味劑。當劑量單元形式是膠嚢時，它可包含，除了上述類型物質之外，液體載體。多種其他物質可存在為包衣或為另外修飾劑量單元的物理形式而存在。例如，片劑，丸劑，或者膠嚢可用蟲膠，糖或兩者包衣。酏劑糖漿可包含活性化合物蔗糖作為甜味劑，對羥苯曱酸甲酯和對羥苯曱酸丙酯作為防腐劑，染料和調味劑，例如櫻桃或橙調味劑。當然，用于制備任何劑量單元形式的任何物質應該是藥學上純的并且使用量基本上是無毒的。另外，活性化合物可并入持續(xù)釋放的制品和制劑中。典型地，這些制劑可包含至少大約0.1%的活性化合物或更多，盡管活性成分的百分比當然可改變并且可方便地在大約1或2%到大約60%或70%或更高的總制劑重量或體積。天然地，每種治療有用組合物中的活性化合物的量可以使得在任何給定劑量單元的化合物中獲得適當?shù)膭┝康姆绞蕉苽?。例如溶解性，生物可利用性，生物半衰期，給藥途徑，產物儲存期，以及其他藥學上的考慮的因素將是制備所述藥物制劑的領域的技術人員可預期的，并且類似地，大量劑量和治療方案可以是期望的。對于口服給藥，本發(fā)明的組合物可替代地與一種或更多種賦形劑合并為漱口劑，潔牙劑，口腔片劑，口噴霧劑，或舌下口給予制劑的形式。例如，漱口劑可被制備為合并在適當溶劑中需要量的活性成分，例如硼酸鈉溶液(Dobell，s溶液)?；蛘?，活性成分可并入口服溶液例如包含硼酸鈉，甘油和碳酸氪鉀的口服溶液，或分散在潔牙劑中，或以治療有效量添加入可包括水，粘合劑，磨料，調味劑，起泡劑，和濕潤劑的組合物中?；蛘呓M合物可被塑造成可放置于舌下或否則融化于口中的片劑或溶液形式。2.可注射遞送在某些環(huán)境中，期望如美國專利5,543,158;美國專利5,641,515和美國專利5,399,363(每種特別地全文通過援引并入本文)中所述腸胃外，靜脈內，肌肉內，或甚至腹膜內遞送本發(fā)明公開的藥物組合物。在儲存和使用的普通條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物的生長。適于可注射使用的藥物形式包括無菌水溶液或分散劑和用于臨時制備無菌可注射溶液或分散劑的無菌粉末(美國專利5,466,468,特別地全文通過援引并入本文)。在所有情況中，該形式必須是無菌的并且必須以存在容易的可注射性的程度為流動的。它必須在制備和儲存條件下為穩(wěn)定的，并且必須儲存預防例如細菌和真菌的微生物的污染反應。載體可以是溶劑或分散介質，包括例如，水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇，和液體聚乙二醇等)，其適當混合物，和/或植物油。可保持適當?shù)牧鲃有?，例如，通過利用包衣，例如，卵磷脂，在分散劑的例子中通過維持所需要的顆粒大小，和通過利用表面活性劑。多種抗細菌和抗真菌試劑，例如，對羥基苯曱酸脂，氯丁醇，酚，山梨酸，硫柳汞等可促進微生物反應的預防。在許多例子中，優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖或氯化鈉。通過用于例如單硬脂酸鋁和凝膠的延遲吸收試劑的組合物中可產生注射組合物的延長吸收。對于以水溶液腸胃外》會藥，例如，如果必要時，溶液應該纟皮適當?shù)鼐彌_，并且利用充分的鹽或葡萄糖，液體稀釋劑首先導致等滲。這些特定的水溶液特別適于靜脈內，肌肉內，皮下和腹膜內給藥。在這種聯(lián)系中，可利用的無菌水介質將是本領域技術人員根據(jù)本公開已知的。例如，一種劑量可溶解于lml的等滲NaCl溶液中并且添加到1000ml的皮下輸液中或在計劃的輸注位點注射(見例如，Aemwgto"》尸/^r腸固"ca/Sc/e膨s,15thEdition,pp.1035-1038和1570-1580)。劑量根據(jù)治療的個體條件必然將發(fā)生一些改變。負責給藥的人將，在任何情況下，確定對于各個個體適當?shù)膭┝?。而且，對于人給藥，制劑應滿足FDA生物制品標準辦公室所要求的無菌性，熱原質性，和普通的安全性和純度標準。如所需要的，通過將所需量的活性成分并入具有多種上面列舉的其他成分的適當溶劑中而制備無菌可注射溶液，然后過濾無菌化。通常，通過將多種無菌活性成分并入包含堿性分散介質和來自上面列舉的所需的其他成分的無菌載體中而制備分散劑。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的例子中，制備的優(yōu)選方法是真空干燥和冷凍干燥技術，其產生活性成分加上來自其先前無菌過濾溶液的任何另外的期望成分的粉末。本文公開的組合物可配制為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽，包括酸添加鹽(用蛋白的游離氨基基團形成)并且其利用無機酸例如，鹽酸或磷酸，或有機酸例如乙酸，草酸，酒石酸，扁桃酸等，而形成。具有游離羧基基團的鹽形式也可源于無機堿例如，氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化銨，氫氧化鈣或氫氧化鐵，和有機堿例如，異丙胺，三甲胺，組氨酸，普魯卡因等。對于制劑，溶液以與劑量制劑兼容的方式和以治療有效的量給藥。制劑以多種劑量形式例如可注射溶液，藥物釋放膠嚢等而容易地給藥。如本文所用，"載體"包括任何和全部溶劑，分散介質，載體，包衣，稀釋劑，抗細菌和抗真菌試劑，等滲和吸收延遲試劑，緩沖劑，載體溶液，懸浮劑，膠體等。所述介質和試劑用于藥物活性物質是本領域公知的。除了任何常用介質或試劑與活性成分不兼容的情況，它用于治療組合物是期望的。補充的活性成分也可并入組合物。短語"藥學上可接受"表示當給予人時不產生過敏性或類似不利反應的分子實體和組合物。包含作為活性成分的蛋白的水組合物的制備是本領域公知的。典型地，所述組合物制備為可注射的，為液體溶液或懸浮劑；也可制備適于在注射前溶解于或懸浮于液體中的固體形式。制劑還可被乳化。3.粘膜遞送(i)鼻遞送在某些實施方式中，藥物組合物可通過鼻內噴霧劑，吸入劑，和/或其他氣溶膠遞送載體遞送。用于通過鼻氣溶膠噴霧劑將基因，核酸和肽組合物直接遞送到肺的方法已描述于例如，美國專利5,756,353和美國專利5,804,212(每種特別全文通過援引并入本文)。類似地，利用鼻內微顆粒樹脂的藥物遞送(Takenaga等，1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美國專利5,725,871,特別地全文通過援引并入本文)也是藥物領域公知的。類似地，以聚四氟乙烯支持基質形式的經(jīng)粘膜藥物遞送描述于美國專利5,780，045(特別地全文通過"t爰引并入本文)。(ii)陰道內遞送在本發(fā)明的其他實施方式中，藥物組合物可為陰道內遞送而配制。所述制劑可存在為液體，半固體或固體(包括例如，乳膏，軟膏，凝59膠等)，或可包含在物理遞送系統(tǒng)中，例如陰道栓，海綿，陰道環(huán)或膜。(iii)目艮遞送在本發(fā)明的進一步的實施方式中，藥物組合物可為眼遞送而配制。所述制劑理想地將是澄明的和無色的。(iv)直腸遞送在本發(fā)明另外的實施方式中，藥物組合物可為直腸遞送而配制。5.脂質體，納米膠嚢，和微顆粒介導的遞送在某些實施方式中，發(fā)明人預期了脂質體，納米顆粒，微顆粒，微球，脂質體顆粒，嚢等用于將本發(fā)明組合物引入適當?shù)乃拗骷毎?。