專(zhuān)利名稱(chēng)：：生物材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的合成骨材料領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及用于組織工程的包含例如膠原蛋白、磷酸鉤以及任選地糖胺聚糖的分層支架。
背景技術(shù)：
：天然骨是膠原蛋白、非膠原蛋白有機(jī)相(包括糖胺聚糖)以及磷酸鈣的生物復(fù)合物。其復(fù)雜的分層結(jié)構(gòu)導(dǎo)致出色的機(jī)械性質(zhì)，包括高硬度、高強(qiáng)度和高斷裂韌度，其進(jìn)而使得骨能夠承受它們每日所經(jīng)受的生理壓力。本領(lǐng)域的研究人員所面臨的挑戰(zhàn)是制備一種合成材料，其具有允許在人或動(dòng)物體內(nèi)天然骨生長(zhǎng)于所述合成材料內(nèi)和其周?chē)慕M成和結(jié)構(gòu)。已經(jīng)觀(guān)察到骨通過(guò)在身體環(huán)境中形成的類(lèi)骨磷灰石層直接與人體內(nèi)的磷酸鈣結(jié)合(此性質(zhì)稱(chēng)為生物活性)。另一方面，已知膠原蛋白與包含膠原蛋白和其它生物有機(jī)物(例如糖胺聚糖)的共聚物是多種細(xì)胞類(lèi)型(包括負(fù)責(zé)人體中骨的形成和維持的那些細(xì)胞類(lèi)型)進(jìn)行粘附和增殖的最佳基質(zhì)。羥磷灰石是最常用作骨替代材料之成分的磷酸鈣。然而，與其它形式的磷酸鈞材料(例如透釣磷石、磷酸三釣和磷酸八鉤)相比較而言，它是相對(duì)難溶的材料。由于磷灰石材料在體內(nèi)的重吸收速率特別慢，因此在制備生物材料時(shí)磷灰石的相對(duì)低溶解度可能是不利的。磷酸鈣(例如羥磷灰石)是機(jī)械硬度高的材料。然而，與天然骨相比較而言它們相對(duì)較脆。膠原蛋白是機(jī)械韌度高的材料，但是與天然骨相比較而言其硬度相對(duì)較低。相比于單獨(dú)的膠原蛋白，包含膠原蛋白與糖胺聚糖之共聚物的材料的韌度和硬度較高，但是與天然骨相比較而言其硬度仍然相對(duì)較低。之前對(duì)制備韌度大于羥磷灰石、硬度大于膠原蛋白及膠原蛋白和糖胺聚糖之共聚物的合成骨替代材料的嘗試包括通過(guò)機(jī)械混合合并膠原蛋白和磷灰石。這種機(jī)械方法描述于EP-A-0164484中。后來(lái)的發(fā)展包括通過(guò)機(jī)械混合羥磷灰石、膠原蛋白和4-硫酸軟骨素來(lái)制備包含這些成分的骨替代材料。這種方法描述于EP-A-0214070中。該文獻(xiàn)還描述了膠原蛋白和4-硫酸軟骨素的脫水熱交聯(lián)。發(fā)現(xiàn)包含磷灰石、膠原蛋白和4-硫酸軟骨素的材料具有良好的生物相容性。機(jī)械混合磷灰石與膠原蛋白以及任選地4-硫酸軟骨素基本上形成被膠原蛋白/4-硫酸軟骨素包裹的磷灰石顆粒。還發(fā)現(xiàn)盡管這種材料是生物相容性的，但是其在人或動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生有限的天然骨的體內(nèi)(in-growth)生長(zhǎng)，并且不重建所述合成材料的磷酸鈣相。以前的工作已經(jīng)開(kāi)發(fā)了可用于控制冷凍干燥方案參數(shù)以制備膠原蛋白和一種或多種糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)之多孔支架的手段。這些技術(shù)允許以受控方式改變支架特征(例如孔徑和長(zhǎng)寬比)，其已知是對(duì)外傷或損傷部位處的愈合響應(yīng)具有顯著影響的參數(shù)。然而，為了治療涉及骨骼和肌肉骨骼缺損的損傷，需要開(kāi)發(fā)制備所具有的材料組成和機(jī)械特性與骨十分接近(這與非礦化的膠原蛋白-GAG支架不同)的多孔支架的技術(shù)。申請(qǐng)人于2006年3月6日提交的較早的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/GB2006/000797涉及用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的材料，具體而言涉及含有例如膠原蛋白、磷酸鉀和任選地糖胺聚糖的多孔整體式支架和多孔分層支架。PCT/GB2006/000797的內(nèi)容還在本文所附的附錄中進(jìn)行闡述以利于更好地理解本發(fā)明。用于組織工程的先進(jìn)支架材料的持續(xù)應(yīng)用和開(kāi)發(fā)表明具有開(kāi)發(fā)分層支架材料的需求。體內(nèi)許多相關(guān)的生理部位包括一種或多種組織類(lèi)型之間的界面。已經(jīng)注意到具體的組織類(lèi)型和細(xì)胞類(lèi)型需要開(kāi)發(fā)具體的支架結(jié)構(gòu)；通常生物活性支架結(jié)構(gòu)在不同組織之間、不同細(xì)胞之間、以及不同用途之間可以有顯著的不同[1。這些現(xiàn)象表明為了治療更復(fù)雜組織中的損傷部位和涉及界面損傷(即軟骨的損傷經(jīng)常還損傷下面的骨，骨或肌肉止點(diǎn)附近的腱和韌帶損傷)的部位，需要開(kāi)發(fā)在支架結(jié)構(gòu)中具有梯度界面和突變界面的支架。特別的，由于外傷、畸形或疾病而被損傷的骨骼部位的修復(fù)帶來(lái)了一系列特定的挑戰(zhàn)。與皮膚、神經(jīng)和大多數(shù)其它組織缺損不同，骨骼缺損涉及多種不同的組織類(lèi)型(即骨、軟骨、腱和韌帶)，涉及承受日常止點(diǎn)，骨/軟-骨界面的"潮標(biāo)")。當(dāng)前的支架制造技術(shù)不包括使用參數(shù)(例如物理結(jié)構(gòu)、機(jī)械性質(zhì)或化學(xué)組成)的突變梯度(sharpgradient)來(lái)制備支架的合適方案。數(shù)量有限的近期努力力求開(kāi)發(fā)出使用多孔分層支架來(lái)治療涉及單獨(dú)軟骨或涉及骨和軟骨二者的損傷(例如關(guān)節(jié)缺損)。這些構(gòu)建物力求同時(shí)誘導(dǎo)骨和軟骨的再生，但是各自使用分開(kāi)的支架[2-9。盡管該新方法很有前景，但是兩個(gè)主要的缺點(diǎn)可能限制了迄今為止所報(bào)道的多層支架的有效性。第一個(gè)缺點(diǎn)涉及用于支架各個(gè)層的材料?？稍傥盏暮铣删酆衔锸怯糜谲浌菍拥奈ㄒ徊牧?，并且在許多這些支架中也經(jīng)常是骨部分的成分。盡管合成聚合物易于制備，但是已知其對(duì)細(xì)胞粘附和增殖的益處比天然聚合物(例如膠原蛋白)要小，并且當(dāng)它們降解時(shí)可釋放高濃度的潛在細(xì)胞毒性的酸物質(zhì)。此外，對(duì)于必須進(jìn)行腱或韌帶修復(fù)的應(yīng)用而言，可再吸收的合成聚合物(不論它們的交聯(lián)方式如何)的強(qiáng)度和硬度不足以承受甚至在康復(fù)鍛煉中所施加的降低的負(fù)荷?，F(xiàn)有多層支架的第二個(gè)缺點(diǎn)涉及各個(gè)層之間的界面。在體內(nèi)，觀(guān)察到膠原蛋白原纖維跨越許多組織(例如天然關(guān)節(jié)和腱/韌帶止點(diǎn))之間界面的連續(xù)性。所得的平滑過(guò)渡體系(軟界面)賦予這些部位以固有的機(jī)械穩(wěn)定性，使得它們能承受生理負(fù)荷而沒(méi)有機(jī)械故障。相反，大多數(shù)現(xiàn)有的分層支架含有硬界面，在兩種不同的材料之間形成明顯的分界線(xiàn)?？p合[7、纖維蛋白粘合劑粘合[3以及其它技術(shù)[4，5用于強(qiáng)化該界面，然而，甚至在受控動(dòng)物模型中也報(bào)道了界面脫粘現(xiàn)象。還值得指出的是這些縫合和粘合方法是精細(xì)的并且重現(xiàn)性差，因此在臨床環(huán)境中可能不實(shí)用。很明顯需要新的技術(shù)來(lái)進(jìn)一步擴(kuò)展制備用于多種用途的具有明確的非均一性質(zhì)的分層支架結(jié)構(gòu)的能力。首先關(guān)心的是開(kāi)發(fā)適當(dāng)?shù)募夹g(shù)來(lái)制備具有適當(dāng)層間結(jié)合的分層支架結(jié)構(gòu)。這對(duì)于用在重機(jī)械負(fù)荷之下從而增加層間分離機(jī)會(huì)的區(qū)域中的支架而言是尤其重要的問(wèn)題。另外至關(guān)重要的是開(kāi)發(fā)用于制備基于膠原蛋白的分層多孔支架的技術(shù)。在大量不同的組織工程研究中已經(jīng)將基于膠原蛋白的支架成功地用作天然細(xì)胞外基質(zhì)的類(lèi)似物；傳統(tǒng)上通過(guò)冷凍干燥制備基于膠原蛋白的支架。在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下固化膠原蛋白、其它可用蛋白質(zhì)以及疼體載體的混懸液，得到由膠原蛋白纖維所圍繞的相互穿插的冰晶網(wǎng)絡(luò)。然后將冷凍的混懸液升華，除去冷凍的液體載體，得到多孔的支架結(jié)構(gòu)。所述支架的孔尺寸由漿的冷凍過(guò)程決定。該制備技術(shù)的顯著優(yōu)點(diǎn)是在整個(gè)支架中觀(guān)察到膠原蛋白纖維的連續(xù)性。然而，為了制備孔徑和形狀差異很大的分層支架，需要非常小心地控制所述溫度環(huán)境。此外，當(dāng)設(shè)法在一步固化步驟中同時(shí)形成所有結(jié)構(gòu)時(shí)，由于混懸液混雜在一起而使得制備具有顯著不同性質(zhì)(例如化學(xué)組成、交聯(lián)密度和材料性質(zhì))的支架變得非常困難。本發(fā)明擴(kuò)展了PCT/GB2006/000797中所述的工作并且其目的在于解決與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的一些問(wèn)題。因此，本發(fā)明提供一種用于制備復(fù)合生物材料的方法，其包括提供基本上是固體的第一成分，其包含膠原蛋白、糖胺聚糖、白蛋白、透明質(zhì)酸(hyaluronan)、殼聚糖和含有膠原蛋白多肽序列之一部分的合成多肽中的一種或多種以及任選地?zé)o機(jī)材料，所述成分至少具有多孔的表面部分；提供一種流體組合物，其包含膠原蛋白、糖胺聚糖、白蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖和含有膠原蛋白多肽序列之一部分的合成多肽中的一種或多種以及液體栽體和任選地?zé)o機(jī)材料；將所述流體組合物與所述第一成分的所述多孔表面部分相接觸；的溫度；通過(guò)升華和/或蒸發(fā)除去至少一些所述多個(gè)固體晶體或顆粒。所述方法還可以包括提供基本上是固體的第二成分，其包含膠原蛋白、糖胺聚糖、白蛋白透明質(zhì)酸、殼聚糖和含有膠原蛋白多肽序列之一部分的合成多肽中的一種或多種以及任選地?zé)o機(jī)材料，所述成分至少具有多孔的表面部分；將所述流體組合物放入所述第一成分和所述笫二成分之間使得其與所述多孔表面部分相接觸；將所述第一成分和所述第二成分之間的所述流體組合物冷卻至使得所述液體載體轉(zhuǎn)變成多個(gè)固體晶體或顆粒的溫度；通過(guò)升華和/或蒸發(fā)除去至少一些所述多個(gè)固體晶體或顆粒，以得到所述第一成分和所述第二成分之間的中間層。本文所用的術(shù)語(yǔ)生物材料意指能與人體或動(dòng)物體生物相容的材料。本文所用的術(shù)語(yǔ)漿(slurry)包括漿、溶液、混懸液、膠體和分散體系。本文所用的術(shù)語(yǔ)膠原蛋白包括重組人(rh)膠原蛋白。本文所用的術(shù)語(yǔ)成分指獨(dú)特區(qū)域，例如具有特定化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)性質(zhì)和/或材料性質(zhì)的支架的獨(dú)特區(qū)域。術(shù)語(yǔ)支架指最終的多成分支架結(jié)構(gòu)，術(shù)語(yǔ)復(fù)合支架和分層支架是同義的，是指含有兩層或更多層的支架，其中每層的材料組成通常基本上不同于其相鄰層的材料成分。術(shù)語(yǔ)單層支架或整體式(monolithic)支架是同義的，是指僅僅含有一層的支架，其中每層中的材料組成大體是均一的。本文所用的術(shù)語(yǔ)多孔意指可含有大孔和/或小孔的材料。所述孔可在表面上以及可延伸到材料本體內(nèi)。大孔隙度通常指大于約IO微米尺度上的孔相關(guān)的特征。小孔隙度通常指小于約10微米尺度上的孔相關(guān)的特征。應(yīng)當(dāng)理解所述材料內(nèi)可以存在開(kāi)放孔和閉合孔的任意組合。例如，所述材料通常既含有大孔又含有小孔。所述大孔隙度通常是開(kāi)放孔的，盡管可能存在閉合孔成分。本發(fā)明的方法包含可以任何次數(shù)重復(fù)應(yīng)用的一系列步驟以制備含有一系列獨(dú)立成分的多孔復(fù)合/分層支架。這些獨(dú)立成分可彼此分開(kāi)進(jìn)行制備，然后通過(guò)任何次數(shù)重復(fù)的共合成過(guò)程連接在一起以形成具有不同結(jié)構(gòu)特征、機(jī)械特征和/或組成特征(例如孔徑、相對(duì)密度、孔形、硬度、化學(xué)組成、交聯(lián)密度、降解速率)之區(qū)域的單個(gè)復(fù)合/分層支架。在組裝較大的復(fù)合/分層支架結(jié)構(gòu)之后，可進(jìn)行任何次數(shù)的制造后加工步驟，包括物理交聯(lián)技術(shù)(例如脫水熱交聯(lián)、紫外交聯(lián))、化學(xué)交聯(lián)技術(shù)(例如基于碳二亞胺的交聯(lián)、基于戊二醛的交聯(lián))或使用混合酶制劑(enzymecocktail)(例如膠原蛋白酶、分散酶)部分降解支架。在使用涉及支架水化的任何處理之后，可使用例如冷凍干燥法除去液體成優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了具有例如可模擬在體內(nèi)所見(jiàn)的支架成分層之間膠原蛋白原纖維連續(xù)性之連續(xù)(軟)界面的制備。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這解決了與在制造后將不同相縫合或粘合在一起相關(guān)聯(lián)的問(wèn)題。本發(fā)明的方法提供了不需要在基本上相同時(shí)間從液態(tài)形成所述個(gè)體支架成分的優(yōu)點(diǎn)。這與將所有漿分層并固化在一起的液相共合成是不同的。以固體形式或基本為固體的形式提供第一成分和第二成分(如果存在的話(huà))。所述第一成分和/或所述第二成分通常包含膠原蛋白和任選地糖胺聚糖。所述第一成分和/或所述第二成分通常包含無(wú)機(jī)材料，例如磷酸鉀材料。實(shí)例包括透鈣磷石、磷酸八鉀和磷灰石中的一種或多種。磷灰石是一類(lèi)含有鉀和磷酸鹽的礦物質(zhì)，其具有以下通式Ca5(P04)3(X)，其中X可以是通常為OET、F和Cr的離子以及本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它離子。術(shù)語(yǔ)磷灰石還包括取代的磷灰石，例如硅取代的磷灰石。