特別地，本發(fā)明的組合物可為包封在脂質顆粒，脂質體，嚢，納米球，或納米顆粒等中遞送而配制。優(yōu)選所述制劑用于引入本文公開的核酸或構建體的藥學上可接受的制劑。脂質體的形成和利用對于本領域技術人員是公知的(見例如，Couvreur等，1977;Couvreur,1988;Lasic,1998;其描述了脂質體和納米膠嚢在靶向抗生素治療細胞內細菌感染和疾病中的用途)。最近，發(fā)展了具有改進的血清穩(wěn)定性和循環(huán)半衰期的脂質體(Gabizon&Papahadjopoulos,1988;AllenandChoun,1987;美國專利5,741,516，特別地全文通過援引并入本文)。而且，已經(jīng)綜述了脂質體和類脂質體制劑作為潛在藥物載體的多種方法(Takakura,1998;Chandran等，1997;Margalit，1995;美國專利5,567,434;美國專利5，552,157;美國專利5,565,213;美國專利5,738,868和美閨專利5,795,587,每種全文通過援引并入本文)。脂質體已經(jīng)成功地與通常抵抗通過其他方法轉染的大量細胞類型一起利用，所述細胞類型包括T細胞懸浮液，原代肝細胞培養(yǎng)物和PC12細胞(Re誕isen等，1990;Muller等，1990)。另外，脂質體沒有對于基于病毒的遞送系統(tǒng)典型的DNA長度的限制。脂質體已經(jīng)有效地用于將基因，藥物0^&^&Martin,1986;Heath等，1986;Balazsovits等，1989;Fresta&Puglisi,1996),放射治療劑(Pikul等.，1987),酶(Imaizumi等，1990a;Imaizumi等,1990b》病毒(Faller&Baltimore,1984)，轉錄因子和別構劑(Nicolau&Gersonde，1979)引入多種培養(yǎng)細胞系和動物。另外，已經(jīng)完成了檢查脂質體介導的藥物遞送的有效性的幾種成功的臨床試驗(Lopez-Berestein等，1985a;1985b;Coune,1988;Sculier等，1988)。而且，幾種研究暗示脂質體的利用與全身遞送之后的自身免疫應答，毒性或生殖腺局限(gonadallocalization)無關(Mori&Fukatsu,1992)。脂質體形成于分散于水介質中的磷脂并且自發(fā)形成多層同心雙層嚢(也稱為多層嚢(MLVs))。MLVs通常具有從25nm到4|um的直徑。MLVs的聲裂法導致形成小的單層嚢(SUVs),直徑為200到500A,包含在核中的水溶液。脂質體與細胞膜類似，并且期望作為肽組合物的載體用于本發(fā)明。它們是廣泛地適用的，因為可溶于水和脂質的物質可被捕獲，即分別在水空間中和在雙層本身中。有可能含有藥物的脂質體甚至可用于通過選擇性修飾脂質體制劑而位點特異性遞送活性試劑。除了Couvreur等(1977;1988)的教導之外，下列信息可用于產生脂質體制劑。當分散于水中時磷脂可形成除了脂質體之外的多種結構，依賴于脂質與水的摩爾比。在低比例時，脂質體是優(yōu)選的結構。脂質體的物理特性依賴于PH,離子強度和雙價陽離子的存在。脂質體可顯示出對于離子和極性物質低的滲透性，但在提高的溫度下經(jīng)歷顯著改變它們的滲透性的相變。相變涉及從稱為凝膠狀態(tài)的封閉包裝，有序結構，改變?yōu)榉Q為流體狀態(tài)的松散包裝，無序結構。這在特征性相變溫度下發(fā)生并且產生對離子，糖和藥物的滲透性的提高。除了溫度，暴露于蛋白可改變脂質體的滲透性。某些可溶蛋白，例如，細胞色素C,結合，變形并且穿透雙層，由此導致滲透性的改變。膽固醇表面上通過將磷脂包裝得更緊密而抑制蛋白的這種穿透。預期用于抗生素和抑制劑遞送的最有用的脂質體制劑將包含膽固醇。捕獲溶質的能力在不同類型的脂質體之間改變。例如，MLVs在捕獲溶質上是中等有效的，但是SUVs是極端無效的。SUVs提供了同源性和在大小分配上的可復制性的優(yōu)點，但是，大單層嚢(LUVs)提供了在大小和捕獲效率之間的妥協(xié)。這些通過醚蒸發(fā)制備并且在溶質捕獲效率上是MLVs的三到四倍。除了脂質體特征，在捕獲化合物中的重要的決定因素是化合物自身的物理化學特性。極性化合物在水空間中捕獲并且非極性化合物結合嚢的脂質雙層。極性化合物通過滲透或當雙層破裂時釋放，但是非極性化合物保持在雙層中，除非它被通過溫度或暴露于脂蛋白而裂解。61兩種類型都顯示了在相變溫度下最大的流出率。脂質體與細月包通過四種不同機理相互作用通過網(wǎng)狀內皮細胞系統(tǒng)的吞噬細胞例如巨噬細胞和嗜中性粒細胞的胞吞作用；與細胞表面的吸附，通過非特異性弱疏水或靜電力，或通過與細胞表面成分的特異性反應；通過將脂質體的脂質雙層插入質膜，同時釋放脂質體成分到細胞質中，與漿細胞膜的融合；和通過將脂質體脂質轉移到細胞或亞細胞膜，或反之亦然，不涉及任何脂質體成分。通常很難確定哪種機理起作用并且多于一種機理可能同時起作用。靜脈內注射脂質體的命運和處置依賴于它們的物理特性，例如大小，流動性，和表面電荷。它們可存在于組織中數(shù)小時或數(shù)天，依賴于它們的組成，和從分鐘到幾小時的在血中的半衰期。更大的脂質體，例如MLVs和LUVs,被網(wǎng)狀內皮細胞系統(tǒng)的吞噬細胞快速吸收，但是循環(huán)系統(tǒng)的生理學限制了如此大的種類在大多數(shù)位點的離去。它們僅僅可在在毛細管內皮中存在大的開口或孔的地方離去，例如肝或脾的竇狀隙。由此，這些器官是吸收的主要位點。另一方面，SUVs顯示出更寬的組織分配，但仍然是高度隔絕在肝和脾中。通常，這種體內行為限制了脂質體潛在僅僅靶向于達到它們的大小的這些器官和組織。這包括血，肝，脾，骨髓，和淋巴器官。耙向通常不是根據(jù)本發(fā)明的限制。然而，特異性耙向應該是期望的，為完成此的方法是可獲得的?？贵w可用于結合脂質體表面并且將抗體和它的藥物成分指引到位于特定細胞類型表面上的特異性抗原受體。碳水化合物決定簇(在細胞-細胞識別，相互作用和粘附中起作用的糖蛋白或糖脂細胞表面成分)也可用作識別位點，因為它們具有將脂質體指引到特定細胞類型的潛能。通常，預期靜脈內注射脂質體制劑將被使用，但是其他給藥途徑也是可能的?；蛘撸景l(fā)明提供了本發(fā)明組合物的藥學上可接受的納米膠嚢制劑。納米膠嚢通?？梢苑€(wěn)定和可復制的方式捕獲化合物(Henry-Michelland等，1987;Quintanar-Guerrero等，1998;Douglas等，1987)。為避免由于細胞內聚合超載的副作用，所述超細的顆粒(大小大約0.1|im)應利用能夠體內降解的聚合物設計。符合這些要求的生物可降解聚烷基-氰基丙烯酸酯納米顆粒預期可用于本發(fā)明。如(Couvreur等，1980;1988;zurMuhlen等，1998;Zambaux等1998;Pinto-Alphandry等，1995和美國專利5,145,684,特別地全文通過援引并入本文)所述，所述顆?？梢允侨菀椎刂苽涞摹Ｒ呙缭诒景l(fā)明的某些優(yōu)選實施方式中，提供了疫苗。疫苗通常包含與免疫刺激劑組合的一種或更多種藥物組合物，例如上面討論的那些。