術(shù)語(yǔ)磷灰石包括幾磷灰石(磷灰石的具體實(shí)例)。羥磷灰石還可以被其它物質(zhì)(例如硅)取代。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，所述第一成分和/或所述第二成分由膠原蛋白和磷酸鈣材料的共沉淀物形成。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方面，所述第一成分和/或所述第二成分由膠原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物形成。有利地，所述第一成分和/或所述第二成分由膠原蛋白、磷酸鈣材料和糖胺聚糖的三元共沉淀物形成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一成分包含膠原蛋白和糖胺聚糖以及任選地磷酸鈣材料，所述第二成分(如果存在的話(huà))包含膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鈣材料。所述流體組合物通常包含膠原蛋白和任選地糖胺聚糖。所述流體組合物還可包含無(wú)機(jī)材料，例如磷酸釣材料。實(shí)例包括透鉤磷石、磷酸八鈣和磷灰石中的一種或多種。所述液體載體優(yōu)選包含水。所述流體組合物可以混懸液(例如基于膠原蛋白的混懸液或漿)的形式提供。所述混懸液/漿還可包含糖胺聚糖和/或磷酸鈣材料中的一種或兩種。優(yōu)選地，所述流體組合物是包含膠原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物和/或膠原蛋白、磷酸釣材料和糖胺聚糖的三元共沉淀物的混懸液/漿?；蛘撸鰸{可簡(jiǎn)單地包含膠原蛋白和磷酸釣材料以及任選地糖胺聚糖的機(jī)械混合物。這可通過(guò)例如EP-A-0164484和EP-A-0214070中所述的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行制備。所述磷酸釣材料可選自例如透釣磷石、磷酸八鉀和/或磷灰石中的一種或多種。所述磷酸鉀材料優(yōu)選包含透鈣磷石。所述混懸液/漿的pH優(yōu)選為2.5至6.5,更優(yōu)選為2.5至5.5，甚至更優(yōu)選為3.0至4.5,i至更優(yōu)選為3.8至4.2。所述混懸液/漿組合物可包含一種或多種糖胺聚糖。所述漿組合物可包含一種或多種磷酸鉀材料。所述混懸液/漿中不排除存在其它物質(zhì)(例如銀、硅、二氧化硅、餐桌鹽、糖等)。應(yīng)當(dāng)理解所述混懸液/漿中可存在其它成分。例如，任選地可單獨(dú)或以組合形式將生長(zhǎng)因子、基因、藥物或其它生物活性物質(zhì)添加到所述混懸液/漿中。至少一些所述多個(gè)固體晶體或顆粒可通過(guò)升華和/或蒸發(fā)除去以得到所述第一成分和第二成分之間的中間層。優(yōu)選的方法是升華。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于制備本發(fā)明的復(fù)合生物材料的方法包括(a)提供基本上是固體的第一成分，其包含膠原蛋白(包括重組人(recombinanthuman,rh)膠原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、透明質(zhì)酸(hyaluronan)、殼聚糖和含有膠原蛋白多肽序列之一部分的合成多肽中的一種或多種以及任選地?zé)o機(jī)材料，所述成分至少具有多孔的表面部分；(b)提供基本上是固體的第二成分，其包含膠原蛋白(包括重組人(rh)膠原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖和含有膠原蛋白多肽序列之一部分的合成多肽中的一種或多種以及任選地?zé)o機(jī)材料，所述成分至少具有多孔的表面部分；(c)提供流體組合物，其包含膠原蛋白(包括重組人(rh)膠原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖和含有膠原蛋白多肽序列之一部分的合成多肽中的一種或多種以及液體載體，還任選地包含無(wú)機(jī)材料；(d)將所述流體組合物放入到所述第一成分和所述第二成分之間使得其與所述多孔表面部分相接觸；(e)將所述第一成分和所述第二成分之間的所述流體組合物冷卻至使得所述液體載體轉(zhuǎn)變成多個(gè)固體晶體或顆粒的溫度；(f)通過(guò)升華和/或蒸發(fā)除去至少一些所述多個(gè)固體晶體或顆粒，以得到所述第一成分和所述第二成分之間的中間層。在本發(fā)明中，例如基于膠原蛋白的混懸液薄層有利地置于第一成分和第二成分(例如支架)之間，并且使之被吸收到每個(gè)支架中前幾層孔中。然后再次將支架冷凍干燥，得到在各個(gè)不同支架成分之間相互穿插的膠原蛋白纖維的網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)然，必要時(shí)，該過(guò)程可重復(fù)多次?？筛鶕?jù)所述第一和第二成分的化學(xué)和物理性質(zhì)選擇所述混懸液/漿的化學(xué)和物理性質(zhì)(例如粘度)。例如，如果所述第一和第二成分的孔非常小，那么可選擇粘度更小的混懸液/漿以保證滲透到孔內(nèi)。將所述流體組合物冷卻至使得所述液體載體轉(zhuǎn)變成多個(gè)固體晶體或顆粒的溫度以及通過(guò)升華和/或蒸發(fā)除去至少一些所述多個(gè)固體晶體或顆粒的步驟可通過(guò)冷凍干燥技術(shù)進(jìn)行。如果所述液體載體是水，那么所述升華步驟包括將模具和冷凍混懸液/漿周?chē)h(huán)境中的壓力降低至水/冰/水蒸汽體系的三相點(diǎn)以下，然后在所達(dá)到的真空壓下將溫度升高至固體-蒸汽相轉(zhuǎn)變溫度以上。在當(dāng)前溫度下，只要環(huán)境液體蒸汽分壓低于冷凍液體的分壓，產(chǎn)物中的冰就通過(guò)升華直接轉(zhuǎn)變?yōu)檎羝Ｍǔ囟壬叩?。C或以上。進(jìn)行該步驟以通過(guò)升華除去冷凍混懸液/漿中的水晶。可調(diào)節(jié)冷凍干燥參數(shù)以根據(jù)需要控制孔徑和長(zhǎng)寬比。一般而言，較慢的冷卻速率和較高的最終冷凍溫度(例如以約0.25。C/分鐘的速率冷卻至約-10'C的溫度)有利于形成具有較高長(zhǎng)寬比的大孔，而較快的冷卻速率和較低的最終冷凍溫度(例如以約2.5。C/分鐘的速率冷卻至約-40。C的溫度)有利于形成小的各方等大的孔?？稍谀＞咧袑?shí)施本發(fā)明的方法，術(shù)語(yǔ)模具旨在包括能成形、容納或支持所述第一和第二成分和流體組合物的任何模具。因此，最簡(jiǎn)單形式的模具可簡(jiǎn)單地包括支持表面。所述模具可以是任何所需形狀，并且可由合適的材料制得(包括聚合物(例如聚砜、聚丙烯、聚乙烯)、金屬(例如不銹鋼、鈦、鈷鉻合金)、陶瓷(例如氧化鋁、氧化鋯)、玻璃陶瓷以及玻璃(例如硼酸鹽玻璃))。所述第一成分的組成通常與所述第二成分的組成不同。所述流體組合物的組成通常與所述第一成分或所述第二成分(如果存在的話(huà))的組成不同。通過(guò)本發(fā)明方法制備的復(fù)合生物材料可用于制備其中至少兩層是多孔的多層支架。優(yōu)選地，所述多層的所有層均包含膠原蛋白并且任選地還包含糖胺聚糖。優(yōu)選地，其中至少一層還包含磷酸鉀材料?？赏ㄟ^(guò)本申請(qǐng)人于2006年3月6日提交的較早的國(guó)際申請(qǐng)PCT/GB2006/000797(其內(nèi)容在本文所附附錄中陳述)中所述方法制備所述第一和/或第二成分。此外，所述流體組合物可以是PCT/GB2006/000797中有關(guān)漿組合物方面所述的組合物。本申請(qǐng)人于2004年10月28日提交的較早的已公開(kāi)申請(qǐng)PCT/GB04/004550描述了膠原蛋白、透鈣磷石和糖胺聚糖的三元共沉淀物及其制備方法。PCT/GB04/004550的內(nèi)容在此通過(guò)參考并入本文。PCT/GB04/004550中所述的方法包括提供含有膠原蛋白、鈣源和磷源以及糖胺聚糖的酸性水溶液；膠原蛋白、透鉀磷石和糖胺聚糖從所述水溶液中一起沉淀形成三元共沉淀物。術(shù)語(yǔ)共沉淀物意指其中化合物基本上在同一時(shí)間從同一溶液/分散體系中沉淀出來(lái)的兩種或三種化合物的沉淀物。其與通過(guò)機(jī)械混合所述成分而形成的材料不同，尤其在例如不同溶液中單獨(dú)沉淀這些成分的情形下更是如此。共沉淀物的微觀(guān)結(jié)構(gòu)基本上不同于通過(guò)機(jī)械混合其成分而形成的材料。在制備共沉淀物的方法中，所述釣源優(yōu)選地選自下列一種或多種硝酸鉀、醋酸釣、氯化鉀、碳酸鉀、烷醇鉀、氬氧化鉀、硅酸釣、硫酸鈣、葡萄糖酸鈣和肝素鈣鹽。肝素鈣鹽可源自豬腸粘膜。合適的鈣鹽可從例如Sigma-AldrichInc購(gòu)得。磷源優(yōu)選地選自下列一種或多種砩酸二氫銨、磷酸氫二銨、磷酸、正磷酸氫二鈉二水合物(Na2HP04.2H20，有時(shí)稱(chēng)為GPRSorensen's鹽)以及磷酸三甲酯、堿金屬(例如鈉或鉀)磷酸鹽、堿土金屬(例如鎂或釣)磷酸鹽。糖胺聚糖是包含含有重復(fù)二糖單元的長(zhǎng)直鏈多糖的一類(lèi)大分子。優(yōu)選地，所述糖胺聚糖選自下列一種或多種硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、肝素、硫酸肝素、硫酸角質(zhì)素和透明質(zhì)酸。硫酸軟骨素可以是4-硫酸軟骨素或6-硫酸軟骨素，這兩種軟骨素均可從例如Sigma-AldrichInc購(gòu)得。6-硫酸軟骨素可來(lái)源于鯊魚(yú)軟骨。透明質(zhì)酸可來(lái)源于人臍帶。肝素可來(lái)源于豬腸粘膜。所述膠原蛋白可以是可溶的或不溶的并且可源自任何動(dòng)物中的任何組織，并且可使用許多常規(guī)技術(shù)進(jìn)行提取?？赏ㄟ^(guò)以下方法進(jìn)行沉淀將膠原蛋白、釣源、磷源和糖胺聚糖合并在酸性水溶液中，以及或者將溶液靜置直到沉淀出現(xiàn)、攪拌溶液、用堿性滴定劑(例如氨)滴定、加入成核劑(例如預(yù)先制備的透釣磷石)、改變鉤源的添加速率，或者這些技術(shù)或本領(lǐng)域已知多種其它技術(shù)的任意組合。本發(fā)明的復(fù)合生物材料有利地用作肌肉骨骼用途和牙用途的組織再生支架。本發(fā)明的復(fù)合生物材料可用作替代性骨材料或牙材料。因此，本發(fā)明提供含有本文所述生物材料的合成骨材料、骨植入體、骨移植物、骨替代物、骨支架、填充劑、包衣(coating)或粘固劑(cement)?？捎欣匾远鄬又Ъ苄问教峁┧鰪?fù)合生物材料。具體而言，本發(fā)明提供肌肉骨骼用途和牙用途的組織再生支架。本發(fā)明的多層(即兩層或更多層)支架可用于例如骨/軟骨界面(例如關(guān)節(jié))、骨/腱界面(例如腱止點(diǎn))、骨/韌帶界面(例如韌帶止點(diǎn))以及牙/韌帶界面(例如牙/牙周韌帶交界處)。盡管本發(fā)明主要涉及組織工程用的支架，但是本發(fā)明的材料可用于制備在體內(nèi)持續(xù)存在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間的植入體。例如，半永久性植入體可能是腱和韌帶應(yīng)用所必需的。現(xiàn)在參考兩個(gè)優(yōu)選的合成實(shí)施方案來(lái)描述本發(fā)明固相共合成和固液共合成。本發(fā)明人開(kāi)發(fā)這些技術(shù)以使得能制備具有顯著不同成分性質(zhì)的多成分支架。它們提供用于制備可模擬在體內(nèi)所見(jiàn)的在支架成分層之間具有膠原蛋白原纖維連續(xù)性的連續(xù)(軟的)界面的方法。它們解決了在制造后將不同相縫合或粘合在一起時(shí)所存在的問(wèn)題。本發(fā)明的固相共合成和固液共合成方法提供了下述優(yōu)點(diǎn)即不需要在基本上同一時(shí)間由液態(tài)形成所述獨(dú)立支架成分。這與其中所有漿分層并固化在一起的液相共合成不同。所述合成方法包含可以任何次數(shù)重復(fù)應(yīng)用的一系列步驟以制備含有一系列獨(dú)立成分的多孔支架。這些獨(dú)立成分可分別進(jìn)行制備，然后通過(guò)任何次數(shù)重復(fù)的共合成過(guò)程連接在一起以形成具有不同結(jié)構(gòu)特征、機(jī)械特征和/或組成特征(例如孔徑、相對(duì)密度、孔形、硬度、化學(xué)組成、交聯(lián)密度、降解速率)之區(qū)域的單一復(fù)合/分層支架?，F(xiàn)在通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述所述固相共合成和固液共合成方法。固相共合成在固相共合成的情形下，分別制備所述多成分支架的每個(gè)成分層。然后使用二次冷凍干燥分法由所述分開(kāi)的成分區(qū)組裝成支架結(jié)構(gòu)的最終三維基質(zhì)。例如，將一薄層基于膠原蛋白的混懸液置于每個(gè)支架之間，使得其被吸收到每個(gè)支架中前幾層孔中。然后再次將所述支架冷凍干燥，得到膠原蛋白纖維在每個(gè)不同支架成分之間互相貫穿的網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)然，必要時(shí)，可將該方法重復(fù)數(shù)次。固相共合成步驟l:漿的制備可制備水性的基于膠原蛋白的漿的任意組合。針對(duì)I型膠原蛋白[10,11、H型膠原蛋白[12、或礦化I型膠原蛋白/GAG/透鈣磷石漿有詳細(xì)的制備方法(見(jiàn)例如PCT/GB04/004550)。固相共合成步驟2:多孔的基于膠原蛋白之成分的制備可通過(guò)冷凍干燥由不同的基于膠原蛋白的漿制備每種成分。已經(jīng)公開(kāi)了多種能制備具有不同平均孔徑、形狀和方向性之支架的冷凍干燥方法[10，11，13-15，任意這些方法可用于形成每種支架成分。簡(jiǎn)而言之，將每種基于膠原蛋白的混懸液置于模具中；所述模具可以是任何期望形狀并且可由任何數(shù)目的材料(即聚合物、金屬、陶瓷、玻璃或玻璃陶瓷)制備。然后通過(guò)將所述模具暴露于冷凍環(huán)境中將混懸液固化在所述模具內(nèi)；固化可快速或緩慢地以主要方向進(jìn)行或均一地進(jìn)行，可以任何方式控制所述固化環(huán)境的溫度以使得所述混懸液完全固化，產(chǎn)生膠原蛋白纖維所圍繞的互相貫穿的水晶網(wǎng)絡(luò)。然后將所述固化混懸液升華，除去水晶，得到其自身構(gòu)成均一支架結(jié)構(gòu)的多孔成分。可使用不同的冷凍方案在不同的模具中由不同的混懸液制任何數(shù)目的獨(dú)立成分。固相共合成步驟3:制造后加工在冷凍干燥之后可對(duì)每種成分進(jìn)行制造后加工。這些制備后加工包括物理交聯(lián)技術(shù)(即脫水熱交聯(lián)、紫外交聯(lián))[11,13,16-18]、化學(xué)交聯(lián)技術(shù)(即基于碳二亞胺的交聯(lián)、基于戊二醛的交聯(lián))[11,16、或使用混合酶制劑(即膠原蛋白酶、分散酶)部分降解支架。使用涉及支架水化的任何處理之后，可使用再次冷凍干燥法除去液體成分。