免疫刺激劑可以是增強或加強對外源抗原的免疫應答(包括抗體和/或細胞介導的)的任何物質。免疫刺激劑的例子包括佐劑，生物可降解微球(例如，聚乳酸半乳糖酐(polylacticgalactide))和脂質體(化合物并入其中；見例如，F(xiàn)ullerton,美國專利號4,235,877)。疫苗制劑通常4笛述于,例長口,owell&Newman,eds.,(thesubunitandadjuvantapproach)(1995)。本發(fā)明范圍內的藥物組合物和疫苗還可包含其他化合物，其可以是生物學活性或無活性的。例如，可存在一種或更多種其他抗原的免疫原性部分，在組合物或疫苗中，每種并入融合多肽或作為獨立的化合物。例示性的疫苗可包含編碼兩種或更多種上述多肽的DNA，使得多肽原位產生。如上所提到的，DNA可存在于本領域普通技術人員已知的多種遞送系統(tǒng)中的任何遞送系統(tǒng)中，包括核酸表達系統(tǒng)，細菌和病毒表達系統(tǒng)。大量基因遞送技術是本領域公知的，例如Rolland,Cr".尺ev.T7zerap.Z>wgCam"Sj^ews15:143-198(1998)及其引用的參考文獻所述。適當?shù)暮怂岜磉_系統(tǒng)包含用于在患者中表達的必要DNA序列(例如適當?shù)膯幼雍徒K止信號)。細菌遞送系統(tǒng)涉及給予在它的細胞表面上表達多肽的免疫原性部分或分泌所述表位的細菌(例如，5ac/〃w-Ca/me〃e-Gwern力)。在優(yōu)選的實施方式中，可利用病毒表達系統(tǒng)將DNA引入(例如牛痘或其他痘病毒，逆轉錄病毒，或腺病毒)，其可涉及非病原性(缺陷的)，有復制能力的病毒的利用。適當?shù)南到y(tǒng)公開于，例如，F(xiàn)isher-Hoch等，尸roc.A^/.Jc"dSc.86:317-321(1989);Flexner等，勘".W.XS".569:86-103(1989);Flexner等，F(xiàn)頻力e8:17-21(1990);美國專利號4,603,112，4,769,330,和5,017,487;WO89/01973;美國專利號4,777,127;GB2,200,651;EP0,345,242;WO91/02805;Berkner,腸^/zm々廳6:616-627(1988);Rosenfeld等，S"e"ce252:431-434(1991);Kolls等.，TVa".^c^/.91:215-219C1994);Kass-Eisler等，尸toc.A^/.Jcat/.Sc/.V&490:11498-11502(1993);Guzman等，C/""》"88:2838-2848(1993);和Guzman等，0>.尺w.73:1202-1207(1993)。將DNA引入所述表達系統(tǒng)的技術是本領域普通技術人員公知的。DNA也可以是"棵的"，如所描述于例如，Ulmer等,259:1745-1749(1993),和綜述于Cohen,259:1691-1692(1993)。可通過將DNA包—皮到生物可降解珠之上，其被有效地運送到細胞中，而提高棵DNA的吸收。很明顯疫苗可包含多核苷酸和多肽成分。所述疫苗可提供增強的免疫應答。很明顯疫苗可包含本文提供的多核普酸和多肽的藥學上可接受的鹽。所述鹽可從藥學上可接受的非毒性堿制備，包括有機堿(例如，伯，仲，叔胺的鹽和堿性氨基酸)和無機堿(例如，鈉，鉀，鋰，銨，4丐和鎂鹽)。盡管本領域普通技術人員已知的任何適當?shù)妮d體可用于本發(fā)明的疫苗組合物，載體的類型將依賴于給藥模式。本發(fā)明的組合物可為任何適當?shù)慕o藥方式而配制，包括例如，局部，口月良，鼻，靜脈內，顱內，腹膜內，皮下或肌肉內給藥。對于腸胃外給藥，例如皮下注射，載體優(yōu)選包含水，鹽，醇，脂肪，蠟或緩沖劑。對于口服給藥，任何上述載體或固體載體，例如甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石，纖維素，葡萄糖，蔗糖，和碳酸鎂可被使用。生物可降解微球(例如，聚乙酸酯聚乙醇酸酯)也可用作本發(fā)明藥物組合物的載體。適當?shù)纳锟山到馕⑶蚬_于，例如，美國專利號4,897,268;5,075,109;5,928,647;5,811,128;5,820,883;5,853,763;5,814,344和5,942,252。也可利用包含美國專利號5,928,647中描述的微粒蛋白復合物的載體，其能夠在宿主中誘導I型限制性細胞毒性T淋巴細胞響應。所述組合物也可包含緩沖劑(例如，中性緩沖鹽或磷酸鹽緩沖鹽)，碳水化合物(例如，葡萄糖，甘露糖，蔗糖或葡聚糖)，甘露醇，蛋白質，多肽或氨基酸例如甘氨酸，抗氧化劑，抑菌劑，螯合劑例如EDTA或谷胱甘肽，佐劑(例如，氫氧化鋁)，使得制劑與接受體(recipient)血液等滲，低滲或弱高滲的溶質，懸浮劑，增稠劑和/或防腐劑。或者，本發(fā)明的組合物可配制為凍干劑?；衔镆部衫霉夹g包封在脂質體之內。多種免疫刺激劑中的任何免疫刺激劑可用于本發(fā)明的疫苗。例如，可包括佐劑。大多數(shù)佐劑包含設計為保護抗原免于快速分解代謝的物質，例如氫氧化鋁或礦物油，和免疫應答刺激劑，例如脂質A,百日咳4干菌(5ortode〃a/eWz^s7's)或分才支4干菌(A^yco6a"er/wm)種或源于分枝桿菌的蛋白。例如，可利用去脂化，去糖脂化母牛分枝桿菌(Mvaccae)("pVac")。在另一實施方式中，BCG用作佐劑。另外，疫苗可給予先前暴露于BCG的個體。適當?shù)淖魟┦巧虡I(yè)上可獲得的，例如，F(xiàn)reund，s不完全佐劑和完全佐劑(DifcoLaboratories,Detroit,MI);Merck佐劑65(MerckandCompany,Inc.,Rahway,NJ);CWS，TDM,Leif,鋁鹽例如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁;釣，鐵或鋅鹽；?；野彼岬牟蝗軕腋?；酰化糖；陽離子或陰離子衍生化多糖；聚磷腈；生物可降解微球；單磷?；|A和quilA。細胞因子，例如GM-CSF或白介素-2,-7或-12也可用作佐劑。在本文提供的疫苗之內，佐劑組合物可設計為主要誘導Thl型免疫應答。高水平的Th-l型細胞因子(例如，IFN-y,TNFoc,IL-2和IL-12)高水平的Th2-型細胞因子(例如，IL-4,IL-5,IL-6和IL-10)傾向于促成誘導體液免疫應答。應用本文提供的疫苗之后，患者將支持包括Thl-和Th2-型的應答的免疫應答。在一個實施方式中，其中應答主要是Thl-型，Thl-型細胞因子的水平將提高到高于Th2-型細胞因子的水平的程度。可利用標準測定容易地評價這些細胞因子的水平。對于細胞因子家力矣^l纟宗述，見Mosmann&Coffman,jww.尺ev./mmwwo/.7:145-173(1989)。適于用于主要引發(fā)Thl-型響應的佐劑包括，例如，單膦?；|A,例如，3-脫-0-酰化單膦?；|A(3D-MPL),與鋁鹽一起的組合。MPL佐劑可獲自CorixaCorporation(現(xiàn)在是GlaxoSmithKline的一部分；見美國專利號4,436,727;4,877,611;4,866,034和4,912,094)。包含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷是未曱基化的)也主要誘導Thl應答。所述寡核苷酸是公知的，并且描述于例如，WO96/02555,WO99/33488和美國專利號6,008,200和5,856,462。免疫刺激性DNA序列也被例如Sato等.，273:352(1996)描述。另一適當?shù)淖魟┌碥?，例如QuilA，或其衍生物，包括QS21和QS7(AquilaBiopharmaceuticalsInc.,Framingham，MA);七葉皂苷；毛地黃皂苦；或絲石竹(G_y/wo//n7a)或昆諾藜(C7zewo/0(i/謂拜'woa)皋苦。其他適當?shù)闹苿┌ㄔ诒景l(fā)明的佐劑組合中的超過一種的皂苷，例如包含下列的組中的至少兩種的組合QS21,QS7,QuilA,(3-七葉皂苷或毛地黃皂苷。或者，皂苷制劑可與由下列物質組成的疫苗載體組合殼聚糖或其他聚陽離子聚合物，聚交酯和聚交酯-共-乙交酯顆粒，基于聚-N-乙酰葡糖胺聚合物基質，由多糖或化學修飾的多糖組成的顆粒，脂質體和基于脂質的顆粒，由甘油單酯組成的顆粒等。皂苷還可在膽固醇存在下配制，以形成顆粒結構例如脂質體或ISCOMs。而且，皂香可與聚氧乙烯醚或酯一起配制，配制為非顆粒溶液或懸浮劑，或顆粒結構例如少層的脂質體或ISCOM。皂苷還可與賦形劑例如CarbopoP—起配制以提高粘性，或可利用粉末賦形劑例如乳糖配制為干燥粉末形式。在一個實施方式中，佐劑系統(tǒng)包括單磷酰脂質A和皂苷衍生物的組合，例如QS21和3D-MPL⑧佐劑的組合，如WO94/00153所述，或更少反應原性的組合物，其中用包含膽固醇的脂質體抑制QS21,如WO96/33739所述。其他適當?shù)闹苿┌腿閯┖蜕?。利用在水包油乳劑中的QS21,3D-MP1^佐劑和生育酚的另一適當?shù)淖魟┲苿┟枋鲇赪O95/17210。另一增強的佐劑系統(tǒng)涉及如WO00/09159所述的包含CpG的寡核苷酸和皂苷衍生物的組合，特別是CpG和QS21的組合。適當?shù)兀苿┝硗獾匕腿閯┖蜕?。其他適當?shù)淖魟┌∕ontanideISA720(Seppic,France),SAF(Chi跳California,UnitedStates),ISCOMS(CSL),MF-59(Chiron),SBAS系列佐劑(SmithKlineBeecham,Rixensart,Belgium)，Detox(Corixa),RC-529(Corixa)和其他氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGPs),例如在未決美國專利申請系列號08/853,826和09/074,720中描述的那些，其全文通過援引并入本文，和聚氧乙烯醚佐劑例如WO99/52549A1中描述的那些。SmithKlineBeecham和CorixaCorporation現(xiàn)在為GlaxoSmithKline的部分。其他適當?shù)淖魟┌ㄍㄊ?I)的佐劑分子HO(CH2CH20)n-A-R其中n是1-50，A是鍵或-C(O)-,R是Cwo烷基或苯基d-5o烷基。感興趣的進一步的佐劑是志賀菌毒素b鏈，例如如W02005/112991中所述地利用的。本發(fā)明的一個實施方式由疫苗制劑組成，所述疫苗制劑包含通式(I)的聚氧乙烯醚，其中n在l到50之間，優(yōu)選4-24,最優(yōu)選9;R成分是d-5。，優(yōu)選C4-C2。烷基，并且最優(yōu)選C2烷基，并且A是鍵。聚氧乙烯醚的濃度應在0.1-20%的范圍，優(yōu)選從0.1-10%,并且最優(yōu)選0.1-1%。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自下列組聚氧乙烯-9-月桂基醚，聚氧乙烯-9-硬脂基醚，聚氧乙烯-8-硬脂基醚，聚氧乙烯-4-月桂基醚，聚氧乙烯-35-月桂基醚，和聚氧乙烯-23-月桂基醚。聚氧乙烯醚例如聚氧乙烯月桂基醚描述于Merckindex(12thedition:entry7717)。這些佐劑分子描述于WO99/52549?？衫脤е驴乖?，.免疫應答增強劑和適當?shù)妮d體或賦形劑的組合的公知方法制備本文提供的任何疫苗。本文所述的組合物可作為持續(xù)釋放制劑(即，例如膠嚢，海綿或凝膠(例如由多糖組成)的制劑，其在給藥后影響化合物的緩慢釋放)的部分而給藥。所述制劑通?？衫霉夹g制備(見例如，Coombes等，J^cc,"e14:1429-1438(1996))并且通過例如，口力良，直腸或皮下纟直入，或通過在期望的革G位點一直入而給藥。持續(xù)釋放制劑可包含分散于載體基質和/或包含于由控制速率的膜包裹的儲存體中的多肽，多核苷酸或抗體。用于所述制劑的載體是生物兼容的，并且還可是生物可降解的；優(yōu)選制劑提供相對恒定水平的活性成分釋放。所述載體包括聚(交酯-共-乙交酯)，聚丙烯酸酯，乳膠，淀粉，纖維素，葡聚糖等的微粒。其他的延遲釋放載體包括超分子生物載體，其包含非液體親水性核(例如，交聯(lián)多糖或寡糖)和，任選地，包含兩性化合物的外層，例如磷脂(見例如，美國專利號5,151,254和PCT申請WO94/20078，WO/94/23701和WO96/06638)。包含在持續(xù)釋放制劑中的活性化合物的數(shù)量依賴于植入位點，釋放率和釋放期望持續(xù)期間，待治療或預防的病癥的性質。多種遞送載體中的任何遞送載體可用于藥物組合物和疫苗中以促進靶向腫瘤細胞的抗原特異性免疫應答的產生。遞送載體包括抗原呈遞細胞(APCs),例如，樹突狀細胞，巨噬細胞，B細胞，單核細胞和可被工程化為有效的APCs的其他細胞。所迷細胞可，但不需要，被遺傳修飾以提高用于呈遞抗原的的能力，以改進T細胞應答的活化和/或維持，本身具有抗腫瘤效果和/或與接受體免疫學兼容(即，匹配的HLA單元型)。APCs通?？蓮亩喾N生物液和器官中的任何生物液和器官分離，包括腫瘤和肺瘤周圍組織，并且可以是自體(autologous),同種異體(allogeneic),同系(syngeneic)或異種(xenogeneic)細月包。本發(fā)明的某些實施方式利用樹突狀細胞或其祖細胞作為抗原呈遞細胞。樹突狀細胞是高度有效的APCs(Banchereau&Steinman，A^,w"瘤免疫性的生理佐劑是有效的(見Timmerman&Levy,」朋，Aev.A/^/.50:507-529(1999))。通常，樹突狀細胞可基于它們典型的形狀(原位為星形，體外可見顯著的細胞質過程(樹突狀物(dendrites))),它們高效吸收，加工和呈遞抗原的能力，和它們活化原初T細胞應答的能力而鑒定。樹突狀細胞當然可一皮體內或離體(exvivo)工程化以表達樹突狀細胞中通常沒有發(fā)現(xiàn)的特異性細胞表面受體或配體，并且所述修飾的樹突狀細胞是本發(fā)明預期的。作為樹突狀細胞的替代，分泌的泡嚢抗原-負載樹突狀細胞可在疫苗中使用(見Zitvogel等，A^w"Mec/.4:594-600(1998))。樹突狀細胞和祖細胞可從外周血，骨髓，腫瘤-浸潤細胞，腫瘤周圍組織-浸潤細胞，淋巴結，脾，皮膚，臍帶血或任何其他適當?shù)慕M織或流體。