此外，多種模制容器、冷凍方案和升華方案可用于從支架中除去液體成分。固相共合成步驟4:固相共合成完成每個(gè)成分的加工之后，使用固相共合成將獨(dú)立成分結(jié)合起來(lái)。將基于膠原蛋白的混懸液薄層置于獨(dú)立支架成分之間。重復(fù)該過(guò)程以將所有獨(dú)立支架成分結(jié)合成具有不同區(qū)域的較大支架?；谀z原蛋白的支架局部水化每個(gè)支架之間的界面，暫時(shí)將所述支架粘合在一起。然后使用多種固化和升華方案之一冷凍干燥所組裝的支架；冷凍干燥之后，通過(guò)延伸穿過(guò)支架成分支架每個(gè)界面的互相貫穿的膠原蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)將所述之間成分固定在一起。固相共合成步驟5:制造后加工組裝了較大的支架結(jié)構(gòu)之后，可使用制備后加工步驟；這種加工已經(jīng)列舉在步驟3中。進(jìn)行這種加工之后，可再次冷凍干燥支架以產(chǎn)生具有任何不同的結(jié)構(gòu)和組成性質(zhì)的基于膠原蛋白的多孔支架。固液共合成在固液共合成的情形下，分別制備所述最終支架的一個(gè)或多個(gè)成分層。然后使用再一次或多次額外的冷凍干燥過(guò)程組裝支架結(jié)構(gòu)的最終三維基質(zhì)。例如，將一薄層基于膠原蛋白的混懸液與已經(jīng)制備的成分放在一起，使得其被吸收到所述成分支架中。然后再次將所述混懸液支架系統(tǒng)冷凍干燥，得到膠原蛋白纖維在每個(gè)不同支架成分之間互相貫穿的網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)然，必要時(shí)，可使用額外的混懸液/漿將該過(guò)程重復(fù)數(shù)次以形成最終的支架結(jié)構(gòu)。固液共合成法和固相共合成法相似，其包括可任意次重復(fù)應(yīng)用以產(chǎn)生包含一系列獨(dú)立多孔成分之多孔支架的一系列步驟。還與固相共合成法相似的是，其本身包含均一多孔支架的一個(gè)或多個(gè)所述多孔成分通過(guò)冷凍干燥技術(shù)共同結(jié)合在一起。然而，固液共合成法與固相共合成法的不同在于至少一個(gè)所述成分是通過(guò)冷凍干燥從置于與一個(gè)或多個(gè)之前制備的成分完全接觸的漿形成的。固液共合成步驟l:漿的制備可制備水性的基于膠原蛋白的漿的任意組合。針對(duì)I型膠原蛋白[10,11、II型膠原蛋白[12、或礦化I型膠原蛋白/GAG/透鈣磷石漿有詳細(xì)的制備方法(見(jiàn)例如PCT/GB04/004550)。固液共合成步驟2:多孔成分的制備可使用上述有關(guān)所述固相共合成的一種或多種冷凍干燥技術(shù)從不同的基于膠原蛋白的漿制備一個(gè)或多個(gè)成分支架。固液共合成步驟3:之前制備的多孔成分的制備后加工在與所述固相共合成相關(guān)的上述冷凍干燥之后可對(duì)每個(gè)支架成分進(jìn)行任意制備后加工步驟。固液共合成步驟4:固液共合成完全加工每個(gè)支架成分之后，將一種或多種漿與之前制備的一個(gè)或多個(gè)多孔成分完全接觸；使得所述漿擴(kuò)散進(jìn)入其相鄰的之前所制備成分的孔中持續(xù)指定的一段時(shí)間，使所述一種或多種漿固化，然后通過(guò)冷凍干燥進(jìn)行升華以形成與之前制備的成分整體相連的新支架成分的多相支架。該步驟可重復(fù)任意次以制備含有任何數(shù)目成分的多相支架。固液共合成步驟5:制造后加工組裝了完整的支架結(jié)構(gòu)之后，可應(yīng)用任意制備后加工步驟；這種加工已經(jīng)列舉在步驟3中。這種加工之后，可再次冷凍干燥支架以產(chǎn)生具有任意不同的結(jié)構(gòu)和組成性質(zhì)的基于膠原蛋白的多孔支架。本發(fā)明的方法提供在制備多成分支架上的多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。特別是-獨(dú)立控制支架不同區(qū)域中的物理性質(zhì)(即孔徑、孔形、交聯(lián)密度、降解速率)、機(jī)械性質(zhì)(即模量)、以及化學(xué)性質(zhì)(即礦物質(zhì)含量、膠原蛋白含量、糖胺聚糖含量)；-通過(guò)引入膠原蛋白作為主要成分改善了細(xì)胞附著；-由于相互連接的膠原蛋白-纖維結(jié)構(gòu)穿越不同成分之間的邊界導(dǎo)致強(qiáng)界面強(qiáng)度；-由于固相共合成導(dǎo)致支架中不同化學(xué)組成的相鄰層之間的有限化學(xué)擴(kuò)散。現(xiàn)在本發(fā)明將參考下述實(shí)施例和附圖以進(jìn)一步描述本發(fā)明，其中圖1顯示根據(jù)實(shí)施例1C通過(guò)固相共合成制備兩成分支架以形成雙層支架。上圖包含未礦化的II型膠原蛋白支架，下圖包含礦化的I型膠原蛋白支架。圖2顯示根據(jù)實(shí)施例1C通過(guò)固相共合成制備的分層支架中礦物質(zhì)(Ca和P)含量的元素分析。發(fā)現(xiàn)礦物質(zhì)含量幾乎全部存在于礦化區(qū)域中(下組綠色線(xiàn)之間)。圖3顯示根據(jù)實(shí)施例1C由礦化的I型膠原蛋白和未礦化的II型膠原蛋白支架成分形成的分層支架中的礦物質(zhì)相對(duì)濃度。實(shí)施例實(shí)施例1:固相共合成A.礦化(透鈣磷石)I型膠原蛋白-糖胺聚糖支架的制備混懸液制備由I型膠原蛋白(IntegraLifeSciencesCorp.,Plainsboro，NJ，USA)、6-硫酸軟骨素(Sigma-AldrichInc，St.Louis,MO，USA)、正褲酸(H3P04，BDHLaboratorySupply,Poole,UK)、氫氧化釣(Ca(OH)2,Sigma-AldrichInc)以及硝酸鉀(Ca(N03)24H20,Sigma-AldrichInc.)制備之前在PCT/GB04/004550中所述的礦化(透鉀磷石)膠原蛋白-糖胺聚糖混懸液。冷凍干燥將10mm的礦化(透鉀磷石)I型膠原蛋白-糖胺聚糖混懸液層置于底部厚度為8mm的矩形(25mmx50mm)聚砜模具中。之前所述的溫度改變技術(shù)(temperaturerampingtechnique)[10,15用于固化礦^ft(透鈣磷石)I型膠原蛋白-糖胺聚糖混懸液將冷凍干燥器架的溫度以預(yù)定速率(3"C/分鐘)從室溫驟降至-20n,然后在-20"C保持600分鐘使之完全固化[15；完全固化后，在25TC于200毫托壓強(qiáng)下升華冷凍的混懸液24小時(shí)，導(dǎo)致形成平均孔徑大于250pm的膠原蛋白-糖胺聚糖支架。制造后加工從模具中取出支架并使用預(yù)定的碳二亞胺(基于液體化學(xué)品)交聯(lián)處理進(jìn)行交聯(lián)[16。交聯(lián)后，在磷酸鹽緩沖液(PBS，Sigma-AldrichInc.)和去離子水中反復(fù)清洗所述支架。將水化支架放回恒溫-40"C的冷凍干燥器中保持6o分鐘，然后升華(or;，17小時(shí)，20o亳托)以從支架中除去液體成分。B.未礦化II型膠原蛋白-糖胺聚糖支架的制備混懸液制備從冰箱中取出預(yù)先制備的未礦化II型膠原蛋白-糖胺聚糖混懸液(GeistlichBiomaterials，Wolhusen,Switzerland)[12并4吏其恢復(fù)到室溫o冷凍干燥將3mm的II型膠原蛋白-糖胺聚糖混懸液層置于底部厚度為8mm的矩形(25mmx50mm)聚砜模具中。使用之前所述的溫度改變技術(shù)10，15固化II型膠原蛋白-糖胺聚糖混懸液。將冷凍干燥器架的溫度以預(yù)定速率(1.4匸/分鐘)從室溫驟降至-40x:，然后在-4or;保持60分鐘使得完全固化[15；完全固化后，在OC200毫托壓強(qiáng)下升華冷凍的混懸液17小時(shí)，導(dǎo)致形成平均孔徑為約100pm的膠原蛋白-糖胺聚糖支架。制造后加工從聚砜模具中取出支架并使用之前所述的脫水熱交聯(lián)處理進(jìn)行交聯(lián)以增加支架硬度并降低支架降解速率[11,13；簡(jiǎn)而言之，在105C于50亳托壓強(qiáng)下進(jìn)行脫水熱交聯(lián)24小時(shí)。C.固相共合成以形成雙層支架混懸液制備由I型膠原蛋白(IntegraLifeSciencesInc.)、醋酸(Sigma-AIdrichInc.)、以及6-;危酸軟骨素(Sigma-AIdrichInc.)制備少量的之前所述的未礦化I型膠原蛋白-糖胺聚糖混懸液10、11、15。固相共合成將礦化(透鈣磷石)I型膠原蛋白-糖胺聚糖支架置于在最初的支架制備過(guò)程中所用的矩形聚砜模具中。沿礦化(透鋦磷石)支架的上表面鋪一薄層礦化(透釣磷石)I型膠原蛋白-糖胺聚糖混懸液。將所述II型膠原蛋白-糖胺聚糖支架置于所述混懸液層的頂部。通過(guò)沿界面的膠原蛋白-糖胺聚糖混懸液水化這兩種支架。使用之前所述的溫度改變技術(shù)[10,15]沿兩種之前形成的支架的界面固化I型膠原蛋白-糖胺聚糖混懸液。將冷凍干燥器架的溫度以預(yù)定速率(1.4C/分鐘)從室溫降至-40X:，然后在-40n保持60分鐘使得完全固化[15；完全固化后，在0t:于200毫托壓強(qiáng)下升華冷凍的混懸液17小時(shí)。該方法制備了具有兩個(gè)不同區(qū)域的分層支架(礦化I型膠原蛋白-糖胺聚糖和未礦化II型膠原蛋白-糖胺聚糖的支架)。通過(guò)延伸穿過(guò)所述兩個(gè)初始支架之間界面的一薄層I型膠原蛋白-糖胺聚糖支架結(jié)構(gòu)將所述兩個(gè)支架層固定在一起(見(jiàn)圖1-3)。實(shí)施例2:固液共合成A.礦化(透鈣磷石)I型膠原蛋白-糖胺聚糖支架的制備混懸液制備由I型膠原蛋白(IntegraLifeSciencesCorp.,Plainsboro，NJ，USA)、6-硫酸軟骨素(Sigma-AldrichInc，St.Louis,MO，USA)、正褲酸(H3P04，BDHLaboratorySupply,Poole，UK)、氫氧化釣(Ca(OH)2，Sigma-AldrichInc)以及硝酸釣(Ca(N03)24H20,Sigma-AldrichInc.)制備之前所述(見(jiàn)PCT/GB04/004550)的礦化(透鉀磷石)膠原蛋白-糖胺聚糖混懸液。冷凍干燥將10mm的礦化(透鈣磷石)I型膠原蛋白-糖胺聚糖混懸液層置于底部厚度為8mm的矩形(25mmx50mm)聚砜模具中。使用之前所述的溫度改變技術(shù)[10，15固化礦化(透鈣磷石)I型膠原蛋白-糖胺聚糖混懸液。將冷凍干燥器架的溫度以預(yù)定速率(3匸/分鐘)從室溫降至-20r,然后在-20"C保持600分鐘使得完全固化[15；完全固化后，在251C于200毫托壓強(qiáng)下升華冷凍的混懸液24小時(shí)，導(dǎo)致形成平均孔徑大于250nm的膠原蛋白-糖胺聚糖支架。制造后加工從模具中取出支架并使用預(yù)定的碳二亞胺(基于液體化學(xué)品)交聯(lián)處理進(jìn)行交聯(lián)[16。交聯(lián)后，在磷酸鹽緩沖液(PBS,Sigma-AldrichInc.)和去離子水中反復(fù)清洗所述支架。將水化支架放回恒溫-40r的冷凍干燥器中，放置60分鐘，然后升華(or;，17小時(shí)，20o亳托)以從支架中除去液體成分。B.固液共合成以形成雙層支架混懸液制備使在0.05M磷酸中包含I型牛跟腱膠原蛋白混懸液的冷凍高粘度漿(DevroCasings,Moodiesburn，Chyston，Scotland)恢復(fù)到室溫。固液共合成將礦化的(透鈣磷石)I型膠原蛋白-糖胺聚糖多孔成分置于在最初的支架制備過(guò)程中所用的矩形聚砜模具中。然后在礦化多孔成分的上表面鋪一層2mm的高粘度I型膠原蛋白混懸液，并通過(guò)將所述多孔成分/漿構(gòu)建物靜置15分鐘而使之滲入孔結(jié)構(gòu)的近表面區(qū)域。使用之前所述的溫度改變技術(shù)[10,15固化高粘度I型膠原蛋白混懸液。將冷凍干燥器架的溫度以預(yù)定速率(1.41C/分鐘)從室溫降至-40■C,然后在-40匸保持60分鐘使得完全固化[15；完全固化后，在O匸于200亳托壓強(qiáng)下升華冷凍的混懸液17小時(shí)。制造后加工從其聚砜模具中取出所述支架并使用之前所述的碳二亞胺交聯(lián)處理進(jìn)行交聯(lián)[19以增加支架硬度并降低支架降解速率。該方法制備了具有兩個(gè)不同區(qū)域(礦化I型膠原蛋白-糖胺聚糖和未礦化II型膠原蛋白的層)的分層支架。本發(fā)明描述了用于制備具有不同結(jié)構(gòu)性質(zhì)、組成性質(zhì)和機(jī)械性質(zhì)的區(qū)域的大型多孔支架的新方法。第一方法涉及固相共合成。第二方法涉及固液共合成。固相共合成允許分別制備更大支架結(jié)構(gòu)的不同成分，然后通過(guò)例如冷凍干燥基于膠原蛋白的漿薄層形成互相貫穿的膠原蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)從而連接在一起。該方法允許制備在不同區(qū)域中具有受控物理性質(zhì)(即孔徑、孔形、交聯(lián)密度、降解速率)、機(jī)械性質(zhì)(即模量)、以及化學(xué)性質(zhì)(即礦物質(zhì)含量、膠原蛋白含量、糖胺聚糖含量)的特定支架。固液共合成允許分別制備不同的支架成分，然后通過(guò)冷凍干燥與其它漿一起組裝成更大的支架結(jié)構(gòu)。該方法允許制備在不同區(qū)域中具有受控物理性質(zhì)(即孔徑、孔形、交聯(lián)密度、降解速率)、機(jī)械性質(zhì)(即模量)、以及化學(xué)性質(zhì)(即礦物質(zhì)含量、膠原蛋白含量、糖胺聚糖含量)的特定支架。尤其重要的是使用固相共合成和固液共合成法實(shí)現(xiàn)了不同支架區(qū)域之間的強(qiáng)界面強(qiáng)度，以及當(dāng)支架組分之間的化學(xué)擴(kuò)散不是有益的時(shí)控制相鄰支架區(qū)域之間化學(xué)擴(kuò)散的能力。參考文獻(xiàn)1.YamiasIV.TissueandOrganRegenerationinAdults,ISIewYork:Springer.;2001.2.HunzikerEB,DriesangIMK,FunctionalBarrierPrincipleforGrowth-Factor-BasedArticularCartilageRepair.OsteoarthritisandCartilage2003;11,(5):320-327,3.GaoJ,DennisJE,SolchagaIA,AwadallahAS,GoldbergVM,CaplanA工，Tissue-EngineeredFabricationofanOsteochondralCompositeGraftUsingRatBoneMarrow—DerivedMesenchymalStemCells,TissueEngineering2001-7(4):363-371，4.GaoJ,DennisJE,SolchagaLA,GoldbergVM,CaplanAI.RepairofOsteochondralDefectwith.Tissue-EngineeredTwo—PhaseCompositeMaterialofInjectableCalciumPhosphateandiiyaluronanSponge*TissueEngineering2002,8(5):827-837.5.HungCT,LimaEG,M'auckRL,Ta)ciE,!LeRouxMA,!LuHH,etal.AnatomicallyShapedOsteochondralConstructsforArticularCartilageRepair*JournalofBioinechanics2003"。