例如，可通過添加細胞因子例如GM-CSF,IL-4,IL-13和/或TNFa的組合離體分化樹突狀細胞，以培養(yǎng)收獲自外周血的單核細胞?；蛘?，可通過向培養(yǎng)基中添加GM-CSF,IL-3,TNFa，CD40配體，LPS,flt3配體和/或誘導樹突狀細胞的分化，成熟和增殖的其他化合物而將收獲自外周血，臍帶血或骨髓的CD34陽性細胞分化為樹突狀細胞。樹突狀細胞便利地分類為"未成熟"和"成熟"細胞，其允許一種分辨兩種很好表征的表型的簡單方法。然而，這種命名法不應構建為排除所有可能的分化的中間階段。未成熟樹突狀細胞表征為具有抗原吸收和加工的高能力的APC,其與Fcy受體和甘露糖受體的高表達相關。這種成熟的表型典型地表征為這些標記的低表達，但是對T細胞活化起作用的細胞表面分子，例如I類和II類MHC,粘附分子(例如，CD54和CD11)和共刺激分子(例如，CD40,CD80,CD86和4-1BB),的高表達。APCS通常可用編碼蛋白(或其部分或其他變體)的多核苷酸轉染，使得多肽，或其免疫原性部分，在細胞表面上表達。如本文所述，所述轉染可離體發(fā)生，并且包含所述轉染細胞的組合物或疫苗可然后用于治療目的。或者，靶向樹突狀或其他抗原呈遞細胞的基因遞送載體可被給予患者，導致體內發(fā)生的轉染。樹突狀細胞的體內和離體轉染，例如，通常可利用本領域已知的任何方法實施，例如WO97/24447中描述的那些，或者Mahvi等，/mm麗o/ogy朋dCe〃AWog少75:456-460(1997)描述的基因槍方法。樹突狀細胞的抗原負載可通過用多肽，DNA(棵的或在質粒載體中)或RNA;或用表達抗原的重組細菌或病毒(例如，牛痘，鳥痘，腺病毒或慢病毒載體)培養(yǎng)樹突狀細胞或祖細胞而獲得。負載之前，多肽可共價綴合于提供T細胞輔助的免疫學伴侶(例如，載體分子)。或者，可用非綴合免疫學伴侶脈沖樹突狀細胞，獨立于多肽或在多肽存在下。疫苗和藥物組合物可存在于單元劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿或小瓶。所述容器優(yōu)選氣密地(hermetically)密封以保持制劑的無菌性直至使用。通常，制劑可儲存為懸浮劑，溶液或在油或水載體中的乳劑?；蛘撸呙缁蛩幬锝M合物可儲存在僅僅需要在使用前立刻添加無菌水載體的冷凍干燥條件下。實施例限制。本S域技術人員將認識到描i二多、種非關鍵參數(shù)可被修改以產生類似結果。實施例1:Ct-089,Ct-858和Ct-875序列對比沙眼衣原體血清型E是普通的眼殖血清型并且被選作其他序列比較的基礎。已經(jīng)利用可獲自Lasergene軟件包，5.0版(DNASTAR,Inc.,Madison，WI銷售)的CLUSTALW程序實施了用于比4交的氨基酸序列多重比對。基礎多重比對算法涉及三步法所有序列對分別排列以計算產生每對序列的分歧的距離矩陣，然后從距離矩陣計算引導樹69(guidetree)并且最后根據(jù)引導樹漸進比對序列。CLUSTALW算法描述于77zom/^o"等，M/c.22,"73畫W朋(799力。比對顯示于圖1,2a/2b和3a/3b。T-輔助細胞表位是結合HLAII類分子和被T-輔助細胞識別的肽。存在于來自血清型E的Ct-089,Ct-858和Ct-875沙眼衣原體多肽之上的推定的T-輔助細胞表位的預測，是基于&wrm'o/o等，AtowreS/o/ec/z./7;555-56/(7M力描述的TEPITOPE方法。包含良好的，潛在T-細胞表位的肽在圖1，2a/2b和3a/3b中高亮顯示。實施例2:在小鼠中引發(fā)針對眼沙眼衣原體感染的保護性免疫應答實驗概述利用配制在佐劑中的來自血清型E的Ct-089,Ct-858和Ct-875蛋白的組合接種雌性C57BL/6和C3H小鼠(兩種或三種肌肉內免疫，利用兩種不同的劑量水平)。利用佐劑中來自血清型A或K的UV減毒原體接種陽性對照組。陰性對照組僅僅利用佐劑接種。通過用眼血清型A，B或眼陰道血清型K的單獨眼攻擊感染小鼠。通過利用眼拭子監(jiān)測感染過程。方法測試個體從CharlesRiverLaboratories(Wilmington,Massachusetts)獲得240只，6周齡的雌性小鼠(由144只C3H小鼠和96只C57BL/6小鼠組成)。動物被分為30組，每組8只小鼠(18組C3H小鼠和12組C57BL/6小鼠)。6個實驗組的C3H小鼠被用于利用血清型A，B或K中的每種進行攻擊。6個實驗組的C57BL/6小鼠被用于利用血清型A或K中的每種進纟于攻擊。每個亞組中4組小鼠被根據(jù)本發(fā)明進行免疫(2或3種免疫，低或高劑量)。每個亞組中剩余的兩組被用于具有在佐劑中的UVEB或僅僅佐劑的對照。每組小鼠單獨關籠并且在12小時黑夜/12小時光亮的循環(huán)下飼養(yǎng)。細菌制備活原體(EB)沙眼衣原體血清型A,B和K獲自美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC)并且在用于小鼠攻擊之前擴增。原始儲存滴度是血清型K1.2xl07IFU/ml，血清型B1.4x107IFU/ml并且血清型A1.92x109IFU/ml。儲存的血清型在75cm2培養(yǎng)瓶中的McCoy細胞中培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶中的匯合細胞單層用各自的血清型接種，在2000rpm下旋轉1小時并且在補充了10%胎牛血清，lmM丙酮酸鈉，lxMEMNEA酸，50uMBme卩-巰基乙醇，10mg/L的制霉菌素和10mg/L的萬古霉素的RPMI1640中在具有5%(:〇2在37°C下培養(yǎng)48小時。在感染之前添加1ug/ml的環(huán)己酰胺(環(huán)己酰胺是蛋白合成抑制劑，其促成衣原體復制以建立感染)。衣原體原體(EB)通過用5mm玻璃珠裂解細胞單層而在感染后收獲，并且在-80。C下在SPG中冷凍。為獲得高滴度，在培養(yǎng)瓶中的McCoy細胞單層上培養(yǎng)血清型至少4循環(huán)。不實施半純化，除非每個培養(yǎng)瓶中90到100%的細胞在光學顯微鏡法下檢查時被感染。來自至少20只75cn^感染培養(yǎng)瓶的存活原體利用梯度超速離心在初始30%的泛影鈉梯度上和其次在52%，44%和40%的泛影鈉梯度上半純化。兩次洗滌之后最終的沉淀小丸重懸浮于冷凍小瓶中的SPG(75g蔗糖，0.52g磷酸鉀，2.3g磷酸氫二鈉七水合物和0.72g谷氨酸，PH7.5,無菌)中并且在-80。C冷凍用于以后的利用。UV-減毒原體(UVEB)為控制免疫的目的，純化的血清型A和K原體在UV光下失活。EB懸浮液的薄層在UV燈下(Sanyogermicidallamp)離燈1英寸直接置于六孔板中1小時。UVEBs根據(jù)通過BCA蛋白測定確定的蛋白成分被標準化，分成等分試樣并且冷凍。用于血清型A的儲存的UVEB的濃度是249.3ug/ml并且對于血清型K是5145ug/ml。UVEB的存活性測試在McCoy細胞單層上實施。疫苗制備佐劑對照利用的佐劑是基于包含3D-MPL,QS21和膽固醇的脂質體制劑。佐劑溶液的最終組合物是3D-MPL100ug/mlQS21100ug/mlDOPC2mg/ml(DOPC=二油酰基石粦脂酰膽石咸)膽固醇0.5mg/ml磷酸鹽緩沖鹽從9mMNa2HP04,48mMKH2P04和100mMNaCl在pH6.1下制備。