1853-1864,6.Nie(4erauerGG,SlivkaMA,LeatherburyNC,Korvick.DL,H.H.HJ,EhlerWC,etal.EvaluationofMultiphaseImplants,forRepairofFocalOsteochondralDefectsinGoats-Biomate3:ials2000,'21:2561-2574.7.SchaeferD,Martin工,ShastriP,PaderaRF,LangerR,FreedLE,al.InVitroGenerationofOsteochondralComposites,Biomaterials2000;21(24):2599-2606.8.SchaeferD,Martin工,JundtG,SeidelJ,HebererM,GrodzinslcyA,etal*Tissue—EngineeredCompositesfortheRepairofLargeOsteochondralDefects.ArthritisandRheumatism2002M6(9):2524-2534,9.SherwoodJK,RileySL,PalazzoloR,BrownSCrMonkhouseDC,CoatesM,etal,'AThree-DimensionalOsteochondralCompositeScaffoldforArticularCartilageRepair.Bioraaterials2002卩23:4739-4751*10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(GAGs)的多孔支架的方法(Yannasetal"1989;O'Brienetal"2004;O'Brienetal"2005;Loreeetal1989)。這些技術(shù)允許支架的特征例如孔徑大小和長(zhǎng)寬比以受控方式改變，已知該參數(shù)對(duì)外傷或傷口部位的愈合反應(yīng)具有顯著的影響。但是，對(duì)于涉及骨骼和肌骨骼缺陷的損傷的治療，必需開(kāi)發(fā)技術(shù)來(lái)生產(chǎn)材料組成和機(jī)械特征與骨的材料組成和機(jī)械特征緊密配合的多孔支架，這與未礦化的膠原蛋白-GAG支架相反。本發(fā)明旨在解決至少一些與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問(wèn)題。一種制備包含無(wú)機(jī)材料和有機(jī)材料的復(fù)合生物材料的方法，其包括(a)提供第一漿組合物，其包含液體栽體、無(wú)機(jī)材料和有機(jī)材料;(b)提供用于所述漿的模具；(c)使所述漿沉積在所述模具中；(d)將沉積在所述模具中的漿冷卻至所述液體栽體轉(zhuǎn)化為多個(gè)固體晶體或顆粒的溫度；(e)優(yōu)選通過(guò)升華和/或蒸發(fā)移除至少一些所述多個(gè)固體晶體或顆粒，以留下含有無(wú)機(jī)材料和有機(jī)材料的多孔復(fù)合材料；和(f)將所述材料從所迷模具中移走。此處所用的術(shù)語(yǔ)生物材料指的是可與人體或動(dòng)物體生物相容的材料。此處所用的術(shù)語(yǔ)漿包括漿、溶液、懸浮液、膠體和分散體。所述無(wú)機(jī)材料會(huì)通常包括磷酸鈣材料。所述有機(jī)材料會(huì)通常包括生物有機(jī)物，例如一種能溶解或懸浮在含水介質(zhì)中以形成漿的物質(zhì)。例子包括白蛋白、糖胺聚糖、透明質(zhì)酸、殼聚糖、和包含膠原蛋白的部分多肽序列的合成多肽的一種或多種。膠原蛋白是優(yōu)選的材料，任選地與糖胺聚糖一起使用。此處使用的術(shù)語(yǔ)膠原蛋白包括重組人(rh)膠原蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述無(wú)機(jī)材料包括磷酸鉤材料，所述有機(jī)材料包括膠原蛋白和任選地糖胺聚糖。這產(chǎn)生包含所述磷酸鉀材料和膠原蛋白以及任選地糖胺聚糖的多孔復(fù)合材料。優(yōu)選地，所述第一漿包含膠原蛋白和磷酸鉀材料的共沉淀物。更優(yōu)選地，所述第一漿包含膠原蛋白、磷酸鉀材料和糖胺聚糖的三元共沉淀物。作為選擇，所述第一漿可以只包含膠原蛋白和磷酸釣材料及任選地糖胺聚糖的機(jī)械混合物?？梢酝ㄟ^(guò)例如EP-A-0164484和EP-A-0214070中描述的常規(guī)技術(shù)來(lái)生產(chǎn)該漿。雖然可以使用機(jī)械混合物形成所述漿，但是優(yōu)選膠原蛋白和所述磷酸鉀材料的共沉淀物或膠原蛋白、磷酸釣材料和糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述磷酸鉀材料，可以選自，例如透釣磷石、磷酸八釣和/或磷灰石中的一種或多種。所述磷酸鉤材料優(yōu)選包含透鉀磷石。所述漿的pH優(yōu)選為2.5到6.5，更優(yōu)選為2.5到5.5，還更優(yōu)選為3.0到4.5，并且還更優(yōu)選為3.8到4.2。所述漿組合物可以包含一種或多種糖胺聚糖。所述漿組合可以包含一種或多種磷酸鈣材料。不排除在前體漿中存在其它物質(zhì)(例如銀、硅、二氧化硅、食鹽、糖等)。至少一些所述多個(gè)固體晶體或顆?？梢酝ㄟ^(guò)升華和/或蒸發(fā)除去，以留下包含膠原蛋白、磷酸鈣材料和任選地糖胺聚糖的多孔復(fù)合材料。優(yōu)選的方法是升華。步驟(d)和(e)可能受到凍干技術(shù)的影響。如果所述液體載體是水，所述升華步驟包括降低模具周?chē)h(huán)境的壓力，將漿冷凍至水/水/水蒸氣系統(tǒng)的三相點(diǎn)以下，然后在獲得的真空壓力下將溫度升至比固體-蒸氣轉(zhuǎn)化溫度更高的溫度。當(dāng)周?chē)囊后w蒸氣分壓低于當(dāng)前溫度下凍結(jié)液體分壓時(shí)，所述產(chǎn)品中的冰通過(guò)升華直接轉(zhuǎn)化為蒸氣。該溫度通常升至0C或以上。進(jìn)行該步驟以通過(guò)升華從所述冷凍漿中除去冰晶體。凍干參數(shù)可以被調(diào)整，以控制所需的孔徑大小和長(zhǎng)寬比。一般地，較慢的冷卻速率和較高的最終冷凍溫度(例如以大約0.25X:每分鐘冷卻至約-10匸的溫度)有利于形成具有更大長(zhǎng)寬比的大孔，而較快的冷卻速率和較低的最終冷凍溫度(例如以大約2.5"C每分鐘冷卻至約-401C的溫度)有利于形成等軸的小孔。此處所用的術(shù)語(yǔ)"模具"意欲包括任何能夠成形、容納或支持所述漿組合物的模具、容器或基質(zhì)。因此，最簡(jiǎn)單形式的模具可只包括支承表面。所述模具可以是任何所需的形狀，并且可以由包括聚合物(例如聚砜、聚丙烯、聚乙烯)，金屬(例如不銹鋼、鈦、鈷鉻)，陶瓷(例如氧化鋁、氧化鋯)，玻璃陶瓷，和玻璃(例如硼硅酸鹽玻璃)的任何適合的材料制成。本申請(qǐng)人2004年10月28日提交的較早的申請(qǐng)PCT/GB04/004550描述了膠原蛋白、透鈣磷石和糖胺聚糖的三元共沉淀物和其制備方法。PCT/GB04/004550的內(nèi)容在此通過(guò)引用并入本文。PCT/GB04/004550中描述的方法包括提供包含膠原蛋白、鈞源和磷源以及糖胺聚糖的酸性水溶液；和將所述膠原蛋白、透鉀磷石和糖胺聚糖一起從所述水溶液中沉淀出來(lái)，以形成三元共沉淀物。術(shù)語(yǔ)共沉淀物指的是兩種或三種化合物的沉淀，其中所述化合物基本上同時(shí)從相同的溶液/分散體中沉淀。其區(qū)別于由所述成分的機(jī)械混合形成的材料，尤其是當(dāng)這些成分單獨(dú)地從例如不同的溶液中沉淀料。、"5、力^y在制備所述共沉淀物的過(guò)程中，所述釣源優(yōu)選選自硝酸釣、醋酸鈣、氯化鈣、碳酸鈣、鈣醇鹽、氫氧化鈣、硅酸鉀、硫酸鉀、葡萄糖酸鈣和肝素鈣鹽中的一種或多種。肝素鈣鹽可以源于豬的腸粘膜。合適的釣鹽可商業(yè)得到，例如從Sigma-Aldrich公司得到。磷源優(yōu)選選自磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、磷酸、二水合正磷酸氬二鈉(Na2HP04.2H20，有時(shí)被稱(chēng)為GPRSorensen鹽)和磷酸三甲酯，磷酸的堿金屬鹽(例如鈉或鉀)，磷酸的堿土金屬鹽(例如鎂或鉤)中的一種或多種。糖胺聚糖是含有長(zhǎng)的無(wú)支鏈聚糖的大分子族，所述聚糖含有重復(fù)的二糖單元。優(yōu)選地，所述糖胺聚糖選自硫酸軟骨素、硫酸皮膚素(dermatin)、肝素、硫酸肝素、硫酸角蛋白和透明質(zhì)酸中的一種或多種。硫酸軟骨素可以是4-硫酸軟骨素或6-硫酸軟骨素，兩者都可商業(yè)得到，例如從Sigma-Aldrich公司得到。所述6-硫酸軟骨素可以源于鯊魚(yú)軟骨。透明質(zhì)酸可以源于人的臍帶。肝素可以源于豬的腸粘膜。所述膠原蛋白可以是可溶或不可溶的，并可以源于任何動(dòng)物的任何組織，并且可以用許多常規(guī)技術(shù)提取。沉淀可以通過(guò)在酸性水溶液中結(jié)合所述膠原蛋白、鈞源、磷源和糖胺聚糖，然后使所述溶液靜止直到出現(xiàn)沉淀，攪拌溶液，用堿滴定液例如氨水滴定，加入成核劑例如預(yù)制的透鈣磷石，改變鈣源加入的速率，或這些或本領(lǐng)域中公知的許多其它技術(shù)的任意組合來(lái)實(shí)現(xiàn)。將會(huì)理解，其它的成分可以存在于所述漿中。例如，可以任選地將生長(zhǎng)因子、基因、藥物或其它生物活性物質(zhì)單獨(dú)地或以組合加入到漿中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法還有利地包括提供第二漿組合物，其包括液體載體和有機(jī)材料及任選地?zé)o機(jī)材料；和在所述冷卻步驟之前，在沉積所述第一漿組合物之前或之后將所述第二漿組合物沉積在所述模具中。如前所述，所述有機(jī)材料將通常包含膠原蛋白(包括重組人(rh)膠原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖和包含膠原蛋白的部分多肽序列的合成多肽的一種或多種。所述第二漿組合物可以包含無(wú)機(jī)材料，例如磷酸釣材料。優(yōu)選地，所述第二漿組合物包含液體載體、膠原蛋白、任選地磷酸鈣材料和任選地糖胺聚糖。在這個(gè)實(shí)施方案中，所述第二漿組合物優(yōu)選包含膠原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物，或膠原蛋白和磷酸鉀材料的共沉淀物，或膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鉀材料的三元共沉淀物。已經(jīng)關(guān)于所述第一漿的制備討論過(guò)共沉淀。作為選擇，所述第二漿可以只包含膠原蛋白和任選地一種或兩種磷酸鈣材料和糖胺聚糖的機(jī)械混合物。已經(jīng)關(guān)于所述第一漿的制備討論過(guò)機(jī)械混合物。如果存在，所述第二漿中的磷酸鉀材料可以選自透鉤磷石、磷酸八鉀和/或磷灰石的一種或多種。所述第一和第二漿組合物將通常作為第一和第二層沉積在模具中。例如，將所述第一漿沉積在模具中，然后是第二漿。然后可以對(duì)所述模具中內(nèi)含物進(jìn)行步驟(d)、(e)和(f)。相應(yīng)地，該方法可以用于形成多層材料，其中至少一層優(yōu)選包含含有膠原蛋白、磷酸鉤材料和任選地糖胺聚糖的多孔復(fù)合材料。所述第二漿組合物得到的層可以是多孔的或無(wú)孔的層。如果期望多孔層，則所述孔可以通過(guò)升華和/或蒸發(fā)在第二漿內(nèi)形成的多個(gè)固體晶體或顆粒來(lái)產(chǎn)生。已經(jīng)關(guān)于第一漿討論過(guò)這種技術(shù)，并且優(yōu)選包括凍干技術(shù)。所述方法在液相中進(jìn)行，這樣有助于在第一漿層和第二漿層之間的擴(kuò)散?？梢砸匀魏纬蓪禹樞蚧驇缀蔚姆绞匠练e所述層。例如，所述層可以垂直地(即一層位于另一層上面)、水平地(即一層在另一層旁邊)和/或放射狀地(一個(gè)球形層在下一個(gè)層的上面)定位。根據(jù)本發(fā)明的澆鑄方法能夠制造用于組織工程的多孔單層和多孔分層支架。在所述第一和第二漿組合物沉積在模具中后，所述模具的內(nèi)含物優(yōu)選在冷卻步驟之前靜置多至24小時(shí)。這樣是有利的，因?yàn)槠湓试S在相鄰的層之間不同漿組分的相互擴(kuò)散。這會(huì)導(dǎo)致層間結(jié)合強(qiáng)度的增加。所述第一漿中的液體載體優(yōu)選包含水。所述第二漿中的液體載體也優(yōu)選包含水。將會(huì)理解，可以在所述冷卻步驟之前，在沉積所述第一和/或第二漿組合物之前或之后，在模具中沉積其它的漿層。冷卻步驟之前沉積在模具中的漿的溫度一般會(huì)影響漿的粘度。如果溫度過(guò)高，則會(huì)導(dǎo)致漿的粘度過(guò)低，這可導(dǎo)致一旦沉積第二漿，則所述第一和第二層的完全相互混合(因而是不期望的)。也應(yīng)該注意，太高的溫度可能導(dǎo)致膠原蛋白變性。另一方面，過(guò)低的溫度可能導(dǎo)致漿粘度過(guò)高，而不能有效地展開(kāi)、平滑或成形，并且可能有過(guò)早形成冰結(jié)晶體的風(fēng)險(xiǎn)。相應(yīng)地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在冷卻步驟之前沉積在;^具中的第一漿的溫度優(yōu)選從2至40X:,更優(yōu)選從4至37C,還更優(yōu)選從20至37x:。如果使用多層的漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。沉積在模具中的第一漿的冷卻步驟優(yōu)選進(jìn)行到《ox:的溫度。更優(yōu)選地，冷卻步驟進(jìn)行到-100至0"C的溫度，優(yōu)選從-80至-10"C，更優(yōu)選從-40至-20C。如果使用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。沉積在模具中的第一漿的冷卻步驟優(yōu)選以0.02-10"C/分鐘的冷卻速率進(jìn)行，更優(yōu)選0.02-6.0"C/分鐘，還更優(yōu)選0.2-2.7"C/分鐘。如果使用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。一般地，較慢的冷卻速率和較高的最終冷凍溫度(例如以大約0.25"c每分鐘的速率冷卻至-iox:的溫度)有利于形成具有較大的長(zhǎng)寬比的大孔，而較快的冷卻速率和較低的最終冷凍溫度(例如以大約2.51C每分鐘的速率冷卻至-4ox:的溫度)有利于形成等軸的小孔。沉積在模具中的漿的冷卻步驟優(yōu)選在l~200kPa，更優(yōu)選50~150kPa，仍更優(yōu)選50~101.3kPa的壓力下進(jìn)行。