脂質，月旦固醇和3D-MPL的混合物在有機溶劑中制備，其然后在真空下干燥。PBS然后被添加并且振蕩容器直至形成懸浮液。這種懸浮液然后被微流體化直至獲得大約100nm的脂質體大小(表示為小的單層嚢或SUV)。接下來，通過通過0.2um濾器使SUV無菌。無菌SUV與適當量的水QS21(2mg/ml濃度)混合并且添加磷酸鹽緩沖鹽以獲得最終期望的濃度。必要時然后利用氫氧化鈉或鹽酸將PH調節(jié)到6.1(+/-0.1)。在佐劑中的UVEB通過混合50ul需要的UVEB(即，調節(jié)到20ug/ul的儲存的UVEB濃度)與50ul的兩倍強度佐劑而將10ug的UVEB配制為100ul體積。在佐劑中的Ct-089,Ct-858和Ct-875蛋白利用傳統(tǒng)方法制備蛋白抗原。簡短的說，適當?shù)拇竽c桿菌菌抹BL21plysE,Tuner(DE3)和BL21plysS分別被Ct-089,Ct-858和Ct-875表達質粒轉化，并且在適當?shù)目股剡x擇培養(yǎng)基上生長。產生的表達克隆用于樣B秀導(mini-induction)方案，并且通過SDS-PAGE分析蛋白產量。如果在這過程中細胞生長良好，并且足以在考馬斯亮藍染色的SDS凝膠上被檢測的量的蛋白被異丙基-P-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導，則在大規(guī)模誘導實驗(IPTG,lmM)中利用該克隆。細胞在CHAPS溶液中裂解和離心之后，等份試樣的可溶和沉淀小丸部分被通過SDS-PAGE分析以確定大多數(shù)感興趣蛋白是在沉淀小丸中還是在可溶部分中。包含大多數(shù)每種抗原的部分進行Ni-NTA柱純化(在蛋白適當增溶之后)。等份試樣的制劑，包括來自Ni-NTA結合之前，柱流過，柱洗滌，和柱洗脫部分的物質，凈皮通過SDS-PAGE分析。包含洗脫蛋白的部分^皮組合，對10mMTrispH8或pHIO透析，過濾無菌化，并且濃縮。BCA蛋白測定被用于濃縮的Ct蛋白部分，并且通過SDS-PAGE評價純度。制備了具有佐劑(如上所述)的包含來自沙眼衣原體血清型E的Ct-089,Ct-858和Ct-875的兩種組合物。第一種(失敗劑量)在100ul組合物中具有1.25ug每種蛋白抗原，第二種(高劑量)在lOOul組合72物中具有5ug每種蛋白。免疫和攻擊麻醉免疫之前，通過每只小鼠腹膜內給予30ul的可注射麻醉劑(Ketaject-Xylaject1:1劑量)麻醉小鼠。眼攻擊和眼擦拭之前，通過每只小鼠腹膜內給予30ul并且每只大腿肌肉內20ul的可注射麻醉劑(Ketaject-Xylaject1:1劑量)麻醉小鼠0免疫在第0,21和42天(當適當時)，一次，兩次或三次進行免疫。利用每只小鼠總體積100ul,每只大腿注射50ul的制劑，肌肉內注射小鼠。根據(jù)本發(fā)明接受治療的小鼠組被利用在100ul佐劑制劑中的示例性的三種沙眼衣原體蛋白(Ct-089,Ct-858和Ct-875,對于低劑量每種1.25ug,對于高劑量每種5ug)的組合疫苗進行肌肉內免疫。在第0，21天并且對于接受三種劑量的那些還在第42天利用兩種或三種劑量免疫治療小鼠。小鼠陽性對照組利用100ul佐劑制劑中的10ug的UVEB肌肉內免疫，在第0天并且對于接受三種劑量的那些還在第21和42天接受免疫。陰性對照組利用100ul佐劑制劑肌肉內免疫，在第0,21和42天接受三次免疫。攻擊來自血清型A,B或K的新鮮解凍的沙眼衣原體EB等份試樣每種分別在冷SPG緩沖液中稀釋到5ul中5xl03IFU的最終濃度。接種物在接種過程中保持在水上。深度麻醉的小鼠在第70天用5xl03IFU的適當血清型攻擊，每眼5ul，對每眼利用新的無菌移液管吸頭通過利用微量移液管局部應用到上官窿。感染監(jiān)測眼暴露之后的感染過程通過在攻擊之后第7，14和21天實施眼擦拭并且從IFU的存在下分析拭子而監(jiān)測。在實馬企末端，通過在深度麻醉之下心臟穿刺而實施末端流血(從每只小鼠獲得多至lml的血)。樣品立刻被加工并儲存在-20°。然后利用C02使小鼠安樂死。拭子拭子(無菌聚酯頂端涂抹器)在它們分別的冷凍小瓶中在lml的SPG中預濕潤。每只小鼠深度麻醉時，每種拭子在結膜和眼瞼上旋轉每區(qū)域30轉。拭子然后置于分別的冷凍小瓶中并且置于千冰中。包含拭子的冷凍小瓶儲存在-80。C下。拭子的滴定利用包含在具有環(huán)己酰胺(lug/ml)的培養(yǎng)基中的McCoy匯合單層的24-孔板實施。一旦解凍，包含拭子的冷凍小瓶在玻璃珠存在下渦旋5分鐘。來自每種包含拭子的冷凍小瓶的100ul被接種于包含在具有環(huán)己酰胺的lml培養(yǎng)基中的McCoy細胞單層的相同24孔板上的一個孔中。在2000rpm下離心1小時之后，板在37°C和5%C02下培養(yǎng)。單層在感染后48小時在甲醇中混合，并且被伊文思藍和FITC-綴合抗-沙眼衣原體抗體染色。通過反向熒光顯微鏡法檢查單層的內含物。用于計算每拭子IFU數(shù)量的方法由計數(shù)在熒光顯微鏡下全部的孔并且然后乘以稀釋因子10組成。當沒有觀察到內含體時，在檢測界限10之下的任意數(shù)值(通常7)被用于表示IFU/拭子的數(shù)量。ELISA在血清樣品上實施酶聯(lián)免疫吸附測定。分別稀釋于0.1M磷酸鹽緩沖鹽(PBS)KPL包被溶液濃縮物(pH7.2到7.4)的完整A或KEB作為抗原(106FU/孔)。在用PBS-0.05°/。Tween,1%BSA阻斷之后進行血清的連續(xù)稀釋(l:2),然后在PBS-0.05%Tween中連續(xù)洗滌和添加磷酸酶綴合的笫二抗體到孔IgG+IgM+IgA(Kirkegaard&Perry,Gaithersburg,MD)。用二乙醇胺底物緩沖液(KPLp-NPP微孔底物系統(tǒng))中的硝基苯基磷酸酯進行反應，并且在30到60分鐘后讀取每孔(OD405)的吸附率。治療概述<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>結果圖4到6顯示了存在于在攻擊之后第7,14和21天分別取樣的眼拭子上IFU的數(shù)量。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析導致下列關鍵性的觀察陰性對照(僅僅佐劑)和陽性對照(在佐劑中的UVEB)組的對非配對T檢驗顯示在用血清型A攻擊之后第7，14和21天在C3H小鼠中UVEBA免疫提供了與僅僅使用佐劑相比統(tǒng)計學顯著的保護(p<0.0001)。非配對T4企-驗顯示在用血清型A攻擊之后第7,14和21天在C57BL/6小鼠中UVEBA免疫提供了與僅僅使用佐劑相比統(tǒng)計學顯著的保護(第7天p=0.0019，第14和21天p<0.0001)。在第7,14和21天，Anova-Dunnett，s多重比較檢驗顯示用血清型A攻擊之后在C3H和C57BL/6組中UVEBA免疫提供了與僅僅使用佐劑相比統(tǒng)計學顯著的保護(p〈0.01)。未配對T檢驗顯示在用血清型K攻擊之后第7，14和21天在C3H小鼠中UVEBK免疫提供了與僅僅用佐劑相比統(tǒng)計學顯著的保護(p<0.0001)。