如果使用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，低于50kPa的壓力可能導(dǎo)致在漿中形成氣泡，而高于200kPa的壓力可能引起相鄰層的過(guò)度混合。沉積在模具中的第一漿的厚度優(yōu)選0.1~500mm，更優(yōu)選0.5~20mm，還更優(yōu)選1.0~10mm。如果4吏用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。厚度超過(guò)500mm的層可能難以完全固化，而厚度小于0.1mm的層可幾乎瞬間凍結(jié)，使之難以準(zhǔn)確控制冰結(jié)晶體成核和生長(zhǎng)的進(jìn)程。所述第一漿在被沉積到模具中之前的粘度優(yōu)選為0.1~50Pa.s，更優(yōu)選0.1~10Pa.s，還更優(yōu)選0.5~5Pa.s。如果4吏用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。具有過(guò)高粘度的漿可能難以展開(kāi)、平滑和成形，而具有過(guò)低粘度的漿可能導(dǎo)致一旦沉積第二漿則所述第一層和第二層就完全相互混合(因而是不期望的)。通過(guò)升華除去第一漿中至少一些固體晶體或顆粒的步驟優(yōu)選在0~0.08kPa，更優(yōu)選0.0025~0.08kPa，還更優(yōu)選0.0025~0.04kPa的壓力下進(jìn)行。如果使用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。比水的三相點(diǎn)壓力(約0.08kPa)高的壓力可能有發(fā)生融化而不是升華的風(fēng)險(xiǎn)，而過(guò)低的壓力則難以實(shí)現(xiàn)，并且不一定促進(jìn)升華。關(guān)于通過(guò)升華除去第一漿中至少一些固體晶體或顆粒的步驟，如果升華的持續(xù)時(shí)間過(guò)短，殘留的7jc和溶劑可引起所述支架壁的再溶解，進(jìn)而危及所述孔結(jié)構(gòu)。相應(yīng)地，本發(fā)明AiL現(xiàn)，該步驟優(yōu)選進(jìn)行多至96小時(shí)，更優(yōu)選1272小時(shí)，還更優(yōu)選24~36小時(shí)。如果使用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。通過(guò)升華除去第一漿中至少一些固體晶體或顆粒的步驟優(yōu)選在-10至60",更優(yōu)選040t:，還更優(yōu)選20371c，還更優(yōu)選2537"C的溫度下進(jìn)行。如果使用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。如果在升華期間的溫度過(guò)低，完成升華所需的時(shí)間可能變得過(guò)長(zhǎng)，而過(guò)高的溫度(即高于40匸)可具有膠原蛋白變性的風(fēng)險(xiǎn)。如果所述材料包含膠原蛋白和糖胺聚糖，則根據(jù)本發(fā)明的方法還可以包括使多孔復(fù)合生物材料中的膠原蛋白和糖胺聚糖交聯(lián)的步驟。通常在升華后從模具中移走所述材料后進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)可以通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)對(duì)共沉淀物進(jìn)行y射線(xiàn)輻照，紫外線(xiàn)輻照，脫水熱處理，用例如葡萄糖、甘露糖、核糖和蔗糖的簡(jiǎn)單的糖進(jìn)行非酶糖化的一種或多種、使該三元共沉淀物與戊二醛、碳二亞胺(例如乙基二曱氨基丙基碳二亞胺)和/或去曱二氫愈創(chuàng)木酸中的一種或多種接觸，或上述方法的任意組合。在本領(lǐng)域中這些都是常規(guī)方法。如果所述材料包含磷酸鈣，則根據(jù)本發(fā)明的方法還可以包括將所述多孔復(fù)合生物材料中的至少一些磷酸鈣材料轉(zhuǎn)化成另一種磷酸鈣相的步驟。例如，該方法可以包括將所述多孔復(fù)合生物材料中的至少一些透鈣磷石轉(zhuǎn)化成磷酸八鈣和/或磷灰石。所述透釣磷石到磷酸八鈞和/或砩灰石的轉(zhuǎn)化優(yōu)選通過(guò)水解實(shí)現(xiàn)。相轉(zhuǎn)換將通常在從模具中移走所述材料(和任選地交聯(lián))之后進(jìn)行。磷灰石是包含鈣和磷酸鹽的礦物類(lèi)，并具有通式Ca5(P04)3(X)，其中X可以是離子，其通常為oh-、F和cr，以及本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的其它離子。術(shù)語(yǔ)磷灰石也包括取代的磷灰石，例如硅取代的磷灰石。所述術(shù)語(yǔ)磷灰石包括羥磷灰石，它是磷灰石的一個(gè)具體實(shí)例。所述35羥磷灰石也可以被其它物質(zhì)例如硅取代。如上所述，在所述冷卻步驟之前，在沉積所述第一和/或第二漿組合物之前或之后，可以在模具中沉積其它的漿層。所述其它的漿層通常也會(huì)包含例如液體載體、膠原蛋白、任選地磷酸釣材料和任選地糖胺聚糖。模具中的內(nèi)含物優(yōu)選在冷卻步驟之前靜置多至24小時(shí)，以便允許相鄰的層之間的各種漿組分的相互擴(kuò)散。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了用于制備包含一個(gè)、二個(gè)或更多層的復(fù)合生物材料的方法。所述層中的至少一個(gè)優(yōu)選包括膠原蛋白、磷酸釣材料和優(yōu)選的糖胺聚糖的多孔生物復(fù)合物。優(yōu)選所有的層包含膠原蛋白。根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合生物材料可用于制造，例如多孔的單層支架，或其中至少一層是多孔的多層支架。根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合生物材料被有利地用于肌骨骼和牙科應(yīng)用的組織再生支架。根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選包括將膠原蛋白作為有機(jī)成分引入所述第一和第二層中(優(yōu)選膠原蛋白是第一和第二層中的主要有機(jī)成分)。如果存在另外的層，則所述方法優(yōu)選包括將膠原蛋白作為有機(jī)成分引入這些其它層的一層或多層中(也優(yōu)選膠原蛋白是所述一個(gè)或多個(gè)其它層的主要有機(jī)成分)。所述方法包括在液體相中同時(shí)制造所有的層和從而制造它們之間的界面。這樣導(dǎo)致層與層間通過(guò)相互擴(kuò)散產(chǎn)生強(qiáng)的界面。術(shù)語(yǔ)相互擴(kuò)散指的是當(dāng)兩種組成不同的漿整體接觸放置時(shí)，由于分子擴(kuò)散或布朗運(yùn)動(dòng)而發(fā)生的混合。在第二方面中，本發(fā)明提供了合成的復(fù)合生物材料，其中至少部分生物材料由包含磷酸鈣材料和膠原蛋白(包括重組人(rh)膠原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖或包含膠原蛋白的部分多肽序列的合成多肽的一種或多種的多孔共沉淀物形成，其中大孔尺寸范圍(孔徑)優(yōu)選為1~1000微米，更優(yōu)選200600微米。所述材料優(yōu)選包含膠原蛋白。所述磷酸鈣材料優(yōu)選選自透鈣磷石、磷酸八鈣和/或磷灰石的一種或多種。所述多孔材料優(yōu)選包含膠原蛋白和磷酸鈞材料的共沉淀物。這已經(jīng)關(guān)于本發(fā)明的第一方面描述過(guò)。此處所用的術(shù)語(yǔ)多孔指的是所述材料可以包含大孔和/或微孔。大孔隙率通常指的是與尺度大于約10微米的孔相關(guān)的特征。微孔隙率通當(dāng)4旨的是鳥(niǎo)尺唐小千約1"傲氺AA力.J:曰乂^i接么i:勝厶趣鈕併;3k'W私rf3可能有開(kāi)放小室和閉合小室的任意組合。例如，所述材料一般會(huì)含有大孔和微孔。所述大孔隙率一般是開(kāi)放小室的，盡管可能有閉合的小室部分。根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中大孔的尺寸范圍(孔徑)通常是從1至1200微米，優(yōu)選從10至1000微米，更優(yōu)選從100至800微米，還更優(yōu)選從200至600微米。根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中的平均長(zhǎng)寬比優(yōu)選從1至50，更優(yōu)選從1至10，最優(yōu)選約1。根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中的孔徑分布(平均孔徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差)優(yōu)選從1至800微米，更優(yōu)選從10到400微米，還更優(yōu)選從20到200微米。根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中的孔隙率優(yōu)選從50至99.99體積％，更優(yōu)選從70至98體積o/o。根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中的開(kāi)放小室的孔隙率的百分比(作為總的開(kāi)放和閉合小室的孔的總數(shù)的百分比來(lái)測(cè)量)優(yōu)選從1至100%，更優(yōu)選從20至100%，還更優(yōu)選從90至100%。在第三方面中，本發(fā)明提供了合成的復(fù)合生物材料，其中至少部分生物材料由包含磷酸鉀材料和兩種或多種膠原蛋白(包括重組人(rh)膠原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖和包含膠原蛋白的部分多肽序列的合成多肽的多孔材料形成。所述材料優(yōu)選包含膠原蛋白和糖胺聚糖。所述磷酸鉀材料優(yōu)選選自透釣磷石、磷酸八鉤和/或磷灰石的一種或多種。所述多孔材料優(yōu)選包含膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鉤材料的三元共沉淀物。這已經(jīng)關(guān)于本發(fā)明的第一方面描述過(guò)。根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中的大孔尺寸范圍(孔徑)也適用于所述第三方面。其平均長(zhǎng)寬比范圍、孔徑大小分布、孔隙率和開(kāi)放小室孔隙率百分比同樣如此。第四方面中，本發(fā)明提供了一種合成的復(fù)合生物材料，其包括第一層，其由根據(jù)本發(fā)明第二或第三方面的復(fù)合生物材料形成；和連接至所述第一層的第二層，其由包含膠原蛋白，或膠原蛋白與糖胺聚糖的共沉淀物，或膠原蛋白與磷酸鉀材料的共沉淀物，或膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鉤材料的三元共沉淀物的材料形成。所述磷酸鈣材料優(yōu)選選自透鈣磷石、磷酸八鈣和/或磷灰石的一種或多種。所述第一和第二層優(yōu)選整體地形成。有利地，這可以通過(guò)涉及液相共合成的方法實(shí)現(xiàn)。這包括任何方法，其中通過(guò)在從所述漿除去液體載體之前，將各層的包含前體的漿以整體彼此接觸的方式放置，來(lái)形成包舍多層的材料的密實(shí)或多孔相鄰層，和其中優(yōu)選基本上同時(shí)從所有層中除去所述液體載體。在除去液體栽體之前(即，仍然在液體相中)，將所述前體漿以整體接觸方式放置允許相鄰的漿之間發(fā)生相互擴(kuò)散。這在所得材料的相鄰層之間的界面處形成相互擴(kuò)散區(qū)域，其中的材料組成為所述相鄰層的材料組成的中間值。相互擴(kuò)散區(qū)域的存在可賦予相鄰層之間的界面機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性。相應(yīng)地，所述第一和第二層優(yōu)選通過(guò)相互擴(kuò)散層彼此連接。作為選擇，所述第一和第二層可以通過(guò)中間層相互連接。術(shù)語(yǔ)中間層指的是單獨(dú)地沉積于兩個(gè)其它層之間，用于提高層間結(jié)合強(qiáng)度或阻止所得支架的相鄰層之間的細(xì)胞、分子或流體通過(guò)，并且可以例如包含膠原蛋白、糖胺聚糖、纖維蛋白、抗血管生成藥物(例如蘇拉明(suramin))、生長(zhǎng)因子、基因或任何其它成分的任何層。中間層通過(guò)以下事實(shí)區(qū)別于相互擴(kuò)散層中間層作為組成不同于其相鄰層的組成的漿而單獨(dú)地沉積，而相互擴(kuò)散層只是由于相鄰層之間的相互擴(kuò)散而形成的。所迷第一層是多孔的。優(yōu)選第二層也是多孔的，盡管如果需要，可以是無(wú)孔的或基本上無(wú)孔的層。根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中的大孔尺寸范圍(孔徑)也適用于根據(jù)本發(fā)明第四方面的實(shí)施方案中的第一和/或第二層。其平均長(zhǎng)寬比范圍、孔徑分布、孔隙率和開(kāi)放小室孔隙率百分比同樣如此。在任意的所述第二、三和四方面中，所述生物材料可以包含連接至所述第一和/或第二層的一個(gè)或多個(gè)其它的層，其中所述其它層中的38每一層優(yōu)選由包含膠原蛋白，或膠原蛋白與糖胺聚糖的共沉淀物，或膠原蛋白與磷酸鉀材料的共沉淀物，或膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鉀材料的三元共沉淀物的材料形成。所述磷酸釣材料優(yōu)選選自透釣磷石、磷酸八鈣和/或磷灰石中的一種或多種。所述第一和第二層及所述一個(gè)或多個(gè)其它的層優(yōu)選整體的方式形成，并且相鄰的層優(yōu)選通過(guò)通常由液相共合成形成的相互擴(kuò)散層彼此連接。一般地，所述其它層中的至少一個(gè)將會(huì)是多孔的。此外，根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中的大孔尺寸范圍(孔徑)也適用于這些其它層的一個(gè)或多個(gè)。其平均長(zhǎng)寬比范圍、孔徑分布、孔隙率和開(kāi)放小室孔隙率百分比同樣如此。相鄰層之間的孔徑大小差可以在幾乎可忽略到大至+/-1000微米之間變化。除非另有說(shuō)明，下列描述適用于本發(fā)明的任意方面。如果材料包含膠原蛋白和糖胺聚糖，則可以交聯(lián)所述膠原蛋白和糖胺聚糖。所述膠原蛋白優(yōu)選以從l至99wt。/。，優(yōu)選從5至90wt。/。，更優(yōu)選從15至60wt%的量存在于所述材料中。所述糖胺聚糖優(yōu)選以從0.01至20wt%，更優(yōu)選從1至12wt%,還更優(yōu)選從1至5.5wt%的量存在于所述材料中。如果所述材料包含透鈣磷石，則膠原蛋白和透鈣磷石的重量比優(yōu)選從10:1至1:100，更優(yōu)選從5:1至1:20。如果所述材料包含磷酸八鈣，則膠原蛋白和磷酸八鉤的重量比優(yōu)選為10:1至1:100,更優(yōu)選從5:1至1:20。膠原蛋白和糖胺聚糖的重量比優(yōu)選為從8:1至30:1。根據(jù)本發(fā)明的生物材料可以用作替代骨或牙科材料。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了包含此處描述的生物材料的合成骨材料、骨植入物、骨移植物、骨替代物、骨支架、填充物、涂料或粘固粉。所述生物材料有利地以多層支架的形式提供。具體地，本發(fā)明提供了用于肌骨骼和牙科應(yīng)用的組織再生支架。根據(jù)本發(fā)明的多層(即兩層或多層)支架可以在例如骨/軟骨界面(例如關(guān)節(jié)連接)、骨/腱界面(例如腱止點(diǎn))、骨/韌帶界面(例如韌帶止點(diǎn))、和牙齒/韌帶界面(例如牙齒/牙周韌帶結(jié)合點(diǎn))中找到應(yīng)用。盡管本發(fā)明主要涉及用于組織工程應(yīng)用的支架，但是根據(jù)本發(fā)明的材料可以用于制造在體內(nèi)保持很長(zhǎng)時(shí)間的植入物。例如，腱和韌帶應(yīng)用可能必需的半永久性植入物。本發(fā)明還提供可通過(guò)此處描述的方法獲得的多孔復(fù)合生物材料。合成方法現(xiàn)在將通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。優(yōu)選的合成方法包括一系列步驟，其可以整體或部分地應(yīng)用以生產(chǎn)具有一個(gè)層或多個(gè)層的多孔支架，其中至少一個(gè)層優(yōu)選包含膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸釣材料的三元共沉淀物。步驟0:制備漿可以利用本發(fā)明人2004年10月28日提交的較早的專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/GB04/004550中概述的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)礦化的膠原蛋白/GAG/透鉀磷石漿的制備。PCT/GB04/004550的內(nèi)容在此通過(guò)引用并入本文?？梢岳肶annasetal"1989;O'Brienetal"2004;O'Brienetal"(2005);Loreeetal.，(1989)中概述的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)未礦化的膠原蛋白/GAG漿的制備。在該階段通過(guò)機(jī)械混合，可以任選地將生長(zhǎng)因子、基因、藥物或其它生物活性物質(zhì)單獨(dú)地或以組合加入所述漿中，以促使它們并入所述支架中。在支架具有多于一層的情況下，并入一層中的生物活性物質(zhì)不需要與并入下一層中的生物活性物質(zhì)相同。步驟I:澆鑄步驟I-a:澆鑄第1層步驟I-b:澆鑄第2層40步驟I-c:澆鑄第3層步驟I-n:洗鑄第n層所述澆鑄步驟包括將溶液、懸浮液、膠體或分散體形式(其中水構(gòu)成主要稀釋劑)的漿連續(xù)沉積到模具中，其中至少一種漿包含膠原蛋白、一種或多種糖胺聚糖和磷酸釣透鈣磷石的三元共沉淀物，并且所有的漿包含膠原蛋白。所述模具可以是任何期望的形狀，可以由包括聚合物(例如聚砜、聚丙烯、聚乙烯)，金屬(例如不銹鋼、鈦、鈷、鉻)，或陶瓷(例如氧化鋁、氧化鋯)，玻璃陶瓷，或玻璃(例如硼硅酸鹽玻璃)的任意的許多材料制成。可以專(zhuān)門(mén)地構(gòu)造所述模具用于促進(jìn)層化。例如，所述層可以垂直地(即一層位于另一層上面)、水平地(即一層在另一層旁邊)、和/或放射狀(一個(gè)球形層在下一個(gè)的上面)地定位。在所述支架包括一層的情況下，待澆鑄的單層包含含有膠原蛋白、磷酸鉀材料(優(yōu)選透鉀磷石)和任選地糖胺聚糖的共沉淀物的漿。優(yōu)選地，所述漿包含含有膠原蛋白、透鈣磷石和糖胺聚糖的三元共沉淀物。該層的優(yōu)選厚度列于表l的適當(dāng)部分中。在所述支架包括兩層的情況下，待澆鑄的所述層中的至少一層包含含有膠原蛋白、磷酸釣材料(優(yōu)選透鉤磷石)和任選地糖胺聚糖的共沉淀物的漿。優(yōu)選地，所述漿包含含有膠原蛋白、透釣磷石和糖胺聚糖的三元共沉淀物。該層的優(yōu)選厚度列于表l的適當(dāng)部分中。另一層包括含有膠原蛋白、任選地磷酸鈣材料和任選地糖胺聚糖的漿。該漿組合物優(yōu)選包含膠原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物，或膠原蛋白與磷酸釣材料(比如透鈣磷石)的共沉淀物，或膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鉀材料(優(yōu)選透鈞磷石)的三元共沉淀物?？梢圆鹏迵?jù)需要包括其它層，并且這些其它層優(yōu)選由包含膠原蛋白、任選地磷酸鉤材料和任選地糖胺聚糖的漿形成。所述其它的漿組合物優(yōu)選包含膠原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物，膠原蛋白和磷酸鈣材料(例如透鉤磷石)的共沉淀物，或膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鋦材料(優(yōu)選透釣磷石)的三元共沉淀物。每個(gè)后續(xù)層中的漿的組成可以是相同的，稍微變化的，或顯著變化的，條件是膠原蛋白和優(yōu)選的糖胺聚糖存在于每一層中，并且所述層中的至少一層也包含磷酸釣材料，例如透鉤磷石。步驟II:相互擴(kuò)散所述共擴(kuò)散步驟包括允許澆鑄的、分層的漿的各層相互擴(kuò)散。進(jìn)行這一步步驟，以使得在相鄰層之間的漿組分相互擴(kuò)散，從而增加固化和升華后層間的結(jié)合強(qiáng)度。所述相互擴(kuò)散步驟的優(yōu)選條件列于表2中的適當(dāng)部分。步驟III:受控冷卻所述受控冷卻步驟包括將含有漿的模具置于環(huán)境中，然后以控制速率冷卻至低于0"C的最終溫度。進(jìn)行該步驟，以引發(fā)和控制漿內(nèi)水結(jié)晶體成核和生長(zhǎng)的速率。然后，通過(guò)升華除去冰結(jié)晶體，留下多孔的支架。所述水結(jié)晶體網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)將決定支架的最終孔結(jié)構(gòu)。冷卻的優(yōu)選參數(shù)列于表3中。步驟IV:退火所述退火步驟包括使得漿在受控冷卻步驟的最終溫度下保持給定的時(shí)間。進(jìn)行該步驟以確保漿完全或基本完全凍結(jié)。退火的優(yōu)選參數(shù)列于表4。步驟V:升華所述升華步驟包括當(dāng)凍結(jié)的漿大致維持在受控冷卻和退火步驟的最終溫度時(shí)，將模具和凍結(jié)漿周?chē)h(huán)境中的壓力降低至低于水/冰/水蒸氣系統(tǒng)的三相點(diǎn)，然后將溫度升至高于在獲得的真空壓力下的固體-蒸氣轉(zhuǎn)化溫度的溫度(通?！祇x:)。進(jìn)行該步驟，以通過(guò)升華將水結(jié)晶體從凍結(jié)的漿中除去。作為除去水的方法，升華相對(duì)于蒸發(fā)的優(yōu)點(diǎn)在于其留下了精確模擬之前存在的冰結(jié)晶體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的空的空間(即孔)網(wǎng)絡(luò)。如果允許冰融化，則冰結(jié)晶體網(wǎng)絡(luò)會(huì)喪失其形狀，并且損害所得到的孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。所述升華步驟的優(yōu)選參數(shù)示于表5。步驟VI:交聯(lián)如果需要，所述方法也可以包括交聯(lián)步驟以交聯(lián)膠原蛋白和糖胺聚糖。這記載于本發(fā)明人2004年10月28日提交的較早的專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/GB04/004550中。PCT/GB04/004550的內(nèi)容在此通過(guò)引用并入本文。實(shí)施例實(shí)施例1:膠原蛋白/GAG/CaP的單層支架材料膠原蛋白I型，從牛腱獲得的微原纖維膠原蛋白，IntegraLifeSciencesPlainsboro,NJ，USA;GAG:源于篁魚(yú)軟骨的6-硫酸軟骨素，鈉鹽，Sigma-AldrichInc(St.Louis，MO,USA);鉀源(i)氬氧化釣(Ca(OH)2)Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA);(ii)硝酸鉀(Ca(N03)24H20)Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA);罅源正碌酸(H3P04),BDHLaboratorySupplies(Poole,UnitedKingdom);交聯(lián)劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(=EDAC)，Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA);N-羥基琥珀酰亞胺(=NHS)Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA)。程序步驟0:制備漿通過(guò)使用配備直徑19mm定子的均質(zhì)器在15000rpm下混合卯分鐘，將3.8644g膠原蛋白分散在冰浴中冷卻的171.4mL的0.1383摩爾/升的H3P04中，以產(chǎn)生高粘性的膠原蛋白分散體。平行地，在室溫下4吏得0.3436g6-硫酸軟骨素(GAG)溶解到14.3mL的0.1383摩爾/升H3P04中，通過(guò)周期性振搖分散溶解的GAG，以便生產(chǎn)GAG溶液。90分鐘后，在15,000rpm的連續(xù)均質(zhì)下,以大約0.5mL/分鐘的速率將14.3mL所述GAG溶液加入到混合的膠原蛋白分散體中，然后另外混合得到的高粘性膠原蛋白/GAG分散體90分鐘。混合90分鐘之后，在30分鐘時(shí)間和15000rpm的恒定混合下，將1.804gCa(OH)2和0.780gCa(N03)2.4H20加入所述高粘性膠原蛋白/GAG分散體中，生成pH約4.0的膠原蛋白/GAG/CaP漿。使得所述膠原蛋白/GAG/CaP漿在攪拌板上在25匸下保持48小時(shí)混合，然后在4匸下放置12小時(shí)。然后冷卻的漿在25Pa的壓力下在真空燒瓶中脫氣25小時(shí)。步驟I:澆鑄使用自動(dòng)吸移管管理器將15mL未礦化的膠原蛋白/GAG/CaP漿澆鑄到長(zhǎng)50mm、寬30mm和深10mm的聚砜模具中。使用手動(dòng)吸移管管理器從所述漿中除去所有的大氣泡。步驟II:相互擴(kuò)散由于實(shí)施例I的支架只包括一層，所以相互擴(kuò)散的步驟是不必要的。步驟III:受控冷卻將所述模具和漿放入VirTisGenesis冷凍干燥器(配有溫控的不銹鋼架)中，并且所述冷凍干燥器的架溫以約2.4C每分鐘的速率從4x:降低至-2ox:。步驟IV:退火所述冷凍干燥器的架溫保持在-2or:下io小時(shí)。步驟V:升華當(dāng)仍處于-20匸的架溫時(shí)，將低于25Pa的真空(約200毫托)施加到容納所述模具和(目前凍結(jié)的)漿的室中。然后將所述室的溫度升至37X:，并且允許升華持續(xù)36小時(shí)。然后除去所述真空，溫度恢復(fù)至室溫，留下膠原蛋白/GAG/CaP的單層支架，尺寸為50mmx30mmx10mm。步驟V+I:交聯(lián)44支架在40mL去離子水中水合20分鐘。將20mL的0.035摩爾/升EDAC和0.014摩爾/升NHS的溶液加入到容納所述支架和去離子水的容器中，允許所述支架在室溫和輕度攪拌下交聯(lián)2小時(shí)。除去所述EDAC溶液，用磷酸緩沖溶液(PBS)漂洗支架，然后使得在37"C和中度攪拌下在新鮮的PBS中培養(yǎng)2小時(shí)。在PBS中兩個(gè)小時(shí)后，通過(guò)使得在37t:和中度攪拌下在去離子水中培養(yǎng)兩個(gè)10分鐘間隔來(lái)漂洗所述支架。然后通過(guò)以大約2.4匸每分鐘的速率從室溫受控冷卻至-20"冷凍干燥所述支架，來(lái)除去任何殘余的水，隨后在-20X:退火約5小時(shí)，然后在37匸下低于25Pa升華，生成交聯(lián)的膠原蛋白/GAG/CaP支架，尺寸大致為50mmx30mmx10mm。獲取了所得單層支架的X射線(xiàn)顯微斷層圖像、掃描電鏡圖像、離子分布圖和壓縮機(jī)械行為。值得注意的是整個(gè)支架中材料組成和孔隙率基本均勻的性質(zhì)。顯示了相同支架的連續(xù)橫截面，再次說(shuō)明了所述支架孔結(jié)構(gòu)的均勻性；高度的孔互聯(lián)性、等軸孔形態(tài)和大的(平均直徑500微米)大孔尺寸也很明顯。SEM顯微照片再次顯示了大孔的形態(tài)，同時(shí)也顯示了有限的微孔的存在，其可在某些大孔的壁內(nèi)看見(jiàn)。所述支架壁區(qū)域的高(4000x)放大率二次(即外形敏感的)和反向散射的(即組成敏感的)電子圖像表明所述支架壁的組成均勻性，盡管存在處于尺寸約為l-2微米的突出瘤狀體的形式有限的拓樸變化。鈣和磷圖證實(shí)了整個(gè)支架中組成基本均勻的結(jié)論，其中兩種元素均勻地分布在整個(gè)支架中。干燥狀態(tài)下的單層支架能夠被普通的外科工具例如手術(shù)刀、剃刀和圓鋸刀片(在角膜移植中使用的環(huán)形切割工具)切成任何期望的形狀，而不會(huì)破碎、裂開(kāi)或失去完整性。在干燥狀態(tài)下的單層支架的行為顯示了典型的多孔質(zhì)固體變形的三個(gè)階段，其具有彈性模量762+/-188kPa和壓縮屈服應(yīng)力85.2+/-11.7kPa。重要的是注意到所述干支架的屈服強(qiáng)度使得它們承受有力的拇指壓力(例如在插入缺陷部位時(shí))，其在施加強(qiáng)有力的拇指壓力(例如外科醫(yī)生改變植入物的形狀)時(shí)仍不會(huì)形成永久性的變形。在7jC合狀態(tài)下的單層支架的壓縮變形顯示出三個(gè)階段的機(jī)械行為，但是其彈性模量(4.12+/-0.76kPa)和屈服應(yīng)力(0.29+/-0.11kPa)比相應(yīng)的干支架性能低大約一個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，在塌陷平臺(tái)區(qū)觀(guān)察到了的壓縮應(yīng)力釋放之后粘彈性形變恢復(fù)的證據(jù)。實(shí)施例II:雙層礦化-未礦化支架材料膠原蛋白(用于礦化的漿)從牛腱獲得的I型微原纖維膠原蛋白，IntegraLifeSciencesPlainsboro,NJ,USA;GAG(用于礦化的漿)從篁魚(yú)軟骨獲得的6-硫酸軟骨素，鈉鹽，Sigma曙AldrichInc(St.Louis,MO,USA)。