未配對T檢驗顯示在用血清型K攻擊之后笫7,14和21天在C57BL/6中UVEBK免疫提供了與僅僅使用佐劑相比統(tǒng)計學顯著的保護(pO.OOOl)。在第7,14和21天，Anova-Dunnett，s多重比較檢驗顯示用血清型K攻擊之后在C3H和C57BL/6組中UVEBK免疫提供了與僅僅使用佐劑相比統(tǒng)計學顯著的保護(pO.Ol)。陰性對照與治療組(即，高劑量x3免疫)的比較比較陰性對照(即，僅僅佐劑)和利用Ct-089,Ct-858和Ct-875蛋白的組合根據(jù)本發(fā)明免疫的未配對T檢驗顯示了在第7，14和21天時在C3H和C57BL/6小鼠中用血清型A或血清型K攻擊之后賦予的保護中的顯著差別(pO.OOOl)。比較陰性對照(即,僅僅佐劑)和利用Ct-089,Ct-858和Ct-875蛋白的組合根據(jù)本發(fā)明的免疫的Anova-Tukey，s檢驗顯示了在第7,14和21天時在C3H小鼠中用血清型B攻擊之后賦予的保護中的顯著差別(pO.OOl)。在第7,14和21天時，Anova-Dunnett，s多重比較檢驗顯示了在用血清型A攻擊之后在C3H和C57BL/6小鼠中由陰性對照賦予的保護當與組合治療相比時的顯著的統(tǒng)計學差異(pO.Ol)。陽性對照與三重免疫高劑量治療組的比較在第7,14和21天，Anova-Dunnett，s多重比較檢驗顯示在用血清型A攻擊之后在C3H和C57BL/6小鼠中在陽性對照(即，UVEB免疫)和對應的組合治療之間沒有顯著的統(tǒng)計學差異(pX).05)。在第7,14和21天，Anova-Dunnett，s多重比較檢驗顯示在用血清型K攻擊之后在C3H和C57BL/6小鼠中在陽性對照(即，UVEB免疫)和對應的組合治療之間沒有顯著的統(tǒng)計學差異(pX).05)。在第7,14和21天，Anova-Dunnett，s多重比較檢驗顯示在用血清型B攻擊之后在C3H小鼠中在陽性對照(即，UVEB免疫)和對應的組合治療之間沒有顯著的統(tǒng)計學差異(pX).05)。結論僅僅佐劑(陰性對照)不能賦予針對眼感染的保護。來自血清型A或K的在佐劑中的UVEBs(陽性對照)在兩種小鼠林中在所有時間點分別賦予了針對用血清型A和K的眼感染的保護。當提供了三種高劑量免疫時，用根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物的治療(在每個例子中其源于血清型E)產生了在在所有時間點在每只小鼠抹中針對用血清型A或血清型K的眼感染的統(tǒng)計學顯著的保護。在C3H小鼠中血清型B攻擊中觀察到類似的保護水平，盡管沒有進行統(tǒng)計學分析確認這種結果的顯著性。兩種高劑量的免疫在所有例子中提供了相對于三種低劑量免疫改進的保護。(等同于UVEB)，它能夠引發(fā)針對免疫原性組合物來源的血清型之外的血清型的保護(即，血清型感染的交叉血清型保護)。而且，所述保護可通過非眼途徑給藥而獲得。本申請中提到的所有參考文獻，包括專利和專利申請，在最大可能程度上通過援引并入本文。貫穿本說明書和所附的權利要求書，除非上下文另外要求，"包含"，"包括"及變體將被理解為暗示包括所述的整數(shù)，步驟，整數(shù)組或步驟組，但不排除任何其他整數(shù)，步驟，整數(shù)組或步驟組。本說明書和權利要求書形成其部分的本申請可用于任何后續(xù)申請的優(yōu)先權基礎。所述后續(xù)申請的權利要求可涉及本文所述的任何特征或特征組合。它們可采取產品，組合物，方法或用途權利要求的形式，并且可包括，通過舉例和不限制的方式，下述權利要求。權利要求1.用于治療或預防眼沙眼衣原體感染的方法，該方法包括給予安全和有效量的免疫原性組合物，所述組合物包含一種或更多種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白、其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。2.用于治療或預防眼沙眼衣原體感染的免疫原性組合物，其包含一種或更多種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白、其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。3.—種或更多種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白、其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸在制4.根據(jù)權利要求1到3任一項的方法，組合物或用途，其中所述免疫原性組合物包含兩種或更多種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白、其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。5.根據(jù)權利要求1到4任一項的方法，組合物或用途，其中免疫原性組合物是經(jīng)眼給予。6.根據(jù)權利要求1到4任一項的方法，組合物或用途，其中免疫原性組合物是非經(jīng)眼給予。7.根據(jù)權利要求1到6任一項的方法，組合物或用途，其中免疫原性組合物包含Ct-089。8.根據(jù)權利要求1到6任一項的方法，組合物或用途，其中免疫原性組合物包含Ct-858。9.根據(jù)權利要求1到6任一項的方法，組合物或用途，其中免疫原性組合物包含Ct-875。10.根據(jù)權利要求1到6任一項的方法，組合物或用途，其中免疫原性組合物包含Ct-858和Ct-875。11.根據(jù)權利要求10的方法，組合物或用途，其中免疫原性組合物包含Ct-089,Ct-858和Ct國875。12.根據(jù)權利要求1到11任一項的方法，組合物或用途，其中免疫原性組合物進一步包含藥學上可接受的稀釋劑或載體。13.根據(jù)權利要求1到12任一項的方法，組合物或用途，其中免疫原性組合物進一步包含佐劑。14.根據(jù)權利要求13的方法，組合物或用途，其中佐劑是Thl應答的優(yōu)先刺激劑。15.根據(jù)權利要求14的方法，組合物或用途，其中佐劑包含3D-MPL、QS21或3D-MPL和QS21的組合。16.根據(jù)權利要求15的方法，組合物或用途，其中佐劑進一步包含水包油乳劑。17.根據(jù)權利要求15的方法，組合物或用途，其中佐劑進一步包含脂質體。18.根據(jù)權利要求1到17任一項的方法，組合物或用途，其中兩種或更多種蛋白或免疫原性片段被連接以形成融合蛋白，或編碼蛋白或免疫原性片段的多核苷酸編碼兩種或更多種蛋白或免疫原性片段的融合體。19.根據(jù)權利要求1到18任一項的方法，組合物或用途，其中免疫原性組合物包含下列衣原體多肽或其免疫原性片段或編碼它們的多核苷酸的組合中的一個，條件是所有組合都包含Ct-858和Ct-875成分.1.Swib、Momp、PmpDpd、Ct-858、PmpGpd和Ct-875中的五種.2.PmpDpd、Ct-858、Ct-0875、Swib中的三種.3.Momp、PmpDpd、Ct-858、Ct國622、Ct-875和Swib中的五種.4.Momp、PmpDpd、Ct-858、PmpGpd、Ct-622和Ct垂875中的五種.5.Ct-858、Ct-875、Ct曙622和Ct-089中的三種.6.PmpDpd、Ct-858、Ct-875、Ct-089中的三種.7.Momp、PmpD、Ct-858、PmpGpd和Ct-875中的四種。