II型膠原蛋白+GAG(用于未礦化的漿)從豬的軟骨中溶解的II型膠原蛋白和GAG(膠原蛋白/GAG)漿，GelstlichBiomaterials(Wolhusen,Switzerland),鉀源(i)氫氧化鉀(Ca(OH)2)Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA);(ii)硝酸釣(Ca(N03)2.4H20)Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA);磷源正磷酸(H3P04)，BDHLaboratorySupplies(Poole,UnitedKingdom);交聯(lián)劑l-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)碳二亞胺(=EDAC)，Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA);N-羥基琥珀酰亞胺(=NHS)Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA)步驟0:制備漿制備礦化的漿通過(guò)使用配備直徑19mm定子的均質(zhì)器在15000rpm下混合90分鐘，將3.8644g的膠原蛋白分散在冰浴中冷卻的171.4mL的0.1383摩爾/升的H3P04中，以產(chǎn)生高粘性膠原蛋白分散體。平行地，在室溫下將0.3436g6-硫酸軟骨素(GAG)溶解在14.3mL的0.1383摩爾/升的H3P04中，通過(guò)周期性振搖^t溶解的GAG，以產(chǎn)生GAG溶液。卯分鐘后，在15000rpm的持續(xù)均質(zhì)下，以大約0.5mL/分鐘的速率將14.3mL的GAG溶液加入到混合的膠原蛋白分散體中，然后另外混合得到的高粘性膠原蛋白/GAG分散體90分鐘?；旌?0分鐘之后，在30分鐘時(shí)間和15000rpm的恒定混合下，將1.804gCa(OH)2和0.780gCa(N03)2.4H20加入高粘性膠原蛋白/GAG分散體中，生成pH約為4.0的膠原蛋白/GAG/CaP漿。冷卻的漿在25Pa壓力下在真空瓶中脫氣2546小時(shí)，使用均質(zhì)器再混合30分鐘，然后再次脫氣48小時(shí)。制備未礦化的漿從冰箱中取出1I型膠原蛋白/GAG漿并允許恢復(fù)到室溫。步驟I:澆鑄將2.5mL未礦化的1I型膠原蛋白/GAG漿放入組合聚砜模具的底部，所述底部長(zhǎng)50mm，寬30mm，深2mm。用剃刀將所述漿平整為平坦的表面。將也由聚砜制成的長(zhǎng)50mm寬30mm深6mm的上部環(huán)固定到容納所述平整的未礦化漿的模具底部。將9mL礦化的膠原蛋白/GAG/CaP漿以均勻分布的方式置于所述平整的未礦化層上和之前空的的上部環(huán)內(nèi)。利用手動(dòng)吸移管管理器從所述漿中除去所有大的氣泡。步驟II:相互擴(kuò)散在放入冷凍干燥器之前，使得所述分層的漿保持在室溫和室壓下共4個(gè)小時(shí)。步驟III:受控冷卻將所述模具和分層的漿放入VirTisGenesis冷凍干燥器(配有溫控的不銹鋼架)中，并且所述冷凍干燥器的架溫以約-2.4lC每分鐘的速率從4X:降低至-401C。步驟IV:退火所述冷凍干燥器的架溫保持在-40匸下10小時(shí)。步驟v:升華仍處于-40t:的架溫時(shí)，將低于25Pa的真空(約200毫托)施加到容納所述模具和(目前凍結(jié)的)分層漿的室中。然后所述室的溫度升至37C并且允許升華持續(xù)36小時(shí)。然后除去所述真空，溫度恢復(fù)至室溫，留下膠原蛋白/GAG/CaP的雙層支架，尺寸為50mmx30mmx8mm，由2mm厚的未礦化層和6mm厚的礦化層構(gòu)成。步驟VI:交聯(lián)支架在32mL去離子水中水合20分鐘。將18mL的0.035摩爾/升EDAC和0.014摩爾/升NHS溶液加入到容納所述支架和去離子水的容器中，并且使得所述支架在室溫和輕度攪拌下交聯(lián)2小時(shí)。除去所述EDAC溶液，然后用磷酸緩沖溶液(PBS)漂洗支架，然后允許在37匸和中度攪拌下在新鮮的PBS中培養(yǎng)2小時(shí)。在PBS中兩個(gè)小時(shí)后，通過(guò)允許在371C和中度攪拌下在去離子水中培養(yǎng)兩個(gè)10分鐘間隔來(lái)漂洗所述支架。然后通過(guò)以大約-2.4n每分鐘的速率從室溫受控冷卻至-20匸來(lái)冷凍干燥所述支架，以除去任何殘余的水，然后在-20lC退火5小時(shí)，最終在低于25Pa和37n下升華24小時(shí)，生成交聯(lián)的分層的膠原蛋白/GAG/CaP支架，尺寸約為50mmx30mmx8mm，由2mm厚的未礦化層和6mm厚的礦化層組成。獲取了雙層支架的X射線(xiàn)顯微斷層圖像、掃描電鏡圖像、和離子分布圖。通過(guò)上述步驟生產(chǎn)的雙層支架的9.5mmx9.5mm圓柱部分的X射線(xiàn)顯微斷層圖象包含不透明的下部區(qū)域，其顯示了礦化層，而更透明的上部區(qū)域代表未礦化層。在孔隙率和組成方面，兩層都大致均勻。所述礦化層中的平均大孔尺寸為約400微米，而未礦化層中的那些在700微米的級(jí)別上；礦化和未礦化層中的孔都顯示出等軸形態(tài)。SEM圖像顯示了未礦化層的俯視圖，其說(shuō)明幾乎沒(méi)有微孔隙率存在的證據(jù)，而界面區(qū)的圖像證實(shí)沒(méi)有將所述礦化和未礦化層分開(kāi)的任何大空隙或其它間斷。研究了雙層支架在壓縮負(fù)荷下的行為。在施加壓縮負(fù)荷后，柔性的未礦化層開(kāi)始?jí)嚎s，在不足以在礦化支架內(nèi)引起任何顯著變形的應(yīng)力下導(dǎo)致軟骨區(qū)室的幾乎完全的壓縮。當(dāng)負(fù)荷釋放后，所述未礦化的膠原蛋白/GAG層幾乎立刻恢復(fù)至原來(lái)的形狀。研究了雙層支架在7jC合狀態(tài)下的機(jī)械行為。一旦水合，所述未礦化的膠原蛋白/GAG層在低幅負(fù)荷下可以被壓縮。與干燥狀態(tài)不同，所述水合的未礦化區(qū)室在第一次施加壓縮負(fù)荷之后沒(méi)有完全恢復(fù)其原始厚度，而是在所述礦化區(qū)室的橫截面上下垂。但是在初始?jí)嚎s后，未礦化層在隨后每次施加壓縮負(fù)荷之后恢復(fù)到其壓縮厚度。研究了雙層支架的未礦化層附著到包含關(guān)節(jié)連接處的骨和軟骨界面的外科缺損的壁上的能力。載玻片與骨軟骨缺損的壁相似，所述未礦化層附著到這個(gè)表面的能力表明這些支架填充這些缺損到它們外圍而不會(huì)在支架的未礦化層和相鄰的關(guān)節(jié)軟骨之間留下空隙的能力。實(shí)施例III:三層礦化-未礦化的礦化支架材料膠原蛋白(用于礦化的漿)源于牛腱的I型微原纖維膠原蛋白，IntegraLifeSciences(Plainsboro，NJ,USA)GAG(用于礦化的漿)源于蓳魚(yú)軟骨的6-硫酸軟骨素，鈉鹽，Sigma畫(huà)AldrichInc(StLouis,MO,USA)。鉀源(i)氫氧化鉀(Ca(OH)2)Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA);(ii)硝酸鉀(Ca(N03)2'4H20)Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA);褲源正磷酸(H3P04)，BDHLaboratorySupplies(Poole，UnitedKingdom)膠原蛋白(用于未礦化的膠原蛋白-GAG漿)從豬的真皮中溶解的85%I型，15%III型胃蛋白酶JapanMeatPackers(Osaka,Japan)GAG(用于未礦化的漿)源于篁魚(yú)軟骨的6-硫酸軟骨素，鈉鹽，Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA)'用于未礦化膠原蛋白和GAG的稀釋劑冰醋酸(CH3COOH)，F(xiàn)ischerScientific(Loughborough,UK);交聯(lián)劑去曱二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)，Sigma-AldrichInc(St.Louis，MO,USA);磷酸二氳鈉(NaH2P04)，BDHLaboratorySupplies(Poole,UnitedKingdom);氯化鈉(NaCl)，Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA)步驟0:制備漿制備礦化的漿通過(guò)^^用配備直徑19mm定子的均質(zhì)器在15000rpm下混合90分鐘，將3.8644g的膠原蛋白分散在于冰浴中冷卻的171.4mL的0.1383摩爾/升的H3P04f，以制備高粘性的膠原蛋白分散體。平行地，在室溫下將0.3436g6-硫酸軟骨素(GAG)溶解到14.3mL的0.1383摩爾/升H3P04+，通過(guò)周期性振搖分散溶解的GAG，以產(chǎn)生GAG溶液。卯分鐘后，將14.3mL所述GAG溶液在15，000rpm的持續(xù)均質(zhì)下以大約0.5mL/分鐘的速率加入混合的膠原蛋白分散體中，然后另外混合得到的高粘性膠原蛋白/GAG分散體90分鐘。混合90分鐘之后，在30分鐘時(shí)間和15000rpm的恒定混合下，將1.804gCa(OH)2和0.780gCa(N03)2.4H20加入所述高粘性膠原蛋白/GAG分散體中，生成pH約4.0的膠原蛋白/GAG/CaP漿。然后冷卻的漿在25Pa的壓力下在真空燒瓶中脫氣25小時(shí)，使用均質(zhì)器再次混合30分鐘，然后再次脫氣48小時(shí)。制備未礦化的漿通過(guò)使用配備直徑19mm定子的均質(zhì)器在15000rpm下混合卯分鐘，將1.9322gl/III型膠原蛋白分散在于冰浴中冷卻的171.4mL的0.05摩爾/升的醋酸中，以制備高粘性膠原蛋白分散體。平行地，在室溫下將0.1718g6-硫酸軟骨素(GAG)溶解到28.6mL的0.05摩爾/升醋酸中，通過(guò)周期性振搖分散溶解的GAG，以生成GAG溶液。卯分鐘后，在15，000rpm的持續(xù)均質(zhì)下以大約0.5mL/分鐘的速率，將所述14.3mLGAG溶液加入混合的膠原蛋白分散體中，并另外混合得到的高粘性膠原蛋白/GAG分散體卯分鐘。步驟I:澆鑄將3.5mL礦化的膠原蛋白/GAG/CaP漿置于組合聚砜模具的底部，所述底部長(zhǎng)50mm，寬30mm，深3mm。所述漿用剃刀平整為平面。一個(gè)也由聚砜制成的長(zhǎng)50mm寬30mm深5mm的中間環(huán)連接到容納所述平整的礦化漿的模具底部。將7.5mL未礦化的膠原蛋白/GAG漿以均勻分布的方式置于所述平整的未礦化層上并在之前空的中間環(huán)內(nèi)。將一個(gè)也由聚砜制成的長(zhǎng)50mm寬30nun深3mm的上部環(huán)連接到所述平整的未礦化漿之上的模具的中間部分。將3.5mL礦化的膠原蛋白/GAG/CaP漿以均勻分布的方式置于所述平整的未礦化層上并在之前空的上部環(huán)內(nèi)。利用手動(dòng)吸移管管理器從所述漿中除去所有大的氣泡。步驟II:相互擴(kuò)散50在放入冷凍干燥器之前，允許所述三層漿保持在室溫和室壓下20分鐘。步驟III:受控冷卻將所述模具和三層漿置于VirTisAdvantage冷凍干燥器(配有溫控的不銹鋼架)中，并且所述冷凍干燥器的架溫以約-2.4lC每分鐘的速率從4X:降低至-401C。步驟IV:退火保持所述冷凍干燥器的架溫在-40lC下10小時(shí)。步驟V:升華當(dāng)仍處于-40匸的架溫時(shí)，將低于25Pa的真空(約200毫托)施加到容納所述模具和(目前凍結(jié)的)三層漿的室中。然后所述室的溫度升至371C，并且允許升華持續(xù)36小時(shí)。然后除去所述真空，溫度恢復(fù)至室溫，留下尺寸為50mmx30mmxllmm的三層支架，由5mm厚的未礦化中間層和環(huán)繞它的兩個(gè)3mm厚的礦化層組成。步驟VI:交聯(lián)將三層支架在0.1摩爾/升NaH2P04和0.15摩爾/升NaCl的磷酸鹽緩沖液(PBS;pH7.0)中水合30分鐘。將NDGA懸浮在1NNaOH中，并加入到PBS中生成3mg/mL的NGDA在PBS中的溶液；然后在攪拌下在該溶液中水合支架24小時(shí)。從NGDA-PBS溶液移走所述三層支架，并用去離子水沖洗。然后通過(guò)以大約2.4匸每分鐘的速率從室溫受控冷卻至-20n冷凍千燥所述支架，以除去任何殘余的水，然后在-20"C退火5小時(shí)，并最終在37匸下在低于25Pa下升華24小時(shí)，得到干燥交聯(lián)的支架。然后在濃度為0.1mg/mL的NDGA中進(jìn)行隨后的處理。然后在70%乙醇中清洗支架6小時(shí)，隨后在室溫在PBS中清洗24小時(shí)。然后通過(guò)以大約2.4t:每分鐘的速率從室溫受控冷卻至-20t:來(lái)冷凍干燥所述支架第二時(shí)間，以除去任何殘余的水，然后在-20lC退火5小時(shí)，并最終在37X3下在低于25Pa下升華24小時(shí)。下列表中的參數(shù)可以單獨(dú)地或以組合應(yīng)用到本發(fā)明的任意方面，除非另有說(shuō)明。表l:澆鑄的優(yōu)選參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>GaoJ,Dennis正，SolchagaLA,AwadallahAS,GoldbergVM,CaplanAL2001,Tissue-EngineeredFabricationofanOsteochondralCompositeGraftUsingRatBoneMarrow-DerivedMesenchymalStemCells.TissueEngineering7:363-371.GaoJ,DennisJE，SolchagaLA，GoldbergVM,CaplanAI.2002.RepairofOsteochondralDefectwithTissue-EngineeredTwo-PhaseCompositeMaterialofInjectableCalciumPhosphateandHyaluronanSponge.Tissue^Engineering8:827-837.HungCT,LimaEG,MauckRL，TakiE,LeRouxMA,lAiHH,StaricRG,GuoXE,AteshianGA.2003.AnatomicallyShapedOsteochondralConstructsforArticularCartilageRepair.JournalofBiomechanics36:1853-1864.HunzikerEB,DriesangIMK.2003.FunctionalBarrierPrincipleforGrowth-Factor-BasedArticularCartilageRepair.OsteoarthritisandCartilage11:320-327.-NiedemuerGG，SlivkaMA,Leatherbur^NC,KorvickDL，H.H.HJ,EhierWC，D咖CKieswetterK.2000.EvaluationofMultiphaseImplantsforRepairofFocalOsteochondralDefectsinGoats:Biomaterials21:2561-2574.O'BrienFJ,HarleyBA,YannasIV，GibsonL.2004.InfluenceofFreezingRateonPoreStructureinFreeze-DriedCollagen-GAGScaffolds.Biomaterials25:1077-1086.O'BrienFJ,HarleyBA，YannasIV,GibsonIJ.2005.TheEffectofPoreSizeandStructureonCellAdhesioninCo]lagen-GAGScaffolds.Biomaterials26:433-441.HMLoree,IVYannas,BMikic,ASChang,SMPerutZjTVNorregaard，andCfCararup,'Afreeze-dryhigprocessforfabricationofpolymericbridgesforperipheralnerveregeneration'Proc.15thAnnualNortheastBioeng.Conf.P.53-54,l卿.SchaeferD,MartinI,JundtG，SeidelJ,HebeprM,GrodzinskyA,BergnI，Vunjak-NovakovicG,FreedLE.2002.Tissue-EngineeredCompositesfortheRepairof￡argeOsteochondralDefects.ArthritisandRheumatism46:2524-2534.SchaeferD，MartinI,ShastriP,PaderaRF,LangerR,FreedIJE，Vunjak-NovakovicG.2000.InVitroGenerationofOsteochondralComposites.Biomaterials21:2599-2606.SherwoodJK,RileySL,PalazzoloR，BrownSC，MonkkmseDC,CoatesWGriffithLG,LandeenLK,RatcliffeA.2002.AThree-DimensionalOsteochondralCompositeScaffoldforArticularCartilageRepair.Biomaterials23:4739-4751.YannasIV，LeeE,OrgiHDP,SkrabutEM,MurphyGF.1989.SynthesisandCharacterizationofaModelixtracdularMatrix&atInducesPartialRegenerationofAdultMammalianSkin.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica86:933-937.本發(fā)明在很多領(lǐng)域找到了應(yīng)用，以舉例的方式提供下列應(yīng)用。關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)產(chǎn)品雙層支架雙層支架具有提高現(xiàn)有的將源自骨髄的干細(xì)胞補(bǔ)充至關(guān)節(jié)軟骨創(chuàng)傷部位的首要外科手術(shù)療效的潛力。例如，作為干燥的2cmx2cmxlcm的干燥、真空包裝、y滅菌的類(lèi)似于聚苯乙烯泡沫的塊狀物遞送，這些支架可以利用手術(shù)刀或其它工具切割，簡(jiǎn)單地用拇指或鈍器壓力輕易地插入缺損處，并且直接結(jié)合到所述部位，而不用縫合或膠粘。髕韌帶供體部位的修復(fù)產(chǎn)品三層支架三層支架具有在前十字韌帶(ACL)重建期間增強(qiáng)髕韌帶(髕骨腱)再生的潛力，減輕前膝痛并降低髕韌帶斷裂和膝蓋骨折的風(fēng)險(xiǎn)。腱修復(fù)產(chǎn)品雙層支架具有擴(kuò)大的未礦化成分的雙層支架具有提高肌腱套(rotator-cuff)手術(shù)期間腱修復(fù)療效和解決現(xiàn)在尚無(wú)有效解決方案的小腱應(yīng)用的潛力。還在大型家畜的基礎(chǔ)上研究了本發(fā)明，總結(jié)如下。試驗(yàn)l:綿羊骨缺損模型本發(fā)明使之可以生產(chǎn)分層的組織再生支架，其一側(cè)的結(jié)構(gòu)和組成模擬骨，另一側(cè)上為未礦化組織(例如軟骨、韌帶、腱)，在其間具有平滑穩(wěn)定的界面。此外，本發(fā)明還提供了系統(tǒng)地改變這種植入物的骨區(qū)室礦物相的化學(xué)組成的能力。動(dòng)物骨骼成熟的Texcel陸地綿羊(雌性)。缺損外側(cè)股骨髁上的直徑9mm、深9mm的;^質(zhì)骨缺損植入時(shí)間6周實(shí)驗(yàn)組每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的6個(gè)植入物被以相同的植入類(lèi)型對(duì)側(cè)地植入同一動(dòng)物的每一側(cè)。對(duì)照組正對(duì)照用從脛骨粗隆收獲的多孔自體移植物填充四個(gè)部位。負(fù)對(duì)照用包含完全不含礦物相(即只含有ChondroMimetic骨質(zhì)側(cè)的有機(jī)成分)的植入物的對(duì)照植入物填充四個(gè)部位。研究目的鑒別化學(xué)組成不同的四個(gè)實(shí)驗(yàn)植入組的性能差別，并將這些植入組中最期望的組確定為ChondroMimetic骨區(qū)室的最終組成。重大發(fā)現(xiàn)三個(gè)實(shí)驗(yàn)組都沒(méi)有引發(fā)任何種類(lèi)的不良免疫響應(yīng)；所有三個(gè)實(shí)驗(yàn)組和未礦化的負(fù)對(duì)照組通過(guò)細(xì)胞介導(dǎo)的直接取代機(jī)理支持骨的內(nèi)生長(zhǎng)；三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間沒(méi)有觀(guān)察到顯著的統(tǒng)計(jì)上的差別；并且在全部三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中觀(guān)察到的骨形成比負(fù)對(duì)照組中的骨形成高出顯著的統(tǒng)計(jì)水平。植入物設(shè)計(jì)的應(yīng)用該項(xiàng)研究所涉及的直接取代機(jī)理表明與在傳統(tǒng)的骨移植替代物中觀(guān)察到的典型的外加機(jī)理相比，所述骨形成的機(jī)理更接近于在胎兒和新生動(dòng)物(包括人)的生長(zhǎng)面上出現(xiàn)的模板骨形成。在未礦化的對(duì)照組中存在的這種取代機(jī)理表明所述植入物的有機(jī)組分賦予了這種特性。所述植入物的孔徑大小應(yīng)該通過(guò)降低植入物的骨區(qū)室的平均孔徑來(lái)改變，以解釋這種取代機(jī)理。所述三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的骨形成行為沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)差異表明處理參數(shù)可以用來(lái)識(shí)別最適合的植入物的礦物組成。試驗(yàn)2:公山羊的骨軟骨缺損模型該項(xiàng)研究的目的在于評(píng)估作為增強(qiáng)骨髓刺激術(shù)(軟骨下鉆孔)效果的方法的ChondroMimetic的'性能。動(dòng)物骨骼成熟的西班牙山羊(雌性)。缺損直徑4mm、深6mm的骨軟骨缺損(1個(gè)在滑車(chē)溝內(nèi)；1個(gè)在外側(cè)髁上)。植入時(shí)間16周實(shí)驗(yàn)組ChondroMimetic工作原型的6個(gè)植入物。對(duì)照組模擬傳統(tǒng)的軟骨下鉆孔(即不含植入物)的6個(gè)缺損。研究目的評(píng)估ChondroMimetic作為骨髓刺激輔助物的性能。發(fā)現(xiàn)外科醫(yī)生關(guān)于ChondroMimetic的處理性能的反饋無(wú)一例外地是壓倒性的正面的。權(quán)利要求1.一種用于制備復(fù)合生物材料的方法，所述方法包括提供基本上是固體的第一成分，其包含膠原蛋白、糖胺聚糖、白蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖和含有膠原蛋白多肽序列之一部分的合成多肽中的一種或多種以及任選地?zé)o機(jī)材料，所述成分至少具有多孔的表面部分；提供流體組合物，其包含膠原蛋白、糖胺聚糖、白蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖和含有膠原蛋白多肽序列之一部分的合成多肽中的一種或多種和液體載體以及任選地?zé)o機(jī)材料；將所述流體組合物與所述第一成分的所述多孔表面部分相接觸；將所述流體組合物冷卻至使得所述液體載體轉(zhuǎn)變成多個(gè)固體晶體或顆粒的溫度；通過(guò)升華和/或蒸發(fā)除去至少一些所述多個(gè)固體晶體或顆粒。2.權(quán)利要求1的方法，其還包括提供基本上是固體的第二成分，其包含膠原蛋白、糖胺聚糖、白蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖和含有膠原蛋白多肽序列之一部分的合成多肽中的一種或多種以及任選地?zé)o機(jī)材料，所述成分至少具有多孔的表面部分；將所述流體組合物放入所述第一成分和所述第二成分之間使得其與所述多孔表面部分相接觸；將所述第一成分和所述第二成分之間的所述流體組合物冷卻至使得所述液體載體轉(zhuǎn)變成多個(gè)固體晶體或顆粒的溫度；通過(guò)升華和/或蒸發(fā)除去至少一些所述多個(gè)固體晶體或顆粒，以得到所述第一成分和所述第二成分之間的中間層。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述第一成分和/或所述第二成分包含無(wú)機(jī)材料。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述無(wú)機(jī)材料包含磷酸鉀材料。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述磷酸鉀材料包含透鈣磷石、磷酸八鉀和磷灰石中的一種或多種。6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一成分和/或所述第二成分包含膠原蛋白和任選地糖胺聚糖。7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一成分和/或所述第二成分由膠原蛋白和磷酸鈣材料的共沉淀物形成。8.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一成分和/或所述第二成分由膠原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物形成。9.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一成分和/或所述第二成分由膠原蛋白、磷酸釣材料和糖胺聚糖的三元共沉淀物形成。10.權(quán)利要求2至9中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一成分包含膠原蛋白和糖胺聚糖以及任選地磷酸鉤材料，并且其中第二成分包含膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鈣材料。11.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述流體組合物包含無(wú)機(jī)材料。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述無(wú)機(jī)材料包含磷酸鉀材料。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述磷酸釣材料包含透鈣磷石、磷酸八鈣和磷灰石中的一種或多種。14.權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的方法，其中所述流體組合物包含膠原蛋白和任選地糖胺聚糖。15.權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)的方法，其中所述液體載體包含水。16.權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的方法，其中所述流體組合物以混懸液的形式提供。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述流體組合物包含基于膠原蛋白的混懸液。18.權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)的方法，其中所述流體組合物以漿的形式提供。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述流體組合物是包含膠原蛋白、任選地糖胺聚糖和任選地磷酸釣材料的漿。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述流體組合物是包含膠原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物的漿。21.權(quán)利要求19的方法，其中所述流體組合物是包含膠原蛋白、磷酸鈣材料和糖胺聚糖的三元共沉淀物的漿。22.權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)的方法，其中所述復(fù)合生物材料是多層支架。23.權(quán)利要求2至22中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一成分的組成與所述第二成分的組成不同。24.權(quán)利要求2至23中任一項(xiàng)的方法，其中所述流體組合物的組成與所述第一成分或所述第二成分的組成不同。全文摘要本發(fā)明提供用于制備復(fù)合生物材料的方法，所述方法包括提供基本上是固體的第一成分，其包含膠原蛋白、糖胺聚糖、白蛋白、透明質(zhì)酸(hyaluronan)、殼聚糖和含有膠原蛋白多肽序列之一部分的合成多肽中的一種或多種以及任選地?zé)o機(jī)材料，所述成分至少具有多孔的表面部分；提供流體組合物，其包含膠原蛋白、糖胺聚糖、白蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖和含有膠原蛋白多肽序列之一部分的合成多肽中的一種或多種以及液體載體和任選地?zé)o機(jī)材料；將所述流體組合物與所述第一成分的所述多孔表面部分相接觸；將所述流體組合物冷卻至使得所述液體載體轉(zhuǎn)變成多個(gè)固體晶體或顆粒的溫度；通過(guò)升華和/或蒸發(fā)除去至少一些所述多個(gè)固體晶體或顆粒。文檔編號(hào)A61L27/56GK101668554SQ200780037734公開(kāi)日2010年3月10日申請(qǐng)日期2007年8月10日優(yōu)先權(quán)日2006年8月11日發(fā)明者威廉·邦菲爾德,安德魯·林恩,布倫丹·A·哈萊,扎卡里·D·威斯納-格羅斯,揚(yáng)尼斯·V·揚(yáng)納斯,洛娜·J·吉普森申請(qǐng)人:劍橋有限公司;麻省理工學(xué)院