20.根據(jù)權利要求1到18任一項的方法，組合物或用途，其中免疫原性組合物包含下列衣原體多肽或其免疫原性片段或編碼它們的多核香酸的組合中的一個la.Momp、PmpDpd、Ct-858、Ct-875、Swib、Ct畫0892a.PmpDpd、Ct-858、Ct-875、Swib、Ct-0893a.Momp、PmpDpd、Ct-858、Ct誦622、Ct-875、Swib、Ct-0894a.Momp、PmpDpd、Ct-858、PmpGpd、Ct-622、Ct-875、Ct-0895a.Ct-858、Ct-8756a.Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-0897a.Momp、Ct-858、Ct-8758a.Momp、PmpD、Ct-858、PmpGpd、Ct-875、Ct-0899a.PmpDpd、Ct-858、Ct-875、Ct-089。21.根據(jù)權利要求1到18任一項的方法，組合物或用途，其中免疫原性組合物包含Momp、Ct-089、Ct-858、Swib和PmpDpd多肽或其免疫原性片段或編碼它們的多核苷酸。22.源于第一沙眼衣原體血清型的選自0089、Ct-858和Ct-875的一種或更多種沙眼衣原體蛋白、其免疫原性片段或編碼它們的多核普酸在制備用于治療或預防由第二沙眼衣原體血清型導致的眼衣原體感染的免疫原性組合物中的用途。23.用于治療或預防由第二沙眼衣原體血清型導致的眼衣原體感染的方法，該方法包括給予包含源于第一沙眼衣原體血清型的選自Ct-089、Ct-858和Ct-875的一種或更多種衣原體蛋白、其免疫原性片段或編碼它們的多核芬酸的免疫原性組合物。24.根據(jù)權利要求22或23的用途或方法，其中免疫原性組合物包含選自Ct-089、Ct-858和Ct-875的一種蛋白、其免疫原性片段或編碼它們的多核苷酸。25.4艮據(jù)權利要求22到24任一項的用途或方法，其中免疫原性組合物包含選自Ct-089、Ct-858和Ct-875的兩種蛋白，其免疫原性片段或編碼它們的多核苦酸。26.根據(jù)權利要求25的用途或方法，其中免疫原性組合物包含Ct-089和Ct-858,其免疫原性片段或編碼它們的多核普酸。27.根據(jù)權利要求26的用途或方法，其中免疫原性組合物包含Ct-089和Ct-875,其免疫原性片段或編碼它們的多核苷酸。28.根據(jù)權利要求25的用途或方法，其中免疫原性組合物包含Ct-858和Ct-875,其免疫原性片段或編碼它們的多核苷酸。29.根據(jù)權利要求22到28任一項的用途或方法，其中免疫原性組合物包含Ct-089、Ct-858和Ct-875,其免疫原性片l殳或編碼它們的多核苷酸。30.根據(jù)權利要求22到29任一項的用途或方法，其中第一沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體血清型A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、Ja、K、Ll、L2和L3。31.根據(jù)權利要求22到30任一項的用途或方法，其中沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體眼血清型。32.根據(jù)權利要求31的用途或方法，其中第一沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體眼血清型A、B、Ba和C。33.根據(jù)權利要求22到30任一項的用途或方法，其中第一沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體眼殖血清型。34.根據(jù)權利要求33的用途或方法，其中第一沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體眼殖血清型D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、Ja和K。35.根據(jù)權利要求22到30任一項的用途或方法，其中第一沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體LGV血清型。36.根據(jù)權利要求35的用途或方法，其中第一沙眼衣原體血清型選自沙眼衣原體LGV血清型Ll、L2和L3。37.根據(jù)權利要求22到36任一項的用途或方法，其中選擇第一沙眼衣原體血清型使得它是與大多數(shù)其他沙眼衣原體血清型具有高水平的序列同一性的沙眼衣原體血清型。38.根據(jù)權利要求22到37任一項的用途或方法，其中選擇沙眼衣原體血清型使得它是與大多數(shù)常見沙眼衣原體血清型具有高水平的序列同一性的沙眼衣原體血清型。39.根據(jù)權利要求22到38任一項的用途或方法，其中第一和第二沙眼衣原體血清型是與相同疾病狀態(tài)相關的沙眼衣原體血清型。40.根據(jù)權利要求22到38任一項的用途或方法，其中第一和第二沙眼衣原體血清型是與不同疾病狀態(tài)相關的沙眼衣原體血清型。41.根據(jù)權利要求22到40任一項的用途或方法，其中免疫原性組合物包含一種或更多種另外的抗原。42.根據(jù)權利要求41的用途或方法，其中一種或更多種另外的抗原是沙眼衣原體抗原。43.根據(jù)權利要求41或42的用途或方法，其中一種或更多種另外的4元原選自Momp、Ct-622、PmpGpd和PmpDpd。44.根據(jù)權利要求22到43任一項的用途或方法，其中免疫原性組合物進一步包含佐劑。45.根據(jù)權利要求44的用途或方法，其中佐劑是Thl應答的優(yōu)先刺激劑。46.根據(jù)權利要求45的用途或方法，其中佐劑包含3D-MPL、QS21或3D-MPL和QS21的組合。47.根據(jù)權利要求46的用途或方法，其中佐劑進一步包含水包油乳劑。48.根據(jù)權利要求46的用途或方法，其中佐劑進一步包含脂質體。全文摘要治療或預防沙眼衣原體感染的方法，該方法包括給予安全和有效量的免疫原性組合物，所述組合物包含一種或更多種選自Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpG的過客域(PmpGpd)和PmpD的過客域(PmpDpd)的沙眼衣原體蛋白、其免疫原性片段或編碼所述蛋白或片段的多核苷酸。文檔編號A61K39/118GK101522215SQ200780037316公開日2009年9月2日申請日期2007年10月3日優(yōu)先權日2006年10月4日發(fā)明者J·-F·L·邁松納夫,M·阿爾德森,P·普羅布斯特,P·梅滕斯,R·科勒,S·里德,Y·洛貝申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司;科里克薩公司